KR102270626B1 - 메티오닌 신타제 활성 및 메티오닌 유출이 개선된 메티오닌 생산용 미생물 - Google Patents

메티오닌 신타제 활성 및 메티오닌 유출이 개선된 메티오닌 생산용 미생물 Download PDF

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Abstract

본 출원은 메티오닌 및/또는 그의 유도체의 발효적 생산을 위해 최적화된 재조합 미생물이며, 상기 재조합 미생물에서, 코발라민-의존성 메티오닌 신타제 활성 및 메티오닌 유출이 증진되는 것인 재조합 미생물에 관한 것이다. 본 출원은 또한 c. 재조합 미생물을 배양하며, 여기서 상기 미생물에서, 탄소의 발효성 공급원 및 황의 공급원을 포함하는 적절한 배양 배지에서 코발라민-의존성 메티오닌 신타제 활성 및 메티오닌 유출은 증진되는 것인 단계, 및 d. 배양 배지로부터 메티오닌 및/또는 그의 유도체를 회수하는 단계를 포함하는, 메티오닌 및/또는 그의 유도체의 발효적 생산을 최적화하기 위한 방법에 관한 것이다.

Description

메티오닌 신타제 활성 및 메티오닌 유출이 개선된 메티오닌 생산용 미생물 {MICROORGANISM FOR METHIONINE PRODUCTION WITH IMPROVED METHIONINE SYNTHASE ACTIVITY AND METHIONINE EFFLUX}
본 발명은 L-메티오닌 및/또는 그의 유도체의 생산에 유용한 재조합 미생물 및 L-메티오닌의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 미생물은 L-메티오닌 생산이 그의 코발라민-의존성 메티오닌 신타제 활성 뿐만 아니라 그의 L-메티오닌 엑스포트를 증진시킴으로써 개선되는 방식으로 변형된다. 특히, 유전자 metH, fldA, fpr 또는 그의 상동 유전자 및 유전자 ygaZ 및 ygaH 또는 그의 상동 유전자는 미생물에서 과다발현된다.
황-함유 화합물, 예컨대 시스테인, 호모시스테인, 메티오닌 또는 S-아데노실메티오닌은 세포 대사에 중대하다. 특히 동물에 의해 합성될 수 없는 필수 아미노산인 L-메티오닌은 많은 신체 기능에서 중요한 역할을 한다. 산업적으로 생산된 대부분의 메티오닌은 동물 사료 및 식품 첨가제로서 광범위하게 사용된다.
BSE 및 조류 독감의 결과로서 동물-유래 단백질의 사용이 감소되면서, 순수 메티오닌에 대한 수요가 증가된 바 있다. 통상적으로, D,L-메티오닌은 아크롤레인, 메틸 메르캅탄 및 시안화수소로부터 화학적으로 생산된다. 그러나, 라세미 혼합물은 순수 L-메티오닌만큼 기능하지 않는다 (Saunderson, 1985). 추가적으로, 순수 L-메티오닌이 예를 들어, N-아세틸-D,L-메티오닌의 아실라제 처리를 통해 라세미 메티오닌으로부터 생산될 수 있음에도 불구하고, 이는 생산 비용을 극적으로 증가시킨다. 이에 따라, 환경적 관심과 결부된 순수 L-메티오닌에 대한 증가하는 수요가 메티오닌의 미생물 생산을 매력적인 전망으로 만든다.
다른 중요한 아미노산, 예컨대 리신, 트레오닌 및 트립토판은 동물 사료에 사용하기 위해 발효를 통해 생산된다. 따라서, 이들 아미노산은 출발 물질로 글루코스 및 다른 재생가능한 자원을 사용하여 제조될 수 있다. 발효를 통한 L-메티오닌의 생산은 아직 성공적이지 않았으나, 기술의 개발은 계속 진행중이다.
미생물에서 L-메티오닌 생산의 최적화를 위한 상이한 접근법은 이전에 기재된 바 있지만 (예를 들어, 특허 또는 특허 출원 US7,790,424, US7,611,873, WO2002/10209, WO2005/059093 및 WO2006/008097 참조); 그러나, 미생물로부터의 L-메티오닌의 산업적 생산은 추가 개선을 요구한다.
에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서, 2종의 별개의 효소가 메티오닌의 신생 생합성에서 말단 단계에 촉매하고; 상기 효소는 활성에 요구되는 보결분자단을 함유하는 코발라민-의존성 메티오닌 신타제 (MetH, EC 2.1.1.13), 및 코발라민-비의존성 메티오닌 신타제 (MetE, EC 2.1.1.14)이다 (Foster et al., 1961; Gonzalez et al., 1992). 코발라민-의존성 메티오닌 신타제, MetH는 4종의 도메인을 함유하는 ~136 kDa의 단백질이다: 코발라민 보조인자를 함유하는 도메인 (Cob 도메인), 메틸-THF 기질에 결합하는 도메인 (CH3-THF 도메인), 호모시스테인 기질에 결합하는 도메인 (Hcy 도메인), 및 S-아데노실-메티오닌 (SAM)에 결합하는 도메인 (Adomet 도메인) (Matthews, 2001). 산소의 존재 하에, 효소는 산화에 의해 불활성화된다 (Banerjee et al., 1990). 효소를 재활성화시키기 위해, 환원성 메틸화가 발생한다. 반응은 효소의 AdoMet 도메인에 결합된 SAM에 의해 제공된 메틸 기, 및 외부 수송 쇄를 통해 전달된 2개의 전자를 수반한다. 2개의 전자는 에스케리키아 콜라이 내에서 NADPH에 의해 제공되고 FAD-함유 플라보독신 리덕타제, FldA 및 FMN-함유 플라보독신 리덕타제, Fpr로 구성된 내리막 전위 구동 산화환원 쇄 (Fujii & Huennekens, 1974; Wan & Jarrett, 2002)를 통해 전달된다. 특허 출원 WO2009/144270에 개시된 바와 같이, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)에서, FldA 및 Fpr의 기능적 상동체가 확인된 바 있다. 이들은 각각 FdxC, FdxD 또는 FdxA 및 FprA1, FprA2, FprA3 또는 FldR1이다.
단백질 복합체 YgaZ 및 YgaH는 L-발린의 엑스포트를 담당하는 분지쇄 아미노산 엑스포터 (LIV-E) 패밀리의 구성원이다. 동일한 방식에서, YgaZH는 또한 이것이 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 YgaZH의 상동체인 BrnFE에 대해 트뢰첼(Troetschel) 및 동료에 의해 제시된 바와 같이 메티오닌의 엑스포트에 수반된다 (Troetschel et al., 2005).
수많은 특허 출원이 L-메티오닌을 생산하기 위한 상이한 수단에 의해 메티오닌 신타제 활성의 개선에 대해 출원되었다:
- 바스프(BASF)로부터의 WO2007/012078 및 WO2007/135188은 다른 변형 중에서 적어도 metH 및/또는 metE의 과다발현으로 이어지는 유전자 변경을 청구하고 있고,
- 에보닉(Evonik)으로부터의 WO2009/144270은 코브(I)알라민-의존성 MetH 재활성화 시스템의 증가된 양 및/또는 활성을 나타내는 미생물로 메티오닌을 생산하는 방법을 개시하고 있고,
- 에보닉으로부터의 WO2008/080900은 높은 L-메티오닌 농도에 보다 더 내성이어야 하는 MetHFBR 형태 (피드백 내성(FeedBack Resistant))를 청구하고 있다.
동일한 방식에서 몇몇 특허가 상이한 미생물에서의 메티오닌 배출 시스템을 코딩하는 유전자의 과다발현을 개시하고 있다:
- 코리네박테리움에서의 L-메티오닌 섭취의 감소는 특허 출원 WO2002/097096 및 WO2005/085463 (데구사(Degussa))에 기재되어 있거나,
- L-발린 및 L-메티오닌의 엑스포트를 담당하는 분지쇄 아미노산 엑스포터 (YgaZH)의 과다발현은 특허 출원 EP1239041 (아지노모토(Ajinomoto)) 및 WO2008/082211 (CJ 코포레이션(CJ Corporation))에 개시되어 있다.
본 발명자들은 재조합 L-메티오닌 과다생산자 미생물에서의 코발라민-의존성 L-메티오닌 신타제 활성의 증진과 함께 L-메티오닌 유출의 증가가 메티오닌 생산을 개선시킨다는 것을 놀랍고도 예상외로 발견하였다.
본 발명은 메티오닌 및/또는 그의 유도체의 생산을 최적화하기 위한 재조합 미생물 및 방법에 관한 것이며, 여기서 코발라민-의존성 메티오닌 신타제 활성 및 메티오닌 유출은 증진된다. 재조합 미생물에서, 코발라민-의존성 메티오닌 신타제 활성은 이. 콜라이(E. coli)로부터의 metH의 발현, 및 임의로 유전자 fldA 및 fpr 또는 씨. 글루타미쿰(C. glutamicum)으로부터의 그의 상동 유전자의 발현을 과다발현함으로써 증진되는 반면, 메티오닌 유출은 이. 콜라이로부터의 유전자 ygaZH 또는 씨. 글루타미쿰으로부터의 brnFE 또는 그의 상동 유전자를 과다발현함으로써 증진된다.
재조합 미생물은 또한 하기와 같은 다른 유전자 변형을 포함할 수 있다:
- 하기 유전자: ptsG, pyc, pntAB, cysP, cysU, cysW, cysA, cysM, cysJ, cysI, cysH, gcvT, gcvH, gcvP, lpd, serA, serB, serC, cysE, metF, metA, S-아데노실메티오닌 및/또는 메티오닌에 대한 감소된 피드백 감수성을 갖는 효소를 코딩하는 metA* 대립유전자, thrA, 또는 트레오닌에 대한 감소된 피드백 억제를 갖는 효소를 코딩하는 thrA* 대립유전자 중 적어도 1종의 증가된 발현 및/또는
- 하기 유전자: metJ, pykA, pykF, purU, ybdL, udhA, dgsA, metE, metN, metI, metQ 또는 yncA 중 적어도 1종의 감쇠된 발현.
특정한 실시양태에서, 본 발명은 a) 이. 콜라이로부터의 유전자 metH, 및 임의로 유전자 fldA 및 fpr 또는 씨. 글루타미쿰으로부터의 그의 상동 유전자가 과다발현되고, b) 이. 콜라이로부터의 유전자 ygaZ 및 ygaH 또는 씨. 글루타미쿰으로부터의 유전자 brnF 및 brnE 또는 시트로박터 코세리(Citrobacter koseri ), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri ), 라오울텔라 오르니티놀리티카(Raoultella ornithinolytica), 엔테로박터(Enterobacter ) 종, 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica ), 포토랍두스 루미네센스(Photorhabdus luminescens ), 시트로박터 요웅가에(Citrobacter youngae ) 또는 시트로박터 프레운디이(Citrobacter freundii )로부터 유래하는 그의 상동 유전자가 과다발현되고, c) 유전자 metA*, cysPUWAM, cysJIH, gcvTHP, metF, serA, serB, serC, cysE, thrA*, ptsG 및 pyc의 발현이 증진되고; d) 유전자 metJ, pykA, pykF, purU, yncA, dgsA 및 metE의 발현이 감쇠되는 것인 재조합 미생물에 관한 것이다.
바람직하게는, 재조합 미생물은 에스케리키아 콜라이 또는 코리네박테리움 글루타미쿰이다.
본 발명을 상세하게 기재하기 전에, 본 발명이 특히 예시된 방법에 제한되지 않으며, 물론 달라질 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 사용된 용어는 오직 본 발명의 특정한 실시양태를 기재할 목적일 뿐이지 제한할 의도는 아니며, 이는 오직 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것으로 또한 이해되어야 한다.
본원에 인용된 모든 공개, 특허 및 특허 출원은, 상기한 것이든 하기한 것이든 관계없이, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
게다가, 본 발명의 실시는 달리 나타내지 않는 한, 관련 기술분야의 기술 내의 통상적인 미생물학 및 분자 생물학 기술을 이용한다. 이러한 기술은 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 문헌에 완전히 설명되어 있다.
본원 및 첨부된 청구항에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 명확히 달리 지시되지 않는 한 복수 지시대상을 포함함에 주목해야 한다. 따라서, 예를 들어, "미생물"에 대한 언급은 복수의 이러한 미생물을 포함하고, "내인성 유전자"에 대한 언급은 1종 이상의 내인성 유전자에 대한 언급 등이다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 발명이 속한 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 물질 및 방법이 본 발명을 실시하거나 시험하는데 사용될 수 있더라도, 바람직한 물질 및 방법이 이제 기재된다.
하기 청구범위 및 발명의 이어지는 설명에서, 언어 또는 필요한 함축을 표현하기 위해 문맥상 달리 필요한 경우를 제외하고는, 단어 "포함하다", "함유하다", "수반하다" 또는 "포괄하다", 또는 "포함한다", "포함하는", "함유하는", "수반되는", "포괄한다", "포괄하는"과 같은 변형은 포괄적 의미로, 즉, 언급된 특징의 존재를 명시하나 본 발명의 다양한 실시양태에서 추가적인 특징의 존재 또는 추가를 배제하지 않도록 사용된다.
용어 "메티오닌" 및 "L-메티오닌"은 화학식 HO2CCH(NH2)CH2CH2SCH3 및 특이적 L-이성질체에 대한 CAS 번호 59-51-8 또는 63-68-3을 갖는 필수 황-함유 아미노산을 지정한다.
"메티오닌의 유도체"는, 동일한 화학적 골격을 나타내나 적어도 1종의 화학적 기가 메티오닌과 다른, 메티오닌과 유사한 분자를 지칭한다. 본 발명에서, 바람직한 메티오닌 유도체는 N-아세틸 메티오닌 (NAM), S-아데노실 메티오닌 (SAM) 및 히드록시-메티오닌 (또는 메티오닌 히드록시 유사체 또는 MHA)이다.
본원에 사용된, 용어 "미생물"은 인공적으로 변형되지 않은 박테리아, 효모, 또는 진균을 지칭한다. 우선적으로, 미생물은 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 바실라세아에(Bacillaceae ), 스트렙토미세타세아에(Streptomycetaceae) 및 코리네박테리아세아에(Corynebacteriaceae ) 중에서 선택된다. 보다 우선적으로, 미생물은 에스케리키아(Escherichia ), 클레브시엘라(Klebsiella), 판토에아(Pantoea ), 살모넬라(Salmonella), 또는 코리네박테리움(Corynebacterium)의 종이다. 보다 더 우선적으로, 본 발명의 미생물은 에스케리키아 콜라이 또는 코리네박테리움 글루타미쿰이다.
본원에 사용된 용어 "재조합 미생물" 또는 "유전자 변형된 미생물"은 자연에서 발견되지는 않으며 자연에서 발견되는 그의 등가물과 유전적으로 상이한 박테리아, 효모 또는 진균을 지칭한다. 이는 이것이 유전적 요소의 도입에 의해, 또는 결실에 의해, 또는 변형에 의해 변형됨을 의미한다. 이는 특이적 선택 압력 하에 지정 돌연변이유발 및 진화를 조합함으로써 신규 대사 경로의 개발 및 진화를 강제함으로써 또한 형질전환될 수 있다 (예를 들어, WO2004/076659 또는 WO2007/011939 참조).
미생물은 외인성 유전자가 숙주 미생물 내에서 이들의 발현을 가능하게 하는 모든 요소를 갖는 미생물 내에 도입되는 경우에 이들 유전자를 발현하도록 변형될 수 있다. 외인성 DNA를 갖는 미생물의 변형 또는 "형질전환"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 상용 과제이다.
미생물은 내인성 유전자의 발현 수준을 조정하도록 변형될 수 있다.
용어 "내인성 유전자"는, 임의의 유전자 변형 전에 유전자가 미생물에 존재하였음을 의미한다. 내인성 유전자는 내인성 조절 요소에 추가적으로 또는 이를 대체하도록 이종 서열을 도입함으로써, 또는 염색체 또는 플라스미드 내로 유전자의 1종 이상의 상보적 카피를 도입함으로써 과다발현될 수 있다. 내인성 유전자는 또한 그의 발현 및/또는 활성을 조정하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 유전자 산물을 변형시키기 위해 코딩 서열 내로 돌연변이가 도입될 수 있거나 또는 내인성 조절 요소에 추가적으로 또는 이를 대체하도록 이종 서열이 도입될 수 있다. 내인성 유전자의 조정은 유전자 산물의 활성 상향-조절 및/또는 증진을 유발할 수 있거나, 또는 대안적으로, 내인성 유전자 산물의 활성을 하향 조절 및/또는 저하시킬 수 있다.
이들의 발현을 조정하는 또 다른 방법은, 내인성 유전자의 발현을 상향 또는 하향 조절하기 위해 유전자의 내인성 프로모터 (예를 들어, 야생형 프로모터)를 보다 강하거나 보다 약한 프로모터로 교환하는 것이다. 이들 프로모터는 상동 또는 이종일 수 있다. 적절한 프로모터를 선택하는 것은 충분히 관련 기술분야의 통상의 기술자의 능력 내에 있다.
대조적으로, "외인성 유전자"는, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 수단에 의해 유전자가 미생물에 도입되었지만 이 유전자가 미생물 내에 자연적으로 발생하지는 않은 것임을 의미한다. 외인성 유전자는 숙주 염색체 내로 통합될 수 있거나, 또는 플라스미드 또는 벡터에 의해 염색체외적으로 발현될 수 있다. 세포 내에서의 그의 복제 기점 및 그의 카피수에 대해 다른, 다양한 플라스미드가 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 이들 유전자는 상동일 수 있다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "상동 유전자"는 이론적 공통 유전적 조상을 갖는 유전자를 지정하는 것으로 제한되지 않으나, 유전적으로 비관련될 수 있음에도 불구하고 유사한 기능을 수행하고/거나 유사한 구조를 갖는 단백질을 코딩하도록 진화한 유전자를 포함한다. 따라서 본 발명의 목적을 위한 용어 "기능적 상동체"는 특정 효소적 활성이 정의된 아미노산 서열의 특이적 단백질에 의해 뿐만 아니라 다른 (비)관련된 미생물로부터의 유사한 서열의 단백질에 의해 제공될 수 있다는 사실에 관한 것이다.
공지된 유전자에 대해 진뱅크(Genbank)에 주어진 참고문헌을 사용하여, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 다른 유기체, 박테리아 균주, 효모, 진균, 포유동물, 식물 등에서 동등한 유전자를 결정할 수 있다. 이 상용 작업은 다른 미생물로부터 유래된 유전자와의 서열 정렬을 수행하고 또 다른 유기체에서 상응하는 유전자를 클로닝하기 위한 축중성 프로브를 설계함으로써 결정될 수 있는 컨센서스 서열을 사용하여 유리하게 행해진다. 분자 생물학의 이들 상용 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
본원에 사용된 용어 "개선된 메티오닌 생산", "메티오닌 생산의 개선" 및 그의 문법적 등가물은 증가된 메티오닌/탄소 공급원 수율 (퍼센트로 표현될 수 있는 소모된 탄소 공급원 그램/몰 당 생산된 메티오닌 그램/몰의 비) 및/또는 생산된 메티오닌의 개선된 순도를 지칭한다. 본 발명에서, 생산된 메티오닌의 순도는 케토메틸발레레이트 및/또는 호모란티오닌의 생산을 감소시킴으로써 증가될 수 있다. 소모된 탄소 공급원 및 생산된 메티오닌의 양을 결정하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 생산된 메티오닌의 수율 및/또는 순도는 상응하는 비변형된 미생물에 비해 재조합 미생물에서 보다 높다.
용어 "메티오닌의 발효적 생산을 위해 최적화된 미생물"은 상응하는 야생형 미생물의 내인성 생산에 비해 개선된 메티오닌 생산을 나타내도록 진화되고/거나 유전자 변형된 미생물을 지칭한다. 메티오닌 생산을 위해 "최적화된" 이러한 미생물은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 특히 특허 출원 WO2005/111202, WO2007/077041, WO2009/043803 및 WO2012/098042에 개시된 바 있다.
본 발명에 따른 용어 "발효적 생산", "배양" 또는 "발효"는 박테리아의 성장을 나타내기 위해 사용된다. 이 성장은 사용되는 미생물에 적합화되고, 적어도 1종의 단순 탄소 공급원, 및 필요한 경우에 공동-기질을 함유하는 적절한 배양 배지와 함께 발효기에서 일반적으로 수행된다.
"적절한 배양 배지"는 세포의 유지 및/또는 성장에 필수적이거나 이로운 영양소 예컨대 탄소 공급원 또는 탄소 기질, 질소 공급원, 예를 들어, 펩톤, 효모 추출물, 육류 추출물, 맥아 추출물, 우레아, 암모늄 술페이트, 암모늄 클로라이드, 암모늄 니트레이트 및 암모늄 포스페이트; 인 공급원, 예를 들어, 모노포타슘 포스페이트 또는 디포타슘 포스페이트; 미량 원소 (예를 들어, 금속 염), 예를 들어, 마그네슘 염, 코발트 염 및/또는 망간 염; 뿐만 아니라 성장 인자 예컨대 아미노산 및 비타민을 포함하는 배지 (예를 들어, 멸균, 액체 배지)를 지정한다.
본 발명에 따른 용어 "탄소 공급원" 또는 "탄소 기질" 또는 "탄소의 공급원"은, 모노사카라이드 (예컨대 글루코스, 갈락토스, 크실로스, 프룩토스 또는 락토스), 올리고사카라이드, 디사카라이드 (예컨대 수크로스, 셀로비오스 또는 말토스), 당밀, 전분 또는 그의 유도체, 헤미셀룰로스 및 그의 조합을 포함하는, 미생물의 정상 성장을 지지하기 위해 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 사용될 수 있는 탄소의 임의의 공급원을 나타낸다. 특히 바람직한 단순 탄소 공급원은 글루코스이다. 또 다른 바람직한 단순 탄소 공급원은 수크로스이다. 탄소 공급원은 재생가능한 공급-원료로부터 유래될 수 있다. 재생가능한 공급-원료는 단기 지연 내에 및 목적하는 생성물로 그의 형질전환을 허용하기에 충분한 양으로 재생될 수 있는 특정 산업 공정에 요구되는 원료로 정의된다. 처리되거나 그렇지 않은 식물 바이오매스는 관심있는 재생가능한 탄소 공급원이다.
본 발명에 따른 용어 "황의 공급원"은 술페이트, 티오술페이트, 히드로겐 술피드, 디티오네이트, 디티오나이트, 술파이트, 메틸메르캅탄, 디메틸술피드 및 다른 메틸 캡핑된 술피드 또는 상이한 공급원의 조합을 지칭한다. 보다 우선적으로, 배양 배지 내의 황 공급원은 술페이트 또는 티오술페이트 또는 그의 혼합물이다.
용어 "질소의 공급원"은 암모늄 염 또는 암모니아 가스에 상응한다. 질소 공급원은 암모늄 또는 암모니아 형태로 공급된다.
용어 "감쇠" 또는 "감쇠된 발현"은 이 문맥에서 유전자의 발현 또는 효소의 생산이 비변형된 미생물에 비해 감소되거나 또는 억제되어 비변형된 미생물에 비해 효소 또는 단백질, 리보핵산의 세포내 농도의 감소로 이어지는 것을 의미한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 예를 들어 리보핵산 농도를 결정하기 위한 역전사 폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR) 및 실시간 폴리머라제 연쇄 반응 (qPCR)의 사용 및 특이적 단백질의 농도를 결정하기 위한 특이적 항체의 사용을 포함하여 세포 내 리보핵산 농도 또는 단백질 농도를 측정하기 위한 상이한 수단 및 방법을 알고 있다.
효소의 생산의 감소 또는 억제는 상기 효소를 코딩하는 유전자의 발현의 감쇠에 의해 얻어진다.
유전자의 감쇠는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 수단 및 방법에 의해 달성될 수 있다. 일반적으로, 유전자 발현의 감쇠는 하기에 의해 달성된다:
- 코딩 영역 또는 프로모터 영역의 돌연변이 또는,
- 유전자 발현에 필요한 프로모터 영역의 전부 또는 일부의 결실 또는,
- 상동 재조합에 의한 유전자의 코딩 영역의 전부 또는 일부의 결실 또는,
- 코딩 영역 또는 프로모터 영역으로의 외부 요소의 삽입 또는,
- 약한 프로모터 또는 유도성 프로모터의 제어 하에 유전자의 발현.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 상이한 강도를 나타내는 다양한 프로모터 및 약하거나 유도성 유전적 발현을 위해 어떤 프로모터를 사용해야 하는지를 알고 있다.
용어 효소의 "활성"은 용어 "기능"과 교환가능하게 사용되고, 본 발명의 문맥에서, 효소에 의해 촉매되는 반응을 지정한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상기 효소의 효소적 활성을 측정하는 방법을 알고 있다.
용어 효소의 "감쇠된 활성" 또는 "감소된 활성"은 아미노산 서열 내 돌연변이에 의해 얻어진 단백질의 감소된 특이적 촉매 활성 및/또는 뉴클레오티드 서열의 돌연변이에 의해 또는 유전자의 코딩 영역의 결실에 의해 얻어진 세포 내 단백질의 감소된 농도를 의미한다.
용어 효소의 "증진된 활성" 또는 "증가된 활성"은 예를 들어, 효소를 코딩하는 유전자의 과다발현에 의해 얻어진, 세포 내 효소의 증가된 특이적 촉매 활성 및/또는 효소의 증가된 양/이용률을 지정한다.
용어 "증가된 발현", "증진된 발현" 또는 "과다발현" 및 그의 문법적 등가물은 본문에서 교환가능하게 사용되고 유사한 의미를 갖는다. 이들 용어는 유전자의 발현 또는 효소의 생산이 비변형된 미생물에 비해 증가되어 비변형된 미생물에 비해 리보핵산, 단백질 또는 효소의 세포내 농도의 증가로 이어지는 것을 의미한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 예를 들어 리보핵산 농도를 결정하기 위한 역전사 폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR) 및 실시간 폴리머라제 연쇄 반응 (qPCR)의 사용 및 특이적 단백질의 농도를 결정하기 위한 특이적 항체의 사용을 포함하여 세포 내 리보핵산 농도 또는 단백질 농도를 측정하기 위한 상이한 수단 및 방법을 알고 있다.
효소의 생산 증가는 상기 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시킴으로써 얻어진다.
유전자의 발현을 증가시키기 위해, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상이한 기술 예컨대 하기를 알고 있다:
- 미생물에서 유전자의 카피의 수의 증가. 유전자는 염색체적으로 또는 염색체외적으로 코딩된다. 유전자가 염색체 상에 위치하면, 유전자의 여러 카피는 관련 기술분야의 전문가에게 공지된 재조합의 방법 (유전자 치환을 포함함)에 의해 염색체 상에 도입될 수 있다. 유전자가 염색체외적으로 위치하면, 그의 복제 기점 및 따라서 세포에서의 그의 카피수에 대해 다른 상이한 유형의 플라스미드에 의해 운반될 수 있다. 이들 플라스미드는 플라스미드의 성질에 따라, 1 내지 5 카피, 또는 약 20 카피 또는 최대 500 이하의 카피로 미생물 내에 존재한다: 치밀 복제를 하는 저카피수 플라스미드 (예를 들어 이. 콜라이 pSC101, RK2를 위함), 저카피수 플라스미드 (예를 들어 이. 콜라이 pACYC, pRSF1010를 위함) 또는 고카피수 플라스미드 (예를 들어 이. 콜라이 pSK bluescript II를 위함).
- 유전자의 높은 수준의 발현으로 이어지는 프로모터의 사용. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 어떤 프로모터가 가장 편리한지, 예를 들어, 프로모터 Ptrc, Ptac, Plac, 또는 람다 프로모터 cI가 광범위하게 사용된다는 것을 알고 있다. 이들 프로모터는 특정 화합물에 의해 또는 온도 또는 빛과 같은 특이적 외부 조건에 의해 "유도성"일 수 있다. 이들 프로모터는 상동 또는 이종일 수 있다.
- 유전자의 특이적이거나 비특이적인 전사 억제자의 활성 또는 발현의 감쇠
- 상응하는 메신저 RNA를 안정화시키는 요소 (Carrier and Keasling, 1999) 또는 단백질을 안정화시키는 요소 (예를 들어, GST 태그, 지이 헬스케어(GE Healthcare))의 사용.
용어 "코딩하는" 또는 "코딩"은 전사 및 번역의 메카니즘을 통해, 폴리뉴클레오티드가 아미노산 서열을 생산하는 과정을 지칭한다. 효소(들)을 코딩하는 유전자(들)은 외인성이거나 내인성일 수 있다.
용어 "피드백 감수성" 또는 "피드백 억제"는 특정한 물질이 특정 수준으로 축적되었을 때 세포에서 그 물질의 생산을 촉매하는 1종 또는 여러 종의 효소가 억제되거나 또는 덜 활성화되는 세포 메카니즘 제어를 지칭한다. 그래서 용어 "감소된 피드백 감수성" 또는 "감소된 피드백 억제"는 이러한 메카니즘의 활성이 비변형된 미생물에 비해 감소되거나 억제됨을 의미한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이 결과를 얻기 위해 효소를 변형시키는 방법을 알고 있다. 이러한 변형은 특허 출원 WO2005/111202 또는 특허 US7,611,873에 기재된 바 있다.
본 발명의 제1 측면에서, 재조합 미생물은 상기 미생물에서 코발라민-의존성 메티오닌 신타제 활성을 증진시킴으로써 및 메티오닌 유출을 증진시킴으로써 메티오닌 및/또는 그의 유도체의 발효적 생산을 위해 최적화된다. 바람직하게는, 재조합 미생물은 엔테로박테리아세아에 또는 코리네박테리아세아에 중에서 선택된다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 재조합 미생물은 에스케리키아 콜라이 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 중에서 선택된다.
상기 기재된 바와 같이, 코발라민-의존성 메티오닌 신타제 활성은 MetH 효소에 의해 매개된다. 이 효소는 지속 활성을 갖기 위한 재활성화 시스템을 필요로 한다. 이 시스템은 이. 콜라이에서의 2종의 유전자, fldA 및 fpr에 의해 및 씨. 글루타미쿰에서의 fdxC, fdxD 또는 fdxA 중에서 및 fprA1, fprA2, fprA3 또는 fldR1 중에서 선택된 각각 유전자에 의해 코딩된다. 본 출원에서, 용어 "MetH 및 그의 재활성화 시스템" 또는 "metH, fldA, fpr"은 이. 콜라이 및 씨. 글루타미쿰 둘 다에서의 코발라민-의존성 메티오닌 신타제 및 그의 재활성화 시스템 또는 이. 콜라이 및 씨. 글루타미쿰 둘 다로부터의 그의 코딩 유전자에 관한 것이다. 따라서, 코발라민-의존성 메티오닌 신타제 활성의 증진은 바람직하게는 metH 유전자의 과다발현 및 또한 fldA 및 fpr 유전자에 의해 코딩된 그의 재활성화 시스템의 과다발현에 의해 수행된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 코발라민-의존성 메티오닌 신타제 활성은 이. 콜라이로부터의 유전자 metH, fldA, fpr 또는 씨. 글루타미쿰으로부터의 그의 상동 유전자를 과다발현함으로써 (그의 발현을 증진시킴으로써) 증진된다. 바람직하게는, 이들 유전자는 그의 야생형 프로모터와 상이한 프로모터 하에 과다발현된다.
보다 바람직하게는, 씨. 글루타미쿰으로부터의 유전자 metH, fldA 또는 fpr 또는 그의 상동 유전자가 염색체적으로 과다발현되고, 즉, 이들 유전자는 염색체로부터 과다발현된다. 각 유전자의 1종 또는 여러 종의 상보적 카피가 미생물의 염색체 상에 도입된다. 이들은 특허 출원 WO2011/073122에 개시된 목록으로부터 선택된 상이한 유전자좌에서 통합되고, 그들의 결실이 메티오닌 생산에 영향을 미치지 않는다. 각 유전자의 코딩 서열의 야생형 카피는 보존되나, 그의 프로모터 영역은 인공 프로모터 및/또는 리보솜 결합 부위 (RBS)에 의해 치환될 수 있다.
본 발명의 구체적 실시양태에서:
- 야생형 metH 유전자는 그의 천연 프로모터 및 RBS의 치환으로 보존되고, 2종의 추가의 카피가 염색체에 도입되고,
- 야생형 fldA 및 fpr 유전자 및 그의 프로모터 영역은 보존되고, 각 유전자의 1종의 추가의 카피는 염색체에 도입된다.
도입된 유전자의 추가의 카피는 인공 프로모터 및 RBS의 제어 하에 발현된다.
아미노산 생산자 미생물에서, 메티오닌은 특이적 유출 수송체에 의해 배출된다. 특히, 이. 콜라이에서, 이 수송체는 YgaZH로 불리고, ygaZ 및 ygaH 유전자에 의해 코딩되는 반면, 씨. 글루타미쿰에서, 이는 BrnFE로 명명되고, brnF 및 brnE 유전자에 의해 코딩된다. 이 메티오닌 유출 시스템의 기능적 상동체는 여러 다른 미생물에서 확인된 바 있다. 본 발명에서, 재조합 미생물은 이. 콜라이로부터의 ygaZH 유전자 또는 씨. 글루타미쿰으로부터의 brnFE 유전자를 과다발현한다. 대안적으로, 본 발명의 재조합 미생물은 YgaZH 또는 BrnFE 수송체의 기능적 상동체를 과다발현할 수 있다. YgaZ 및 YgaH 상동 단백질은 표 1 및 표 2에 각각 제시되어 있다.
<표 1> YgaZ 상동 단백질
Figure 112016028664995-pct00001
Figure 112016028664995-pct00002
Figure 112016028664995-pct00003
Figure 112016028664995-pct00004
<표 2> YgaH 상동 단백질
Figure 112016028664995-pct00005
Figure 112016028664995-pct00006
Figure 112016028664995-pct00007
Figure 112016028664995-pct00008
각 상동체에 대해 표에 개시된 수탁 번호로 관련 기술분야의 통상의 기술자는 예를 들어 NCBI 데이터베이스 상에서 아미노산 서열 및 그의 뉴클레오티드 코딩 서열을 얻을 수 있다.
아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열로부터, 이들 상동체를 코딩하는 유전자를 얻는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 상용 과제이다. 그것은 그의 아미노산 서열로부터 관심 단백질을 코딩하는 유전자의 인공 합성에 의해 또는 상응하는 게놈 DNA로부터 관심 코딩 영역의 PCR 증폭에 의해 행해질 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 이들 유전자는 "ygaZ 또는 ygaH 상동 유전자"로 불린다. 이들 ygaZH 상동 유전자의 서열은 숙주 미생물의 코돈 편향으로 조정될 수 있다.
본 발명의 구체적 실시양태에서, 재조합 미생물은 그의 서열이 각각 서열 1 및 서열 2 또는 씨. 글루타미쿰으로부터의 brnF 및 brnE 또는 그의 상동 유전자에 개시된 단백질을 코딩하는 이. 콜라이로부터의 유전자 ygaZ 및 ygaH를 과다발현한다. 바람직하게는, ygaZ 및 ygaH 상동 유전자는 동일한 유기체로부터 유래하는 유전자 쌍에 의해 구성되고 ygaZ의 상동 유전자 및 ygaH의 상동 유전자에 의해 구성된다. 그러나 제1 유기체로부터의 ygaZ 상동 유전자 및 제2 유기체로부터의 ygaH 상동 유전자의 미스매치 쌍이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 유전자 ygaZH, brnFE 또는 그의 상동 유전자가 과다발현된다.
YgaZH 상동 유전자가 표 1 및 표 2에 각각 개시된 YgaZ 및 YgaH 상동체를 코딩하는 유전자 중에서 선택된다. 바람직하게는, ygaZH 상동 유전자는 시트로박터(Citrobacter) 종, 시겔라(Shigella ) 종, 라오울텔라(Raoultella ) 종, 엔테로박터(Enterobacter) 종, 예르시니아(Yersinia ) 종 및 포토랍두스(Photorhabdus ) 종으로부터 YgaZH 상동체를 코딩하는 유전자 중에서 선택된다. 보다 바람직하게는 ygaZH 상동 유전자는 시트로박터 코세리, 시겔라 플렉스네리, 라오울텔라 오르니티놀리티카, 엔테로박터 종, 예르시니아 엔테로콜리티카, 포토랍두스 루미네센스, 시트로박터 요웅가에 또는 시트로박터 프레운디이로부터 유래한다. 가장 바람직하게는, ygaZH 상동 유전자는 시트로박터 코세리, 시트로박터 요웅가에, 시트로박터 프레운디이 또는 엔테로박터 종으로부터 유래한다.
따라서, ygaZH 상동 유전자는 하기에 의해 각각 정의된 YgaZ 상동체 및 YgaH 상동체의 쌍을 코딩하는 유전자 중에서 바람직하게 선택된다: 시트로박터 코세리로부터의 서열 3 및 서열 4, 시겔라 플렉스네리로부터의 서열 5 및 서열 6, 라오울텔라 오르니티놀리티카로부터의 서열 7 및 서열 8, 엔테로박터 종 (R4-368)으로부터의 서열 9 및 서열 10, 예르시니아 엔테로콜리티카 아종 엔테로콜리티카로부터의 서열 11 또는 12 및 서열 13 또는 14, 포토랍두스 루미네센스 아종 라우몬디이로부터의 서열 15 및 서열 16, 시트로박터 요웅가에로부터의 서열 17 및 서열 18, 시트로박터 프레운디이로부터의 서열 19 및 서열 20.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 이들 유전자 ygaZH 또는 brnFE 또는 시트로박터 코세리, 시겔라 플렉스네리, 라오울텔라 오르니티놀리티카, 엔테로박터 종, 예르시니아 엔테로콜리티카, 포토랍두스 루미네센스, 시트로박터 요웅가에 또는 시트로박터 프레운디이로부터 유래하는 상동 유전자는 유도성 프로모터의 제어 하에 과다발현된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자가 이러한 유도성 프로모터를 알고 있다. 예를 들어, λPR 또는 λPL과 같은 프로모터가 본 발명의 재조합 미생물에서 ygaZH 유전자 또는 brnFE 유전자 또는 시트로박터 코세리, 시겔라 플렉스네리, 라오울텔라 오르니티놀리티카, 엔테로박터 종, 예르시니아 엔테로콜리티카, 포토랍두스 루미네센스, 시트로박터 요웅가에 또는 시트로박터 프레운디이에서 유래하는 ygaZH 상동 유전자를 과다발현하는데 사용될 수 있다.
ygaZH 상동 유전자를 확인하고 상기 유전자를 아미노산 생산자 미생물에서 하기 개시된 바와 같이 단독으로 또는 다른 유전자 변형과 조합하여 과다발현하는 것이 본 발명의 또 다른 목적이다.
메티오닌 생합성 경로의 최적화
본 발명에 따른 재조합 미생물은 메티오닌의 생산을 개선시키기 위해 변형된다. 메티오닌 생산에 수반되는 유전자는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 메티오닌 특이적 생합성 경로에 수반되는 유전자 뿐만 아니라 전구체-제공 경로에 수반되는 유전자 및 메티오닌 소모 경로에 수반되는 유전자를 포함한다.
메티오닌의 효율적인 생산은 메티오닌 특이적 경로 및 여러 전구체-제공 경로의 최적화를 요구한다. 메티오닌 생산 균주는 특히 특허 출원 WO2005/111202, WO2007/077041 및 WO2009/043803에 이미 기재된 바 있다. 이들 출원은 본원에 참조로 포함된다.
달리 언급되는 것을 제외하고는, 메티오닌 생합성 경로의 최적화에 관한 하기 언급된 모든 유전자는 이. 콜라이로부터의 유전자를 지칭하고 있다.
본 발명의 구체적 실시양태에서, 재조합 미생물은 하기 기재된 바와 같이 변형된다: ptsG, pyc, pntAB, cysP, cysU, cysW, cysA, cysM, cysJ, cysI, cysH, gcvT, gcvH, gcvP, lpd, serA, serB, serC, cysE, metF, metA, S-아데노실메티오닌 및/또는 메티오닌에 대한 감소된 피드백 감수성을 갖는 효소를 코딩하는 metA* 대립유전자, thrA, 및 트레오닌에 대한 감소된 피드백 억제를 갖는 효소를 코딩하는 thrA* 대립유전자 중에서 선택된 적어도 1종의 유전자의 발현은 증가된다.
Figure 112016028664995-pct00009
ptsG는 특허 출원 WO2013/001055에 기재된 바와 같이 PTS 효소 IICBGlc를 코딩하고,
Figure 112016028664995-pct00010
pyc는 특허 출원 WO2013/001055에 기재된 바와 같이 피루베이트 카르복실라제를 코딩한다. 바람직한 실시양태에서, pyc 유전자는 이종이고, 리조비움 에틀리, 바실루스 서브틸리스, 락토코쿠스 락티스, 슈도모나스 플루오레센스, 또는 코리네박테리움 종으로부터의 pyc 유전자로부터 선택되고,
Figure 112016028664995-pct00011
pntAB는 예컨대 특허 출원 WO2012/055798에 기재된 바와 같이 막-결합된 트랜스히드로게나제의 서브유닛을 코딩하고,
Figure 112016028664995-pct00012
cysP는 WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기재된 바와 같이 주변세포질 술페이트 결합 단백질을 코딩하고,
Figure 112016028664995-pct00013
cysU는 WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기재된 바와 같이 술페이트 ABC 수송체의 구성요소를 코딩하고,
Figure 112016028664995-pct00014
cysW는 WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기재된 바와 같이 막 결합된 술페이트 수송체 단백질을 코딩하고,
Figure 112016028664995-pct00015
cysA는 WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기재된 바와 같이 술페이트 퍼미아제를 코딩하고,
Figure 112016028664995-pct00016
cysM은 WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기재된 바와 같이 O-아세틸 세린 술프히드랄라제를 코딩하고,
Figure 112016028664995-pct00017
cysI 및 cysJ는 WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기재된 바와 같이 술파이트 리덕타제의 알파 및 베타 서브유닛을 각각 코딩한다. 바람직하게는 cysI 및 cysJ는 함께 과다발현되고,
Figure 112016028664995-pct00018
cysH는 WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기재된 바와 같이 아데닐릴술페이트 리덕타제를 코딩한다.
C1 대사의 증가는 또한 개선된 메티오닌 생산으로 이어지는 변형이다. 이는 GcvTHP, Lpd, MetF 또는 MetH 중에서 선택된 C1 대사에 수반되는 적어도 1종의 효소의 활성의 증가에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 1종의 탄소 대사는 하기 중 적어도 1종의 발현 및/또는 활성을 증진시킴으로써 증가된다:
Figure 112016028664995-pct00019
특허 출원 WO2007/077041에 기재된 바와 같이, 글리신 절단 복합체를 코딩하는 gcvT, gcvH, gcvP, 및 lpd. 글리신-절단 복합체 (GCV)는 글리신의 산화를 촉매하고, 이산화탄소, 암모니아, 메틸렌-THF 및 감소된 피리딘 뉴클레오티드를 생성하는 다중효소 복합체이다. GCV 복합체는 P-단백질로 불리는 글리신 데히드로게나제 (GcvP), H-단백질로 불리는 리포일-GcvH-단백질 (GcvH), T-단백질로 불리는 아미노메틸트랜스퍼라제 (GcvT), 및 L-단백질로 불리는 디히드로리포아미드 데히드로게나제 (GcvL 또는 Lpd)인 4종의 단백질 구성요소로 구성된다. P-단백질은 글리신으로부터 CO2의 피리독살 포스페이트-의존성 유리를 촉매하여, 메틸아민 모이어티를 남긴다. 메틸아민 모이어티는 H-단백질의 리포산 기로 전달되어, 글리신의 탈카르복실화 전에 P-단백질에 결합된다. T-단백질은 메틸아민 기로부터 NH3의 방출을 촉매하고, 잔류 C1 유닛을 THF로 전달하여, 메틸렌-THF를 형성한다. 이어서 L 단백질은 H-단백질의 리포산 구성요소를 산화시키고 전자를 NAD+로 전달하여, NADH를 형성하고;
Figure 112016028664995-pct00020
특허 출원 WO2007/07704에 기재된 바와 같이, 메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제를 코딩하는 MetF.
세린 생합성에 수반되는 하기 유전자 중 적어도 1종의 과다발현은 또한 이소류신 부산물의 생산을 감소시킨다:
Figure 112016028664995-pct00021
WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기재된 바와 같이, 포스포글리세레이트 데히드로게나제를 코딩하는 serA,
Figure 112016028664995-pct00022
WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기재된 바와 같이, 포스포세린 포스파타제를 코딩하는 serB,
Figure 112016028664995-pct00023
WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기재된 바와 같이, 포스포세린 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 serC.
하기 유전자의 과다발현은 메티오닌의 생산을 개선시키는 것으로 이미 제시된 바 있다:
Figure 112016028664995-pct00024
cysE는 세린 아실트랜스퍼라제를 코딩하고; 그의 과다발현은 WO2007/077041에 기재된 바와 같이 메티오닌 생산의 증가를 가능하게 하고;
Figure 112016028664995-pct00025
metA는 호모세린 숙시닐트랜스퍼라제를 코딩한다. 대립유전자 metA*는 S-아데노실메티오닌 및/또는 메티오닌에 대해 감소된 피드백 감수성을 갖는 효소를 코딩한다. 우선적으로, 특허 출원 WO2005/111202에 기재된 대립유전자 metA*가 사용되고;
Figure 112016028664995-pct00026
thrA는 아스파르토키나제/호모세린 데히드로게나제를 코딩하고; thrA* 대립유전자는 WO2005/111202에 기재된 바와 같이 트레오닌에 대한 감소된 피드백 억제를 갖는 효소를 코딩한다.
본 발명의 구체적 실시양태에서, 상기 유전자 중 적어도 1종은 유도성 프로모터의 제어 하에 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 이들 유전자 중 적어도 1종은 온도 유도성 프로모터의 제어 하에 있다. 바람직하게는, 유전자: thrA, cysE, metA 중 적어도 1종의 발현은 직접적으로 또는 간접적으로 유도성 프로모터의 제어 하에 있다. 보다 바람직하게는, 유전자 thrA, cysE 및 metA는 직접적으로 또는 간접적으로 유도성 프로모터의 제어 하에 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, thrA 유전자의 발현은 유도성 프로모터의 직접 제어 하에 있고, cysE 유전자의 발현은 thrA 유전자의 유도성 발현의 극성 효과 하에 있다. 본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, thrA 유전자의 발현은 유도성 프로모터의 직접 제어 하에 있고, cysE 및 metA 유전자의 발현은 thrA 유전자의 유도성 발현의 극성 효과 하에 있다.
가장 바람직한 실시양태에서, 온도 유도성 프로모터는 PR 프로모터의 패밀리에 속한다. 유도성 프로모터의 제어 하에 있는 유전자를 갖는 메티오닌 생산 균주는 특허 출원 WO2011/073122에 기재되어 있다.
본 발명의 또 다른 구체적 실시양태에서, 미생물은 추가로 변형된 바 있고, 하기 유전자 중 적어도 1종의 발현이 감쇠된다: metJ, pykA, pykF, purU, ybdL, yncA, metE, dgsA, metN, metI, metQ 또는 udhA.
Figure 112016028664995-pct00027
유전자 metJ는 특허 출원 JP2000/157267에서 시사된 바와 같이 메티오닌 레귤론의 하향-조절을 담당하는 억제자 단백질 MetJ (진뱅크 1790373)를 코딩하고,
Figure 112016028664995-pct00028
유전자 pykA 및 pykF는 효소 '피루베이트 키나제'를 코딩한다. 피루베이트 키나제 중 적어도 1종 또는 둘 다의 발현의 감쇠는 포스포에놀 피루베이트 (PEP)의 소모를 감소시킨다. PEP의 증가된 이용률은 WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기재된 바와 같이 아스파르테이트의 중요한 전구체, 결국 메티오닌의 전구체인 옥살로아세테이트의 생산을 증가시킬 수 있고,
Figure 112016028664995-pct00029
purU는 포르밀-THF 데포르밀라제 반응을 촉매하는 효소인 포르밀테트라히드로폴레이트 데포르밀라제를 코딩한다. 데포르밀라제 활성의 감쇠는 호모시스테인의 메틸화에 요구되는 메틸-THF의 생산을 증가시킨다. 탈포밀화에 의한 C1 대사물의 손실은 메티오닌으로 형질전환될 수 없는 호모시스테인의 증가된 생산으로 이어진다. 이어서 호모시스테인은 WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기재된 바와 같이 호모란티오닌의 생산을 유발하는 O-숙시닐호모세린과 호모시스테인 사이의 반응을 촉매할 수 있는 효소 시스타티오닌 감마 신타제 (MetB)에 대한 기질일 수 있고,
Figure 112016028664995-pct00030
ybdL은 특허 출원 WO2012/090021에 기재된 바와 같이 아미노트랜스퍼라제를 코딩하고,
Figure 112016028664995-pct00031
yncA는 특허 출원 WO2010/020681에 기재된 바와 같이 N-아실트랜스퍼라제를 코딩하고,
Figure 112016028664995-pct00032
metE는 특허 출원 PCT/IB2012/001336에 기재된 바와 같이 코발라민-비의존성 메티오닌 신타제를 코딩하고,
Figure 112016028664995-pct00033
Mlc로 보다 널리 공지된, dgsA는 특허 출원 WO2013/001055에 기재된 바와 같이 포스포트랜스퍼라제 (PTS) 및 포스포엔올피루베이트 (PEP) 시스템의 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 제어하는 전사 이중 조절제를 코딩하고,
Figure 112016028664995-pct00034
metN, metI, metQ는 메티오닌 흡수 시스템을 코딩하고,
Figure 112016028664995-pct00035
udhA는 특허 출원 WO2012/055798에 기재된 바와 같이 가용성 피리딘 뉴클레오티드 트랜스히드로게나제를 코딩한다.
본 발명의 보다 바람직한 실시양태에서, 주요 탄소 공급원으로서 글루코스로부터, 메티오닌 유입이 감쇠되고 메티오닌 유출이 증진된, 재조합 미생물에 의한 메티오닌 및/또는 그의 유도체의 발효적 생산이 상기 미생물에서 상기 논의된 변형의 조합, 예를 들어 하기를 통해 달성될 수 있다:
▷ 유전자 metJ의 발현은 감쇠되고 S-아데노실메티오닌 및/또는 메티오닌에 대한 감소된 피드백 감수성을 갖는 효소를 코딩하는 metA* 대립유전자 (MetA*)의 발현은 증진되고;
▷ 유전자 metJ의 발현은 감쇠되고; S-아데노실메티오닌 및/또는 메티오닌에 대한 감소된 피드백 감수성을 갖는 효소를 코딩하는 metA* 대립유전자 (MetA*)의 발현은 증진되고; 트레오닌에 대한 감소된 피드백 억제를 갖는 효소를 코딩하는 thrA* 대립유전자 (thrA*)의 발현은 증진되고;
▷ 유전자 metJ의 발현은 감쇠되고; S-아데노실메티오닌 및/또는 메티오닌에 대한 감소된 피드백 감수성을 갖는 효소를 코딩하는 metA* 대립유전자 (MetA*)의 발현은 증진되고; 트레오닌에 대한 감소된 피드백 억제를 갖는 효소를 코딩하는 thrA* 대립유전자 (thrA*)의 발현은 증진되고; 유전자 cysE의 발현은 증진되고;
▷ 유전자 metJ의 발현은 감쇠되고; S-아데노실메티오닌 및/또는 메티오닌에 대한 감소된 피드백 감수성을 갖는 효소를 코딩하는 metA* 대립유전자 (MetA*)의 발현은 증진되고; 트레오닌에 대한 감소된 피드백 억제성을 갖는 효소를 코딩하는 thrA* 대립유전자 (thrA*)의 발현은 증진되고; 유전자 cysE의 발현은 증진되고; 유전자 metF의 발현은 증진된다.
본 발명의 특정한 측면에서, 재조합 미생물은 하기 유전자 변형을 포함한다:
Figure 112016028664995-pct00036
이. 콜라이로부터의 유전자 metH, 및 fldA 및 fpr 또는 씨. 글루타미쿰으로부터의 그의 상동 유전자가 과다발현되고,
Figure 112016028664995-pct00037
이. 콜라이로부터의 유전자 ygaZ 및 ygaH 또는 씨. 글루타미쿰으로부터의 유전자 brnF 및 brnE 또는 시트로박터 코세리, 시겔라 플렉스네리, 라오울텔라 오르니티놀리티카, 엔테로박터 종, 예르시니아 엔테로콜리티카, 포토랍두스 루미네센스, 시트로박터 요웅가에 또는 시트로박터 프레운디이로부터 유래하는 그의 상동 유전자가 과다발현되고,
Figure 112016028664995-pct00038
유전자 metA*, cysPUWAM, cysJIH, gcvTHP, metF, serA, serB, serC, cysE, thrA*, ptsG 및 pyc의 발현이 증진되고,
Figure 112016028664995-pct00039
유전자 metJ, pykA, pykF, purU, metE, dgsA 및 yncA의 발현이 감쇠된다.
본 발명의 특정한 실시양태에서, 변형될 미생물은 박테리아 패밀리 엔테로박테리아세아에 또는 코리네박테리아세아에로부터이다.
우선적으로, 변형될 미생물은 에스케리키아 콜라이 또는 코리네박테리움 글루타미쿰이다.
배양 조건
본 발명의 제2 측면에서, 방법은 메티오닌 및/또는 그의 유도체의 발효적 생산을 위해 최적화된다. 이는 하기 단계를 포함한다:
- 재조합 미생물을 배양하며, 여기서 탄소의 발효성 공급원 및 황의 공급원을 포함하는 적절한 배양 배지에서 코발라민-의존성 메티오닌 신타제 활성 및 메티오닌 유출은 이. 콜라이로부터의 유전자 metH, 및 임의로 유전자 fldA 및 fpr 유전자 또는 씨. 글루타미쿰으로부터의 그의 상동 유전자 및 이. 콜라이로부터의 유전자 ygaZH 또는 씨. 글루타미쿰으로부터의 유전자 brnFE 또는 그의 상동 유전자를 각각 과다발현함으로써 증진되는 것인 단계, 및
- 배양 배지로부터 메티오닌 및/또는 그의 유도체를 회수하는 단계.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명에 따른 미생물에 대한 배양 조건을 정의할 수 있다. 특히, 박테리아는 20℃ 내지 55℃, 우선적으로 25℃ 내지 40℃, 보다 구체적으로 씨. 글루타미쿰에 대해 약 30℃ 및 이. 콜라이에 대해 약 37℃의 온도에서 발효된다.
이. 콜라이에 대해, 배양 배지는 M9 배지 (Anderson, 1946), M63 배지 (Miller, 1992); 또는 문헌 [Schaefer et al., (1999)]에 의해 정의된 바와 같은 배지와 동일하거나 유사한 조성일 수 있다.
씨. 글루타미쿰에 대해, 배양 배지는 BMCG 배지 (Liebl et al., 1989) 또는 문헌 [Riedel et al., (2001)]에 의해 기재된 바와 같은 배지와 동일하거나 유사한 조성일 수 있다.
본 발명의 방법에서, 재조합 미생물에서 과다발현되는 ygaZH 상동 유전자는 바람직하게는 시트로박터 종, 시겔라 종, 라오울텔라 종, 엔테로박터 종, 예르시니아 종 및 포토랍두스 종으로부터의 상동 유전자로 이루어지는 군 중에서 선택되고, 보다 바람직하게는 시트로박터 코세리, 시겔라 플렉스네리, 라오울텔라 오르니티놀리티카, 엔테로박터 종, 예르시니아 엔테로콜리티카, 포토랍두스 루미네센스, 시트로박터 요웅가에 또는 시트로박터 프레운디이로부터 유래한다.
방법의 구체적 실시양태에서, 재조합 미생물은 하기 유전자 변형을 포함한다:
a. 이. 콜라이로부터의 유전자 metH, 및 fldA 및 fpr, 또는 씨. 글루타미쿰으로부터의 그의 상동 유전자의 과다발현 및
b. 이. 콜라이로부터의 유전자 ygaZH, 또는 씨. 글루타미쿰으로부터의 brnFE 또는 그의 상동 유전자의 과다발현.
본 발명의 이러한 구체적 실시양태에서, 상기 ygaZH 상동 유전자는 바람직하게는 시트로박터 종, 시겔라 종, 라오울텔라 종, 엔테로박터 종, 예르시니아 종 및 포토랍두스 종으로부터의 상동 유전자로 이루어지는 군 중에서 선택되고, 보다 바람직하게는 시트로박터 코세리, 시겔라 플렉스네리, 라오울텔라 오르니티놀리티카, 엔테로박터 종, 예르시니아 엔테로콜리티카, 포토랍두스 루미네센스, 시트로박터 요웅가에 또는 시트로박터 프레운디이로부터의 상동 유전자로 이루어지는 군 중에서 선택된다.
본 발명의 방법에서, 재조합 미생물에서 과다발현되는 ygaZH 상동 유전자는 가장 바람직하게는 시트로박터 코세리, 시트로박터 요웅가에, 시트로박터 프레운디이 또는 엔테로박터 아종으로부터 유래한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 재조합 미생물의 성장은 배양 배지에서, 1종 또는 여러 종의 무기 기질, 특히 포스페이트 및/또는 포타슘에 대해 제한 또는 고갈 / 결핍을 받는다. 이는 미생물의 성장이 약한 성장을 여전히 허용하는 공급된 무기 화학물질의 양에 의해 제어되는 조건을 지칭한다. 미생물 성장에서 이러한 제한은 특허 출원 WO2009/043372에 기재된 바 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 배양물은 포스페이트 제한을 받는다.
"배양 배지로부터 메티오닌 또는 그의 유도체를 회수하는" 동작은 L-메티오닌 및/또는 그의 유도체, 특히 N-아세틸 메티오닌 (NAM) 및 S-아데노실 메티오닌 (SAM) 및 유용할 수 있는 모든 다른 유도체 예컨대 히드록시-메티오닌 (또는 메티오닌 히드록시 유사체 또는 MHA) 중 1종을 회수하는 동작을 지정한다. 생산된 화합물의 회수 및 정제를 위한 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다 (특히 WO2005/007862, WO2005/059155 참조). 바람직하게는, 메티오닌 및/또는 그의 유도체를 회수하는 단계는 발효 브로쓰 내의 메티오닌 및/또는 그의 유도체를 농축시키는 단계를 포함한다.
발효 배지 내의 생성물의 양은 관련 기술분야에 공지된 다수의 방법, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 또는 기체 크로마토그래피 (GC)를 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 배지에서 얻어진 메티오닌의 양은 표준으로서 L-메티오닌 (플루카(Fluka), Ref 64319)을 사용한 OPA/Fmoc 유도체화 이후에 HPLC에 의해 측정된다. NAM의 양은 표준으로서 NAM (시그마(Sigma), Ref 01310)을 사용한 굴절계 HPLC를 사용하여 결정된다.
실시예
하기 실험은 어떻게 미생물, 예컨대 이. 콜라이 및 씨. 글루타미쿰에서의 L-메티오닌 배출 시스템을 코딩하는 유전자의 과다발현이 B12-의존성 메티오닌 신타제 및 그의 재활성화 시스템을 코딩하는 유전자의 과다발현과 함께 메티오닌 생산을 개선시키는지를 입증한다.
하기 주어진 실시예에서, 관련 기술분야에 널리 공지된 방법은 이. 콜라이에 대해 문헌 [Datsenko & Wanner, (2000)]에 의해 및 씨. 글루타미쿰에 대해 특허 WO2007012078에 널리 기재된 상동 재조합을 사용하여 복제 벡터 및/또는 다양한 염색체 삽입, 결실, 및 치환을 함유하는 이. 콜라이 및 씨. 글루타미쿰 균주를 구축하기 위해 사용되었다.
동일한 방식에서, 재조합 미생물에서 1종 또는 여러 종의 유전자를 발현하거나 과다발현하기 위한 플라스미드 또는 벡터의 사용은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 널리 공지되어 있다.
적합한 이. 콜라이 발현 벡터의 예는 pTrc, pACYC184n pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236 등을 포함한다.
적합한 씨. 글루타미쿰 및 이. 콜라이 셔틀 벡터의 예는 예를 들어 pClik5aMCS (WO2005059093)이거나 또는 문헌 [Eikmanns et al., (1991)]에서 찾을 수 있다.
코리네박테리아를 조작하기 위해 적합한 벡터에 대한 예는 2005년에 에겔링(Eggeling) 및 보트(Bott)에 의해 편집된 코리네박테리아의 핸드북에서 찾을 수 있다.
프로토콜
여러 프로토콜이 하기 실시예에 기재된 메티오닌 생산 균주를 구축하는데 사용된 바 있다.
본 발명에 사용된 프로토콜 1 (상동 재조합에 의한 염색체 변형, 재조합체의 선택 및 항생제 카세트 절제) 및 프로토콜 2 (파지 P1의 형질도입)는 특허 출원 WO2013/001055에 완전히 기재된 바 있다.
프로토콜 3: 재조합 플라스미드의 구축
재조합 DNA 기술은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 널리 기재되어 있고 공지되어 있다.
간략하게, DNA 단편을 올리고뉴클레오티드 (관련 기술분야의 통상의 기술자가 설계할 수 있을 것임) 및 매트릭스로서 MG1655 게놈 DNA를 사용하여 PCR 증폭시켰다. DNA 단편 및 선택된 플라스미드를 상용성 제한 효소로 소화하고, 라이게이션한다음, 적격 세포에서 형질전환시켰다. 형질전환체를 분석하고, 관심 재조합 플라스미드를 DNA 서열분석에 의해 검증하였다.
<표 3> 하기 실시예에 인용된 서열
Figure 112016028664995-pct00040
실시예 1: L-메티오닌 과다생산자 이. 콜라이 재조합 균주에서 코발라민-의존성 메티오닌 신타제의 과다생산 또는 L-메티오닌 분비 시스템의 과다생산 - 균주 1 및 균주 2, 3, 4, 5 및 6의 구축
균주 1 - 참조 균주
특허 출원 WO2013/001055 (본 출원에 참조로 포함됨)에 기재된 메티오닌 생산 균주 17이 본 출원에서 균주 1로 개명되었다. 리마인더를 위해 이 균주는 그의 내인성 유전자좌에서 metH 유전자 앞에서 통합된 인공 프로모터 및 리보솜 결합 부위로 인해 metH를 과다발현하였다 (세부사항에 대해 특허 출원 WO2007/077041 참조). 이 균주는 특허 출원 WO2013/190343에 개시된 metE 유전자에 또한 돌연변이를 함유한다.
균주 5의 구축 - 코발라민-의존성 메티오닌 신타제의 과다생산, metH, fldA 및 fpr의 과다발현
코발라민-의존성 메티오닌 신타제를 코딩하는 이. 콜라이 유전자, metH 및 MetH의 재활성화 시스템을 코딩하는 유전자 fldA 및 fpr를 균주 1의 유전적 배경에서 모두 과다발현하였다.
균주 1을 사용하기 전에, 항생제 카세트를 문헌 [Datsenko & Wanner, 2000]에 의해 기재된 바와 같이 Flp 레콤비나제를 사용하여 ΔdgsA 변형으로부터 제거하였다 (프로토콜 1에 따름). 카나마이신 감수성 형질전환체를 선택하고, ΔdgsA 유전자좌에서 항생제 카세트의 부재를 적절한 올리고뉴클레오티드를 갖는 PCR 분석에 의해 검증하였다. 유지된 균주는 균주 2로 지정하였다.
metH를 과다발현하기 위해, 특허 출원 WO2007/077041에 기재된 바와 같이 동일한 프로모터 및 리보솜 결합 부위에 작동가능하게 연결된 이 유전자를 2종의 상이한 유전자좌 ybeM 및 ypjC (특허 출원 WO2011/073122에 개시된 목록으로부터 선택되고 결실이 메티오닌 생산에 영향을 미치지 않는 것)에서 염색체 상에 통합하였다.
metH를 강하게 과다발현하기 위해, 문헌 [Datsenko & Wanner, 2000]에 의해 기재된 상동 재조합 전략을 사용하였다 (프로토콜 1에 따름). 둘 다의 염색체 통합을 위해, 표적화 통합 유전자좌 ybeM 및 ypjC에 상동인 DNA 서열에 의해 둘 다 플랭킹된 그의 인공 프로모터 및 내성 마커에 연결된 metH 유전자를 보유하는 단편을 중첩 PCR 기술 (중첩 올리고뉴클레오티드)에 의해 PCR 증폭시켰다. ybeM 및 ypjC로의 재조합을 위한 서열은 각각 ybeM 및 ypjC에 대해, 서열 21 및 22, 및 서열 23 및 24로서 지칭하였다 (표 3에 수록됨). 이어서, 얻어진 PCR 산물 "ΔybeM::metH::Km" 및 "ΔypjC::metH::Cm"을 개별적으로 균주 MG1655 metA*11 (pKD46) 내로 전기천공에 의해 도입하였다. 항생제 내성 형질전환체를 선택하고, 표적화 유전자좌에서 내성 카세트를 갖는 metH 유전자의 삽입은 적절한 올리고뉴클레오티드를 사용한 PCR 분석에 의해 검증하였다. 유지된 균주를 MG1655 metA*11 ΔybeM::metH::Km 및 MG1655 metA*11 ΔypjC::metH::Cm으로 지정하였다. 최종적으로, ΔybeM::metH::Km 및 ΔypjC::metH::Cm 염색체 통합은 MG1655 metA*11 ΔybeM::metH::Km 및 MG1655 metA*11 ΔypjC::metH에서부터 균주 2까지 연속적으로 P1 파지 형질도입에 의해 전달하였다 (프로토콜 2에 따름). 클로람페니콜 또는 카나마이신 내성 형질도입체를 선택하고, ΔybeM::metH::Km 및 ΔypjC::metH::Cm 염색체 통합의 존재를 적절한 올리고뉴클레오티드를 사용한 PCR 분석에 의해 검증하였다. 유지된 균주는 균주 3으로 불렀다.
항생제 카세트를 문헌 [Datsenko & Wanner, 2000]에 의해 기재된 바와 같이 Flp 레콤비나제를 사용하여 균주 3 내로 ybeM 및 ypjC 유전자좌에서 만들어진 염색체 통합으로부터 제거하였다 (프로토콜 1에 따름). 카나마이신 및 클로람페니콜 감수성 형질전환체를 선택하고, 둘 다의 유전자좌에서의 항생제 카세트의 부재를 적절한 올리고뉴클레오티드를 사용한 PCR 분석으로 검증하였다. 유지된 균주는 균주 4로 지정하였다.
fldA 및 fpr을 과다발현하기 위해, 이들 유전자를 인공 프로모터 및 인공 리보솜 결합 부위에 작동가능하게 연결하고 ytfA 유전자좌에서 염색체 상에 통합하였다 (ybeM 및 ypjC 유전자좌로서의 동일한 선택 기준, 상기 참조). 인공 프로모터를 fldA의 경우에 서열 25로 및 fpr의 경우에 특허 출원 WO2009/043803에 cysPUWAM 오페론의 과다발현에 대해 기재된 바와 같이 구축하였다. 인공 리보솜 결합 부위는 특허 출원 WO2013/001055에 개시된 균주 17에서 ptsG 유전자를 과다발현하기 위해 기재된 바와 동일한 것이다.
염색체 상에 fldA 및 fpr 과다발현의 카피를 부가하기 위해, 문헌 [Datsenko & Wanner, 2000]에 의해 기재된 상동 재조합 전략을 사용하였다 (프로토콜 1에 따름). 통합 유전자좌 ytfA에 상동인 DNA 서열에 의해 둘 다 플랭킹된, 그의 각각의 프로모터, 및 내성 마커로, fldA 및 fpr 유전자를 보유하는 단편을 중첩 PCR 기술 (중첩 올리고뉴클레오티드)에 의해 PCR 증폭시켰다. ytfA 유전자좌로의 재조합을 위한 서열은 서열 26 및 27로서 지칭하였다 (표 3에 열거됨). 이어서, 얻어진 PCR 산물 "ΔytfA::fldA-fpr::Km"을 MG1655 metA*11 (pKD46) 균주 내로 전기천공에 의해 도입하였다. 이어서, 항생제 내성 형질전환체를 선택하고, ytfA 유전자좌에서 내성 카세트를 갖는 fldA-fpr 유전자의 삽입을 적절한 올리고뉴클레오티드를 사용한 PCR 분석에 의해 검증하였다. 유지된 균주를 MG1655 metA*11 ΔytfA::fldA-fpr::Km로 지정하였다. 최종적으로, ΔytfA::fldA-fpr::Km 염색체 통합을 MG1655 metA*11 ΔytfA::fldA-fpr::Km에서부터 균주 4까지 P1 파지 형질도입에 의해 전달하였다 (프로토콜 2에 따름). 카나마이신 내성 형질도입체를 선택하였고 ΔytfA::fldA-fpr::Km 염색체 통합의 존재를 적절한 올리고뉴클레오티드를 갖는 PCR 분석에 의해 검증하였다. 유지된 균주를 균주 5로 불렀다.
균주 6의 구축 - L-메티오닌 분비 시스템의 과다생산, ygaZH의 과다발현
메티오닌의 엑스포터를 코딩하는 이. 콜라이 유전자 ygaZH를 균주 1에서 과다발현하였다. 이들을 ygaZ의 천연 프로모터의 사용으로 중간 정도의 플라스미드 카피수 pCL1920 (Lerner & Inouye, 1990)로 클로닝하였다. 이 플라스미드를 pME1247로 명명하였다. 최종적으로, 플라스미드 pME1247을 균주 1로 형질전환시켜 균주 6을 생성하였다.
실시예 2: 코발라민-의존성 메티오닌 신타제의 과다생산 및 L-메티오닌 과다생산자 이. 콜라이 균주에서 L-메티오닌 분비 시스템의 과다생산 - 균주 7의 구축
메티오닌의 엑스포터를 코딩하는 이. 콜라이 유전자 ygaZH를 균주 5에서 과다발현하였다. 플라스미드 pME1247을 균주 5로 형질전환시켜 균주 7을 생성하였다.
실시예 3: 코발라민-의존성 메티오닌 신타제 또는 그의 재활성화 시스템의 과다생산 또는 L-메티오닌 과다생산자 씨. 글루타미쿰 재조합 균주에서 L-메티오닌 분비 시스템의 과다생산 - 균주 A 내지 F의 구축
씨. 글루타미쿰 균주 ATCC 13032 hom* ask* metH (하기에 균주 A로 지정됨)는 특허 WO2007/012078에 기재되어 있다.
그 균주 A에서, hom* 및 ask*는 각각, 단백질 Hsdh S393F를 코딩하는 호모세린 데히드로게나제 및 Ask T311I, 또한 LysC T311I로 불리는 단백질을 코딩하는 아스파르테이트 키나제의 피드백 내성 대립유전자에 상응한다.
이 균주 A를 후속적으로 특허 WO2007/012078에 기재된 바와 같이 N-메틸-N'-니트로구아니딘으로 돌연변이유발하였다. 균주 A에서 적어도 2배인 메티오닌 역가를 나타내는 클론을 단리하였다. 추가 실험에 사용된, 1종의 이러한 클론을 균주 B로 명명하였다. 이 균주 B는 씨. 글루타미쿰 L-메티오닌 생산자이다.
이어서, 씨. 글루타미쿰 균주 B를 hsk* metY metA metF DmcbR을 포함하는 균주 C를 얻기 위해 특허 WO2007/012078 및 WO2004/050694에 기재된 바와 같이 변형시켰다.
호모세린 키나제 Hsk T190A를 코딩하는 돌연변이된 대립유전자 hsk* 뿐만 아니라 O-아세틸호모세린 술프히드릴라제를 코딩하는 metY, 호모세린 아세틸-트랜스퍼라제를 코딩하는 metA, 호모시스테인 메틸라제를 코딩하는 metF를 과다발현하고, mcbR 유전자를 결실시켰다.
씨. 글루타미쿰 L-메티오닌 생산자 균주 C에서 코발라민-의존성 메티오닌 신타제 활성을 증가시키기 위해, metHcg (씨. 글루타미쿰으로부터의 metH 유전자)를 MetH 재산화 단백질로서 기능하는 페로독신 리덕타제를 코딩하는 fprA1 유전자와 함께 과다발현하였다. 이들 변형을 특허 WO2009/144270의 기재에 따라 수행하였다. 생성된 균주는 균주 D로 불렀다.
씨. 글루타미쿰 L-메티오닌 생산자 균주 C에서 코발라민-의존성 메티오닌 신타제 활성을 증가시키기 위한 또 다른 방식은, MetH 효소의 재활성화에 수반되는 플라보독신을 코딩하는 이. 콜라이로부터의 fldA 및 fpr 유전자와 함께 metHEc (이. 콜라이로부터의 metH 유전자)를 과다발현하는 것이다. 이를 특허 WO2009/144270의 기재에 따라 달성하였다. 생성된 균주는 균주 E로 불렀다.
균주 C에서 씨. 글루타미쿰의 특이적 L-메티오닌 배출 시스템을 증가시키기 위해, brnFE 오페론을 이. 콜라이-씨. 글루타미쿰 셔틀 발현 벡터 pEC-XT99A (EP1085094)으로부터 과다발현하였다. 플라스미드를 주형으로서 씨. 글루타미쿰 ATCC 13032 DNA를 사용함으로써 PCR-생성된 단편으로부터 이. 콜라이에서 구축하였다. 플라스미드를 pEC-XT99A에서 문헌 [Troetschel et al., (2005)]에 의해 기재된 바와 같이 구축하고, 생성된 플라스미드 pCB1을 후속적으로 균주 C로 형질전환시켜 균주 F를 생성하였다.
실시예 4: 씨. 글루타미쿰 L-메티오닌 과다생산자 균주에서의 L-메티오닌 분비 시스템의 과다생산과 코발라민-의존성 메티오닌 신타제의 조합된 과다생산 - 균주 G 및 H의 구축
특이적 L-메티오닌 배출 시스템 BrnFE와 씨. 글루타미쿰에서의 MetHCG, FprA1 또는 MetHEC, FldA, Fpr의 과다생산을 조합하기 위해, 상기 기재된 플라스미드 pCB1을 균주 D 및 E 내로 전기천공에 의해 도입하여 각각 균주 G 및 H를 생성하였다.
균주 G는 씨. 글루타미쿰에 속하는 유전자만을 보유하는 반면, 균주 H는 이. 콜라이로부터의 코발라민-의존성 메티오닌 신타제 및 그의 재활성화 시스템을 보유한다.
엑스포터는 모든 경우에 BrnFE이다.
실시예 5: 이. 콜라이 균주를 사용한 생물-반응기에서 발효에 의한 L-메티오닌의 생산
페드배치 전략을 사용하여 2.5 L 발효기 (피에르 게랭(Pierre Guerin))에서의 생산 조건 하에 이전 실시예에 기재된 균주를 시험하였다.
간략하게, 2.5 g.L-1 글루코스를 갖는 10 mL LB 배지에서 성장시킨 24시간 배양물을 최소 배지 (B1a)에서 24시간 전배양물을 접종하는데 사용하였다. 이들 인큐베이션을 회전식 진탕기 (200 RPM) 내 최소 배지 (B1a) 50 mL를 함유하는 500 mL 배플형 플라스크에서 수행하였다. 제1 전배양을 30℃의 온도에서 실현하였고, 제2 전배양을 34℃의 온도에서 실현하였다.
제3 전배양 단계를 5 mL 농축된 전배양물과 함께 1.2 g.L-1의 바이오매스 농도로 접종된 최소 배지 (B1b) 200 mL로 채워진 생물-반응기 (식스포르스(Sixfors))에서 수행하였다. 전배양 온도를 34℃에서 일정하여 유지하고, pH를 10% NH4OH 용액을 사용하여 6.8의 값으로 자동으로 조정하였다. 공기 공급 및/또는 교반으로 용존 산소 농도를 부분 공기압 포화 30%의 값으로 연속적으로 조정하였다. 배치 배지로부터 글루코스 소진 후, 약 20 g.L-1의 최종 세포 농도를 얻기 위해 0.13 h-1의 성장 속도로 26시간 동안 지수적으로 증가시키기 전에, 페드배치를 초기 유속 0.7 mL.h-1로 개시하였다.
<표 4> 전배양 배치 미네랄 배지 조성 (B1a 및 B1b)
Figure 112016028664995-pct00041
<표 5> 전배양 페드배치 미네랄 배지 조성 (F1)
Figure 112016028664995-pct00042
후속적으로, 2.5 L 발효기 (피에르 게랭)를 최소 배지 (B2) 600 또는 620 mL로 채우고, 80 내지 100 mL 범위의 전배양물 부피를 갖는 3.2 g.L-1의 바이오매스 농도로 접종하였다.
세포 성장을 포스페이트에 의해 제어하였고, 이는 배치 배지 B2에서 최종 포스페이트 농도가 상이한 농도의 KH2PO4, K2HPO4 및 (NH4)2HPO4의 첨가에 의해, 0 내지 20 mM 사이를 포함하는 값으로 조정하였던 이유이다. 동일한 방식에서, F2 배지의 최종 포스페이트 농도를 상이한 농도의 KH2PO4, K2HPO4 및 (NH4)2HPO4의 첨가에 의해, 5 내지 30 mM 사이를 포함하는 값으로 조정하였다. 페드배치 배지에서 티오술페이트 농도는 배양 동안 이 화합물의 고갈을 방지하기 위해 조정될 수 있다.
<표 6> 배양 배치 미네랄 배지 조성 (B2)
Figure 112016028664995-pct00043
<표 7> 배양 페드배치 배지 조성 (F2)
Figure 112016028664995-pct00044
배양 온도를 37℃에서 일정하게 유지하고, NH4OH 용액 (10% 및 28%)의 자동 첨가에 의해 pH는 작업 값 (6.8)으로 유지하였다. 초기 교반 속도를 배치 기 동안 200 RPM으로 설정하고, 페드배치 기 동안 1000 RPM까지 증가시켰다. 초기 기류 속도를 배치 기 동안 40 NL.h-1로 설정하고, 페드배치 기의 초기에 100 NL.h-1로 증진시켰다. 용존 산소 농도를 교반을 증가시키면서 20 내지 40%, 우선적으로 30% 포화도 값으로 유지하였다.
필요한 경우에 IPTG를 배치 및 페드배치 배지에 최종 농도 20 μM로 첨가하였다. 필요한 경우에, 항생제를 스펙티노마이신에 대해 50 mg.L-1의 농도로, 클로람페니콜에 대해 30 mg.L-1의 농도로, 카나마이신에 대해 50 mg.L-1의 농도로 및 암피실린에 대해 100 mg.L-1의 농도로 첨가하였다.
세포 매스가 5 g.L-1에 근접한 농도에 도달했을 때, 페드배치를 5 mL.h-1의 초기 유량으로 개시하였다. 공급 용액을 25시간 후에 24 mL.h-1에 도달하는 증가하는 유량으로 S자형 프로파일로 주입하였다. 정확한 공급 조건을 하기 방정식에 의해 계산하였다:
Figure 112016028664995-pct00045
.
여기서 Q(t)는 mL.h-1 단위의 공급 유량이며, p1 = 1.80, p2 = 22.4, p3 = 0.27, p4 = 6.50이다. 이 유량을 전체 배양 전반에 걸쳐 10 내지 50%, 우선적으로 20 내지 30%로 증가시켰다.
25시간 페드배치 후에, 공급 용액 펌프를 정지시키고, 배양을 글루코스 소진 후에 완결시켰다.
세포외 아미노산을 OPA/Fmoc 유도체화 후에 HPLC에 의해 정량화하고, 다른 관련 대사물을 굴절계 검출 (유기 산 및 글루코스)과 함께 HPLC 및 실릴화 후 GC-MS를 사용하여 분석하였다.
이. 콜라이에서 metH, fldA, fpr 과다발현 및 ygaZH 과다발현의 조합의 영향을 시험하였다. 결과는 표 8에 제시되어 있다.
<표 8> 상이한 균주에 의해 페드배치 배양물에서 생산된 최대 및 최종 메티오닌 수율 및 호모란티오닌 농도. 관심 균주, 균주 5, 6 및 7의 성능을 참조 균주 1과 비교하고, 동일한 조건에서 배양하였다. 기호 ~는 균주 사이에 차이가 없음을 나타내고, 기호 +는 1 내지 5% 증가를 나타내고, 기호 ++는 5 내지 10% 증가를 나타내고, 기호 +++는 10% 초과의 증가를 나타낸다. 메티오닌/글루코스 수율의 정의에 대해 하기 참조.
Figure 112016028664995-pct00046
이들 결과는, 이. 콜라이에서, ygaZH 유전자의 과다발현만으로 메티오닌의 생산에 이익이 없음 (균주 6)을 나타낸다 . 이. 콜라이에서의 코발라민-의존성 메티오닌 신타제 시스템의 과다발현은 메티오닌의 개선된 생산으로 이어졌다 (균주 5). 놀랍게도, 본 발명자들은 유전자 ygaZH 및 코발라민-의존성 메티오닌 신타제 시스템의 과다발현의 조합이 메티오닌 생산에 대해 상승작용적 효과를 가져 메티오닌의 예상외의 증가된 생산으로 이어지는 것을 관찰하였다. 더욱이 이 조합은 또한 호모란티오닌 생산에 유리한 영향을 또한 미쳐 보다 우수한 순도를 갖는 메티오닌으로 이어졌다.
메티오닌/글루코스 수율 (Ymet)의 결정
pH를 조절하기 위해 및 배양물을 공급하기 위해 첨가된 용액의 양을 초기 부피에 첨가하고, 샘플링에 사용되고 증발에 의해 손실된 부피를 감산함으로써 반응기 부피를 계산하였다.
페드배치 부피를 공급 스톡의 중량을 측정함으로써 연속적으로 추적하였다. 이어서, 주입된 글루코스의 양을 주입된 중량, 용액의 밀도 및 브릭스 (Brix)의 방법에 의해 결정된 글루코스 농도 ([글루코스])를 기반으로 하여 계산하였다. 메티오닌 수율을 하기와 같이 표현하였다:
Figure 112016028664995-pct00047
메티오닌0 및 메티오닌t는 각각 초기 및 최종 메티오닌 농도이고, V0 및 Vt는 초기 및 순간 t의 부피이다.
소모된 글루코스를 하기와 같이 계산하였다:
Figure 112016028664995-pct00048
주입된 글루코스t = 공급 부피t * [글루코스]
소모된 글루코스t = [글루코스]0 * V0 + 주입된 글루코스 - [글루코스]잔류 * Vt이며, [글루코스]0, [글루코스], [글루코스]잔류는 각각 초기, 공급, 및 잔류 글루코스 농도이다.
코발라민-의존성 메티오닌 신타제 활성 검정
코발라민-의존성 메티오닌 활성 검정은 문헌 [Drummond et al., in 1995]에 의해 기재된 검정의 변형법이다.
코발라민-의존성 메티오닌 신타제 활성은 350 nm의 파장에서 및 37℃의 일정한 온도에서 분광광도계로 산물 테트라히드로폴레이트 (H4폴레이트) 농도를 측정함으로써 검정하였다.
반응 혼합물을 800μl의 최종 부피에서 80 mM 포타슘 포스페이트 pH7.2, 20 mM DTT, 15 μM S-아데노실메티오닌 (SAM), 0.6 mM (6R,S)-5-메틸-5,6,7,8-테트라히드로폴산, 40μM 히드록소코발라민, 0.1mM 아연 클로라이드 및 8μg의 조 추출물로 수행하였다. 반응 혼합물을 0.8 mM의 최종 농도에서 기질 호모시스테인의 첨가에 의해 반응을 개시하기 전에 37℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 37℃에서 5분 후에, 산성 유도체화 용액 (60% 포름산 중 4M HCl) 200 μl를 부피를 1ml로 만드는 전환을 켄칭하기 위해 첨가하고, 튜브를 10분 동안 80℃에서 가열하였다. 이 단계는 반응의 효소적 산물, 산 중에서 안정하지 않은 테트라히드로폴레이트를 안정화시키기 위해 필요하다. 열은 350 nm에서 광을 흡수하는 메테닐테트라히드로폴레이트의 형성으로 이어지는 반면, 잔류 기질 5-메틸테트라히드로폴레이트는 350 nm에서의 흡광도에 기여하지 않는다. 반응 블랭크는 기질 호모시스테인을 제외한 반응 혼합물의 모든 구성요소를 함유하였다.
FldA 및 Fpr의 단백질 수준의 정량화
2종의 단백질을 정량화하기 위해, 항체를 플라보독신-1 (fldA) 및 플라보독신 리덕타제 (fpr)에 대해 생성하고 (토끼로부터의 항체, 유로젠텍 (Eurogentec)),웨스턴 블롯 실험에 사용하였다. 웨스턴 블롯 검출을 염소 항-토끼 AP를 사용하여 수행하였다. 염색된 블롯에서 FldA 및 Fpr의 단백질 수준을 상업적으로 입수가능한 영상화 시스템 (엡손 익스프레션 1680 프로페셔널(Epson Expression 1680 professional))으로 정량화하고, 본 특허에 기재된 상이한 균주에서 비교하였다.
실시예 6: 씨. 글루타미쿰 균주를 사용한 발효에 의한 L-메티오닌의 생산
균주를 특허 출원 WO2009/144270에 기재된 바와 동일한 조건하에 플라스크에서 배양하였다.
<표 9> 참조 균주 C와 비교된 씨. 글루타미쿰 균주 D, E, F, G 및 H에 의해 생산된 메티오닌 역가. 기호 ~는 균주 사이에 차이가 없음을 나타내고, 기호 +는 1 내지 3% 증가를 나타내고, 기호 ++는 3% 초과의 증가를 나타낸다.
Figure 112016028664995-pct00049
이. 콜라이와 유사하게, 씨. 글루타미쿰에서, 유전자 brnFE 및 코발라민-의존성 메티오닌 신타제 시스템의 과다발현의 조합 (이. 콜라이로부터 - 균주 H 및 씨. 글루타미쿰으로부터 - 균주 G)은 메티오닌 생산에 대해 상승작용적 효과를 가져 메티오닌의 예상외의 증가된 생산으로 이어졌다.
실시예 7: L-메티오닌의 이. 콜라이 균주 과다생산자에서 코발라민-의존성 메티오닌 신타제의 과다생산 및 상동 L-메티오닌 분비 시스템의 과다생산 - 균주 8 내지 17의 구축
시트로박터 종, 라오울텔라 종, 시겔라 종, 엔테로박터 종, 예르시니아 종 및 포토랍두스 종으로부터의 ygaZH 상동 유전자를 균주 5의 유전적 배경에서 과다발현하였다.
균주 5를 사용하기 전에, ytfA 유전자좌에 만들어진 염색체 통합의 항생제 카세트를 문헌 [Datsenko & Wanner, 2000]에 의해 기재된 바와 같이 Flp 레콤비나제를 사용하여 제거하였다 (프로토콜 1에 따름). 카나마이신 감수성 형질전환체를 선택하고, ytfA 유전자좌에서의 항생제 카세트의 부재를 적절한 올리고뉴클레오티드를 사용한 PCR 분석에 의해 검증하였다. 생성된 균주는 균주 8로 명명하였다.
균주 9의 구축 - 내인성 L-메티오닌 분비 시스템의 과다생산, 이. 콜라이로부터의 ygaZH의 과다발현
동일한 유전적 배경에서 이. 콜라이로부터의 ygaZH의 과다발현 및 ygaZH 상동체의 과다발현의 효과를 비교하기 위해, 이. 콜라이로부터의 ygaZH를 보유하는 플라스미드 pME1247을 균주 8로 형질변환시켜 균주 9를 생성하였다.
균주 10 내지 17의 구축 - 상동 L-메티오닌 분비 시스템의 과다생산, 표 10에 열거된 속 및 종으로부터의 ygaZH의 과다발현
표 10에 열거된 ygaZH 상동 유전자를 과다발현하기 위해, 유전자의 각 쌍을 이. 콜라이 ygaZH 유전자에 대해 이전에 기재된 바와 같이 이. 콜라이 ygaZ 유전자의 천연 프로모터 및 천연 리보솜 결합 부위를 사용하여 중간 정도의 카피수 플라스미드 pCL1920 (Lerner & Inouye, 1990)로 클로닝하고, 표 11에 명시된 바와 같이, ygaZH 상동체 유전자는 이. 콜라이에 코돈 용법을 최적화하거나 최적화하지 않고, 상응하는 균주의 게놈 DNA로부터 증폭시키나 화학적으로 합성하였다 (진아트(GeneArt)® 진 신테시스 서비스(Gene Synthesis service)와 함께 진옵티마이저(GeneOptimizer)® 소프트웨어 - 라이프테크놀로지스(Lifetechnologies)에 의해 제안된 바와 같음). ygaZH 상동 유전자를 포함하는 증폭된 DNA 단편을 표 11에 나타낸 서열 번호로 개시하였다. 생성된 플라스미드를 표 11에 언급된 바와 같이 명명하였다. 최종적으로 각 플라스미드를 균주 8로 형질변환시켜 표 11에 언급된 바와 같은 균주 10 내지 17을 생성하였다.
<표 10> YgaZH 상동체 단백질
Figure 112016028664995-pct00050
<표 11> ygaZH 상동체 유전자를 보유하는 플라스미드 및 균주
Figure 112016028664995-pct00051
실시예 8: 플라스크 실험에서 발효에 의한 L-메티오닌의 생산
코발라민 의존성 메티오닌 신타제 MetH 뿐만 아니라 다양한 미생물로부터의 상이한 L-메티오닌 분비 시스템 (이. 콜라이로부터의 YgaZH와 상동)을 과다생산하는 재조합 L-메티오닌 생산자를 소형 삼각 플라스크에서 평가하였다.
생산 균주를 소형 삼각 플라스크에서 평가하였다. 5.5 mL 전배양물을 30℃에서 21시간 동안 혼합된 배지 (2.5 g.L-1 글루코스를 갖는 10% LB 배지 (시그마 25%) 및 90% 최소 배지 PC1)에서 성장시켰다. 이를 배지 PC1에서 OD600 0.2로 50 mL 배양물에 접종하는데 사용하였다. 스펙티노마이신을 50 mg.L-1의 농도로 첨가하고, 필요한 경우에 겐타마이신을 10 mg.L-1의 농도로 첨가하였다. 배양물의 온도는 37℃였다. 배양물이 5 내지 7의 OD600에 도달하였을 때, OPA/Fmoc 유도체화 후에 HPLC에 의해 세포외 아미노산을 정량화하고, 다른 관련된 대사물을 굴절계 검출 (유기 산 및 글루코스)과 함께 HPLC 및 실릴화 후 GC-MS를 사용하여 분석하였다.
<표 12> 최소 배지 조성 (PC1)
Figure 112016028664995-pct00052
<표 13> ygaZH 상동체 유전자 뿐만 아니라 metH, fldA 및 fpr 유전자의 과다발현을 보유하는 관심 균주에 의해 플라스크 배양에서 생산된 g 메티오닌 / 글루코스 g %로 메티오닌 수율 (Ymet). 메티오닌/글루코스 수율의 정확한 정의에 대해 하기 참조. "n"은 반복 횟수를 나타낸다.
Figure 112016028664995-pct00053
표 13에서 보여질 수 있는 바와 같이, metH, fldA, fpr 유전자를 과다발현하는 L-메티오닌 생산자에서 상이한 미생물로부터의 ygaZH 상동 유전자의 과다발현은 이. 콜라이로부터의 ygaZH를 과다발현하는 균주 9를 사용하여 얻어진 것들과 동등하거나 그들보다 우수한 성능으로 이어졌다. 이. 콜라이와는 다른 미생물로부터의 상동 L-메티오닌 분비 시스템은 박테리아의 내인성 단백질을 대체할 수 있다.
시트로박터 코세리 (균주 10, Ymet=19.6g/g), 시트로박터 요웅가에 (균주 16, Ymet=19.6g/g), 시트로박터 프레운디이 (균주 17, Ymet=19.6g/g) 및 엔테로박터 종 (균주 13, Ymet=19.4g/g)으로부터의 상동 단백질 YgaZH는 균주 9 (Ymet=18.7g/g)와 비교하여 생산의 최고 L-메티오닌 수율을 나타내었다.
메티오닌 수율을 하기와 같이 표현하였다:
Figure 112016028664995-pct00054
참고문헌
Figure 112016028664995-pct00055
SEQUENCE LISTING <110> METABOLIC EXPLORER <120> Microorganism for methionine production with improved methionine synthase activity and methionine efflux <130> D32914 <140> PCT/EP2014/068539 <141> 2014-09-01 <150> EP13306185.3 <151> 2013-08-30 <160> 35 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 245 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Met Glu Ser Pro Thr Pro Gln Pro Ala Pro Gly Ser Ala Thr Phe Met 1 5 10 15 Glu Gly Cys Lys Asp Ser Leu Pro Ile Val Ile Ser Tyr Ile Pro Val 20 25 30 Ala Phe Ala Phe Gly Leu Asn Ala Thr Arg Leu Gly Phe Ser Pro Leu 35 40 45 Glu Ser Val Phe Phe Ser Cys Ile Ile Tyr Ala Gly Ala Ser Gln Phe 50 55 60 Val Ile Thr Ala Met Leu Ala Ala Gly Ser Ser Leu Trp Ile Ala Ala 65 70 75 80 Leu Thr Val Met Ala Met Asp Val Arg His Val Leu Tyr Gly Pro Ser 85 90 95 Leu Arg Ser Arg Ile Ile Gln Arg Leu Gln Lys Ser Lys Thr Ala Leu 100 105 110 Trp Ala Phe Gly Leu Thr Asp Glu Val Phe Ala Ala Ala Thr Ala Lys 115 120 125 Leu Val Arg Asn Asn Arg Arg Trp Ser Glu Asn Trp Met Ile Gly Ile 130 135 140 Ala Phe Ser Ser Trp Ser Ser Trp Val Phe Gly Thr Val Ile Gly Ala 145 150 155 160 Phe Ser Gly Ser Gly Leu Leu Gln Gly Tyr Pro Ala Val Glu Ala Ala 165 170 175 Leu Gly Phe Met Leu Pro Ala Leu Phe Met Ser Phe Leu Leu Ala Ser 180 185 190 Phe Gln Arg Lys Gln Ser Leu Cys Val Thr Ala Ala Leu Val Gly Ala 195 200 205 Leu Ala Gly Val Thr Leu Phe Ser Ile Pro Val Ala Ile Leu Ala Gly 210 215 220 Ile Val Cys Gly Cys Leu Thr Ala Leu Ile Gln Ala Phe Trp Gln Gly 225 230 235 240 Ala Pro Asp Glu Leu 245 <210> 2 <211> 111 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 2 Met Ser Tyr Glu Val Leu Leu Leu Gly Leu Leu Val Gly Val Ala Asn 1 5 10 15 Tyr Cys Phe Arg Tyr Leu Pro Leu Arg Leu Arg Val Gly Asn Ala Arg 20 25 30 Pro Thr Lys Arg Gly Ala Val Gly Ile Leu Leu Asp Thr Ile Gly Ile 35 40 45 Ala Ser Ile Cys Ala Leu Leu Val Val Ser Thr Ala Pro Glu Val Met 50 55 60 His Asp Thr Arg Arg Phe Val Pro Thr Leu Val Gly Phe Ala Val Leu 65 70 75 80 Gly Ala Ser Phe Tyr Lys Thr Arg Ser Ile Ile Ile Pro Thr Leu Leu 85 90 95 Ser Ala Leu Ala Tyr Gly Leu Ala Trp Lys Val Met Ala Ile Ile 100 105 110 <210> 3 <211> 244 <212> PRT <213> Citrobacter koseri <400> 3 Met Glu Ser Pro Ala Pro Gln Ser Glu Pro Arg Pro Ala Thr Leu Thr 1 5 10 15 Glu Gly Phe Lys Asp Ser Leu Pro Ile Val Ile Ser Tyr Ile Pro Val 20 25 30 Ala Phe Ala Phe Gly Leu Asn Ala Thr Arg Leu Gly Phe Thr Pro Leu 35 40 45 Glu Ser Val Phe Phe Ser Cys Ile Ile Tyr Ala Gly Ala Ser Gln Phe 50 55 60 Val Ile Thr Thr Met Leu Ala Ala Gly Ser Thr Leu Trp Val Ala Ala 65 70 75 80 Leu Thr Val Met Ala Met Asp Val Arg His Val Leu Tyr Gly Pro Ser 85 90 95 Leu Arg Ser Arg Ile Ser Gln Arg Leu Ser Lys Pro Lys Thr Ala Leu 100 105 110 Trp Ala Phe Gly Leu Thr Asp Glu Val Phe Ala Ala Ala Thr Ala Lys 115 120 125 Leu Val Arg Asp Asn Arg Arg Trp Ser Glu Trp Met Ile Gly Ile Ala 130 135 140 Phe Cys Ser Trp Ala Ser Trp Val Leu Gly Thr Val Ile Gly Ala Phe 145 150 155 160 Ser Gly Ser Gly Leu Leu Lys Gly Phe Pro Ala Val Glu Ala Ala Leu 165 170 175 Gly Phe Met Leu Pro Ala Leu Phe Met Ser Phe Leu Leu Ala Ser Phe 180 185 190 Gln Arg Lys Gln Thr Leu Cys Val Thr Ala Ala Leu Ile Gly Ala Leu 195 200 205 Ala Gly Val Thr Leu Phe Ser Ile Pro Ala Ala Ile Leu Ala Gly Ile 210 215 220 Ala Ser Gly Cys Leu Thr Ala Leu Ile Gln Ser Phe Trp Gln Gly Ala 225 230 235 240 Pro Asp Glu Leu <210> 4 <211> 111 <212> PRT <213> Citrobacter koseri <400> 4 Met Ser Tyr Glu Val Leu Leu Leu Gly Leu Leu Val Gly Cys Ala Asn 1 5 10 15 Tyr Cys Phe Arg Tyr Leu Pro Leu Arg Leu Arg Met Gly Asn Thr Arg 20 25 30 Pro Ala Arg Arg Gly Ala Thr Gly Val Leu Leu Asp Thr Ile Gly Ile 35 40 45 Ala Ser Ile Cys Ala Leu Leu Val Val Ser Thr Ala Pro Glu Val Met 50 55 60 His Asp Ala Ser Arg Phe Ile Pro Thr Leu Val Gly Phe Ala Val Leu 65 70 75 80 Gly Val Ser Phe Tyr Lys Thr Arg Ser Ile Ile Ile Pro Thr Leu Leu 85 90 95 Ser Ala Leu Gly Tyr Gly Leu Ala Trp Lys Ile Glu Val Ile Leu 100 105 110 <210> 5 <211> 245 <212> PRT <213> Shigella flexneri <400> 5 Met Glu Ser Pro Val Pro Gln Ser Glu Ser Arg Ser Ala Thr Leu Thr 1 5 10 15 Glu Gly Phe Lys Asp Ser Leu Pro Ile Val Ile Ser Tyr Ile Pro Val 20 25 30 Ala Phe Ala Phe Gly Met Asn Ala Thr Arg Leu Gly Phe Thr Pro Val 35 40 45 Glu Ser Val Phe Phe Ser Cys Ile Ile Tyr Ala Gly Ala Ser Gln Phe 50 55 60 Val Ile Thr Thr Met Leu Ala Ala Gly Ser Ser Leu Trp Val Ala Ala 65 70 75 80 Leu Thr Val Met Ala Met Asp Val Arg His Val Leu Tyr Gly Pro Ser 85 90 95 Leu Arg Ser Arg Ile Ala Arg Gln Leu Ser Lys Pro Lys Ser Ala Leu 100 105 110 Trp Ala Phe Gly Leu Thr Asp Glu Val Phe Ala Ala Ala Thr Ala Lys 115 120 125 Leu Val Arg Asp Asn Arg Arg Trp Ser Glu Asn Trp Met Ile Gly Ile 130 135 140 Ala Leu Cys Ser Trp Ala Ser Trp Val Leu Gly Thr Val Ile Gly Ala 145 150 155 160 Phe Ser Gly Thr Gly Leu Leu Lys Gly Phe Pro Ala Val Glu Ala Ala 165 170 175 Leu Gly Phe Met Leu Pro Ala Leu Phe Met Ser Phe Leu Leu Ala Ser 180 185 190 Phe Gln Arg Asn Gln Thr Leu Cys Val Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala 195 200 205 Leu Ala Gly Val Thr Leu Phe Ser Ile Pro Ala Ala Ile Leu Ala Gly 210 215 220 Ile Val Cys Gly Cys Leu Thr Ala Leu Ile Gln Ser Phe Trp Gln Gly 225 230 235 240 Gly Pro Asp Glu Leu 245 <210> 6 <211> 111 <212> PRT <213> Shigella flexneri <400> 6 Met Ser Tyr Glu Val Leu Leu Leu Gly Leu Leu Val Gly Cys Val Asn 1 5 10 15 Tyr Cys Phe Arg Tyr Leu Pro Leu Arg Leu Arg Met Gly Asn Val Arg 20 25 30 Pro Thr Lys Arg Gly Ala Thr Gly Ile Leu Leu Asp Thr Ile Gly Ile 35 40 45 Ala Ser Ile Cys Ala Leu Leu Val Val Ser Thr Ala Pro Glu Val Met 50 55 60 His Asp Ala Arg Arg Phe Val Pro Thr Leu Val Gly Phe Val Val Leu 65 70 75 80 Gly Ala Ser Phe Tyr Lys Thr Arg Ser Ile Ile Ile Pro Thr Leu Leu 85 90 95 Ser Ala Leu Gly Tyr Gly Leu Ala Trp Lys Met Leu Phe Val Leu 100 105 110 <210> 7 <211> 242 <212> PRT <213> Raoultella ornithinolytica <400> 7 Met Glu Lys Pro Ala Pro Ala Ser Glu Ala Thr Leu Pro Glu Gly Ile 1 5 10 15 Lys Asp Ser Leu Pro Ile Val Ile Ser Tyr Ile Pro Val Ala Phe Ala 20 25 30 Phe Gly Leu Asn Ala Thr Arg Leu Gly Phe Thr Pro Leu Glu Ser Leu 35 40 45 Phe Phe Ser Cys Ile Ile Tyr Ala Gly Ala Ser Gln Phe Val Ile Thr 50 55 60 Ala Met Leu Ala Ala Gly Ser Ser Leu Trp Val Ala Ala Leu Thr Val 65 70 75 80 Met Ala Met Asp Val Arg His Val Leu Tyr Gly Pro Ser Leu Arg Ser 85 90 95 Arg Ile His Arg Ala Leu Asp Lys Arg Lys Thr Ala Leu Trp Ala Phe 100 105 110 Gly Leu Thr Asp Glu Val Phe Ala Ala Ala Thr Ala Lys Leu Val Arg 115 120 125 Asp Asn Arg Arg Trp Ser Glu Ser Trp Met Leu Gly Ile Ala Phe Thr 130 135 140 Ser Trp Ile Ser Trp Val Phe Gly Thr Leu Ile Gly Ala Tyr Ser Gly 145 150 155 160 Ser Gly Leu Leu Val Gly Phe Pro Ala Val Glu Ala Ala Leu Ser Phe 165 170 175 Met Leu Pro Ala Leu Phe Met Ser Phe Leu Leu Ala Ser Phe Gln Arg 180 185 190 Lys Gln Ser Leu Ser Val Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Leu Gly Gly 195 200 205 Ile Ile Leu Phe Ser Ile Pro Ala Ala Ile Leu Ala Gly Ile Val Cys 210 215 220 Gly Cys Leu Ala Ala Leu Ile Gln Ala Ser Ile Gln Gly Met Pro Asp 225 230 235 240 Glu Gln <210> 8 <211> 113 <212> PRT <213> Raoultella ornithinolytica <400> 8 Met Asn Asn Asn Val Leu Ile Ile Gly Ile Val Val Gly Cys Val Asn 1 5 10 15 Tyr Leu Phe Arg Tyr Leu Pro Leu Arg Leu Arg Ala Gly Asn Ala Arg 20 25 30 Pro Thr Arg Arg Gly Pro Leu Ser Val Leu Leu Asp Thr Ile Gly Ile 35 40 45 Ala Ser Ile Cys Ala Leu Leu Ile Val Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu 50 55 60 Ser Asp Ser Arg Arg Leu Leu Pro Thr Leu Val Gly Phe Thr Val Leu 65 70 75 80 Gly Leu Ala Phe Trp Lys Thr Arg Ser Ile Ile Met Pro Thr Leu Leu 85 90 95 Ser Ala Leu Ala Tyr Gly Ile Ala Trp Lys Ile Thr Thr Phe Leu Tyr 100 105 110 Phe <210> 9 <211> 250 <212> PRT <213> Enterobacter sp. (R4-368) <400> 9 Met Asp Met Asp Ser Ser Val Thr Ala Thr Lys Ser Thr Ser Asp Gln 1 5 10 15 Ser Ala Thr Phe Leu Glu Gly Ile Lys Asp Ser Leu Pro Ile Val Leu 20 25 30 Ser Tyr Val Pro Val Ala Phe Ala Phe Gly Met Asn Ala Thr Lys Leu 35 40 45 Gly Phe Thr Pro Leu Glu Ser Val Phe Phe Ser Cys Ile Ile Tyr Ala 50 55 60 Gly Ala Ser Gln Phe Val Ile Thr Thr Met Leu Ala Ala Gly Ser Ala 65 70 75 80 Leu Trp Val Ala Ala Leu Thr Val Met Ala Met Asp Val Arg His Val 85 90 95 Leu Tyr Gly Pro Ser Leu Arg Ser Arg Ile Leu Gln Pro Leu Lys Asn 100 105 110 Arg Lys Thr Ala Val Trp Ala Phe Gly Leu Thr Asp Glu Val Phe Ala 115 120 125 Ala Ala Thr Ala Lys Leu Val Arg Asp Asn Arg Arg Trp Ser Glu Asn 130 135 140 Trp Met Ile Gly Ile Ala Leu Phe Ser Trp Leu Ser Trp Val Ala Gly 145 150 155 160 Thr Val Leu Gly Ala Phe Ser Gly Asp Gly Leu Leu Asp Gly Tyr Pro 165 170 175 Ala Val Glu Ser Ala Leu Gly Phe Met Leu Pro Ala Leu Phe Met Ser 180 185 190 Phe Leu Leu Ala Ser Phe Gln Arg Arg Gln Ile Ser Ala Val Thr Ala 195 200 205 Ala Leu Leu Gly Ala Leu Ala Gly Val Thr Leu Phe Ser Ile Pro Ala 210 215 220 Ala Ile Leu Ala Gly Ile Phe Ala Gly Cys Leu Ala Ala Leu Val Gln 225 230 235 240 Ala Phe Tyr Gln Gly Ala Ser Asp Ala Gln 245 250 <210> 10 <211> 111 <212> PRT <213> Enterobacter sp. (R4-368) <400> 10 Met Arg Asn Glu Val Leu Leu Leu Gly Leu Leu Val Gly Cys Val Asn 1 5 10 15 Phe Leu Phe Arg Tyr Leu Pro Leu Arg Ile Arg Ala Gly Gln Ser Arg 20 25 30 Pro Ala Lys Arg Gly Val Ser Gly Val Phe Leu Asp Thr Ile Gly Ile 35 40 45 Ala Ser Ile Cys Ala Leu Leu Val Val Ser Cys Val Pro Glu Ile Ala 50 55 60 Ala Asp Ser Arg Arg Leu Leu Pro Thr Leu Ala Gly Phe Ala Val Leu 65 70 75 80 Gly Val Ser Phe Trp Lys Thr Arg Ser Ile Ile Leu Pro Thr Leu Leu 85 90 95 Ser Ala Phe Ala Tyr Gly Ile Val Trp Lys Leu Leu Ala Asp Ala 100 105 110 <210> 11 <211> 257 <212> PRT <213> Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica <400> 11 Met Gln Ser Gln Thr Thr Asp Ser Pro Ser Thr Ala Gln Pro Thr Ala 1 5 10 15 Thr Phe Ile Glu Gly Ile Thr Asp Ser Leu Pro Ile Val Ile Gly Tyr 20 25 30 Leu Pro Val Ala Phe Ala Phe Gly Leu Ser Ser Val Lys Leu Gly Phe 35 40 45 Thr Pro Trp Glu Ala Ile Phe Phe Ser Cys Ile Ile Tyr Ala Gly Ala 50 55 60 Ser Gln Phe Val Ile Thr Ala Leu Leu Ser Ala Gly Met Ser Leu Trp 65 70 75 80 Val Ser Ala Leu Thr Val Met Ala Met Asp Val Arg His Ile Leu Tyr 85 90 95 Gly Pro Ala Leu Lys His Arg Ile Val Thr Arg Leu Ser Gly Lys Lys 100 105 110 Thr Ala Leu Trp Ala Phe Gly Leu Thr Asp Glu Val Phe Ala Ala Ala 115 120 125 Thr Thr Lys Leu Met Lys Asp Gln Arg Arg Trp Ser Glu Asn Trp Met 130 135 140 Leu Gly Ile Ala Phe Thr Ser Trp Leu Ser Trp Val Ala Gly Thr Ala 145 150 155 160 Ile Gly Ala Met Phe Gly His Gly Pro Leu Glu Asn Tyr Pro Ala Ile 165 170 175 Glu Ala Ser Leu Ser Phe Met Leu Pro Ala Leu Phe Leu Ser Phe Leu 180 185 190 Leu Ala Ser Phe Lys Arg Gln Tyr Ser Leu Thr Val Ile Ala Ser Leu 195 200 205 Thr Gly Ala Leu Leu Gly Val Leu Leu Phe Ser Ile Pro Val Ala Ile 210 215 220 Leu Ala Gly Ile Gly Gly Gly Cys Leu Ala Ala Leu Leu Gln Pro Val 225 230 235 240 Pro Glu Thr Val Ile Glu Asn Asn Glu Ser Asp Lys Glu Glu Pro Lys 245 250 255 Pro <210> 12 <211> 257 <212> PRT <213> Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica <400> 12 Met Gln Ser Gln Thr Thr Asp Ser Pro Ser Thr Ala Gln Pro Thr Ala 1 5 10 15 Thr Phe Ile Glu Gly Ile Thr Asp Ser Leu Pro Ile Val Ile Gly Tyr 20 25 30 Leu Pro Val Ala Phe Ala Phe Gly Leu Ser Ser Val Lys Leu Gly Phe 35 40 45 Thr Pro Trp Glu Ala Ile Phe Phe Ser Cys Ile Ile Tyr Ala Gly Ala 50 55 60 Ser Gln Phe Val Ile Thr Ala Leu Leu Ser Ala Gly Met Ser Leu Trp 65 70 75 80 Val Ser Ala Leu Thr Val Met Ala Met Asp Val Arg His Ile Leu Tyr 85 90 95 Gly Pro Ala Leu Lys His Arg Ile Val Thr Arg Leu Ser Gly Lys Lys 100 105 110 Thr Ala Leu Trp Ala Phe Gly Leu Thr Asp Glu Val Phe Ala Ala Ala 115 120 125 Thr Thr Lys Leu Met Lys Asp Gln Arg Arg Trp Ser Glu Asn Trp Met 130 135 140 Leu Gly Ile Ala Phe Thr Ser Trp Leu Ser Trp Val Ala Gly Thr Ala 145 150 155 160 Ile Gly Ala Met Phe Gly His Gly Pro Leu Glu Asn Tyr Pro Ala Ile 165 170 175 Glu Ala Ser Leu Ser Phe Met Leu Pro Ala Leu Phe Leu Ser Phe Leu 180 185 190 Leu Ala Ser Phe Lys Arg Gln Tyr Ser Leu Thr Val Ile Ala Ser Leu 195 200 205 Thr Gly Ala Leu Leu Gly Val Leu Leu Phe Ser Ile Pro Val Ala Ile 210 215 220 Leu Ala Gly Ile Gly Gly Gly Cys Leu Ala Ala Leu Leu Gln Pro Val 225 230 235 240 Pro Glu Thr Val Ile Glu Asn Asn Glu Ser Asp Lys Glu Glu Pro Lys 245 250 255 Pro <210> 13 <211> 113 <212> PRT <213> Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica <400> 13 Met Asn Met Asp Val Val Ile Ile Gly Leu Val Val Gly Thr Val Asn 1 5 10 15 Tyr Leu Phe Arg Tyr Leu Pro Leu Arg Leu Gly Pro Ala Arg Lys Gln 20 25 30 Ala Gly Leu Gln Arg Gly Lys Val Ser Leu Leu Leu Asp Ser Ile Gly 35 40 45 Ile Ala Ser Ile Cys Ala Leu Leu Val Val Ser Ser Thr Pro Glu Ile 50 55 60 Val His Thr Pro Gln Lys Leu Ile Pro Thr Leu Ile Gly Phe Leu Val 65 70 75 80 Ile Cys Gly Cys Phe Tyr Lys Thr Asn Ser Ile Ile Phe Ala Thr Leu 85 90 95 Leu Gly Ala Leu Ser Tyr Gly Leu Thr Phe Lys Leu Leu Met Ile Leu 100 105 110 Ala <210> 14 <211> 113 <212> PRT <213> Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica <400> 14 Met Asn Met Asp Val Val Ile Ile Gly Leu Val Val Gly Thr Val Asn 1 5 10 15 Tyr Leu Phe Arg Tyr Leu Pro Leu Arg Leu Gly Pro Ala Arg Lys Gln 20 25 30 Ala Gly Leu Gln Arg Gly Lys Val Ser Leu Leu Leu Asp Ser Ile Gly 35 40 45 Ile Ala Ser Ile Cys Ala Leu Leu Val Val Ser Ser Thr Pro Glu Ile 50 55 60 Val His Asn Pro Gln Lys Leu Ile Pro Thr Leu Ile Gly Phe Leu Val 65 70 75 80 Ile Cys Gly Cys Phe Tyr Lys Thr Asn Ser Ile Ile Phe Ala Thr Leu 85 90 95 Leu Gly Ala Leu Ser Tyr Gly Leu Thr Phe Lys Leu Leu Met Ile Leu 100 105 110 Ala <210> 15 <211> 252 <212> PRT <213> Photorhabdus luminescens subsp. laumondii <400> 15 Met Pro Val Ser Asp Thr Ser Ser Pro Leu Thr Ser Lys Lys Ser Ser 1 5 10 15 Phe Thr Glu Gly Ile Ile Asp Ser Leu Pro Ile Val Ile Gly Tyr Ile 20 25 30 Pro Val Ala Phe Ala Phe Gly Leu Asn Ala Val Lys Leu Gly Phe Asn 35 40 45 Pro Met Glu Ala Ile Phe Phe Ser Cys Ile Ile Tyr Ala Gly Ala Ser 50 55 60 Gln Phe Val Ile Thr Ala Leu Leu Ser Ala Gly Thr Ser Leu Trp Ile 65 70 75 80 Ser Ala Leu Thr Ile Met Ala Met Asp Val Arg His Ile Leu Tyr Gly 85 90 95 Pro Ser Leu Arg His Arg Ile Lys Asp Lys Leu Thr Glu Lys Lys Thr 100 105 110 Val Ile Trp Ala Phe Gly Leu Thr Asp Glu Val Phe Ala Ala Ala Thr 115 120 125 Ala Lys Leu Ile Lys Asn His Arg Ser Trp Ser Glu Asn Trp Met Val 130 135 140 Ala Ile Ala Ile Cys Ser Trp Leu Ala Trp Gly Ala Gly Thr Ala Ala 145 150 155 160 Gly Ala Phe Leu Gly Asn Gly Tyr Leu Glu Ser Tyr Pro Ala Ile Glu 165 170 175 Ala Ala Met Ile Phe Met Leu Pro Ala Leu Phe Leu Ser Phe Leu Leu 180 185 190 Ala Ser Cys Arg Lys Gln Asn Ser Tyr Cys Val Ala Thr Ala Leu Thr 195 200 205 Gly Ala Leu Leu Gly Ile Thr Phe Phe Ser Ile Pro Val Ala Ile Leu 210 215 220 Ala Gly Ile Val Gly Gly Cys Ile Ala Ala Leu Leu Gln Pro Gln Asn 225 230 235 240 Asn Cys Asn Asp Ser Ser Glu Gln Lys Glu Thr Pro 245 250 <210> 16 <211> 112 <212> PRT <213> Photorhabdus luminescens subsp. laumondii <400> 16 Met Ile Asp Ser Lys Ile Leu Leu Ile Gly Leu Phe Val Gly Leu Ala 1 5 10 15 Asn Phe Ser Phe Arg Tyr Leu Pro Leu Arg Phe Gly Lys Ala Arg Gln 20 25 30 Ser Ala Gly Arg Lys Ala Gly Lys Thr Ser Ile Ile Leu Asp Ser Ile 35 40 45 Gly Ile Ala Ser Ile Cys Ser Leu Leu Ile Val Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Val Met Arg Glu Ser Gln Lys Leu Leu Pro Thr Leu Ile Gly Cys Leu 65 70 75 80 Thr Ile Cys Leu Val Phe Tyr Lys Thr Lys Gln Ile Ile Leu Ala Thr 85 90 95 Leu Phe Gly Ala Leu Leu Phe Gly Leu Thr Phe Lys Ile Phe Met Asn 100 105 110 <210> 17 <211> 245 <212> PRT <213> Citrobacter youngae <400> 17 Met Asp Ser Pro Ile Pro Gln Ser Gly Ser Arg Ser Ala Thr Leu Thr 1 5 10 15 Glu Gly Phe Lys Asp Ser Leu Pro Ile Val Ile Ser Tyr Ile Pro Val 20 25 30 Ala Phe Ala Phe Gly Leu Asn Ala Thr Arg Leu Gly Phe Thr Pro Val 35 40 45 Glu Ser Val Phe Leu Ser Cys Ile Ile Tyr Ala Gly Ala Ser Gln Phe 50 55 60 Val Ile Thr Thr Met Leu Ala Ala Gly Ser Ser Leu Trp Val Ala Ala 65 70 75 80 Leu Thr Val Met Ala Met Asp Val Arg His Val Leu Tyr Gly Pro Ser 85 90 95 Leu Arg Ser Arg Ile Ala Gln Arg Leu Ser Lys Pro Lys Ser Ala Leu 100 105 110 Trp Ala Phe Gly Leu Thr Asp Glu Val Phe Ala Ala Ala Thr Ala Lys 115 120 125 Leu Val Arg Asp Asn Arg Arg Trp Ser Glu Asn Trp Met Ile Gly Ile 130 135 140 Ala Leu Cys Ser Trp Ala Ser Trp Val Phe Gly Thr Ala Ile Gly Ala 145 150 155 160 Phe Ser Gly Ser Gly Leu Leu Lys Asp Tyr Pro Ala Val Glu Ala Ala 165 170 175 Leu Gly Phe Met Leu Pro Ala Leu Phe Met Ser Phe Leu Leu Ala Ser 180 185 190 Phe Gln Arg Lys Gln Ala Leu Cys Val Thr Val Ala Leu Thr Gly Ala 195 200 205 Leu Ala Gly Val Ile Leu Phe Ser Ile Pro Ala Ala Ile Leu Leu Gly 210 215 220 Ile Val Cys Gly Cys Leu Thr Ala Leu Leu Gln Ser Phe Trp Gln Gly 225 230 235 240 Gly Pro Asp Glu Leu 245 <210> 18 <211> 111 <212> PRT <213> Citrobacter youngae <400> 18 Met Ser Tyr Glu Val Leu Leu Leu Gly Leu Leu Val Gly Cys Val Asn 1 5 10 15 Tyr Cys Phe Arg Tyr Leu Pro Leu Arg Leu Gly Ala Gly Asn Val Arg 20 25 30 Pro Ala Arg Arg Gly Ala Thr Gly Ile Leu Leu Asp Thr Ile Gly Ile 35 40 45 Ala Ser Ile Cys Ala Leu Leu Val Val Ser Thr Ala Pro Glu Val Met 50 55 60 His Asp Ala Arg Arg Phe Val Pro Thr Leu Val Gly Phe Val Ile Leu 65 70 75 80 Gly Ala Ser Phe Tyr Lys Thr Arg Ser Ile Ile Ile Pro Thr Leu Leu 85 90 95 Ser Ala Leu Gly Tyr Gly Leu Ala Trp Lys Met Leu Val Gly Leu 100 105 110 <210> 19 <211> 245 <212> PRT <213> Citrobacter freundii <400> 19 Met Glu Ser Pro Val Pro Gln Ser Glu Ser Ser Ser Ala Thr Leu Thr 1 5 10 15 Glu Gly Phe Lys Asp Ser Leu Pro Ile Val Ile Ser Tyr Ile Pro Val 20 25 30 Ala Phe Ala Phe Gly Leu Asn Ala Thr Arg Leu Gly Phe Thr Pro Val 35 40 45 Glu Ser Val Phe Phe Ser Cys Ile Ile Tyr Ala Gly Ala Ser Gln Phe 50 55 60 Val Ile Thr Thr Met Leu Ala Ala Gly Ser Ser Leu Trp Val Ala Ala 65 70 75 80 Leu Thr Val Met Ala Met Asp Val Arg His Val Leu Tyr Gly Pro Ser 85 90 95 Leu Arg Ser Arg Ile Ala Gln Arg Leu Ser Lys Pro Lys Ser Ala Leu 100 105 110 Trp Ala Phe Gly Leu Thr Asp Glu Val Phe Ala Ala Ala Thr Ala Lys 115 120 125 Leu Val Arg Asp Asn Arg Arg Trp Ser Glu Asn Trp Met Ile Gly Ile 130 135 140 Ala Leu Cys Ser Trp Ala Ser Trp Val Phe Gly Thr Val Leu Gly Ala 145 150 155 160 Phe Ser Gly Ser Gly Leu Leu Lys Asp Tyr Pro Ala Val Glu Ala Ala 165 170 175 Leu Gly Phe Met Leu Pro Ala Leu Phe Met Ser Phe Leu Leu Ala Ser 180 185 190 Phe Gln Arg Lys Gln Ala Leu Cys Val Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala 195 200 205 Leu Ala Gly Val Met Leu Phe Ser Ile Pro Ala Ala Ile Leu Ala Gly 210 215 220 Ile Val Cys Gly Cys Leu Thr Ala Leu Ile Gln Ser Phe Trp Gln Gly 225 230 235 240 Gly Pro Asp Glu Leu 245 <210> 20 <211> 111 <212> PRT <213> Citrobacter freundii <400> 20 Met Ser Tyr Glu Val Leu Leu Leu Gly Leu Leu Val Gly Cys Val Asn 1 5 10 15 Tyr Cys Phe Arg Tyr Leu Pro Leu Arg Leu Gly Val Gly Asn Val Arg 20 25 30 Pro Thr Lys Arg Gly Ala Thr Gly Ile Leu Leu Asp Thr Ile Gly Ile 35 40 45 Thr Ser Ile Cys Ala Leu Leu Val Val Ser Thr Ala Pro Glu Val Met 50 55 60 His Asp Ala Arg Arg Phe Val Pro Thr Leu Val Gly Phe Val Ile Leu 65 70 75 80 Gly Ala Ser Phe Tyr Lys Thr Arg Ser Ile Ile Ile Pro Thr Leu Leu 85 90 95 Ser Ala Leu Gly Tyr Gly Leu Ala Trp Lys Met Leu Val Val Leu 100 105 110 <210> 21 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 21 aacactgcaa aatcctgcta tttgatttgt atgagtgata agtgtaacgc cgaataatcg 60 tcgttggcga attttacgac tctgacagga ggtggcaatg 100 <210> 22 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 22 gagaaagtaa acgtaacatg atgacgacaa ttctgacgat tcatgttcct tcaacgccgg 60 ggcgcgcatg gaatatgctg gtggcacttc aggcaggaaa 100 <210> 23 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 23 tgaggaatag acaatgttag ttagtaaaag caacggattt aacgctagcg cagttttggg 60 tagtggaagt tataatgaaa ataaatcttc taaacacatg 100 <210> 24 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 24 tgcgctaaaa gaaatgaata gaaccttttc gataatataa gaaaaagtga ttttcatgtt 60 ggtttactta agccaagtag tacgcgtagt gttattttag 100 <210> 25 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 25 aaattattct tgtatctttg ttataatatg ggaaagtgca accat 45 <210> 26 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 26 cgttaatcag caggttagcc agccacaaaa agccattgag aaaattattg attttacatg 60 ggattattat attgctaatc cttggttttt aaaaattgtg 100 <210> 27 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 27 tcatctaccg cgcacgaata aaactgccat ccggctggcg ggtgaacagg acctgttgat 60 tattccccgt atcaatggtt aagcccgtca ccacgccgct 100 <210> 28 <211> 1063 <212> DNA <213> Citrobacter koseri <400> 28 atggaaagcc ctgcacccca gtctgagccc cgtccggcaa cattaacgga aggattcaaa 60 gacagtttac cgatagtcat aagttatatt ccggtggcgt ttgcgtttgg ccttaacgcc 120 acccgtctgg gctttactcc cctcgaaagc gtttttttct cctgcattat ttacgcaggc 180 gccagccagt tcgtcatcac caccatgctc gcggcgggca gcacattatg ggtcgccgcg 240 ctgaccgtga tggcgatgga cgtgcgtcat gtgctgtacg gcccttccct gcgtagtcgc 300 atcagccaac ggctcagtaa acctaaaacc gccctgtggg catttggcct caccgatgaa 360 gtgtttgctg ccgccacggc caaactggtg cgggataacc gccgctggag tgaaaactgg 420 atgatcggca tcgcgttctg ctcctgggcc tcctgggtgc tcggcacggt cattggcgca 480 ttttccggga gcggattgct gaaaggcttc cccgccgttg aggcggcatt aggttttatg 540 ctgccagccc tgtttatgag ctttttgctc gcttcttttc aacgcaaaca aacgctgtgc 600 gtcacggcgg cgttaatcgg cgcgctggca ggcgtcacgc tgttttccat tcctgcggct 660 atcctggcgg gtatcgccag cgggtgtctg accgccttga tccagtcgtt ctggcaagga 720 gcgcccgatg agttatgagg ttctgctgct gggactgctg gtcggctgcg ccaattattg 780 ttttcgttat ttaccgcttc gtctgcgaat gggaaacacc cgccccgcca ggcgcggcgc 840 aacgggcgtg ttgctcgaca ccattggcat cgcgtccatc tgcgccctgc tggtggtgtc 900 tacggctccc gaagtgatgc acgacgccag ccggttcatt ccgacgctgg tcgggtttgc 960 cgtcctgggc gtcagtttct acaagacgcg cagcatcatc atcccaacgc tactgagcgc 1020 tctgggctat ggactcgcct ggaagataga ggtcatttta taa 1063 <210> 29 <211> 1063 <212> DNA <213> Shigella flexneri <400> 29 atggaaagcc ctgttcccca gtctgaatcc cgttctgcaa cgttaactga aggattcaaa 60 gacagcctac cgatagttat cagttatatt ccggtcgcat ttgcatttgg tatgaatgcg 120 actcgcctgg gctttactcc cgttgaaagc gtttttttct cctgcatcat ttacgctggc 180 gccagccagt ttgtcatcac aaccatgctc gccgcaggca gctcactgtg ggtcgcggct 240 ctgaccgtca tggcgatgga tgttcgccat gttttgtacg gcccttctct gcgcagccgt 300 atcgcccgac agctgagcaa acctaaaagc gcgctatggg cctttggcct caccgacgaa 360 gtctttgccg cggcaacggc caagctggtg cgggataacc ggcgctggag tgaaaactgg 420 atgatcggca tcgcgctatg ctcctgggct tcctgggtac ttggtacggt tatcggcgca 480 ttttccggca ctggcttact gaagggattc ccggcggtag aagcggcgct ggggtttatg 540 ctcccggcgc tgtttatgag ttttctgctg gcctctttcc agcgtaatca aacgctatgc 600 gtcacggcgg ctttagccgg tgcgctggct ggcgtgacgc tgttttctat cccggcagcc 660 atcctcgcag gcatagtctg cggatgcctg accgcgctca ttcagtcgtt ctggcaggga 720 ggtcctgatg agttatgagg ttctgctgct cggcctgctg gtcggctgcg tcaattactg 780 ttttcgctat ttaccactgc gtctgcgaat ggggaatgtg cgcccgacaa aacgcggagc 840 cactggaata ctactcgaca ccatcggtat tgcatcaatt tgcgccctgc tagtggtgtc 900 tactgcgcca gaagtgatgc acgatgcccg tcgttttgtg cctacgctgg tggggtttgt 960 ggtactgggt gcaagcttct ataagacccg cagcatcatc attccgacct tactgagtgc 1020 cctgggctat ggattagcct ggaaaatgct gtttgtctta tag 1063 <210> 30 <211> 1060 <212> DNA <213> Raoultella ornithinolytica <400> 30 atggaaaaac cggcaccggc aagcgaagca accctgccgg aaggtattaa agatagcctg 60 ccgattgtga ttagctatat tccggttgca tttgcctttg gtctgaatgc aacccgtctg 120 ggttttacac cgctggaaag cctgtttttt agctgtatta tctatgccgg tgcaagccag 180 tttgttatta ccgcaatgct ggcagcaggt agcagcctgt gggttgcagc actgaccgtt 240 atggcaatgg atgttcgtca tgttctgtat ggtccgagcc tgcgtagccg tattcatcgt 300 gcactggata aacgtaaaac cgcactgtgg gcatttggcc tgaccgatga agtttttgca 360 gcagcaaccg caaaactggt tcgtgataat cgtcgttgga gcgaaagctg gatgctgggt 420 attgcattta ccagctggat tagctgggtt tttggcaccc tgattggtgc atatagcggt 480 agcggtctgc tggttggttt tccggcagtt gaagcagccc tgagctttat gctgcctgca 540 ctgtttatga gttttctgct ggcaagcttt cagcgtaaac agagcctgag cgttaccgca 600 gcactggcag gcgcactggg tggtattatt ctgtttagca ttccggcagc aattctggca 660 ggtattgttt gtggttgtct ggcagcgctg attcaggcaa gcattcaggg tatgccggat 720 gaacaataac gttctgatta ttggtattgt ggtgggctgt gtgaattacc tgtttcgtta 780 tctgccgctg cgtctgcgtg caggtaatgc acgtccgacc cgtcgtggtc cgctgagcgt 840 tctgctggat accattggca ttgcaagcat ttgtgcactg ctgattgtta gcagcgttcc 900 ggaaattctg agcgatagcc gtcgtctgct gccgaccctg gttggtttta ccgttctggg 960 tctggcattt tggaaaaccc gtagcattat tatgccgaca ctgctgagcg cactggccta 1020 tggtattgca tggaaaatta ccacctttct gtatttttga 1060 <210> 31 <211> 1078 <212> DNA <213> Enterobacter sp. (R4-368) <400> 31 atggatatgg atagcagcgt taccgcaacc aaaagcacca gcgatcagag cgcaaccttt 60 ctggaaggta ttaaagatag cctgccgatt gttctgagct atgttccggt tgcatttgcc 120 tttggtatga atgcaaccaa actgggtttt acaccgctgg aaagcgtgtt ttttagctgt 180 attatctatg ccggtgcaag ccagtttgtt attaccacca tgctggcagc aggtagcgca 240 ctgtgggttg cagcactgac cgttatggca atggatgttc gtcatgttct gtatggtccg 300 agcctgcgta gccgtattct gcagccgctg aaaaatcgta aaaccgcagt gtgggcattt 360 ggtctgaccg atgaagtttt tgcagcagca accgcaaaac tggttcgtga taatcgtcgt 420 tggagcgaaa attggatgat tggtattgca ctgtttagct ggctgagctg ggttgccggt 480 acagttctgg gtgcatttag cggtgatggt ctgctggatg gttatccggc agttgaaagt 540 gcactgggct ttatgctgcc tgccctgttt atgagctttc tgctggcaag ctttcagcgt 600 cgtcagatta gcgcagttac cgcagcactg ctgggtgcac tggcaggcgt taccctgttt 660 agcattccgg cagcaattct ggcaggcatt tttgcaggtt gtctggcagc actggttcag 720 gccttttatc agggtgcaag tgatgcgcaa tgaggttctg ctgctgggcc tgctggttgg 780 ttgtgttaat tttctgtttc gttatctgcc gctgcgtatt cgtgcaggtc agagccgtcc 840 ggcaaaacgt ggtgttagcg gtgtttttct ggataccatt ggcattgcaa gcatttgtgc 900 cctgctggta gttagctgtg ttccggaaat tgcagcagat agccgtcgtc tgctgccgac 960 cctggcaggt tttgcagtgc tgggtgttag cttttggaaa acccgtagca ttattctgcc 1020 gacactgctg agcgcatttg cgtatggtat tgtttggaaa ctgctggcag atgcctaa 1078 <210> 32 <211> 1112 <212> DNA <213> Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica <400> 32 atgcaaagcc aaaccaccga ctccccctcg acggcccagc cgaccgccac ctttattgaa 60 ggaataaccg atagcctacc gattgttatc ggttatctac ccgttgcttt tgcctttggt 120 ttgagttcgg taaaacttgg ctttactccg tgggaagcta ttttcttttc ttgcattatt 180 tatgccggag ccagccaatt cgttattacc gccctgctca gcgcggggat gtcattgtgg 240 gtttccgcct tgaccgtgat ggctatggat gtccgccata tcttgtacgg gccagcactg 300 aaacaccgca ttgtaaccag gttatctggc aaaaaaacgg cgctgtgggc ctttggtctt 360 actgatgaag tgtttgccgc cgcaacaacc aagctaatga aagatcaacg gcgctggagt 420 gaaaactgga tgcttggcat cgcgttcacc tcttggttgt cttgggtagc tggcaccgct 480 atcggcgcga tgtttggtca tgggccgctg gaaaattacc cggcgattga agcatcactc 540 tcctttatgc tcccggcgct attcctcagc ttcttattgg cctcgttcaa acgccaatac 600 agccttaccg ttattgcttc actgaccgga gccttgctgg gcgtgctgct gttctctatt 660 ccggtggcta ttttagccgg tattggcggc ggatgcctgg cagccctgct ccaacccgtc 720 cccgagaccg ttatagaaaa taacgagagt gataaagagg agccgaagcc atgaatatgg 780 atgttgtgat cattggtttg gtggtgggaa cggtcaatta cctgtttcgt tatctgccgc 840 tgcgcctggg gcctgcccgt aaacaagcag gcctgcaacg agggaaagtc tccctgttgc 900 tagacagcat cgggatcgcc tctatctgtg cgttgttggt ggtttccagt accccggaga 960 tagtgcataa cccacagaaa ttaattccta cactaattgg ttttttagtt atctgtggat 1020 gcttttataa aaccaacagt attatcttcg ccaccttact gggagcactc agttacggtc 1080 tgacattcaa attactgatg attttggcat aa 1112 <210> 33 <211> 1094 <212> DNA <213> Photorhabdus luminescens subsp. laumondii <400> 33 atgcctgttt ctgatacatc atccccctta acgagtaaaa aatcttcttt tactgaagga 60 ataatagata gtttacccat tgttatcggt tatattcccg tcgcctttgc ttttggtctc 120 aatgccgtca aacttggctt caacccaatg gaagccattt tcttttcatg catcatctac 180 gccggtgcaa gccagttcgt catcacagct ttactgagtg cggggacatc attatggatt 240 tctgccctaa caattatggc aatggatgtc cgccatattc tttatggtcc atctttaagg 300 caccgtatca aagataagct aacggagaaa aaaaccgtta tctgggcttt cggcctgaca 360 gatgaagttt ttgccgccgc gactgcaaaa ctcattaaaa accaccggag ctggagtgaa 420 aactggatgg ttgctattgc aatctgttct tggctggcct ggggcgcagg taccgcagcc 480 ggtgcatttc ttggtaacgg ttatttggaa tcctatcccg ctatagaagc tgccatgatt 540 ttcatgttac cagcactatt tctcagtttt cttcttgctt cttgtagaaa acaaaatagt 600 tattgtgttg caaccgcact aaccggagca cttttaggga ttacattttt ctcaattcca 660 gttgctattc tggcaggtat tgtcggtggt tgtatcgcgg cactgttaca accgcaaaac 720 aattgcaatg actcttcaga acaaaaggaa acaccatgat tgatagcaag attttgctga 780 ttggactatt tgttgggtta gctaactttt catttcgcta tctgccacta cgatttggga 840 aagcacgcca atctgccggc agaaaagctg gaaaaacaag cattatcctt gacagtattg 900 gtattgcatc catttgttct ttactcatcg tatcaggtgt acctgatgtg atgagagaaa 960 gtcaaaaact acttcctacc ctcataggtt gtctgaccat ctgtttagtc ttttacaaaa 1020 caaagcaaat tatactcgca acactatttg gcgcactgct ttttggacta acattcaaaa 1080 tatttatgaa ttag 1094 <210> 34 <211> 1063 <212> DNA <213> Citrobacter youngae <400> 34 atggatagcc cgattccgca gagcggtagc cgtagcgcaa ccctgaccga aggttttaaa 60 gatagcctgc cgattgtgat tagctatatt ccggttgcat ttgcctttgg tctgaatgca 120 acccgtctgg gttttacacc ggttgaaagc gtttttctga gctgtattat ctatgccggt 180 gcaagccagt ttgttattac caccatgctg gcagcaggta gcagcctgtg ggttgcagca 240 ctgaccgtta tggcaatgga tgttcgtcat gttctgtatg gtccgagcct gcgtagccgt 300 attgcacagc gtctgagcaa accgaaaagc gcactgtggg catttggcct gaccgatgaa 360 gtttttgcag cagcaaccgc aaaactggtt cgtgataatc gtcgttggag cgaaaattgg 420 atgattggta ttgcactgtg tagctgggca agctgggttt ttggcaccgc aattggtgca 480 tttagcggta gcggtctgct gaaagattat ccggcagttg aagcagcact gggctttatg 540 ctgcctgcac tgtttatgag ctttctgctg gcgagctttc agcgtaaaca ggcactgtgt 600 gttaccgttg ccctgaccgg tgcactggca ggcgttattc tgtttagcat tccggcagca 660 attctgctgg gtattgtttg tggttgtctg accgcactgc tgcagagctt ttggcagggt 720 ggtccggatg agctatgagg ttctgctgct gggtctgctg gttggttgtg tgaattattg 780 ttttcgttat ctgccgctgc gtctgggtgc aggtaatgtt cgtccggcac gtcgtggtgc 840 aaccggtatc ctgctggata caattggcat tgcaagcatt tgtgcactgc tggtagttag 900 caccgcaccg gaagttatgc atgatgcacg tcgttttgtt ccgaccctgg tgggttttgt 960 tattctgggt gccagcttct ataaaacccg tagcattatt atcccgaccc tgctgagcgc 1020 actgggttat ggtctggcat ggaaaatgct ggtaggtctg taa 1063 <210> 35 <211> 1063 <212> DNA <213> Citrobacter freundii <400> 35 atggaaagtc cggttccgca gagcgaaagc agcagcgcaa ccctgaccga aggttttaaa 60 gatagcctgc cgattgtgat tagctatatt ccggttgcat ttgcctttgg tctgaatgca 120 acccgtctgg gttttacacc ggttgaaagc gtgtttttta gctgcattat ctatgccggt 180 gcaagccagt ttgttattac caccatgctg gcagcaggta gcagcctgtg ggttgcagca 240 ctgaccgtta tggcaatgga tgttcgtcat gttctgtatg gtccgagcct gcgtagccgt 300 attgcacagc gtctgagcaa accgaaaagc gcactgtggg catttggcct gaccgatgaa 360 gtttttgcag cagcaaccgc aaaactggtt cgtgataatc gtcgttggag cgaaaattgg 420 atgattggta ttgcactgtg tagctgggca agctgggttt ttggcaccgt tctgggtgca 480 tttagcggta gcggtctgct gaaagattat ccggcagttg aagcagcact gggctttatg 540 ctgcctgcac tgtttatgag ctttctgctg gcgagctttc agcgtaaaca ggcactgtgt 600 gttaccgcag ccctggcagg cgcactggct ggtgttatgc tgtttagcat tccggcagca 660 attctggcag gtattgtttg tggttgtctg accgcactga ttcagagctt ttggcagggt 720 ggtccggatg agctatgaag ttctgctgct gggtctgctg gttggttgtg tgaattattg 780 ttttcgttat ctgccgctgc gtctgggtgt tggtaatgtt cgtccgacca aacgtggtgc 840 aaccggtatt ctgctggata ccattggtat taccagcatt tgtgcactgc tggtagttag 900 caccgcaccg gaagttatgc atgatgcacg tcgttttgtt ccgaccctgg tgggttttgt 960 tatcctgggt gccagcttct ataaaacccg tagcattatt atcccgaccc tgctgagcgc 1020 actgggttat ggtctggcat ggaaaatgct ggttgttctg taa 1063

Claims (15)

  1. 상응하는 야생형 미생물의 내인성 생산에 비해 개선된 메티오닌의 발효적 생산을 나타내도록 유전자 변형된 재조합 미생물이며, 여기서 상기 재조합 미생물이 이. 콜라이(E. coli)이고, 상기 재조합 미생물에서, 이. 콜라이로부터의 유전자 metH의 발현 및 이. 콜라이로부터의 유전자 fldA 및 fpr의 발현은 증진되고, 이. 콜라이로부터의 유전자 ygaZH 또는 그의 상동 유전자는 과다발현되며,
    상기 증진된 발현 및 과다발현은 각각
    - 미생물에서 유전자의 카피의 수의 증가,
    - 유전자의 높은 수준의 발현으로 이어지는 프로모터의 사용,
    - 유전자의 특이적이거나 비특이적인 전사 억제자의 활성 또는 발현의 감쇠, 또는
    - 상응하는 메신저 RNA를 안정화시키는 요소 또는 단백질을 안정화시키는 요소의 사용
    에 의해 얻어지는 것인 재조합 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 유전자 metH, fldA 및 fpr이 염색체적으로 과다발현되는 것인 재조합 미생물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 ygaZH 상동 유전자가 시트로박터(Citrobacter) 종, 시겔라(Shigella) 종, 라오울텔라(Raoultella) 종, 엔테로박터(Enterobacter) 종, 예르시니아(Yersinia) 종 및 포토랍두스(Photorhabdus) 종으로부터의 상동 유전자로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 재조합 미생물.
  4. 제3항에 있어서, ygaZH 상동 유전자가 시트로박터 코세리(Citrobacter koseri), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri ), 라오울텔라 오르니티놀리티카(Raoultella ornithinolytica ), 엔테로박터( Enterobacter ) 종, 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica ), 포토랍두스 루미네센스(Photorhabdus luminescens), 시트로박터 요웅가에(Citrobacter youngae ) 또는 시트로박터 프레운디이(Citrobacter freundii)로부터 유래하는 것인 재조합 미생물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 ygaZH 또는 상동 유전자가 유도성 프로모터의 제어 하에 발현되는 것인 재조합 미생물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 유전자 중 적어도 1종이 유도성 프로모터의 제어 하에 있는 것인 재조합 미생물.
  7. a. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 정의된 재조합 미생물을 탄소의 발효성 공급원 및 황의 공급원을 포함하는 적절한 배양 배지에서 배양하는 단계, 및
    b. 배양 배지로부터 메티오닌을 회수하는 단계
    를 포함하는, 메티오닌의 발효적 생산을 위한 방법.
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