CN107278225A - 能够产生喹啉酸的微生物及使用该微生物产生喹啉酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及能够产生喹啉酸的微生物；以及使用该微生物产生喹啉酸的方法。

Description

能够产生喹啉酸的微生物及使用该微生物产生喹啉酸的方法

技术领域

本公开涉及具有喹啉酸产生能力的微生物及使用该微生物产生喹啉酸的方法。

背景技术

喹啉酸被称为2，3-吡啶二羧酸，并且用于诸如医药、农业化学品和染色材料的众多领域作为化学化合物的前体。

可以通过化学合成方法或生物合成方法制备喹啉酸。由于化学合成方法使用源自石油的不可再生材料作为原料，因此具有受到环境问题、油价或石油开采成本影响较大的问题。

作为生物合成方法的代表性实例，有用于产生喹啉酸的方法，其中将编码L-天冬氨酸氧化酶(NadB)和喹啉酸合酶(NadA)的基因克隆到各自具有不同拷贝数的质粒中，并且在其中去除了喹啉酸磷酸核糖基转移酶活性的大肠杆菌中增强了这两种酶的表达后，由该菌株产生喹啉酸(Eur.J.Biochem.175，221-228(1988)，DE3826041)。然而，在这种情况下，喹啉酸的浓度为500mg/L或更低，这是非常低的水平。

以如此低浓度产生喹啉酸的第一个原因是NadR抑制了转录阶段的表达调控，NadR是编码L-天冬氨酸氧化酶的nadB和编码喹啉酸合酶的nadA基因的NAD相关的转录阶段抑制因子。第二个原因是NAD对NadB蛋白(其是L-天冬氨酸氧化酶)的反馈抑制，和第三个原因被确定为其自身使用的大肠杆菌具有从碳源到L-天冬氨酸的弱生物合成途径。

公开

技术问题

作为解决所述问题的第一个原因的方法，本发明人发现了高活性外源性喹啉酸合酶，并且已经做出大量努力以增加使用它们产生喹啉酸的产量。结果，当将源自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的喹啉酸合酶活性引入具有喹啉酸产生能力的微生物中时，发现与使用源自大肠杆菌(Escherichia coli)的喹啉酸合酶相比，喹啉酸的产生能力更优良，从而完成本公开。

技术方案

本公开的目的是提供具有喹啉酸产生力的微生物，其被转化为具有源自肺炎克雷伯氏菌的喹啉酸合酶活性。

本公开的另一目的是提供使用具有喹啉酸产生能力的微生物产生喹啉酸的方法。

有益效果

本公开的具有喹啉酸产生能力的微生物，可以有价值地用于有效产生喹啉酸。

最佳实施方式

本公开的具体方面是具有喹啉酸产生能力的微生物，其被转化为具有源自肺炎克雷伯氏菌的喹啉酸合酶活性。

如本文所用，术语“喹啉酸合酶”是指具有从亚氨基丁二酸合成喹啉酸的活性的酶。喹啉酸合酶的EC编号为2.5.1.72，也被命名为NadA。喹啉酸合酶的活性如下。

[喹啉酸合酶的活性]

α-亚氨基丁二酸+磷酸二羟丙酮<＝>喹啉酸+磷酸盐+2H₂O

用于本公开的喹啉酸合酶是源自克雷伯氏菌(Klebsiella)的喹啉酸合酶，具体地，可以是源自肺炎克雷伯氏菌的喹啉酸合酶。在本公开中，源自肺炎克雷伯氏菌的喹啉酸合酶也被命名为NadA(KP)。

源自肺炎克雷伯氏菌的喹啉酸合酶的序列可以容易地从本领域已知的数据库获得，诸如美国国家生物技术信息中心(NCBI)和日本DNA数据库(DDBJ)，并且其实例包括但不限于具有NCBI GenBank登记号339761016的基因序列。

源自肺炎克雷伯氏菌的喹啉酸合酶，可以是具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白。此外，作为与SEQ ID NO：1具有80％或更多，具体是90％或更多，更具体是95％或更多，甚至更具体是99％或更多同源性的蛋白，如果它是具有与源自肺炎克雷伯氏菌的喹啉酸合酶基本上相同或相当的生物学活性的氨基酸序列，很明显，在本公开的范围内包括这样的情况：其中一些序列具有氨基酸序列的缺失、修改，取代或添加。

此外，编码源自肺炎克雷伯氏菌的喹啉酸合酶的多核苷酸，可以具有编码SEQ IDNO：1的氨基酸序列的核苷酸序列。由于密码子的简并性或考虑到蛋白将在其中被表达的生物体中的密码子偏好性，在不会改变所述蛋白的氨基酸序列的范围内的编码区中多核苷酸可以具有各种修改。多核苷酸序列可以具有例如SEQ ID NO：2的核苷酸序列，并且可以具有80％或更多，具体是90％或更多，更具体是99％或更多的同源性，但不限于此。

如本文所用，术语“同源性”是指两个多核苷酸或两个多肽部分之间的同一性百分比。可以通过已知技术来确定从一部分到另一部分的序列之间的同源性。例如，可以使用容易获得的能够比对序列信息的计算机程序，通过直接比对两个多核苷酸分子或两个多肽分子之间的序列信息来确定同源性。计算机程序可以是BLAST(NCBI)、CLC Main Workbench(CLC bio)、MegAlign TM(DNASTAR，Inc.)等。此外，通过在同源区域之间产生稳定双链的条件下进行多核苷酸的杂交，然后通过单链特异性核酸酶进行降解以确定降解片段的大小，可以确定多核苷酸之间的同源性。

特别地，与其内源性喹啉酸合酶活性相比，转化成具有源自肺炎克雷伯氏菌的喹啉酸合酶活性的具有喹啉酸产生能力的微生物，可具有增强的喹啉酸合酶活性。

如本文所用，术语“内源性活性”是指目的蛋白在其天然状态(即在其不变状态)的活性状态。“与内源性活性相比，增强”是指与在其天然状态的蛋白活性相比，活性增加，并且是这样的概念：其还包括将所述活性引入到没有所述蛋白活性的微生物中。

可以通过本领域众所周知的各种方法来实现这种活性的增强，例如，可以使用将包含编码所述蛋白的核苷酸序列的多核苷酸插入到染色体中的方法，将编码所述蛋白的多核苷酸引入到载体系统从而将其引入微生物中的方法，引入位于编码所述蛋白的多核苷酸上游的具有增强的表达能力的启动子或引入其中对启动子进行修改的蛋白的方法，引入编码所述蛋白的多核苷酸变体的方法等。此外，当微生物具有所述蛋白活性时，可以进行以下方法：修改编码所述蛋白的基因表达调控序列的方法，或者将修改引入到编码所述蛋白的染色体上基因的方法以增强蛋白活性等，但是所述方法不受上述实例的限制。此外，当增强本说明书中其它蛋白的活性时，可以同样参考用于增强这种活性的方法。

例如，作为具有增强的表达能力的启动子，可以使用已知的启动子，例如可以包括cj1启动子(第0620092号韩国注册专利)、lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子，λ噬菌体PR启动子、PL启动子和tet启动子。

如本文所用，术语“载体”是指含有编码目标蛋白的多核苷酸的核苷酸序列的DNA产物，所述多核苷酸可操作地连接到合适的调控序列以便能够在合适的宿主内表达目标蛋白。调控序列包括能启动转录的启动子，用于调控这种转录的任何操纵子序列，编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列，以及调控转录和翻译终止的序列。可以将载体转化进入合适的宿主，然后可以独立于宿主基因组被复制或起作用，并且可以整合入基因组本身。

本公开中使用的载体没有特别限制，只要其在宿主中可复制，并且可以使用本领域已知的任何载体。常规使用的载体的实例包括其天然或重组状态的质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，可以将pWE15载体、M13载体、λMBL3载体、λMBL4载体、λIXII载体、λASHII载体、λAPII载体、λt10载体、λt11载体、Charon4A载体和Charon21A载体等用作噬菌体载体或粘粒载体，并且可以将PBR载体、pUC载体、pBluescriptII载体、pGEM载体、pTZ载体、pCL载体、pET载体等用作质粒载体。具体地，可以使用pACYC177载体、pACYC184载体、pCL载体、pECCG117载体、pUC19载体、pBR322载体、pMW118载体、PCC1BAC载体等。然而，所述载体不限于此。

如本文所用，术语“转化”是指其中将含有编码目标蛋白的多核苷酸的载体引入到宿主细胞，使得由多核苷酸编码的蛋白可以在宿主细胞中表达的一系列操作。引入宿主细胞的多核苷酸可以是任何形式，只要其可以被引入宿主细胞并表达即可。例如，多核苷酸可以以表达盒的形式引入宿主细胞，所述表达盒是包含自身表达所需要的所有元件的结构(与多核苷酸可操作连接的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点、翻译终止信号等)，并且表达盒可以是能够自我复制的表达载体的形式。此外，所述多核苷酸也可以以其自身的形式引入至宿主细胞，从而可操作地连接至宿主细胞中用于表达的所需序列。

此外，如上所述，术语“可操作地连接”是指引发和介导编码本公开的目标蛋白的多核苷酸进行转录的启动子序列和所述基因序列是功能性连接的。

基于初始微生物菌株的活性或浓度，所述蛋白的这种活性增加通常可以使得相应蛋白的活性或浓度增加至少1％、10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或500％，高达1,000％或2,000％，但不限于此。

此外，与其内源性L-天冬氨酸氧化酶活性相比，具有喹啉酸生成能力的微生物还可以具有增强的L-天冬氨酸氧化酶活性。

如本文所用，术语“L-天冬氨酸氧化酶”是指具有将L-天冬氨酸氧化成亚氨基丁二酸的活性的酶。L-天冬氨酸氧化酶的EC编号为1.4.3.16，可以命名为NadB。L-天冬氨酸氧化酶的活性如下。

[L-天冬氨酸氧化酶的活性]

L-天冬氨酸+延胡索酸<＝>α-亚氨基丁二酸+琥珀酸+H⁺，或者，

L-天冬氨酸+氧<＝>过氧化氢+α-亚氨基丁二酸+H⁺

此外，可以容易地从参考文献(Mol.Syst.Biol.2006；2：2006.0007.Epub 2006Feb21)公开的大肠杆菌的基因组序列或从本领域已知的数据库(如NCBI和DDBJ)获得L-天冬氨酸氧化酶序列。

作为实例，L-天冬氨酸氧化酶不仅可以是具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的蛋白，而且也可以是与其具有80％或更多，具体是90％或更多，更具体是95％或更多，甚至更具体是99％或更多同源性的蛋白，但不限于此。基本上，只要是具有与L-天冬氨酸氧化酶相同或相当的生物活性的氨基酸序列，很明显在本公开的范围内包括这样的情况：其中一些序列具有氨基酸序列的缺失、修改，取代或添加。

此外，编码L-天冬氨酸氧化酶的多核苷酸可以具有编码SEQ ID NO：19的氨基酸序列的核苷酸序列。由于密码子的简并性或考虑到所述蛋白将在其中被表达的生物体中的密码子偏好性，在不改变所述蛋白氨基酸序列的范围内的编码区中多核苷酸可以具有各种修改。此外，所述多核苷酸序列可以具有SEQ ID NO：20的多核苷酸序列，并且可以是与其具有80％或更多，具体是90％或更多，更具体是95％或更多同源性的核苷酸序列。然而，实施多核苷酸序列不限于此。

此外，与其内源性喹啉酸磷酸核糖基转移酶活性相比，埃希氏杆菌属的微生物还可能具有减弱的喹啉酸磷酸核糖基转移酶活性。

喹啉酸磷酸核糖基转移酶是指具有将喹啉酸转化为烟酸单核苷酸的活性的酶。喹啉酸磷酸核糖基转移酶的EC编号为2.4.2.19，也被命名为NadC。喹啉酸磷酸核糖基转移酶的活性表达如下。

[喹啉酸磷酸核糖基转移酶的活性]

5-磷酸-α-D-核糖1-二磷酸+喹啉酸+2H⁺<＝>CO₂+二磷酸+烟酸单核苷酸

此外，可以容易地从参考文献(Mol.Syst.Biol.2006；2：2006.2007.Epub 2006Feb21)公开的大肠杆菌的基因组序列(GI：89106990)或从本领域已知的数据库(如NCBI和DDBJ)获得喹啉酸磷酸核糖基转移酶序列，并且作为实例，其不仅可以具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，而且还具有与其有80％或更多，具体是90％或更多，更具体是95％或更多，甚至更具体是99％或更多同源性的蛋白，但不限于此。

此外，编码喹啉酸磷酸核糖基转移酶的多核苷酸可以具有编码SEQ ID NO：3的氨基酸序列的核苷酸序列。由于密码子的简并性或考虑到所述蛋白将在其中被表达的生物体中的密码子偏好性，在不改变蛋白氨基酸序列的范围内的编码区中所述多核苷酸可以具有各种修改。此外，所述多核苷酸序列可以具有例如SEQ ID NO：4的多核苷酸序列，并且可以具有与其有80％或更多，具体是90％或更多，更具体是95％或更多同源性的核苷酸序列，但是不限于此。

与其内源性活性相比，通过减弱NadC活性可以增加细胞中喹啉酸的积累。

与内源性活性相比，蛋白活性的减弱是这样的概念：与其天然状态中原始微生物的蛋白活性相比，包括所述活性降低或所述活性不存在两种情况。

可以通过应用本领域众所周知的各种方法来实现蛋白活性的这种减弱。作为该方法的实例，存在删除编码所述蛋白的染色体上全部或部分基因的方法，其包括去除蛋白活性的情况；用突变基因替换染色体上编码所述蛋白的基因以降低酶活性的方法；将修改引入编码所述蛋白的染色体上基因的表达调控序列的方法；用具有弱活性或没有活性的序列替换编码所述蛋白的基因的表达调控序列的方法(例如，用比内源性启动子弱的启动子替换所述基因的启动子的方法)；引入与染色体上基因的转录物互补结合并抑制mRNA翻译成蛋白的反义寡核苷酸(例如反义RNA)的方法；将与SD序列互补的序列人工添加到编码所述蛋白的基因的SD序列前面以形成二级结构而使得核糖体不可能附着的方法；和逆转录工程(RTE)方法，其中加入启动子以逆转相应序列的开放阅读框(ORF)的3′末端等，并且还可以通过这些的组合来实现，但是没有特别限定于上述实例。

具体地，可以通过用其中已经删除一些核酸序列的多核苷酸或通过载体来插入至微生物染色体的标记基因以替换染色体中编码目标蛋白的多核苷酸，进行删除编码所述蛋白的全部或部分基因的方法。作为这种方法的实例，可以使用通过同源重组来删除基因的方法，但不限于此。此外，在上述中，术语“部分”根据多核苷酸的类型而变化，并且可以由本领域技术人员适当确定，具体地可以是1-300个，更具体地1-100个，甚至更具体地1-50个，但不限于此。

此外，可以通过在核酸序列中进行缺失、插入、非保守取代或保守取代或其组合来诱导表达调控序列中的修改以进一步减弱表达调控序列的活性，或用具有弱得多活性的核酸序列进行替换，来实施修改表达调控序列的方法。表达调控序列可以包括启动子序列、操纵子序列、编码核糖体结合位点的序列，以及调孔转录和翻译终止的序列，但不限于此。

此外，可以通过进行缺失、插入、非保守取代或保守取代或其组合在序列中诱导修改以进一步减弱蛋白活性，或通过用改进的基因序列以具有较弱的活性或用改进的没有任何活性的基因序列进行替换，来实施修改染色体上基因序列的方法，但不限于此。

此外，与内源性活性相比，埃希氏菌属(Escherichia)的微生物可另外具有增强的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PPC)或L-天冬氨酸转氨酶活性。

磷酸烯醇丙酮酸羧化酶是介导由磷酸烯醇丙酮酸和CO₂产生草酰乙酸的反应的酶。磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的EC编号为4.1.1.31，也被命名为PPC。

[磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性]

磷酸烯醇丙酮酸+CO₂->草酰乙酸+磷酸

此外，L-天冬氨酸转氨酶具有从磷酸烯醇丙酮酸合成L-天冬氨酸的活性。L-天冬氨酸转氨酶的EC编号为2.6.1.1，也可以被命名为AspC或L-天冬氨酸氨基转移酶。

[L-天冬氨酸转氨酶的活性]

草酰乙酸+谷氨酸<＝>L-天冬氨酸+2-酮-谷氨酸

可以从参考文献(Mol.Syst.Biol.2006；2：2006.0007.Epub 2006Feb 21)公开的基因组序列(gi：89110074，GI：89107778)或从数据库(如NCBI和DDBJ)获得编码所述酶的基因ppc和aspC的序列。

PPC和AspC介导了从磷酸烯醇丙酮酸合成L-天冬氨酸(其作为喹啉酸前体)，并且当其活性增强时，可以增加L-天冬氨酸(其为细胞中喹啉酸的前体)的产生，从而可以提高喹啉酸的产生。

如本文所用，术语“具有喹啉酸的产生能力的微生物”是指能够在培养基中从碳源产生喹啉酸的微生物。此外，产生喹啉酸的微生物可以是重组微生物。具体地，产生喹啉酸的微生物的种类没有特别限定，只要能够产生喹啉酸即可，并且可以是属于肠杆菌属(Enterobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、普罗威登斯菌属(Providencia)、棒状杆菌属(Corynebacterium)和短杆菌属(Brevibacterium)的微生物，具体地可以是属于埃希氏菌属，更具体地，可以是大肠杆菌的微生物，但不限于此。

本公开的另一具体方面是使用具有喹啉酸产生能力，并且还具有源自肺炎克雷伯氏菌的喹啉酸合酶活性的微生物产生喹啉酸的方法。

具体地，该方法可以包括：(a)在培养基中培养微生物；和(b)从步骤(a)中所培养的微生物、所述培养基或两者中回收喹啉酸。

可以根据本领域已知的合适的培养基和培养条件进行微生物的培养。可以根据本领域技术人员选择的微生物，容易地调整和使用这种培养方法。培养方法包括分批培养、连续培养和补料分批培养，但不限于此。培养微生物的各种方法公开于例如，“BiochemicalEngineering”by James M.Lee，Prentice-Hall International Editions，pp 138-176。

用于培养的培养基可以是适合满足特定微生物要求的培养基。各种微生物的培养基公开在参考文献(美国细菌学会的“Manual of Methods for General Bacteriology”，Washington D.C.，USA，1981)中。所述培养基包含各种碳源成分、氮源成分和微量元素成分。

可用于培养微生物的培养基中的碳源包括：碳水化合物(如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素)、脂肪(如大豆油、向日葵油、蓖麻油和椰子油)、脂肪酸(如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)、甘油、醇(如乙醇)和有机酸(如乙酸)，但不限于此。可以单独使用或组合使用碳源。

可用于培养微生物的培养基中的氮源包括：有机氮源和诸如蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆(CSL)和大豆小麦的成分，以及无机氮源(如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)，但不限于此。可以单独使用或组合使用氮源。

用于培养微生物的培养基可以包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和相应的含钠盐作为磷源。此外，它可以包括诸如硫酸镁或硫酸铁的金属盐。此外，培养基中可以包括氨基酸、维生素和合适的前体等，但是所述培养基不限于此。可以将用于培养微生物的培养基或各个成分分批地或连续地加入到培养溶液中。

此外，在培养过程中，可以以适当的方式向微生物培养液中加入诸如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸等化合物，以调整培养液的pH值。此外，通过在培养期间使用消泡剂(如脂肪酸聚乙二醇酯)可以抑制气泡形成。为了维持培养液的需氧条件，可以向培养液中注入氧气或含氧气体(例如空气)。培养液的温度通常可以在20℃至45℃的范围，特别是25℃至40℃。可以继续该培养期直到获得期望量的喹啉酸，并且可以具体地在10小时至160小时的范围。

在步骤(b)中，可以通过本领域众所周知的各种方法进行回收喹啉酸的步骤，并且可以包括纯化步骤。

发明详述

在下文中，将参照以下示例性实施方案来详细描述本公开。然而，这些示例性实施方案用于更详细地解释本公开，并且这些示例性实施方案并不意图限制本公开的范围。

实施例1.制备产生喹啉酸的菌株

1-1.制备去除喹啉酸磷酸核糖基转移酶的菌株

进行以下实验以删除编码参与喹啉酸降解途径的喹啉酸磷酸核糖基转移酶的nadC基因。

通过使用大肠杆菌K12W3110的染色体DNA作为模板进行PCR，获得喹啉酸降解途径的nadC基因。从国立卫生研究院(NIH)的GenBank获得nadC基因的核苷酸序列信息(NCBI登记号“GI：89106990”，SEQ ID NO：4)，并且其氨基酸序列与SEQ ID NO：3相同。基于SEQ IDNO：4，合成扩增nadC基因下游区域的SEQ ID NO：5的引物和SEQ ID NO：6的引物，扩增nadC和loxpCm的上游区域和下游区域的SEQ ID NO：7的引物和SEQ ID NO：8的引物，以及扩增上游区域的SEQ ID NO：9的引物和SEQ ID NO：10的引物。

使用大肠杆菌K12 W3110的染色体DNA作为模板，并使用SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的寡核苷酸作为引物进行PCR，以分别扩增0.5kb和0.3kb的nadC基因的上游区域和下游区域。此外，通过使用pLoxpCat2载体(其为含有作为模板的loxpCm(Genbank登录号：AJ401047)的质粒载体)，和通过使用SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的寡核苷酸作为引物进行PCR，以扩增在1.0kb的两端具有nadC基因同源序列的loxpCm基因。使用PfuUltra^TM DNA聚合酶(Stratagene，USA)作为聚合酶，通过重复30次循环进行PCR，所述循环由以下组成：在96℃变性30秒，在53℃退火30秒和在72℃延伸1分钟。

此后，使用通过上述PCR反应获得的nadC上游片段、nadC下游片段和loxpCm片段作为模板进行PCR，并且PCR条件是重复10次循环，所述循环由以下组成：在96℃变性60秒，在50℃变性60秒和在72℃延伸1分钟，然后在加入SEQ ID NO：5的引物和SEQ ID NO：10的引物后重复该循环20次。结果是，获得了含有1.8kb的nadC基因-上游-loxpCm-下游的nadC-缺陷盒。

在含有作为λ红色重组酶表达载体的pKD46的大肠杆菌K12W3110上，通过电穿孔转化制备的nadC-缺陷盒，并将其在含有作为选择标记物的氯霉素的Luria-Bertani(LB)平板培养基(10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物、10g/L的NaCl和1.5％的琼脂)上铺开，并且在37℃下孵育过夜后，选择对氯霉素显示抗性的菌株。

通过使用选择的菌株作为直接模板，以及通过使用SEQ ID NO：6的引物和SEQ IDNO：9的引物，在相同条件下进行PCR，通过在1.0％琼脂糖凝胶上证实：在野生型菌株的情况下该基因的大小为1.6kb，以及在去除nadC的菌株的情况下该基因的大小为1.3kb，证实删除了nadC基因。它被命名为W3110-ΔnadC。

1-2.制备去除喹啉酸合酶的菌株

为了确认源自本发明的肺炎克雷伯氏菌的喹啉酸合酶的活性，进行以下实验以删除微生物本身的编码喹啉酸合酶的nadA。

通过使用大肠杆菌K12 W3110的染色体DNA作为模板进行PCR，获得喹啉酸合酶的nadA基因。从国立卫生研究院(NIH)的GenBank获得nadA基因的核苷酸序列信息(NCBI登记号“GI：89107601”，SEQ IDNO：12)，并且其氨基酸序列与SEQ ID SEQ ID NO：11相同。基于SEQ ID NO：12，合成扩增nadA基因下游区域的SEQ ID NO：13的引物和SEQ ID NO：14的引物，扩增nadA和loxpCm的上游区域和下游区域的SEQ ID NO：15的引物和SEQ ID NO：16的引物，以及扩增上游区域的SEQ ID NO：17的引物和SEQ ID NO：18的引物。

使用大肠杆菌W3110的染色体DNA作为模板，并使用SEQ ID NO：13的引物、SEQ IDNO：14的引物、SEQ ID NO：17的引物和SEQ ID NO：18的引物进行PCR，以分别扩增0.5kb和0.5kb的nadA基因的上游区域和下游区域。此外，通过使用pLoxpCat2载体(其为含有作为模板的loxpCm(Genbank登录号：AJ401047)的质粒载体)，和通过使用SEQ ID NO：15和SEQ IDNO：16的寡核苷酸作为引物进行PCR，以扩增在1.0kb的两端具有nadA基因同源序列的loxpCm基因。使用PfuUltra^TM DNA聚合酶(Stratagene，USA)作为聚合酶，通过重复30次循环进行PCR，所述循环由以下组成：在96℃变性30秒，在53℃退火30秒和在72℃延伸1分钟。

此后，使用通过上述PCR反应获得的nadA上游片段、nadA下游片段和loxpCm片段作为模板进行PCR，并且PCR条件是重复10次循环，所述循环由以下组成：在96℃变性60秒，在50℃变性60秒和在72℃延伸1分钟，然后在加入SEQ ID NO：13的引物和SEQ ID NO：18的引物后重复该循环20次。结果是，获得了含有2.0kb的nadA基因-上游-loxpCm-下游的nadA-缺陷盒。

在含有作为λ红色重组酶表达载体的pKD46的大肠杆菌W3110-AnadC上，通过电穿孔转化制备的nadA-缺陷盒，并将其在含有作为选择标记物的氯霉素的Luria-Bertani(LB)平板培养基(10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物、10g/L的NaCl和1.5％的琼脂)上铺开，并且在37℃下孵育过夜后，选择对氯霉素显示抗性的菌株。

通过使用选择的菌株作为直接模板，以及通过使用SEQ ID NO：14的引物和SEQ IDNO：17的引物，在相同条件下进行PCR，通过在1.0％琼脂糖凝胶上证实：在野生型菌株的情况下该基因的大小为1.1kb，以及在去除nadA的菌株的情况下该基因的大小为1.3kb，证实删除了nadA基因。它被命名为W311O-ΔnadCΔnadA。

1-3.制备大肠杆菌L-天冬氨酸氧化酶表达载体

进行以下实验以增强编码L-天冬氨酸氧化酶的nadB基因。

将源自大肠杆菌的野生型nadB基因克隆到表达载体中。作为其模板，使用大肠杆菌K12W3110菌株(ATCC No.23257)的染色体。基因序列是基于来自国立卫生研究院(NIH)的GenBank的基因的核苷酸序列(NCBI登记号“GI：89109380”，SEQ ID NO：20)，并且氨基酸序列与SEQ ID NO：19相同。合成扩增nadB基因的ORF区域的具有限制性内切酶NdeI和BamHI识别位点的SEQ ID NO：21的引物和SEQ ID NO：22的引物。

使用大肠杆菌K12W3110的染色体DNA作为模板，并使用SEQID NO：21和SEQ ID NO：22的寡核苷酸作为引物进行PCR。使用PfuUltra^TM DNA聚合酶(Stratagene，USA)作为聚合酶，通过重复30次循环进行PCR，所述循环由以下组成：在96℃变性30秒，在50℃退火30秒和在72℃延伸2分钟。通过进行PCR，获得含有nadB ORF基因和限制性内切酶NdeI和BamHI的识别位点的约1.9kb的扩增基因。

通过琼脂糖凝胶洗脱来回收通过PCR获得的nadB基因，然后用限制性内切酶NdeI和BamHI处理该基因。此后，将其连接到用限制性内切酶NdeI和BamHI处理的pProLar载体(CloneTech，USA)，并且从与pPro启动子连接的nadB基因表达L-天冬氨酸氧化酶。将通过上述方法制备的载体命名为pPro-nadB载体。

1-4.制备表达喹啉酸合酶的载体

(1)制备pNadA-nadA载体

将编码源自大肠杆菌的野生型喹啉酸合酶的nadA基因克隆到表达载体中。作为其模板，使用大肠杆菌K12 W3110菌株(ATCC NO.23257)的染色体。从国立卫生研究院(NIH)的GenBank获得SEQ ID NO：12的nadA基因的核苷酸序列信息(NCBI登记号“GI：89107601”)。此外，基于此，合成能够扩增nadA基因的ATG区域和含有TAA的ORF区域的、具有限制性内切酶XbaI和BamHI的识别位点的SEQ ID NO：25的引物和SEQ ID NO：26的引物。

使用大肠杆菌W3110的染色体DNA作为模板，并使用SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26的寡核苷酸作为引物进行PCR。使用PfuUltra^TM DNA聚合酶(Stratagene，USA)作为聚合酶，通过重复30次循环进行PCR，所述循环由以下组成：在96℃变性30秒，在50℃退火30秒和在72℃延伸2分钟。结果是，获得了含有nadA基因和限制性内切酶XbaI和BamHI的识别位点的约1kb的扩增基因。

此外，基于Mendoza-Vargas等人，PLoS ONE，4：e7526，通过使用含有pNadA启动子的大肠杆菌W3110的染色体DNA进行PCR，获得了pNadA启动子。为了连接pNadA启动子和上述扩增的nadA基因，合成具有限制性内切酶PstI和XbaI的识别位点的SEQ ID NO：23的引物和SEQ ID NO：24的引物。

使用大肠杆菌W3110的染色体DNA作为模板，并使用SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24的寡核苷酸作为引物进行PCR。使用PfuUltra^TM DNA聚合酶(Stratagene，USA)作为聚合酶，并且PCR的条件是重复30次循环，所述循环由以下组成：在96℃变性30秒，在50℃退火30秒和在72℃延伸1分钟。结果是，获得含有pNadA启动子和限制性内切酶PstI和XbaI的识别位点的约0.3kb的扩增基因。

用限制性内切酶XbaI和BamHI处理通过PCR获得的nadA基因，并用PstI和XbaI处理扩增的pNadA启动子片段。将用限制性内切酶处理的nadA和pNadA启动子片段，通过连接克隆到pCL1920载体中，以制备pNadA-nadA重组载体。这与SEQ ID NO：27所示相同。

(2)制备pNadA-nadA(KP)载体

为了制备源自肺炎克雷伯氏菌的喹啉酸合酶，将编码克雷伯氏菌喹啉酸合酶的nadA(KP)基因克隆到表达载体中。为此，使用克雷伯氏菌菌株的染色体DNA作为模板。对于所述菌株，购买并使用ATCC No.25955。所使用的基因序列是国立卫生研究院(NIH)的GenBank基因的SEQ ID NO：2的核苷酸序列，并且其氨基酸序列与SEQ ID NO：1相同。对于基因克隆，合成能够扩增nadA(KP)基因区域的具有限制性内切酶XbaI和BamHI的识别位点的SEQ ID NO：28的引物和SEQ ID NO：29的引物。

使用克雷伯氏菌的染色体DNA作为模板，并使用SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29的寡核苷酸作为引物进行PCR。使用PfuUltra^TM DNA聚合酶(Stratagene，USA)作为聚合酶，通过重复30次循环进行PCR，该循环由以下组成：在96℃变性30秒，在50℃退火30秒在72℃延伸2分钟。结果是，获得了含有nadA(KP)基因和限制性内切酶XbaI和BamHI的识别位点的约1kb的扩增基因。

用限制性内切酶XbaI和BamHI处理通过PCR获得的nadA(KP)基因，并通过将用限制性内切酶处理的nadA(KP)片段连接到含有pNadA启动子的pCL1920载体上，来制备pNadA-nadA(KP)重组载体。该核苷酸序列与SEQ ID NO：30所示的相同。

1-5.制备用于表达天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合酶的质粒

(1)制备pPro-nadB-pCJ1-nadA载体

为了产生喹啉酸，必需增强两种酶(即天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合酶)。因此，制备其中可以一起表达编码这两种酶的nadB基因和nadA基因的质粒。首先，通过使用大肠杆菌W3110的染色体DNA作为模板进行PCR，获得编码喹啉酸合酶的nadA基因。使用来自国立卫生研究院(NIH)的GenBank的nadA基因的核苷酸序列信息(NCBI登记号“GI：89107601”)，并且它是与SEQ ID NO：12相同的。基于此，合成能够扩增nadA基因的ATG区域和含有TAA的ORF区域的、具有限制性内切酶ApaI和NotI的识别位点的SEQ ID NO：31的引物和SEQ ID NO：32的引物。

使用大肠杆菌W3110的染色体DNA作为模板，并使用SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32的寡核苷酸作为引物进行PCR。使用PfuUltra^TM DNA聚合酶(Stratagene，USA)作为聚合酶，通过重复30次循环进行PCR，该循环由以下组成：在96℃变性30秒，在50℃退火30秒和在72℃延伸2分钟。结果是，获得了含有nadA基因和限制性内切酶ApaI和NotI的识别位点的约1.0kb的扩增基因。

基于第0620092号韩国注册专利，通过使用含有pCJ1启动子的质粒DNA作为模板，进行PCR得到pCJ1启动子。为了将上述扩增的nadA基因与pCJ1启动子连接，合成具有限制性内切酶BamHI和ApaI的识别位点的SEQ ID NO：33的引物和SEQ ID NO：34的引物。

使用大肠杆菌W3110的染色体DNA作为模板，并使用SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34的寡核苷酸作为引物进行PCR。使用PfuUltra^TM DNA聚合酶(Stratagene，USA)作为聚合酶，并且PCR条件是重复30次循环，所述循环由以下组成：在96℃变性30秒，在50℃退火30秒和在72℃延伸1分钟。结果是，获得了含有pCJ1启动子和限制性内切酶BamHI和ApaI的识别位点的约0.3kb的扩增基因。

用限制性内切酶ApaI和NotI处理通过进行PCR获得的nadA基因，并用ApaI和BamHI处理扩增的pCJ1启动子片段。将用限制性内切酶处理的nadA和pCJ1启动子片段，通过连接克隆到实施例1-3中获得的用NotI和BamHI处理pPro-nadB载体中，最后制备5.9kb的pPro-nadB_pCJ1-nadA重组载体，其中克隆nadB基因(其表达受作为组成型启动子的pPro启动子调控)和nadA基因(其表达受pCJ1基因启动子调控)。

(2)制备pPro-nadB-pCJ1-nadA(KP)载体

为了产生喹啉酸，必需增强两种酶(即天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合酶)。为了制备其中可以一起表达编码这两种酶的nadB和nadA(KP)的质粒，通过使用克雷伯氏菌菌株的染色体DNA作为模板进行PCR，获得编码喹啉酸合酶的nadA(KP)基因。使用的序列是国立卫生研究院(NIH)的GenBank的基因的核苷酸序列(NCBI登记号“GI：339761016”)，并且它是与SEQ ID NO：2相同的。基于此，合成能够扩增nadA基因的ATG区域和含有TAA的ORF区域的、具有限制性内切酶ApaI和NotI的识别位点的SEQ ID NO：35的引物和SEQ ID NO：36的引物。

使用克雷伯氏菌菌株的染色体DNA作为模板，并使用SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36的寡核苷酸作为引物进行PCR。使用PfuU1tra^TM DNA聚合酶(Stratagene，USA)作为聚合酶，通过重复30次循环进行PCR，所述循环由以下组成：在96℃变性30秒，在50℃退火30秒和在72℃延伸2分钟。结果是，获得了含有nadA启动子和限制性内切酶ApaI和NotI的识别位点的约1.0kb的扩增基因。

用限制性内切酶ApaI和Not处理通过PCR获得的nadA(KP)基因，并通过连接将其克隆到实施例1-5(1)中获得的pPro-nadB-pCJ1-nadA载体中，最后制备5.9kb的pPro-nadB_pCJ1-nadA(KP)重组载体，其中克隆nadB基因(其表达受作为组成型启动子的pPro启动子调控)和nadA基因(其表达受pCJ1基因启动子调控)。

1-6.制备用于表达磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和L-天冬氨酸转氨酶的质粒

通过使用大肠杆菌W3110的染色体DNA作为模板进行PCR，获得编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因。从国立卫生研究院(NIH)的GenBank获得SEQ ID NO：37的ppc基因的核苷酸序列(NCBI登记号“GI：89110074”)，基于此，合成可以扩增含有ppc基因启动子至终止子的区域的、具有限制性内切酶HindIII和BamHI的识别位点的SEQ ID NO：38的引物和SEQID NO：39的引物。

使用大肠杆菌W3110菌株的染色体DNA作为模板，并使用SEQ ID NO：38和SEQ IDNO：39的寡核苷酸作为引物进行PCR。使用PfuUltra^TM DNA聚合酶(Stratagene，USA)作为聚合酶，通过重复30次循环进行PCR，该循环由以下组成：在96℃变性30秒，在50℃退火30秒和在72℃延伸4分钟。结果是，获得了含有ppc基因和限制性内切酶HindIII和BamHI的识别位点的约3.1kb的扩增基因。用限制性内切酶HindIII和BamHI处理通过PCR获得的ppc基因，并通过连接将其克隆到用限制性内切酶HindIII和BamHI处理的PCL1920(AB236930)载体中，最后制备在其中克隆ppc基因的pCP重组载体。

为了在其中克隆ppc基因的pCP重组载体上克隆aspC基因，通过使用大肠杆菌W3110的染色体DNA作为模板进行PCR，获得编码L-天冬氨酸转氨酶的aspC基因。从国立卫生研究院(NIH)的GenBank获得SEQ ID NO：40的aspC基因的核苷酸序列(NCBI登记号“GI：89107778”)，基于此，合成可以扩增含有aspC基因启动子至终止子的区域的、具有限制性内切酶BamHI和KpnI的识别位点的SEQ ID NO：41的引物和SEQ ID NO：42的引物。

使用大肠杆菌W3110的染色体DNA作为模板，并使用SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42的寡核苷酸作为引物进行PCR。使用PfuUltra^TM DNA聚合酶(Stratagene，USA)作为聚合酶，通过重复30次循环进行PCR，该循环由以下组成：在96℃变性30秒，在50℃退火30秒和在72℃延伸2分钟。结果是，获得含有aspC基因和限制性内切酶BamHI和KpnI的识别位点的约1.5kb的扩增基因。

用限制性内切酶BamHI和KpnI处理通过PCR获得的aspC基因，并通过连接将其克隆到用限制性内切酶BamHI和KpnI处理的pCP载体上，最后制备了其中同时克隆aspC基因和ppc基因的pCPA重组载体。制备的pCPA载体具有SEQ ID NO：43的序列。

实施例2.评估产生喹啉酸的菌株的生产率

为了评估nadA(KP)基因增强菌株产生喹啉酸的能力，将pNadA-nadA载体和pNadA-nadA(KP)载体引入W3110-ΔnadC菌株，并分别将W3110ΔnadC/pNadA-nadA菌株和W3110ΔnadC/pNadA-nadA(KP)菌株命名为CV01-0812和CV01-0813。此外，为了增强nadB，将pPro-nadB载体引入到CV01-0812和CV01-0813中，并将它们分别命名为CV01-0814和CV01-0815。

载体引入方法是使用CaCl₂方法转化，并在37℃的培养箱中，将CV01-0812和CV01-0813在LB-Sp(10g/L的酵母提取物，5g/L的NaCl，10g/L的胰蛋白胨，1.5％的琼脂，50μg/L的壮观霉素)平板培养基上铺开并培养过夜，将CV01-0814和CV01-0815在LB-sp，Km(10g/L的酵母提取物，5g/L的NaCl、，10g/L的胰蛋白胨，1.5％的琼脂，50μg/L的卡那霉素，50μg/L的壮观霉素)平板培养基上铺开并培养过夜。此后，将获得的具有抗生素抗性的单菌落，通过铂环接种到25mL的喹啉酸滴定培养基中，并在33℃以250rpm培养24小时至72小时。下表1表示用于产生喹啉酸的培养基的组成。

[表1]喹啉酸滴定培养基的组成

组成	浓度(每升)
		葡萄糖	70g
硫酸铵	17g
		KH2PO4	1.0g
MgSO4·7H2O	0.5g
		FeSO4·7H2O	5mg
MnSO4·8H2O	5mg
		ZnSO4	5mg
碳酸钙	30g
		酵母提取物	2g
甲硫氨酸	0.15g

通过HPLC分析培养液中的喹啉酸，结果如下表2所示。如表2所证实，证实了在产生喹啉酸时同时增强nadB和nadA的必要性，证实了与野生型nadA增强型菌株相比，基于克雷伯氏菌的nadA(KP)增强菌株显示大约10％的喹啉酸产量的增加。

[表2]

菌株	喹啉酸(g/L)
		CV01-0812	0.1
CV01-0813	0.1
		CV01-0814	5.6
CV01-0815	6.1

为了评估单种喹啉酸合酶的活性，使用CaCl₂方法分别将pNadA-nadA载体和pNadA-nadA(KP)载体转化到含有pPro-nadB载体的W3110-ΔnadCΔnadA菌株中，并且将W3110ΔnadCΔnadA/pNadA-nadA，pPro-nadB菌株和W3110ΔnadCΔnadA/pNadA-nadA(KP)，pPro-nadB菌株分别命名为CV01-0816和CV01-0817。其中，CV01-0817菌株于2014年11月27日在“布达佩斯条约”下于韩国微生物培养中心(KCCM)保藏，并获得了登记号KCCM11612P。

使用上述两种菌株，如下进行喹啉酸滴定培养基的评估。

将转化的CV01-0816菌株和CV01-0817菌株在LB-Km，Sp(10g/L的酵母提取物，5g/L的NaCl，10g/L的胰蛋白胨，1.5％的琼脂，50μg/L的卡那霉素，50μg/L的壮观霉素)平板培养基铺开，并在37℃的培养箱中培养过夜。此后，将获得的具有卡那霉素抗性和壮观霉素抗性的单菌落，通过铂环接种到25mL的喹啉酸滴定培养基中，并在33℃以250rpm培养24小时至72小时。

通过HPLC分析培养液中的喹啉酸，结果如表3中所示。如表3所证实，当增强基于克雷伯氏菌的NadA(KP)时，与当增强nadA相比，喹啉酸的产量增加9％或更多。

[表3]

菌株	喹啉酸(g/L)
		CV01-0816	6.1
CV01-0817	6.5

此外，为了评估在增强生物合成途径时喹啉酸的产生能力，将pCPA载体引入W3110-ΔnadC菌株和W3110-ΔnadCΔnadA菌株，进一步分别引入将其中nadB和nadA同时增强的pPro-nadB-pCJ1-nadA载体和pPro-nadB-pCJ1-nadA(KP)载体。分别将W3110-ΔnadC/pCPA，pPro-nadB-pCJ1-nadA菌株、W3110-ΔnadC/pCPA，pPro-nadB-pCJ1-nadA(KP)菌株、W3110-ΔnadCΔnadA/pCPA，pPro-nadB-pCJ1-nadA菌株，以及W3110-ΔnadCΔnadA/pCPA和pPro-nadB-pCJ1-nadA(KP)菌株，分别命名为CV01-0818、CV01-0819、CV01-0820和CV01-0821。

引入方法是使用CaCl₂法转化，将这些菌株在LB-Km，Sp(10g/L的酵母提取物，5g/L的NaCl，10g/L的胰蛋白胨，50μg/L的卡那霉素，50μg/L的壮观霉素)平板培养基中铺开，并在37℃的培养箱中培养过夜。此后，将获得的具有卡那霉素和壮观霉素抗性的单个菌落，通过铂环接种到25mL的喹啉酸滴定培养基中，并在33℃以250rpm培养24小时至72小时。

通过HPLC分析培养液中的喹啉酸，结果如下表4所示。从下表4可以看出，证实了当增强了基于克雷伯氏菌的nadA(KP)时，与当nadA增强时相比，喹啉酸的产量增加了10％或更多。

[表4]

菌株	喹啉酸(g/L)
		CV01-0818	7.1
CV01-0819	7.8
		CV01-0820	7.3
CV01-0821	8.1

如上所述，本公开所属领域的技术人员将能够理解，本公开可以以其他具体形式实施，而不修改本公开的技术概念或本质特征。在这方面，本文公开的示例性实施方案仅用于说明性目的，并且不应被解释为限制本公开的范围。相反，本公开旨在不仅涵盖示例性实施方案，而且涵盖可以包括在由所附权利要求限定的本公开的精神和范围内的各种替代、修改、等同物及其他实施方案。

序列表

<110> CJ第一制糖株式会社

<120> 能够产生喹啉酸的微生物及使用该微生物产生喹啉酸的方法

<130> OPA15315-PCT

<150> KR 10-2015-0016971

<151> 2015-02-03

<160> 43

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 347

<212> PRT

<213> 肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)

<400> 1

Met Ser Val Met Phe Asp Pro Glu Thr Ala Ile Tyr Pro Phe Pro Ala

1 5 10 15

Lys Pro Gln Pro Leu Thr Val Asp Glu Lys Gln Phe Tyr Arg Glu Lys

20 25 30

Ile Lys Arg Leu Leu Arg Glu Arg Asp Ala Val Met Val Ala His Tyr

35 40 45

Tyr Thr Asp Pro Glu Ile Gln Gln Leu Ala Glu Glu Thr Gly Gly Cys

50 55 60

Ile Ala Asp Ser Leu Glu Met Ala Arg Phe Gly Ala Arg His Ser Ala

65 70 75 80

Ser Thr Leu Leu Val Ala Gly Val Arg Phe Met Gly Glu Thr Ala Lys

85 90 95

Ile Leu Ser Pro Glu Lys Thr Ile Leu Met Pro Thr Leu Asn Ala Glu

100 105 110

Cys Ser Leu Asp Leu Gly Cys Pro Ile Glu Glu Phe Asn Ala Phe Cys

115 120 125

Asp Ala His Pro Asp Arg Thr Val Val Val Tyr Ala Asn Thr Ser Ala

130 135 140

Ala Val Lys Ala Arg Ala Asp Trp Val Val Thr Ser Ser Ile Ala Val

145 150 155 160

Glu Leu Ile Asp His Leu Asp Ser Leu Gly Gln Lys Ile Leu Trp Ala

165 170 175

Pro Asp Arg His Leu Gly Arg Tyr Val Gln Arg Gln Thr Gly Ala Asp

180 185 190

Val Leu Cys Trp Gln Gly Ala Cys Ile Val His Asp Glu Phe Lys Thr

195 200 205

Gln Ala Leu Met Arg Met Lys Ala Leu His Pro Glu Ala Ala Val Leu

210 215 220

Val His Pro Glu Ser Pro Gln Ala Ile Val Glu Met Ala Asp Ala Val

225 230 235 240

Gly Ser Thr Ser Gln Leu Ile Ala Ala Ala Lys Ser Leu Pro Gln Arg

245 250 255

Gln Leu Ile Val Ala Thr Asp Arg Gly Ile Phe Tyr Lys Met Gln Gln

260 265 270

Ala Val Pro Glu Lys Thr Leu Leu Glu Ala Pro Thr Ala Gly Glu Gly

275 280 285

Ala Thr Cys Arg Ser Cys Ala His Cys Pro Trp Met Ala Met Asn Gly

290 295 300

Leu Lys Ala Ile Ala Glu Gly Leu Glu Gln Gly Gly Ala Glu His Glu

305 310 315 320

Ile His Val Asp Glu Ala Leu Arg Thr Gly Ala Leu Ile Pro Leu Asn

325 330 335

Arg Met Leu Asp Phe Ala Ala Thr Leu Arg Gly

340 345

<210> 2

<211> 1044

<212> DNA

<213> 肺炎克雷伯氏菌

<400> 2

atgagcgtaa tgtttgatcc tgaaacggcg atttatcctt tccctgctaa accgcagccg 60

ctgaccgtcg acgaaaagca gttttaccgc gaaaaaatca agcgcctgct gcgcgagcgc 120

gatgccgtga tggtggcgca ttactacacc gatcctgaaa ttcaacagct ggcggaagag 180

accggcggct gtatcgccga ctcgctggag atggcgcgct ttggcgcccg ccattcggcc 240

tccacgctgc tggtcgccgg ggtgcgtttt atgggggaaa ccgccaaaat tctcagcccg 300

gaaaagacca ttttgatgcc gaccctgaac gccgagtgtt cattggatct gggctgtccg 360

attgaggaat tcaacgcctt ttgcgacgcc catcctgacc gcaccgtcgt ggtctatgcc 420

aatacgtccg ccgcggtgaa ggcccgcgcc gactgggtgg tgacctccag catcgccgtg 480

gaactcattg accatctgga tagtcttggt caaaagatcc tctgggcgcc ggaccgccac 540

cttgggcgtt acgttcagcg tcagaccggc gcagacgtgc tgtgctggca gggggcgtgc 600

atcgtgcacg acgagtttaa aacccaggcg ttgatgcgga tgaaggctct gcatcccgaa 660

gccgccgtgc tggtccatcc cgagtcgccg caggcgatcg ttgagatggc cgatgccgta 720

ggctccacca gccagctgat tgcggcggcg aaaagcctgc cccagcgcca gctgatcgtg 780

gccaccgatc gcggtatttt ctataaaatg cagcaggcgg tgccggagaa aacgctgctg 840

gaagcgccca ccgccggcga aggggcgacc tgccgcagct gcgcgcattg tccgtggatg 900

gcgatgaatg gcctgaaagc cattgccgag gggctcgagc agggcggcgc tgaacatgaa 960

atccatgtcg acgaagcgct gcgaaccggc gcattaattc cccttaaccg gatgctggat 1020

tttgcggcta cactacgggg ataa 1044

<210> 3

<211> 297

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 3

Met Pro Pro Arg Arg Tyr Asn Pro Asp Thr Arg Arg Asp Glu Leu Leu

1 5 10 15

Glu Arg Ile Asn Leu Asp Ile Pro Gly Ala Val Ala Gln Ala Leu Arg

20 25 30

Glu Asp Leu Gly Gly Thr Val Asp Ala Asn Asn Asp Ile Thr Ala Lys

35 40 45

Leu Leu Pro Glu Asn Ser Arg Ser His Ala Thr Val Ile Thr Arg Glu

50 55 60

Asn Gly Val Phe Cys Gly Lys Arg Trp Val Glu Glu Val Phe Ile Gln

65 70 75 80

Leu Ala Gly Asp Asp Val Thr Ile Ile Trp His Val Asp Asp Gly Asp

85 90 95

Val Ile Asn Ala Asn Gln Ser Leu Phe Glu Leu Glu Gly Pro Ser Arg

100 105 110

Val Leu Leu Thr Gly Glu Arg Thr Ala Leu Asn Phe Val Gln Thr Leu

115 120 125

Ser Gly Val Ala Ser Lys Val Arg His Tyr Val Glu Leu Leu Glu Gly

130 135 140

Thr Asn Thr Gln Leu Leu Asp Thr Arg Lys Thr Leu Pro Gly Leu Arg

145 150 155 160

Ser Ala Leu Lys Tyr Ala Val Leu Cys Gly Gly Gly Ala Asn His Arg

165 170 175

Leu Gly Leu Ser Asp Ala Phe Leu Ile Lys Glu Asn His Ile Ile Ala

180 185 190

Ser Gly Ser Val Arg Gln Ala Val Glu Lys Ala Ser Trp Leu His Pro

195 200 205

Asp Ala Pro Val Glu Val Glu Val Glu Asn Leu Glu Glu Leu Asp Glu

210 215 220

Ala Leu Lys Ala Gly Ala Asp Ile Ile Met Leu Asp Asn Phe Glu Thr

225 230 235 240

Glu Gln Met Arg Glu Ala Val Lys Arg Thr Asn Gly Lys Ala Leu Leu

245 250 255

Glu Val Ser Gly Asn Val Thr Asp Lys Thr Leu Arg Glu Phe Ala Glu

260 265 270

Thr Gly Val Asp Phe Ile Ser Val Gly Ala Leu Thr Lys His Val Gln

275 280 285

Ala Leu Asp Leu Ser Met Arg Phe Arg

290 295

<210> 4

<211> 894

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 4

atgccgcctc gccgctataa ccctgacacc cgacgtgacg agctgctgga acgcattaat 60

ctcgatatcc ccggcgcggt ggcccaggcg ctgcgggaag atttaggcgg aacagtcgat 120

gccaacaatg atattacggc aaaactttta ccggaaaatt ctcgctctca tgccacggtg 180

atcacccgcg agaatggcgt cttttgcggc aaacgctggg ttgaagaggt gtttattcaa 240

ctggcaggcg acgatgtcac cataatctgg catgtggatg acggcgatgt catcaatgcc 300

aatcaatcct tgttcgaact tgaaggccca tcccgcgtgc tgttaacggg cgaacgcact 360

gcgcttaatt ttgtgcaaac cctttcagga gttgccagta aggtacgcca ctatgtcgaa 420

ttgctggaag gcaccaacac gcagttgttg gatacgcgca aaaccttacc cggcctgcgt 480

tcagctctga aatacgcggt actttgcggc ggcggagcga atcaccgtct ggggctttct 540

gatgccttcc tgatcaaaga aaaccatatt attgcctccg gctcagtgcg ccaggcggtc 600

gaaaaagcgt cctggctgca cccggatgcg ccagtagaag tcgaagtaga gaatctggaa 660

gaacttgatg aagccctgaa agcaggagcc gatatcatca tgctggataa cttcgaaaca 720

gaacagatgc gcgaagccgt caaacgcacc aacggcaagg cgctactgga agtgtctggc 780

aacgtcactg acaaaacact gcgtgaattt gccgaaacgg gcgtggactt tatctccgtc 840

ggtgcgctaa ctaaacacgt acaagcactc gacctttcaa tgcgttttcg ctaa 894

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

cattatacga acggtacccc cagttgaata aacacctctt ca 42

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 6

tggcggcagg ctaatatt 18

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 7

gttcttccag attctctact tttcgagctc ggtacctacc g 41

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 8

tgaagaggtg tttattcaac tgggggtacc gttcgtataa tg 42

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 9

ataaccacca tcagttcgat a 21

<210> 10

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 10

cggtaggtac cgagctcgaa aagtagagaa tctggaagaa c 41

<210> 11

<211> 347

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 11

Met Ser Val Met Phe Asp Pro Asp Thr Ala Ile Tyr Pro Phe Pro Pro

1 5 10 15

Lys Pro Thr Pro Leu Ser Ile Asp Glu Lys Ala Tyr Tyr Arg Glu Lys

20 25 30

Ile Lys Arg Leu Leu Lys Glu Arg Asn Ala Val Met Val Ala His Tyr

35 40 45

Tyr Thr Asp Pro Glu Ile Gln Gln Leu Ala Glu Glu Thr Gly Gly Cys

50 55 60

Ile Ser Asp Ser Leu Glu Met Ala Arg Phe Gly Ala Lys His Pro Ala

65 70 75 80

Ser Thr Leu Leu Val Ala Gly Val Arg Phe Met Gly Glu Thr Ala Lys

85 90 95

Ile Leu Ser Pro Glu Lys Thr Ile Leu Met Pro Thr Leu Gln Ala Glu

100 105 110

Cys Ser Leu Asp Leu Gly Cys Pro Val Glu Glu Phe Asn Ala Phe Cys

115 120 125

Asp Ala His Pro Asp Arg Thr Val Val Val Tyr Ala Asn Thr Ser Ala

130 135 140

Ala Val Lys Ala Arg Ala Asp Trp Val Val Thr Ser Ser Ile Ala Val

145 150 155 160

Glu Leu Ile Asp His Leu Asp Ser Leu Gly Glu Lys Ile Ile Trp Ala

165 170 175

Pro Asp Lys His Leu Gly Arg Tyr Val Gln Lys Gln Thr Gly Gly Asp

180 185 190

Ile Leu Cys Trp Gln Gly Ala Cys Ile Val His Asp Glu Phe Lys Thr

195 200 205

Gln Ala Leu Thr Arg Leu Gln Glu Glu Tyr Pro Asp Ala Ala Ile Leu

210 215 220

Val His Pro Glu Ser Pro Gln Ala Ile Val Asp Met Ala Asp Ala Val

225 230 235 240

Gly Ser Thr Ser Gln Leu Ile Ala Ala Ala Lys Thr Leu Pro His Gln

245 250 255

Arg Leu Ile Val Ala Thr Asp Arg Gly Ile Phe Tyr Lys Met Gln Gln

260 265 270

Ala Val Pro Asp Lys Glu Leu Leu Glu Ala Pro Thr Ala Gly Glu Gly

275 280 285

Ala Thr Cys Arg Ser Cys Ala His Cys Pro Trp Met Ala Met Asn Gly

290 295 300

Leu Gln Ala Ile Ala Glu Ala Leu Glu Gln Glu Gly Ser Asn His Glu

305 310 315 320

Val His Val Asp Glu Arg Leu Arg Glu Arg Ala Leu Val Pro Leu Asn

325 330 335

Arg Met Leu Asp Phe Ala Ala Thr Leu Arg Gly

340 345

<210> 12

<211> 1044

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 12

atgagcgtaa tgtttgatcc agacacggcg atttatcctt tccccccgaa gccgacgccg 60

ttaagcattg atgaaaaagc gtattaccgc gagaagataa aacgtctgct aaaagaacgt 120

aatgcggtga tggttgccca ctactatacc gatcccgaaa ttcaacaact ggcagaagaa 180

accggtggct gtatttctga ttctctggaa atggcgcgct tcggtgcaaa gcatcccgct 240

tctactttgt tagtcgctgg ggtgagattt atgggagaaa ccgccaaaat tctcagtccg 300

gaaaaaacaa ttctgatgcc gacacttcag gctgaatgtt cactggatct cggctgccct 360

gttgaagaat ttaacgcatt ttgcgatgcc catcccgatc gtactgtcgt cgtctacgcc 420

aacacttctg ctgcggtaaa agcgcgcgca gattgggtgg taacttcaag cattgccgtc 480

gaacttattg atcatcttga tagtttgggt gaaaaaatca tctgggcacc cgacaaacat 540

ctggggcgtt acgtgcaaaa acagacgggt ggagacattc tatgctggca gggtgcctgt 600

attgtgcatg atgaatttaa gactcaggcg ttaacccgct tgcaagaaga atacccggat 660

gctgccatac tggtgcatcc agaatcacca caagctattg tcgatatggc ggatgcggtc 720

ggttccacca gtcaactgat cgctgctgcg aaaacattgc cacatcagag gcttattgtg 780

gcaaccgatc ggggtatttt ctacaaaatg cagcaggcgg tgccagataa agagttactg 840

gaagcaccaa ccgcaggtga gggtgcaacc tgccgcagct gcgcgcattg tccgtggatg 900

gccatgaatg gccttcaggc catcgcagag gcattagaac aggaaggaag caatcacgag 960

gttcatgttg atgaaaggct gcgagagagg gcgctggtgc cgctcaatcg tatgctggat 1020

tttgcggcta cactacgtgg ataa 1044

<210> 13

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

cattatacga acggtacccc cccggatgct gccatactg 39

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

ccatgagaga tcataaccgc 20

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

tgacttttcc ccaccattcg ttcgagctcg gtacctaccg 40

<210> 16

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

cagtatggca gcatccgggg gggtaccgtt cgtataatg 39

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

gggtcgttag ctcagttggt 20

<210> 18

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 18

cggtaggtac cgagctcgaa cgaatggtgg ggaaaagtca 40

<210> 19

<211> 540

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 19

Met Asn Thr Leu Pro Glu His Ser Cys Asp Val Leu Ile Ile Gly Ser

1 5 10 15

Gly Ala Ala Gly Leu Ser Leu Ala Leu Arg Leu Ala Asp Gln His Gln

20 25 30

Val Ile Val Leu Ser Lys Gly Pro Val Thr Glu Gly Ser Thr Phe Tyr

35 40 45

Ala Gln Gly Gly Ile Ala Ala Val Phe Asp Glu Thr Asp Ser Ile Asp

50 55 60

Ser His Val Glu Asp Thr Leu Ile Ala Gly Ala Gly Ile Cys Asp Arg

65 70 75 80

His Ala Val Glu Phe Val Ala Ser Asn Ala Arg Ser Cys Val Gln Trp

85 90 95

Leu Ile Asp Gln Gly Val Leu Phe Asp Thr His Ile Gln Pro Asn Gly

100 105 110

Glu Glu Ser Tyr His Leu Thr Arg Glu Gly Gly His Ser His Arg Arg

115 120 125

Ile Leu His Ala Ala Asp Ala Thr Gly Arg Glu Val Glu Thr Thr Leu

130 135 140

Val Ser Lys Ala Leu Asn His Pro Asn Ile Arg Val Leu Glu Arg Ser

145 150 155 160

Asn Ala Val Asp Leu Ile Val Ser Asp Lys Ile Gly Leu Pro Gly Thr

165 170 175

Arg Arg Val Val Gly Ala Trp Val Trp Asn Arg Asn Lys Glu Thr Val

180 185 190

Glu Thr Cys His Ala Lys Ala Val Val Leu Ala Thr Gly Gly Ala Ser

195 200 205

Lys Val Tyr Gln Tyr Thr Thr Asn Pro Asp Ile Ser Ser Gly Asp Gly

210 215 220

Ile Ala Met Ala Trp Arg Ala Gly Cys Arg Val Ala Asn Leu Glu Phe

225 230 235 240

Asn Gln Phe His Pro Thr Ala Leu Tyr His Pro Gln Ala Arg Asn Phe

245 250 255

Leu Leu Thr Glu Ala Leu Arg Gly Glu Gly Ala Tyr Leu Lys Arg Pro

260 265 270

Asp Gly Thr Arg Phe Met Pro Asp Phe Asp Glu Arg Gly Glu Leu Ala

275 280 285

Pro Arg Asp Ile Val Ala Arg Ala Ile Asp His Glu Met Lys Arg Leu

290 295 300

Gly Ala Asp Cys Met Phe Leu Asp Ile Ser His Lys Pro Ala Asp Phe

305 310 315 320

Ile Arg Gln His Phe Pro Met Ile Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Leu Gly

325 330 335

Ile Asp Leu Thr Gln Glu Pro Val Pro Ile Val Pro Ala Ala His Tyr

340 345 350

Thr Cys Gly Gly Val Met Val Asp Asp His Gly Arg Thr Asp Val Glu

355 360 365

Gly Leu Tyr Ala Ile Gly Glu Val Ser Tyr Thr Gly Leu His Gly Ala

370 375 380

Asn Arg Met Ala Ser Asn Ser Leu Leu Glu Cys Leu Val Tyr Gly Trp

385 390 395 400

Ser Ala Ala Glu Asp Ile Thr Arg Arg Met Pro Tyr Ala His Asp Ile

405 410 415

Ser Thr Leu Pro Pro Trp Asp Glu Ser Arg Val Glu Asn Pro Asp Glu

420 425 430

Arg Val Val Ile Gln His Asn Trp His Glu Leu Arg Leu Phe Met Trp

435 440 445

Asp Tyr Val Gly Ile Val Arg Thr Thr Lys Arg Leu Glu Arg Ala Leu

450 455 460

Arg Arg Ile Thr Met Leu Gln Gln Glu Ile Asp Glu Tyr Tyr Ala His

465 470 475 480

Phe Arg Val Ser Asn Asn Leu Leu Glu Leu Arg Asn Leu Val Gln Val

485 490 495

Ala Glu Leu Ile Val Arg Cys Ala Met Met Arg Lys Glu Ser Arg Gly

500 505 510

Leu His Phe Thr Leu Asp Tyr Pro Glu Leu Leu Thr His Ser Gly Pro

515 520 525

Ser Ile Leu Ser Pro Gly Asn His Tyr Ile Asn Arg

530 535 540

<210> 20

<211> 1623

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 20

atgaatactc tccctgaaca ttcatgtgac gtgttgatta tcggtagcgg cgcagccgga 60

ctttcactgg cgctacgcct ggctgaccag catcaggtca tcgttctaag taaaggcccg 120

gtaacggaag gttcaacatt ttatgcccag ggcggtattg ccgccgtgtt tgatgaaact 180

gacagcattg actcgcatgt ggaagacaca ttgattgccg gggctggtat ttgcgatcgc 240

catgcagttg aatttgtcgc cagcaatgca cgatcctgtg tgcaatggct aatcgaccag 300

ggggtgttgt ttgataccca cattcaaccg aatggcgaag aaagttacca tctgacccgt 360

gaaggtggac atagtcaccg tcgtattctt catgccgccg acgccaccgg tagagaagta 420

gaaaccacgc tggtgagcaa ggcgctgaac catccgaata ttcgcgtgct ggagcgcagc 480

aacgcggttg atctgattgt ttctgacaaa attggcctgc cgggcacgcg acgggttgtt 540

ggcgcgtggg tatggaaccg taataaagaa acggtggaaa cctgccacgc aaaagcggtg 600

gtgctggcaa ccggcggtgc gtcgaaggtt tatcagtaca ccaccaatcc ggatatttct 660

tctggcgatg gcattgctat ggcgtggcgc gcaggctgcc gggttgccaa tctcgaattt 720

aatcagttcc accctaccgc gctatatcac ccacaggcac gcaatttcct gttaacagaa 780

gcactgcgcg gcgaaggcgc ttatctcaag cgcccggatg gtacgcgttt tatgcccgat 840

tttgatgagc gcggcgaact ggccccgcgc gatattgtcg cccgcgccat tgaccatgaa 900

atgaaacgcc tcggcgcaga ttgtatgttc cttgatatca gccataagcc cgccgatttt 960

attcgccagc atttcccgat gatttatgaa aagctgctcg ggctggggat tgatctcaca 1020

caagaaccgg taccgattgt gcctgctgca cattatacct gcggtggtgt aatggttgat 1080

gatcatgggc gtacggacgt cgagggcttg tatgccattg gcgaggtgag ttataccggc 1140

ttacacggcg ctaaccgcat ggcctcgaat tcattgctgg agtgtctggt ctatggctgg 1200

tcggcggcgg aagatatcac cagacgtatg ccttatgccc acgacatcag tacgttaccg 1260

ccgtgggatg aaagccgcgt tgagaaccct gacgaacggg tagtaattca gcataactgg 1320

cacgagctac gtctgtttat gtgggattac gttggcattg tgcgcacaac gaagcgcctg 1380

gaacgcgccc tgcggcggat aaccatgctc caacaagaaa tagacgaata ttacgcccat 1440

ttccgcgtct caaataattt gctggagctg cgtaatctgg tacaggttgc cgagttgatt 1500

gttcgctgtg caatgatgcg taaagagagt cgggggttgc atttcacgct ggattatccg 1560

gaactgctca cccattccgg tccgtcgatc ctttcccccg gcaatcatta cataaacaga 1620

taa 1623

<210> 21

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 21

aattcatatg aatactctcc ctgaacatt 29

<210> 22

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 22

aattggatcc ctataccact acgcttgatc ac 32

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 23

ctgcagatcc tgcacgaccc acc 23

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 24

tctagactta ccatctcgtt tta 23

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 25

tctagaatga gcgtaatgtt tga 23

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 26

ggatccttat ccacgtagtg tag 23

<210> 27

<211> 1356

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pNadA-nadA

<400> 27

ctgcagatcc tgcacgaccc accaatgtaa aaaagcgccc taaaggcgct tttttgctat 60

tcaggcatcc tcaatttcac tttgtaaacc tgatgacatc gtcagagctt actgtgcaag 120

caactctatg tcggtggaat taggcgtaaa atgacgcatc ctgcacatta ggcgtaattc 180

gagtgacttt tccccaccat tcgactatct tgtttagcat ataaaacaaa ttacaccgat 240

aacagcgaat attacgctaa tgtcggtttt aacgttaagc ctgtaaaacg agatggtaag 300

tctagaatga gcgtaatgtt tgatccagac acggcgattt atcctttccc cccgaagccg 360

acgccgttaa gcattgatga aaaagcgtat taccgcgaga agataaaacg tctgctaaaa 420

gaacgtaatg cggtgatggt tgcccactac tataccgatc ccgaaattca acaactggca 480

gaagaaaccg gtggctgtat ttctgattct ctggaaatgg cgcgcttcgg tgcaaagcat 540

cccgcttcta ctttgttagt cgctggggtg agatttatgg gagaaaccgc caaaattctc 600

agtccggaaa aaacaattct gatgccgaca cttcaggctg aatgttcact ggatctcggc 660

tgccctgttg aagaatttaa cgcattttgc gatgcccatc ccgatcgtac tgtcgtcgtc 720

tacgccaaca cttctgctgc ggtaaaagcg cgcgcagatt gggtggtaac ttcaagcatt 780

gccgtcgaac ttattgatca tcttgatagt ttgggtgaaa aaatcatctg ggcacccgac 840

aaacatctgg ggcgttacgt gcaaaaacag acgggtggag acattctatg ctggcagggt 900

gcctgtattg tgcatgatga atttaagact caggcgttaa cccgcttgca agaagaatac 960

ccggatgctg ccatactggt gcatccagaa tcaccacaag ctattgtcga tatggcggat 1020

gcggtcggtt ccaccagtca actgatcgct gctgcgaaaa cattgccaca tcagaggctt 1080

attgtggcaa ccgatcgggg tattttctac aaaatgcagc aggcggtgcc agataaagag 1140

ttactggaag caccaaccgc aggtgagggt gcaacctgcc gcagctgcgc gcattgtccg 1200

tggatggcca tgaatggcct tcaggccatc gcagaggcat tagaacagga aggaagcaat 1260

cacgaggttc atgttgatga aaggctgcga gagagggcgc tggtgccgct caatcgtatg 1320

ctggattttg cggctacact acgtggataa ggatcc 1356

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 28

tctagaatga gcgtaatgtt tga 23

<210> 29

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 29

ggatccttat ccccgtagtg tag 23

<210> 30

<211> 1356

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pNadA-nadA(KP)

<400> 30

ctgcagatcc tgcacgaccc accaatgtaa aaaagcgccc taaaggcgct tttttgctat 60

tcaggcatcc tcaatttcac tttgtaaacc tgatgacatc gtcagagctt actgtgcaag 120

caactctatg tcggtggaat taggcgtaaa atgacgcatc ctgcacatta ggcgtaattc 180

gagtgacttt tccccaccat tcgactatct tgtttagcat ataaaacaaa ttacaccgat 240

aacagcgaat attacgctaa tgtcggtttt aacgttaagc ctgtaaaacg agatggtaag 300

tctagaatga gcgtaatgtt tgatcctgaa acggcgattt atcctttccc tgctaaaccg 360

cagccgctga ccgtcgacga aaagcagttt taccgcgaaa aaatcaagcg cctgctgcgc 420

gagcgcgatg ccgtgatggt ggcgcattac tacaccgatc ctgaaattca acagctggcg 480

gaagagaccg gcggctgtat cgccgactcg ctggagatgg cgcgctttgg cgcccgccat 540

tcggcctcca cgctgctggt cgccggggtg cgttttatgg gggaaaccgc caaaattctc 600

agcccggaaa agaccatttt gatgccgacc ctgaacgccg agtgttcatt ggatctgggc 660

tgtccgattg aggaattcaa cgccttttgc gacgcccatc ctgaccgcac cgtcgtggtc 720

tatgccaata cgtccgccgc ggtgaaggcc cgcgccgact gggtggtgac ctccagcatc 780

gccgtggaac tcattgacca tctggatagt cttggtcaaa agatcctctg ggcgccggac 840

cgccaccttg ggcgttacgt tcagcgtcag accggcgcag acgtgctgtg ctggcagggg 900

gcgtgcatcg tgcacgacga gtttaaaacc caggcgttga tgcggatgaa ggctctgcat 960

cccgaagccg ccgtgctggt ccatcccgag tcgccgcagg cgatcgttga gatggccgat 1020

gccgtaggct ccaccagcca gctgattgcg gcggcgaaaa gcctgcccca gcgccagctg 1080

atcgtggcca ccgatcgcgg tattttctat aaaatgcagc aggcggtgcc ggagaaaacg 1140

ctgctggaag cgcccaccgc cggcgaaggg gcgacctgcc gcagctgcgc gcattgtccg 1200

tggatggcga tgaatggcct gaaagccatt gccgaggggc tcgagcaggg cggcgctgaa 1260

catgaaatcc atgtcgacga agcgctgcga accggcgcat taattcccct taaccggatg 1320

ctggattttg cggctacact acggggataa ggatcc 1356

<210> 31

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 31

aattgggccc atgagcgtaa tgtttgatcc a 31

<210> 32

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 32

aattgcggcc gctcgtgcct accgcttcg 29

<210> 33

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 33

ccgcggatcc caccgcgggc ttattccatt ac 32

<210> 34

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 34

gatgggccca tcttaatctc ctagattggg tttc 34

<210> 35

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 35

aattgggccc atgagcgtaa tgtttgatcc t 31

<210> 36

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 36

aattgcggcc gctcgtcccc acggcctct 29

<210> 37

<211> 3096

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 37

ataaggcgct cgcgccgcat ccggcactgt tgccaaactc cagtgccgca ataatgtcgg 60

atgcgatact tgcgcatctt atccgaccta cacctttggt gttacttggg gcgatttttt 120

aacatttcca taagttacgc ttatttaaag cgtcgtgaat ttaatgacgt aaattcctgc 180

tatttattcg tttgctgaag cgatttcgca gcatttgacg tcaccgcttt tacgtggctt 240

tataaaagac gacgaaaagc aaagcccgag catattcgcg ccaatgcgac gtgaaggata 300

cagggctatc aaacgataag atggggtgtc tggggtaata tgaacgaaca atattccgca 360

ttgcgtagta atgtcagtat gctcggcaaa gtgctgggag aaaccatcaa ggatgcgttg 420

ggagaacaca ttcttgaacg cgtagaaact atccgtaagt tgtcgaaatc ttcacgcgct 480

ggcaatgatg ctaaccgcca ggagttgctc accaccttac aaaatttgtc gaacgacgag 540

ctgctgcccg ttgcgcgtgc gtttagtcag ttcctgaacc tggccaacac cgccgagcaa 600

taccacagca tttcgccgaa aggcgaagct gccagcaacc cggaagtgat cgcccgcacc 660

ctgcgtaaac tgaaaaacca gccggaactg agcgaagaca ccatcaaaaa agcagtggaa 720

tcgctgtcgc tggaactggt cctcacggct cacccaaccg aaattacccg tcgtacactg 780

atccacaaaa tggtggaagt gaacgcctgt ttaaaacagc tcgataacaa agatatcgct 840

gactacgaac acaaccagct gatgcgtcgc ctgcgccagt tgatcgccca gtcatggcat 900

accgatgaaa tccgtaagct gcgtccaagc ccggtagatg aagccaaatg gggctttgcc 960

gtagtggaaa acagcctgtg gcaaggcgta ccaaattacc tgcgcgaact gaacgaacaa 1020

ctggaagaga acctcggcta caaactgccc gtcgaatttg ttccggtccg ttttacttcg 1080

tggatgggcg gcgaccgcga cggcaacccg aacgtcactg ccgatatcac ccgccacgtc 1140

ctgctactca gccgctggaa agccaccgat ttgttcctga aagatattca ggtgctggtt 1200

tctgaactgt cgatggttga agcgacccct gaactgctgg cgctggttgg cgaagaaggt 1260

gccgcagaac cgtatcgcta tctgatgaaa aacctgcgtt ctcgcctgat ggcgacacag 1320

gcatggctgg aagcgcgcct gaaaggcgaa gaactgccaa aaccagaagg cctgctgaca 1380

caaaacgaag aactgtggga accgctctac gcttgctacc agtcacttca ggcgtgtggc 1440

atgggtatta tcgccaacgg cgatctgctc gacaccctgc gccgcgtgaa atgtttcggc 1500

gtaccgctgg tccgtattga tatccgtcag gagagcacgc gtcataccga agcgctgggc 1560

gagctgaccc gctacctcgg tatcggcgac tacgaaagct ggtcagaggc cgacaaacag 1620

gcgttcctga tccgcgaact gaactccaaa cgtccgcttc tgccgcgcaa ctggcaacca 1680

agcgccgaaa cgcgcgaagt gctcgatacc tgccaggtga ttgccgaagc accgcaaggc 1740

tccattgccg cctacgtgat ctcgatggcg aaaacgccgt ccgacgtact ggctgtccac 1800

ctgctgctga aagaagcggg tatcgggttt gcgatgccgg ttgctccgct gtttgaaacc 1860

ctcgatgatc tgaacaacgc caacgatgtc atgacccagc tgctcaatat tgactggtat 1920

cgtggcctga ttcagggcaa acagatggtg atgattggct attccgactc agcaaaagat 1980

gcgggagtga tggcagcttc ctgggcgcaa tatcaggcac aggatgcatt aatcaaaacc 2040

tgcgaaaaag cgggtattga gctgacgttg ttccacggtc gcggcggttc cattggtcgc 2100

ggcggcgcac ctgctcatgc ggcgctgctg tcacaaccgc caggaagcct gaaaggcggc 2160

ctgcgcgtaa ccgaacaggg cgagatgatc cgctttaaat atggtctgcc agaaatcacc 2220

gtcagcagcc tgtcgcttta taccggggcg attctggaag ccaacctgct gccaccgccg 2280

gagccgaaag agagctggcg tcgcattatg gatgaactgt cagtcatctc ctgcgatgtc 2340

taccgcggct acgtacgtga aaacaaagat tttgtgcctt acttccgctc cgctacgccg 2400

gaacaagaac tgggcaaact gccgttgggt tcacgtccgg cgaaacgtcg cccaaccggc 2460

ggcgtcgagt cactacgcgc cattccgtgg atcttcgcct ggacgcaaaa ccgtctgatg 2520

ctccccgcct ggctgggtgc aggtacggcg ctgcaaaaag tggtcgaaga cggcaaacag 2580

agcgagctgg aggctatgtg ccgcgattgg ccattcttct cgacgcgtct cggcatgctg 2640

gagatggtct tcgccaaagc agacctgtgg ctggcggaat actatgacca acgcctggta 2700

gacaaagcac tgtggccgtt aggtaaagag ttacgcaacc tgcaagaaga agacatcaaa 2760

gtggtgctgg cgattgccaa cgattcccat ctgatggccg atctgccgtg gattgcagag 2820

tctattcagc tacggaatat ttacaccgac ccgctgaacg tattgcaggc cgagttgctg 2880

caccgctccc gccaggcaga aaaagaaggc caggaaccgg atcctcgcgt cgaacaagcg 2940

ttaatggtca ctattgccgg gattgcggca ggtatgcgta ataccggcta atcttcctct 3000

tctgcaaacc ctcgtgcttt tgcgcgaggg ttttctgaaa tacttctgtt ctaacaccct 3060

cgttttcaat atatttctgt ctgcatttta ttcaaa 3096

<210> 38

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 38

aagcttctgt aggccggata aggcgctcgc gccgcat 37

<210> 39

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 39

cggatccttt gaataaaatg cagacag 27

<210> 40

<211> 1556

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 40

gtccacctat gttgactaca tcatcaacca gatcgattct gacaacaaac tgggcgtagg 60

ttcagacgac accgttgctg tgggtatcgt ttaccagttc taatagcaca cctctttgtt 120

aaatgccgaa aaaacaggac tttggtcctg ttttttttat accttccaga gcaatctcac 180

gtcttgcaaa aacagcctgc gttttcatca gtaatagttg gaattttgta aatctcccgt 240

taccctgata gcggacttcc cttctgtaac cataatggaa cctcgtcatg tttgagaaca 300

ttaccgccgc tcctgccgac ccgattctgg gcctggccga tctgtttcgt gccgatgaac 360

gtcccggcaa aattaacctc gggattggtg tctataaaga tgagacgggc aaaaccccgg 420

tactgaccag cgtgaaaaag gctgaacagt atctgctcga aaatgaaacc accaaaaatt 480

acctcggcat tgacggcatc cctgaatttg gtcgctgcac tcaggaactg ctgtttggta 540

aaggtagcgc cctgatcaat gacaaacgtg ctcgcacggc acagactccg gggggcactg 600

gcgcactacg cgtggctgcc gatttcctgg caaaaaatac cagcgttaag cgtgtgtggg 660

tgagcaaccc aagctggccg aaccataaga gcgtctttaa ctctgcaggt ctggaagttc 720

gtgaatacgc ttattatgat gcggaaaatc acactcttga cttcgatgca ctgattaaca 780

gcctgaatga agctcaggct ggcgacgtag tgctgttcca tggctgctgc cataacccaa 840

ccggtatcga ccctacgctg gaacaatggc aaacactggc acaactctcc gttgagaaag 900

gctggttacc gctgtttgac ttcgcttacc agggttttgc ccgtggtctg gaagaagatg 960

ctgaaggact gcgcgctttc gcggctatgc ataaagagct gattgttgcc agttcctact 1020

ctaaaaactt tggcctgtac aacgagcgtg ttggcgcttg tactctggtt gctgccgaca 1080

gtgaaaccgt tgatcgcgca ttcagccaaa tgaaagcggc gattcgcgct aactactcta 1140

acccaccagc acacggcgct tctgttgttg ccaccatcct gagcaacgat gcgttacgtg 1200

cgatttggga acaagagctg actgatatgc gccagcgtat tcagcgtatg cgtcagttgt 1260

tcgtcaatac gctgcaggaa aaaggcgcaa accgcgactt cagctttatc atcaaacaga 1320

acggcatgtt ctccttcagt ggcctgacaa aagaacaagt gctgcgtctg cgcgaagagt 1380

ttggcgtata tgcggttgct tctggtcgcg taaatgtggc cgggatgaca ccagataaca 1440

tggctccgct gtgcgaagcg attgtggcag tgctgtaagc attaaaaaca atgaagcccg 1500

ctgaaaagcg ggctgagact gatgacaaac gcaacattgc ctgatgcgct acgctt 1556

<210> 41

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 41

ggatccgtcc acctatgttg actaca 26

<210> 42

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 42

ggtaccgagc tcataagcgt agcgcatcag g 31

<210> 43

<211> 9193

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCPA

<400> 43

cccgtcttac tgtcgggaat tcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt 60

ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt 120

aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg 180

gataacaatt tcacacagga aacagctatg accatgatta cgccaagctt ctgtaggccg 240

gataaggcgc tcgcgccgca tccggcactg ttgccaaact ccagtgccgc aataatgtcg 300

gatgcgatac ttgcgcatct tatccgacct acacctttgg tgttacttgg ggcgattttt 360

taacatttcc ataagttacg cttatttaaa gcgtcgtgaa tttaatgacg taaattcctg 420

ctatttattc gtttgctgaa gcgatttcgc agcatttgac gtcaccgctt ttacgtggct 480

ttataaaaga cgacgaaaag caaagcccga gcatattcgc gccaatgcga cgtgaaggat 540

acagggctat caaacgataa gatggggtgt ctggggtaat atgaacgaac aatattccgc 600

attgcgtagt aatgtcagta tgctcggcaa agtgctggga gaaaccatca aggatgcgtt 660

gggagaacac attcttgaac gcgtagaaac tatccgtaag ttgtcgaaat cttcacgcgc 720

tggcaatgat gctaaccgcc aggagttgct caccacctta caaaatttgt cgaacgacga 780

gctgctgccc gttgcgcgtg cgtttagtca gttcctgaac ctggccaaca ccgccgagca 840

ataccacagc atttcgccga aaggcgaagc tgccagcaac ccggaagtga tcgcccgcac 900

cctgcgtaaa ctgaaaaacc agccggaact gagcgaagac accatcaaaa aagcagtgga 960

atcgctgtcg ctggaactgg tcctcacggc tcacccaacc gaaattaccc gtcgtacact 1020

gatccacaaa atggtggaag tgaacgcctg tttaaaacag ctcgataaca aagatatcgc 1080

tgactacgaa cacaaccagc tgatgcgtcg cctgcgccag ttgatcgccc agtcatggca 1140

taccgatgaa atccgtaagc tgcgtccaag cccggtagat gaagccaaat ggggctttgc 1200

cgtagtggaa aacagcctgt ggcaaggcgt accaaattac ctgcgcgaac tgaacgaaca 1260

actggaagag aacctcggct acaaactgcc cgtcgaattt gttccggtcc gttttacttc 1320

gtggatgggc ggcgaccgcg acggcaaccc gaacgtcact gccgatatca cccgccacgt 1380

cctgctactc agccgctgga aagccaccga tttgttcctg aaagatattc aggtgctggt 1440

ttctgaactg tcgatggttg aagcgacccc tgaactgctg gcgctggttg gcgaagaagg 1500

tgccgcagaa ccgtatcgct atctgatgaa aaacctgcgt tctcgcctga tggcgacaca 1560

ggcatggctg gaagcgcgcc tgaaaggcga agaactgcca aaaccagaag gcctgctgac 1620

acaaaacgaa gaactgtggg aaccgctcta cgcttgctac cagtcacttc aggcgtgtgg 1680

catgggtatt atcgccaacg gcgatctgct cgacaccctg cgccgcgtga aatgtttcgg 1740

cgtaccgctg gtccgtattg atatccgtca ggagagcacg cgtcataccg aagcgctggg 1800

cgagctgacc cgctacctcg gtatcggcga ctacgaaagc tggtcagagg ccgacaaaca 1860

ggcgttcctg atccgcgaac tgaactccaa acgtccgctt ctgccgcgca actggcaacc 1920

aagcgccgaa acgcgcgaag tgctcgatac ctgccaggtg attgccgaag caccgcaagg 1980

ctccattgcc gcctacgtga tctcgatggc gaaaacgccg tccgacgtac tggctgtcca 2040

cctgctgctg aaagaagcgg gtatcgggtt tgcgatgccg gttgctccgc tgtttgaaac 2100

cctcgatgat ctgaacaacg ccaacgatgt catgacccag ctgctcaata ttgactggta 2160

tcgtggcctg attcagggca aacagatggt gatgattggc tattccgact cagcaaaaga 2220

tgcgggagtg atggcagctt cctgggcgca atatcaggca caggatgcat taatcaaaac 2280

ctgcgaaaaa gcgggtattg agctgacgtt gttccacggt cgcggcggtt ccattggtcg 2340

cggcggcgca cctgctcatg cggcgctgct gtcacaaccg ccaggaagcc tgaaaggcgg 2400

cctgcgcgta accgaacagg gcgagatgat ccgctttaaa tatggtctgc cagaaatcac 2460

cgtcagcagc ctgtcgcttt ataccggggc gattctggaa gccaacctgc tgccaccgcc 2520

ggagccgaaa gagagctggc gtcgcattat ggatgaactg tcagtcatct cctgcgatgt 2580

ctaccgcggc tacgtacgtg aaaacaaaga ttttgtgcct tacttccgct ccgctacgcc 2640

ggaacaagaa ctgggcaaac tgccgttggg ttcacgtccg gcgaaacgtc gcccaaccgg 2700

cggcgtcgag tcactacgcg ccattccgtg gatcttcgcc tggacgcaaa accgtctgat 2760

gctccccgcc tggctgggtg caggtacggc gctgcaaaaa gtggtcgaag acggcaaaca 2820

gagcgagctg gaggctatgt gccgcgattg gccattcttc tcgacgcgtc tcggcatgct 2880

ggagatggtc ttcgccaaag cagacctgtg gctggcggaa tactatgacc aacgcctggt 2940

agacaaagca ctgtggccgt taggtaaaga gttacgcaac ctgcaagaag aagacatcaa 3000

agtggtgctg gcgattgcca acgattccca tctgatggcc gatctgccgt ggattgcaga 3060

gtctattcag ctacggaata tttacaccga cccgctgaac gtattgcagg ccgagttgct 3120

gcaccgctcc cgccaggcag aaaaagaagg ccaggaaccg gaccctcgcg tcgaacaagc 3180

gttaatggtc actattgccg ggattgcggc aggtatgcgt aataccggct aatcttcctc 3240

ttctgcaaac cctcgtgctt ttgcgcgagg gttttctgaa atacttctgt tctaacaccc 3300

tcgttttcaa tatatttctg tctgcatttt attcaaagga tccgtccacc tatgttgact 3360

acatcatcaa ccagatcgat tctgacaaca aactgggcgt aggttcagac gacaccgttg 3420

ctgtgggtat cgtttaccag ttctaatagc acacctcttt gttaaatgcc gaaaaaacag 3480

gactttggtc ctgttttttt tataccttcc agagcaatct cacgtcttgc aaaaacagcc 3540

tgcgttttca tcagtaatag ttggaatttt gtaaatctcc cgttaccctg atagcggact 3600

tcccttctgt aaccataatg gaacctcgtc atgtttgaga acattaccgc cgctcctgcc 3660

gacccgattc tgggcctggc cgatctgttt cgtgccgatg aacgtcccgg caaaattaac 3720

ctcgggattg gtgtctataa agatgagacg ggcaaaaccc cggtactgac cagcgtgaaa 3780

aaggctgaac agtatctgct cgaaaatgaa accaccaaaa attacctcgg cattgacggc 3840

atccctgaat ttggtcgctg cactcaggaa ctgctgtttg gtaaaggtag cgccctgatc 3900

aatgacaaac gtgctcgcac ggcacagact ccggggggca ctggcgcact acgcgtggct 3960

gccgatttcc tggcaaaaaa taccagcgtt aagcgtgtgt gggtgagcaa cccaagctgg 4020

ccgaaccata agagcgtctt taactctgca ggtctggaag ttcgtgaata cgcttattat 4080

gatgcggaaa atcacactct tgacttcgat gcactgatta acagcctgaa tgaagctcag 4140

gctggcgacg tagtgctgtt ccatggctgc tgccataacc caaccggtat cgaccctacg 4200

ctggaacaat ggcaaacact ggcacaactc tccgttgaga aaggctggtt accgctgttt 4260

gacttcgctt accagggttt tgcccgtggt ctggaagaag atgctgaagg actgcgcgct 4320

ttcgcggcta tgcataaaga gctgattgtt gccagttcct actctaaaaa ctttggcctg 4380

tacaacgagc gtgttggcgc ttgtactctg gttgctgccg acagtgaaac cgttgatcgc 4440

gcattcagcc aaatgaaagc ggcgattcgc gctaactact ctaacccacc agcacacggc 4500

gcttctgttg ttgccaccat cctgagcaac gatgcgttac gtgcgatttg ggaacaagag 4560

ctgactgata tgcgccagcg tattcagcgt atgcgtcagt tgttcgtcaa tacgctgcag 4620

gaaaaaggcg caaaccgcga cttcagcttt atcatcaaac agaacggcat gttctccttc 4680

agtggcctga caaaagaaca agtgctgcgt ctgcgcgaag agtttggcgt atatgcggtt 4740

gcttctggtc gcgtaaatgt ggccgggatg acaccagata acatggctcc gctgtgcgaa 4800

gcgattgtgg cagtgctgta agcattaaaa acaatgaagc ccgctgaaaa gcgggctgag 4860

actgatgaca aacgcaacat tgcctgatgc gctacgctta tgagctcggt accgagctcg 4920

aattcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt tacccaactt 4980

aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc 5040

gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat ggcgcctgat gcggtatttt 5100

ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatatggt gcactctcag tacaatctgc 5160

tctgatgccg catagttaag ccagccccga cacccgccaa cacccgctga cgagcttagt 5220

aaagccctcg ctagatttta atgcggatgt tgcgattact tcgccaacta ttgcgataac 5280

aagaaaaagc cagcctttca tgatatatct cccaatttgt gtagggctta ttatgcacgc 5340

ttaaaaataa taaaagcaga cttgacctga tagtttggct gtgagcaatt atgtgcttag 5400

tgcatctaac gcttgagtta agccgcgccg cgaagcggcg tcggcttgaa cgaattgtta 5460

gacattattt gccgactacc ttggtgatct cgcctttcac gtagtggaca aattcttcca 5520

actgatctgc gcgcgaggcc aagcgatctt cttcttgtcc aagataagcc tgtctagctt 5580

caagtatgac gggctgatac tgggccggca ggcgctccat tgcccagtcg gcagcgacat 5640

ccttcggcgc gattttgccg gttactgcgc tgtaccaaat gcgggacaac gtaagcacta 5700

catttcgctc atcgccagcc cagtcgggcg gcgagttcca tagcgttaag gtttcattta 5760

gcgcctcaaa tagatcctgt tcaggaaccg gatcaaagag ttcctccgcc gctggaccta 5820

ccaaggcaac gctatgttct cttgcttttg tcagcaagat agccagatca atgtcgatcg 5880

tggctggctc gaagatacct gcaagaatgt cattgcgctg ccattctcca aattgcagtt 5940

cgcgcttagc tggataacgc cacggaatga tgtcgtcgtg cacaacaatg gtgacttcta 6000

cagcgcggag aatctcgctc tctccagggg aagccgaagt ttccaaaagg tcgttgatca 6060

aagctcgccg cgttgtttca tcaagcctta cggtcaccgt aaccagcaaa tcaatatcac 6120

tgtgtggctt caggccgcca tccactgcgg agccgtacaa atgtacggcc agcaacgtcg 6180

gttcgagatg gcgctcgatg acgccaacta cctctgatag ttgagtcgat acttcggcga 6240

tcaccgcttc cctcatgatg tttaactttg ttttagggcg actgccctgc tgcgtaacat 6300

cgttgctgct ccataacatc aaacatcgac ccacggcgta acgcgcttgc tgcttggatg 6360

cccgaggcat agactgtacc ccaaaaaaac agtcataaca agccatgaaa accgccactg 6420

cgccgttacc accgctgcgt tcggtcaagg ttctggacca gttgcgtgag cgcatacgct 6480

acttgcatta cagcttacga accgaacagg cttatgtcca ctgggttcgt gccttcatcc 6540

gtttccacgg tgtgcgtcac ccggcaacct tgggcagcag cgaagtcgag gcatttctgt 6600

cctggctggc gaacgagcgc aaggtttcgg tctccacgca tcgtcaggca ttggcggcct 6660

tgctgttctt ctacggcaag gtgctgtgca cggatctgcc ctggcttcag gagatcggaa 6720

gacctcggcc gtcgcggcgc ttgccggtgg tgctgacccc ggatgaagtg gttcgcatcc 6780

tcggttttct ggaaggcgag catcgtttgt tcgcccagct tctgtatgga acgggcatgc 6840

ggatcagtga gggtttgcaa ctgcgggtca aggatctgga tttcgatcac ggcacgatca 6900

tcgtgcggga gggcaagggc tccaaggatc gggccttgat gttacccgag agcttggcac 6960

ccagcctgcg cgagcagggg aattaattcc cacgggtttt gctgcccgca aacgggctgt 7020

tctggtgttg ctagtttgtt atcagaatcg cagatccggc ttcagccggt ttgccggctg 7080

aaagcgctat ttcttccaga attgccatga ttttttcccc acgggaggcg tcactggctc 7140

ccgtgttgtc ggcagctttg attcgataag cagcatcgcc tgtttcaggc tgtctatgtg 7200

tgactgttga gctgtaacaa gttgtctcag gtgttcaatt tcatgttcta gttgctttgt 7260

tttactggtt tcacctgttc tattaggtgt tacatgctgt tcatctgtta cattgtcgat 7320

ctgttcatgg tgaacagctt tgaatgcacc aaaaactcgt aaaagctctg atgtatctat 7380

cttttttaca ccgttttcat ctgtgcatat ggacagtttt ccctttgata tgtaacggtg 7440

aacagttgtt ctacttttgt ttgttagtct tgatgcttca ctgatagata caagagccat 7500

aagaacctca gatccttccg tatttagcca gtatgttctc tagtgtggtt cgttgttttt 7560

gcgtgagcca tgagaacgaa ccattgagat catacttact ttgcatgtca ctcaaaaatt 7620

ttgcctcaaa actggtgagc tgaatttttg cagttaaagc atcgtgtagt gtttttctta 7680

gtccgttatg taggtaggaa tctgatgtaa tggttgttgg tattttgtca ccattcattt 7740

ttatctggtt gttctcaagt tcggttacga gatccatttg tctatctagt tcaacttgga 7800

aaatcaacgt atcagtcggg cggcctcgct tatcaaccac caatttcata ttgctgtaag 7860

tgtttaaatc tttacttatt ggtttcaaaa cccattggtt aagcctttta aactcatggt 7920

agttattttc aagcattaac atgaacttaa attcatcaag gctaatctct atatttgcct 7980

tgtgagtttt cttttgtgtt agttctttta ataaccactc ataaatcctc atagagtatt 8040

tgttttcaaa agacttaaca tgttccagat tatattttat gaattttttt aactggaaaa 8100

gataaggcaa tatctcttca ctaaaaacta attctaattt ttcgcttgag aacttggcat 8160

agtttgtcca ctggaaaatc tcaaagcctt taaccaaagg attcctgatt tccacagttc 8220

tcgtcatcag ctctctggtt gctttagcta atacaccata agcattttcc ctactgatgt 8280

tcatcatctg agcgtattgg ttataagtga acgataccgt ccgttctttc cttgtagggt 8340

tttcaatcgt ggggttgagt agtgccacac agcataaaat tagcttggtt tcatgctccg 8400

ttaagtcata gcgactaatc gctagttcat ttgctttgaa aacaactaat tcagacatac 8460

atctcaattg gtctaggtga ttttaatcac tataccaatt gagatgggct agtcaatgat 8520

aattactagt ccttttcctt tgagttgtgg gtatctgtaa attctgctag acctttgctg 8580

gaaaacttgt aaattctgct agaccctctg taaattccgc tagacctttg tgtgtttttt 8640

ttgtttatat tcaagtggtt ataatttata gaataaagaa agaataaaaa aagataaaaa 8700

gaatagatcc cagccctgtg tataactcac tactttagtc agttccgcag tattacaaaa 8760

ggatgtcgca aacgctgttt gctcctctac aaaacagacc ttaaaaccct aaaggcttaa 8820

gtagcaccct cgcaagctcg ggcaaatcgc tgaatattcc ttttgtctcc gaccatcagg 8880

cacctgagtc gctgtctttt tcgtgacatt cagttcgctg cgctcacggc tctggcagtg 8940

aatgggggta aatggcacta caggcgcctt ttatggattc atgcaaggaa actacccata 9000

atacaagaaa agcccgtcac gggcttctca gggcgtttta tggcgggtct gctatgtggt 9060

gctatctgac tttttgctgt tcagcagttc ctgccctctg attttccagt ctgaccactt 9120

cggattatcc cgtgacaggt cattcagact ggctaatgca cccagtaagg cagcggtatc 9180

atcaacaggc tta 9193

Claims (7)

1.具有喹啉酸产生能力的埃希氏菌属(Escherichia)微生物，其被转化为具有源自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)的喹啉酸合酶活性。

2.如权利要求1所述的埃希氏菌属微生物，其中所述源自肺炎克雷伯氏菌的喹啉酸合酶具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的埃希氏菌属微生物，其中编码所述源自肺炎克雷伯氏菌的喹啉酸合酶的多核苷酸具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列。

4.如权利要求1所述的埃希氏菌属微生物，其中与其内源性L-天冬氨酸氧化酶活性相比，所述埃希氏菌属微生物还具有增强的L-天冬氨酸氧化酶活性。

5.如权利要求1所述的埃希氏菌属微生物，其中与其内源性喹啉酸磷酸核糖基转移酶活性相比，所述埃希氏菌属微生物还具有减弱的喹啉酸磷酸核糖基转移酶活性。

6.如权利要求1所述的埃希氏菌属微生物，其中所述埃希氏菌属微生物是大肠杆菌(Escherichia coli)。

7.产生喹啉酸的方法，其包括：

(a)在培养基中培养权利要求1-6中任一项所述的埃希氏菌属微生物；和

(b)从步骤(a)所培养的微生物、所述培养基或两者中回收喹啉酸。