CN101386841A

CN101386841A - 突变乙酰乳酸合酶和用于产生支链l-氨基酸的方法

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Publication number: CN101386841A
Application number: CNA2007101496930A
Authority: CN
Inventors: 伊莱纳·V·西彻瓦; 弗斯沃洛德·A·塞里布赖尼; 塔蒂亚纳·A·扬波尔斯卡亚; 埃卡特里纳·S·普雷奥布拉曾斯卡亚; 纳塔利亚·V·斯托伊诺瓦
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2006-09-13
Filing date: 2007-09-13
Publication date: 2009-03-18
Anticipated expiration: 2027-09-13
Also published as: US9279137B2; EP1942183B1; DE602007002975D1; CN101386841B; US20140335574A1; PL1942183T3; ES2333055T3; RU2006132818A; RU2355763C2; ATE447014T1; US20090197309A1; EP1942183A1; BRPI0703528A2; JP2008099668A; JP5813907B2; BRPI0703528B1

Abstract

本发明描述了对L－缬氨酸的反馈抑制有抗性的突变细菌乙酰乳酸合酶(AHAS I)。也描述了使用来自肠杆菌科细菌产生支链L－氨基酸的方法，其中通过使用对L－缬氨酸的反馈抑制有抗性的乙酰乳酸合酶(AHAS I)来增强所述细菌的L－氨基酸生产力。这种乙酰乳酸合酶含有由突变ilvN基因编码的突变小亚基。

Description

突变乙酰乳酸合酶和用于产生支链L-氨基酸的方法

技术领域

本发明涉及生物技术，并具体涉及用于产生支链L-氨基酸的方法。更具体地，本发明公开了新的L-缬氨酸抗性酶的用途，所述新的L-缬氨酸抗性酶涉及支链L-氨基酸的生物合成。更具体地，本发明涉及从大肠杆菌(E.coli)纯化的L-缬氨酸-抗性的突变乙酰乳酸合酶(AHAS I)，所述大肠杆菌是来自含有此合酶的肠杆菌科(Enterobacteriaceae family)的细菌，和使用此细菌的菌株通过发酵产生支链L-氨基酸的方法。

背景技术

传统上，使用由天然来源获得的微生物菌株或其经过特异性修饰而增强L-氨基酸生产力的突变体通过发酵在工业上生产L-氨基酸。

先前已经描述了许多技术以特异性地增强L-氨基酸生产力，例如用重组DNA转化微生物(参见，例如，美国专利号4,278,765)。这些技术是基于增加涉及氨基酸生物合成的酶的活性和/或使目标酶对所产生L-氨基酸的反馈抑制脱敏(参见，例如，Japanese Laid-open申请号56-18596(1981)，WO95/16042或美国专利号5,661,012和6,040,160)。

异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸的生物合成通过分支途径(branched pathway)发生，在所述分支途径中三种步骤对于每种终产物是共同的。AHAS反应代表三种产物共同的第一生物合成步骤。反应由同工酶(isoenzyme)催化，所述同工酶是缬氨酸的终产物抑制的靶物(target)。这种调节在生理控制细菌中的途径方面发挥主要作用。反应包括活性乙醛(源自丙酮酸)与α-酮丁酸(α-ketobutyrate)或丙酮酸的缩合以分别产生α-乙酰-α-羟基丁酸(异亮氨酸的前体)或α-乙酰乳酸(亮氨酸和缬氨酸前体)。

已经报道缬氨酸及其酮酸(keto-acid)前体α-酮异戊酸抑制大肠杆菌K12的生长，而异亮氨酸对抗(counter)此抑制(Tatum，E.L.，Fed.Proc.8:511(1946))。目前，普遍接受的是缬氨酸的抑制主要因阻断α-乙酰-α-羟基丁酸合成而产生。大肠杆菌K12的分析揭示了这种菌株含有指定为同工酶AHAS I、AHAS II和AHAS III的三种AHAS活性的结构基因。AHAS I和AHAS III二者均由缬氨酸抑制，而AHAS II对缬氨酸是抗性的；然而AHAS II通常不在大肠杆菌K12细胞中表达(Guardiola，J.et al，Mol.Gen.Genet.156:17-25(1977))。所有来自肠细菌的AHAS同工酶均由大亚基和小亚基以α₂β₂结构组成，大亚基发挥催化功能而小亚基发挥调节功能。小亚基对于酶活性对反馈抑制物缬氨酸的敏感性是绝对必需的。对AHAS I和AHAS III亚基的单独性质的研究(Weinstock O.et al，J.Bacteriol.174:5560-5566(1992))显示小亚基特异地诱导全酶的催化活性构象(catalytically competent conformation)并且稳定过渡态。

以来自大肠杆菌AHAS III调节小亚基的缬氨酸结合区的模型为基础，进行从小亚基羧基端的截断(truncation)。这些截断引起截短的AHAS III酶中缬氨酸敏感性的缺失(Mendel S.et al，J Mol Biol.10；325(2):275-84(2003))。

但是目前还没有报导描述对缬氨酸是反馈抗性的突变的细菌乙酰乳酸合酶(AHAS I)和这种突变乙酰乳酸合酶在相应的产生L-氨基酸的菌株中用于改进支链L-氨基酸产生的用途。

发明内容

本发明提供了新的突变的细菌乙酰乳酸合酶用于开发产生支链L-氨基酸的菌株，所述菌株具有增强的支链L-氨基酸生产力，并且提供使用这些菌株产生支链L-氨基酸的方法。

通过构建来自大肠杆菌的新的突变乙酰乳酸合酶来完成本发明。此来自大肠杆菌的突变乙酰乳酸合酶在IlvN调节单元中，尤其是Asn-17、Ala-30和/或Ile-44具有突变。将编码这种突变乙酰乳酸合酶的DNA引入产生支链L-氨基酸的菌株时，已显示该突变酶增强支链L-氨基酸的产生。

本发明的一个方面是提供突变细菌乙酰乳酸合酶(AHAS I)小亚基，其包含大肠杆菌的野生型乙酰乳酸合酶小亚基，所述小亚基包含选自下组的突变：将所述野生型乙酰乳酸合酶小亚基中位置17和/或30的L-氨基酸用另外的L-氨基酸取代，将所述野生型乙酰乳酸合酶小亚基中位置44的L-氨基酸下游的N-末端部分用几种L-氨基酸取代，和它们的组合，而且其中所述乙酰乳酸合酶的突变小亚基对缬氨酸的反馈抑制脱敏。

本发明的另一方面提供了如上所述的细菌乙酰乳酸合酶(AHAS I)的突变小亚基，其中将位置17的所述L-氨基酸用赖氨酸残基取代。

本发明的另一方面提供了如上所述的细菌乙酰乳酸合酶(AHAS I)的突变小亚基，其中将位置30的L-氨基酸用脯氨酸残基取代。

本发明的另一方面提供了如上所述的细菌乙酰乳酸合酶(AHAS I)的突变小亚基，其中将位置44的L-氨基酸下游的所述N-末端部分用精氨酸和苯丙氨酸取代。

本发明的另一方面提供了如上所述的细菌乙酰乳酸合酶(AHAS I)的突变小亚基，其中用赖氨酸残基取代的位置17的所述L-氨基酸是天冬酰胺。

本发明的另一方面提供了如上所述的细菌乙酰乳酸合酶(AHAS I)的突变小亚基，其中用脯氨酸残基取代的位置30的所述L-氨基酸是丙氨酸。

本发明的另一方面提供了如上所述的细菌乙酰乳酸合酶(AHAS I)的突变小亚基，其中用精氨酸和苯丙氨酸取代的位置44的所述L-氨基酸是异亮氨酸。

本发明的另一方面提供了突变的细菌乙酰乳酸合酶，其包含如上所述的小亚基。

本发明的另一方面提供了如上所述的突变乙酰乳酸合酶，其中所述突变乙酰乳酸合酶包含大肠杆菌大亚基。

本发明的另一方面提供了如上所述的突变的细菌乙酰乳酸合酶，其中小亚基在除了位置17、30和/或44之外的一个或多个位置包括一个或几个氨基酸的缺失、取代、插入或添加，并且其中所述突变乙酰乳酸合酶对缬氨酸的反馈抑制脱敏。

本发明的另一方面提供了编码如上所述的乙酰乳酸合酶突变小亚基的DNA。

本发明的另一方面提供了肠杆菌科的细菌，所述细菌含有如上所述的DNA并且具有产生支链L-氨基酸的能力。

本发明的另一方面提供了如上所述的细菌，其中所述支链L-氨基酸选自下组：L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸。

本发明的另一方面提供了如上所述的细菌，其中将细菌中突变乙酰乳酸合酶的活性增强。

本发明的另一方面提供了如上所述的细菌，其中所述细菌属于埃希氏菌属(Escherichia)。

本发明的另一方面提供了如上所述的细菌，其中通过增加突变乙酰乳酸合酶基因的表达来增强突变乙酰乳酸合酶的活性。

本发明的另一方面提供了如上所述的细菌，其中通过选自下组的方法增加突变乙酰乳酸合酶的活性：

a)增加突变乙酰乳酸合酶基因的拷贝数，

b)修饰基因的表达控制序列以使基因的表达增强，和

c)它们的组合。

本发明的另一方面提供了如上所述的细菌，其中通过将突变乙酰乳酸合酶基因的多拷贝整合到细菌染色体中来增加拷贝数。

本发明的另一方面提供了用于产生支链L-氨基酸的方法，包括在培养基中培养如上所述的细菌，和从培养基中收集支链L-氨基酸。

本发明的另一方面提供了如上所述的方法，其中细菌具有涉及支链L-氨基酸生物合成的基因的增强表达。

本发明的另一方面提供了如上所述的方法，其中所述支链L-氨基酸选自下组：L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸。

附图说明

图1显示质粒pMIV-P_ivbL-ilvBN的构建。

图2显示对ilvBN33操纵子测序的方案。

图3显示ilvN和ilvN33的核苷酸和氨基酸序列的比对。核苷酸序列以小写字母显示，氨基酸序列以大写显示。ilvN33中的34bp同向重复(direct repeat)以粗体显示并且使用箭头标记。

图4显示质粒pM12的构建。

图5显示质粒pM12-ter(thr)的构建。

图6显示intJS整合盒(integrative cassette)的构建。

图7显示质粒pMIV-5JS的构建。

图8显示具有失活的ilvBN基因的染色体DNA片段的构建。

优选实施方案描述

此外，将对本发明进行详细的说明。

<1>乙酰乳酸合酶的突变小亚基和突变ilvN基因

术语“细菌乙酰乳酸合酶”的意思是肠杆菌科的细菌、棒杆菌属(corynebacteria)、属于芽孢杆菌属(Bacillus)等的细菌中存在的野生型或外源的乙酰乳酸合酶。肠杆菌科包括属于埃希氏菌属、欧文氏菌属(Erwinia)、普罗威登斯菌属(Providencia)和沙雷氏菌属(Serratia)的细菌。埃希氏菌属是优选的。

短语“乙酰乳酸合酶的活性”的意思是催化从丙酮酸和2-丁酮酸(2-oxobutanoate)形成2-乙酰-2-羟基丁酸和CO₂的活性，或催化从两分子丙酮酸形成2-乙酰乳酸和CO₂的活性。能够使用F.C.Stormer和H.E.Umbarger的方法(Biochem.Biophys.Res.Commun.，17，5，587-592(1964))在细菌提取物中测量此活性。

乙酰羟基丁酸合酶I，也称为乙酰乳酸合酶I(AHAS I)是包含两个催化结构域和两个调节结构域的异源四聚体蛋白(Weinstock，O.et al，J.Bacteriol.，174(17)，5560-5566(1992))。通常接受的是大亚基(大约60-kDa)是催化的，而小亚基是调节的。AHAS I由ilvB和ilvN基因编码。

将大肠杆菌乙酰乳酸合酶[EC 4.1.3.18]的小亚基中位置17的天冬酰胺和/或位置30的丙氨酸用任何氨基酸，优选位置17的赖氨酸、位置30的脯氨酸取代，产生对缬氨酸的反馈抑制有抗性的突变蛋白。同样，将位置44的L-氨基酸下游的N-末端部分用一个或几个氨基酸，优选2个氨基酸例如精氨酸和苯丙氨酸取代，产生对缬氨酸的反馈抑制有抗性的突变蛋白。这种突变体的典型实例是IlvN33(SEQ ID NO：11)。可取代位置44的下游的几个氨基酸，但通常可为1至20个，优选1至10个，并且更优选2个。在位置17和/或位置30具有取代、或具有在位置44下游的N-末端部分取代的几个氨基酸的野生型乙酰乳酸合酶的小亚基可称为“突变小亚基”。含有突变小亚基的乙酰乳酸合酶可称为“突变乙酰乳酸合酶”。编码突变小亚基的DNA可称为“突变ilvN基因”。不具有任何取代的乙酰乳酸合酶的小亚基可称为“野生型小亚基”。含有野生型小亚基的乙酰乳酸合酶可以称为“野生型乙酰乳酸合酶”。此外，编码本发明的突变小亚基和乙酰乳酸合酶的大亚基的DNA可称为“突变乙酰乳酸合酶基因”。

ilvB基因(同物异名-b3671)编码乙酰乳酸合酶大亚基。ilvB基因(与核苷酸位置3849119至3850807互补的核苷酸；GeneBank登录号NC_000913.2；gi:16129170)位于大肠杆菌K-12染色体上的ilvN基因和ivbL基因之间。

ilvN基因(同物异名-b3670)编码乙酰乳酸合酶小亚基。ilvN基因(与核苷酸位置3848825至3849115互补的核苷酸；GeneBank登录号NC_000913.2；gi:49175990)位于大肠杆菌K-12染色体上的uhpA基因和ilvB基因之间。ilvN基因的核苷酸序列和由ilvN基因编码的乙酰乳酸合酶小亚基的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。ilvB和ilvN基因形成ilvBN操纵子。

通过使用已知的方法将突变引入到野生型ilvN基因中来获得突变小亚基。能够使用基于操纵子的核苷酸序列的引物通过PCR(聚合酶链式反应；参考White，T.J.et al.，Trends Genet.，5，185(1989))获得ilvBN操纵子。能够以相似的方式获得来自其它微生物的编码乙酰乳酸合酶的基因。

突变小亚基可以在除了17、30和/或44之外的一个或多个位置包含一个或几个氨基酸的缺失、取代、插入或添加，只要保持含有突变亚基的乙酰乳酸合酶的活性。“几个”氨基酸的数目依赖于在蛋白质三维结构中的位置或氨基酸残基的类型而有所不同。这是因为一些氨基酸在蛋白质内它们的结构和功能是彼此相似的，并且交换这些氨基酸不强烈影响蛋白质的三维结构或功能。因此，本发明的突变乙酰乳酸合酶可以是与乙酰乳酸合酶的全部氨基酸序列具有不少于70％，优选80％，并且更优选90％，并且最优选95％的同源性，并且保持乙酰乳酸合酶的活性的突变乙酰乳酸合酶。可供选择的是，“几个”氨基酸的数目可为1至30，优选1至15，并且更优选1至5。

一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加是保守突变使得活性得到保持。代表性的保守突变是保守取代。保守取代的实例包括用Ser或Thr取代Ala，用Gln、His或Lys取代Arg，用Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn，用Asn、Glu或Gln取代Asp，用Ser或Ala取代Cys，用Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln，用Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu，用Pro取代Gly，用Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His，用Leu、Met、Val或Phe取代Ile，用Ile、Met、Val或Phe取代Leu，用Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys，用Ile、Leu、Val或Phe取代Met，用Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe，用Thr或Ala取代Ser，用Ser或Ala取代Thr，用Phe或Tyr取代Trp，用His、Phe或Trp取代Tyr和用Met、Ile或Leu取代Val。

由ilvB基因编码的乙酰乳酸合酶的大亚基也可以在一个或多个位置包括一个或几个氨基酸的缺失、取代、插入或添加。

在本发明中，短语“在位置17、30和/或44的L-氨基酸”的意思是与SEQ ID NO：2的氨基酸序列中位置17、30和/或44的氨基酸残基相对应的氨基酸残基，所述SEQ ID NO：2的氨基酸序列是大肠杆菌乙酰乳酸合酶的野生型小亚基的序列。在来自大肠杆菌的乙酰乳酸合酶的小亚基中，位置17的氨基酸残基是天冬酰胺，位置30的氨基酸残基是丙氨酸，并且位置44的氨基酸残基是异亮氨酸。氨基酸残基的位置可以改变。例如，如果将氨基酸残基插入N-末端部分，位置17、30和/或44的氨基酸残基变成位置18、31和/或45。在这样的情况下，将在原始位置17、30和/或44的氨基酸残基指定为本发明中在位置17、30和/或44的氨基酸残基。

为了测定来自感兴趣的细菌的乙酰乳酸合酶小亚基在位置17、30和/或44的L-氨基酸，将来自大肠杆菌的乙酰乳酸合酶小亚基的氨基酸序列(SEQID NO：2)和来自感兴趣的细菌的乙酰乳酸合酶小亚基的氨基酸序列进行比对，并可测定来自感兴趣的细菌的乙酰乳酸合酶小亚基中在位置17、30和/或44的L-氨基酸。

例如，通过定位诱变修饰核苷酸序列从而在指定位点缺失、取代、插入或添加一个或多个氨基酸残基来获得编码与上述突变小亚基基本上相同的蛋白质的DNA。通过常规已知的突变处理获得如上所述修饰的DNA。这些突变处理包括体外处理含有突变ilvN基因的DNA，例如，使用羟胺进行处理；和使用紫外照射或已知的突变剂如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和亚硝酸处理微生物，例如，包含突变ilvN基因的属于埃希氏菌属的细菌。

如上所述的核苷酸的取代、缺失、插入或添加也包括天然存在的突变(突变体或变体)，例如，以含有乙酰乳酸合酶的细菌的个体差异或种或属中的差异为基础的突变。

编码与突变小亚基基本上相同的蛋白质的DNA能够通过如下方法获得：从已经施以突变处理的细胞分离DNA，所述DNA与具有和已知ilvN基因序列或其部分互补的序列的DNA在严紧条件下杂交，并且其编码的蛋白质形成带有大亚基的具有乙酰乳酸合酶活性的全酶。

“严紧条件”包括这样的条件，在所述条件下形成特异性杂合体，例如，具有不少于60％，优选不少于70％，更优选不少于80％，还更优选不少于90％，并且最优选不少于95％的同源性的杂合体，而不形成非特异性杂合体，例如，具有低于上述的同源性的杂合体。例如，严紧条件的示例是在60℃在1×SSC、0.1％ SDS，优选0.1×SSC、0.1％ SDS的盐浓度洗涤一次或多次，优选两次或三次。洗涤的持续时间依赖于印迹所使用的膜的类型，通常，应该由制造者推荐。例如，在严紧条件下Hybond^TM N+尼龙膜(Amersham)的推荐洗涤持续时间是15分钟。优选可以将洗涤进行2至3次。探针的长度可以依赖于杂交条件合适地选择，并且通常是100bp至1kbp。

为了评估蛋白质或DNA同源性的程度，能够使用几种计算方法例如BLAST搜索、FASTA搜索和ClustalW。

BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)是程序blastp、blastn、blastx、megablast、tblastn和tblastx所采用的启发式搜索算法(heuistic searchalgorithm)；这些程序采用Karlin、Samuel和Stephen F.Altschul的统计学方法赋予它们的结果以显著性(“Methodsfor assessing the statistical significance ofmolecular sequence features by using general scoring schemes”.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1990，87:2264-68；“Applications and statistics for multiple high-scoringsegments in molecular sequences”.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1993，90:5873-7)。FASTA搜索方法由W.R.Pearson描述(＂Rapid and Sensitive SequenceComparison with FASTP and FASTA＂，Methods in Enzymology，1990 183:63-98)。ClustalW方法由Thompson J.D.，Higgins D.G.和Gibson T.J.描述(＂CLUSTAL W：improving the sensitivity of progressive multiple sequencealignment through sequence weighting，position-specific gap penalties and weightmatrix choice＂，Nucleic Acids Res.1994，22:4673-4680)。

能在如上所述的条件下杂交的基因，包括在编码区内具有终止密码子的基因，和由于活性位点的突变而失活的基因。然而，能够通过将基因与商业上可获得的表达载体连接，并研究含有所表达的蛋白质的全酶的乙酰乳酸合酶活性而将这些不便容易地去除。

<2>本发明的细菌

本发明的细菌是肠杆菌科的产生支链L-氨基酸的细菌，其含有编码乙酰乳酸合酶的突变小亚基的DNA。此外，本发明的细菌是肠杆菌科的产生支链L-氨基酸的细菌，其具有增加的突变乙酰乳酸合酶活性。具体地，本发明的细菌是肠杆菌科的产生支链L-氨基酸的细菌，其中由于将编码本发明的突变小亚基的突变ilvN基因引入细菌而增加了支链L-氨基酸的产生。本发明的细菌是属于埃希氏菌属的产生支链L-氨基酸的细菌，其中通过增强细菌中的乙酰乳酸合酶，即缬氨酸抗性的突变乙酰乳酸合酶的活性来增加支链L-氨基酸的产生。更具体地，本发明的细菌在细菌的染色体上或在质粒中含有突变ilvN基因，其中所述基因是过表达的，并且此细菌具有增强的产生支链L-氨基酸的能力。

短语“具有产生支链L-氨基酸的能力的细菌”指当在培养基中培养本发明的细菌时，具有引起支链L-氨基酸在培养基中积累的能力的细菌，所述支链L-氨基酸例如L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸。可以通过培育(breeding)来赋予或增强产生支链L-氨基酸的能力。本文中使用的短语“具有产生支链L-氨基酸的能力的细菌”还指能够产生和引起比野生型或亲本菌株更大量的支链L-氨基酸在培养基中积累的细菌，并优选指所述细菌能够产生和引起不少于0.5g/L，更优选不少于1.0g/L的支链L-氨基酸在培养基中积累。代表性的L-氨基酸包括L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸。

肠杆菌科包括属于以下属的细菌：埃希氏菌属、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、泛菌属(Pantoea)、光杆状菌属(Photorhabdus)、普罗威登斯菌属、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属、志贺氏菌属(Shigella)、摩根氏菌属(Morganella)和耶尔森氏菌属(Yersinia)等。具体地，能够使用根据NCBI(National Center for Biotechnology Information；国家生物技术信息中心)数据库中所用的分类法(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi？id＝91347)归类为肠杆菌科的那些细菌。属于埃希氏菌属或泛菌属的细菌是优选的。

术语“属于埃希氏菌属的细菌”的意思是根据微生物领域技术人员已知的分类归类为埃希氏菌属的细菌。一个实例是大肠杆菌(E.coli)。

短语“将突变乙酰乳酸合酶的活性增强”的意思是每个细胞的活性高于未经修饰的菌株，例如，野生型菌株。代表性的增强的活性包括每个细胞的突变乙酰乳酸合酶分子的数目增加时的情况，和每个突变乙酰乳酸合酶分子的比活增加时的情况等。此外，可用于比较的代表性的野生型菌株，例如，为大肠杆菌K-12。作为增强突变乙酰乳酸合酶的细胞内活性的结果，培养基中支链L-氨基酸的量得到增加。

能够通过增加编码突变乙酰乳酸合酶的基因的表达来增强细菌细胞中的突变乙酰乳酸合酶活性。可使用源自肠杆菌科或棒状杆菌型细菌(coryneformbacteria)的或从肠杆菌科或棒状杆菌型细菌分离的编码突变乙酰乳酸合酶的任何基因。其中，源自属于埃希氏菌属的细菌的基因是优选的。

使用编码蛋白质的DNA转化细菌的意思是将DNA例如，通过常规方法引入细菌细胞，以增加编码本发明蛋白质的基因的表达和增强细菌细胞中蛋白质的活性。

用于增强基因表达的方法包括增加基因拷贝数。将基因引入载体中增加基因的拷贝数，所述载体能够在属于埃希氏菌属的细菌中发挥功能。为了这些目的，可优选使用多拷贝载体，例如pBR322、pUC19、pBluescript KS⁺、pACYC177、pACYC184、pAYC32、pMW119、pET22b等。也可通过将基因的多拷贝，例如通过同源重组等引入细菌染色体来增强基因表达。

也可通过将本发明的DNA置于比天然启动子更强的启动子的控制下来增强基因表达。通过RNA合成起始的频率来定义启动子的强度。用于评估启动子强度的方法和强启动子的实例由Deuschle，U.，Kammerer，W.，Gentz，R.，Bujard，H.描述(Promoters in Escherichia coli：a hierarchy of in vivo strengthindicates alternate structures.EMBO J.1986，5，2987-2994)。例如，P_R启动子被认为是强的组成型启动子。其它已知的强启动子是P_L启动子、lac启动子、trp启动子、trc启动子、λ噬菌体的启动子等。

可通过将更有效的Shine-Dalgarno序列(SD序列)引入本发明DNA中取代天然SD序列来增强翻译，当SD序列在mRNA起始密码子的上游时，其与核糖体的16S RNA相互作用(Shine J.and Dalgarno L.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1974，71，4，1342-6)。

使用强启动子能够与使用多基因拷贝组合。

用于制备染色体DNA、杂交、PCR、质粒DNA的制备、DNA的消化和连接、转化、选择作为引物的寡核苷酸等的方法可以是本领域技术人员熟知的典型方法。这些方法在Sambrook，J.，and Russell D.，“Molecular Cloning ALaboratory Manual，Third Edition”，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)等中有所描述。

可通过将前述DNA引入到细菌中来获得本发明的细菌，所述细菌固有地(inherently)能够产生支链L-氨基酸。可选择地，可通过将产生支链L-氨基酸的能力赋予已经含有所述DNA的细菌来获得本发明的细菌。

对于本发明的亲本菌株，使用属于埃希氏菌属的产生L-缬氨酸的细菌例如H-81(VKPM B-8066)、NRRL B-12287和NRRL B-12288(美国专利号4,391,907)、VKPM B-4411(美国专利号5,658,766)、VKPM B-7707(欧洲专利申请EP1016710A2)等。同样，可使用属于埃希氏菌属的产生L-亮氨酸的细菌例如H-9070(FERM BP-4704)和H-9072(FERM BP-4706)(US5744331)、VKPM B-7386和VKPM B-7388(RU2140450)、W1485atpA401/pMWdAR6、W1485lip2/pMWdAR6和AJ12631/pMWdAR6(EP0872547)等。同样，可使用属于埃希氏菌属的产生L-异亮氨酸的细菌，例如菌株(NZ10)TDH6/pVIC40、pMWD5(Hashiguchi，K.et al，Biosci.Biotechnol.Biochem.，63(4)，672-679(1999))，或菌株AJ12919，其描述于欧洲专利申请EP685555A1等。

<3>本发明的方法

本发明的方法包括通过如下方法来产生支链L-氨基酸，例如L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸：在培养基中培养本发明的细菌、使支链L-氨基酸在培养基中产生和从培养基中收集支链L-氨基酸。

在本发明中，在培养基中培养、从培养基中收集和纯化支链L-氨基酸等可以按照与使用微生物生产氨基酸的常规发酵方法相似的方式进行。用于培养的培养基可以是合成的或天然的，只要它包括碳源和氮源和矿物质和，如果需要的话，微生物生长所需的适量营养物。碳源可以包括各种糖例如葡萄糖和蔗糖，和各种有机酸。依赖于所选微生物的同化作用的模式，可以使用醇，包括乙醇和甘油。作为氮源，使用各种铵盐例如氨和硫酸铵、其它氮化合物例如胺、天然氮源例如蛋白胨、大豆水解物和消化的发酵微生物。作为矿物质，使用单磷酸钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钙等。如果需要可将额外的营养物添加至培养基。例如，如果微生物生长需要脯氨酸(脯氨酸营养缺陷型)，可以将足够量脯氨酸添加至培养基。

培养优选在需氧条件下，例如摇动培养和带有通气的搅拌培养，在20至42℃，优选37至40℃的温度进行。培养的pH通常在5和9之间，优选在6.5和7.2之间。可以使用氨、碳酸钙、各种酸、各种碱和缓冲液调节培养的pH。通常，1至5天的培养导致目标L-氨基酸在液体培养基中的积累。

培养之后，可通过离心或膜过滤将固形物例如细胞从液体培养基中去除，随后可收集目标L-氨基酸并通过离子交换、浓缩和结晶方法纯化。

实施例

将参考以下非限制性实施例更具体地说明本发明。

实施例1.克隆编码大肠杆菌的AHAS I的ilvBN操纵子

将ilvBN操纵子作为2439bp PCR产物的部分克隆入pMIV5JS载体。载体pMIV5JS的构建在下面参考实施例1中描述。将MG1655染色体用作PCR反应中的模板。将合成的寡核苷酸ilvBX60(SEQ ID NO：3)和ilvBR64(SEQ IDNO：4)用作引物。引物ilvBX60在5’-端含有XbaI限制位点，并且引物ilvBR64在5’-端含有SalI限制位点。PCR的条件如下：94℃变性5分钟；30个循环的程序(profile)：94℃ 30秒，59℃ 30秒，72℃ 2分钟；最终步骤：72℃ 7分钟。将2449bp PCR产物在琼脂糖凝胶中纯化，使用XbaI和SalI处理，并且克隆到已用相同限制酶处理的pMIV5JS载体中。将菌株B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH用作克隆的受体。菌株B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH的构建在下面参考实施例2中描述。所得质粒pMIV-P_ivbL-ilvBN(图1)补充了B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH菌株的AHAS^-表型。

实施例2.培育大肠杆菌乙酰乳酸合酶同种型I(IlvBNVal^ValR)的缬氨酸抗性突变体

实施例1中所述的菌株B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH/pMIV-P_ivbL-ilvBN仅含有一种编码AHAS的操纵子(ilvBN操纵子)。在补充1g/l缬氨酸的基本培养基平板(plates with minimal medium and supplemented with 1 g/l of valine)上选择缬氨酸抗性的自发突变体。在粗提物中通过F.C.Stomer和H.E.Umbarger(Biochem.Biophys.Res.Commun.，17，5，587-592(1964))的方法测定乙酰乳酸合酶活性和对L-缬氨酸抑制有抗性的酶。对于粗提物，将细胞培养在M9基本培养基中直到对数期的末端，使用补充100mM KCl，pH7.0的100mMKH₂PO₄/K₂HPO₄缓冲液洗涤。通过在相同的缓冲液中超声处理细胞制备细胞粗提物。将从选择的缬氨酸抗性突变体分离的质粒用于再转化AHAS缺陷菌株B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH。结果，获得质粒pMIV-P_ivbL-ilvBN^ValR33，其提供AHAS-缺陷的受体菌株的缬氨酸抗性生长。此质粒含有编码对缬氨酸抑制有抗性的AHAS I的操纵子。测定在10mM L-缬氨酸存在下残余的AHAS活性。残余AHAS活性等于L-缬氨酸存在下的活性(nmol/minmg)*100％/L-缬氨酸不存在时的活性(nmol/minmg)。通过F.C.Stormer和H.E.Umbarger(Biochem.Biophys.Res.Commun.，17，5，587-592(1964))的方法测定AHAS活性。将这种菌株AHAS活性测定的结果示于表1。

实施例3 编码缬氨酸抗性AHAS I的基因的核苷酸序列

使用五个寡核苷酸测序克隆到pMIV-P_ivbL-ilvBN33中的ilvBN DNA片段：ML74(SEQ ID NO：5)、LattRS1(SEQ ID NO：6)、ilvbS31(SEQ ID NO：7)、ilvbS32(SEQ ID NO：8)和ilvbS33(SEQ ID NO：9)。测序方案示于图2。

将所得序列在序列表中显示为ilvBN33(SEQ ID NO：10)。使用计算程序比较该序列揭示了在编码小亚基的区域中34个核苷酸的同向重复(directrepeat)。将突变基因命名为ilvN33(图3)。这种DNA重排导致较早的翻译终止，导致从位置44的异亮氨酸的下游N-末端部分由精氨酸和苯丙氨酸取代，形成45个氨基酸的截短的蛋白质IlvN33(SEQ ID NO：11)。

实施例4将P_ivbL-ilvBN^ValR33操纵子整合到AHAS缺陷菌株的染色体中，随后消除cat标记

1.将cat-P_ivbL-ilvBN^ValR33基因整合到染色体中

为了将mini-Mu::cat-P_ivbL-ilvBN^ValR33整合到细菌染色体中，使用标准方法。将pMIV-P_ivbL-ilvBN^ValR33引入B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH/pMH10细胞。通过在转化之后立即在44℃温育20分钟来诱导由pMH10(pACYC177衍生物，其含有Km^R基因、编码Mu转座酶的Mu-噬菌体A和B基因、编码Mu阻抑物的cts62基因和噬菌体-λ阻抑物基因cI857)(欧洲专利EP1149911)编码的Mu转座酶。

在含有20mg/l氯霉素的LB琼脂平板上于30℃选择氯霉素抗性(Cm^R)克隆。在通过将这些克隆在LB中培养消除两种质粒之后，获得能够在无添加(without addition)的基本培养基上生长的Cm^RKm^SAp^S克隆。

结果，获得在非识别的(non-identified)染色体基因座中含有整合盒mini-Mu::cat-P_ivbL-ilvBN^ValR33的菌株B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIHmini-Mu::cat-P_ivbL-ilvBN^ValR33。

2.从菌株B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH mini-Mu::cat-P_ivbL-ilvBN^ValR33消除氯霉素抗性标记

为了从B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH消除氯霉素抗性标记，用质粒pMW118-int-xis(Ap^R)(WO2005/010175)转化mini-Mu::cat-P_ivbL-ilvBN^ValR33细胞。将Ap^R克隆于30℃在含有150mg/l氨苄青霉素的LB琼脂平板上培养。挑取几十个Ap^R克隆检测氯霉素敏感性。通过在LB琼脂平板上于42℃温育将质粒pMW118-int-xis从Cm^S细胞消除。结果，获得在非识别的染色体基因座中含有整合盒mini-Mu::P_ivbL-ilvBN^ValR33的菌株B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIHmini-Mu::P_ivbL-ilvBN^ValR33。在10mM L-缬氨酸存在下测定残余AHAS活性。将这种菌株的AHAS活性测定结果示于表1。

实施例5用人工调节子区(artificial regulator region)取代ilvBN^ValR33操纵子的天然启动子

1.ilvBN^ValR33操纵子的调节子区的修饰

修饰ilvBN^ValR33操纵子的调节子区，即用P_L启动子取代ilvBN操纵子的天然启动子区，其通过最初由Datsenko和Wanner(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97(12)，6640-6645)开发的称为“Red-驱动整合”的方法完成。根据这种方法，构建PCR引物ilvB-attR1(SEQ ID NO：12)和ilvB-PLSD(SEQ IDNO：13)。寡核苷酸ilvB-attR1(SEQ ID NO：12)与ilvB基因的上游区和BW25113cat-P_L-yddG染色体DNA中存在的赋予抗生素抗性的基因的相邻区同源。寡核苷酸ilvB-PLSD(SEQ ID NO：13)与ilvB区和BW25113 cat-P_L-yddG染色体中存在的P_L启动子的下游区二者同源。获得BW25113 cat-P_L-yddG已经详细描述(EP1449918A1，俄罗斯专利RU2222596)。将菌株BW25113cat-P_L-yddG的染色体DNA用作PCR的模板。PCR条件如下：95℃变性3分钟；前两个循环的程序：95℃ 1分钟，34℃ 30秒，72℃ 40秒；后30个循环的程序：95℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 40秒；最终步骤：72℃ 5分钟。结果，获得PCR产物(SEQ ID NO：14)，在琼脂糖凝胶中纯化，并且用于大肠杆菌菌株B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH mini-Mu::P_ivbL-ilvBN^ValR33的电穿孔，所述菌株含有具有温度敏感复制起点的质粒pKD46。质粒pKD46(Datsenko andWanner，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97:12:6640-45)包括噬菌体λ(GenBank登录号J02459)的2,154nt(31088-33241)DNA片段，其含有在阿拉伯糖诱导型P_araB启动子控制下的λRed同源重组体系的基因(γ、β、exo基因)。质粒pKD46是将PCR产物整合到菌株B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIHmini-Mu::P_ivbL-ilvBN^ValR33的染色体中所必需的。

如下制备电感受态细胞：将大肠杆菌菌株B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIHmini-Mu::P_ivbL-ilvBN^ValR33在含有氨苄青霉素(100mg/l)的LB培养基中于30℃培养过夜，并且将培养物用具有氨苄青霉素和L-阿拉伯糖(1mM)的5ml SOB培养基(Sambrook et al，“Molecular Cloning A Laboratory Manual，SecondEdition”，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))稀释100倍。将细胞在30℃带有通气地培养至OD₆₀₀≈0.6，并且随后通过浓缩100倍和使用冰冷的去离子水洗涤三次来制成电感受态。使用70μl细胞和≈100ng PCR产物进行电穿孔。在电穿孔之后，将细胞与1ml SOC培养基(Sambrook et al，“MolecularCloning A Laboratory Manual，Second Edition”，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989))一起在37℃温育2.5小时，涂布在L-琼脂上并于37℃培养以选择CmR重组体。随后，为了消除pKD46质粒，在含有Cm的L-琼脂上于42℃进行2次传代，并且检测所得菌落对氨苄青霉素的敏感性。

2.ilvBN调节子区修饰的验证

获得克隆B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH mini-Mu::cat-P_L-ilvBN^ValR33，其含有盒mini-Mu::cat-P_L-ilvBN^ValR33与编码在噬菌体λP_L启动子的控制下的反馈抗性AHAS I的突变ilvBN^ValR33操纵子，以Cm抗性基因标记。用以Cm抗性基因标记的P_L启动子取代天然ilvBN调节子区通过PCR验证。将噬菌体Mu右连接特异性引物(right attachment-specific primer)MR74(SEQ ID NO：15)和对氯霉素乙酰转移酶基因特异性的引物Cm-test2(SEQ ID NO：16)在用于验证的PCR中使用。PCR验证的条件如下：94℃变性3分钟；30个循环的程序：94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 1分钟；最终步骤：72℃ 7分钟。使用B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH mini-Mu::cat-P_ivbL-ilvBN^ValR33细胞作为模板，获得的PCR产物长度为586nt(SEQ ID NO：17)。使用B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIHmini-Mu::cat-PL-ilvBN^ValR33细胞作为模板，获得的PCR产物长度为879nt(SEQID NO：18)。测定在10mM L-缬氨酸存在下B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIHmini-Mu::cat-P_L-ilvBN^ValR33菌株中的残余AHAS活性。将这种菌株AHAS活性测定的结果示于表1。

表1.

菌株	AHAS活性，nmol/min mg	10mM L-Val存在下的残余AHAS活性，％
菌株	AHAS活性，nmol/min mg	10mM L-Val存在下的残余AHAS活性，％	B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIHB7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH/pMIV-P_ivbL-ilvBNB7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH/pMIV-P_ivbL-ilvBNu^ValR33B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH mini-Mu::P_ivbL-ilvBN^ValR33B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH mini-Mu::cat-P_L-ilvBN^ValR33	08.11.31.721.5	011928291

实施例6通过具有缬氨酸抗性AHAS I的大肠杆菌菌株产生L-缬氨酸

将两种大肠杆菌菌株B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH mini-Mu::P_ivbL-ilvBN^ValR33和B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH mini-Mu::cat-P_L-ilvBN^ValR33均在L-琼脂平板上于37℃培养18小时。随后将来自大约0.5cm²平板表面的细胞引入发酵培养基(2ml)中并且在试管中带有通气地于32℃培养72小时。对于营养缺陷的AHAS缺陷菌株B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH，将发酵培养基额外补充各100μg/ml的异亮氨酸和缬氨酸。通过TLC测定积累的L-缬氨酸。结果示于表2。

发酵培养基组成(g/l)：

葡萄糖 60.0

(NH₄)₂SO₄ 18.0

KH₂PO₄ 3H₂O 2.0

MgSO₄ 7H₂O 1.0

CaCO₃ 25.0

硫胺素(thiamin) 0.02

豆浓(Mameno) 4.0

表2

菌株	L-缬氨酸，g/l
菌株	L-缬氨酸，g/l	B7B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIHB7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH mini-Mu::P_ivbL-ilvBN^ValR33B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH mini-Mu::cat-P_L-ilvBN^ValR33	002.03.0

如表2所见，缬氨酸抗性AHAS I的表达导致缬氨酸的产生。操纵子P_ivbL-ilvBN^ValR33由转录弱化和环-AMP控制。在大肠杆菌菌株B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH mini-Mu::P_ivbL-ilvBN^ValR33中用噬菌体λ的P_L启动子取代ilvBN^ValR33操纵子的天然调节子区(包括消除编码前导肽的基因(ivbL))将L-缬氨酸的产生增加了1.5倍。

实施例7具有修饰的ilvBN表达的新大肠杆菌AHAS I缬氨酸抗性突变体

通过如实施例5中所述相同的方法在菌株B7 ΔilvIH ΔilvGM(参见参考实施例2，第5部分)中，使用噬菌体λ的P_L启动子取代ilvBN操纵子的天然调节子区。此菌株仅具有AHAS I。所得菌株B7 ΔilvIH ΔilvGM cat-P_L-ilvBN对于缬氨酸是敏感的。从这种菌株获得AHAS I的新缬氨酸抗性自发突变体。将在1g/l缬氨酸上生长较好的菌株进行表征(表3)。

表3

同样获得对异亮氨酸是抗性的缬氨酸抗性突变。获得比活高于野生型比活的变体。如表4中所见，缬氨酸抗性AHAS I的表达导致缬氨酸的产生。发酵培养基含有6％葡萄糖。测定两种最佳突变体ilvBN ValR1和ilvBN ValR4的突变操纵子的核苷酸序列。显示出IlvBN ValR1在IlvN中含有一个点突变：A30P Ala-Pro(用Pro取代在位置30的Ala；用相应的密码子ccc取代gcc)，而IlvBN ValR4也在IlvN中含有一个点突变：N17K Asn-Lys(用Lys取代在位置17的Asn；用相应的密码子aag取代aac)。在两种情况下，这些取代都是罕见的(rare)。

表4

菌株	L-缬氨酸，g/l
菌株	L-缬氨酸，g/l	B7ΔilvIHΔilvGM cat-P_L-ilvBN ValR1B7ΔilvIHΔilvGM cat-P_L-ilvBN ValR4B7ΔilvIHΔilvGM cat-P_L-ilvBN ValR5B7ΔilvIHΔilvGM cat-P_L-ilvBN wt	2.37.63.30

实施例8通过具有缬氨酸抗性AHAS I的大肠杆菌菌株产生L-亮氨酸

将盒cat-P_L-ilvBN ValR4引入产生L-亮氨酸的大肠杆菌菌株57中(俄罗斯专利RU 2140450，VKPM B-7386)。为了这个目的，用生长于供体菌株B7ΔilvIH ΔilvGM cat-P_L-ilvBNValR4上的噬菌体Pl_vir感染菌株大肠杆菌57。在补充氯霉素(20μg/ml)的L-琼脂平板上选择转导物。菌株57于1997年5月19日以保藏号VKPM B-7386保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(RussianNational Collection of Industrial Microorganisms)(VKPM)(Russia，117545Moscow，1 Dorozhny proezd，1)。

如实施例6中所示培养两种大肠杆菌菌株57和57 cat-P_L-ilvBNValR4。通过TLC测定积累的L-亮氨酸。结果示于表5。

表5

菌株	L-亮氨酸，g/l
菌株	L-亮氨酸，g/l	5757cat-P_L-ilvBN ValR4	1.61.9

如表5所示，菌株57cat-P_L-ilvBNValR4产生较大量的L-亮氨酸。

参考实施例1 构建质粒pMIV5JS

根据以下方案构建PMIV-5JS。首先，通过将源自Mu的整合盒在体内整合到质粒pMW1中来构建质粒pM12，所述质粒pMW1是pMW119的衍生物(图4)。合成两种彼此互补的终止子寡核苷酸序列(SEQ ID NO：19和SEQ IDNO：20)。通过在正向(SEQ ID NO：19)和反向(SEQ ID NO：20)将这些合成的寡核苷酸退火而获得终止子thrL。终止子thrL侧翼为位点HindIII和PstI。随后通过将合成的终止子序列Ter(thr)插入到pM12中来构建质粒pM12-ter(thr)，所述pM12已经使用HindIII和Mph1103I消化(图5)。

如下构建intJS整合盒(图6)：

a)使用上游引物(SEQ ID NO：21)(将BglII位点加下划线)，和磷酸化的下游引物(SEQ ID NO：22)通过PCR扩增获得0.12kbp LattL片段。将质粒pMW118-attL-tet-attR-ter_rrnB用作模板(WO2005/010175)；

b)使用磷酸化的上游引物(SEQ ID NO：23)，和下游引物(SEQ ID NO：24)(将PstI位点加下划线)通过PCR扩增获得1.03kbp Cm^R片段。将质粒pACYC184用作模板；

c)使用上游引物(SEQ ID NO：25)(将PstI位点加下划线)，和下游引物(SEQ ID NO：26)(将SacI位点加下划线)通过PCR扩增获得0.16kbp LattR片段。将质粒pMW118-attL-tet-attR-ter_rrnB用作模板；

d)将片段LattL和Cm^R连接并将所得1.15kbp片段LattL-Cm^R纯化；

e)将片段LattL-Cm^R和LattR通过PstI消化、连接，并且将所得1.31kbpLattL-Cm^R-LattR片段纯化；

f)通过将以下两种合成的寡核苷酸退火来获得含有多克隆位点的70bp双链DNA片段(MCS)：具有SEQ ID NO：27中所述序列的寡核苷酸和具有与SEQ ID NO：27互补序列的另一寡核苷酸；

g)将片段LattL-CmR-Latt^R和MCS通过SacI消化、连接，并且将所得1.38kbp盒LattL-Cm^R-LattR-MCS纯化；

在最后的步骤，将片段LattL-Cm^R-LattR-MCS通过BglII和HindIII消化并且克隆到已用BamHI和HindIII消化的pM12-ter(thr)中以产生质粒pMIV-5JS(图7)。

参考实施例2 构建具有失活的乙酰乳酸合酶基因的菌株

1.ilvBN操纵子的缺失

通过首先由Datsenko和Wanner(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97(12)，6640-6645)开发的称为“Red-驱动整合”的方法缺失ilvBN操纵子。根据这种方法，构建与模板质粒中ilvBN操纵子相邻区和赋予氯霉素抗性的基因二者同源的PCR引物ilvBN1(SEQ ID NO：28)和ilvBN2(SEQ ID NO：29)。将质粒pMW-attL-Cm-attR(PCT申请WO05/010175)用作PCR反应中的模板。PCR的条件如下：变性步骤95℃ 3分钟；前两个循环的程序：95℃ 1分钟、34℃30秒、72℃ 40秒；后30个循环的程序：95℃ 30秒、50℃ 30秒、72℃ 40秒；最终步骤：72℃ 5分钟。

将所得的1713bp PCR产物在琼脂糖凝胶中纯化并且用于大肠杆菌菌株MG1655的电穿孔，所述大肠杆菌菌株MG1655包含具有温度敏感复制起点的质粒pKD46。质粒pKD46(Datsenko and Wanner，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97:12:6640-45)包括噬菌体λ(GenBank登录号J02459)的2,154nt(31088-33241)DNA片段，其含有在阿拉伯糖诱导型P_araB启动子控制下的λRed同源重组体系的基因(γ、β、exo基因)。质粒pKD46对于将PCR产物整合到大肠杆菌菌株MG1655的染色体中是必需的。

如下制备电感受态细胞：将在补充氨苄青霉素(100mg/l)的LB培养基中于30℃生长的大肠杆菌MG1655/pKD46过夜培养物使用带有氨苄青霉素和L-阿拉伯糖(1mM)的5ml SOB培养基(Sambrook et al，“Molecular Cloning ALaboratory Manual，Second Edition”，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))稀释100倍。将培养物在30℃通气培养至OD₆₀₀≈0.6并且随后通过浓缩100倍和用冰冷的去离子水洗涤三次而制成电感受态。使用70μl细胞和≈100ng PCR产物进行电穿孔。将电穿孔之后的细胞与1ml SOC培养基(Sambrook et al，“Molecular Cloning A Laboratory Manual，Second Edition”，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))一起于37℃温育2.5小时，涂布于L-琼脂上，并且在37℃培育以选择Cm^R重组体。随后为了消除pKD46质粒，在带有Cm的L-琼脂上于42℃进行2次传代，并且检测所得菌落对氨苄青霉素的敏感性。由此，构建具有失活的ilvBN操纵子的突变菌株MG1655ΔilvBN::cat。

2.通过PCR验证ilvBN操纵子缺失

通过PCR验证具有用Cm抗性基因标记的和缺失ilvBN操纵子的突变体。将基因座特异性引物ilvBNC5(SEQ ID NO：30)和ilvBNC6(SEQ ID NO：31)用于验证PCR中。PCR验证的条件如下：变性步骤94℃ 3分钟；30个循环的程序：94℃ 30秒、53℃ 30秒、72℃ 1分钟；最终步骤：72℃ 7分钟。在使用来自亲本ilvBN⁺菌株MG1655的染色体DNA作为模板的反应中获得的PCR产物长度为2275nt。在使用来自突变的MG1655 ΔilvBN::cat菌株的染色体DNA作为模板的反应中获得的PCR产物长度为1995nt(图8)。

3.ilvIH操纵子的缺失

通过与第1部分中所述缺失ilvBN操纵子相同的方法来缺失ilvIH操纵子。根据这种方法，构建与模板质粒中ilvIH操纵子相邻区和赋予氯霉素抗性的基因二者同源的PCR引物ilvIH1(SEQ ID NO：32)和ilvIH2(SEQ ID NO：33)。将质粒pMW-attL-Cm-attR(PCT申请WO05/010175)用作PCR反应中的模板。PCR的条件如下：变性步骤95℃ 3分钟；前两个循环的程序：95℃ 1分钟、34℃ 30秒、72℃ 40秒；后30个循环的程序：95℃ 30秒、50℃ 30秒、72℃ 40秒；最终步骤：72℃ 5分钟。

将1713bp PCR产物在琼脂糖凝胶中纯化并且用于大肠杆菌菌株MG1655/pKD46的电穿孔。在电穿孔之后选择氯霉素抗性的重组体并使用基因座特异性引物ilvIHC3(SEQ ID NO：34)和ilvIHC4(SEQ ID NO：35)通过PCR验证。PCR验证的条件如下：变性步骤94℃ 3分钟；30个循环的程序：94℃ 30秒、53℃ 30秒、72℃ 1分20秒；最终步骤：72℃ 7分钟。在使用来自亲本IlvIH⁺菌株MG1655B7 ΔilvBN::cat的染色体DNA作为模板的反应中获得的PCR产物长度为2491nt。在使用来自突变的MG1655B7ΔilvBN::cat ΔilvIH::cat菌株的染色体DNA作为模板的反应中获得的PCR产物长度为1823nt。结果获得菌株MG1655 ΔilvIH::cat。

4.ilvGM操纵子的缺失

通过与第1部分中所述缺失ilvBN操纵子相同的方法来缺失ilvGM操纵子。根据这种方法，构建与模板质粒中ilvGM操纵子相邻区和赋予氯霉素抗性的基因二者同源的PCR引物ilvGM1(SEQ ID NO：36)和ilvGM2(SEQ IDNO：37)。将质粒pMW-attL-Cm-attR(PCT申请WO 05/010175)用作PCR反应中的模板。PCR的条件如下：变性步骤95℃ 3分钟；前两个循环的程序：95℃ 1分钟、34℃ 30秒、72℃ 40秒；后30个循环的程序：95℃ 30秒、50℃30秒、72℃ 40秒；最终步骤：72℃ 5分钟。

将1713bp PCR产物在琼脂糖凝胶中纯化并且用于大肠杆菌菌株MG1655/pKD46的电穿孔。在电穿孔之后选择氯霉素抗性的重组体并使用基因座特异性引物ilvGMC3(SEQ ID NO：38)和ilvGMC4(SEQ ID NO：39)通过PCR验证。PCR验证的条件如下：变性步骤94℃3分钟；30个循环的程序：94℃ 30秒、54℃ 30秒、72℃ 1分30秒；最终步骤：72℃ 7分钟。在使用来自亲本菌株MG1655的染色体DNA作为模板的反应中获得的PCR产物长度为2209nt。在使用来自突变MG1655 ΔilvGM::cat菌株的染色体DNA作为模板的反应中获得的PCR产物长度为1941nt。结果获得菌株MG1655ΔilvGM::cat。

5.构建所有乙酰乳酸合基因失活的菌株(ΔilvBN、ΔilvIH和ΔilvGM缺失的组合)

在野生型菌株大肠杆菌K12(VKPM B-7)中通过P1转导(Sambrook et al，“Molecular Cloning A Laboratory Manual，Second Edition”，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989))缺失ilvIH基因(ΔilvIH::cat)。将第3部分中所述的大肠杆菌菌株MG1655ΔilvIH::cat用作供体菌株，并选择CmR转导物。结果获得菌株B7ΔilvIH::cat。为了从B7 ΔilvIH::cat消除氯霉素抗性标记，用质粒pMW118-int-xis(Ap^R)(WO2005/010175)转化细胞。将Ap^R克隆于30℃在含有150mg/l氨苄青霉素的LB琼脂平板上培养。挑取几十个Ap^R克隆检测氯霉素敏感性。通过在LB琼脂平板上于42℃温育将质粒pMW118-int-xis从Cm^S细胞消除。结果，获得菌株B7 ΔilvIH。

在大肠杆菌菌株B7 ΔilvIH中通过P1转导缺失ilvBN基因(ΔilvBN::cat)。将第1部分中所述的菌株大肠杆菌MG1655 ΔilvBN::cat用作供体菌株，并选择CmR转导物。结果获得菌株B7 ΔilvIH ΔilvBN::cat。如上所述将氯霉素抗性标记从B7 ΔilvIH ΔilvBN::cat消除。结果，获得菌株B7 ΔilvIHΔilvBN。

在大肠杆菌菌株B7 ΔilvIH中通过P1转导缺失ilvGM基因(ΔilvGM::cat)。将第4部分中所述的菌株大肠杆菌MG 1655 ΔilvGM::cat用作供体菌株，并选择CmR转导物。结果获得菌株B7 ΔilvIH ΔilvGM::cat。如上所述将氯霉素抗性标记从B7 ΔilvIH ΔilvGM::cat消除。结果，获得菌株B7 ΔilvIH ΔilvGM。菌株B7 ΔilvIH ΔilvGM是原养型的，因此ilvGM基因的缺失不阻止异亮氨酸-缬氨酸操纵子的远端基因(distal genes)的表达。

在大肠杆菌菌株B7 ΔilvIH ΔilvBN中通过P1转导缺失ilvGM基因(ΔilvGM::cat)。将第4部分中所述的菌株大肠杆菌MG1655 ΔilvGM::cat用作供体菌株；选择CmR转导物。结果获得菌株B7 ΔilvIH ΔilvBN ΔilvGM::cat。如上所述将氯霉素抗性标记从B7 ΔilvIHΔilvBNΔilvGM::cat消除。结果，获得菌株B7 ΔilvIHΔilvBNΔilvGM。

虽然已参考本发明的优选实施方案具体描述了本发明，但对于本领域的技术人员显而易见的是，可进行各种修改并可采用等同物而不背离本发明的范围。本文中所有引用的参考文献均作为此申请的一部分并入以供参考。

序列表

<110>味之素株式会社(Ajinomoto Co.，Inc.)

<120>突变乙酰乳酸合酶和用于产生支链L-氨基酸的方法

<130>OP-C7212

<160>39

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>291

<212>DNA

<213>大肠杆菌K12

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(291)

<400>1

<210>2

<211>96

<212>PRT

<213>大肠杆菌K12

<400>2

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>序列:引物ilvBX60

<400>3

<210>4

<211>29

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>序列:引物ilvBR64

<400>4

<210>5

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>序列:引物ML74

<400>5

<210>6

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>序列:引物LattRS1

<400>6

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>序列:引物ilvbS31

<400>7

<210>8

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>序列:引物ilvbS32

<400>8

<210>9

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>序列:引物ilvbS33

<400>9

<210>10

<211>1830

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>序列:突变的ilvBN基因

<400>10

<210>11

<211>45

<212>PRT

<213>截短的蛋白质IlvN33

<400>11

<210>12

<211>64

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>序列:引物ilvB-attR1

<400>12

<210>13

<211>64

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>序列:引物ilvB-PLSD

<400>13

<210>14

<211>1968

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>序列:含有cat基因和PL启动子的DNA片段

<400>14

<210>15

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>序列:引物MR74

<400>15

<210>16

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>序列:引物Cm-test2

<400>16

<210>17

<211>586

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>序列:天然的ilvBN调节区

<400>17

<210>18

<211>879

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>序列:修饰之后的ilvBN调节区

<400>18

<210>19

<211>62

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>正向终止子合成寡核苷酸

<400>19

<210>20

<211>62

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>反向终止子合成寡核苷酸

<400>20

<210>21

<211>37

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>序列:引物

<400>21

<210>22

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>序列:引物

<400>22

<210>23

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>序列:引物

<400>23

<210>24

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>序列:引物

<400>24

<210>25

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>序列:引物

<400>25

<210>26

<211>37

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>序列:引物

<400>26

<210>27

<211>70

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>序列：引物

<400>27

<210>28

<211>64

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物ilvBN1

<400>28

<210>29

<211>64

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物ilvBN2

<400>29

<210>30

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物ilvBNC5

<400>30

<210>31

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物ilvBNC6

<400>31

<210>32

<211>61

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物ilvIH1

<400>32

<210>33

<211>64

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物ilvIH2

<400>33

<210>34

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物ilvIHC3

<400>34

<210>35

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物ilvIHC4

<400>35

<210>36

<211>64

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物ilvGM1

<400>36

<210>37

<211>64

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物ilvGM2

<400>37

<210>38

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物ilvGMC3

<400>38

<210>39

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物ilvGMC4

<400>39

Claims

1.一种细菌乙酰乳酸合酶(AHAS I)的突变小亚基，其包含大肠杆菌的野生型乙酰乳酸合酶小亚基，所述小亚基包含选自下组的突变：

A)将所述野生型乙酰乳酸合酶小亚基中位置17和/或30的L-氨基酸用另外的L-氨基酸取代，

B)将所述野生型乙酰乳酸合酶小亚基中位置44的L-氨基酸下游的N-末端部分用几种L-氨基酸取代，和

C)它们的组合，

而且其中所述乙酰乳酸合酶的突变小亚基对缬氨酸的反馈抑制脱敏。

2.根据权利要求1的细菌乙酰乳酸合酶的突变小亚基，其中将位置17的所述L-氨基酸用赖氨酸残基取代。

3.根据权利要求1的细菌乙酰乳酸合酶的突变小亚基，其中将位置30的所述L-氨基酸用脯氨酸残基取代。

4.根据权利要求1的细菌乙酰乳酸合酶的突变小亚基，其中将位置44的L-氨基酸下游的所述N-末端部分用精氨酸和苯丙氨酸取代。

5.根据权利要求2的细菌乙酰乳酸合酶的突变小亚基，其中用赖氨酸残基取代的位置17的所述L-氨基酸是天冬酰胺。

6.根据权利要求3的细菌乙酰乳酸合酶的突变小亚基，其中用脯氨酸残基取代的位置30的所述L-氨基酸是丙氨酸。

7.根据权利要求4的细菌乙酰乳酸合酶的突变小亚基，其中用精氨酸和苯丙氨酸取代的位置44的所述L-氨基酸是异亮氨酸。

8.一种突变乙酰乳酸合酶，包含根据权利要求1的小亚基。

9.根据权利要求8的突变乙酰乳酸合酶，其中所述突变乙酰乳酸合酶包含大肠杆菌大亚基。

10.根据权利要求8的突变乙酰乳酸合酶，其中小亚基在除了位置17、30和/或44之外的一个或多个位置包括一个或几个氨基酸的缺失、取代、插入或添加，并且其中所述突变乙酰乳酸合酶对缬氨酸的反馈抑制脱敏。

11.一种DNA，其编码根据权利要求1的乙酰乳酸合酶的突变小亚基。

12.一种肠杆菌科的细菌，所述细菌包含根据权利要求11的DNA并且具有产生支链L-氨基酸的能力。

13.根据权利要求12的细菌，其中所述支链L-氨基酸选自下组：L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸。

14.根据权利要求13的细菌，其中将突变乙酰乳酸合酶的活性增强。

15.根据权利要求14的细菌，其中细菌属于埃希氏菌属；

16.根据权利要求15的细菌，其中通过增加突变乙酰乳酸合酶基因的表达来增强突变乙酰乳酸合酶的活性。

17.根据权利要求16的细菌，其中通过选自下组的方法来增加突变乙酰乳酸合酶的活性：

a)增加突变乙酰乳酸合酶基因的拷贝数，

b)修饰所述基因的表达控制序列以使基因的表达增强，和

c)它们的组合。

18.根据权利要求17的细菌，其中通过将突变乙酰乳酸合酶基因的多拷贝整合到细菌的染色体中来增加拷贝数。

19.一种用于产生支链L-氨基酸的方法，其包括在培养基中培养根据权利要求12的细菌，和从培养基中收集支链L-氨基酸。

20.根据权利要求19的方法，其中细菌具有涉及支链L-氨基酸生物合成的基因的增强表达。

21.根据权利要求20的方法，其中所述支链L-氨基酸选自下组：L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸。