JP5087362B2

JP5087362B2 - エシェリヒア属細菌を用いたｌ−アミノ酸の製造法

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Publication number: JP5087362B2
Application number: JP2007273965A
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Inventors: アレクサンドロヴナタボリナエカチェリナ; ヴャチェスラヴォヴィッチルイバクコンスタンチン; モイセエヴィッチフルゲスエヴゲーニ; ボリソヴナヴォロシロヴァエリヴィラ; マルコヴィッチグシャチネルミハイル
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Priority date: 2001-02-13
Filing date: 2007-10-22
Publication date: 2012-12-05
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Description

本発明は、バイオテクノロジーに関し、具体的には発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法に関し、さらに、具体的には、エシェリヒア・コリ由来の遺伝子に関する。同遺伝子は、Ｌ−アミノ酸、例えば、Ｌ−スレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−メチオニン、及びＬ−アルギニンの生産性の改良に有用である。

従来、Ｌ−アミノ酸は、自然界より得られる微生物、またはＬ−アミノ酸の生産性を増強するために改変されたそれらの微生物の変異株を用いた発酵法により産業的に生産されている。

Ｌ−アミノ酸生産性を増強する数多くの技術が開示されており、例えば、組み換えＤＮＡによる微生物の形質転換によるものがある（例えば、特許文献１を参照）。これらの技術は、アミノ酸の生合成に関与する酵素の活性を増加させること、および／または生成されたＬ−アミノ酸によるフィードバック阻害に対して目的の酵素を脱感作させることに基づいている（例えば、特許文献２〜５参照）。

他方では、Ｌ−アミノ酸の排出を増強させることによっても、Ｌ−アミノ酸生産菌の生産性を増強することができる。発現が増強されたＬ−リジン排出遺伝子（lysE遺伝子）を有するコリネバクテリウム属細菌の菌株が開示されている（特許文献６）。さらに、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−アセチルセリンまたはチアゾリジンの誘導体の分泌に適した流出タンパク質をコードする遺伝子が開示されている（特許文献７）。

現在、Ｌ−アミノ酸生産性を増強する推定上の膜タンパク質をコードするいくつかのエシェリヒア・コリの遺伝子が開示されている。rhtB遺伝子のコピー数を増やすことにより、細菌は、Ｌ−ホモセリンに対してより耐性となり、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリンおよびＬ−イソロイシンの生産性は増強される（特許文献８）。rhtC遺伝子のコピー数を増やすことにより、細菌は、Ｌ−ホモセリンおよびＬ−スレオニンに対してより耐性となり、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−スレオニンおよびＬ−ロイシンの生産性は増強される（特許文献９）。yahN、yeaS、yfiKおよびyggA遺伝子のコピー数を増やすことにより、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−バリンおよびＬ−イソロシンの生産は増強される（特許文献１０）。尚、エシェリヒア・コリＫ−１２株の全ゲノム配列は明らかにされているが（非特許文献１）、機能が未だ不明のORFが数多くある。
米国特許4,278,765 特開昭56-18596(1981) 公報 WO95/16042 米国特許5,661,012 米国特許6,040,160 WO9723597A2 米国特許5,972,663 欧州特許出願EP994190A2 欧州特許出願EP1013765A1 欧州特許出願EP1016710A2 Blattner F.R., Plunkett G., Bloch C.A. et al., Science, 227, 1453-1474, 1997; ftp://ftp.genetics.wisc.edu/pub/sequence/ecolim52.seq.gz

本発明は、Ｌ−アミノ酸生産菌株の生産性を増強し、同菌株を用いて前記Ｌ−アミノ酸、例えば、Ｌ−スレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−メチオニン、及びＬ−アルギニンを製造する方法を提供することを課題とする。

本課題は、目的とするＬ−アミノ酸の生合成経路には関与していないが、それらの生産性を増強するタンパク質をコードする遺伝子の同定により達成された。これらのタンパク質の例としては、Ｌ−アミノ酸の排出活性を有する膜タンパク質が挙げられる。エシェリヒア・コリの全ゲノム配列の解析に基づいて、４若しくはそれ以上の推定上の膜貫通部（Transmembrane segment）（TMS）を有するタンパク質を選択した。入念なスクリーニングの結果、本発明者らはそれらの中からいくつかの遺伝子、すなわち、b2682およびb2683、b1242、並びにb3434を同定し、詳細に研究した。b2682およびb2683遺伝子は、機能が未知のタンパク質をコードし得る推定上のＣＤＳとして知られている（それぞれ、GenBank accessionNo. AE000353 U00096の塩基配列の配列番号９２〜８２９および８１９〜１１５４）。b2683遺伝子は、ygaHとしても知られている。

また、b1242遺伝子は、機能が未知のタンパク質をコードし得る推定上のＣＤＳとして知られている（GenBank accession No. AE000222 U00096の塩基配列の配列番号８４３２〜９０７９）。b1242遺伝子は、ychEとしても知られている。

さらに、b3434遺伝子は、機能が未知のタンパク質をコードし得る推定上のＣＤＳとして知られている（GenBank accession No. AE000420 U00096の塩基配列の配列番号１４６３〜２０５６）。b3434遺伝子は、yhgNとしても知られている。

本発明者らは、また、b2682、b2683、b1242又はb3434遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を増強することにより、Ｌ−アミノ酸生産菌の生産性が増強されることを見いだした。かくして、本発明は完成された。本発明は、以下のとおりである。

（１）Ｌ−アミノ酸生産能を有するエシェリヒア属細菌であって、同細菌の細胞内において以下の（Ａ）または（Ｂ）、および（Ｃ）または（Ｄ）に記載のタンパク質の活性を増強することにより、Ｌ−アミノ酸生産性が増強された前記エシェリヒア属細菌。
（Ａ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、（Ｂ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含み、かつ、細菌のＬ−アミノ酸および／またはそのアナログに対する耐性を増強させる活性を有するタンパク質。（Ｃ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、（Ｄ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含み、細菌のＬ−アミノ酸および／またはそのアナログに対する耐性を増強させる活性を有するタンパク質。（以下、前記（Ａ）または（Ｂ）、および（Ｃ）または（Ｄ）に記載のタンパク質は、「第一の本発明のタンパク質」と呼ぶことがある。また、前記（Ａ）または（Ｂ）、および（Ｃ）または（Ｄ）に記載のタンパク質の活性が増強されたエシェリヒア属細菌は、「第一の本発明の細菌」と呼ぶことがある。）
（２）（Ａ）または（Ｂ）、および（Ｃ）または（Ｄ）に記載のタンパク質の活性は、（Ａ）または（Ｂ）、および（Ｃ）または（Ｄ）に記載のタンパク質をコードするＤＮＡで前記細菌を形質転換するか、または、前記細菌の染色体上の前記ＤＮＡの発現制御配列を改変することにより増強されたことを特徴とする前記細菌。
（３）前記形質転換はマルチコピーベクターを用いて行われた前記細菌。
（４）前記細菌を培地中に培養し、生成、蓄積されたＬ−アミノ酸を該培地中から採取す
る、Ｌ−アミノ酸の製造法。
（５）Ｌ−アミノ酸がＬ−スレオニンである、前記の方法。
（６）前記細菌のスレオニンオペロンの発現が増強された、前記の方法。
（７）Ｌ−アミノ酸がＬ−バリンである、前記の方法。
（８）前記細菌のilvオペロンの発現が増強された、前記の方法。
（９）Ｌ−アミノ酸がＬ−プロリンである、前記の方法。
（１０）前記細菌のプロリンの生合成に関与する遺伝子の発現が増強された、前記の方法。
（１１）Ｌ−アミノ酸がＬ−ロイシンである、前記の方法。
（１２）前記細菌のleuオペロンの発現が増強された、前記の方法。
（１３）Ｌ−アミノ酸がＬ−メチオニンである、前記の方法。
（１４）前記細菌のmetレギュロンの発現が増強された、前記の方法。

（１５）Ｌ−アミノ酸生産能を有するエシェリヒア属細菌であって、同細菌の細胞内において以下の（Ｅ）または（Ｆ）に記載のタンパク質の活性を増強することにより、Ｌ−アミノ酸生産性が増強されたエシェリヒア属細菌。
（Ｅ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、または、（Ｆ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含み、かつ、細菌のＬ−アミノ酸および／またはそのアナログに対する耐性を増強させる活性を有するタンパク質。（以下、前記（Ｅ）または（Ｆ）に記載のタンパク質は、「第二の本発明のタンパク質」と呼ぶことがある。また、前記（Ｅ）または（Ｆ）に記載のタンパク質の活性が増強されたエシェリヒア属細菌は、「第二の本発明の細菌」と呼ぶことがある。）
（１６）前記（Ｅ）または（Ｆ）に記載のタンパク質の活性は、（Ｅ）または（Ｆ）に記載のタンパク質をコードするＤＮＡで前記細菌を形質転換するか、または、前記細菌の染色体上の前記ＤＮＡの発現制御配列を改変することにより増強されたことを特徴とする前記細菌。
（１７）前記形質転換はマルチコピーベクターを用いて行われた前記細菌。
（１８）前記細菌を培地中に培養し、生成、蓄積されたＬ−アミノ酸を該培地中から採集する、Ｌ−アミノ酸の製造法。
（１９）Ｌ−アミノ酸がＬ−スレオニンである、前記の方法。
（２０）前記細菌のスレオニンオペロンの発現が増強された、前記の方法。
（２１）Ｌ−アミノ酸がＬ−バリンである、前記の方法。
（２２）前記細菌のilvオペロンの発現が増強された、前記の方法。

（２３）Ｌ−アミノ酸生産能を有するエシェリヒア属細菌であって、同細菌の細胞内において以下の（Ｇ）または（Ｈ）に記載のタンパク質の活性を増強することにより、Ｌ−アミノ酸生産性が増強されたエシェリヒア属細菌。
（Ｇ）配列表の配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、または、（Ｈ）配列表の配列番号１６に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含み、かつ、細菌のＬ−アミノ酸および／またはそのアナログ、例えば、ＤＬ−ｏ−メチルセリン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシンおよびＤＬ−β−ヒドロキシ−ノルバリンに対する耐性を増強させる、およびＳ−（２−アミノエチル）システインに対する感受性を増強させる活性を有するタンパク質。（以下、前記（Ｇ）または（Ｈ）に記載のタンパク質は、「第三の本発明のタンパク質」と呼ぶことがある。また、前記（Ｇ）または（Ｈ）に記載のタンパク質の活性が増強されたエシェリヒア属細菌は、「第三の本発明の細菌」と呼ぶことがある。）
（２４）前記（Ｇ）または（Ｈ）に記載のタンパク質の活性は、（Ｇ）または（Ｈ）に記載のタンパク質をコードするＤＮＡで前記細菌を形質転換するか、または、前記細菌の染色体上の前記ＤＮＡの発現制御配列を改変することにより増強されたことを特徴とする、
前記細菌。
（２５）前記形質転換はマルチコピーベクターを用いて行われた前記細菌。
（２６）前記細菌を培地中に培養し、生成、蓄積されたＬ−アミノ酸を該培地中から採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法。
（２７）Ｌ−アミノ酸がＬ−アルギニンである、前記の方法。
（２８）前記細菌のアルギニンレギュロンの発現が増強された、前記の方法。
（２９）Ｌ−アミノ酸がＬ−プロリンである、前記の方法。
（３０）前記細菌のプロリンの生合成に関与する遺伝子の発現が増強された、前記の方法。

前記Ｌ−アミノ酸の製造法は、本発明のタンパク質、例えば、配列番号４および６に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の活性が増強された、Ｌ−スレオニン生産菌を用いたＬ−スレオニンの製造を含む。
また、本発明のＬ−アミノ酸の製造法は、本発明のタンパク質、例えば、配列番号４および６に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の活性が増強された、Ｌ−バリン生産菌を用いたＬ−バリンの製造を含む。

さらに、前記Ｌ−アミノ酸の製造法は、本発明のタンパク質、例えば、配列番号４および６に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の活性が増強された、Ｌ−プロリン生産菌を用いたＬ−プロリンの製造を含む。さらに、前記Ｌ−アミノ酸の製造法は、本発明のタンパク質、例えば、配列番号４および６に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の活性が増強された、Ｌ−ロイシン生産菌を用いたＬ−ロイシンの製造を含む。さらに、前記Ｌ−アミノ酸の製造法は、本発明のタンパク質、例えば、配列番号４および６に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の活性が増強された、Ｌ−メチオニン生産菌を用いたＬ−メチオニンの製造を含む。

また、本発明のＬ−アミノ酸の製造法は、本発明のタンパク質、例えば、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の活性が増強された、Ｌ−スレオニン生産菌を用いたＬ−スレオニンの製造を含む。さらに、前記Ｌ−アミノ酸の製造法は、本発明のタンパク質、例えば、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の活性が増強された、Ｌ−バリン生産菌を用いたＬ−バリンの製造を含む。

また、本発明のＬ−アミノ酸の製造法は、本発明のタンパク質、例えば、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の活性が増強された、Ｌ−アルギニン生産菌を用いたＬ−アルギニンの製造を含む。さらに、前記Ｌ−アミノ酸の製造法は、本発明のタンパク質、例えば、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の活性が増強された、Ｌ−プロリン生産菌を用いたＬ−プロリンの製造を含む。

本発明により、Ｌ−アミノ酸、例えば、Ｌ−スレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−メチオニン、及びＬ−アルギニンの生産性が向上したエシェリヒア属細菌、及び同細菌を利用したＬ−アミノ酸の製造法が提供される。

以下、本発明を詳細に説明する。本発明の細菌は、エシェリヒア属に属するＬ−アミノ酸生産菌であって、同細菌によるＬ−アミノ酸の生産性は、同細菌細胞内で本発明のタンパク質の活性を増強することにより増強される。

本発明において「Ｌ−アミノ酸生産菌」とは、前記細菌を培地中に培養したときに、Ｌ−アミノ酸を培地中に蓄積させる能力を有する細菌を意味する。Ｌ−アミノ酸生産能は、野
生株の性質として細菌が保持しているものでよく、または、育種によって付与又は増強されたものでもよい。

本発明の細菌は、目的のＬ−アミノ酸の生産性を増強させるタンパク質の活性を増強させた、エシェリヒア属に属するＬ−アミノ酸生産菌である。具体的には、本発明の細菌は、本発明のタンパク質の少なくとも１種又は２種の活性が増強された、エシェリヒア属に属するＬ−アミノ酸生産菌である。

「タンパク質の活性の増強」という用語は、細菌あたりの活性が、非改変株、例えば、エシェリヒア属細菌の野生株の活性よりも高くなっていることを意味する。例えば、細菌あたりのタンパク質分子の数が増加している場合、又は、タンパク質当たりの比活性が増加している場合等が挙げられる。さらに、比較対象とされるエシェリヒア属細菌の野生株としては、例えば、エシェリヒア・コリの野生株が挙げられる。

具体的には、第一の本発明の細菌は、染色体ＤＮＡ上または細菌内のプラスミド上に、b2682およびb2683遺伝子の少なくとも一方、好ましくは両方を過剰発現するＤＮＡを保持し、増強された、Ｌ−アミノ酸生産能、例えば、Ｌ−スレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシンまたはＬ−メチオニンの生産能を有する。第二の本発明の細菌は、染色体ＤＮＡ上または細菌内のプラスミド上に、b1242遺伝子を過剰発現するＤＮＡを保持し、増強された、Ｌ−アミノ酸生産能、例えば、Ｌ−スレオニンおよび／またはＬ−バリンの生産能を有する。第三の本発明の細菌は、染色体ＤＮＡ上または細菌内のプラスミド上に、b3434遺伝子を過剰発現するＤＮＡを保持し、増強されたＬ−アミノ酸生産能、例えば、Ｌ−アルギニンおよび／またはＬ−プロリンの生産能を有する。

第一の本発明のタンパク質は、以下の（Ａ）または（Ｂ）、および（Ｃ）または（Ｄ）に記載されたものを含む。
（Ａ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含み、かつ、細菌のＬ−アミノ酸および／またはそのアナログに対する耐性を増強させる活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、（Ｄ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含み、かつ、細菌のＬ−アミノ酸および／またはそのアナログに対する耐性を増強させる活性を有するタンパク質。

前記「数個」のアミノ酸の数は、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によって異なる。その数はそれぞれ、タンパク質（Ａ）については、２〜２４個、好ましくは２〜１２個、より好ましくは２〜５個であり得、タンパク質（Ｃ）については、２〜１１個、好ましくは２〜７個、より好ましくは２〜５個であり得る。

第二の本発明のタンパク質は、以下の（Ｅ）または（Ｆ）に記載されたものを含む。
（Ｅ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｆ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含み、かつ、細菌のＬ−アミノ酸および／またはそのアナログに対する耐性を増強させる活性を有するタンパク質。前記「数個」のアミノ酸の数は、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によって異なる。その数は、タンパク質（Ｅ）については、２〜２２個、好ましくは２〜１１個、より好ましくは２〜５個であり得る。

第三の本発明のタンパク質は、以下の（Ｇ）または（Ｈ）に記載されたものを含む。
（Ｇ）配列表の配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｈ）配列表の配列番号１６に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含み、かつ、細菌のＬ−アミノ酸および／またはそのアナログ、例えば、ＤＬ−ｏ−メチルセリン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、および、ＤＬ−β−ヒドロキシ−ノルバリンに対する耐性を増強させる、およびＳ−（２−アミノエチル）システインに対する感受性を増強させる活性を有するタンパク質。前記「数個」のアミノ酸の数は、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によって異なる。その数は、タンパク質（Ｇ）については、２〜２０個、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜５個であり得る。

Ｌ−アミノ酸および／またはそのアナログに対する耐性とは、Ｌ−アミノ酸またはそのアナログを非改変株または野生株が生育できない濃度で含む最小培地上で生育できるか、またはＬ−アミノ酸またはそのアナログを含む培地上で非改変株または野生株よりも早く生育できる細菌の能力を意味する。

より具体的には、エシェリヒア・コリの菌株を、Ｌ−アミノ酸又はそのアナログを含むアダムス寒天培地で適当な条件で培養したときに、３７℃、２〜４日後に非改変株又は野生株よりも大きなコロニーを形成した場合、前記菌株は、前記Ｌ−アミノ酸又はそのアナログに耐性であるということができる。「適当な条件」とは、培養されるエシェリヒア・コリの菌株のための、温度、pH、給気、又は必要に応じて加える必須栄養素等をいう。

Ｌ−アミノ酸のアナログの例としては、３，４−ジヒドロプロリン、ＤＬ−チアイソロイシン、ＤＬ−ｏ−メチルセリン、４−アザロイシン、ノルロイシン、Ｌ−ｏ−フルオロフェニルアラニン、ホモセリン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、および、ＤＬ−β−ヒドロキシ−ノルバリンが挙げられる。前記の非改変株又は野生株が生育できないＬ−アミノ酸またはそのアナログの濃度は、使用する化合物の構造によって、かなり異なる（ＤＬ−チアイソロイシンの０．５μｇ／ｍｌ〜ＤＬ−ｏ−メチルセリンの９６００μｇ／ｍｌ）。例えば、この濃度は、３，４−ジヒドロプロリンの場合では、一般的には７〜７０μｇ／ｍｌ、好ましくは２０〜２５μｇ／ｍｌであり、ＤＬ−チアイソロイシンの場合では、一般的には０．５〜５μｇ／ｍｌ、好ましくは０．９〜１．１μｇ／ｍｌであり、ＤＬ−ｏ−メチルセリンの場合では、一般的には１１００〜９６００μｇ／ｍｌ、好ましくは３０００〜３５００μｇ／ｍｌであり、４−アザロイシンの場合では、一般的には１５〜１５０μｇ／ｍｌ、好ましくは４０〜５０μｇ／ｍｌであり、ノルロイシンの場合では、一般的には１５０〜１５００μｇ／ｍｌ、好ましくは４５０〜５５０μｇ／ｍｌであり、Ｌ−ｏ−フルオロフェニルアラニンの場合では、一般的には０．６〜６μｇ／ｍｌ、好ましくは１．５〜２μｇ／ｍｌであり、ＤＬ−ｏ−フルオロフェニルアラニンの場合では、一般的には２〜２０μｇ／ｍｌ、好ましくは５〜７μｇ／ｍｌであり、ホモセリンの場合では、一般的には３３０〜３３００μｇ／ｍｌ、好ましくは９００〜１１００μｇ／ｍｌであり、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシンの場合では、一般的には５〜５０μｇ／ｍｌ、好ましくは１２〜１８μｇ／ｍｌであり、ＤＬ−β−ヒドロキシ−ノルバリンの場合では、一般的には２５〜２５０μｇ／ｍｌ、好ましくは７０〜９０μｇ／ｍｌである。

Ｌ−アミノ酸および／またはそのアナログに対する感受性とは、Ｌ−アミノ酸またはそのアナログを所定の濃度で含む最小培地上で非改変株または野生株よりも遅く生育するか、または、Ｌ−アミノ酸またはそのアナログを非改変株または野生株の親株が生育できる濃度で含む最小培地上で生育できない、細菌の能力を意味する。Ｌ−アミノ酸のアナログの例としては、Ｓ−（２−アミノエチル）システインが挙げられる。前記記載の濃度は、Ｓ−（２−アミノエチル）システインの場合には、一般的には０．２〜２．０μｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜１．０μｇ／ｍｌである。

本発明の細菌は、前記細菌を（Ａ）または（Ｂ）、および（Ｃ）または（Ｄ）、または（Ｅ）もしくは（Ｆ）、または（Ｇ）もしくは（Ｈ）に記載のタンパク質をコードするＤＮＡで形質転換するか、または前記細菌の染色体上の前記ＤＮＡの発現制御配列を改変することによって増強された本発明のタンパク質のうち一つを含む。

本発明の細菌の改変に用いられるＤＮＡは、推定上の膜タンパク質をコードしている。具体的には、前記ＤＮＡは、４若しくはそれ以上の膜貫通部を有するタンパク質をコードしている。このようなＤＮＡは、Ｌ−アミノ酸の排出活性を有するタンパク質をコードし得る。さらに具体的には、前記ＤＮＡは、b2682、b2683、b1242、及びb3434遺伝子に代表される。b2682遺伝子のコード領域の728〜738と、b2683遺伝子のコード領域の1〜11は、オーバーラップしていることに注目する必要がある。b2682およびb2683遺伝子は、例えば、配列番号１および２に記載の塩基配列を有するプライマーを用いたＰＣＲにより、単一ＰＣＲ産物として得られる。また、b1242遺伝子は、例えば、配列番号９および１０に示される塩基配列を有するプライマーを用いたＰＣＲによって得ることができる。b3434遺伝子は、例えば、配列番号１３および１４に示される塩基配列を有するプライマーを用いたＰＣＲによって得ることができる。

エシェリヒア・コリの全ゲノム配列の分析により、４若しくはそれ以上の推定上のTMSを有するタンパク質をコードする遺伝子の選択が可能となった。PaulsenI.T., Sliwinski M.I., Saier M.H. (J. Mol. Biol., 1998, 277, 573)およびLinton K.J., Higgins C.F. (Molecular Microbiology, 1998, 28(1),5)により明らかにされた既知の機能を有するタンパク質およびトランスポーターは、スクリーニングする群から排除した。残りの遺伝子の入念なスクリーニングの結果、推定上の膜エキスポーターをコードするいくつかの遺伝子を選択した。そして、b2682、b2683、b1242、又はb3434遺伝子の過剰発現が、Ｌ−アミノ酸生産菌のＬ−アミノ酸の生産性を増強することを見いだした。

本発明のＤＮＡは、前記タンパク質の活性を失わない範囲で、前記タンパク質（Ａ）または（Ｃ）上の１若しくはそれ以上の位置で、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含むタンパク質をコードするＤＮＡを含む。「数個」のアミノ酸の数は、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によって異なるが、その数はそれぞれ、タンパク質（Ａ）については、２〜２４個、好ましくは２〜１２個、より好ましくは２〜５個であり得、タンパク質（Ｃ）については、２〜１１個、好ましくは２〜７個、より好ましくは２〜５個であり得る。

また、本発明のＤＮＡは、前記タンパク質の活性を失わない範囲で、前記タンパク質（Ｅ）上の１若しくはそれ以上の位置で、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含むタンパク質をコードするＤＮＡを含む。「数個」のアミノ酸の数は、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によって異なるが、その数は、タンパク質（Ｅ）については、２〜２２個、好ましくは２〜１１個、より好ましくは２〜５個であり得る。さらに、本発明のＤＮＡは、前記タンパク質の活性を失わない範囲で、前記タンパク質（Ｇ）上の１若しくはそれ以上の位置で、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含むタンパク質をコードするＤＮＡを含む。「数個」のアミノ酸の数は、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によって異なるが、その数は、タンパク質（Ｇ）については、２〜２０個、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜５個であり得る。

（Ａ）、（Ｃ）、（Ｅ）または（Ｇ）に記載のタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように（Ａ）、（Ｃ）、（Ｅ）または（Ｇ）に記
載のタンパク質をコードする塩基配列を改変することによって得られる。また、このような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異を生じさせる変異剤および条件による処理によっても取得され得る。このような処理としては、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡをヒドロキシルアミンで処理する方法、または前記ＤＮＡを保持する微生物を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の変異剤による処理を含む。

本発明のＤＮＡは、異なる菌株、及び自然界の多様性によるエシェリヒア属に属する細菌のバリアントとして見い出され得る変異体を含む。このような変異体をコードするＤＮＡは、ストリンジェントな条件下でb2862、b2683、b1242、又はb3434遺伝子およびその遺伝子の一部とハイブリダイズし、Ｌ−アミノ酸の生産性を増強するタンパク質をコードするＤＮＡをクローニングすることによって得ることができる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的ハイブリッドが形成され、非特異的ハイブリッドが形成されない条件である。例えば、ストリンジェントな条件は、例えば７０％以上の高いホモロジーを互いに有するＤＮＡがハイブリダイズする条件を含む。あるいは、ストリンジェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である、例えば、６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む条件が挙げられる。b2862、b2683、b1242、又はb3434遺伝子とハイブリダイズする変異体をコードするＤＮＡに対するプローブとしては、配列番号３、５、１１または１５の塩基配列の一部の配列をそれぞれ用いることもできる。そのようなプローブは、配列番号３、５、１１または１５の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、配列番号３または５の塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製することができる。プローブとして、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが挙げられる。

タンパク質をコードするＤＮＡで細菌を形質転換することは、前記ＤＮＡを細菌細胞に、例えば、従来法で導入し、前記細菌細胞内での本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現を増加させ、本発明のタンパク質の活性を増強させることを意味する。

遺伝子発現の増強の方法には、遺伝子のコピー数を増加させる方法が含まれる。エシェリヒア属細菌内で機能できるベクターへの遺伝子の導入は、遺伝子のコピー数を増加させる。このような目的には、マルチコピーベクターが好ましく使用できる。マルチコピーベクターとしては、pBR322、pMW119、pUC19、pET22b等が挙げられる。

さらに、遺伝子発現の増強は、例えば、相同組み換え等の方法で細菌染色体へ遺伝子をマルチコピーで導入することによっても達成することができる。２又はそれ以上の遺伝子の発現を増強する場合は、それらの遺伝子は同じプラスミドに同時に保持させるか、または違うプラスミドに個々に保持させてもよい。また、遺伝子の一方を染色体上に保持させ、他方をプラスミド上に保持させてもよい。

また、遺伝子発現の増強は、遺伝子の発現制御配列を改変することによって達成することができる。遺伝子の発現制御配列の改変には、遺伝子固有のプロモーターのような発現制御配列に、その発現が増強されるように変異を導入すること、及び、本発明のＤＮＡを強力なプロモーターの制御下に置くことが含まれる。例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、ラムダファージのP_Lプロモーターは、強力なプロモーターとして知られている。プロモーターの使用は、遺伝子コピーの増幅と組み合わせることができる。

本発明の細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を元々有する細菌へ前記ＤＮＡを導入することによ
って得ることができる。あるいは、本発明の細菌は、前記ＤＮＡを既に保持する細菌に、Ｌ−アミノ酸生産能を付与することによっても得ることができる。本発明のタンパク質の活性を増強させる親株として、エシェリヒア属に属するＬ−スレオニン生産菌としては、例えば、VL2054（VKPM B-8067）、VNIIGenetika 472T23（米国特許5,631,157）、VKPM B-3996（米国特許5,175,107および5,976,843）、KCCM-10132（WO 009660A1）、KCCM-10133（WO 009661A1）等が使用できる。また、本発明のタンパク質の活性を増強させる親株として、エシェリヒア属に属するＬ−バリン生産菌としては、例えば、H-81（VKPM B-8066）、NRRLB-12287およびNRRL B-12288(米国特許4,391,907）、VKPM B-4411（米国特許5,658,766）、VKPM B-7707（欧州特許出願1016710A2）等が使用できる。

また、本発明のタンパク質の活性を増強させる親株として、エシェリヒア属に属するＬ−プロリン生産菌としては、例えば、NRRL B-12403、およびNRRL B-12404（英国特許2075056）、VKPM B-8012（ロシア特許出願2000124295）、ドイツ特許3127361に記載のプラスミド変異株、Bloom F.R.等の文献（The 15^th Miami winter symposium, 1983, p.34）に記載のプラスミド変異株等が使用できる。また、本発明のタンパク質の活性を増強させる親株として、エシェリヒア属に属するＬ−ロイシン生産菌としては、例えば、H-9070（FERM
BP-4704）およびH-9072（FERM BP-4706）（米国特許5744331）、VKPM B-7386およびVKPM
B-7388（ロシア特許2140450）、W1485atpA401/pMWdAR6、W1485lip2/pMWdAR6およびAJ12631/pMWdAR6（欧州特許0872547）等が使用できる。また、本発明のタンパク質の活性を増強させる親株として、エシェリヒア属に属するＬ−アルギニン生産菌としては、例えば、AJ11539（NRRL B-12399）、AJ11540（NRRL B-12400）、AJ11541（NRRLB-12401）およびAJ11542（NRRL B-12402）（英国特許2075055）等が使用できる。

また、本発明のタンパク質の活性を増強させる親株として、エシェリヒア属に属するＬ−メチオニン生産菌としては、例えば、AJ11531およびAFJ11538（特開昭56-106598）、AJ11593（FERM P-5616）およびAJ11594（FERM P-5617）（特開昭57-5693）等が使用できる。

本発明の細菌は、Ｌ−アミノ酸の生合成に関与する１またはそれ以上の発現が増強された遺伝子を有することができる。このような遺伝子として、Ｌ−スレオニン生産菌については、好ましくは、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害が解除されたアスパラギン酸キナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含むスレオニンオペロン（特開平1-29559）が挙げられる。前記遺伝子としては、Ｌ−バリン生産菌については、ilvオペロン、好ましくは、アテニュエーションが抑制されたスレオニンデアミナーゼを発現しないilvGMEDAオペロン（特願平8-477397）が挙げられる。また、Ｌ−プロリンの生合成に関与する遺伝子として、Ｌ−プロリン生産菌については、Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたグルタミン酸キナーゼをコードするproB遺伝子（ドイツ特許312736）が好ましく挙げられる。また、前記遺伝子として、Ｌ−ロイシン生産菌については、好ましくは、Ｌ−ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたイソプロピルマレイン酸シンターゼをコードする遺伝子を含むロイシンオペロン、すなわち、leuオペロン（ロシア特許出願99114325）が挙げられる。また、前記遺伝子として、Ｌ−メチオニン生産菌については、メチオニンレギュロンが挙げられる。メチオニンレギュロンは、アミノ酸の生合成を抑制する活性が低減したタンパク質をコードする変異遺伝子を含んでいてもよい。また、前記遺伝子として、メチオニン生合成における抑制活性が低減した、エシェリヒア・コリ由来のＬ−メチオニン生合成に関与するリプレッサータンパク質をコードする変異型metJ遺伝子（特開2000-157267）が挙げられる。さらに、前記遺伝子として、アルギニンレギュロン、好ましくはＬ−アルギニンによるフィードバック阻害が解除されたＮ−アセチルグルタミン酸シンターゼをコードする遺伝子を含むアルギニンレギュロン（Rajagopal B.S. et al, Appl. Environ. Microbiol., 1998, v.64, No.5, p.1805-1811）が挙げられる。

本発明の方法は、第一の本発明の細菌を培地に培養し、Ｌ−スレオニンを培地中に生成、蓄積させるステップと、該培地からＬ−スレオニンを採取するステップを含むＬ−スレオニンの製造法を含む。また、本発明の方法は、本発明の細菌を培地に培養し、Ｌ−バリンを培地中に生成、蓄積させるステップと、該培地からＬ−バリンを採取するステップを含むＬ−バリンの製造法を含む。また、本発明の方法は、第一の本発明の細菌を培地に培養し、Ｌ−プロリンを培地中に生成、蓄積させるステップと、該培地からＬ−プロリンを採取するステップを含むＬ−プロリンの製造法を含む。また、本発明の方法は、本発明の細菌を培地に培養し、Ｌ−ロイシンを培地中に生成、蓄積させるステップと、該培地からＬ−ロイシンを採取するステップを含むＬ−ロイシンの製造法を含む。また、本発明の方法は、本発明の細菌を培地に培養し、Ｌ−メチオニンを培地中に生成、蓄積させるステップと、該培地からＬ−メチオニンを採取するステップを含むＬ−メチオニンの製造法を含む。

また、本発明の方法は、第二の本発明の細菌を培地に培養し、Ｌ−スレオニンを培地中に生成、蓄積させるステップと、該培地からＬ−スレオニンを採取するステップを含むＬ−スレオニンの製造法を含む。また、本発明の方法は、本発明の細菌を培地に培養し、Ｌ−バリンを培地中に生成、蓄積させるステップと、該培地からＬ−バリンを採取するステップを含むＬ−バリンの製造法を含む。

さらに、本発明の方法は、第三の本発明の細菌を培地に培養し、Ｌ−アルギニンを培地中に生成、蓄積させるステップと、該培地からＬ−アルギニンを採取するステップを含むＬ−アルギニンの製造法を含む。また、本発明の方法は、本発明の細菌を培地に培養し、Ｌ−プロリンを培地中に生成、蓄積させるステップと、該培地からＬ−プロリンを採取するステップを含むＬ−プロリンの製造法を含む。

本発明における細菌の培養および培養液からのＬ−アミノ酸の採取、精製等は、従来の微生物を用いた発酵法によるアミノ酸の製造法と同様にして行えばよい。培養に使用する培地としては、炭素源、窒素源、無機物を含有し、必要があれば使用微生物が生育に要求する栄養素を適当量含有するものであれば、合成培地でも天然培地でもよい。炭素源としては、グルコースやシュークロースをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸が挙げられる。また使用する微生物の資化性によってはエタノールやグリセロール等のアルコールを用いることができる。窒素源としては、アンモニアや硫酸アンモニウム等の各種アンモニウム塩類や、アミン類その他の窒素化合物や、ペプトン、大豆加水分解物、発酵菌体分解物等の天然窒素源を用いることができる。無機物としては、リン酸一カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化カルシウム等が用いられる。

培養は、振盪培養、通気撹拌培養等の好気条件下で行うことが好ましく、培養温度は20〜40℃で、好ましくは30〜38℃の範囲で行う。培養のpHは、通常は5〜9の範囲であり、6.5〜7.2の範囲が好ましい。培養のpHは、アンモニア、炭酸カルシウム、各種酸、各種塩基および緩衝液などによって調整することができる。通常、1〜5日の培養により液体培地中へ目的のＬ−アミノ酸が蓄積する。

培養終了後、培養液から菌体などの固形物を、遠心分離や膜分離法で除去し、イオン交換法、濃縮法、晶析法によって目的のＬ−アミノ酸を採収、精製することができる。

[実施例]
本発明は以下の実施例を用いてさらに詳細に説明される。実施例中アミノ酸は特に記載のない限りＬ−型である。

プラスミドpΔlacZへのb2682、b2683、b1242、又はb3434遺伝子のクローニングb2682およびb2683遺伝子のクローニングには、pΔlacZベクターを用いた。pΔlacZベクターは、pET-22b(+)ベクター（Novagen, Madison, WI, USA）の誘導体である。pET-22b(+)は、BglIIおよびXbaIで処理し、同じ酵素で処理したP_lacUV5プロモーターを保持するプラスミドpMB9-lac（Fuller F., Gene, 19, 43-54, 1982）のポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）による増幅断片と連結した。配列番号７および８に記載の配列を有するプライマーを用いて、P_lacUV5プロモーター断片を増幅した。得られたプラスミドに、pJEL250プラスミド（Dymakova E. et al, Genetika(rus), 35, 2, 181-186, 1999）のSalI-BamHI断片をクローニングすることにより、lacZ遺伝子の構造部分（プロモーターを含まない237bp）を追加した。pΔlacZベクターの取得手順を、図１に示す。

エシェリヒア・コリTG1株のＤＮＡを鋳型として用いて得られたＰＣＲ断片を出発材料として、エシェリヒア・コリのb2682およびb2683の推定上のリーディングフレーム（b2682およびb2683遺伝子）をクローニングした。この断片の合成には、配列番号１および２記載の配列を有する２つのプライマーを用いた。ＰＣＲは、"Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2400"で以下の条件；95℃ 40秒、47℃ 40秒、72℃ 40秒、30サイクルで行った。このようにして、1158bpのb2682およびb2683遺伝子を含む直鎖ＤＮＡ断片が得られた。このＰＣＲ断片を制限酵素XbaIおよびBamHIで処理し、事前に同じ制限酵素で処理したpΔlacZマルチコピーベクターに挿入した。

得られたＰＣＲ断片を有するプラスミドは、pYGAZHと名付けた。このプラスミドは、ラクトースプロモーター（P_lacUV5）の制御下にb2682およびb2683両遺伝子を有する。

同様にして、エシェリヒア・コリTG1株のＤＮＡを鋳型として用いて得られたＰＣＲ断片を出発材料として、エシェリヒア・コリのb1242の推定上のリーディングフレーム（b1242遺伝子）をクローニングした。この断片の合成には、配列番号９および１０記載の配列を有する２つのプライマーを用いた。得られたＰＣＲ断片を有するプラスミドは、pYCHEと名付けた。このプラスミドは、ラクトースプロモーター（P_lacUV5）の制御下にb1242遺伝子を有する。また、エシェリヒア・コリTG1株のＤＮＡを鋳型として用いて得られたＰＣＲ断片を出発材料として、エシェリヒア・コリのb3434の推定上のリーディングフレーム（b3434遺伝子）をクローニングした。この断片の合成には、配列番号１３および１４記載の配列を有する２つのプライマーを用いた。得られたＰＣＲ断片を有するプラスミドは、pYHGNと名付けた。このプラスミドは、ラクトースプロモーター（P_lacUV5）の制御下にb3434遺伝子を有する。

エシェリヒア・コリTG1株のアミノ酸およびそのアナログに対する耐性における増幅されたb2682、b2683、b1242、及びb3434遺伝子の効果エシェリヒア・コリTG1（pYGAZH）株、TG1（pYCHE）株、TG1（pYHGN）株および挿入断片を含まないベクターを有するTG1株（コントロール株）を、アンピシリン（100μg/ml）を添加したＬＢ培地中で一晩培養した。全ての菌株を一晩培養したものは、アンピシリン（100μg/ml）およびIPTG（0.5mM）を添加した新鮮なＬＢ培地で25倍に希釈し、37℃、通気下で２時間培養した。対数増殖期培養物は、0.9%塩化ナトリウム溶液で希釈し、約1000個の細胞を、アンピシリン（100μg/ml）、IPTG（0.5mM）およびアミノ酸またはそのアナログを含む固体アダムス培地プレートに接種した。37℃で2〜4日間の培養後、ハイブリッドプラスミドを有するTG1株とコントロールのTG1株との間のコロニーの大きさ、およびコロニー数についての差違を記録した。実験結果を表１に示す。

プラスミドpYGAZHを保持する菌株によるスレオニンの製造スレオニン生産菌であるVL2054を、P_lacUV5プロモーターの制御下にb2682およびb2683両遺伝子を含むpYGAZHで形質転換した。得られた菌株は、VL2054（pYGAZH）と名付けた。VL2054株は、VKPM B-3996株の誘導体であり、その染色体上に、(a)P_Rプロモーターの制御下に組み込まれたスレオニンオペロン、(b)野生型rhtA遺伝子、(c)Tn5中の不活性化トランスヒドロゲナーゼをコードする染色体上の遺伝子（tdh遺伝子）および不活性化カナマイシン耐性遺伝子（kan遺伝子）（tdh::Tn5，Kan^S）、(d)変異型ilvA₄₄₂、を、保持している。

VL2054株は、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms）（住所：1, Dorozhny Proezd., 1, 113545, Moscow, Russia）(VKPM)に、2001年1月30日にVKPM B-8067の寄託番号で寄託され、2002年2月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管されている。VL2054株、挿入断片を含まないプラスミドを有するコントロール株としてのVL2054（pΔlacZ）株およびVL2054(pYGAZH)株からそれぞれ５つのコロニーを、20mlの試験管
中の2mlの最小培地（（NH₄)₂SO₄ 11g/l ; NaCl 0.4g/l ; MgSO₄ 0.4g/l ; K₂HPO₄ 1g/l ;
FeSO₄ 10mg/l ; MnSO₄ 10mg/l ; チアミン 0.1mg/l ; イーストエキストラクト 0.5g/l ; グルコース 40g/l ; アンピシリン 300mg/l（必要な場合））に懸濁し、32℃、通気下で一晩培養した。一晩培養した培養物は、IPTGを含むか、又は含まない新鮮な発酵培地2mlを入れた３つの20ml試験管に、0.2mlずつ移し、32℃で45または70時間、ロータリーシェーカーで培養した。

発酵培地の組成(NH₄)₂SO₄ 22 g/lNaCl 0.8 g/lMgSO₄ 0.8 g/lK₂HPO₄ 2 g/lFeSO₄ 20 mg/lMnSO₄ 20 mg/lチアミン 0.2 mg/lイーストエキストラクト 1 g/lCaCO₃ 30 g/lグルコース
80 g/lアンピシリン 300 mg/l（必要な場合）
IPTG 0.5 mM（必要な場合）

培養終了後、プラスミドの安定性と540nmにおける培地の吸光度を従来法で決定した。培地中のスレオニンの蓄積量は、薄層クロマトグラフィー(TLC)により決定した。TLC用の液層の組成は以下の通りである : イソプロパノール 50ml、アセトン 50ml、NH₄OH(30%) 12ml、H₂O 8ml。結果を、表２に示す。ハイブリッドプラスミドpYGAZHが、スレオニン生産菌株であるVL2054のスレオニンの蓄積を改良したことが分かる。

プラスミドpYGAZHを保持する菌株によるバリンの製造バリン生産株であるH-81は、P_lacUV5プロモーターの制御下にb2682およびb2683両遺伝子を有するプラスミドpYGAZHで形質転換した。H-81株は、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM)（住所：1,Dorozhny Proezd., 1, 113545, Moscow, Russia）に、2001年1月31日にVKPM B-8066の寄託番号で寄託され、2002年2月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管されている。

H-81株、挿入断片を含まないプラスミドを有するコントロール株としてのH-81（pΔlacZ）株およびH-81(pYGAZH)株からそれぞれ５つのコロニーを、20mlの試験管中の2mlの最小培地（（NH₄)₂SO₄ 18g/l ; K₂HPO₄ 1.8g/l ; MgSO₄ 1.2g/l ;チアミン 0.1mg/l ; イーストエキストラクト 0.5g/l ; グルコース 60g/l ;アンピシリン 300mg/l（必要な場合））に懸濁し、32℃、通気下で一晩培養した。一晩培養した培養物は、IPTGを含むか、又は含まない新鮮な発酵培地2mlを入れた３つの20ml試験管に0.2mlずつ移し、32℃で45または70時間、ロータリーシェーカーで培養した。

発酵培地の組成(NH₄)₂SO₄ 18 g/lK₂HPO₄ 1.8 g/lMgSO₄ 1.2 g/lCaCO₃ 20 g/lチアミン 0.1 mg/lグルコース 60 g/lアンピシリン 300 mg/l（必要な場合）
IPTG 0.5 mM（必要な場合）

培養終了後、プラスミドの安定性と540nmにおける培地の吸光度を従来法で決定した。培地中のバリンの蓄積量は、TLCにより決定した。TLC用の液層の組成は以下の通りである :
イソプロパノール 80ml、酢酸エチル 80ml、NH₄OH(30%) 15ml、H₂O 45ml。結果を、表３に示す。ハイブリッドプラスミドpYGAZHが、バリン生産菌株であるH-81株のバリンの蓄積を改良したことが分かる。

[参考例１]
ilvA欠損Ｌ−プロリン生産株によるＬ−プロリンの製造野生型エシェリヒア・コリK12株（VKPM B-7）を、変異剤Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（0.1mg/ml）で、３７℃で２０分間処理した後、洗浄し、トリプトン 1.25 mg/ml、Ｌ−プロリン 10
mg/ml、および２，３，５−トリフェニル塩化テトラゾリウム 0.05 mg/mlを添加したＭ９最小寒天培地上で培養した。３７℃での培養３日目以降に出現したコロニーの多くは、赤色であった。Ｌ−プロリンを酸化できないいくつかのコロニーが白色であった。このようなコロニーのうちの一つを親株として用い、プロリンアナログ（３，４−デヒドロキシプロリンおよびアザチジン−２−カルボキシレート）に対して耐性の変異株を得た。Ｍ９寒天培地に、プロリンアナログは、それぞれ、2 mg/mlの濃度で加えた。

出現した変異株のうちのいくつかがＬ−プロリンを生産した。最も優れたＬ−プロリン生産株である702を、ilvA遺伝子がクロラムフェニコール（Cm）耐性（Cm^r）遺伝子の挿入により破壊されているTG1株の細胞上で培養したＰ１バクテリオファージで処理した。得られたCm耐性形質導入株のうちの一つである702ilvAは、Ｌ−イソロイシン栄養要求株となり、Ｌ−イソロイシン原栄養株である親株702株と比べ、非常に効果的なＬ−プロリン生産株となった（表４）。発酵培地の組成は、以下のものを含む：グルコース 60g/l、硫酸アンモニウム 25g/l、KH₂PO₄ 2 g/l、MgSO₄ 1 g/l、チアミン 0.1mg/l、Ｌ−イソロイシン 50mg/l、炭酸カルシウム 25g/l（pH 7.2）。グルコースと炭酸カルシウムは別々に滅菌した。培地2 mlを試験管に入れ、試験する微生物を一白金耳殖菌し、３７℃で２日間振とう下で培養した。

702および702ilvA株は、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms）(VKPM) に、2000年7月25日にVKPM B-8011およびVKPM B-8012の寄託番号でそれぞれ寄託されている。

プラスミドpYGAZHを保持する菌株によるプロリンの製造プロリン生産菌であるエシェリヒア・コリ702ilvAを、P_lacUV5プロモーターの制御下にb2682およびb2683両遺伝子を有するpYGAZHで形質転換した。

702ilvA株、挿入断片を含まないプラスミドを有するコントロール株としての702ilvA（pΔlacZ）株および702ilvA(pYGAZH)株からそれぞれ５つのコロニーを、20mlの試験管中の2mlの最小培地（（NH₄)₂SO₄ 18 g/l ; K₂HPO₄ 1.8 g/l ; MgSO₄ 1.2 g/l ; チアミン 0.1 mg/l ; イーストエキストラクト 0.5 g/l ; グルコース 60 g/l ; イソロイシン 50 mg/l
; アンピシリン 300 mg/l（必要な場合））に懸濁し、32℃、通気下で一晩培養した。一晩培養した培養物は、IPTGを含むか、又は含まない新鮮な発酵培地2mlを入れた３つの20ml試験管に0.2mlずつ移し、32℃で40時間、ロータリーシェーカーで培養した。

（発酵培地の組成）
(NH₄)₂SO₄ 18 g/lK₂HPO₄ 1.8 g/lMgSO₄ 1.2 g/lCaCO₃ 20 g/lチアミン 0.1 mg/lグルコース 60 g/lイソロイシン 50 mg/lアンピシリン 300 mg/l（必要な場合）
IPTG 0.5 mM （必要な場合）

培養終了後、プラスミドの安定性と540nmにおける培地の吸光度を従来法で決定した。培地中のプロリンの蓄積量は、薄層クロマトグラフィー(TLC)により決定した。TLC用の液層の組成は以下の通りである : エタノール 80ml、NH₄OH(30%) 5ml、H₂O 25ml。結果を、表５に示す。ハイブリッドプラスミドpYGAZHが、プロリン生産菌株である702ilvAのプロリンの蓄積を改良したことが分かる。

[参考例２]
ilvE欠損Ｌ−ロイシン生産株によるＬ−ロイシンの製造野生型エシェリヒア・コリK12株（VKPM B-7）を、変異剤Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（0.05 mg/ml）で、３７℃で２０分間処理した後、生理食塩水で４回洗浄し、ＤＬ−４−アザロイシン 4 mg/mlを添加したＭ９最小寒天培地上で、３７℃で５日間培養した。プレート上に出現したコロニーを拾い、Ｌ−寒天培地上にストリークして単離した。得られたＤＬ−４−アザロイシンに対して耐性の変異株のうちの一つを用いて、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−バリン二重栄養要求性の誘発を行った。Ｌ−イソロイシンおよびＬ−バリンを生育に必要とする二重栄養要求性株が多数得られた。このことにより、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−バリン栄養要求性は、ilvE遺伝子における変異により引き起こされたことが示された。得られた二重栄養要求株のうち、最も優れたＬ−ロイシン生産株であり、Ｌ−ロイシンを1.8 g/l生産する505株を選択した。発酵培地の組成は以下のものを含む：グルコース 60g/l、硫酸アンモニウム 25g/l、KH₂PO₄2 g/l、MgSO₄ 1 g/l、チアミン 0.1mg/l、Ｌ−イソロイシン 100 mg/l、Ｌ−バリン 100 mg/l、炭酸カルシウム 25g/l（pH 7.2）。グルコースと炭酸カルシウムは別々に滅菌した。培地2 mlを試験管に入れ、試験する微生物を一白金耳殖菌し、３７℃で２日間振とう下で培養した。

エシェリヒア・コリ505株は、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms）（住所：1, Dorozhny Proezd., 1, 113545, Moscow, Russia）(VKPM) に、2001年5月14日にVKPM B-8124の寄託番号で寄託され、2002年2月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管されている。

プラスミドpYGAZHを保持する菌株によるロイシンの製造ロイシン生産菌であるエシェリヒア・コリ505を、P_lac UV5プロモーターの制御下にb2682およびb2683両遺伝子を有するpYGAZHで形質転換した。

505株、挿入断片を含まないプラスミドを有するコントロール株としての505（pΔlacZ）株および505(pYGAZH)株からそれぞれ20個コロニーを、を20mlの試験管中のアンピシリンを含むか、又は含まないＬＢ培地に白金耳で移し、32℃、通気下で一晩培養した。一晩培養した培養物は、IPTGを含むか、又は含まない発酵培地2mlを入れた20ml試験管に0.1mlず
つ移し、32℃で72時間、ロータリーシェーカーで培養した。

（発酵培地の組成）
(NH₄)₂SO₄ 15 g/lK₂HPO₄ 1.5 g/lMgSO₄・7H₂O 1.0 g/lCaCO₃ 20 g/l (個別に滅菌)チアミン 0.1 mg/lグルコース 60 g/l (個別に滅菌)イソロイシン 0.3 g/lバリン 0.3 g/lアンピシリン 150 mg/l（必要な場合）
IPTG 0.5 mM（必要な場合）

培養終了後、プラスミドの安定性を従来法で決定した。培地中のロイシンの蓄積量は、TLCにより決定した。TLC用の液層の組成は以下の通りである : イソプロパノール 80 ml、酢酸エチル 80 ml、NH₄OH(30%) 25 ml、H₂O 50 ml。結果を、表６に示す。ハイブリッドプラスミドpYGAZHが、ロイシン生産菌株である505株のロイシンの蓄積を改良したことが分かる。

[参考例３]
ノルロイシン耐性Ｌ−メチオニン生産株によるＬ−メチオニンの製造プラスミドを持たないスレオニンおよびロイシン欠損株であるエシェリヒア・コリC600株を親株として用いた。まず、エシェリヒア・コリC600株のLeu⁺変異株は、エシェリヒア・コリK-12株上で培養させたＰ１ファージの形質導入により得られた。Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（NTG）による処理の後、8 g/lのＬ−ホモセリンに対して耐性の変異株である44株が得られた。44株はＬ−スレオニン欠損性であり、高濃度のＬ−スレオニンに耐性である。44株は、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms）(VKPM) に、VKPM B-2175の寄託番号で寄託されている。

メチオニンアナログであるノルロイシンに耐性の変異株を、NTGを用いた変異誘発により44株から誘発した。ＬＢ培地中で一晩培養して生育させた細菌の培養物を遠心分離し、NTG
50mg/mlを含む生理食塩水（0.9% NaCl）中に再懸濁した。３７℃で３０分間NTGに曝した後、細菌を遠心分離し、生理食塩水で４回洗浄し、スレオニン 0.5 mg/ml、およびノルロイシン 2.5 mg/mlまたは5.0 mg/mlを含むM9最小培地上で培養した。プレートを３７℃で５日間インキュベートした。プレート上に出現したコロニーを拾い、Ｌ−寒天培地上にストリークして単離した。それらのうち最も優れたＬ−メチオニン生産株は218株であった。新規な218株の試験管培養を３２℃で３日間振とう下で行った結果、約1 g/lのＬ−メチ
オニンが培地中に蓄積された。発酵培地として、4% グルコース、2.5% 硫酸アンモニウム、0.5 g/l スレオニン、25 g/l 炭酸カルシウムを含むＭ９最小培地を用いた。グルコースと炭酸カルシウムは別々に滅菌した。

218株は、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms）(VKPM) に、2001年5月14日にVKPM B-8125の寄託番号で寄託され、2002年2月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管されている。

さらに、218株のppc遺伝子をＰ１ファージを用いて欠失させ、続いて、バチルス・サブチリス由来のpycA遺伝子を組込んだ（ロシア特許出願99121636）。得られた218pycA株はノルロイシンに対する耐性を失った。したがって、ノルロイシンに対する耐性は、上記記載の様にして同株に再度付与された。得られた株のうち、最も優れたＬ−メチオニン生産株は、上記の条件下で約1 g/lのＬ−メチオニンを生産するエシェリヒア・コリ73株であった。

エシェリヒア・コリ73株は、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms）（住所：1, Dorozhny Proezd., 1, 113545, Moscow,Russia）(VKPM) に、2001年5月14日にVKPM B-8126の寄託番号で寄託され、2002年2月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管されている。

プラスミドpYGAZHを保持する菌株によるメチオニンの製造メチオニン生産菌であるエシェリヒア・コリ73株を、P_lac UV5プロモーターの制御下にb2682およびb2683両遺伝子を有するpYGAZHで形質転換した。

73株、挿入断片を含まないプラスミドを有するコントロール株としての73（pΔlacZ）株および73(pYGAZH)株からそれぞれ５つのコロニーを、20mlの試験管中の2mlの最小培地（(NH₄)₂SO₄ 18 g/l ; K₂HPO₄ 1.8 g/l ; MgSO₄ 1.2 g/l ; チアミン 0.1 mg/l ; イーストエキストラクト 10 g/l ; グルコース 60g/l ; スレオニン 400 mg/l ; アンピシリン 300 mg/l（必要な場合））に懸濁し、32℃、通気下で一晩培養した。一晩培養した培養物は、IPTGを含むか、又は含まない新鮮な発酵培地2mlを入れた３つの20ml試験管に0.2mlずつ移し、32℃で48時間、ロータリーシェーカーで培養した。

（発酵培地の組成）
(NH₄)₂SO₄ 18 g/lK₂HPO₄ 1.8 g/lMgSO₄ 1.2 g/lCaCO₃ 20 g/lチアミン 0.1 mg/lグルコース 60 g/lスレオニン 400 mg/lイーストエキストラクト 1.0 g/lアンピシリン 300 mg/l（必要な場合）
IPTG 0.5 mM（必要な場合）

培養終了後、プラスミドの安定性と540nmにおける培地の吸光度を従来法で決定した。培地中のメチオニンの蓄積量は、TLCにより決定した。TLC用の液層の組成は以下の通りである : イソプロパノール 80 ml、酢酸エチル 80 ml、NH₄OH(30%) 15 ml、H₂O 45 ml。結果を、表７に示す。ハイブリッドプラスミドpYGAZHが、メチオニン生産菌株である73株のメチオニンの蓄積を改良したことが分かる。

プラスミドpYCHEを保持する菌株によるスレオニンの製造スレオニン生産菌であるVL2054株を、P_lacUV5プロモーターの制御下にb1242遺伝子を有するプラスミドpYCHEで形質転換した。得られた菌株は、VL2054（pYCHE）と名付けた。

VL2054株、挿入断片を含まないプラスミドを有するコントロール株としてのVL2054（pΔlacZ）株およびVL2054(pYCHE)株からそれぞれ５つのコロニーを、20mlの試験管中の2mlの最小培地（（NH₄)₂SO₄ 11g/l ; NaCl 0.4g/l ; MgSO₄ 0.4g/l; K₂HPO₄ 1g/l ; FeSO₄ 10mg/l ; MnSO₄ 10mg/l ; チアミン 0.1mg/l ; イーストエキストラクト 0.5g/l ; グルコース 40g/l ; アンピシリン 300mg/l（必要な場合））に懸濁し、32℃、通気下で一晩培養した。一晩培養した培養物は、IPTGを含むか、又は含まない新鮮な発酵培地2mlを入れた３つの20ml試験管に0.2mlずつ移し、32℃で45時間、ロータリーシェーカーで培養した。

（発酵培地の組成）
(NH₄)₂SO₄ 22 g/lNaCl 0.8 g/lMgSO₄ 0.8 g/lK₂HPO₄ 2 g/lFeSO₄ 20 mg/lMnSO₄ 20 mg/lチアミン 0.2 mg/lイーストエキストラクト 1 g/lCaCO₃ 30 g/lグルコース 80 g/lアンピシリン 300 mg/l（必要な場合）
IPTG 0.5 mM（必要な場合）

培養終了後、プラスミドの安定性と540nmにおける培地の吸光度を従来法で決定した。培地中のスレオニンの蓄積量は、薄層クロマトグラフィー（TLC）により決定した。TLC用の液層の組成は以下の通りである : イソプロパノール 50 ml、アセトン 50 ml、NH₄OH(30%) 12 ml、H₂O 8 ml。結果を、表８に示す。ハイブリッドプラスミドpYCHEが、スレオニン生産菌株であるVL2054株のスレオニンの蓄積を改良したことが分かる。

プラスミドpYCHEを保持する菌株によるバリンの製造バリン生産菌であるH-81株を、P_lac UV5プロモーターの制御下にb1242遺伝子を有するプラスミドpYCHEで形質転換した。H-81株、挿入断片を含まないプラスミドを有するコントロール株としてのH-81（pΔlacZ）株およびH-81(pYCHE)株からそれぞれ５つのコロニーを、20mlの試験管中の2mlの最小培地（（NH₄)₂SO₄ 18 g/l ; K₂HPO₄ 1.8 g/l ; MgSO₄ 1.2 g/l; チアミン 0.1 mg/l ; イーストエキストラクト 0.5 g/l ; グルコース 60 g/l; アンピシリン 300 mg/l（必要な場合））に懸濁し、32℃、通気下で一晩培養した。一晩培養した培養物は、IPTGを含むか、又は含まない新鮮な発酵培地2mlを入れた３つの20ml試験管に0.2mlずつ移し、32℃で45時間、ロータリーシェーカーで培養した。

（発酵培地の組成）
(NH₄)₂SO₄ 18 g/lK₂HPO₄ 1.8 g/lMgSO₄ 1.2 g/lCaCO₃ 20 g/lチアミン 0.1 mg/lグルコース 60 g/lアンピシリン 300 mg/l（必要な場合）
IPTG 0.5 mM（必要な場合）

培養終了後、プラスミドの安定性と540nmにおける培地の吸光度を従来法で決定した。培地中のバリンの蓄積量は、TLCにより決定した。TLC用の液層の組成は以下の通りである :
イソプロパノール 80 ml、酢酸エチル 80 ml、NH₄OH(30%)15 ml、H₂O 45 ml。結果を、表９に示す。ハイブリッドプラスミドpYCHEが、バリン生産菌株であるH-81株のバリンの蓄積を改良したことが分かる。

プラスミドpYHGNを保持する菌株によるアルギニンの製造アルギニン生産菌である382株を、P_lac UV5プロモーターの制御下にb3434遺伝子を有するプラスミドpYHGNで形質転換した。382株は、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms）（住所：1, Dorozhny Proezd., 1, 113545, Moscow, Russia）(VKPM)に、2000年4月10日にVKPM B-7926の寄託番号で寄託されている。

382株、挿入断片を含まないプラスミドを有するコントロール株としての382（pΔlacZ）株および382(pYHGN)株からそれぞれ５つのコロニーを、20mlの試験管中の2mlの最小培地（（NH₄)₂SO₄ 25 g/l ; K₂HPO₄ 2.0 g/l ; MgSO₄ 7H₂O 1.0 g/l ; チアミン 0.2 mg/l ; イーストエキストラクト 5 g/l ; グルコース 60 g/l ; アンピシリン 100 mg/l（必要な場合））に懸濁し、32℃、通気下で一晩培養した。一晩培養した培養物は、IPTGを含むか、又は含まない新鮮な発酵培地2mlを入れた３つの20ml試験管に0.2mlずつ移し、32℃で72時間、ロータリーシェーカーで培養した。

（発酵培地の組成）
(NH₄)₂SO₄ 25 g/lK₂HPO₄ 2.0 g/lMgSO₄・7H₂O 1.0 g/lチアミン 0.2 mg/lイーストエキストラクト 5 g/lグルコース 60 g/lCaCO₃ 20 g/lアンピシリン 100 mg/l（必要な場合）
IPTG 0.5 mM（必要な場合）

培養終了後、プラスミドの安定性と540nmにおける培地の吸光度を従来法で決定した。培地中のアルギニンの蓄積量は、TLCにより決定した。TLC用の液層の組成は以下の通りである : イソプロパノール 80 ml、酢酸エチル 40 ml、NH₄OH(30%) 25 ml、H₂O 50 ml。結果を、表１０に示す。ハイブリッドプラスミドpYHGNが、アルギニン生産菌株である382株のアルギニンの蓄積を改良したことが分かる。

プラスミドpYHGNを保持する菌株によるプロリンの製造プロリン生産菌であるエシェリヒア・コリ702ilvAを、P_lac UV5プロモーターの制御下にb3434遺伝子を有するプラスミドpYHGNで形質転換した。

702ilvA株、挿入断片を含まないプラスミドを有するコントロール株としての702ilvA（pΔlacZ）株および702ilvA(pYHGN)株からそれぞれ５つのコロニーを、20mlの試験管中の2mlの最小培地（（NH₄)₂SO₄ 18 g/l ; K₂HPO₄ 1.8 g/l ; MgSO₄１．２ 1.2g/l ; チアミン 0.1 mg/l ; イーストエキストラクト 0.5 g/l ; グルコース 60 g/l ; イソロイシン 50 mg/l ; アンピシリン 300 mg/l（必要な場合））に懸濁し、32℃、通気下で一晩培養した。一晩培養した培養物は、IPTGを含むか、又は含まない新鮮な発酵培地2mlを入れた３つの20ml試験管に0.2mlずつ移し、32℃で40時間、ロータリーシェーカーで培養した。

（発酵培地の組成）
(NH₄)₂SO₄ 18 g/lK₂HPO₄ 1.8 g/lMgSO₄ 1.2 g/lCaCO₃ 20 g/lチアミン 0.1 mg/lグルコース 60 g/lイソロイシン 50 mg/lアンピシリン 300 mg/l（必要な場合）
IPTG 0.5 mM（必要な場合）

培養終了後、プラスミドの安定性と540nmにおける培地の吸光度を従来法で決定した。培地中のプロリンの蓄積量は、TLCにより決定した。TLC用の液層の組成は以下の通りである
: エタノール 80 ml、NH₄OH(30%) 5 ml、H₂O 25 ml。結果を、表１１に示す。ハイブリッドプラスミドpYHGNが、プロリン生産菌株である702ilvA株のプロリンの蓄積を改良したことが分かる。

プラスミドpΔlacZの構築を示す図。

Claims

エシェリヒア属細菌を培地中に培養し、生成、蓄積されたＬ−スレオニンおよびＬ−バリンからなる群より選択されるＬ−アミノ酸を該培地中から採集する、Ｌ−スレオニンおよびＬ−バリンからなる群より選択されるＬ−アミノ酸の製造法であって、前記エシェリヒア属細菌は、前記Ｌ−アミノ酸の生産能を有するエシェリヒア属細菌であって、同細菌の細胞内において以下の（Ｅ）または（Ｆ）に記載のタンパク質の発現量が、該タンパク質をコードするＤＮＡで前記細菌を形質転換するか、または、前記細菌の染色体上の前記ＤＮＡを強力なプロモーターの制御下に置くことによりエシェリヒア属細菌の非改変株と比較して増強したエシェリヒア属細菌であることを特徴とする前記Ｌ−アミノ酸の製造法。（Ｅ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、または、（Ｆ）配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含み、かつ、エシェリヒア属細菌のＤＬ−ｏ−メチルセリン及びホモセリンに対する耐性をエシェリヒア属細菌の非改変株と比較して増強させる活性を有するタンパク質。
前記形質転換はマルチコピーベクターを用いて行われた請求項１に記載の前記Ｌ−アミノ酸の製造法。