WO2020121462A1 - バリン生成能が向上したヒドロゲノフィラス属細菌遺伝子組換え体 - Google Patents

バリン生成能が向上したヒドロゲノフィラス属細菌遺伝子組換え体 Download PDF

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湯川　英明
直人 大谷
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株式会社Ｃｏ２資源化研究所
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    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
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    • C12Y202/01—Transketolases and transaldolases (2.2.1)
    • C12Y202/01006—Acetolactate synthase (2.2.1.6)

Definitions

  • the present invention relates to a hydrogenophyllus bacterium gene recombinant having improved valine producing ability, a method for producing valine using this gene recombinant, and a method for producing the gene recombinant.
  • Japan aims to reduce greenhouse gas emissions such as carbon dioxide and methane by 26% by 2030 compared to 2013.
  • gases such as carbon dioxide, methane, and carbon monoxide are attracting attention as carbon materials having higher sustainability, and valuable chemicals and bio products using microorganisms that utilize these gases.
  • gases such as carbon dioxide, methane, and carbon monoxide are attracting attention as carbon materials having higher sustainability, and valuable chemicals and bio products using microorganisms that utilize these gases.
  • Valine which is one of the essential amino acids for valine production , is a substance useful as a component of medicines, foods, cosmetics, an additive for livestock feed and the like.
  • valine has been produced by a fermentation method or protein hydrolysis.
  • the production of valine by the fermentation method using a renewable resource as a raw material has a very large number of metabolic reaction steps from the sugar as a raw material compared with the production of lactic acid and ethanol, and the valine as a product produces a large amount of metabolic reaction.
  • Low productivity has been a problem in the industrial production of valine due to feedback inhibition of the enzyme.
  • valine is produced from pyruvate, an important intracellular metabolite, through 4 steps. That is, acetolactate synthase (acetolactate synthase) catalytic action produces acetolactate from pyruvic acid, and then ketol acid reducttoisomerase (Ketol acid reductoisomerase) catalytic action produces 2,3-dihydroxyisovaleric acid from acetolactate. It is produced, and then 2-ketoisovaleric acid is produced from 2,3-dihydroxyisovaleric acid by the catalytic action of Dihydroxyacid dehydratase, and finally, a branched-chain amino acid aminotransferase (branched-chain acid aminotransferase). ), the amino group is transferred from glutamic acid to 2-ketoisovaleric acid to produce valine.
  • acetolactate synthase acetolactate synthase catalytic action produces acetolactate from pyruvic acid
  • acetolactate synthases involved in valine biosynthesis.
  • Acetolactate synthase II is resistant to valine
  • acetolactate synthase I and acetolactate synthase III are subject to feedback inhibition by valine. Therefore, in order to produce valine using a microorganism, it is necessary to highly produce acetolactate synthase which is not subject to feedback inhibition by valine.
  • Acetolactate synthase is composed of a large subunit and a small subunit, the large subunit has a catalytic function, and the small subunit has a regulatory function. It is a function of the small subunit that the enzymatic activity of acetolactate synthase is subject to feedback inhibition by valine.
  • Patent Document 1 discloses a technique for producing valine using Escherichia coli in which a gene encoding a small subunit of acetolactate synthase I (ilvN gene) is mutated so as to desensitize feedback inhibition by valine. doing.
  • Patent Document 2 discloses a technique for producing valine using Escherichia coli obtained by mutating a gene encoding the small subunit of acetolactate synthase III (ilvH gene) so as to desensitize feedback inhibition by valine. Is disclosed. However, none of the above methods is a method of producing valine using sugar as a carbon raw material, and not a method of producing valine using carbon dioxide as a carbon raw material.
  • Modification of a gene on the genome For example, when a gene encoding a small subunit of acetolactate synthase I or III is mutated to desensitize feedback inhibition by valine, etc. Marker genes are used as a marker for successful cell selection. As the marker gene, an antibiotic resistance gene or the like is commonly used. Since the cells into which the antibiotic resistance gene has been introduced can grow in the presence of antibiotics, the antibiotic resistance gene is used for selection of cells into which the gene has been introduced, that is, positive selection.
  • marker genes since the types of marker genes are limited, it is necessary to recycle the marker genes when modifying, such as deleting, inserting or substituting genes at multiple locations (locus) on the genome.
  • a positive selection marker such as a drug resistance gene as an index
  • after selecting a gene recombinant in which the target locus has been modified if a cell from which the positive selection marker has been omitted can be selected, another locus will be selected. In, it becomes possible to use the positive selection marker again. Therefore, there is a need for a method for efficiently selecting cells from which the positive selection marker has been omitted.
  • a gene marker that causes cell death by expression that is, counter selection marker may be used. According to this method, by using a positive selection marker and a counter selection marker in combination, by selecting cells that did not die because the counter selection marker was omitted, cells with a positive selection marker omitted were removed together with the counter selection marker. It can be acquired selectively.
  • the levansucrase gene (sacB) derived from Bacillus subtilis is widely used as a counter selection marker.
  • Escherichia coli introduced with the sacB gene cannot grow in the presence of sucrose.
  • Escherichia coli not carrying the sacB gene can be selectively obtained.
  • a method of counter selection utilizing a streptomycin susceptibility gene is also known.
  • a streptomycin-resistant strain appears at a certain frequency even in bacteria that are sensitive to the antibiotic streptomycin.
  • rpsL gene the mutant rpsL gene that causes streptomycin resistance
  • rpsL * the mutant rpsL gene that causes streptomycin resistance
  • the host bacterium becomes streptomycin-sensitive. That is, the wild-type rpsL gene is a dominant gene with respect to the rpsL * gene (streptomycin resistance gene) which is a mutant rpsL gene.
  • the rpsL gene may be called a streptomycin sensitivity gene.
  • a method of counter selection in which a streptomycin resistant strain such as Escherichia coli is obtained, and this streptomycin resistant strain is used as a host, and a wild-type rpsL gene (streptomycin sensitivity gene) is used as a counter selection marker (non-patent document). Reference 1).
  • the present invention uses a hydrogen genus bacterial gene recombinant capable of efficiently producing valine by utilizing carbon dioxide as a sole carbon source, and efficiently producing valine using this genetic recombinant.
  • the first issue is to provide a method.
  • a second object of the present invention is to provide a method for efficiently producing a gene recombinant in a hydrogenophilus bacterium.
  • Hydrogen genus (Hydrogenophilus) bacterium is a hydrogen bacterium that grows by utilizing hydrogen energy to produce organic substances from carbon dioxide. Generally, the growth rate of hydrogen bacteria is extremely slow, but the growth rate of Hydrogenophyllus bacteria is fast, and the carbon dioxide fixing ability is much higher than that of plants and photosynthetic bacteria. Hydrogenophyllus bacterium produces valine, but its productivity is low because valine causes feedback inhibition of metabolic enzymes.
  • the present inventor has extensively investigated the method of gene modification in a hydrogenophilus bacterium, by combining a streptomycin-resistant strain of a hydrogenophilus bacterium and a wild-type rpsL gene (streptomycin susceptibility gene), We have succeeded in carrying out gene recombination of hydrogenophyllus bacteria capable of recycling positive selection markers. That is, the present inventors, in hydrogenophylus bacteria, streptomycin resistant strains can be isolated, and, to the streptomycin resistant strains, the rpsL gene of hydrogenophyllus bacteria can function as a streptomycin sensitive gene, a counter It was found that it can be used as a selection marker.
  • hygromycin phosphotransferase gene As a hygromycin phosphotransferase gene, a gene (hph) encoding the hygromycin B phosphotransferase of Escherichia coli is known (Plasmid-encoded hygromycin B phosphotransferase gene and its expression in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae. Gritz L, Davies J. Gene (1983) 25:179-188).
  • kanamycin genes that confer resistance to kanamycin include the gene that encodes neomycin phosphotransferase of the Escherichia coli transposon Tn5 (nptII) and the gene that encodes kanamycin nucleotidyltransferase of Staphylococcus aureus (knt).
  • nptII neomycin phosphotransferase of the Escherichia coli transposon Tn5
  • knt kanamycin nucleotidyltransferase of Staphylococcus aureus
  • neomycin/kanamycin phosphotransferase gene and the kanamycin nucleotide transferase gene each express a protein that functions in a bacterium of the genus Hydrogenophilus and impart kanamycin resistance.
  • the ilvH gene which encodes the acetolactate synthase III small subunit, is present on the genome of valine-producing hydrogenophilus bacteria. Since acetolactate synthase III is feedback-inhibited by valine, it is expected in the present invention that the gene encoding acetolactate synthase on the genome of hydrogenophilus bacteria is desensitized to feedback inhibition by valine. We tried to introduce mutations.
  • SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of the acetolactate synthase III small subunit of hydrogenophilus bacteria
  • Asn of amino acid number 11 was replaced with Asp, His, or Ala
  • Gly of amino acid number 14 was replaced with Asp, Or replaced with Ala
  • Ser of amino acid number 17 with Phe replaced Asn of amino acid number 29 with Lys, Tyr, Asp, or His
  • Thr of amino acid number 34 with Ile replaced Ala of amino acid number 36 with Val.
  • the present invention has been completed based on the above findings, and provides the following hydrogenophyllus bacterium gene recombinant, a method for producing valine, a method for producing a gene recombinant, and the like.
  • Item 1 Mutant acetolactate synthase III small subunit according to any of (1) to (3) below.
  • Mutant acetolactate synthase III small subunit consisting of a mutant amino acid sequence having any of the following mutations (a) to (h) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (a) Substitution of Asn at amino acid number 11 with Asp, His, or Ala (b) Substitution of Gly at amino acid number 14 with Asp or Ala (c) Substitution of Ser at amino acid number 17 with Phe (d) Substitution of Asn at amino acid number 29 with Lys, Tyr, Asp, or His (e) Substitution of Thr at amino acid number 34 with Ile (f) Substitution of Ala at amino acid number 36 with Val (g) Deletion of all amino acids after Arg of amino acid number 84 (h) Substitution of amino acid number 131 with Leu for Arg (2) A mutant acetolactate synthase comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the mutant amino acid sequence according to (1), having acetolactate synthase III small subunit activity, and being suppressed in feedback inhibition
  • the mutant amino acid sequence has a mutation of (a), the amino acid of amino acid number 11 is Asp, His, or Ala, When the mutant amino acid sequence has the mutation of (b), the amino acid of amino acid number 14 is Asp, or Ala, When the mutant amino acid sequence has a mutation of (c), the amino acid at amino acid number 17 is Phe, When the mutant amino acid sequence has a mutation of (d), the amino acid of amino acid number 29 is Lys, Tyr, Asp, or His, When the mutant amino acid sequence has a mutation of (e), the amino acid at amino acid number 34 is Ile, If the mutant amino acid sequence has a mutation of (f), the amino acid at amino acid number 36 is Val, When the mutant amino acid sequence has a mutation of (g), all amino acids after amino acid number 84 are deleted, When the mutant amino acid sequence has the mutation of (h), the amino acid at amino acid number 131 is Arg.
  • mutant amino acid sequence according to (1) consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added, and having acetolactate synthase III small subunit activity and valine-dependent activity. Feedback inhibition suppressed mutant acetolactate synthase III small subunit (provided that the mutant amino acid sequence has a mutation of (a) amino acid No.
  • a mutant acetolactate synthase III small subunit gene according to any of (4) to (6) below.
  • (4) A gene consisting of a mutant nucleotide sequence having any of the following mutations (i) to (p) in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2
  • (i) Substitution of AAC having base numbers 31 to 33 with GAT, GAC, CAT, CAC, GCT, GCC, GCA, or GCG
  • k Substitution of TCG having base numbers 49 to 51 with TTT or TTC
  • l Substitution of AAC having base numbers 85 to 87 with AAA, AAG, TAT, TAC, GAT, GAC, CAT, or CAC
  • (m) Substitution of ACC of base numbers 100 to 102 with ATT, ATC, or ATA
  • (n) Substitution of GCA of nucleotide numbers 106 to 108 with
  • a gene encoding the acetolactate synthase III small subunit (however, if the mutant base sequence has the mutation (i), the bases of base numbers 31 to 33 are GAT, GAC, CAT, CAC, GCT, GCC, GCA, or GCG, When the mutant base sequence has the mutation (j), the bases of base numbers 40 to 42 are GAT, GAC, GCT, GCC, GCA, or GCG, When the mutant base sequence has a mutation of (k), the bases of base numbers 49 to 51 are TTT or TTC, When the mutant base sequence has a mutation of (l), the bases of base numbers 85 to 87 are AAA, AAG, TAT, TAC, GAT, GAC, CAT, or CAC, When the mutant base sequence has a mutation of (m), the bases of base numbers 100 to 102 are ATT, ATC, or ATA, When the mutant base sequence has the mutation (n), the bases of base numbers 106 to 108 are GTT, GTC, GTA, or GTG, When the mutant
  • the mutant base sequence has the mutation (i)
  • the bases of base numbers 31 to 33 are GAT, GAC, CAT, CAC, GCT, GCC, GCA) , Or GCG
  • the mutant base sequence has the mutation (j)
  • the bases of base numbers 40 to 42 are GAT, GAC, GCT, GCC, GCA, or GCG
  • the mutant base sequence has a mutation of (k)
  • the bases of base numbers 49 to 51 are TTT or TTC
  • the mutant base sequence has a mutation of (l)
  • the bases of base numbers 85 to 87 are AAA, AAG, TAT, TAC, GAT, GAC, CAT, or CAC
  • the mutant base sequence has a mutation of (m)
  • the bases of base numbers 100 to 102 are ATT, ATC, or ATA
  • the mutant base sequence has the mutation (n)
  • the bases of base numbers 106 to 108 are GTT, GTC, GTA, or GTG
  • Item 3 A bacterium belonging to the genus Hydrogenophyllus that produces the mutant acetolactate synthase III small subunit according to Item 1.
  • Item 4. A bacterium belonging to the genus Hydrogenophyllus having the mutant acetolactate synthase III small subunit gene according to Item 2.
  • Item 5. A method for producing valine, which comprises the step of culturing the hydrogenophilus bacterium according to Item 3 or 4 using carbon dioxide as a substantially sole carbon source.
  • Item 6. A counter selection marker for a bacterium of the genus Hydrogenophilus, which comprises the streptomycin susceptibility gene of the following (7), (8), or (9).
  • Streptomycin sensitivity gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 is a gene consisting of a nucleotide sequence having 90% or more identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, and encodes a polypeptide having an activity of sensitizing a streptomycin-resistant strain of a hydrogenophilus bacterium to streptomycin.
  • gene (9) a polypeptide having an activity of hybridizing to a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 under stringent conditions, and imparting streptomycin sensitivity to a streptomycin-resistant strain of a hydrogenophilus bacterium.
  • Item 8. (A) between the 5'-terminal region and the 3'-terminal region of a DNA fragment consisting of a mutant target gene of hydrogenophilus bacterium, a DNA fragment containing a streptomycin sensitivity gene, and a DNA fragment containing a positive selection marker gene
  • a step of producing a DNA fragment for labeling in which a marker cassette in which and are linked is inserted, (B) this labeling DNA fragment, an operation of introducing into a streptomycin-resistant strain of hydrogenophyllus bacterium, with the index of having the property of the positive selection marker, the target gene of this streptomycin-resistant strain is A step of selecting a gene recombinant substituted with a DNA fragment for labeling, (C) a DNA fragment consisting of the mutant target gene of hydrogenophil
  • Item 9. The method according to Item 8, wherein the streptomycin sensitivity gene is the gene of (7), (8), or (9) below.
  • Streptomycin sensitivity gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 (8) is a gene consisting of a nucleotide sequence having 90% or more identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, and encodes a polypeptide having an activity of sensitizing a streptomycin-resistant strain of a hydrogenophilus bacterium to streptomycin.
  • gene (9) a polypeptide having an activity of hybridizing to a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 under stringent conditions, and imparting streptomycin sensitivity to a streptomycin-resistant strain of a hydrogenophilus bacterium.
  • E the circular DNA for labeling, an operation of introducing into a streptomycin resistant strain of Hydrogenophyllus bacterium, with the index having the property of the positive selection marker, the target gene of this streptomycin resistant strain, A step of selecting a genetic recombinant in which the labeling circular DNA is inserted in a linear form
  • G A method for producing a gene recombinant of a bacterium of the genus Hydrogenophilus, which comprises the step of selecting a gene re
  • streptomycin sensitivity gene is the gene of (7), (8), or (9) below.
  • Streptomycin sensitivity gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 (8) is a gene consisting of a nucleotide sequence having 90% or more identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, and encodes a polypeptide having an activity of sensitizing a streptomycin-resistant strain of a hydrogenophilus bacterium to streptomycin.
  • gene (9) a polypeptide having an activity of hybridizing to a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 under stringent conditions, and imparting streptomycin sensitivity to a streptomycin-resistant strain of a hydrogenophilus bacterium.
  • Hygromycin resistance gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4
  • a gene consisting of a nucleotide sequence having 90% or more identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, and a gene encoding a polypeptide having an activity of imparting hygromycin resistance to a hydrogenophilus bacterium
  • (12) a gene that hybridizes with a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 under stringent conditions, and encodes a polypeptide having an activity of conferring hygromycin resistance to a hydrogenophilus bacterium Item 13.
  • a positive selection marker for a bacterium of the genus Hydrogenophyllus which comprises the kanamycin resistance gene of (13), (14), or (15) below.
  • Kanamycin resistance gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 or 6
  • a gene consisting of a nucleotide sequence having 90% or more identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 or 6, and a gene encoding a polypeptide having an activity of imparting kanamycin resistance to a hydrogenophilus bacterium (15) encodes a polypeptide which hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 or 6 and has an activity of imparting kanamycin resistance to a hydrogenophyllus bacterium gene
  • Hydrogen bacterium is a bacterium that can grow using carbon dioxide as the sole carbon source by utilizing the chemical energy generated by the reaction of hydrogen and oxygen, and can produce chemical products using a mixed gas of oxygen, hydrogen, and carbon dioxide as a raw material. , Carbon dioxide can be efficiently organized, and can be cultured in a simple medium. Generally, the growth of hydrogen bacteria is slow, but the growth rate of hydrogenophilus bacteria, Hydrogenophyllus, is remarkably high. In “Mitsubishi Research Institute Report No.34 1999", hydrogenophyllus bacteria are described as "This growth ability is so high that it cannot be compared with the carbon dioxide fixing ability of plants, and that the microorganisms have a high carbon dioxide fixing ability. It tells the truth.”
  • Hydrogenophilus bacteria produce the amount of valine required for survival, but not the industrially available amount of valine.
  • the gene recombinant of the present invention can efficiently produce valine by introducing a mutation into a gene relating to valine production on the genome of a bacterium belonging to the genus Hydrogenophilus.
  • the hydrogenophyllus bacterium has a particularly excellent carbon dioxide-fixing ability among organisms having a carbon dioxide-fixing ability. Therefore, when the gene recombinant of the present invention is used, industrially, carbon dioxide Can be fixed to produce valine.
  • a hygromycin resistance gene and a kanamycin resistance gene which can be used as a positive selection marker in a hydrogenophilus bacterium are provided.
  • a streptomycin susceptibility gene that can be used as a counterselection marker in combination with a streptomycin resistant strain of a hydrogenophilus bacterium is provided. This opened the way for gene recombination and genome modification of Hydrogenophyllus bacteria.
  • the discovery of a streptomycin susceptibility gene that can be used as a counter selection marker has made it possible to repeatedly carry out gene recombination of a bacterium of the genus Hydrogenophilus, which has enabled the genome to be modified on a large scale.
  • Mutant acetolactate synthase III small subunit consisting of a mutant amino acid sequence having any of the following mutations (a) to (h) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (a) Substitution of Asn at amino acid number 11 with Asp, His, or Ala (b) Substitution of Gly at amino acid number 14 with Asp or Ala (c) Substitution of Ser at amino acid number 17 with Phe (d) Substitution of Asn at amino acid number 29 with Lys, Tyr, Asp, or His (e) Substitution of Thr at amino acid number 34 with Ile (f) Substitution of Ala at amino acid number 36 with Val (g) Deletion of all amino acids after Arg of amino acid number 84 (h) Substitution of amino acid number 131 with Leu for Arg SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of the natural acetolactate synthase III small subunit of Hydrogenophilus thermoluteolus.
  • amino acid sequence identity is a value calculated by GENETYX ver.17 (manufactured by GENETYX Corporation).
  • mutant amino acid sequence according to (1) which consists of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added, and has acetolactate synthase III small subunit activity and valine-dependent activity. Feedback inhibition suppressed mutant acetolactate synthase III small subunit (provided that the mutant amino acid sequence has a mutation of (a) amino acid No.
  • examples of the plurality include 1 to 5, particularly 1 to 3, particularly 1 to 2, and particularly 1.
  • Acetolactate synthase produces acetolactate from pyruvate.
  • the test polypeptide has acetolactate synthase III small subunit activity by detecting acetolactate synthase activity in the presence of acetolactate synthase III large subunit.
  • the test polypeptide suppresses feedback inhibition by valine. If the test polypeptide improves acetolactate synthase activity even in the presence of valine at that concentration in the presence of valine at a concentration higher than that of wild-type (natural type) acetolactate synthase III in the presence of a large subunit of acetolactate synthase III. , It is determined that the feedback inhibition by valine is suppressed.
  • Examples of the recombinant gene of Hydrogenophilus bacterium of the present invention include those having the mutant acetolactate synthase III small subunit gene of any of the following (4) to (6) on the genome.
  • the mutant acetolactate synthase III small subunit gene of any of the following (4) to (6) on the genome.
  • the natural acetolactate synthase III small subunit gene on the genome is replaced with the mutant acetolactate synthase III small subunit gene of any of (4) to (6) below.
  • a gene consisting of a mutant nucleotide sequence having any of the following mutations (i) to (p) in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 (i) Substitution of AAC having base numbers 31 to 33 with GAT, GAC, CAT, CAC, GCT, GCC, GCA, or GCG (j) Substitution of GGC of base numbers 40 to 42 with GAT, GAC, GCT, GCC, GCA, or GCG (k) Substitution of TCG having base numbers 49 to 51 with TTT or TTC (l) Substitution of AAC having base numbers 85 to 87 with AAA, AAG, TAT, TAC, GAT, GAC, CAT, or CAC (m) Substitution of ACC of base numbers 100 to 102 with ATT, ATC, or ATA (n) Substitution of GCA of nucleotide numbers 106 to 108 with GTT, GTC, GTA, or GTG (o) Substitution of CGC of base number 250 to 252 with TAA, TAG,
  • the mutant base sequence has a mutation of (i)
  • the base number is 31-33 bases are GAT, GAC, CAT, CAC, GCT, GCC, GCA, or GCG
  • the mutant base sequence has the mutation (j)
  • the bases of base numbers 40 to 42 are GAT, GAC, GCT, GCC, GCA, or GCG
  • the mutant base sequence has a mutation of (k)
  • the bases of base numbers 49 to 51 are TTT or TTC
  • the mutant base sequence has a mutation of (l)
  • the bases of base numbers 85 to 87 are AAA
  • nucleotide sequence identity is a value calculated by GENETYX ver.17 (manufactured by GENETYX Corporation).
  • a gene encoding a mutant acetolactate synthase III small subunit (however, if the mutant base sequence has the mutation of (i), the bases 31-33 are GAT, GAC, CAT, CAC, GCT, GCC, GCA) , Or GCG,
  • the mutant base sequence has the mutation (j) the bases of base numbers 40 to 42 are GAT, GAC, GCT, GCC, GCA, or GCG,
  • the mutant base sequence has a mutation of (k) the bases of base numbers 49 to 51 are TTT or TTC
  • the mutant base sequence has a mutation of (l) the bases of base numbers 85 to 87 are AAA, AAG, TAT, TAC, GAT, GAC, CAT, or CAC
  • the mutant base sequence has a mutation of (m) the bases of base numbers 100 to 102 are ATT, ATC, or ATA
  • the mutant base sequence has the mutation (n) the bases of base numbers 106 to 108 are GTT, GTC, GTA, or GTG
  • stringent conditions means that hybridization is carried out in a hybridization solution having a salt concentration of 6 ⁇ SSC at a temperature of 50 to 60° C. for 16 hours and then in a solution having a salt concentration of 0.1 ⁇ SSC. The conditions under which cleaning is performed.
  • the bacteria belonging to the genus Hydrogenophyllus include Hydrogenophyllum thermophilus, Hydrogenophilus halorhabdus, Hydrogenophyllus denitrificans, Hydrogenophilus hirschii, and Hydrogenophyllus hirschii.
  • Philus islandicas Hydrogenophyllus islandicus
  • hydrogenophyllus bacterium Mar3 strain Hydrogenophyllus sp. Mar3 strain.
  • Hydrogenophyllus thermolteolus is preferable in that it has a top-level growth rate as a carbonic acid-fixing microorganism and thus has a carbonic acid-fixing ability. Hydrogenophyllus can easily be isolated from anywhere on the globe.
  • a TH-1 (NBRC 14978) strain is mentioned as a preferable strain of Hydrogenophyllus thermolteolus.
  • Hydrogenophyllus thermolteolas TH-1 (NBRC 14978) strain shows the top growth rate as a carbonic acid-fixing microorganism [Agricultural and Biological Chemistry, 41, 685-690 (1977)].
  • the Hydrogenophyllus thermolteolas NBRC 14978 strain has been internationally deposited under the Budapest Treaty and is publicly available.
  • an inorganic medium or an organic medium is supplied while supplying a mixed gas containing hydrogen, oxygen and carbon dioxide.
  • the transformant may be cultured using the medium.
  • the gas to be supplied is preferably a mixed gas of hydrogen, oxygen and carbon dioxide, but different gases may be mixed in the range where valine can be efficiently produced.
  • Hydrogenophyllus can grow using hydrogen as an energy source and carbon dioxide as the only carbon source. Therefore, in particular, using substantially only carbon dioxide as a carbon source (in particular, using only carbon dioxide) By producing the above compound, carbon dioxide can be efficiently fixed.
  • an inorganic medium that does not contain a carbon source such as organic matter or carbonate, that is, to culture substantially only carbon dioxide as a carbon source (in particular, carbon dioxide only as a carbon source).
  • substantially only carbon dioxide as a carbon source includes the case where an unavoidable amount of another carbon source is mixed. It is also possible to use a medium that does not supply carbon dioxide but contains organic substances such as sugars, organic acids and amino acids, and carbonates.
  • the pH of the medium is preferably 6.2 to 8, more preferably 6.4 to 7.4, and even more preferably 6.6 to 7. Within this range, the growth of the bacteria and the dissolution of the mixed gas in the medium are good, and valine can be efficiently produced.
  • the mixed gas may be enclosed in a closed culture container and subjected to static culture or shake culture.
  • shake culture while continuously supplying the mixed gas to the closed culture container.
  • the transformant may be cultured while introducing the mixed gas into the medium by bubbling using a closed culture container. Shaking culture is preferred because it improves the dissolution of the mixed gas in the medium.
  • the volume ratio (hydrogen:oxygen:carbon dioxide) of hydrogen, oxygen and carbon dioxide in the supply gas is preferably 1.75 to 7.5:1:0.25 to 3, more preferably 5 to 7.5:1:1 to 2, and 6.25 to Even more preferred is 7.5:1:1.5. Within this range, the growth of the bacterium is good and the target compound can be efficiently produced.
  • the supply rate of the mixed gas or the raw material gas may be 10.5 to 60 L/hour, 10.5 to 40 L/hour, and particularly 10.5 to 21 L/hour per 1 L of the culture medium.
  • the transformant can grow well, valine can be efficiently produced, and waste of the mixed gas can be suppressed.
  • the culture temperature is preferably 35 to 55°C, more preferably 37 to 52°C, even more preferably 50 to 52°C. Within this range, the transformant can grow well and valine can be efficiently produced.
  • valine can be recovered by recovering the reaction solution, valine can also be separated from the reaction solution by a known method. Examples of such known methods include an ion exchange resin method, a concentration method, a crystallization method, and an activated carbon adsorption elution method.
  • a mutant gene is prepared by PCR or the like, and a bacterium is transformed with DNA containing this mutant gene to obtain a mutant gene and a gene on the genome.
  • Genes on the chromosome can be replaced with mutant genes by causing homologous recombination with and. That is, a mutation can be introduced into a gene on the chromosome.
  • the enzyme protein encoded by the mutant gene has a three-dimensional structure different from that of the wild-type enzyme protein and has a changed function. The modification of the gene on the genome using such homologous recombination has not been preceded by hydrogenophyllus bacteria.
  • a counter selection method utilizing a streptomycin resistant strain and a streptomycin susceptibility gene was developed, and a site-specific marker incorporation by homologous recombination and a marker by homologous recombination in the second step.
  • the gene was modified based on the principle of omission.
  • the streptomycin sensitivity gene of (7), (8), or (9) below is used as a counter selection marker.
  • These streptomycin susceptibility genes function in hydrogenophilus bacteria.
  • Streptomycin sensitivity gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 (8) A gene consisting of a nucleotide sequence having 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, and hydrogeno A gene encoding a polypeptide having an activity of conferring streptomycin sensitivity to a streptomycin-resistant strain of a bacterium of the genus Fir.
  • streptomycin susceptibility genes of (8) and (9) include the following genes (r), (s), and (t).
  • Preferred promoters for expressing the marker gene in the hydrogenophilus bacterium include tac promoter, lac promoter, trc promoter, or Oxford Genetics OXB1, OXB11 to OXB20 promoters, and the like. , The rrnB T1T2 terminator of the E. coli rRNA operon, and the bacteriophage ⁇ t0 transcription terminator.
  • the test gene is a gene encoding a polypeptide having an activity of conferring streptomycin sensitivity to a streptomycin-resistant strain of a bacterium belonging to the genus Hydrogenophilus means that the streptomycin-resistant strain introduced with the test gene is a wild-type hydrogenophilus. Confirm that the growth is inhibited in the presence of streptomycin (50 ⁇ g/mL or more) to the same extent as the genus bacteria.
  • Examples of the method for producing a gene recombinant of a hydrogenophyllus bacterium using the above counter selection marker include a method including the following steps (A) to (C) (first method, FIG. 1).
  • a step of producing a DNA fragment for labeling in which a marker cassette in which and are linked is inserted,
  • this labeling DNA fragment, an operation of introducing into a streptomycin-resistant strain of hydrogenophyllus bacterium, with the index of having the property of the positive selection marker, the target gene of this streptomycin-resistant strain is A step of selecting a gene recombinant substituted with a DNA fragment for labeling,
  • a site-directed mutagenesis method for introducing a target mutation (substitution, deletion, or addition (including insertion)) into a target gene is well known.
  • the mutation is a target gene of hydrogenophyllus bacterium You can get what was introduced.
  • the target gene is divided into two 5'-terminal side region and 3'-terminal side region, each is amplified by PCR, either one or both regions, respectively 1 or multiple mutations are introduced. Good.
  • the amplified 5′-terminal region and 3′-terminal region may be linked to a vector such as Escherichia coli that can be used in a host.
  • the marker cassette is a streptomycin-sensitive gene that functions in a bacterium belonging to the genus Hydrogenophilus, and a positive selection marker gene that functions in a bacterium belonging to the genus Hydrogenophilus, adjacent to each other or sandwiching a DNA of about 10,000 base pairs or less. It is a connection.
  • a marker cassette may be inserted between the 5'terminal region and the 3'terminal region of the mutant target gene. ..
  • a host may be transformed with the obtained vector and this vector may be extracted from the transformant according to a conventional method.
  • the 5'-terminal region and the 3'-terminal region of the mutant target gene may be linearized by cutting with a restriction enzyme to obtain a labeling DNA fragment. Cleavage is performed so that the marker cassette is sandwiched between the 5′-terminal region and the 3′-terminal region of the mutant target gene.
  • the gene of (7), (8), or (9) above can be used as the streptomycin susceptibility gene that functions in bacteria of the genus Hydrogenophilus.
  • a positive selection marker gene that functions in the genus Hydrogenophilus has never been known.
  • the hygromycin resistance gene of the following (10), (11) or (12) functions in a bacterium of the genus Hydrogenophilus and can be used as a positive selection marker.
  • Hygromycin resistance gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4
  • a gene comprising a nucleotide sequence having 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, and hydrogeno
  • a gene encoding a polypeptide having an activity of conferring hygromycin resistance to a bacterium belonging to the genus Philus
  • (12) a gene that hybridizes with a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 under stringent conditions, and encodes a polypeptide having an activity of conferring hygromycin resistance to a hydrogenophilus bacterium
  • the test gene is a gene encoding a polypeptide having an activity of imparting hygromycin resistance to a hydrogenophyllus bacterium, that the hydrogenophyllus bacterium into which the test gene was introduced is a wild type before the introduction of the test gene.
  • the growth in the presence of hygromycin (100 ⁇ g/mL) is improved (e.g. However, it can be grown in the presence of hygromycin (100 ⁇ g/mL)).
  • Kanamycin resistance gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 or 6
  • 90% or more preferably 95% or more, more preferably 98% or more, even more preferably 99% or more
  • a gene consisting of a nucleotide sequence having an identity of 90% or more with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 or 6, and A gene encoding a polypeptide having an activity of conferring kanamycin resistance to a genus Hydrogenophilus.
  • the test gene is a gene encoding a polypeptide having an activity of imparting kanamycin resistance to a hydrogenophyllus bacterium, that the hydrogenophyllus bacterium into which the test gene was introduced is Improved growth in the presence of kanamycin (50 ⁇ g/mL) compared to hydrogenophyllus bacteria (for example, unlike wild-type hydrogenophyllus bacteria before test gene transfer, Confirm that it can grow in the presence of kanamycin (50 ⁇ g/mL).
  • a positive selection marker A gene recombinant having acquired the property, for example, a gene recombinant resistant to hygromycin or kanamycin may be selected.
  • the host is a streptomycin-resistant strain of a genus Hydrogenophilus.
  • Streptomycin-resistant strains usually appear at a fixed ratio by coating a solid medium containing streptomycin in an amount of about 50 to 500 ⁇ g/mL with a bacterial solution of Hydrogenophyllus and culturing. Perform the operation of introducing the labeling DNA fragment into the streptomycin resistant strain, and select the gene recombinant in which the target gene on the genome of the streptomycin resistant strain is replaced with the labeling DNA fragment using the property of the positive selection marker as an index. ..
  • the labeling DNA fragment to be introduced may have additional nucleotides added to both ends (5' end of the 5'end region of the mutant target gene, and 3'end of the 3'end region of the mutant target gene). Good. The resulting recombinant is streptomycin sensitive.
  • DNA can be introduced into cells of the genus Hydrogenophilus by known methods such as calcium chloride method, calcium phosphate method, DEAE-dextran-mediated transfection method, and electric pulse method.
  • a method for producing a gene recombinant of a hydrogenophyllus bacterium using the counter selection marker a method including the following steps (D) to (G) is also included (second method, Figure 2).
  • D a DNA fragment of a mutant target gene of Hydrogenophilus bacterium, and a step of producing a labeling circular DNA containing a marker cassette in which a DNA fragment containing a streptomycin sensitivity gene and a DNA fragment containing a positive selection marker gene are linked
  • E the circular DNA for labeling, an operation of introducing into a streptomycin resistant strain of Hydrogenophyllus bacterium, with the index having the property of the positive selection marker, the target gene of this streptomycin resistant strain, A step of selecting a genetic recombinant in which the labeling circular DNA is inserted in a linear form
  • F From the gene recombinants, a step of selecting a gene recombinant in which the region of the labeling DNA inserted on
  • (F) Counter selection from among the recombinants obtained, a strain that became streptomycin resistant, preferably streptomycin resistant, and by selecting a strain that has lost the property of a positive selection marker, mutation on the genome
  • a second homologous recombination occurs between the target gene and the natural target gene to obtain a gene recombinant in which the region between both genes has been eliminated.
  • the target gene on the genome of the resulting recombinant may be of a natural type or a mutant type.
  • homologous recombination occurs in the same region where the first homologous recombination occurs in the 5'terminal region or 3'terminal region of the target gene, the target gene becomes a wild type and 5'of the target gene.
  • the target gene has a mutation introduced therein.
  • step (G) Selection of Genetic Recombinant Having Mutant Target Gene From the gene recombinants obtained in the step (F), a strain in which the desired mutation is introduced into the target gene is selected.
  • the base sequence of the target gene of the obtained gene recombinant may be determined to confirm that the mutation has been introduced.
  • the target gene is the acetolactate synthase III small subunit gene, and the mutant target gene of interest has a mutant acetolactate synthase III small subunit activity and a mutant acetolactate synthase III small subunit in which feedback inhibition by valine is suppressed.
  • a strain having improved growth in the presence of valine may be selected as compared with a wild strain of a genus Hydrogenophyllus subjected to mutation.
  • the mutant acetolactate synthase III small subunit gene consisting of a nucleotide sequence in which GGC of nucleotide numbers 40 to 42 of SEQ ID NO: 2 is replaced with GAC is designed to include a recognition sequence for the restriction enzyme MluI by mutation. .. Therefore, in the gene recombinant obtained in step (F), the target gene may be amplified by colony PCR, and it may be confirmed that the amplified DNA fragment is cleaved by the restriction enzyme MluI.
  • the positive selection marker and the counter selection marker that function in the bacterium of the genus Hydrogenophilus it has become possible to modify the gene on the genome using homologous recombination.
  • the hydrogenophyllus bacterium gene recombinant having improved valine-producing ability of the present invention can also be produced by the method described above.
  • the number of positive selection markers that can be used in hydrogenophilus bacteria is limited, by combining a positive selection marker and a counter selection marker, it is possible to repeatedly perform gene recombination operations, Can modify multiple genes on the genome.
  • a medium containing carbonate as a carbon source may be used.
  • the mixed gas may be enclosed or continuously supplied in a closed culture container and dissolved in the medium by shaking culture, and the culture container may be a closed type or an open type, and dissolved in the medium by bubbling.
  • the volume ratio (hydrogen:oxygen:carbon dioxide) of hydrogen, oxygen and carbon dioxide in the supply gas is preferably 1.75 to 7.5:1:0.25 to 3, more preferably 5 to 7.5:1:1 to 2, and 6.25 to Even more preferred is 7.5:1:1.5.
  • the culture temperature is preferably 35 to 55°C, more preferably 37 to 52°C, even more preferably 50 to 52°C.
  • TH-1 strain A liquid medium [(NH 4) 2 SO 4 3.0 g , KH 2 PO 4 1.0 g, K 2 HPO 4 2.0 g, NaCl 0.25 g, FeSO 4 /7H 2 O 0.014 g, MgSO 4 /7H 2 O 0.5 g, CaCl 2 0.03 g, MoO 3 4.0 mg, ZnSO 4 ⁇ Dissolve 7H 2 O 28 mg, CuSO 4 /5H 2 O 2.0 mg, H 3 BO 3 4.0 mg, MnSO 4 /5H 2 O 4.0 mg, CoCl 2 /6H 2 O 4.0 mg in distilled water 1 L (pH 7.0) ] A test tube containing 5 mL was inoculated with a platinum loop, the test tube was filled with a mixed gas of H 2 :O 2
  • the cells were cultured at 50°C for 60 hours in a chamber filled with the mixed gas of.
  • Genomic DNA was extracted from a wild strain of TH-1 strain (streptomycin-sensitive strain) by a conventional method. Using the extracted genomic DNA as a template, a DNA fragment encoding the S12 ribosomal protein and containing the rpsL gene, which is a streptomycin-sensitive gene, was amplified by the PCR method. The following primers were used for PCR. PCR was carried out by a conventional method using "DNA Thermal Cycler" manufactured by Life Technologies, using KOD FX Neo (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) as a reaction reagent.
  • Primer for TH-1 strain wild-type rpsL gene amplification (a-1) 5'-AT ACGCGT CCTCCGATGCGTCGTAAGGGAAACGTC-3' (SEQ ID NO: 7) (b-1) 5'-ATA GTCGAC TTATTTCTTGCCCGCAGCGGCGCCCG-3' (SEQ ID NO: 8)
  • the primer (a-1) has a MluI restriction enzyme site added, and the primer (b-1) has a SalI restriction enzyme site added.
  • hph gene amplification primer (a-2) 5'-ATA CTCGAG GAGATGACGTTGGAGGGGCAAGGTCG-3' (SEQ ID NO: 9)
  • (b-2) 5'-AT ACGCGT CTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTGCT-3' (SEQ ID NO: 10)
  • the primer (a-2) has an XhoI restriction enzyme site added
  • the primer (b-2) has an MluI restriction enzyme site added.
  • the reaction solution generated by each PCR was subjected to electrophoresis using 1% agarose gel.
  • a DNA fragment of about 0.5-kbp corresponding to the rpsL gene was obtained.
  • a DNA fragment of about 1.0-kbp corresponding to the hph gene was detected.
  • a DNA fragment containing the rpsL gene thus prepared was digested with the restriction enzyme SalI, a DNA fragment containing the hph gene was digested with the restriction enzyme XhoI, and the Escherichia coli plasmid vector pUC19 (GenBank: M77789.2) digested with the restriction enzyme SmaI was used. After mixing, they were ligated to each other using T4 DNA ligase (Takara Bio Inc.). Escherichia coli JM109 was transformed with the obtained ligation solution by the calcium chloride method, and applied to LB agar medium containing 50 ⁇ g/mL of ampicillin and 50 ⁇ g/mL of hygromycin.
  • the growing strain on the medium was subjected to liquid culture by a conventional method, plasmid DNA was extracted from the culture, and this plasmid was cleaved with restriction enzyme MluI to confirm the inserted fragment.
  • MluI restriction enzyme
  • an approximately 1.5-kbp DNA fragment corresponding to the sequence in which the rpsL gene and the hph gene were linked was observed.
  • the constructed plasmid containing the marker cassette in which the rpsL gene and the hph gene were linked was designated as pUC-Sm s ⁇ Hm r .
  • mutant ilvH gene [ilvH(G14D)] 5 of mutant ilvH gene [ilvH(G14D)] was prepared using the genomic DNA of the wild strain of TH-1 strain extracted in (2-1) as a template. DNA fragments containing the'side region and the 3'side region were each amplified by the PCR method. The following primers were used for PCR. Since the primer contains a sequence corresponding to the G14D mutation, the DNA region of the mutant ilvH gene [ilvH(G14D)] having the G14D mutation introduced therein can be amplified by amplifying the region of the ilvH gene with these primers. PCR was carried out by a conventional method using "DNA Thermal Cycler" manufactured by Life Technologies, using KOD FX Neo (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) as a reaction reagent.
  • Primer for amplification of 5'side region of ilvH (G14D) gene (a-3) 5'-AT GAATTC CCCGGAAGCGACAAGCAGTTCCTGGGG-3' (SEQ ID NO: 11) (b-3) 5'-ACA ACGCGT CCGATTCGTTTTCCACCAGCAGTGCA-3' (SEQ ID NO: 12)
  • the primer (a-3) has an EcoRI restriction enzyme site added, and the primer (b-3) has an MluI restriction enzyme site added.
  • the nucleotide at the 9th position from the 5'end of SEQ ID NO: 12 in (b-3) is the mutation site.
  • Primer for amplification of 3'side region of ilvH (G14D) gene (a-4) 5'-CGG ACGCGT TGTCGCGCATCGCCGGGCTCTTTTCG-3' (SEQ ID NO: 13) (b-4) 5'-TT CTGCAG GCGCTTTGCCGCTTTGGTCCTGATGCA-3' (SEQ ID NO: 14)
  • the primer (a-4) has a MluI restriction enzyme site added, and the primer (b-4) has a PstI restriction enzyme site added.
  • the fourth nucleotide from the 5'end of SEQ ID NO: 13 of (a-4) is the mutation site.
  • the thus prepared ilvH(G14D) gene 5'side region DNA fragment was digested with restriction enzymes EcoRI and MluI, and the mutant ilvH(G14D) gene 3'side region DNA fragment was digested with restriction enzymes MluI and PstI.
  • PUC19 vector cut with restriction enzymes EcoRI and PstI and mixed with each other using T4 DNA ligase (Takara Bio Inc.).
  • Escherichia coli JM109 was transformed with the obtained ligation solution by the calcium chloride method and applied to LB agar medium containing 50 ⁇ g/mL of ampicillin.
  • the growing strain on the medium was subjected to liquid culture by a conventional method, plasmid DNA was extracted from the culture, and this plasmid was cleaved with restriction enzymes EcoRI and PstI to confirm the inserted fragment.
  • restriction enzymes EcoRI and PstI As a result, in addition to the approximately 2.7-kbp DNA fragment of the pUC19 vector, an approximately 2.0-kbp DNA fragment corresponding to the sequence in which the 5'side region and the 3'side region of the ilvH(G14D) gene were linked was observed.
  • the 5'side region and the 3'side region of the ilvH(G14D) gene are linked, and ilvH(G14D) is cloned as a complete gene.
  • the constructed plasmid containing the ilvH(G14D) gene was designated as pUC-ilvH(G14D).
  • Escherichia coli JM109 was transformed with the obtained ligation solution by the calcium chloride method and applied to LB agar medium containing 50 ⁇ g/mL of ampicillin and 50 ⁇ g/mL of hygromycin.
  • the growing strain on the medium was subjected to liquid culture by a conventional method, plasmid DNA was extracted from the culture, and this plasmid was cleaved with restriction enzyme MluI to confirm the inserted fragment.
  • MluI restriction enzyme
  • a DNA fragment of about 1.5-kbp corresponding to the sequence of the marker cassette was recognized.
  • the constructed plasmid for ilvH labeling was named pUC-ilvH(G14D)-Sm s ⁇ Hm r .
  • the following primers were used for PCR. It is a combination of the primers (a-3) and (b-4) used in (3).
  • PCR was performed using the genomic DNA of the wild type TH-1 strain as a template, about 2.0-kbp containing the ilvH gene was obtained. The DNA region of is amplified. PCR was performed by a conventional method using "DNA Thermal Cycler” manufactured by Life Technologies, using TaKaRa Ex Taq (manufactured by Takara Bio Inc.) as a reaction reagent.
  • Region amplification primer containing ilvH gene (a-3) 5'-AT GAATTC CCCGGAAGCGACAAGCAGTTCCTGGGG-3' (SEQ ID NO: 11) (b-4) 5'-TT CTGCAG GCGCTTTGCCGCTTTGGTCCTGATGCA-3' (SEQ ID NO: 14)
  • a DNA fragment of about 3.5-kbp corresponding to the sequence in which the marker cassette was inserted into ilvH was detected.
  • a strain in which a marker cassette was inserted into the ilvH gene that is, a strain in which the ilvH gene was labeled with a marker was designated as NOC278 strain.
  • a DNA fragment of about 2.0-kbp similar to that in the case of performing PCR using the genomic DNA of the wild type TH-1 strain as a template was detected. It was That is, it corresponds to the sequence in which the marker cassette is missing.
  • the amplified DNA fragment of about 2.0-kbp was digested with restriction enzyme MluI and subjected to electrophoresis using 1% agarose gel. When it was digested with the MluI site introduced with the mutation of G14D in (3), Two resulting DNA fragments of about 1.0-kbp were detected.
  • the DNA fragment of about 2.0-kbp amplified when using the genomic DNA of the wild-type TH-1 strain as a template does not contain the MluI site, so it is not cleaved even when the restriction enzyme MluI is reacted, and the 2.0-kbp It remains. Therefore, the strain that is cleaved with MluI and two DNA fragments of about 1.0-kbp are detected is a strain in which the ilvH gene is replaced by the ilvH(G14D) gene, that is, a strain in which the G14D mutation is introduced into the ilvH gene. is there. This G14D mutant of the ilvH gene was designated as NOC279 strain.
  • valine NOC279 strain which is a G14D mutant of the wild type ilvH gene of hydrogenophilus
  • Wild-type hydrogenophilus bacteria are growth-inhibited in the presence of 1 mM valine, but the NOC279 strain in which the G14D mutation was introduced into the gene encoding acetolactate synthase III is 10 mM valine. Growth was not inhibited even in the presence.
  • the NOC279 strain desensitizes the feedback inhibition of valine.
  • the mixed gas was supplied along with the culture, and the culture was carried out at 50° C. for 30 hours with shaking. After culturing, quantification of valine in the culture supernatant obtained by centrifugation (4° C., 15,000 rpm, 1 minute) was performed. As a result, 9 mM valine was produced in the medium supernatant.
  • wild-type Hydrogenophyllus thermolteolus TH-1 strain was similarly cultured and valine in the culture supernatant was quantified, it was 0.1 mM or less.
  • Hydrogenophyllus thermolteolus NOC279 strain was deposited at the Patent Microorganism Depositary Center (2-5-8, Kazusa, Kamasa, Kisarazu-shi, Chiba, Japan) (Postal code 292-0818)
  • the accession number of Hydrogenophyllus thermolteolus NOC279 strain is NITE BP-02829 and the deposit date is November 22, 2018. Therefore, this strain is publicly available.
  • the genetic recombinant of the present invention efficiently produces valine on an industrial scale by using carbon dioxide as the sole carbon source, and thus suppresses global warming due to carbon dioxide while adding pharmaceuticals, foods, cosmetics, and feed for livestock.
  • Valine which is used as a product, can be produced on an industrial scale.

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Abstract

配列番号1のアミノ酸配列において、下記(a)～(h) (a)　アミノ酸番号11のAsnのAsp、His、又はAlaへの置換 (b)　アミノ酸番号14のGlyのAsp、又はAlaへの置換 (c)　アミノ酸番号17のSerのPheへの置換 (d)　アミノ酸番号29のAsnのLys、Tyr、Asp、又はHisへの置換 (e)　アミノ酸番号34のThrのIleへの置換 (f)　アミノ酸番号36のAlaのValへの置換 (g)　アミノ酸番号84のArg以降の全てのアミノ酸の欠失 (h)　アミノ酸番号131のLeuのArgへの置換 の何れかのアミノ酸置換を有する変異アミノ酸配列からなる変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニットを生成するヒドロゲノフィラス属細菌は、二酸化炭素を唯一の炭素源として利用して効率よくバリンを製造することができる。

Description

バリン生成能が向上したヒドロゲノフィラス属細菌遺伝子組換え体
　本発明は、バリン生成能を向上させたヒドロゲノフィラス属細菌遺伝子組換え体、この遺伝子組換え体を用いたバリンの製造方法、及び遺伝子組換え体の作製方法に関する。
微生物を用いた化学品製造
　2015年採択のパリ協定は、世界全体の温室効果ガスの排出量を迅速に削減することを定めている。これに従い、日本は2030年までに、二酸化炭素やメタンなどの温室効果ガス排出量を2013年に比べて26％削減することを目標としている。
　世界的に化学品製造の大半は石油原料に依存しており、温室効果ガスの排出量増大といった問題を抱えている。従って、化学品製造の脱石油化が求められており、バイオマスからグリーン化学品を製造するバイオリファイナリーの研究開発が各国で精力的に行われている。しかしながら、微生物発酵の原料とするためのバイオマスの糖類への変換には複雑な工程が必要であり、高コストとなる課題がある。
　脱石油化の研究の一環として、より高度のサステナビリティを有する炭素原料として二酸化炭素、メタン、一酸化炭素などのガスが注目されており、これらのガスを利用する微生物を用いた有価化学品やバイオ燃料を製造する技術に関心が寄せられている。中でも、温暖化への寄与率が高い二酸化炭素を固定して有効利用することへの期待が高い。
バリン製造
　必須アミノ酸の一つであるバリンは、医薬、食品、化粧品の成分や、家畜飼料添加物などとして有用な物質である。従来、バリンは、発酵法やタンパク質の加水分解により生産されている。
　しかし、再生可能資源を原料とした発酵法によるバリンの生産は、乳酸やエタノールの生産と比較して、原料となる糖類からの代謝の反応ステップが非常に多く、また生産物であるバリンにより代謝酵素がフィードバック阻害を受けるなどの理由により、生産性が低いことがバリンの工業生産の難点となっている。
　微生物において、バリンは、細胞内の重要代謝物であるピルビン酸から4ステップを経て生成される。即ち、アセトラクテートシンターゼ（Acetolactate synthase）の触媒作用によりピルビン酸からアセトラクテートが生成し、次いで、ケトール酸レダクトイソメラーゼ（Ketol acid reductoisomerase）の触媒作用によりアセトラクテートから2,3-ジヒドロキシイソ吉草酸が生成し、次いで、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（Dihydroxy acid dehydratase）の触媒作用により2,3-ジヒドロキシイソ吉草酸から2-ケトイソ吉草酸が生成し、最後に、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（branched-chain amino acid aminotransferase）の触媒作用によりグルタミン酸から2-ケトイソ吉草酸にアミノ基が転移して、バリンが生成する。
　バリンの生合成に関与するアセトラクテートシンターゼとして、エシェリヒア　コリ(Escherichia coli)では、I、II、IIIの３つのアイソザイムが知られている。アセトラクテートシンターゼIIはバリンに耐性があるのに対して、アセトラクテートシンターゼI及びアセトラクテートシンターゼIIIはバリンによるフィードバック阻害を受ける。従って、微生物を用いてバリンを製造するためには、バリンによるフィードバック阻害を受けないアセトラクテートシンターゼを高生産させる必要がある。
　アセトラクテートシンターゼは大サブユニットと小サブユニットから構成され、大サブユニットは触媒機能を有しており、小サブユニットは調節機能を有している。アセトラクテートシンターゼの酵素活性がバリンによるフィードバック阻害を受けるのは小サブユニットの機能による。
　微生物におけるバリンの生産性を向上させる技術のうち、バリンによるフィードバック阻害が脱感作された変異型アセトラクテートシンターゼを用いる方法としては、特許文献１、２に記載の技術が挙げられる。
　特許文献１は、アセトラクテートシンターゼIの小サブユニットをコードする遺伝子（ilvN遺伝子）を、バリンによるフィードバック阻害が脱感作するように変異させたエシェリヒア　コリを用いて、バリンを製造する技術を開示している。
　また、特許文献２は、アセトラクテートシンターゼIIIの小サブユニットをコードする遺伝子（ilvH遺伝子）を、バリンによるフィードバック阻害が脱感作するように変異させたエシェリヒア　コリを用いて、バリンを製造する技術を開示している。
　しかし、上記方法は何れも、糖を炭素原料として用いてバリンを生成する方法であって、二酸化炭素を炭素原料として用いてバリンを生成する方法ではない。
ゲノム上の遺伝子の改変
　例えば、アセトラクテートシンターゼI又はIIIの小サブユニットをコードする遺伝子について、バリンによるフィードバック阻害が脱感作するように変異させるなどの遺伝子組換えを行う場合、遺伝子組換えに成功した細胞を選別するための目印となる、マーカー遺伝子が利用される。マーカー遺伝子としては、抗生物質耐性遺伝子などが汎用される。抗生物質耐性遺伝子が導入された細胞は、抗生物質存在下で生育可能となるため、抗生物質耐性遺伝子は、遺伝子が導入された細胞の選択、即ちポジティブセレクションに用いられる。
　しかし、マーカー遺伝子の種類は限られているため、ゲノム上の複数の箇所（遺伝子座）で遺伝子の欠失、挿入、置換などの改変を行う場合には、マーカー遺伝子をリサイクルする必要がある。薬剤耐性遺伝子などのポジティブセレクションマーカーを指標にして、目的の遺伝子座が改変された遺伝子組換え体を選択した後、その中から、そのポジティブセレクションマーカーが抜け落ちた細胞を選択できれば、別の遺伝子座において、再度そのポジティブセレクションマーカーを使用することが可能となる。そのため、ポジティブセレクションマーカーが抜け落ちた細胞を効率良く選択する方法が必要である。
　また、ゲノム上の遺伝子の改変に当たり、改変された細胞の選別のために薬剤耐性遺伝子などのポジティブセレクションマーカー遺伝子がゲノム中に挿入されると、挿入されたポジティブセレクションマーカー遺伝子の発現がその周辺の遺伝子の発現に影響を及ぼすことがよくある。この場合には、挿入されたポジティブセレクションマーカー遺伝子の発現の影響を排除するために、改変された遺伝子型を維持したまま、ポジティブセレクションマーカー遺伝子のみが消去された細胞を、効率よく選択する必要性が生じる。
　上記のポジティブセレクションマーカーが抜け落ちた細胞の選択、即ちカウンターセレクションには、発現することで細胞を死に至らしめる遺伝子マーカー、即ちカウンターセレクションマーカーを用いれば良い。この方法によれば、ポジティブセレクションマーカーとカウンターセレクションマーカーを連結して使用し、カウンターセレクションマーカーが抜け落ちたために死に至らなかった細胞を選択することで、カウンターセレクションマーカーと共にポジティブセレクションマーカーが抜け落ちた細胞を選択的に取得することができる。
　エシェリヒア　コリなど多くの細菌においては、カウンターセレクションマーカーとして、バチルス　サブチリス(Bacillus subtilis)由来のレバンシュクラーゼ遺伝子(sacB)が汎用されている。sacB遺伝子が導入されたエシェリヒア　コリは、ショ糖の存在下では生育できなくなる。この性質を利用して、ショ糖を添加した培地で生育したエシェリヒア　コリを選択することで、sacB遺伝子を保持しないエシェリヒア　コリを選択的に取得することができる。
　また、エシェリヒア　コリなどにおいて、ストレプトマイシン感受性遺伝子を利用するカウンターセレクションの方法も知られている。
　本来、抗生物質であるストレプトマイシンに感受性の細菌であっても、ある頻度でストレプトマイシン耐性株が出現することが知られている。これらのストレプトマイシン耐性株では、S12リボソームタンパク質をコードする遺伝子(rpsL遺伝子)内部に変異が生じており、変異によるS12リボソームタンパク質のアミノ酸置換がストレプトマイシン耐性の要因となっている。この場合、ストレプトマイシン耐性の要因となっている変異rpsL遺伝子（以下、「rpsL*」と呼ぶことがある）は、ストレプトマイシン耐性遺伝子と呼ばれる。
　さらに、これらのストレプトマイシン耐性株に野生型（天然型）のrpsL遺伝子を導入すると、宿主細菌はストレプトマイシン感受性となる。即ち、変異型rpsL遺伝子であるrpsL*遺伝子（ストレプトマイシン耐性遺伝子）に対して、野生型のrpsL遺伝子は優性遺伝子である。この場合、rpsL遺伝子をストレプトマイシン感受性遺伝子と呼ぶことがある。
　即ち、エシェリヒア　コリなどのストレプトマイシン耐性株を取得し、このストレプトマイシン耐性株を宿主として用い、野生型rpsL遺伝子（ストレプトマイシン感受性遺伝子）をカウンターセレクションマーカーとして用いる、カウンターセレクションの方法が知られている（非特許文献１）。
特開2001-231584号 特開2008-099668号
Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis. Reyrat JM, Pelicic V, Gicquel B, Rappuoli R. Infect. Immun. (1998) 66:4011-4017
　本発明は、二酸化炭素を唯一の炭素源として利用して効率よくバリンを製造することができるヒドロゲノフィラス属細菌遺伝子組換え体、及びこの遺伝子組換え体を用いて効率よくバリンを製造する方法を提供することを第1の課題とする。
　本発明は、ヒドロゲノフィラス属細菌において、遺伝子組換え体を効率良く作成する方法を提供することを第2の課題とする。
　上記課題を解決するために本発明者は研究を重ね、以下の知見を得た。
宿主遺伝子の改変技術
　ヒドロゲノフィラス（Hydrogenophilus）属細菌は水素エネルギーを利用して二酸化炭素から有機物質を生成して生育する水素細菌である。一般的に水素細菌の生育速度は極めて遅いが、ヒドロゲノフィラス属細菌は生育速度が速く、植物や光合成細菌に比べて、炭酸固定能力が格段に高い。ヒドロゲノフィラス属細菌は、バリンを生成するが、バリンにより代謝酵素がフィードバック阻害を受けるため、生産性は低い。工業規模でのバリン生成能を付与するためには、バリンを生成する反応を触媒する酵素をコードする遺伝子に変異を導入し、フィードバック阻害を脱感作する必要がある。しかし、ヒドロゲノフィラス属細菌のゲノム上の遺伝子を改変（欠失、置換、付加（挿入を含む）など）する技術は存在しなかった。
　この点に関して、本発明者は、ヒドロゲノフィラス属細菌における遺伝子改変の手法を幅広く検討し、ヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株と野生型rpsL遺伝子（ストレプトマイシン感受性遺伝子）を組み合わせることで、ポジティブセレクションマーカーのリサイクルが可能なヒドロゲノフィラス属細菌の遺伝子組換えを実施することに成功した。
　即ち、本発明者は、ヒドロゲノフィラス属細菌において、ストレプトマイシン耐性株が単離できること、及び、そのストレプトマイシン耐性株に対し、ヒドロゲノフィラス属細菌のrpsL遺伝子がストレプトマイシン感受性遺伝子として機能でき、カウンターセレクションマーカーとして使用できることを見出した。
　また、ヒドロゲノフィラス属細菌で使用できるポジティブセレクションマーカーも、これまで知られていない。本発明者は、ヒドロゲノフィラス属細菌にハイグロマイシン リン酸転移酵素遺伝子を導入することにより、ハイグロマイシン耐性を与え、ポジティブセレクションマーカーとして使用できることを見出した。また、ヒドロゲノフィラス属細菌にネオマイシン／カナマイシン リン酸転移酵素の遺伝子、又はカナマイシン ヌクレオチド転移酵素の遺伝子を導入することにより、カナマイシン耐性を与え、ポジティブセレクションマーカーとして使用できることも見出した。
　ハイグロマイシン リン酸転移酵素遺伝子としては、エシェリヒア　コリのhygromycin B phosphotransferaseをコードする遺伝子（hph）などが知られている（Plasmid-encoded hygromycin B resistance: the sequence of hygromycin B phosphotransferase gene and its expression in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae. Gritz L, Davies J. Gene (1983) 25:179-188）。
　また、カナマイシン耐性を与える遺伝子としては、エシェリヒア　コリのトランスポゾンTn5のneomycin phosphotransferaseをコードする遺伝子（nptII）、スタフィロコッカス　オーレウス(Staphylococcus aureus)のkanamycin nucleotidyltransferaseをコードする遺伝子(knt)などが知られている（Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum. Schafer A, Tauch A, Jager W, Kalinowski J, Thierbach G, Puhler A. Gene (1994) 145:69-73;　Enzymatic and nucleotide sequence studies of a kanamycin-inactivating enzyme encoded by a plasmid from thermophilic bacilli in comparison with that encoded by plasmid pUB110. Matsumura M, Katakura Y, Imanaka T, Aiba S. J. Bacteriol. (1984) 160:413-420）。
　本発明者の研究によれば、ヒドロゲノフィラス属細菌に異種遺伝子を導入しても発現しない場合が多いが、ハイグロマイシン リン酸転移酵素遺伝子は、ヒドロゲノフィラス属細菌内で機能するタンパク質を発現し、ハイグロマイシン耐性を与えることを見出した。また、ネオマイシン／カナマイシン リン酸転移酵素遺伝子、及びカナマイシン ヌクレオチド転移酵素の遺伝子は、それぞれ、ヒドロゲノフィラス属細菌内で機能するタンパク質を発現し、カナマイシン耐性を与えることを見出した。
バリン製造
　ヒドロゲノフィラス属細菌のゲノム上には、アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニットをコードするilvH遺伝子が存在する。アセトラクテートシンターゼIIIはバリンによりフィードバック阻害を受けるため、本発明では、ヒドロゲノフィラス属細菌のゲノム上のアセトラクテートシンターゼをコードする遺伝子に、バリンによるフィードバック阻害が脱感作されると期待される変異の導入を試みた。
　その結果、ヒドロゲノフィラス属細菌のアセトラクテートシンターゼIII 小サブユニットのアミノ酸配列である配列番号１において、アミノ酸番号11のAsnをAsp、His、若しくはAlaに置換、アミノ酸番号14のGlyをAsp、若しくはAlaに置換、アミノ酸番号17のSerをPheに置換、アミノ酸番号29のAsnをLys、Tyr、Asp、若しくはHisに置換、アミノ酸番号34のThrをIleに置換、アミノ酸番号36のAlaをValに置換、アミノ酸番号84のArg以降の全てのアミノ酸を欠失、又はアミノ酸番号131のLeuをArgに置換した変異アセトラクテートシンターゼIIIは、バリンによるフィードバック阻害が脱感作されることが分かった。即ち、野生型のヒドロゲノフィラス属細菌は、1 mMのバリンの存在下で生育が阻害されるが、アセトラクテートシンターゼIIIをコードする遺伝子に上記変異が導入されたヒドロゲノフィラス属細菌は、高濃度のバリン存在下でも生育が阻害されず、培養液中にバリンを蓄積する。このヒドロゲノフィラス属細菌遺伝子組換え体は、二酸化炭素を唯一の炭素源として用いて一層効率良くバリンを生成する。
　本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、下記のヒドロゲノフィラス属細菌遺伝子組換え体、バリンの製造方法、及び遺伝子組換え体の製造方法などを提供する。
項１．　下記(1)～(3)の何れかの変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット。
(1)　配列番号1のアミノ酸配列において、下記(a)～(h)の何れかの変異を有する変異アミノ酸配列からなる変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット
(a)　アミノ酸番号11のAsnのAsp、His、又はAlaへの置換
(b)　アミノ酸番号14のGlyのAsp、又はAlaへの置換
(c)　アミノ酸番号17のSerのPheへの置換
(d)　アミノ酸番号29のAsnのLys、Tyr、Asp、又はHisへの置換
(e)　アミノ酸番号34のThrのIleへの置換
(f)　アミノ酸番号36のAlaのValへの置換
(g)　アミノ酸番号84のArg以降の全てのアミノ酸の欠失
(h)　アミノ酸番号131のLeuのArgへの置換
(2)　(1)に記載の変異アミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット活性を有すると共にバリンによるフィードバック阻害が抑制された変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット
（但し、変異アミノ酸配列が(a)の変異を有する場合はアミノ酸番号11のアミノ酸はAsp、His、又はAlaであり、
変異アミノ酸配列が(b)の変異を有する場合、アミノ酸番号14のアミノ酸はAsp、又はAlaであり、
変異アミノ酸配列が(c)の変異を有する場合、アミノ酸番号17のアミノ酸はPheであり、
変異アミノ酸配列が(d)の変異を有する場合、アミノ酸番号29のアミノ酸はLys、Tyr、Asp、又はHisであり、
変異アミノ酸配列が(e)の変異を有する場合、アミノ酸番号34のアミノ酸はIleであり、
変異アミノ酸配列が(f)の変異を有する場合、アミノ酸番号36のアミノ酸はValであり、
変異アミノ酸配列が(g)の変異を有する場合、アミノ酸番号84以降の全てのアミノ酸は欠失しており、
変異アミノ酸配列が(h)の変異を有する場合、アミノ酸番号131のアミノ酸はArgである。）
(3)　(1)に記載の変異アミノ酸配列において、1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット活性を有すると共にバリンによるフィードバック阻害が抑制された変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット
（但し、変異アミノ酸配列が(a)の変異を有する場合はアミノ酸番号11のアミノ酸はAsp、His、又はAlaであり、
変異アミノ酸配列が(b)の変異を有する場合、アミノ酸番号14のアミノ酸はAsp、又はAlaであり、
変異アミノ酸配列が(c)の変異を有する場合、アミノ酸番号17のアミノ酸はPheであり、
変異アミノ酸配列が(d)の変異を有する場合、アミノ酸番号29のアミノ酸はLys、Tyr、Asp、又はHisであり、
変異アミノ酸配列が(e)の変異を有する場合、アミノ酸番号34のアミノ酸はIleであり、
変異アミノ酸配列が(f)の変異を有する場合、アミノ酸番号36のアミノ酸はValであり、
変異アミノ酸配列が(g)の変異を有する場合、アミノ酸番号84以降の全てのアミノ酸は欠失しており、
変異アミノ酸配列が(h)の変異を有する場合、アミノ酸番号131のアミノ酸はArgである。）
項２．　下記(4)～(6)の何れかの変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット遺伝子。
(4)　配列番号2の塩基配列において、下記(i)～(p)の何れかの変異を有する変異塩基配列からなるからなる遺伝子
(i)　塩基番号31～33のAACのGAT、GAC、CAT、CAC、GCT、GCC、GCA、又はGCGへの置換
(j)　塩基番号40～42のGGCのGAT、GAC、GCT、GCC、GCA、又はGCGへの置換
(k)　塩基番号49～51のTCGのTTT、又はTTCへの置換
(l)　塩基番号85～87のAACのAAA、AAG、TAT、TAC、GAT、GAC、CAT、又はCACへの置換
(m)　塩基番号100～102のACCのATT、ATC、又はATAへの置換
(n)　塩基番号106～108のGCAのGTT、GTC、GTA、又はGTGへの置換
(o)　塩基番号250～252のCGCのTAA、TAG、又はTGAへの置換
(p)　塩基番号391～393のCTCのCGT、CGC、CGA、CGG、AGA、又はAGGへの置換
(5)　(4)に記載の変異塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であり、かつアセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット活性を有すると共にバリンによるフィードバック阻害が抑制された変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニットをコードする遺伝子
（但し、変異塩基配列が(i)の変異を有する場合、塩基番号31～33の塩基はGAT、GAC、CAT、CAC、GCT、GCC、GCA、又はGCGであり、
変異塩基配列が(j)の変異を有する場合、塩基番号40～42の塩基はGAT、GAC、GCT、GCC、GCA、又はGCGであり、
変異塩基配列が(k)の変異を有する場合、塩基番号49～51の塩基はTTT、又はTTCであり、
変異塩基配列が(l)の変異を有する場合、塩基番号85～87の塩基はAAA、AAG、TAT、TAC、GAT、GAC、CAT、又はCACであり、
変異塩基配列が(m)の変異を有する場合、塩基番号100～102の塩基はATT、ATC、又はATAであり、
変異塩基配列が(n)の変異を有する場合、塩基番号106～108の塩基はGTT、GTC、GTA、又はGTGであり、
変異塩基配列が(o)の変異を有する場合、塩基番号250～252の塩基はTAA、TAG、又はTGAであり、
変異塩基配列が(p)の変異を有する場合、塩基番号391～393の塩基はCGT、CGC、CGA、CGG、AGA、又はAGGである。）
(6)　(4)に記載の変異塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット活性を有すると共にバリンによるフィードバック阻害が抑制された変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニットをコードする遺伝子
（但し、変異塩基配列が(i)の変異を有する場合、塩基番号31～33の塩基はGAT、GAC、CAT、CAC、GCT、GCC、GCA、又はGCGであり、
変異塩基配列が(j)の変異を有する場合、塩基番号40～42の塩基はGAT、GAC、GCT、GCC、GCA、又はGCGであり、
変異塩基配列が(k)の変異を有する場合、塩基番号49～51の塩基はTTT、又はTTCであり、
変異塩基配列が(l)の変異を有する場合、塩基番号85～87の塩基はAAA、AAG、TAT、TAC、GAT、GAC、CAT、又はCACであり、
変異塩基配列が(m)の変異を有する場合、塩基番号100～102の塩基はATT、ATC、又はATAであり、
変異塩基配列が(n)の変異を有する場合、塩基番号106～108の塩基はGTT、GTC、GTA、又はGTGであり、
変異塩基配列が(o)の変異を有する場合、塩基番号250～252の塩基はTAA、TAG、又はTGAであり、
変異塩基配列が(p)の変異を有する場合、塩基番号391～393の塩基はCGT、CGC、CGA、CGG、AGA、又はAGGである。）
項３．　項１に記載の変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニットを生成するヒドロゲノフィラス属細菌。
項４．　項２に記載の変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット遺伝子を有するヒドロゲノフィラス属細菌。
項５．　項３又は４に記載のヒドロゲノフィラス属細菌を、二酸化炭素を実質的に唯一の炭素源として用いて培養する工程を含むバリンの製造方法。
項６．　下記(7)、(8)、又は(9)のストレプトマイシン感受性遺伝子を含むヒドロゲノフィラス属細菌用カウンターセレクションマーカー。
(7)　配列番号3の塩基配列からなるストレプトマイシン感受性遺伝子
(8)　配列番号3の塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であり、かつヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株にストレプトマイシン感受性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
(9)　配列番号3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株にストレプトマイシン感受性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
項７．　項６に記載のカウンターセレクションマーカーとヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株を用いるヒドロゲノフィラス属細菌の遺伝子組換え体の製造方法。
項８．　(A)　ヒドロゲノフィラス属細菌の変異標的遺伝子からなるDNA断片の5’末端側領域と3’末端側領域の間に、ストレプトマイシン感受性遺伝子を含むDNA断片と、ポジティブセレクションマーカー遺伝子を含むDNA断片とが連結したマーカーカセットが挿入されたラベリング用DNA断片を作製する工程と、
(B)　このラベリング用DNA断片を、ヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株に導入する操作を行い、上記ポジティブセレクションマーカーの性質を有することを指標にして、このストレプトマイシン耐性株の標的遺伝子が上記ラベリング用DNA断片に置換された遺伝子組換え体を選択する工程と、
(C)　ヒドロゲノフィラス属細菌の上記変異標的遺伝子からなるDNA断片を、この遺伝子組換え体に導入する操作を行い、ストレプトマイシン耐性であることを指標にして、ゲノム上の上記ラベリング用DNAの領域が変異標的遺伝子に置換された遺伝子組換え体を選択する工程
を含む、ヒドロゲノフィラス属細菌の遺伝子組換え体の製造方法。
項９．　ストレプトマイシン感受性遺伝子が下記(7)、(8)、又は(9)の遺伝子である、項８に記載の方法。
(7)　配列番号3の塩基配列からなるストレプトマイシン感受性遺伝子
(8)　配列番号3の塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であり、かつヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株にストレプトマイシン感受性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
(9)　配列番号3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株にストレプトマイシン感受性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
項１０．　(D)　ヒドロゲノフィラス属細菌の変異標的遺伝子のDNA断片、及びストレプトマイシン感受性遺伝子を含むDNA断片とポジティブセレクションマーカー遺伝子を含むDNA断片とが連結したマーカーカセットを含むラベリング用環状DNAを作製する工程と、
(E)　このラベリング用環状DNAを、ヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株に導入する操作を行い、上記ポジティブセレクションマーカーの性質を有することを指標にして、このストレプトマイシン耐性株の標的遺伝子に、上記ラベリング用環状DNAが直鎖状になって挿入された遺伝子組換え体を選択する工程と、
(F)　その遺伝子組換え体の中から、ストレプトマイシン耐性であることを指標にして、ゲノム上に挿入された上記ラベリング用DNAの領域が脱落した遺伝子組換え体を選択する工程と、
(G)　その遺伝子組換え体の中から、標的遺伝子に変異が導入された遺伝子組換え体を選択する工程
を含む、ヒドロゲノフィラス属細菌の遺伝子組換え体の製造方法。
項１１．　ストレプトマイシン感受性遺伝子が下記(7)、(8)、又は(9)の遺伝子である、項１０に記載の方法。
(7)　配列番号3の塩基配列からなるストレプトマイシン感受性遺伝子
(8)　配列番号3の塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であり、かつヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株にストレプトマイシン感受性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
(9)　配列番号3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株にストレプトマイシン感受性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
項１２．　下記(10)、(11)、又は(12)のハイグロマイシン耐性遺伝子を含むヒドロゲノフィラス属細菌用ポジティブセレクションマーカー。
(10)　配列番号4の塩基配列からなるハイグロマイシン耐性遺伝子
(11)　配列番号4の塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であり、かつヒドロゲノフィラス属細菌にハイグロマイシン耐性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
(12)　配列番号4の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつヒドロゲノフィラス属細菌にハイグロマイシン耐性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
項１３．　下記(13)、(14)、又は(15)のカナマイシン耐性遺伝子を含むヒドロゲノフィラス属細菌用ポジティブセレクションマーカー。
(13)　配列番号5又は6の塩基配列からなるカナマイシン耐性遺伝子
(14)　配列番号5又は6の塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であり、かつヒドロゲノフィラス属細菌にカナマイシン耐性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
(15)　配列番号5又は6の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつヒドロゲノフィラス属細菌にカナマイシン耐性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
　二酸化炭素の増加を抑制する対策として、二酸化炭素の排出量の低減と排出された二酸化炭素の固定がある。二酸化炭素の排出量を低減するために、化石エネルギーに代えて太陽、風力、地熱などのエネルギーの利用が行われている。しかし、現実には、このようなエネルギーの利用によっても二酸化炭素の増加を十分に抑制できていない。そこで、排出された二酸化炭素の固定又は資源化を進める必要がある。
　二酸化炭素は、物理的又は化学的に固定することもできるが、生物を利用して二酸化炭素を固定すれば、それにより食料、飼料、燃料などとして利用できる有機物を生産することができる。即ち、二酸化炭素そのものを資源として直接的に有価化学品に変換することができる。これにより、二酸化炭素の増加による地球温暖化と、食料、飼料、燃料の確保困難という二つの問題を共に解決できる。
　水素細菌は、水素と酸素の反応によって生じる化学エネルギーを利用し、二酸化炭素を唯一の炭素源として生育できる細菌であり、酸素、水素、及び二酸化炭素の混合ガスを原料として化学品を製造できるため、二酸化炭素を効率よく有機化することができ、また、単純な培地で培養することができる。一般的に水素細菌の生育は遅いが、水素細菌であるヒドロゲノフィラス属細菌は増殖速度が格段に速い。「三菱総合研究所報　No.34 1999」ではヒドロゲノフィラス属細菌を、『この増殖能力は植物の持つ炭酸固定能力とは比較出来ない程の高い効率であり、微生物の炭酸固定能力の高さを如実に物語っている』と評価している。
　ヒドロゲノフィラス属細菌は、生存に必要な量のバリンを生成するが、工業的に利用できる量のバリンは生成しない。本発明の遺伝子組換え体は、ヒドロゲノフィラス属細菌のゲノム上のバリン生成に関わる遺伝子に変異が導入されていることにより、効率よくバリンを生成することができる。
　上記の通り、ヒドロゲノフィラス属細菌は、二酸化炭素固定能力を有する生物の中でも、特に優れた二酸化炭素固定能力を有するため、本発明の遺伝子組換え体を用いれば、工業的に、二酸化炭素を固定してバリンを製造することができる。
　また、本発明によれば、ヒドロゲノフィラス属細菌でポジティブセレクションマーカーとして使用できるハイグロマイシン耐性遺伝子、及びカナマイシン耐性遺伝子が提供された。また、ヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株と共に用いてカウンターセレクションマーカーとして使用できるストレプトマイシン感受性遺伝子が提供された。これにより、ヒドロゲノフィラス属細菌の遺伝子組換え、ゲノム改変の途が開かれた。特に、カウンターセレクションマーカーとして使用できるストレプトマイシン感受性遺伝子を見出したことで、ヒドロゲノフィラス属細菌の遺伝子組換えを繰り返し行うことが可能となり、大規模にゲノムを改変できるようになった。また、マーカーが残らないため、ヒドロゲノフィラス属細菌の組換え株を野生株と比較する際に、その表現型、即ち性質の違いを、遺伝子型の違いに直接的に関連付けて考察することが可能となった。
ストレプトマイシン感受性遺伝子をカウンターセレクションマーカーとして用いた、ヒドロゲノフィラス属細菌の遺伝子組換え体の製造方法の一例を示す図である。 ストレプトマイシン感受性遺伝子をカウンターセレクションマーカーとして用いた、ヒドロゲノフィラス属細菌の遺伝子組換え体の製造方法の他の例を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
（１）ヒドロゲノフィラス属細菌遺伝子組換え体
　本発明のヒドロゲノフィラス属細菌遺伝子組換え体は、下記(1)～(3)の何れかの変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニットを生成する。
(1)　配列番号1のアミノ酸配列において、下記(a)～(h)の何れかの変異を有する変異アミノ酸配列からなる変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット
(a)　アミノ酸番号11のAsnのAsp、His、又はAlaへの置換
(b)　アミノ酸番号14のGlyのAsp、又はAlaへの置換
(c)　アミノ酸番号17のSerのPheへの置換
(d)　アミノ酸番号29のAsnのLys、Tyr、Asp、又はHisへの置換
(e)　アミノ酸番号34のThrのIleへの置換
(f)　アミノ酸番号36のAlaのValへの置換
(g)　アミノ酸番号84のArg以降の全てのアミノ酸の欠失
(h)　アミノ酸番号131のLeuのArgへの置換
 
　配列番号1は、ヒドロゲノフィラス　サーモルテオラス（Hydrogenophilus thermoluteolus）の天然型アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニットのアミノ酸配列である。
(2)　(1)に記載の変異アミノ酸配列と90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、さらにより好ましくは99％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット活性を有すると共にバリンによるフィードバック阻害が抑制された変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット
（但し、変異アミノ酸配列が(a)の変異を有する場合はアミノ酸番号11のアミノ酸はAsp、His、又はAlaであり、
変異アミノ酸配列が(b)の変異を有する場合、アミノ酸番号14のアミノ酸はAsp、又はAlaであり、
変異アミノ酸配列が(c)の変異を有する場合、アミノ酸番号17のアミノ酸はPheであり、
変異アミノ酸配列が(d)の変異を有する場合、アミノ酸番号29のアミノ酸はLys、Tyr、Asp、又はHisであり、
変異アミノ酸配列が(e)の変異を有する場合、アミノ酸番号34のアミノ酸はIleであり、
変異アミノ酸配列が(f)の変異を有する場合、アミノ酸番号36のアミノ酸はValであり、
変異アミノ酸配列が(g)の変異を有する場合、アミノ酸番号84以降の全てのアミノ酸は欠失しており、
変異アミノ酸配列が(h)の変異を有する場合、アミノ酸番号131のアミノ酸はArgである。）
　本発明において、アミノ酸配列の同一性は、GENETYX ver.17（GENETYX 株式会社ゼネティックス製）により算出した値である。
(3)　(1)に記載の変異アミノ酸配列において、1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット活性を有すると共にバリンによるフィードバック阻害が抑制された変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット
（但し、変異アミノ酸配列が(a)の変異を有する場合はアミノ酸番号11のアミノ酸はAsp、His、又はAlaであり、
変異アミノ酸配列が(b)の変異を有する場合、アミノ酸番号14のアミノ酸はAsp、又はAlaであり、
変異アミノ酸配列が(c)の変異を有する場合、アミノ酸番号17のアミノ酸はPheであり、
変異アミノ酸配列が(d)の変異を有する場合、アミノ酸番号29のアミノ酸はLys、Tyr、Asp、又はHisであり、
変異アミノ酸配列が(e)の変異を有する場合、アミノ酸番号34のアミノ酸はIleであり、
変異アミノ酸配列が(f)の変異を有する場合、アミノ酸番号36のアミノ酸はValであり、
変異アミノ酸配列が(g)の変異を有する場合、アミノ酸番号84以降の全てのアミノ酸は欠失しており、
変異アミノ酸配列が(h)の変異を有する場合、アミノ酸番号131のアミノ酸はArgである。）
　本発明において、複数個としては、1～5個、中でも1～3個、中でも1～2個、特に1個が挙げられる。
　アセトラクテートシンターゼは、ピルビン酸からアセトラクテートを生成する。本発明において、被験ポリペプチドがアセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット活性を有することは、アセトラクテートシンターゼIII 大サブユニットの共存下で、アセトラクテートシンターゼ活性が検出されることにより確認する。アセトラクテートシンターゼ活性は、100 mM リン酸カリウム(pH 7.5)、50 mM ピルビン酸ナトリウム、10 mM MgCl2、0.1 mM チアミンピロホスフェート、0.1 mM フラビンアデニンジヌクレオチド、及び被験ポリペプチドを混合し、ピルビン酸の吸収を示す333 nm(ε＝17.5 /M・cm)の吸光度の減少を指標に測定する。
　本発明において、被験ポリペプチドがバリンによるフィードバック阻害が抑制されたものであることは、バリン存在下でアセトラクテートシンターゼ活性を検出することにより確認する。被験ポリペプチドが、アセトラクテートシンターゼIII 大サブユニットの共存下で、野生型（天然型）のアセトラクテートシンターゼIIIと比較して、その濃度のバリン存在下で少しでもアセトラクテートシンターゼ活性が向上すれば、バリンによるフィードバック阻害が抑制されたものであると判定する。
　本発明のヒドロゲノフィラス属細菌遺伝子組換え体としては、下記(4)～(6)の何れかの変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット遺伝子をゲノム上に有するものが挙げられる。
　特に、ゲノム上の天然型アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット遺伝子が下記(4)～(6)の何れかの変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット遺伝子に置き換わったものが挙げられる。
(4)　配列番号2の塩基配列において、下記(i)～(p)の何れかの変異を有する変異塩基配列からなるからなる遺伝子
(i)　塩基番号31～33のAACのGAT、GAC、CAT、CAC、GCT、GCC、GCA、又はGCGへの置換
(j)　塩基番号40～42のGGCのGAT、GAC、GCT、GCC、GCA、又はGCGへの置換
(k)　塩基番号49～51のTCGのTTT、又はTTCへの置換
(l)　塩基番号85～87のAACのAAA、AAG、TAT、TAC、GAT、GAC、CAT、又はCACへの置換
(m)　塩基番号100～102のACCのATT、ATC、又はATAへの置換
(n)　塩基番号106～108のGCAのGTT、GTC、GTA、又はGTGへの置換
(o)　塩基番号250～252のCGCのTAA、TAG、又はTGAへの置換
(p)　塩基番号391～393のCTCのCGT、CGC、CGA、CGG、AGA、又はAGGへの置換
 
　配列番号2は、ヒドロゲノフィラス　サーモルテオラスの天然型アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット遺伝子の塩基配列である。
(5)　(4)に記載の変異塩基配列と90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、さらにより好ましくは99％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であり、かつアセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット活性を有すると共にバリンによるフィードバック阻害が抑制された変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニットをコードする遺伝子
（但し、変異塩基配列が(i)の変異を有する場合、塩基番号31～33の塩基はGAT、GAC、CAT、CAC、GCT、GCC、GCA、又はGCGであり、
変異塩基配列が(j)の変異を有する場合、塩基番号40～42の塩基はGAT、GAC、GCT、GCC、GCA、又はGCGであり、
変異塩基配列が(k)の変異を有する場合、塩基番号49～51の塩基はTTT、又はTTCであり、
変異塩基配列が(l)の変異を有する場合、塩基番号85～87の塩基はAAA、AAG、TAT、TAC、GAT、GAC、CAT、又はCACであり、
変異塩基配列が(m)の変異を有する場合、塩基番号100～102の塩基はATT、ATC、又はATAであり、
変異塩基配列が(n)の変異を有する場合、塩基番号106～108の塩基はGTT、GTC、GTA、又はGTGであり、
変異塩基配列が(o)の変異を有する場合、塩基番号250～252の塩基はTAA、TAG、又はTGAであり、
変異塩基配列が(p)の変異を有する場合、塩基番号391～393の塩基はCGT、CGC、CGA、CGG、AGA、又はAGGである。）
　本発明において、塩基配列の同一性は、GENETYX ver.17（GENETYX 株式会社ゼネティックス製）により算出した値である。
(6)　(4)に記載の変異塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット活性を有すると共にバリンによるフィードバック阻害が抑制された変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニットをコードする遺伝子
（但し、変異塩基配列が(i)の変異を有する場合、塩基番号31～33の塩基はGAT、GAC、CAT、CAC、GCT、GCC、GCA、又はGCGであり、
変異塩基配列が(j)の変異を有する場合、塩基番号40～42の塩基はGAT、GAC、GCT、GCC、GCA、又はGCGであり、
変異塩基配列が(k)の変異を有する場合、塩基番号49～51の塩基はTTT、又はTTCであり、
変異塩基配列が(l)の変異を有する場合、塩基番号85～87の塩基はAAA、AAG、TAT、TAC、GAT、GAC、CAT、又はCACであり、
変異塩基配列が(m)の変異を有する場合、塩基番号100～102の塩基はATT、ATC、又はATAであり、
変異塩基配列が(n)の変異を有する場合、塩基番号106～108の塩基はGTT、GTC、GTA、又はGTGであり、
変異塩基配列が(o)の変異を有する場合、塩基番号250～252の塩基はTAA、TAG、又はTGAであり、
変異塩基配列が(p)の変異を有する場合、塩基番号391～393の塩基はCGT、CGC、CGA、CGG、AGA、又はAGGである。）
　本発明において、「ストリンジェントな条件」は、6×SSCの塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、50～60℃の温度条件下、16時間ハイブリダイゼーションを行い、0.1×SSCの塩濃度の溶液中で洗浄を行う条件をいう。
　ヒドロゲノフィラス属細菌としては、ヒドロゲノフィラス　サーモルテオラス、ヒドロゲノフィラス　ハロラブダス（Hydrogenophilus halorhabdus）、ヒドロゲノフィラス　デニトリフィカンス（Hydrogenophilus denitrificans）、ヒドロゲノフィラス　ハルシ（Hydrogenophilus hirschii）、ヒドロゲノフィラス　アイランディカス（Hydrogenophilus islandicus）、ヒドロゲノフィラス属細菌Mar3株（Hydrogenophilus sp. Mar3）が挙げられる。中でも、炭酸固定微生物としてトップレベルの生育速度ひいては炭酸固定能力を有する点で、ヒドロゲノフィラス　サーモルテオラスが好ましい。
　ヒドロゲノフィラス属細菌は地球上のいたる所から簡単に分離できる。ヒドロゲノフィラス　サーモルテオラスの好ましい株として、TH-1（NBRC 14978）株が挙げられる。ヒドロゲノフィラス　サーモルテオラス　TH-1（NBRC 14978）株は、炭酸固定微生物としてトップの生育速度を示す〔Agricultural and Biological Chemistry, 41, 685-690 (1977)〕。ヒドロゲノフィラス　サーモルテオラス　NBRC 14978株は、ブダペスト条約の下で国際寄託されており、公に利用可能である。
（２）バリンの製造方法
　上記説明したヒドロゲノフィラス属細菌遺伝子組換え体を用いてバリンを製造するに当たっては、水素、酸素、及び二酸化炭素を含む混合ガスを供給しながら、無機培地又は有機培地を用いて形質転換体を培養すればよい。
　供給されるガスは、水素、酸素、及び二酸化炭素からなる混合ガスとすることが好ましいが、効率的にバリンを生成できる範囲で異種ガスが混入していてもよい。
　ヒドロゲノフィラス属細菌は、水素をエネルギー源として、二酸化炭素を唯一の炭素源として生育できるため、特に、炭素源として実質的に二酸化炭素だけを用いて（特に、二酸化炭素だけを用いて）上記化合物を製造することにより、効率的に二酸化炭素を固定できる。従って、有機物や炭酸塩などの炭素源を含まない無機培地を用いること、即ち、実質的に二酸化炭素だけを炭素源として（特に、二酸化炭素だけを炭素源として）培養することが好ましい。「炭素源として実質的に二酸化炭素だけを用いる」ことは、不可避の量の他の炭素源が混入する場合も包含する。なお、二酸化炭素を供給せず、糖、有機酸、アミノ酸などの有機物や炭酸塩を含む培地を用いることもできる。
　培地のpHは、6.2～8が好ましく、6.4～7.4がより好ましく、6.6～7がさらにより好ましい。この範囲であれば、菌の生育及び混合ガスの培地中への溶解が良く、バリンを効率よく製造できる。
　バッチ培養の場合は、混合ガスを密閉された培養容器に封入して静置培養又は振盪培養すればよく、連続培養の場合は、混合ガスを密閉された培養容器に連続供給しながら振盪培養するか、又は密閉された培養容器を用いてバブリングにより混合ガスを培地内に導入しながら形質転換体を培養すればよい。混合ガスの培地中への溶解が良くなる点で振盪培養が好ましい。
　供給ガス中の水素、酸素、二酸化炭素の容量比（水素：酸素：二酸化炭素）は、1.75～7.5：1：0.25～3が好ましく、5～7.5：1：1～2がより好ましく、6.25～7.5：1：1.5がさらにより好ましい。この範囲であれば、菌の生育が良く、目的化合物を効率よく製造できる。
　混合ガス又は原料ガスの供給速度は、培地1 L当たり、10.5～60 L／時間、中でも10.5～40 L／時間、中でも10.5～21 L／時間とすればよい。この範囲であれば、形質転換体の生育が良く、バリンを効率よく製造できると共に、混合ガスの無駄が抑えられる。
　培養温度は、35～55℃が好ましく、37～52℃がより好ましく、50～52℃がさらにより好ましい。この範囲であれば、形質転換体の生育が良く、バリンを効率よく製造できる。
　上記のようにして培養することにより、反応液中に目的化合物であるバリンが生成される。反応液を回収することによりバリンを回収できるが、さらに、公知の方法でバリンを反応液から分離することもできる。そのような公知の方法として、イオン交換樹脂法、濃縮法、晶析法、活性炭吸着溶離法等が挙げられる。
（３）ヒドロゲノフィラス属細菌の遺伝子組換え体の作製方法
　PCR等により変異型遺伝子を作製し、この変異型遺伝子を含むDNAで細菌を形質転換して、変異型遺伝子とゲノム上の遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の遺伝子を変異型遺伝子に置換することができる。即ち、染色体上の遺伝子に変異を導入することができる。変異型遺伝子によってコードされる酵素タンパク質は、野生型酵素タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が変化している。
　このような相同組換えを利用したゲノム上の遺伝子の改変は、ヒドロゲノフィラス属細菌では前例がない。本発明では、ヒドロゲノフィラス属細菌において、ストレプトマイシン耐性株とストレプトマイシン感受性遺伝子を利用するカウンターセレクション法を開発し、相同組換えによる部位特異的なマーカーの組込みと第二段階の相同組換えによるマーカーの脱落を原理とした遺伝子改変を行った。
　この方法では、下記(7)、(8)、又は(9)のストレプトマイシン感受性遺伝子をカウンターセレクションマーカーとして用いる。これらのストレプトマイシン感受性遺伝子は、ヒドロゲノフィラス属細菌内で機能する。
(7)　配列番号3の塩基配列からなるストレプトマイシン感受性遺伝子
(8)　配列番号3の塩基配列と90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、さらにより好ましくは99％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であり、かつヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株にストレプトマイシン感受性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
(9)　配列番号3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株にストレプトマイシン感受性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
　(8)及び(9)のストレプトマイシン感受性遺伝子の例として、下記(r)、(s)、及び(t)の遺伝子が挙げられる。
(r)配列番号3において、塩基番号127～129のAAAがCGT、CGC、CGA、CGG、AGA、AGG、AAT、AAC、ACT、ACC、ACA、ACG、ATT、ATC、又はATAに置換された塩基配列からなるストレプトマイシン感受性遺伝子
(s)配列番号3において、塩基番号262～264のAAAがCGT、CGC、CGA、CGG、AGA、AGG、GAA、又はGAGに置換された塩基配列からなるストレプトマイシン感受性遺伝子
(t)配列番号3において、塩基番号271～273のCCGがTTA、TTG、CTT、CTC、CTA、CTG、CAA、又はCAGに置換された塩基配列からなるストレプトマイシン感受性遺伝子
　ヒドロゲノフィラス属細菌内でマーカー遺伝子を発現させるための好ましいプロモーターとしては、tacプロモーター、lacプロモーター、trcプロモーター、又はOxford Genetics社OXB1,OXB11～OXB20の各プロモーターなどが挙げられ、好ましいターミネーターとしては、大腸菌rRNAオペロンのrrnB T1T2 ターミネーター、バクテリオファージλt0転写ターミネーターなどが挙げられる。
　被験遺伝子が、ヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株にストレプトマイシン感受性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であることは、被験遺伝子を導入したストレプトマイシン耐性株が、野生型のヒドロゲノフィラス属細菌と同程度に、ストレプトマイシンの存在下（50 μg/mL以上）で生育が阻害されることにより確認する。
　上記カウンターセレクションマーカーを用いたヒドロゲノフィラス属細菌の遺伝子組換え体の製造方法として、以下の(A)～(C)の工程を含む方法が挙げられる（第1の方法、図1）。
(A)　ヒドロゲノフィラス属細菌の変異標的遺伝子からなるDNA断片の5’末端側領域と3’末端側領域の間に、ストレプトマイシン感受性遺伝子を含むDNA断片と、ポジティブセレクションマーカー遺伝子を含むDNA断片とが連結したマーカーカセットが挿入されたラベリング用DNA断片を作製する工程と、
(B)　このラベリング用DNA断片を、ヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株に導入する操作を行い、上記ポジティブセレクションマーカーの性質を有することを指標にして、このストレプトマイシン耐性株の標的遺伝子が上記ラベリング用DNA断片に置換された遺伝子組換え体を選択する工程と、
(C)　ヒドロゲノフィラス属細菌の上記変異標的遺伝子からなるDNA断片を、この遺伝子組換え体に導入する操作を行い、ストレプトマイシン耐性であることを指標にして、ゲノム上の上記ラベリング用DNAの領域が変異標的遺伝子に置換された遺伝子組換え体を選択する工程
(A) ラベリング用DNA断片の作製
　標的遺伝子に目的とする変異（置換、欠失、又は付加（挿入を含む）など）を導入する部位特異的変異導入方法は、良く知られている。例えば、一方のプライマーに目的の変異を組み込んだプライマーセットを用いて、ヒドロゲノフィラス属細菌のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行うことにより、ヒドロゲノフィラス属細菌の標的遺伝子であって変異が導入されたものを得ることができる。
　このとき、標的遺伝子を5’末端側領域と3’末端側領域の2つに分割して、それぞれをPCRで増幅し、何れか一方又は双方の領域に、それぞれ1又は複数の変異を導入すればよい。
　さらに、増幅した5’末端側領域と3’末端側領域を、エシェリヒア　コリなどの宿主で使用できるベクターに連結しておけばよい。
　次いで、ベクター上の5’末端側領域と3’末端側領域との間に挿入するマーカーカセットを作製する。マーカーカセットは、ヒドロゲノフィラス属細菌内で機能するストレプトマイシン感受性遺伝子と、ヒドロゲノフィラス属細菌内で機能するポジティブセレクションマーカー遺伝子とが、隣接して又は約10,000塩基対以下のDNAを挟んで連結したものである。
　次いで、ヒドロゲノフィラス属細菌の変異標的遺伝子からなるDNA断片が挿入されたベクター上の、変異標的遺伝子の5’末端側領域と3’末端側領域との間にマーカーカセットを挿入すればよい。さらに、常法に従い、得られたベクターで宿主を形質転換し、このベクターを形質転換体から抽出すればよい。
　次いで、変異標的遺伝子の5’末端側領域と3’末端側領域との間を制限酵素で切断することにより直鎖状にして、ラベリング用DNA断片を得ればよい。切断は、マーカーカセットが変異標的遺伝子の5’末端側領域と3’末端側領域との間に挟まれた状態になるように行う。
　ヒドロゲノフィラス属細菌内で機能するストレプトマイシン感受性遺伝子としては、上記(7)、(8)、又は(9)の遺伝子を用いることができる。
　ヒドロゲノフィラス属細菌内で機能するポジティブセレクションマーカー遺伝子は、これまで全く知られていなかった。本発明では、下記(10)、(11)、又は(12)のハイグロマイシン耐性遺伝子がヒドロゲノフィラス属細菌内で機能し、ポジティブセレクションマーカーとして用い得ることを見出した。
(10)　配列番号4の塩基配列からなるハイグロマイシン耐性遺伝子
(11)　配列番号4の塩基配列と90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、さらにより好ましくは99％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であり、かつヒドロゲノフィラス属細菌にハイグロマイシン耐性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
(12)　配列番号4の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつヒドロゲノフィラス属細菌にハイグロマイシン耐性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
　被験遺伝子が、ヒドロゲノフィラス属細菌にハイグロマイシン耐性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であることは、被験遺伝子を導入したヒドロゲノフィラス属細菌が、被験遺伝子導入前の野生型のヒドロゲノフィラス属細菌と比較して、ハイグロマイシンの存在下(100 μg/mL)での生育が向上していること（例えば、被験遺伝子導入前の野生型のヒドロゲノフィラス属細菌と異なり、ハイグロマイシンの存在下(100 μg/mL)で生育できること）により確認する。
　また、本発明では、下記(13)、(14)、又は(15)のカナマイシン耐性遺伝子がヒドロゲノフィラス属細菌内で機能し、ポジティブセレクションマーカーとして用い得ることを見出した。
(13)　配列番号5又は6の塩基配列からなるカナマイシン耐性遺伝子
(14)　配列番号5又は6の塩基配列と90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、さらにより好ましくは99％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であり、かつヒドロゲノフィラス属細菌にカナマイシン耐性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
(15)　配列番号5又は6の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつヒドロゲノフィラス属細菌にカナマイシン耐性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
　被験遺伝子が、ヒドロゲノフィラス属細菌にカナマイシン耐性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であることは、被験遺伝子を導入したヒドロゲノフィラス属細菌が、被験遺伝子導入前の野生型のヒドロゲノフィラス属細菌と比較して、カナマイシンの存在下(50 μg/mL)での生育が向上していること（例えば、被験遺伝子導入前の野生型のヒドロゲノフィラス属細菌と異なり、カナマイシンの存在下(50 μg/mL)で生育できること）により確認する。
(B) ポジティブセレクション
　ラベリング用DNA断片による相同組換えにより、ヒドロゲノフィラス属細菌のゲノム上の標的遺伝子がラベリング用DNA断片に置換された遺伝子組換え体を選択する際は、ポジティブセレクションマーカーの性質を獲得した遺伝子組換え体、例えば、ハイグロマイシン耐性又はカナマイシン耐性となった遺伝子組換え体を選択すればよい。
　次工程でストレプトマイシン感受性遺伝子をカウンターセレクションマーカーとしたカウンターセレクションを行うために、宿主は、ヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株とする。ストレプトマイシンを50～500 μg/mL程度含む固体培地に、ヒドロゲノフィラス属細菌の菌液を塗布して培養することにより、通常、一定の比率でストレプトマイシン耐性株が現れる。
　ストレプトマイシン耐性株にラベリング用DNA断片を導入する操作を行い、ポジティブセレクションマーカーの性質を指標にして、ストレプトマイシン耐性株のゲノム上の標的遺伝子がラベリング用DNA断片に置換された遺伝子組換え体を選択する。導入するラベリング用DNA断片は、両端（変異標的遺伝子の5’末端側領域の5’末端、及び変異標的遺伝子の3’末端側領域の3’末端）にさらに余分なヌクレオチドが付加されていてもよい。得られる組換え体はストレプトマイシン感受性となる。
　ヒドロゲノフィラス属細菌細胞内へのDNAの導入は、塩化カルシウム法、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン介在トランスフェクション法、電気パルス法などの公知の方法で行える。
(C) カウンターセレクション
　次いで、変異標的遺伝子に挿入されているマーカーカセットを欠失させるために、変異標的遺伝子からなるDNA断片を用いた相同組換えを行う。
　ヒドロゲノフィラス属細菌の変異標的遺伝子が挿入されたベクターを変異標的遺伝子が分断されないように切断して直鎖状にする。この直鎖状DNA断片を、上記ストレプトマイシン感受性株（標的遺伝子がラベリング用DNA断片に置換された遺伝子組換え体）に導入する操作を行い、ストレプトマイシン耐性となった株を選択すればよい。ストレプトマイシン耐性で、かつポジティブセレクションマーカーの性質を失った株を選択することも好ましい。これにより、変異標的遺伝子に挿入されているマーカーカセットが脱落した遺伝子組換え体、即ち、標的遺伝子に目的とする変異が導入された遺伝子組換え体が得られる。
　上記カウンターセレクションマーカーを用いたヒドロゲノフィラス属細菌の遺伝子組換え体の製造方法の別の例として、以下の(D)～(G)の工程を含む方法も挙げられる（第2の方法、図2）。
(D)　ヒドロゲノフィラス属細菌の変異標的遺伝子のDNA断片、及びストレプトマイシン感受性遺伝子を含むDNA断片とポジティブセレクションマーカー遺伝子を含むDNA断片とが連結したマーカーカセットを含むラベリング用環状DNAを作製する工程と、
(E)　このラベリング用環状DNAを、ヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株に導入する操作を行い、上記ポジティブセレクションマーカーの性質を有することを指標にして、このストレプトマイシン耐性株の標的遺伝子に、上記ラベリング用環状DNAが直鎖状になって挿入された遺伝子組換え体を選択する工程と、
(F)　その遺伝子組換え体の中から、ストレプトマイシン耐性であることを指標にして、ゲノム上に挿入された上記ラベリング用DNAの領域が脱落した遺伝子組換え体を選択する工程と、
(G)　その遺伝子組換え体の中から、標的遺伝子に変異が導入された遺伝子組換え体を選択する工程
(D) ラベリング用環状DNAの作製
　ヒドロゲノフィラス属細菌の標的遺伝子であって変異が導入されたものと、マーカーカセットを含む環状DNAを作製する。マーカーカセットは、第1の方法の工程(A)で説明した通りである。この環状DNAの大きさは、全体として15,000塩基対程度以下であればよい。
(E) ポジティブセレクション
　得られたラベリング用環状DNAをヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株に導入する操作を行い、ポジティブセレクションマーカーの性質を獲得した遺伝子組換え体、例えば、ハイグロマイシン耐性又はカナマイシン耐性となった遺伝子組換え体を選択すればよい。これにより、標的遺伝子の5’末端側領域又は3’末端側領域による相同組換えの結果、ヒドロゲノフィラス属細菌のゲノム上の標的遺伝子に、ラベリング用環状DNAが直鎖状になって挿入された遺伝子組換え体が選択される。即ち、この遺伝子組換え体のゲノム上では、変異標的遺伝子と天然型標的遺伝子との間に、マーカーカセットを含むDNAが挿入されている。従って、得られる組換え体はストレプトマイシン感受性である。
(F) カウンターセレクション
　得られた遺伝子組換え体の中から、ストレプトマイシン耐性となった株、好ましくは、ストレプトマイシン耐性で、かつポジティブセレクションマーカーの性質を失った株を選択することにより、ゲノム上の変異標的遺伝子と天然型標的遺伝子との間で2回目の相同組換えが起きて、両遺伝子間の領域が脱落した遺伝子組換え体が得られる。得られる組換え体のゲノム上の標的遺伝子は、天然型の場合と変異型の場合がある。標的遺伝子の5’末端側領域又は3’末端側領域のうち1回目の相同組換えが生じた領域と同じ領域で相同組換えが生じると、標的遺伝子は野生型になり、標的遺伝子の5’末端側領域又は3’末端側領域のうち1回目の相同組換えが生じた領域と異なる領域で相同組換えが生じると、標的遺伝子は変異が導入されたものとなる。
(G) 変異標的遺伝子を有する遺伝子組換え体の選択
　(F)工程で得られた遺伝子組換え体の中から、標的遺伝子に目的とする変異が導入された株を選択する。得られた遺伝子組換え体の標的遺伝子の塩基配列を決定し、変異が導入されていることを確認すればよい。
　標的遺伝子がアセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット遺伝子であり、目的とする変異標的遺伝子が、アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット活性を有すると共にバリンによるフィードバック阻害が抑制された変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニットをコードする遺伝子である場合は、変異に供したヒドロゲノフィラス属細菌の野生株に比べて、バリン存在下での生育が向上した株を選択すればよい。
　また、配列番号2の塩基番号40-42のGGCがGACに置換された塩基配列からなる変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット遺伝子は、変異により制限酵素MluIの認識配列が含まれるようになっている。従って、(F)工程で得られた遺伝子組換え体について、コロニーPCRにより標的遺伝子を増幅し、増幅したDNA断片が制限酵素MluIにより切断されることを確認すればよい。
　このように、ヒドロゲノフィラス属細菌内で機能するポジティブセレクションマーカーとカウンターセレクションマーカーを組み合わせることで、相同組換えを利用したゲノム上の遺伝子の改変が行えるようになった。
　本発明のバリン生成能が向上したヒドロゲノフィラス属細菌遺伝子組換え体も、上記説明した方法で作製することができる。
　また、ヒドロゲノフィラス属細菌で使用できるポジティブセレクションマーカーの数は限られているが、ポジティブセレクションマーカーとカウンターセレクションマーカーを組み合わせることで、繰り返し何度でも、遺伝子組換え操作を行うことができ、ゲノム上の複数の遺伝子の改変を行える。
　ヒドロゲノフィラス属細菌は独立栄養条件で生育するが、従属栄養条件でも生育できるため、ヒドロゲノフィラス属細菌の宿主及び遺伝子組換え体の培養に用いる培地は、無機培地及び有機培地の何れであってもよい。糖、有機酸、アミノ酸などを含む有機培地を用いることができる。培地のpHは、6.2～8程度とすればよい。
　何れの場合も、水素、酸素、及び二酸化炭素を含む混合ガス、好ましくは水素、酸素、及び二酸化炭素からなる混合ガスを供給しながら培養すればよい。有機培地を使用する場合は、水素、酸素、及び二酸化炭素を含む混合ガス、例えば空気の通気で良い。二酸化炭素ガスを供給しない場合は、炭素源として炭酸塩を含む培地を用いればよい。混合ガスは、密閉された培養容器に封入又は連続供給して、振盪培養することで培地内に溶解させてもよく、培養容器を密閉型又は開放型とし、かつバブリングにより培地内に溶解させてもよい。
　供給ガス中の水素、酸素、二酸化炭素の容量比（水素：酸素：二酸化炭素）は、1.75～7.5：1：0.25～3が好ましく、5～7.5：1：1～2がより好ましく、6.25～7.5：1：1.5がさらにより好ましい。また、ヒドロゲノフィラス属細菌は好熱細菌であるため、培養温度は、35～55℃が好ましく、37～52℃がより好ましく、50～52℃がさらにより好ましい。
（１）ストレプトマイシン耐性株の取得
　ヒドロゲノフィラス　サーモルテオラス　TH-1株(NBRC 14978)（以下、「TH-1株」と言うことがある）をA液体培地〔(NH4)2SO4　3.0 g、KH2PO4　1.0 g、K2HPO4　2.0 g、NaCl　0.25 g、FeSO4・7H2O　0.014 g、MgSO4・7H2O　0.5 g、CaCl2　0.03 g、MoO3　4.0 mg、ZnSO4・7H2O　28 mg、CuSO4・5H2O　2.0 mg、H3BO3　4.0 mg、MnSO4・5H2O　4.0 mg、CoCl2・6H2O　4.0 mgを蒸留水1 Lに溶解(pH 7.0)〕5 mLの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、試験管にH2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入して、50℃で震盪培養した。24時間後の培養液をストレプトマイシン 500 μg/mLを含むA固体培地〔(NH4)2SO4　3.0 g、KH2PO4　1.0 g、K2HPO4　2.0 g、NaCl　0.25 g、FeSO4・7H2O　0.014 g、MgSO4・7H2O　0.5 g、CaCl2　0.03 g、MoO3　4.0 mg、ZnSO4・7H2O　28 mg、CuSO4・5H2O　2.0 mg、H3BO3　4.0 mg、MnSO4・5H2O　4.0 mg、CoCl2・6H2O　4.0 mg、寒天 15 gを蒸留水1 Lに溶解(pH 7.0)〕に塗布し、H2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入したチャンバー内で、50℃にて60時間培養した。
　その結果、ストレプトマイシン 500 μg/mLを含むA固体培地上で３つのコロニーの形成が確認できた。これらの生育株は、TH-1株のストレプトマイシン耐性株であり、そのうちの１つをNOC269株と命名した。
（２）マーカーカセットの構築
(2-1)カウンターセレクションマーカーの調製
　TH-1株の野生株（ストレプトマイシン感受性株）から、常法に従い、ゲノムDNAを抽出した。抽出したゲノムDNAを鋳型として用いて、S12リボソームタンパク質をコードする、ストレプトマイシン感受性遺伝子であるrpsL遺伝子を含むDNA断片をPCR法により増幅した。PCRには、以下のプライマーを用いた。PCRは、ライフテクノロジーズ社製の「DNAサーマルサイクラー」を用い、反応試薬としてKOD FX Neo(東洋紡株式会社製)を用いて、常法により行った。
TH-1株の野生型rpsL遺伝子増幅用プライマー
(a-1)  5’-ATACGCGTCCTCCGATGCGTCGTAAGGGAAACGTC-3’（配列番号7）
(b-1)  5’-ATAGTCGACTTATTTCTTGCCCGCAGCGGCGCCCG-3’（配列番号8）
なお、プライマー(a-1)にはMluI制限酵素部位が付加されており、プライマー(b-1)にはSalI制限酵素部位が付加されている。
(2-2)ポジティブセレクションマーカーの調製
　ハイグロマイシン耐性遺伝子（以下、「hph」と言うことがある）配列を含有するプラスミドpJR225(GenBank: K01193)〔Gene, 25, 179-188 (1983)〕のDNAを鋳型として用いて、hph遺伝子を含むDNA断片をPCR法により増幅した。PCRには、以下のプライマーを用いた。PCRは、ライフテクノロジーズ社製の「DNAサーマルサイクラー」を用い、反応試薬としてKOD FX Neo(東洋紡株式会社製)を用いて、常法により行った。
hph遺伝子増幅用プライマー
(a-2) 5’-ATACTCGAGGAGATGACGTTGGAGGGGCAAGGTCG-3’（配列番号9）
(b-2) 5’-ATACGCGTCTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTGCT-3’（配列番号10）
なお、プライマー(a-2)には、XhoI制限酵素部位が付加されており、プライマー(b-2)には、MluI制限酵素部位が付加されている。
　上記各PCRで生成した反応液を1%アガロースゲルを用いた電気泳動に供した結果、TH-１株のゲノムDNAを鋳型とした場合には、rpsL遺伝子に相当する約0.5-kbpのDNA断片が検出され、pJR225のプラスミドDNAを鋳型とした場合には、hph遺伝子に相当する約1.0-kbpのDNA断片が検出された。
　このようにして調製したrpsL遺伝子を含むDNA断片を制限酵素SalIで、hph遺伝子を含むDNA断片を制限酵素XhoIで切断し、制限酵素SmaIで切断した大腸菌プラスミドベクターpUC19(GenBank: M77789.2)と混合して、T4 DNAリガーゼ(タカラバイオ株式会社製)を用いて互いに結合させた。
　得られたライゲーション液で、塩化カルシウム法によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、アンピシリン50 μg/mL、及びハイグロマイシン50 μg/mLを含むLB寒天培地に塗布した。培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出し、このプラスミドを制限酵素MluIで切断し、挿入断片を確認した。この結果、pUC19ベクターの約2.7-kbpのDNA断片に加え、rpsL遺伝子とhph遺伝子が連結した配列に相当する約1.5-kbpのDNA断片が認められた。
　構築された、rpsL遺伝子とhph遺伝子が連結したマーカーカセットを含むプラスミドを、pUC-Sms・Hmrと命名した。
(３)変異ilvH遺伝子〔ilvH(G14D)〕の構築
　(2-1)で抽出したTH-1株の野生株のゲノムDNAを鋳型として用いて、変異型ilvH遺伝子〔ilvH(G14D)〕の5’側領域、及び3’側領域を含むDNA断片をそれぞれPCR法により増幅した。PCRには、以下のプライマーを用いた。プライマーがG14D変異に相当する配列を含んでいるため、これらのプライマーでilvH遺伝子の領域を増幅することで、G14D変異が導入された変異ilvH遺伝子〔ilvH(G14D)〕のDNA領域を増幅できる。PCRは、ライフテクノロジーズ社製の「DNAサーマルサイクラー」を用い、反応試薬としてKOD FX Neo(東洋紡株式会社製)を用いて、常法により行った。
ilvH(G14D)遺伝子の5’側領域増幅用プライマー
(a-3)  5’-ATGAATTCCCCGGAAGCGACAAGCAGTTCCTGGGG-3’（配列番号11）
(b-3)  5’-ACAACGCGTCCGATTCGTTTTCCACCAGCAGTGCA-3’（配列番号12）
なお、プライマー(a-3)にはEcoRI制限酵素部位が付加されており、プライマー(b-3)にはMluI制限酵素部位が付加されている。(b-3)の配列番号12の5’末端から9番目のヌクレオチドが変異箇所である。
 
ilvH(G14D)遺伝子の3’側領域増幅用プライマー
(a-4)  5’-CGGACGCGTTGTCGCGCATCGCCGGGCTCTTTTCG-3’（配列番号13）
(b-4)  5’-TTCTGCAGGCGCTTTGCCGCTTTGGTCCTGATGCA-3’（配列番号14）
なお、プライマー(a-4)にはMluI制限酵素部位が付加されており、プライマー(b-4)にはPstI制限酵素部位が付加されている。(a-4)の配列番号13の5’末端から4番目のヌクレオチドが変異箇所である。
　上記各PCRで生成した反応液を1%アガロースゲルを用いた電気泳動に供した結果、ilvH(G14D)遺伝子の5’側領域、及び3’側領域に相当する約1.0-kbpのDNA断片がそれぞれ検出された。
　このようにして調製したilvH(G14D)遺伝子の5’側領域のDNA断片を制限酵素EcoRI及びMluIで、変異ilvH(G14D)遺伝子の3’側領域のDNA断片を制限酵素MluI及びPstIで切断し、制限酵素EcoRI及びPstIで切断したpUC19ベクターと混合して、T4 DNAリガーゼ(タカラバイオ株式会社製)を用いて互いに結合させた。
　得られたライゲーション液で、塩化カルシウム法によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、アンピシリン　50 μg/mLを含むLB寒天培地に塗布した。培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出し、このプラスミドを制限酵素EcoRI及びPstIで切断し、挿入断片を確認した。この結果、pUC19ベクターの約2.7-kbpのDNA断片に加え、ilvH(G14D)遺伝子の5’側領域と3’側領域が連結した配列に相当する約2.0-kbpのDNA断片が認められた。
　このプラスミドでは、ilvH(G14D)遺伝子の5’側領域と3’側領域が連結されており、ilvH(G14D)は完全な１つの遺伝子としてクローニングされている。構築された、ilvH(G14D)遺伝子を含むプラスミドを、pUC-ilvH(G14D)と命名した。
(４)ilvHラベリング用プラスミドの構築
　上記（２）で調製したpUC-Sms・Hmrを制限酵素MluIで切断し、1%アガロースゲルを用いた電気泳動に供した後、rpsL遺伝子とhph遺伝子が連結したマーカーカセットの約1.5-kbpのDNA断片をアガロースゲルから切り出し、ゲルを凍結及び融解することで、ゲルからDNAを回収した。
　回収したマーカーカセットのDNA断片を、制限酵素MluIで切断した（３）で作成したpUC-ilvH(G14D)と混合し、T4 DNAリガーゼ(タカラバイオ株式会社製)を用いて互いに結合させた。
　得られたライゲーション液で、塩化カルシウム法によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、アンピシリン　50 μg/mL、及びハイグロマイシン　50 μg/mLを含むLB寒天培地に塗布した。培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出し、このプラスミドを制限酵素MluIで切断し、挿入断片を確認した。この結果、pUC-ilvH(G14D)プラスミドの約4.7-kbpのDNA断片に加え、マーカーカセットの配列に相当する約1.5-kbpのDNA断片が認められた。
　構築されたilvHラベリング用のプラスミドをpUC-ilvH(G14D)-Sms・Hmrと命名した。
（５）TH-1株ilvH遺伝子へのG14D変異の導入
(5-1)マーカーカセットによるilvH遺伝子のラベリング（ポジティブセレクション）
　（４）で調製した環状プラスミドpUC-ilvH(G14D)-Sms・Hmrを制限酵素EcoRIとPstIで切断することで直鎖状にした。得られた直鎖状のpUC-ilvH(G14D)-Sms・Hmrで、電気パルス法（エレクトロポレーション法）により、（１）で取得したTH-1株のストレプトマイシン耐性株であるNOC269株を形質転換し、ハイグロマイシン 100 μg/mLを含むA固体培地に塗布し、H2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入したチャンバー内で、50℃にて60時間培養した。
　A固体培地上の各生育株を、ハイグロマイシン 100 μg/mL、又はストレプトマイシン 500 μg/mLを含むA固体培地にそれぞれ再ストリークし、H2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入したチャンバー内で、50℃にて60時間培養した。
　その結果得られた、ハイグロマイシン耐性かつストレプトマイシン感受性の株を鋳型として用いて、ilvH遺伝子を含むDNA領域をコロニーPCR法により増幅した。PCRには、以下のプライマーを用いた。（３）で用いた(a-3)及び(b-4)のプライマーの組み合わせであり、野生型のTH-1株のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行うと、ilvH遺伝子を含む約2.0-kbpのDNA領域が増幅する。PCRは、ライフテクノロジーズ社製の「DNAサーマルサイクラー」を用い、反応試薬としてTaKaRa Ex Taq(タカラバイオ株式会社製)を用いて、常法により行った。
 
ilvH遺伝子を含む領域増幅用プライマー
(a-3)  5’-ATGAATTCCCCGGAAGCGACAAGCAGTTCCTGGGG-3’（配列番号11）
(b-4)  5’-TTCTGCAGGCGCTTTGCCGCTTTGGTCCTGATGCA-3’（配列番号14）
 
　生成した反応液を1%アガロースゲルを用いた電気泳動に供した結果、ilvHにマーカーカセットが挿入された配列に相当する約3.5-kbpのDNA断片が検出された。このilvH遺伝子にマーカーカセットが挿入された、即ちilvH遺伝子がマーカーによりラベリングされた株をNOC278株と命名した。
(5-2)ilvH遺伝子のilvH(G14D)遺伝子による置換（カウンターセレクション）
　（３）で調製した環状プラスミドpUC-ilvH(G14D)を制限酵素EcoRIとPstIで切断することで直鎖状にした。得られた直鎖状のpUC-ilvH(G14D)で、電気パルス法（エレクトロポレーション法）により、(5-1)で取得したilvH遺伝子のラベリング株であるNOC278株を形質転換し、ストレプトマイシン 500 μg/mLを含むA固体培地に塗布し、H2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入したチャンバー内で、50℃にて60時間培養した。
　A固体培地上の各生育株を、ハイグロマイシン 100 μg/mL、又はストレプトマイシン 500 μg/mLを含むA固体培地にそれぞれ再ストリークし、H2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入したチャンバー内で、50℃にて60時間培養した。
　その結果得られた、ハイグロマイシン感受性かつストレプトマイシン耐性の株を鋳型として用いて、ilvH遺伝子を含むDNA領域をコロニーPCR法により増幅した。コロニーPCRは (5-1)と同様の方法で行った。
　生成した反応液を1%アガロースゲルを用いた電気泳動に供した結果、野生型のTH-1株のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行った場合と同様の約2.0-kbpのDNA断片が検出された。即ち、マーカーカセットが抜け落ちた配列に相当する。
　この増幅した約2.0-kbpのDNA断片を制限酵素MluIで切断し、1%アガロースゲルを用いた電気泳動に供したところ、（３）でG14Dの変異と共に導入したMluIサイトで切断された場合に生じる、２本の約1.0-kbpのDNA断片が検出された。野生型のTH-1株のゲノムDNAを鋳型とした場合に増幅する約2.0-kbpのDNA断片は、MluIサイトが含まれないため、制限酵素MluIを反応させても切断されず、2.0-kbpのままである。従って、MluIにより切断されて、２本の約1.0-kbpのDNA断片が検出される株は、ilvH遺伝子がilvH(G14D)遺伝子により置換された、即ちilvH遺伝子にG14D変異が導入された株である。このilvH遺伝子のG14D変異株をNOC279株と命名した。
（６）バリンによるフィードバック阻害の脱感作の確認
　ヒドロゲノフィラス属細菌の野生型ilvH遺伝子のG14D変異株であるNOC279株をそれぞれバリン 1 mM、10 mMを含むA液体培地5 mLの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、試験管にH2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入して、50℃で震盪培養した。
　野生型のヒドロゲノフィラス属細菌は、1 mMのバリンの存在下で生育が阻害されるが、アセトラクテートシンターゼIIIをコードする遺伝子にG14Dの変異が導入されたNOC279株は、10 mMのバリン存在下でも生育が阻害されなかった。このように、NOC279株はバリンのフィードバック阻害を脱感作している。
（７）バリン生成
　ヒドロゲノフィラス　サーモルテオラスのilvH遺伝子のG14D変異株であるNOC279株をA液体培地に白金耳を用いて植菌し、H2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを培養に伴い供給し、50℃にて30時間、振盪培養した。
　培養後、遠心分離(4℃、15,000 rpm、1分間) により得た培養上清のバリンの定量を行ったところ、培地上清中に9 mMのバリンが生成していた。なお、野生型のヒドロゲノフィラス　サーモルテオラス TH-1株を同様に培養し、培養上清のバリンの定量を行った場合は、0.1 mM以下であった。
（８）寄託菌株
　ヒドロゲノフィラス　サーモルテオラスNOC279株を、独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8（郵便番号292-0818）に寄託した。ヒドロゲノフィラス　サーモルテオラスNOC279株の、受託番号はNITE BP-02829であり、受託日は2018年11月22日である。従って、この菌株は公に利用可能である。
　また、本明細書に記載した全ての菌株は、ブダペスト条約の下で国際寄託されているか、条件なく誰でも分譲を受けることができる機関が保有しているか、市販されているか、又はこれらの株の操作により誰でも取得でき、公に利用可能である。
　本発明の遺伝子組換え体は、二酸化炭素を唯一の炭素源として、工業規模でバリンを効率よく生成するため、二酸化炭素による地球温暖化を抑制しながら、医薬、食品、化粧品、家畜用飼料添加物などとして利用されるバリンを工業規模で製造することができる。

Claims (13)

  1. 　下記(1)～(3)の何れかの変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット。
    (1)　配列番号1のアミノ酸配列において、下記(a)～(h)の何れかの変異を有する変異アミノ酸配列からなる変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット
    (a)　アミノ酸番号11のAsnのAsp、His、又はAlaへの置換
    (b)　アミノ酸番号14のGlyのAsp、又はAlaへの置換
    (c)　アミノ酸番号17のSerのPheへの置換
    (d)　アミノ酸番号29のAsnのLys、Tyr、Asp、又はHisへの置換
    (e)　アミノ酸番号34のThrのIleへの置換
    (f)　アミノ酸番号36のAlaのValへの置換
    (g)　アミノ酸番号84のArg以降の全てのアミノ酸の欠失
    (h)　アミノ酸番号131のLeuのArgへの置換
    (2)　(1)に記載の変異アミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット活性を有すると共にバリンによるフィードバック阻害が抑制された変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット
    （但し、変異アミノ酸配列が(a)の変異を有する場合はアミノ酸番号11のアミノ酸はAsp、His、又はAlaであり、
    変異アミノ酸配列が(b)の変異を有する場合、アミノ酸番号14のアミノ酸はAsp、又はAlaであり、
    変異アミノ酸配列が(c)の変異を有する場合、アミノ酸番号17のアミノ酸はPheであり、
    変異アミノ酸配列が(d)の変異を有する場合、アミノ酸番号29のアミノ酸はLys、Tyr、Asp、又はHisであり、
    変異アミノ酸配列が(e)の変異を有する場合、アミノ酸番号34のアミノ酸はIleであり、
    変異アミノ酸配列が(f)の変異を有する場合、アミノ酸番号36のアミノ酸はValであり、
    変異アミノ酸配列が(g)の変異を有する場合、アミノ酸番号84以降の全てのアミノ酸は欠失しており、
    変異アミノ酸配列が(h)の変異を有する場合、アミノ酸番号131のアミノ酸はArgである。）
    (3)　(1)に記載の変異アミノ酸配列において、1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット活性を有すると共にバリンによるフィードバック阻害が抑制された変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット
    （但し、変異アミノ酸配列が(a)の変異を有する場合はアミノ酸番号11のアミノ酸はAsp、His、又はAlaであり、
    変異アミノ酸配列が(b)の変異を有する場合、アミノ酸番号14のアミノ酸はAsp、又はAlaであり、
    変異アミノ酸配列が(c)の変異を有する場合、アミノ酸番号17のアミノ酸はPheであり、
    変異アミノ酸配列が(d)の変異を有する場合、アミノ酸番号29のアミノ酸はLys、Tyr、Asp、又はHisであり、
    変異アミノ酸配列が(e)の変異を有する場合、アミノ酸番号34のアミノ酸はIleであり、
    変異アミノ酸配列が(f)の変異を有する場合、アミノ酸番号36のアミノ酸はValであり、
    変異アミノ酸配列が(g)の変異を有する場合、アミノ酸番号84以降の全てのアミノ酸は欠失しており、
    変異アミノ酸配列が(h)の変異を有する場合、アミノ酸番号131のアミノ酸はArgである。）
  2. 　下記(4)～(6)の何れかの変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット遺伝子。
    (4)　配列番号2の塩基配列において、下記(a)～(h)の何れかの変異を有する変異塩基配列からなるからなる遺伝子
    (i)　塩基番号31～33のAACのGAT、GAC、CAT、CAC、GCT、GCC、GCA、又はGCGへの置換
    (j)　塩基番号40～42のGGCのGAT、GAC、GCT、GCC、GCA、又はGCGへの置換
    (k)　塩基番号49～51のTCGのTTT、又はTTCへの置換
    (l)　塩基番号85～87のAACのAAA、AAG、TAT、TAC、GAT、GAC、CAT、又はCACへの置換
    (m)　塩基番号100～102のACCのATT、ATC、又はATAへの置換
    (n)　塩基番号106～108のGCAのGTT、GTC、GTA、又はGTGへの置換
    (o)　塩基番号250～252のCGCのTAA、TAG、又はTGAへの置換
    (p)　塩基番号391～393のCTCのCGT、CGC、CGA、CGG、AGA、又はAGGへの置換
    (5)　(4)に記載の変異塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であり、かつアセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット活性を有すると共にバリンによるフィードバック阻害が抑制された変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニットをコードする遺伝子
    （但し、変異塩基配列が(i)の変異を有する場合、塩基番号31～33の塩基はGAT、GAC、CAT、CAC、GCT、GCC、GCA、又はGCGであり、
    変異塩基配列が(j)の変異を有する場合、塩基番号40～42の塩基はGAT、GAC、GCT、GCC、GCA、又はGCGであり、
    変異塩基配列が(k)の変異を有する場合、塩基番号49～51の塩基はTTT、又はTTCであり、
    変異塩基配列が(l)の変異を有する場合、塩基番号85～87の塩基はAAA、AAG、TAT、TAC、GAT、GAC、CAT、又はCACであり、
    変異塩基配列が(m)の変異を有する場合、塩基番号100～102の塩基はATT、ATC、又はATAであり、
    変異塩基配列が(n)の変異を有する場合、塩基番号106～108の塩基はGTT、GTC、GTA、又はGTGであり、
    変異塩基配列が(o)の変異を有する場合、塩基番号250～252の塩基はTAA、TAG、又はTGAであり、
    変異塩基配列が(p)の変異を有する場合、塩基番号391～393の塩基はCGT、CGC、CGA、CGG、AGA、又はAGGである。）
    (6)　(4)に記載の変異塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット活性を有すると共にバリンによるフィードバック阻害が抑制された変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニットをコードする遺伝子
    （但し、変異塩基配列が(i)の変異を有する場合、塩基番号31～33の塩基はGAT、GAC、CAT、CAC、GCT、GCC、GCA、又はGCGであり、
    変異塩基配列が(j)の変異を有する場合、塩基番号40～42の塩基はGAT、GAC、GCT、GCC、GCA、又はGCGであり、
    変異塩基配列が(k)の変異を有する場合、塩基番号49～51の塩基はTTT、又はTTCであり、
    変異塩基配列が(l)の変異を有する場合、塩基番号85～87の塩基はAAA、AAG、TAT、TAC、GAT、GAC、CAT、又はCACであり、
    変異塩基配列が(m)の変異を有する場合、塩基番号100～102の塩基はATT、ATC、又はATAであり、
    変異塩基配列が(n)の変異を有する場合、塩基番号106～108の塩基はGTT、GTC、GTA、又はGTGであり、
    変異塩基配列が(o)の変異を有する場合、塩基番号250～252の塩基はTAA、TAG、又はTGAであり、
    変異塩基配列が(p)の変異を有する場合、塩基番号391～393の塩基はCGT、CGC、CGA、CGG、AGA、又はAGGである。）
  3. 　請求項１に記載の変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニットを生成するヒドロゲノフィラス属細菌。
  4. 　請求項２に記載の変異アセトラクテートシンターゼIII 小サブユニット遺伝子を有するヒドロゲノフィラス属細菌。
  5. 　請求項３又は４に記載のヒドロゲノフィラス属細菌を、二酸化炭素を実質的に唯一の炭素源として用いて培養する工程を含むバリンの製造方法。
  6. 　下記(7)、(8)、又は(9)のストレプトマイシン感受性遺伝子を含むヒドロゲノフィラス属細菌用カウンターセレクションマーカー。
    (7)　配列番号3の塩基配列からなるストレプトマイシン感受性遺伝子
    (8)　配列番号3の塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であり、かつヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株にストレプトマイシン感受性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
    (9)　配列番号3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株にストレプトマイシン感受性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
  7. 　請求項６に記載のカウンターセレクションマーカーとヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株を用いるヒドロゲノフィラス属細菌の遺伝子組換え体の製造方法。
  8. (A)　ヒドロゲノフィラス属細菌の変異標的遺伝子からなるDNA断片の5’末端側領域と3’末端側領域の間に、ストレプトマイシン感受性遺伝子を含むDNA断片と、ポジティブセレクションマーカー遺伝子を含むDNA断片とが連結したマーカーカセットが挿入されたラベリング用DNA断片を作製する工程と、
    (B)　このラベリング用DNA断片を、ヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株に導入する操作を行い、上記ポジティブセレクションマーカーの性質を有することを指標にして、このストレプトマイシン耐性株の標的遺伝子が上記ラベリング用DNA断片に置換された遺伝子組換え体を選択する工程と、
    (C)　ヒドロゲノフィラス属細菌の上記変異標的遺伝子からなるDNA断片を、この遺伝子組換え体に導入する操作を行い、ストレプトマイシン耐性であることを指標にして、ゲノム上の上記ラベリング用DNAの領域が変異標的遺伝子に置換された遺伝子組換え体を選択する工程
    を含む、ヒドロゲノフィラス属細菌の遺伝子組換え体の製造方法。
  9. 　ストレプトマイシン感受性遺伝子が下記(7)、(8)、又は(9)の遺伝子である、請求項８に記載の方法。
    (7)　配列番号3の塩基配列からなるストレプトマイシン感受性遺伝子
    (8)　配列番号3の塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であり、かつヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株にストレプトマイシン感受性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
    (9)　配列番号3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株にストレプトマイシン感受性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
  10. (D)　ヒドロゲノフィラス属細菌の変異標的遺伝子のDNA断片、及びストレプトマイシン感受性遺伝子を含むDNA断片とポジティブセレクションマーカー遺伝子を含むDNA断片とが連結したマーカーカセットを含むラベリング用環状DNAを作製する工程と、
    (E)　このラベリング用環状DNAを、ヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株に導入する操作を行い、上記ポジティブセレクションマーカーの性質を有することを指標にして、このストレプトマイシン耐性株の標的遺伝子に、上記ラベリング用環状DNAが直鎖状になって挿入された遺伝子組換え体を選択する工程と、
    (F)　その遺伝子組換え体の中から、ストレプトマイシン耐性であることを指標にして、ゲノム上に挿入された上記ラベリング用DNAの領域が脱落した遺伝子組換え体を選択する工程と、
    (G)　その遺伝子組換え体の中から、標的遺伝子に変異が導入された遺伝子組換え体を選択する工程
    を含む、ヒドロゲノフィラス属細菌の遺伝子組換え体の製造方法。
  11. 　ストレプトマイシン感受性遺伝子が下記(7)、(8)、又は(9)の遺伝子である、請求項１０に記載の方法。
    (7)　配列番号3の塩基配列からなるストレプトマイシン感受性遺伝子
    (8)　配列番号3の塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であり、かつヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株にストレプトマイシン感受性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
    (9)　配列番号3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつヒドロゲノフィラス属細菌のストレプトマイシン耐性株にストレプトマイシン感受性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
  12. 　下記(10)、(11)、又は(12)のハイグロマイシン耐性遺伝子を含むヒドロゲノフィラス属細菌用ポジティブセレクションマーカー。
    (10)　配列番号4の塩基配列からなるハイグロマイシン耐性遺伝子
    (11)　配列番号4の塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であり、かつヒドロゲノフィラス属細菌にハイグロマイシン耐性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
    (12)　配列番号4の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつヒドロゲノフィラス属細菌にハイグロマイシン耐性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
  13. 　下記(13)、(14)、又は(15)のカナマイシン耐性遺伝子を含むヒドロゲノフィラス属細菌用ポジティブセレクションマーカー。
    (13)　配列番号5又は6の塩基配列からなるカナマイシン耐性遺伝子
    (14)　配列番号5又は6の塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であり、かつヒドロゲノフィラス属細菌にカナマイシン耐性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
    (15)　配列番号5又は6の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつヒドロゲノフィラス属細菌にカナマイシン耐性を与える活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
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