BRPI0703528A2 - subunidade pequena mutante de acetolactato sintase bacteriana (ahas i), acetolactato sintase mutante, dna, bactéria da famìlia enterobacteriaceae, e, método para produzir um l-aminoácido de cadeia ramificada - Google Patents

Abstract

SUBUNIDADE PEQUENA MUTANTE DE ACETOLACTATO SINTASE BACTERIANA (AHAS 1), ACETOLACTATO SINTASE MUTANTE, DNA, BACTéRIA DA FAMìLIA ENTEROBACTERIACEAE, E, METODO PARA PRODUZIR UM L-AMINOáCIDO DE CADEIA RAMIFICADA Uma acetolactato sintase bacteriana mutante (AI-IAS 1) que é resistente à inibição da realimentação por L-valina é descrita. Também é descrito um método para produzir L-aminoácidos de cadeia ramificada usando uma bactéria da família Enterobacteriaceae em que a produtividade de L-aminoácido da referida bactéria é melhorada pelo uso de acetolactato sintase (AI-IAS 1) que é resistente à inibição de realimentação por L-valina.Esta acetolactato sintase contém uma subunidade pequena mutante codificada pelo gene ilvN mutante.

Description

"SUBUNIDADE PEQUENA MUTANTE DE ACETOLACTATO SINTASEBACTER1ANA (AHAS I), ACETOLACTATO SINTASE MUTANTE,DNA, BACTÉRIA DA FAMÍLIA ENTEROBACTERIACEAE, E, MÉTODOPARA PRODUZIR UM L-AMINOÁCIDO DE CADEIA RAMIFICADA"ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se à biotecnologia, eespecificamente a um método para produzir L-aminoácidos de cadeiaramificada. Mais especificamente, a presente invenção descreve o uso de umanova enzima resistente a L-valina que está envolvida na biossíntese de L-aminoácidos de cadeia ramificada. Mais especificamente, a presente invençãorefere-se a acetolactato sintase mutante resistente a L-valina (AHAS 1)purificada de E. coli, uma bactéria da família Enterobacteriaceae que contémesta enzima sintase, e um método para produzir L-aminoácidos de cadeiaramificada por fermentação usando as cepas destas bactérias.

Breve Descrição da Arte Relacionada

Tradicionalmente, L-aminoácidos foram industrialmenteproduzidos por fermentação utilizando cepas de microorganismos obtidos defontes naturais, ou seus mutantes, que foram especificamente modificadospara melhorar a produtividade de L-aminoácido.

Muitas técnicas foram previamente descritas paraespecificamente melhorar a produtividade de L-aminoácido, como, porexemplo, transformação de microorganismos com DNA recombinante (ver,patente US 4.278.765). Estas técnicas são baseadas em aumento dasatividades das enzimas envolvidas em biossíntese de aminoácido e/oudessenssibilização das enzimas alvo para realimentar a inibição do L-aminoácido produzido (ver, por exemplo, pedido de patente japonesaacessível ao público No. 56-18596 (1981), WO 95/16042 ou patentes US5.661.012 e 6.040.160).A biossíntese de isoleucina, leucina, e valina ocorre através deuma via ramificada em que três etapas são comuns a cada produto final. Areação AHAS representa a primeira etapa biossintética comum aos trêsprodutos. A reação é catalisada por isoenzimas que são o alvo da inibição doproduto final por valina. Esta regulação desempenha um papel principal nocontrole fisiológico da via em bactérias. A reação inclui a condensação deacetaldeído ativo (derivado de piruvato) com ou a- cetobutirato ou piruvatopara dar a-aceto-a- hidroxibutirato (um precursor de isoleucina) ou a-acetolactato (um precursor de leucina e valina), respectivamente.

Foi relatado que valina e seu precursor de ceto-ácido ácido a-cetoisovalérico inibem o crescimento de E. coli K12, e que isoleucina écontrária a esta inibição (Tatum, E. LI, Fed. Proc. 8:511 (1946)). Atualmente,é comumente aceito que a inibição de valina primariamente resulta dobloqueio da síntese de a-aceto-a- hidroxibutirato. Uma análise de E. coli Kl2revelou que esta cepa contém os genes estruturais para as três atividades deAHAS, que são designadas como isoenzimas AHAS I, AHAS II e AHAS III.AHAS I e AHAS III são, ambos, inibidos por valina, enquanto AHAS II éresistente à mesma; no entanto, AHAS II não é normalmente expressada emcélulas de E. coli Kl2 (Guardiola, J et al, Mol. Gen. Genet. 156: 17-25(1977). Todas as isoenzimas AHAS de enterobactérias são compostas de umasubunidade grande e uma pequena em uma estrutura a2p2, com as grandessubunidades realizando uma função catalítica e as subunidades pequenasrealizando uma função regulatória. As subunidades pequenas sãoabsolutamente requeridas para sensibilidade da atividade de enzima para oinibidor de realimentação de valina. Um estudo das propriedades individuaisde subunidades AHAS I e AHAS III (Weinstock O. et al, J. Bacteriol. 174:5560-5566 (1992)) mostraram que as subunidades pequenas especificamenteinduziram uma conformação competente cataliticamente da enzima completae estabilizaram o estado de transição.Com base em um modelo da região de ligação a valina dasubunidade pequena regulatória de AHAS III de E. coli, truncagens daextremidade carboxila da subunidade pequena foram feitas. Estas truncagensinduziram uma falta de sensibilidade a valina nas enzimas AHAS IIItruncadas (Mendel S. et al. J. Mol. Biol., 10; 325(2) 275-85 (2003)).

Mas, atualmente, não se tem relatórios descrevendoacetolactato sintase bacteriano mutante (AHAS I) que é resistente àrealimentação a valina e o uso desta acetolactato sintase mutante paramelhorar a produção de L-aminoácido de cadeia ramificada em cepasproduzindo L-aminoácido correspondente.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção provê uma nova acetolactato sintasebacteriana mutante para o fim de desenvolver cepas produzindo L-aminoácidode cadeia ramificada com melhorada produtividade de L-aminoácidos decadeia ramificada e para prover um método para produzir L-aminoácidos decadeia ramificada usando estas cepas.

A presente invenção foi obtida pela construção de novaacetolactato sintase mutante a partir de E. coli. Esta acetolactato sintasemutante de E. coli tem uma mutação na unidade regulatória IIvN,especificamente Asn-17, Ala-30, e/ou Ile-44. Esta acetolactato sintasemutante foi mostrada como melhorando a produção de L-aminoácido decadeia ramificada quando DNA codificando a enzima mutante é introduzidana cepa produtora de L-aminoácido de cadeia ramificada.

É um aspecto da presente invenção prover uma subunidadepequena de acetolactato sintase bacteriana mutante (AHAS I) compreendendoa subunidade pequena de acetolactato sintase de tipo selvagem de Escherichiacoli compreendendo uma mutação selecionada dentre o grupo consistindo de :substituir o L-aminoácido na posição 17 e/ou 30 na referida subunidadepequena de acetolactato sintase de tipo selvagem com outro L-aminoácido,substituir a porção N-término a jusante do L-aminoácido na posição 44 nareferida subunidade pequena de acetolactato sintase de tipo selvagem comvários L-aminoácidos, e suas combinações, em que referida subunidadepequena mutante de acetolactato sintase é dessenssibilizada para inibição darealimentação por valina.

É um outro aspecto da presente invenção prover a subunidadepequena mutante de acetolactato sintase bacteriana (AHAS I) descrita acima,em que referido L-aminoácido na posição 17 é substituído com um resíduo delisina.

É um outro aspecto da presente invenção prover a subunidadepequena mutante de acetolactato sintase bacteriana (AHAS I) descrita acima,em que o L-aminoácido na posição 30 é substituído com um resíduo prolina.

É um outro aspecto da presente invenção prover a subunidadepequena mutante de acetolactato sintase bacteriana (AHAS I) descrita acima,em que a referida porção N-término a jusante de L-aminoácido na posição 44é substituída com arginina e fenilalanina.

É um outro aspecto da presente invenção prover a subunidadepequena mutante de acetolactato sintase bacteriana (AHAS I) descrita acima,em que referido L-aminoácido na posição 17 que é substituído com umresíduo lisina é asparagina.

É um outro aspecto da presente invenção prover a subunidadepequena mutante de acetolactato sintase bacteriana (AHAS I) descrita acima,em que referido L-aminoácido na posição 30, que é substituído com umresíduo de prolina, é alanina.

É um outro aspecto da presente invenção prover a subunidadepequena mutante de acetolactato sintase bacteriana (AHAS I) descrita acima,em que referido L-aminoácido na posição 44, que é substituído com argininae fenilalanina, é isoleucina.

É um outro aspecto da presente invenção prover umaacetolactato sintase bacteriana mutante compreendendo a subunidade pequenadescrita acima.

É um outro aspecto da presente invenção prover a acetolactatosintase mutante descrita acima, em que referida acetolactato sintase mutantecompreende a subunidade grande de Escherichia coli.

É um outro aspecto da presente invenção prover a acetolactatosintase bacteriana mutante descrita acima, em que a subunidade pequenainclui deleções, substituições, inserções, ou adições de um ou váriosaminoácidos em uma ou mais posições diferentes de posições 17, 30 e/ou 44,e em que referida acetolactato sintase mutante é dessenssilizada para inibiçãode realimentação por valina.

É um outro aspecto da presente invenção prover um DNAcodificando para a subunidade pequena mutante da acetolactato sintasedescrita acima.

É um outro aspecto da presente invenção prover uma bactériada família Enterobaeteriaceae, que contém o DNA descrito acima e tem acapacidade de prover L-aminoácidos de cadeia ramificada.

É um outro aspecto da presente invenção prover a bactériadescrita acima, em que referidos L-aminoácidos de cadeia ramificada sãoselecionados dentre o grupo consistindo de L-leucina, L-isoleucina, e L-valina.

É um outro aspecto da presente invenção prover a bactériadescrita acima, em que a atividade da acetolactato sintase mutante émelhorada na bactéria.

É um outro aspecto da presente invenção prover a bactériadescrita acima, em que a bactéria pertence ao gênero Eseheriehia.

É um outro aspecto da presente invenção prover a bactériadescrita acima, em que a atividade da acetolactato sintase mutante émelhorada por aumento da expressão do gene acetolactato sintase mutante.É um outro aspecto da presente invenção prover a bactériadescrita acima, em que a atividade da acetolactato sintase mutante émelhorada por um método selecionado dentre o grupo consistindo de:

a) aumentar o número de cópias do gene de acetolactatosintase mutante,

b) modificar uma seqüência de controle de expressão do gene,de modo que a expressão do gene é melhorada, e

c) suas combinações.

É um outro aspecto da presente invenção prover a bactériadescrita acima, em que o número de cópias é melhorado pela integração decópias múltiplas do gene acetolactato sintase mutante no cromossomo dabactéria.

É um outro aspecto da presente invenção prover um métodopara produzir L-aminoácidos de cadeia ramificada compreendendo cultivar abactéria descrita acima em um meio de cultura, e coletar os L-aminoácidos decadeia ramificada do meio de cultura.

É um outro aspecto da presente invenção prover o métododescrito acima, em que a bactéria tem melhorada expressão de genesenvolvidos em biossíntese de L-aminoácido de cadeia ramificada.

É um outro aspecto da presente invenção prover o métododescrito acima, em que referido L-aminoácido de cadeia ramificada éselecionado dentre o grupo consistindo de L-leucina, L-isoleucina, e L-valina.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 mostra a construção do plasmídeo pMIV-PiVbL-ilvBN.

A figura 2 mostra a estratégia para o seqüenciamento deoperon ilvBN33.

A figura 3 mostra um alinhamento das seqüências denucleotídeos e aminoácidos de ilvN e ilvN33. A seqüência de nucleotídeos émostrada em letras minúsculas, os aminoácidos em maiúsculas. Umarepetição direta de 34 bp em ilvN33 é mostrada em negrito e marcada comsetas.

A figura 4 mostra a construção do plasmídeo pM12.

A figura 5 mostra a construção do plasmídeo pM12-ter(thr).

A figura 6 mostra a construção do cassete integrativo intJS.

A figura 7 mostra a construção do plasmídeo pMIY-5JS.

A figura 8 mostra a construção do fragmento de DNAcromossômico com o gene ilvBN inativado.

DESCRIÇÃO DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS

Além disso, a presente invenção será explicada em detalhes.

<1> A subunidade pequena mutante de acetolactato sintase egene ilvN mutante

O termo "acetolactato sintase bacteriana" significa aacetolactato sintase de tipo selvagem, ou endógena, presente em bactérias dafamília Enterobacteriaceae, corinebactérias, bactérias pertencendo ao gêneroBacillus etc. A família Enterobacteriaceae inclui bactérias pertencendo aogênero Escherichia, Erwinia, Providencia e Serratia. O gene Escherichia épreferido.

A expressão "atividade de acetolactato sintase" significa aatividade que catalisa a formação de 2-aceto-2-hidróxi-butirato e CO2 a partirde piruvato e 2-oxobutanoato, ou a formação de 2-acetolactato e CO2 a partirde duas moléculas de piruvato. Esta atividade pode ser medida em extratosbacterianos usando o método de F.C. Stormer e H.E. Umbarger (Biochem.Biophys. Res. Commun. 17, 5, 587- 592 (1964)).

A acetohidroxibutanoato sintase I, também chamadaacetolactato sintase I (AHAS I) é uma proteína heterotetrâmera que incluidois domínios catalíticos e dois regulatórios (Weinstock, O. et al, J. Bacteriol.174 (17), 5560-5566 (1992)). É geralmente aceito que as subunidades grandes(cerca de 60 kDa) são catalíticas, enquanto as pequenas são regulatórias.AHAS I é codificado pelos genes ilvB e ilvN.

A substituição de asparagina na posição 17 e/ou a alanina naposição 30 na subunidade pequena de acetolactato sintase de Escherichia coli[EC 4.1.3.18] com qualquer aminoácido, preferivelmente lisina na posição 17,e prolina na posição 30, resulta em uma proteína mutante que é resistente àinibição de realimentação por valina. Também, substituindo a porção N-término a jusante do L-aminoácido na posição 44 com um ou váriosaminoácidos, preferivelmente 2 aminoácidos, como arginina e fenilalalina,resulta em uma proteína mutante que é resistente à inibição de realimentaçãopor valina. Um exemplo típico deste mutante é ILvN33 (SEQ ID NO: 11).Vários aminoácidos podem ser substituídos a jusante de posição 44, mastipicamente podem estar entre 1 a 20, preferivelmente 1 a 10, e maispreferivelmente 2. A subunidade pequena de acetolactato sintase de tiposelvagem que tem uma substituição(ões) na posição 17 e/ou posição 30, outem vários aminoácidos substituídos na porção de N-término a jusante daposição 44, pode ser referida como a "subunidade pequena mutante". Aacetolactato sintase contendo a subunidade pequena mutante pode ser referidacomo a "acetolactato sintase mutante". Um DNA codificando para asubunidade pequena mutante pode ser referido como o "gene ilvN mutante".A subunidade pequena de acetolactato sintase sem quaisquer substituiçõespode ser referida como "subunidade pequena de tipo selvagem". Umaacetolactato sintase que contém subunidades pequenas de tipo selvagem podeser referida como uma "acetolactato sintase de tipo selvagem". Além disso,um DNA codificando a subunidade pequena mutante da presente invenção euma subunidade grande de acetolactato sintase podem ser referidas como o"gene de acetolactato sintase mutante".

O gene ilvB (sinônimo - b3671) codifica a subunidade grandede acetolactato sintase. O gene ilvB (nucleotídeos complementares a posiçõesde nucleotídeos 3849119 a 3850807; número de acesso do GeneBankNC_000913.2; gi: 16129170) está localizado entre o gene UvNq o gene ivbLno cromossomo de E. coli K-12.

O gene ilvN (sinônimo b3670) codifica a subunidade pequenade acetolactato sintase. O gene ilvN (nucleotídeos complementares a posiçõesde nucleotídeos 3848825 a 3849115; número de acesso do GeneBankNC_000913.2; gi:49175990) está localizado entre os genes uhpA e ilvB nocromossomo de E. coli K-12. A seqüência de nucleotídeos do gene ilvN e aseqüência de aminoácidos de subunidade pequena de acetolactato sintasecodificada pelo gene ilvN são mostradas em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2,respectivamente. Os genes ilvB e ilvN formam o operon ilvBN.

A subunidade pequena mutante é obtida por introdução demutações em um gene ilvN de tipo selvagem usando métodos conhecidos. Ooperon ilvBN pode ser obtido por PCR (reação de cadeia polimerase, fazerreferência a White, T.J. et al, Trends Genet. 5, 185 (1989) usando iniciadorescom base na seqüência de nucleotídeos do operon. Os genes codificando paraacetolactato sintase de outros microorganismos podem ser obtidos em ummodo similar.

A subunidade pequena mutante pode incluir deleções,substituições, inserções ou adições de um ou vários aminoácidos em uma oumais posições diferentes de 17, 30 e/ou 44, desde que a atividade deacetolactato sintase, que contém as subunidades mutantes seja obtida. Onúmero de "vários" aminoácidos difere dependendo a posição na estrutura tri-dimensional da proteína ou o tipo de resíduos de aminoácidos. Isto é porquealguns aminoácidos são similares entre si em sua estrutura e função dentro deuma proteína, e a inter-mudança destes aminoácidos não afeta muito aestrutura tri-dimensional ou a função da proteína. Assim, a acetolactatosintase mutante da presente invenção pode ser uma que tem homologia de nãomenos que 70%, preferivelmente 80%, e mais preferivelmente 90%, e maispreferivelmente 95% com relação à seqüência de aminoácidos completa paraacetolactato sintase, e que mantém a atividade de acetolactato sintase.Alternativamente, o número de "vários" aminoácidos pode ser 1 a 30,preferivelmente 1 a 15, e mais preferivelmente 1 a 5.

As substituições, deleções, inserções ou adições de um ouvários resíduos de aminoácidos é/são mutação(ões) conservativa(s) de modoque se mantém a atividade. A mutação conservativa representativa fé umasubstituição conservativa. Os exemplos de substituições conservativasincluem substituição de Ser ou Thr por Ala, substituição de Gln, His ou Lyspor Arg5 substituição de Glu, Gln, Lys, His ou Asp por Asn, substituição deAsn, Glu ou Gln por Asp, substituição de Ser ou Ala por Cys, substituição deAsn, Glu, Lys, His, Asp ou Arg por Gln, substituição de Asn, Gln, Lys ouAsp por Glu, substituição de Pro por Gly5 substituição de Asn, Lys, Gln, Argou Tyr por His, substituição de Leu, Met, Val ou Phe por lie, substituição delie, Met, Val ou Phe por Leu, substituição de Asn, Glu, Gln, His ou Arg porLys, substituição de lie, Leu, Val ou Phe por Met, substituição de Trp, Tyr,Met, Ile ou Leu por Phe, substituição de Thr ou Ala por Ser, substituição deSer ou Ala por Thr, substituição de Phe ou Tyr por Trp, substituição de His,Phe ou Trp por Tyr, e substituição de Met, Ile ou Leu por Vai.

A subunidade grande de acetolactato sintase codificada pelogene ilvB também pode incluir deleções, substituições, inserções ou adiçõesde um ou vários aminoácidos em uma ou mais posições.

Na presente invenção, a expressão "L-aminoácido na posição17, 30 e/ou 44" significa um resíduo de aminoácido correspondendo aoresíduo de aminoácido na posição 17, 30 e/ou 44 na seqüência de aminoácidode SEQ ID NO: 2, que é a seqüência de subunidade pequena de tipo selvagemde E. coli, de acetolactato sintase. Na subunidade pequena de acetolactatosintase a partir de E. coli, o resíduo de aminoácido na posição 17 éasparagina, o resíduo de aminoácido na posição 30 é alanina, e o resíduo deaminoácido na posição 44 é isoleucina. A posição de um resíduo deaminoácido pode mudar. Por exemplo, se um resíduo de aminoácido forinserido na porção N-término, o resíduo de aminoácido na posição 17, 30,e/ou 44 se torna posição 18, 31 e/ou 45. Em tal caso, o resíduo de aminoácidona posição original 17, 30 e/ou 44 é designado como o resíduo de aminoácidona posição 17, 30 e/ou 44 na presente invenção.

Para determinar o L-aminoácido na posição 17, 30 e/ou 44 deuma subunidade pequena de acetolactato sintase de uma bactéria de interesse,a seqüência de aminoácido de subunidade pequena de acetolactato sintase deE. coli (SEQ ID NO: 2) é alinhada com a seqüência de aminoácido dasubunidade pequena de acetolactato sintase de bactéria de interesse, e os L-aminoácidos nas posições 17, 30 e/ou 44 na subunidade pequena deacetolactato sintase da bactéria de interesse podem ser determinados.

O DNA que codifica por substancialmente a mesma proteínacomo a subunidade pequena mutante descrita acima é obtido, por exemplo,por modificação da seqüência de nucleotídeos por mutagênese sítio-dirigidade modo que um ou mais resíduos de aminoácidos em um sítio especificadosão deletados, substituídos, inseridos ou adicionados, DNA modificado comodescrito acima é obtido por tratamentos de mutação convencionalmenteconhecidos. Estes tratamentos de mutação incluem o tratamento de um DNAcontendo o gene UvN mutante in vitro, por exemplo com hidroxilamina, etratando um microorganismo, por exemplo uma bactéria pertencendo aogênero Escherichia abrigando o gene ilvN mutante, com irradiaçãoultravioleta ou um agente de mutação conhecido como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) e ácido nitroso.

As substituições, deleções, inserções ou adições denucleotídeos, como acima descrito, também incluem mutações de ocorrêncianatural (mutante ou variante), por exemplo, na base de diferenças individuaisou diferenças em espécie ou gênero da bactéria, que contém acetolactatosintase.

O DNA que codifica para substancialmente a mesma proteínacomo a subunidade pequena mutante pode ser obtido por isolamento do DNAque hibridiza com DNA tendo uma seqüência complementar a seqüência degene ilvN conhecido ou parte do mesmo, sob condições estringentes, e quecodifica para uma proteína que forma uma enzima completa tendo atividadede acetolactato sintase, com uma subunidade grande, de uma célula que foisubmetida a tratamento de mutação.

"Condições estringentes" incluem as sob as quais um híbridoespecífico, por exemplo, um híbrido tendo homologia de não menos que 60%,preferivelmente não menos que 70%, mais preferivelmente não menos que80%, ainda mais preferivelmente não menos que 90% e o maispreferivelmente não menos que 95%, é formado e um híbrido não específico,por exemplo, um híbrido tendo homologia menor do que acima, não éformado. Por exemplo, condições estringentes são exemplificadas porlavagem uma vez ou mais, preferivelmente duas ou três vezes, em umaconcentração de sal de 1 χ SSC, 0,1% SDS, preferivelmente 0,1 X SSC, 0,1%SDS a 60°C. A duração de lavagem depende do tipo de membrana usada parablotting, e como uma regra, deve ser a recomendada pelo fabricante. Porexemplo, a duração recomendada de lavagem para a membrana Hybond ™N+ nylon (Amersham) sob condições estringentes é de 15 minutos.Preferivelmente, a lavagem por ser realizada 2 a 3 vezes. O comprimento dasonda pode ser selecionado de modo apropriado dependendo das condições dehibridização, e é geralmente de 100 bp a 1 kbp.

Para avaliar o grau de homologia de DNA ou proteína, váriosmétodos de cálculo, como busca BLAST, busca FASTA, e ClustalW, podemser usados.

BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) é o algoritmo debusca heurístico empregado pelos programas blastp, blastn, blastx, megablast,tblastn, e tblastx. Estes programas atribuem significância a suas descobertasusando os métodos estatísticos de Karlin, Samuel e Stephen F. Altschul("Methods for assessing the statistical significance of molecular sequencefeatures for using general scoring schemes", Proc. Natl. Acad. Sei. USA1990, 87: 2264-68; "Applications and statisties for multiple high scoringsegments in molecular sequences", Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1993, 90:5873-7). O método de busca FASTA é descrito por W.R. Pearson ("Rapid andSensitive Sequence Comparison with FASTP e FASTA", Methods inEnzymology, 1990, 183: 63-98). O método ClustalW é descrito porThompson J.D. Higgins D.G. e Gibson TJ. ("CLUSTAL W: improving thesensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequenceweighting,position-specific gap penalties and weight matrix choice", NucleicAcids Res. 1994, 22: 4673- 4680).

O gene que é capaz de hibridizar sob as condições comodescrito acima, inclui genes que tem um códon de parada dentro da região decodificação e genes que são inativos devido à mutação do sítio ativo. Noentanto, estas inconveniências podem ser facilmente removidas por ligação dogene com um vetor de expressão comercialmente disponível, e investigando aatividade de acetolactato sintase de enzima completa contendo a proteínaexpressada.

<2> Bactéria da presente invenção

A bactéria da presente invenção é uma bactéria produzindo L-aminoácido de cadeia ramificada da família Enterobacteriaceae que contémum DNA que codifica para a subunidade pequena mutante de acetolactatosintase. Além disso, a bactéria da presente invenção é uma bactériaproduzindo L-aminoácido de cadeia ramificada da família Enterobacteriaeeaeque tem uma aumentada atividade de acetolactato sintase mutante.Especificamente, a bactéria da presente invenção é uma bactéria produzindoL-aminoácido de cadeia ramificada da família Enterobaeteriaeeae, em que aprodução de L-aminoácido de cadeia ramificada é aumentada devido àintrodução, na bactéria, do gene ilvN mutante que codifica a subunidadepequena mutante da presente invenção. A bactéria da presente invenção é umabactéria produzindo L-aminoácido de cadeia ramificada pertencendo aogênero Escherichia, em que a produção de L-aminoácido de cadeiaramificada é aumentada por melhorada da atividade de acetolactato sintase,ou seja acetolactato sintase mutante resistente a valina, na bactéria. Maisconcretamente, a bactéria da presente invenção contém o gene ilvN mutantesobre o cromossomo bacteriano ou em um plasmídeo, em que o gene é super-expressado, e esta bactéria tem uma capacidade melhorada para produzir L-aminoácidos de cadeia ramificada.

A expressão "bactéria que tem a capacidade de produzir L-aminoácidos de cadeia ramificada" indica uma bactéria que tem a capacidadede causar acúmulo de L-aminoácidos de cadeia ramificada em um meio, comoL-leucina, L-isoleucina e L-valina, quando a bactéria da presente invenção écultivada no meio. A capacidade produtora de L-aminoácido de cadeiaramificada pode ser conferida ou melhorada por criação. A expressão"bactéria que tem a capacidade de produzir L-aminoácido de cadeiaramificada" usada aqui também indica uma bactéria que é capaz de produzir ecausar acúmulo, no meio de cultura, de uma quantidade maior de L-aminoácidos de cadeia ramificada do que uma cepa parental ou tipo selvagem,e preferivelmente significa que a bactéria é capaz de produzir e causaracúmulo no meio de não menos que 0,5 g/L, mais preferivelmente não menosque 1,0 g/L dos L-aminoácidos de cadeia ramificada. Os L-aminoácidosexemplares incluem L-leucina, L-isoleucina, e L-valina.

A família Enterobacteriaceae inclui bactériaspertencendo aos gêneros Escherichia, Enterobacter, Erwinia,Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia,Shigella, Morganella e Yersinia, etc.. Especificamente, os classificadoscomo Enterobacteriaceae de acordo com a taxonomia usada na basede dados NCBI (National Center for Biotechnology Information)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347)pode ser usado. Uma bactéria pertencendo ao gênero Escherichia ou Pantoeais preferida.

O termo "uma bactéria um pertencendo ao gêneroEscherichia" significa a bactéria classificada como o gênero Escherichia deacordo com a classificação bem conhecida do versado em microbiologia. Umexemplo é Escherichia coli (E. coli).

A expressão "atividade da acetolactato sintase mutante émelhorada" significa que a atividade por célula é maior do que a da cepa nãomodificada, por exemplo uma cepa de tipo selvagem. As atividadesmelhoradas exemplares incluem quando o número das moléculas deacetolactato sintase mutante por célula aumentada, e quando a atividadeespecífica por molécula de acetolactato sintase mutante aumentada, e assimem diante. Além disso, uma cepa de tipo selvagem exemplar que pode serusada para comparação, por exemplo, é Escherichia coli KI-12. Como umresultado da melhora da atividade intracelular da acetolactato sintase mutante,a quantidade de L-aminoácidos de cadeia ramificada no meio é aumentada.

A atividade de acetolactato sintase mutante em uma célulabacteriana pode ser melhorada por aumento da expressão do gene codificandopara a acetolactato sintase mutante. Qualquer gene que codifica paraacetolactato sintase mutante derivada ou isolada de bactérias da famíliaEnterobacteriaceae ou bactérias corineformes pode ser usado. Dentre estes,genes derivados de bactérias pertencendo ao gênero Escherichia sãopreferidos.

A transformação de uma bactéria com um DNA codificandopara uma proteína significa introduzir o DNA em uma bactéria, por exemplo,por métodos convencionais, para aumentar a expressão do gene codificandopara a proteína da presente invenção e para melhorar a atividade da proteínana célula bacteriana.

Os métodos para melhorar a expressão de genes incluemaumentar o número de cópias de genes. A introdução de um gene em umvetor que é capaz de funcionar em uma bactéria pertencendo ao gêneroEscherichia aumenta o número de cópias do gene. Para estes fms, vetores demúltiplas cópias podem ser preferivelmente usados, como pBR322, pUC19,pBluescript KS+, pACYC177, pACYC184, pAYC32, pMW119, pET22b, ououtros. A expressão dos genes também pode ser melhorada por introdução decópias múltiplas do gene no cromossomo bacteriano por, por exemplo,recombinação homóloga, ou outros.

A expressão de genes também pode ser melhorada porcolocação do DNA da presente invenção sob o controle de um promotor que émais forte do que o promotor nativo. A potência de um promotor é definidapela freqüência de iniciação de síntese de RNA. Os métodos para avaliar apotência de um promotor e exemplos de promotores potentes são descritospor Deuschle, U., Kammerer, W., Gentz, R., Bujard, H. (Promoters inEscherichia coli: a hierarchy of in vivo strength indicates alternate structures.EMBO J. 1986, 5, 2987-2994). Por exemplo, o promotor Pr é conhecidocomo um promotor constitutivo potente. Outros potentes promotoresconhecidos são o promotor PL, promotor Iac, promotor trp, promotor tre, dofago lambda, e semelhantes.

A tradução pode ser melhorada por introdução no DNA dapresente invenção de uma seqüência de Shine-Dalgarno mais eficiente(seqüência SD) em vez da seqüência SDe nativa, quando a seqüência SD estáa montante do códon de partida do mRNA que interage com o 16S RNA deribossoma (Shine J. e Dalgarno L., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1974, 71,4,1342-6).

Uso de um promotor potente pode ser combinado com o usode cópias de genes múltiplas.

Os métodos para preparar DNA cromossômico, hibridização,PCR5 preparação de DNA plasmídeo digestão e ligação de DNA,transformação, seleção de um oligonucleotídeo como um iniciador, e outros,podem ser métodos típicos que são bem conhecidos dos versados. Estesmétodos são descritos em Sambrook, J., e Russell D., "Molecular Cloning ALaboratory Manual, 3a. ed.", Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001), esemelhantes.

A bactéria da presente invenção pode ser obtida por introduçãodos DNAs acima mencionados em uma bactéria que é inerentemente capaz deproduzir L-aminoácidos de cadeia ramificada. Alternativamente, a bactéria dapresente invenção pode ser obtida ao conferir a capacidade de produzir L-aminoácido de cadeia ramificada em uma bactéria já contendo os DNAs.

Para a cepa parental da presente invenção, as bactériasproduzindo L-valina pertencendo ao gênero Escherichia como H-81 (VKPMB- 8066), NRRL B-12287 e NRRL B-12288 (Patente US 4.391.907), VKPMB-4411 (Patente US 5.658.766), VKPM B-7707 (pedido de patente européiaEPlOl 6710A2), ou semelhantes são empregadas. Também, bactériasproduzindo L-Ieucina pertencendo ao gênero Eseherichia podem ser usadas,como H-9070 (FERM BP-4704) e H-9072 (FERM BP-4706) (US5744331),VKPM B-7386 e VKPM B-7388 (RU2140450), W1485atpA401/pMWdAR6,Wl 4851ip2/pMWdAR6 e AJ12631/pMWdAR6 (EP0872547), ousemelhantes. Também, bactérias produzindo L-isoleucina pertencendo aogênero Eseheriehia podem ser usadas, como cepas (NZlO) TDH6/pVIC40,pMWD5 (Hashiguchi, K. et al, Biosci. Biotechnol. Biochem., 63(4), 672-679(1999)), ou cepa AJ12919 descritas em pedido de patente européia EP 685555Al, ou semelhantes.

<3> Método da presente invenção.

O método da presente invenção inclui produzir um L-aminoácido de cadeia ramificada, como L-leucina, L-isoleucina, e L-valina,por cultivo da bactéria da presente invenção em um meio de cultura,permitindo que o L-aminoácido de cadeia ramificada seja produzido no meiode cultura, e coleta do L-aminoácido de cadeia ramificada do meio de cultura.

Na presente invenção, o cultivo, a coleta e purificação dos L-aminoácidos de cadeia ramificada do meio e outros podem ser realizados emum modo similar aos métodos de fermentação convencionais, em que umaminoácido é produzido usando um microorganismo. O meio usado para acultura pode ser ou sintético ou natural, desde que ele inclua uma fonte decarbono e uma fonte de nitrogênio e minerais e, se necessário, quantidadesapropriadas de nutrientes que o microorganismo requer para crescimento. Afone de carbono pode incluir vários carboidratos como glicose e sacarose, evários ácidos orgânicos. Dependendo do modo de assimilação domicroorganismo selecionado, álcool incluindo etanol e glicerol pode serusado. Como a fonte de nitrogênio, vários sais de amônio como amônia esulfato de amônio, outros compostos de nitrogênio como aminas, uma fontede nitrogênio natural como peptona, hidrolisado de soja e microorganismofermentativo digerido são usados. Como minerais, monofosfato de potássio,sulfato de magnésio, cloreto de sódio, sulfato ferroso, sulfato de manganês,cloreto de cálcio, e outros, são usados. Os nutrientes adicionais podem seradicionados ao meio, se necessário. Por exemplo, se o microorganismorequerer prolina para crescimento (auxotrofia de prolina), uma quantidadesuficiente de prolina pode ser adicionada ao meio.

O cultivo é realizado preferivelmente sob condições aeróbicascomo cultura em agitação, e uma cultura em agitação com aeração, a umatemperatura de 20 a 42°C, preferivelmente 37 a 40°C. O pH da cultura estágeralmente entre 5 e 9, preferivelmente entre 6.5 e 7.2. O pH da cultura podeser ajustado com amônia, carbonato de cálcio, vários ácidos, várias bases, etampões. Geralmente, um cultivo de 1-5 dias leva ao acúmulo do L-aminoácido alvo no meio líquido.

Após cultivo, os sólidos como as células podem ser removidosdo meio líquido por centrifugação ou filtração de membrana, e então o L-aminoácido alvo pode ser coletado e purificado por métodos de troca iônica,concentração e cristalização.

Exemplos

A presente invenção será mais concretamente explicada abaixocom referência aos seguintes exemplos não limitativos.

Exemplo 1. Clonagem de operon UvBN codificando AHAS I de E. coli

O operon ilvBN foi clonado no vetor pMIV5JS como umaparte de um produto PCR de 2439 bp. Construção do vetor pMIV5JS édescrita abaixo em exemplo de referência 1. O cromossomo MGl655 foiusado como um gabarito na reação PCR. Oligonucleotídeos sintéticosilvBX60 (SEQ ID NO: 3) e ilvBR64 (SEQ ID NO: 4) foram usados comoiniciadores. Iniciador ilvBX60 contém o sítio de restrição Xbal naextremidade 5', e iniciador ilvBR64 contém o sítio de restrição Sall- naextremidade 5'. Condições para PCR foram as seguintes: desnaturaçãodurante 5 min a 94°C; perfil para 30 ciclos: 30 segundos a 94°C, 30 segundosa 59°C, 2 min a 72°C; etapa final: 7 min a 72°C. O produto PCR de 2449 bpfoi purificado em um gel agarose, tratado com Xbal e Sall, e clonado no vetorpMIV5JS que tinha sido tratado com as mesmas restrictases. A cepaB7AilvBNAilvGMAilvIH foi usada como o recipiente para clonagem.

Construção da cepa B7AilvBNAilvGMAilvIH é descrita abaixo no exemplode referência 2. O plasmídeo resultante pMIV- PivbL-ilvBN (Fig. 1)complementou o fenótipo AHAS" da cepa B7AilvBNAilvGMAilvIH.

Exemplo 2. Criação de mutantes resistentes a valina de acetolactatosintase isoforma I de E. coli (IlvBNVa,R)

A cepa B7AilvBNAilvGMAilvIH/pMIV-PivbL-ilvBN descritano Exemplo 1 contém somente um operon codificando AHAS (ilvBN operon).Mutantes espontâneos resistentes a valina foram selecionados em placas commeio mínimo e suplementados com 1 g/l de valina. A atividade deacetolactato sintase e resistência de enzimas a inibição de L-valina foramdeterminadas em extratos brutos pelo método de F.C. Stomer e H.E.

Umbarger (Biochem. Biophys. Res. Commun., 17, 5, 587-592 (1964)). Paraos extratos brutos, as células foram cultivadas em meio mínimo M9 até o finalda fase logarítmica, lavadas com tampão 100 mM KH2PO4ZK2HPO4suplementado com 100 mM KCl, pH 7.0. Os extratos celulares brutos forampreparados por sonicação das células no mesmo tampão. Os plasmídeosisolados dos mutantes resistentes a valina selecionados foram usados para re-transformação da cepa deficiente em AHAS B7AilvBNAilvGMAilvIH. Comoum resultado, o plasmídeo pMIV- PivbL-ilvBNValR33 foi obtido, que forneceu ocrescimento resistente a valina da cepa recipiente deficiente em AHAS. Esteplasmídeo contém um operon codificando AHAS I resistente a inibição devalina. A atividade residual de AHAS na presença de L-valina IOmM foimedida. A atividade de AHAS residual é igual à atividade na presença de L-valina (nmol/minmg) * 100% / a atividade na ausência de L-valina(nmol/minmg). Atividade de AHAS foi medida pelo método de F.C. Stormere H.E. Umbarger (Biochem. Biophys. Res. Commun., 17, 5, 587-592 (1964)).Resultados da medida de atividade de AHAS para esta cepa são apresentadosna tabela 1.

Exemplo 3. Seqüência de nucleotídeos do gene codificando AHAS Iresistente a valina

Cinco oligonucleotídeos foram usados para sequenciar ofragmento de DNA UvBN clonado em pMIV-PivbL-ilvBN33: ML74 (SEQ IDNO: 5), LattRSl (SEQ ID NO: 6), ilvbS31 (SEQ ID NO: 7), ilvbS32 (SEQ IDNO: 8), e ilvbS33 (SEQ ID NO: 9). A estratégia de seqüenciamento éapresentada na Fig.2.

A seqüência resultante é mostrada como ilvBN33 (SEQ IDNO: 10) na Listagem de Seqüências. Comparação desta seqüência comprogramas de cálculo revelaram uma repetição direta de 34 nucleotídeos naregião de codificação para a subunidade pequena. O gene mutante foichamado z7vN33 (Fig. 3). Este rearranjo de DNA levou a uma terminação datradução prematura, resultando na substituição da porção de N-término ajusante da isoleucina na posição 44 com arginina e fenilalanina, que forma aproteína truncada de 45 aminoácidos IlvN33 (SEQ ID NO: 11).

Exemplo 4. Integração do operon PivbL-ilvBNValR33 no cromossomos decepa deficiente em AHAS, seguido por eliminação do marcador cat

1. Integração dos genes cat-PivbL-üvBNValR33 no cromossomo

Para integrar mini-Mu::cat-PivbL-ilvBNValR33 no cromossomobacteriano, procedimentos padrões foram usados. pMIV- PivbL-ilvBNValR33 foiintroduzido nas células B7AilvBNAilvGMAilvIH/pMH10. Mu transposasecodificado por derivado de pMHIO (pACYC177 abrigando gene KmR, genesde fagos Mu- AeB codificando Mu transposase, gene cts62 codificandorepressor Mu, e o gene repressor de fago-lambda cI857) (patente européiaEPl 149911) foram induzidos por incubação durante 20 min a 44°Cimediatamente após a transformação.

Clones resistentes a cloranfenicol (CmR) foram selecionados a30°C em placas de agar LB contendo 20 mg/l cloranfenicol. Após eliminarambos os plasmídeos por cultivo destes clones em LB, clones Cm^ Km^ Ap^foram obtidos que eram capazes de crescer em meio mínimo sem adições.

Como um resultado, a cepa B7AilvBNAilvGMAilvIH mini-Mu::cat-PiVbL-ilvBNValR33 contendo o cassete integrado mini-Mu::cat-PiVbL-ilvBNValR33 em um locus cromossômico não identificado foi obtida.

2. Eliminação do marcador de resistência a cloranfenicol dacepa B7AilvBNAilvGMAilvIH mini-Mu::cat-PivbL-ilvBNValR33

Para eliminar o marcador de resistência a cloranfenicol deB 7ΔΪ1 vBNAilvGMAil vIH, células mini-Mu::cat-PivbL-ilvBNValR33 foramtransformadas com o plasmídeo pMW118-int-xis (ApR) (W02005/010175).

Os clones ApR foram cultivados em placas de agar LB contendo 150 mg/lampicilina a 30°C. Várias dezenas de clones de ApR foram tomadas e testadaspara sensibilidade a cloranfenicol. O plasmídeo pMW118-int-xis foieliminado de células Cms por incubação em placas de agar LB a 42°C. Comoum resultado, a cepa B7AilvBNAilvGMAilvIH mini-Mu::PivbL-ilvBNValR33contendo o cassete integrado mini-Mu::PiVbL-ilvBNValR33 em um locuscromossômico não identificado foi obtida. Atividade residual de AHAS napresença de IOmM L-valina foi medida. Resultados das medidas de atividadede AHAS para esta são apresentados na tabela 1.

Exemplo 5. Substituição do promotor nativo de operon ílvBN comuma região de regulador artificial

1. Modificação da região de regulador do operon ilvBNValR33

Modificação da região de regulador do operon ilvBNValR33, ouseja a substituído da região de promotor nativa do operon ilvBN com opromotor PL, foi obtida pelo método primeiro desenvolvido por Datsenko eWanner (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2000, 97(12), 6640-6645) chamado"Red-driven integration". De acordo com este procedimento, os iniciadores dePCR ilvB-attRl (SEQ ID NO: 12) e ilvB-PLSD (SEQ ID NO: 13) foramconstruídos. Oligonucleotídeo ilvB-attRl (SEQ ID NO: 12) é homólogo àregião a montante do gene ilvB e a região adjacente ao gene conferindoresistência a antibiótico presente no DNA cromossômico de BW25113 cat-PL-yddG. Oligonucleotídeos ilvB-PLSD (SEQ ID NO: 13) é homólogo a tanto aregião ilvB como a região a jusante do promotor Pl presente no cromossomode BW25113 cat-PL-yddG. A obtenção de BW25113 cat-PL-yddG foi descritaem detalhes (EP1449918A1, patente russa RU2222596). O DNAcromossômico de cepa BW25113 cat-PL-yddG foi usado como um gabaritopara PCR. Condições para PCR foram as seguintes: desnaturação durante 3min a 95 °C; perfil para os dois primeiros ciclos: 1 min a 95°C, 30 segundos a34°C, 40 segundos a 72°C; perfil para os últimos 30 ciclos: 30 segundos a95°C, 30 segundos a 50°C, 40 segundos a 72°C; etapa final: 5 min a 12°C.Como um resultado, o produto PCR foi obtido (SEQ ID NO: 14), purificadoem gel agarose, e usado para eletroporação da cepa de E. coliB7AilvBNAilvGMAilvIH mini-Mu: :PivbL-ilvBNValR33, que contém o plasmídeopKD46 com uma origem de replicação sensível a temperatura. O plasmídeopKD46 (Datsenko e Wanner, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2000, 97:12:6640-45) inclui o fragmento de DNA 2,154 nt (31088-33241) de fago λ (número deacesso GenBank J02459), contendo os genes do sistema de recombinaçãohomólogo λ Red (genes γ, β, exo) sob o controle do promotor de ParaBindutível por arabinose. O plasmídeo pKD46 é necessário para integração doproduto PCR no cromossomo da cepa B7AilvBNAilvGMAilvIH mini-

Mu: :PivbL-ilvBNValR33.

As células eletrocompetentes foram preparadas como a seguir:E. coli cepa B7AilvBNAilvGMAilvIH mini-Mu: :PivbL-ilvBNValR33 foi cultivadadurante a noite a 3 0°C em meio LB contendo ampicilina (100 mg/l), e acultura foi diluída em 100 vezes com 5 ml de meio SOB (Sambrook et al,"Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a. ed.", Cold Spring HarborLaboratory Press (1989)) com ampicilina e L-arabinose (1 mM). As célulasforam cultivadas com aeração a 30°C a um OD600 de «0.6 e então tornadaseletrocompetentes por concentração de 100 vezes e lavagem três vezes comH2O deionizado resfriado em gelo. Eletroporação foi realizada usando 70 μΐde células e «100 ng de produto PCR. Após a eletroporação, as células foramincubadas com 1 ml de meio SOC (Sambrook et al, "Molecular Cloning ALaboratory Manual, 2a. ed.", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) a37°C durante 2.5 h, colocadas em placas de L-agar, e cultivadas a 37 0C paraselecionar recombinantes de CmR. Então, para eliminar o plasmídeo pKD46,2 passagens em L-agar com Cm a 42 0C foram realizadas e as resultantescolônias foram testadas para sensibilidade a ampicilina.2. Verificação da modificação da região de regulador ilvBN

O clone B7AilvBNAilvGMAilvIH mini-Mu::cat-PL-ilvBNValR33foi obtido, que contém o cassete mini-Mu ::cat-PL-ilvBNValR33 com o operonilvBNValR33 mutante codificando o AHAS I resistente a realimentação sob ocontrole do promotor do fago lambda PL, marcado com o gene de resistência aCm. A substituição da região ilvBN nativa de regulador com o promotor PL,marcado com o gene de resistência a Cm, foi verificada por PCR. O iniciadorespecífico da fixação à direta do fago Mu MR74 (SEQ ID NO: 15) e oiniciador especifico para o gene cloranfenicol acetiltransferase Cm-test2 (SEQID NO: 16) foram usados em PCR para a verificação. Condições paraverificação de PCR foram as seguintes: desnaturação durante 3 min a 94°C;perfil para os 30 ciclos: 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 55°C, 1 min a12°c·, etapa final: 7 min a 72°C. O produto PCR obtido usando as células deB7AilvBNAilvGMAilvIH mini-Mu::cat-PivbL-ilvBNValR33 como um gabaritofoi 586 nt em comprimento (SEQ ID NO: 17). O produto PCR obtido usandoas células de B7AilvBNAilvGMAilvIH mini-Mu::cat-PL-ilvBNValR33 como umgabarito tinha 879 nt em comprimento (SEQ ID NO: 18). A atividade deAHAS residual na cepa B7AilvBNAilvGMAilvIH mini-Mu: :cat-PL-ilvBNValR33 cepa na presença de IOmM L-valina foi medida. Resultados dasmedidas de atividade de AHAS para esta cepa são apresentados na tabela 1.

Tabela 1.

<table>table see original document page 25</column></row><table>

Exemplo 6. Produção de L-valina pelas cepas de E. coli com AHAS Iresistente a valina

Ambas as cepas de E. coli B7AilvBNAilvGMAilvIH mini-Mu::PivbL-ilvBNValR33 e B7AilvBNAilvGMAilvIH mini-Mu::cat-PL-ilvBNValR33foram cultivadas durante 18 horas a 37 0C em placas de L-agar. Então, ascélulas de cerca de 0.5 cm2 da superfície da placa foram introduzidas nomeio de fermentação (2ml) e cultivadas em tubos com aeração durante 72horas a 32 0C. Para a cepa deficiente em AHAS auxotróficaB7AilvBNAilvGMAilvEH, o meio de fermentação foi adicionalmentesuplementado com 100 μg/ml de cada dentre isoleucina e valina. A L-valinaacumulada foi medida por TLC. Os resultados são apresentados na tabela 2.

A composição do meio de fermentação (g/l) Glicose 60,0(NH4)2SO4 18,0KH2PO4 3 H2O 2,0MgSO4 7H20 1,0CaCO3 25,0Tiamina 0,02Mameno 4,0

Tabela 2.

<table>table see original document page 26</column></row><table>

Como mostrado em Tabela 2, expressão de AHAS I resistentea valina resultou na produção de valina. Operon PivbL-ilvBNValR33 é controladopor atenuação de transcrição e AMP cíclico. Substituição da região nativa deregulador do operon ilvBNValR33 (incluindo eliminação do gene (ivbL)codificando o peptídeo líder ) em cepa de E. coli B7AilvBNAilvGMAilvIHmini-Mu: :PivbL-ilvBNValR33 com o promotor Pl de fago lambda aumentou aprodução de L-valina em 1,5 vezes.

Exemplo 7. Novos mutantes resistentes a valina de E. coli AHAS I comexpressão de ilvBN modificadaA região de regulador nativo do operon ilvBN foi substituídacom o promotor de fago lambda Pl pelo mesmo método como descrito noExemplo 5 em cepa B7 AilvIH AilvGM (ver Exemplo de referência 2, seção5). Esta cepa tinha somente AHAS I. A cepa resultante B7 AilvIH AilvGMcat-PL-ilvBN foi sensível a valina. Novos mutantes espontâneos resistentes avalina de AHAS I foram obtidos a partir desta cepa. Cepas que crescemmelhor em 1 g/l def valina foram caracterizadas (Tabela 3).

Tabela 3.

As mutações resistentes a valina que eram resistentes aisoleucina foram obtidas também. Variantes com uma atividade específicamaior do que a de tipo selvagem foram obtidas. Como visto na Tabela 4,expressão de AHAS I resistente a valina resultou na produção de valina. Omeio de fermentação continha 6 % glicose. As seqüências de nucleotídeos dosoperons mutantes para os dois melhores mutantes, ilvBN ValRl e ilvBNValR4, foram determinadas. Foi revelado que IlvBN ValRl continha umamutação de um ponto em IlvN: A30P Ala-Pro (Ala na posição 30 ésubstituída com Pro; codon gcc correspondente foi substituído com ccc), eIlvBN ValR4 também continha uma mutação de um ponto em IlvN: N17KAsn-Lys (Asn na posição 17 é substituído com Lys; codon aac correspondentefoi substituído com aag). Em ambos os casos, estas substituições foram raras.

Tabela 4.

<table>table see original document page 27</column></row><table><table>table see original document page 28</column></row><table>

Exemplo 8. Produção de L-Ieucina pelas cepas de E. coli com AHAS Iresistente a valina

O cassete cat-PL-ilvBN ValR4 foi introduzido em cepa 57 deE. coli produzindo L-Ieucina (patente russa RU 2140450, VKPM B-7386).

Para este fim, a cepa E. coli 57 foi infectada com fago Plvir cultivado na cepadoadora B7 AilvIH AilvGM cat-PL-ilvBNValR4. Os transdutores foramselecionados em placas de L-agar suplementadas com cloranfenicol (20μg/ml). A cepa 57 foi depositada no Russian National Collection of IndustrialMicroorganisms (VKPM) (Rússia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd, 1)em 29 de maio de 1997 sob o número de acesso VKPM B-7386.

Ambas as cepas de E. coli 57 e 57 cat-PL-ilvBNValR4 foramcultivadas como mostrado em Exemplo 6. A L-Ieucina acumulada foi medidapor TLC. Resultados são apresentados na tabela 5.

Tabela 5

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Como mostrado na Tabela 5, cepa 57 cat-PL-ilvBNValR4produziu uma maior quantidade de L-leucina.

Exemplo de referência 1. Construção do plasmídeo pMIV5JS

PMIV-5JS foi construído de acordo com o seguinte esquema.Primeiro, plasmídeo pM12 foi construído por integração in vivo de um acassete de integração derivado de Mu no plasmídeo pMWl, que é umderivado de pMW119 (Fig. 4). Duas seqüências de oligonucleotídeosterminadores complementares um a cada outro foram sintetizadas (SEQ IDNO: 19 e SEQ ID NO: 20). Terminador thrL foi obtido por anelamento destesoligonucleotídeos sintéticos nas direções dianteira (SEQ ID NO: 19) e reversa(SEQ ID NO: 20). Terminador thrL foi flanqueado com os sítios Hindlll ePstl. Então, plasmídeo pM12-ter(thr) foi construído por inserção da seqüênciade terminador sintético Ter(í/zr} em pM12 que tinha sido digerido com HindIIIe Mphl 1031 (Fig. 5).

O cassete integrativo intJS foi construído como a seguir (Fig. 6):

a) um fragmento LattL 0,12 kbp foi obtido por amplificaçãoPCR usando um iniciador a montante (SEQ ID NO: 21) (o sítio para BglII ésublinhado), e um iniciador a jusante fosforilado (SEQ ID NO: 22).Plasmídeo pMWl 18-attL-tet-attR-ter_rrnB foi usado como um gabarito(W02005/010175);

b) um fragmento CmR 1,03 kbp foi obtido por amplificaçãoPCR usando um iniciador a montante fosforilado (SEQ ID NO: 23), e uminiciador a jusante (SEQ ID NO: 24) (o sítio para Pstl é sublinhado).Plasmídeo pACYC184 foi usado como um gabarito;

c) um fragmento LattR 0,16 kbp foi obtido por amplificaçãoPCR usando um iniciador a montante (SEQ ID NO: 25) (o sítio para Pstl ésublinhado), e um iniciador a jusante (SEQ ID NO: 26) (o sítio para SacI ésublinhado). Plasmídeo pMW118-attL-tet-attR-ter_rrnB foi usado como umgabarito;

d) fragmentos LattL e CmR foram ligados e o fragmento LattL-CmR 1.15 kbp resultante foi purificado;

e) fragmentos LattL-CmR e LattR foram digeridos por PstI,ligados, e o fragmento LattL-CmR-LattR 1,31 kbp resultante foi purificado;

f) um fragmento DNA 70 bp duplo filamento contendo sítiosde clonagem múltiplos (MCS) foi obtido por anelamento de doisoligonucleotídeos sintetizados: oligonucleotídeos tendo a seqüência mostradaem SEQ ED NO: 27 e outros oligonucleotídeos tendo uma seqüênciacomplementar a SEQ ID NO: 27;

g) fragmentos LattL-CmR-LattR e MCS foram digeridos porSaci, ligados, e o cassete LattL-CmR-LattR-MCS 1,38 kbp resultante foipurificado;

Para a última etapa, o fragmento LattL-CmR-LattR-MCS foidigerido por BglII e HindIII e clonado em pM12-ter(thr) que tinha sidodigerido com BamHI e HindIII para dar o plasmídeo pMTV-5JS (Fig. 7).

Exemplo de referência 2. Construção de uma cepa com genes acetolactatosintases inativados

1. Deleção de operon UvBN

O operon ilvBN foi deletado pelo método primeirodesenvolvido por Datsenko e Wanner (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2000,97(12), 6640-6645) chamado como "Red-driven integration". De acordo comeste procedimento, os iniciadores de PCR ilvBNl (SEQ ED NO: 28) e ilvBN2(SEQ ID NO: 29) homólogos tanto à região adjacente ao operon ilvBN comoao gene conferindo resistência a cloranfenicol no plasmídeo de gabarito foramconstruídos. O plasmídeo pMW-attL-Cm-attR (Pedido PCT WO 05/010175)foi usado como um gabarito na reação PCR. Condições para PCR foram asseguintes: etapa de desnaturação durante 3 min a 95°C; perfil para os doisprimeiros ciclos: 1 min a 95°C, 30 segundos a 34°C, 40 segundos a 72°C;perfil para os últimos 30 ciclos: 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 50°C, 40segundos a 72°C; etapa final: 5 min a 72°C.

O produto PCR 1713 bp resultante foi purificado em gelagarose e usado para eletroporação da cepa de E. coli MG1655, que contém oplasmídeo pKD46 com uma origem de replicação sensível a temperatura. Oplasmídeo pKD46 (Datsenko e Wanner, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2000,97:12:6640-45) inclui um fragmento de DNA 2,154 nt (31088-33241) de fagoλ (número de acesso GenBank J02459), que contém genes do sistema derecombinação homólogo λ Red (genes γ, β, exo) sob o controle do promotorParaB indutível a arabinose. O plasmídeo pKD46 é necessário para integraçãodo produto PCR no cromossomo da cepa de E. coli MG1655.

Células eletrocompetentes foram preparadas como a seguir:cultura noturna de E. coli MG1655/pKD46 cultivada a 30 0C em meio LB5suplementado com ampicilina (100 mg/l), foi diluída em 100 vezes com 5 mlde meio SOB (Sambrook et al, "Molecular Cloning A Laboratory Manual,2a.ed.", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) com ampicilina e L-arabinose (1 mM). A cultura foi cultivada com aeração a 3 O0C a um ODóoo de«0.6 e então tornada eletrocompetentes por concentração de 100 vezes elavagem três vezes com H2O deionizado resfriado em gelo. A eletroporaçãofoi realizada usando 70 μΐ de células e «100 ng de produto PCR. As célulasapós eletroporação foram incubadas comi ml de meio SOC (Sambrook et al,"Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a. ed. ", Cold Spring HarborLaboratory Press (1989)) a 37 0C durante 2.5 h, colocadas em L-agar, ecultivadas a 37 0C para selecionar recombinantes CmR. Então, para eliminar oplasmídeo pKD46, 2 passagens em L-agar com Cm a 42°C foram realizadas eas colônias resultantes foram testadas para sensibilidade a ampicilina. Assim,a cepa mutante MGl 655 AilvBN::cat com um operon ilvBN inativado foiconstruída.

2. Verificação de deleção de operon ilvBN por PCR.

Mutantes com o operon ilvBN deletado e marcado com o genede resistência a CM foram verificados por PCR. Iniciadores específicos delocus ilvBNC5 (SEQ ID NO: 30) e ilvBNCó (SEQ ID NO: 31) foram usadoem PCR para a verificação. Condições para verificação PCR foram asseguintes: etapa de desnaturação durante 3 min a 94°C; perfil para os 30ciclos: 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 53°C, 1 min a 72 °C; etapa final: 7min a 72 °C. O produto PCR obtido na reação usando o DNA cromossômico de cepa ilvBN^parental MGl655 como um gabarito tinha 2275 nt decomprimento. O produto PCR obtido na reação usando o DNA cromossômicode cepa mutante MG1655 AilvBN::cat como um gabarito tinha 1995 nt decomprimento (Figure 8).

3. Deleção de operon ilvIHO operon ilvIH foi deletado pelos mesmos métodos como adeleção do operon ilvBN descrita em Seção 1. De acordo com esteprocedimento, os iniciadores PCR ilvIHl (SEQ ID NO: 32) e ilvlffi (SEQ IDNO: 33) homólogos a tanto a região adjacente ao operon ilvIH como o geneconferindo resistência a cloranfenicol no plasmídeo de gabarito foramconstruídos. O plasmídeo pMW-attL-Cm-attR (pedido PCT WO 05/010175)foi usado como um gabarito na reação PCR. Condições para PCR foram asseguintes: etapa de desnaturação durante 3 min a 95°C; perfil para os doisprimeiros ciclos: 1 min a 95°C, 30 segundos a 34°C, 40 segundos a 72°C;perfil para os últimos 30 ciclos: 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 50°C, 40segundos a 72°C; etapa final: 5 min a 72°C.

O produto PCR de 1713 bp foi purificado em um gel agarose eusado para eletroporação da cepa de E. coli MG1655/pKD46.

Recombinantes resistentes a cloranfenicol foram selecionadosapós eletroporação e verificados por meio de PCR com os iniciadoresespecíficos de locus ilvIHC3 (SEQ ID NO: 34) e ilvIHC4 (SEQ ID NO: 35).

Condições para verificação de PCR foram as seguintes: etapa de desnaturaçãodurante 3 min a 94°C; perfil para os 30 ciclos: 30 segundos a 94°C, 30segundos a 53°C, 1 min 20 segundos a 72°C; etapa final: 7 min a 12°C. Oproduto PCR obtido na reação usando o DNA cromossômico de cepa IlvIH+parental MG1655B7 AilvBN::cat como um gabarito tinha 2491 nt decomprimento. O produto PCR obtido na reação usando o DNA cromossômicode cepa mutante MG1655B7 AilvBN::cat AilvIH::cat como um gabarito tinha1823 nt de comprimento. Como um resultado, a cepa MGl655 AilvIH::cat foiobtida.

4. Deleção de operon ilvGM

O operon ilvGM foi deletado pelos mesmos métodos que adeleção de operon ilvBN descrita em Seção 1. De acordo com esteprocedimento, os iniciadores de PCR, ilvGMl (SEQ ID NO: 36) e ilvGM2(SEQ ID NO: 37), homólogos tanto à região adjacente ao operon ilvGM comoo gene conferindo resistência a cloranfenicol no plasmídeo gabarito foramconstruídos. O plasmídeo pMW-attL-Cm-attR (pedido PCT WO 05/010175)foi usado como um gabarito na reação PCR. Condições para PCR foram as seguintes: etapa de desnaturação durante 3 min a 95°C; perfil para os doisprimeiros ciclos: 1 min a 95°C, 30 segundos a 34°C, 40 segundos a 72°C;perfil para os últimos 30 ciclos: 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 50°C, 40segundos a 72°C; etapa final: 5 min a 72°C.

O produto PCR de 1713 bp foi purificado em um gel agarose eusado para eletroporação da cepa de E. coli MG1655/pKD46. Recombinantesresistentes a cloranfenicol foram selecionados após eletroporação everificados por PCR com os iniciadores específicos de locus ilvGMC3 (SEQID NO: 38) e ilvGMC4 (SEQ ID NO: 39). Condições para verificação PCRforam as seguintes: etapa de desnaturação durante 3 min a 94°C; perfil para os30 ciclos: 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 54°C, 1 min 30 segundos a72°C; etapa final: 7 min a 72°C. O produto PCR obtido na reação usando oDNA cromossômico de cepa MGl655 parental como um gabarito tinha 2209nt de comprimento. O produto PCR obtido na reação usando o DNAcromossômico de cepa MG1655 AilvGM::cat mutante como um gabaritotinha 1941 nt de comprimento. Como um resultado, a cepa MGl655AilvGM::cat foi obtida.

5. Construção de cepas com os genes de acetolactato sintaseinativados (Combinação de deleções de AilvBN, AilvIH e AilvGM).

Os genes ilvIH (AilvIH::cat) foram deletados em cepa de tiposelvagem E. coli Kl2 (VKPM B-7) por transdução de Pl (Sambrook et al,"Molecular Cloning A Laboratory Manual,2a. edCold Spring HarborLaboratory Press (1989). A cepa de E. coli MG1655 AilvIH::cat descrita emSeção 3 foi usada como uma cepa doadora, e transdutores CmR foramselecionados. Como um resultado, a cepa B7 AilvIH::cat foi obtida. Paraeliminar o marcador de resistência a cloranfenicol de B7 AilvIH::cat, célulasforam transformadas com o plasmídeo pMW118-int-xis (ApR)(W02005/010175). Clones ApR foram cultivados em placas de agar LBcontendo 150 mg/l ampicilina a 30°C. Várias dezenas de clones ApR foramtomadas e testadas para sensibilidade a cloranfenicol. O plasmídeo pMWl 18-int-xis foi eliminado das células Cms por incubação em placas de agar LB a42°C. Como um resultado, a cepa B7 AilvIH foi obtida.

Os genes ilvBN (AilvBN::cat) foram deletados na cepa de E.coli B7 AilvIH por transdução de PL A cepa de E. coli MG1655 AilvBN::catdescrita em Seção 1 foi usada como uma cepa doadora, e transdutores CmRforam selecionados. Como um resultado, a cepa B7 AilvIH AilvBN::cat foiobtida. O marcador de resistência a cloranfenicol foi eliminado de B7 AilvIHAilvBN::cat como descrito acima. Como um resultado, a cepa B7 AilvIHAilvBN foi obtida.

Os genes ilvGM genes (AilvGM::cat) foram deletados nascepas de E. coli B7 AilvIH por transdução de PL A cepa de E. coli MGl 655AilvGM::cat descrita em Seção 4 foi usada como uma cepa doadora, etransdutores de CmR foram selecionados. Como um resultado, a cepa B7AilvIH AilvGM::cat foi obtida. O marcador de resistência a cloranfenicol foieliminado de B7 AilvIH AilvGM::cat como descrito acima. Como umresultado, a cepa B7 AilvIH AilvGM foi obtida. A cepa B7 AilvIH AilvGMera prototrófica, assim a deleção de genes ilvGM genes não evitou a expressãodos genes distais do operon isoleucina-valina.

Os genes ilvGM (AilvGM::cat) foram deletados nas cepas deE.coli Bl AilvIH AilvBN por transdução de PL A cepa de E. coli MGl655AilvGM::cat descrita em Seção 4 foi usada como uma cepa doadora; ostransdutores de CmR foram selecionados. Como um resultado, a cepa B7AilvIH AilvBN AilvGM: :cat foi obtida. O marcador de resistência acloranfenicol foi eliminado de B7 AilvIH AilvBN AilvGM::cat como descritoacima. Como um resultado, a cepa B7 AilvIH AilvBN AilvGM foi obtida.

Apesar da invenção ter sido descrita em detalhes comreferência a formas de realização preferidas da mesma, será evidente para osversados na arte que várias mudanças podem ser feitas, e equivalentesempregados, sem sair do escopo da invenção. Todas as referências aquicitadas são incorporadas como parte deste pedido por referência.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Ajinomoto Co., Inc.

<120> UMA ACETOLACTATO SINTASE MUTANTE E UM MÉTODO PARA APRODUZIR L-AMINOÁCIDOS DE CADEIA RAMIFICADA

<130> OP-C7212

<150> RU2006132818<151> 2006-09-13

<160> 39

<170> PatentIn versão 3.1

<210> 1

<211> 291

<212> DNA

<213> Escherichia coli K12<220>

<221> CDS

<222> (1) . . (29:

<400> 1atg caa aac acaMet Gln Asn Thr1

aac cat ccg ggcAsn His Pro Gly20

gct ttt aac gttAla Phe Asn Val35

aaa age cat ateLys Ser His Ile50

atg ata age caaMet Ile Ser Gln65

aat cag tcc gatAsn Gln Ser Asp

taa

)

act cat gac aac gta att ctgThr His Asp Asn Val Ile Leu5 10

gta atg acc cac gtt tgt ggcVal Met Thr His Val Cys Gly25

gaa ggc att ctt tgt ctg ccgGlu Gly Ile Leu Cys Leu Pro40

tgg cta ctg gtc aat gac gacTrp Leu Leu Val Asn Asp Asp55

ate gat aag ctg gaa gat gtcIle Asp Lys Leu Glu Asp Val

70 75

ccg acg atg ttt aac aag atePro Thr Met Phe Asn Lys Ile85 90

gag etc acc gtt cgc 48

Glu Leu Thr Val Arg15

ctt ttt gcc cgc cgc 96

Leu Phe Ala Arg Arg30

att cag gac age gac 144

Ile Gln Asp Ser Asp45

cag cgt ctg gag cag 192

Gln Arg Leu Glu Gln60

gtg aaa gtg cag cgt 240

Val Lys Val Gln Arg80

gcg gtg ttt ttt cag 288

Ala Val Phe Phe Gln95

291

<210> 2<211> 96<212> PRT

<213> Escherichia coli K12<400> 2

Met Gln Asn Thr Thr His Asp Asn Val Ile Leu Glu Leu Thr Val Arg15 10 15

Asn His Pro Gly Val Met Thr His Val Cys Gly Leu Phe Ala Arg Arg

20 25 30

Ala Phe Asn Val Glu Gly Ile Leu Cys Leu Pro Ile Gln Asp Ser Asp

35 40 45

Lys Ser His Ile Trp Leu Leu Val Asn Asp Asp Gln Arg Leu Glu Gln50 55 60Met Ile Ser Gln Ile Asp Lys Leu Glu Asp Val Val Lys Val Gln Arg

65 70 75 80

Asn Gln Ser Asp Pro Thr Met Phe Asn Lys Ile Ala Val Phe Phe Gln85 90 95

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> seqüência:iniciador ilvBX60

<400> 3

actctagacg actgacgaaa cctcgct

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> seqüência:iniciador ilvBR64

<400> 4

aggtcgacgt gatcatggtc ttgtcctgg

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> seqüência:iniciador ML74

<400> 5

cctgttcatg aatcccatac tttgac

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> seqüência:iniciador LattRSl

<400> 6

ccatctaagt agttgattca tagtga

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> seqüência:iniciador ilvbS31

<400> 7caacatcgac gcgtaagcgc t

21

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> seqüência:iniciador ilvbS32<400> 8

gcgaagaaag cattcgtgac gca

23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> seqüência:iniciador ilvbS33<400> 9

cgcctgtgtc gatgacaatg caa

23

<210><211><212><213>

10

1830DNA

artificial

<220><223>

seqüência:gene mutante ilvBN

<400> 10

atggcaagtt

catttcctgg

cctgtttacg

cagggcgcgg

atggcctgta

gactccatcc

gccttccagg

gtcagacata

ggccgcccag

attgaaacac

attcgtgacg

ggtgtgatca

accatgactt

ctggggatgc

gtgctcggtg

gccaaaatca

gtggcgattc

caaccgcgtg

atcccgaaag

gtcgatgaca

gcttatccgc

tttggcctgc

ttctccggcg

cagctggatg

cagagtctgt

atgcagattg

caggcttcat

cgggcacaacaacagcagggatgccttaaggctttatcgcgcggaccgggcgctgatttgaagtggacactcgaagaactgcccggtgtgagcccgctatcagcggcgatatgcgcccgctaatggcgctacggcgtgcgcgcgttttgattcatgtcgaaggcggatgtcagagtggcacgtgcgatccatgcaattattcaatcgcccctgcggcgatacggcagccttcaaaatcattctacgagcaccgccggatttgcaggaaat

atcgacgcgtcattaagattccaaagcacgtcagggaatgtgcgactaaccatcactggtctacggcatccccgcaggtcgatagacattggcagaaaaagattaacgctacgggtgcgtgggcatgttgcagcaccaactgaccgggcgtatcgaccgttgatgacgtgccagttggtagttaagccatcaccaccgacacgccagtggtggcgctgcggatgatgaattctgatgaacaggcgtttttcggcctcgaacatcaatcgc

aagcgctttagtgacaggcacaaatccgccgcgcgcaccgctggtgaccgcaggttcccgtctatccccaatgagcgatgcctaaggatggccgccgcccgccaaacgccgaactggcggccaaaagcgctatattttgcattggcaaaagcagagctggctggcgcagtgcggatttgctacggcctgagttggtcagcctgacctccgctggcgaaccattcaggagaaacgaagcgcgccgccacctacctgtgattcctggcccgg

ccggcgcagattccgggcggatattctggcacggtaaaccccattgccgacctcgatgattcaccaaacaccttccgcattgcaaacggcccgcctttagcggtgctttaagaaagcgcaatccgttgtcaggaggcggaccgagcagttgtaaaatcaatgatcccgctagcgtgagtttcaacgccgtatcagatgtggtgggctgggcggatcgcaatggcgaccgctggggctggtatccgggcaatgaataacgacgctgatcca

atttatcgttttctatcctgccgtcatgaaggcggtctgttgcgcggctgcggcaccgaccaactatctgtgcgcaatcaagtttttgagcgaagaaagctctgggcggcactgcctaccgctgggtatgtttgttgatactgtccgaatgcagccgcacggtggaagcgtccgtgtccatgccgcctgtgaccgcgcaacacgatgggtagtgttgtgtcagtgaaaatgcatcagcaaaatcaactttagccgatccgtgtgcgcatt

6012018024030036042048054060066072078084090096010201080114012001260132013801440150015601620gatgccgaag aaaaagttta cccgatggtg ccgccaggtg cggcgaatac tgaaatggtg 1680

ggggaataag ccatgcaaaa cacaactcat gacaacgtaa ttctggagct caccgttcgc 1740

aaccatccgg gcgtaatgac ccacgtttgt ggcctttttg cccgccgcgc ttttaacgtt 1800

gaaggcattc tttgtctgcc gcgcttttaa 1830

<210> 11

<211> 45

<212> PRT

<213> Proteína truncada Ι1νΝ33

<4 00> 11

Met Gln Asn Thr Thr His Asp Asn1 5

Asn His Pro Gly Val Met Thr His20

Ala Phe Asn Val Glu Gly Ile Leu35 40

Val Ile Leu Glu Leu Thr Val Arg

10 15

Val Cys Gly Leu Phe Ala Arg Arg25 30

Cys Leu Pro Arg Phe45

<210> 12

<211> 64

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> seqüência:iniciador ilvB-attRl<4 00> 12

ccgcaggcga ctgacgaaac ctcgctccgg cggggtcgct caagttagta taaaaaagct

<210> 13

<211> 64

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> seqüência:iniciador ilvB-PLSD<4 00> 13

tgcccgaact tgccatgctc cagtctcctt cttctgagct gtttccttct agacggccaa

<210> 14

<211> 1968

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> seqüência:DNA fragment containing cat gene and PL prometer

<4 00> 14

ccgcaggcga ctgacgaaac ctcgctccgg cggggtcgct caagttagta taaaaaagct

gaacgagaaa cgtaaaatga tataaatatc aatatattaa attagatttt gcataaaaaa

cagactacat aatactgtaa aacacaacat atgcagtcac tatgaatcaa ctacttagat

ggtattagtg acctgtaaca gactgcagtg gtcgaaaaaa aaagcccgca ctgtcaggtg

cgggcttttt tctgtgttaa gcttcgacga atttctgcca ttcatccgct tattatcact

tattcaggcg tagcaccagg cgtttaaggg caccaataac tgccttaaaa aaattacgcc

ccgccctgcc actcatcgca gtactgttgt aattcattaa gcattctgcc gacatggaag

ccatcacaga cggcatgatg aacctgaatc gccagcggca tcagcacctt gtcgccttgc

60120180240300360420480gtataatattaaatcaaaacaaccctttagtgtagaaacttgctcatggattcattgccagccggataaatgaacggtctcgatgccatttccttagctcagtgttaccttcgtgcgacttgatcgcgtaagcggtcggactagcagcacccggcagtactgacgatgaggtgataaacttcaaataatgatgcttttttaacaatgccctgataaattaagcaggacgccagcattcaaaaggaaacag

tgcccatggttggtgaaactggaaataggcgccggaaatcaaacggtgtatacggaattcacttgtgcttggttataggtgggatatatcctgaaaatctagcgatttgttatcaggctggtcgatagtgcagtgctccggccatagtgacggcataacccgcattgttaaccgcattaaattttattttataatgccaaccctgcaaaatctctggcggactgaccaccagcagaaggcctcagaagaa

gaaaacggggcacccagggacaggttttcagtcgtggtatacaagggtgacggatgagcaatttttctttacattgagcaaacggtggtacggatccgatatcttactgctctacttatcgctccaagtaagaacgggtgctggcgatgcaagcctatgcgatttcatacagcttatcgagactgatagtcttagtataaaataaattcatgttgacataatgaaggtgatttggggtgtggagactgga

gcgaagaagtttggctgagaccgtaacacgtcactccagaacactatcccttcatcaggcacggtctttaactgactgaatatccagtgaatctagctagatgttacttccggagatccagcgaagcgagcgcatagaaatgtcggaatgctacagcatcacggtgcctgtgataagctggacctgttcgaaaagcaggctataaaaaacaataccactgcgctcttaaagtgatacgaagcatggcaag

tgtccatattcgaaaaacatccacatcttggcgatgaaaaatatcaccaggggcaagaataaaaggccgtatgcctcaaatttttttctcagcgcccggtatgttgtcaacaggacgggtcaggactgggttgcatcaacgacgatatcccagggtgacgactgcgttagtcaaacatgattgcaacaaattcaagatctatacagataagcggtgatacaattaagcccacgaagcattttcgggca

ggccacgtttattctcaatacgaatatatgcgtttcagttctcaccgtctgtgaataaagaatatccagcatgttctttacattttagcttgacgctgcttacctgttttgtggtcgccacggcggccaagcatatagcgcgcaagaggcgtgccgaggacaatttaactgaattcgaaattgataagcatcacctaccaccatctgcggtgagcacatctgaagaagggggccgtctag

54060066072078084090096010201080114012001260132013801440150015601620168017401800186019201968

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> seqüência:iniciador MR74

<4 00> 15

tgaagcggcg cacgaaaaac gcg

23

<210><211><212><213>

1621DNA

artificial

<220><223>

seqüência:iniciador Cm-test2

<4 00> 16

ttcatcgctc tggagtgaat a

21

<210><211><212><213>

17

586

DNA

artificial

<220><223>

seqüência:região reguladora de ilvBN nativo

<4 00> 17

tgaagcggcg cacgaaaaac gcgaaagcgt ttcacgataa atgcgaaaac tttagctttc 60

gcgcttcaaa tgaaacagat gtattaatta ctgcttttta ttcattacat ggggatcttg 120

aagcctgctt ttttatacta agttggcatt ataaaaagca ttgcttatca atttgttgca 180acgaacaggt cactatcagt caaaataaaa tcattatttg atttcgtcga gttacgcccc

gccctgccac tcatcgcagt actgttgtaa ttcattaagc attctgccga catggaagcc

atcaçagacg gcatgatgaa cctgaatcgc cagcggcatc agcaccttgt cgccttgcgt

ataatatttg cccatggtga aaacgggggc gaagaagttg tccatattgg ccacgtttaa

atcaaaactg gtgaaactca cccagggatt ggctgagacg aaaaacatat tctcaataaa

ccctttaggg aaataggcca ggttttcacc gtaacacgcc acatcttgcg aatatatgtg

tagaaactgc cggaaatcgt cgtggtattc actccagagc gatgaa

240300360420480540586

<210> 18

<211> 879

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> seqüência:região reguladora de ilvBN após modificação

<4 00> 18

tgaagcggcg

gcgcttcaaa

aagcctgctt

actgacgaaa

acgtaaaatg

taatactgta

gacctgtaac

ttctgtgtta

gtagcaccag

cactcatcgc

acggcatgat

ttgcccatgg

ctggtgaaac

gggaaatagg

tgccggaaat

cacgaaaaactgaaacagatttttatactacctcgctccgatataaatataaacacaacaagactgcagtagcttcgacggcgtttaaggagtactgttggaacctgaattgaaaacgggtcacccagggccaggttttccgtcgtggta

gcgaaagcgtgtattaattaacttgagcgggcggggtcgccaatatattatatgcagtcaggtcgaaaaaaatttctgccgcaccaataataattcattacgccagcggcggcgaagaagattggctgagaccgtaacacttcactccag

ttcacgataa atgcgaaaac tttagctttc 60ctgcttttta ttcattacat ggggatcttg 120agctcggtac ctcgcgaatg catctagacg 180tcaagttagt ataaaaaagc tgaacgagaa 240aattagattt tgcataaaaa acagactaca 300ctatgaatca actacttaga tggtattagt 360aaaagcccgc actgtcaggt gcgggctttt 420attcatccgc ttattatcac ttattcaggc 480ctgccttaaa aaaattacgc cccgccctgc 540agcattctgc cgacatggaa gccatcacag 600atcagcacct tgtcgccttg cgtataatat 660ttgtccatat tggccacgtt taaatcaaaa 720acgaaaaaca tattctcaat aaacccttta 780gccacatctt gcgaatatat gtgtagaaac 840agcgatgaa 879

<210> 19

<211> 62

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> oligonucleotideo sintético de terminador dianteiro<4 00> 19

aagcttaaca cagaaaaaag cccgcacctg acagtgcggg cttttttttt cgaccactgc

<210> 20<211> 62<212> DNA<213> artificial<220> <223> oligonucleotideo<400> 20

ttcgaattgt gtcttttttc gggcgtggac tgtcacgccc gaaaaaaaaa gctggtgacg 60

tc 62

<210> 21<211> 37<212> DNA<213> artificial

<220>

<223> seqüência:iniciador<400> 21

ccagatcttg aagcctgctt ttttatacta agttggc

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> seqüência:iniciador<4 00> 22

gaaatcaaat aatgatttta ttttg

<210> 23

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> seqüência:iniciador<4 00> 23

ttacgccccg ccctgccact catcgc

<210> 24

<211> 34

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> seqüência:iniciador<4 00> 24

gtcactgcag ctgatgtccg gcggtgcttt tgcc

<210> 25

<211> 31

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> seqüência:iniciador<4 00> 25

cagctgcagt ctgttacagg tcactaatac c

<210> 26

<211> 37

<212> DNA

<213> artificial<220>

<223> seqüência:iniciador<400> 26

ccgagctccg ctcaagttag tataaaaaag ctgaacg

<210> 27

<211> 70

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> seqüência:iniciador

<4 00> 27

cccgagctcg gtacctcgcg aatgcatcta gatgggcccg tcgactgcag aggcctgcatgcaagcttcc

<210> 28

<211> 64

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador ilvBNl

<400> 28

taaacatcgt cggatcggac tgattacgct gcactttgaa gcctgctttt ttatactaag 60

ttgg 64

<210> 29

<211> 64

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador ilvBN2

<4 00> 29

tcccggaaag tcggcccaga agaaaaggac tggagccgct caagttagta taaaaaagct 60

gaac 64

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador ilvBNC5<4 00> 30

gtctataagg gcaacggtga tcat

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> iniciador ilvBNC6<400> 31

catgctcaac gcaaaactac tacc

<210> 32

<211> 61

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador ilvIHl<400> 32

ttcacctttc ctcctgttta ttcttattac ccctgaagcc tgctttttta tactaagttg

<210> 33

<211> 64

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador ilvIH2<400> 33

acatgttggg ctgtaaattg cgcattgaga tcattccgct caagttagta taaaaaagct

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador ilvIHC3<400> 34

ttgctgtaag ttgtgggatt c

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador ilvIHC4<400> 35

tccaggttcc cactgatttc

<210> 36

<211> 64

<212> DNA

<213> Artificial

<220><223> iniciador ilvGMl<400> 36

gtttctcaag attcaggacg gggaactaac tatgaatgaa gcctgctttt ttatactaag

<210> 37<211> 64<212> DNA<213> Artificial<220> <223> iniciador ilvGM2<400> 37

tcagctttct tcgtggtcat ttttatattc cttttgcgct caagttagta taaaaaagct

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador ilvGMC3<400> 38

tggtcgtgat tagcgtggtg

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador ilvGMC4

<400> 39

cacatgcacc ttcgcgtctt

20

Claims (21)

1. Subunidade pequena mutante de acetolactato sintasebacteriana (AHAS I), caracterizada pelo fato de compreender a subunidadepequena de acetolactato sintase de tipo selvagem de Escherichia colicompreendendo uma mutação selecionada dentre o grupo consistindo de :A) substituir o L-aminoácido na posição 17 e/ou 30 na referidasubunidade pequena de acetolactato sintase de tipo selvagem com outro L-aminoácido,B) substituir a porção N-término a jusante do L-aminoácido naposição 44 na referida subunidade pequena de acetolactato sintase de tiposelvagem com vários L-aminoácidos, eC) suas combinações, eem que referida subunidade pequena mutante de acetolactatosintase é dessenssibilizada para inibição da realimentação por valina.

2. Subunidade pequena mutante de acetolactato sintasebacteriana de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de quereferido L-aminoácido na posição 17 é substituído com um resíduo de lisina.

3. Subunidade pequena mutante de acetolactato sintasebacteriana de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que oL-aminoácido na posição 30 é substituído com um resíduo prolina.

4. Subunidade pequena mutante de acetolactato sintasebacteriana de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que areferida porção N-término a jusante de L-aminoácido na posição 44 ésubstituída com arginina e fenilalanina.

5. Subunidade pequena mutante de acetolactato sintasebacteriana de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de quereferido L-aminoácido na posição 17 que é substituído com um resíduo lisinaé asparagina.

6. Subunidade pequena mutante de acetolactato sintasebacteriana de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de quereferido L-aminoácido na posição 30, que é substituído com um resíduo deprolina, é alanina.

7. Subunidade pequena mutante de acetolactato sintasebacteriana de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de quereferido L-aminoácido na posição 44, que é substituído com arginina efenilalanina, é isoleucina.

8. Acetolactato sintase mutante, caracterizada pelo fato decompreender a subunidade pequena como definida na reivindicação 1.

9. Acetolactato sintase mutante de acordo com a reivindicação-8, caracterizada pelo fato de que referida acetolactato sintase mutantecompreende a subunidade grande de Escherichia coli.

10. Acetolactato sintase mutante bacteriana de acordo com areivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a subunidade pequena incluideleções, substituições, inserções, ou adições de um ou vários aminoácidosem uma ou mais posições diferentes de posições 17, 30 e/ou 44, e em quereferida acetolactato sintase mutante é dessenssilizada para inibição derealimentação por valina.

11. DNA, caracterizado pelo fato de codificar para asubunidade pequena mutante da acetolactato sintase como definida nareivindicação 1.

12. Bactéria da família Enterobaeteriaeeae, caracterizada pelofato de conter o DNA como definido na reivindicação 11, e ter a capacidadede produzir L-aminoácidos de cadeia ramificada.

13. Bactéria de acordo com a reivindicação 12, caracterizadapelo fato de que os referidos L-aminoácidos de cadeia ramificada sãoselecionados dentre o grupo consistindo de L-leucina, L-isoleucina, e L-valina.

14. Bactéria de acordo com a reivindicação 13, caracterizadapelo fato de que a atividade da acetolactato sintase mutante é melhorada nabactéria.

15. Bactéria de acordo com a reivindicação 14, caracterizadapelo fato de que a bactéria pertence ao gênero Escherichia.

16. Bactéria de acordo com a reivindicação 15, caracterizadapelo fato de que a atividade da acetolactato sintase mutante é melhorada poraumento da expressão do gene acetolactato sintase mutante.

17. Bactéria de acordo com a reivindicação 16, caracterizadapelo fato de que a atividade da acetolactato sintase mutante é aumentada porum método selecionado dentre o grupo consistindo de:a) aumentar o número de cópias do gene de acetolactatosintase mutante,b) modificar uma seqüência de controle de expressão do gene,de modo que a expressão do gene é melhorada, ec) suas combinações.

18. Bactéria de acordo com a reivindicação 17, caracterizadapelo fato de que o número de cópias é melhorado pela integração de cópiasmúltiplas do gene acetolactato sintase mutante no cromossomo da bactéria.

19. Método para produzir um L-aminoácido de cadeiaramificada, caracterizado pelo fato de compreender cultivar a bactéria, comodefinida na reivindicação 12, em um meio de cultura, e coletar os L-aminoácidos de cadeia ramificada do meio de cultura.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que a bactéria tem melhorada expressão de genes envolvidos embiossíntese de L-aminoácido de cadeia ramificada.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato de que referido L-aminoácido de cadeia ramificada é selecionadodentre o grupo consistindo de L-leucina, L-isoleucina, e L-valina.