ES2231772T3 - Adn codante para la descarbamilasa con termoestabilidad mejorada y uso del mismo. - Google Patents
Adn codante para la descarbamilasa con termoestabilidad mejorada y uso del mismo.Info
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Abstract
Una descarbamilasa derivada de Agrobacterium sp. KNK712 (FERM BP-1900) que tiene termoestabilidad mejorada conteniendo una sustitución de otro aminoácido por al menos un aminoácido seleccionado entre la histidina 57, la prolina 203 y la valina 236 como se ha mostrado en la SEC ID Nnm. 1.
Description
ADN codante para la descarbamilasa con
termoestabilidad mejorada y uso del mismo.
La presente invención se refiere a un fragmento
de ADN, y más concretamente, se refiere a un fragmento de ADN que
codifica una enzima con termoestabilidad mejorada capaz de convertir
D-N-carbamoil-\alpha-aminoácidos
en los D-\alpha-aminoácidos
correspondientes (referida más adelante como descarbamilasa). La
presente invención también se refiere a un procedimiento para
preparar el fragmento de ADN, un vector que comprende el fragmento
de ADN, un transformante obtenido mediante la transformación con el
vector, una descarbamilasa con termoestabilidad mejorada y su
procedimiento de producción, y un procedimiento mejorado para
producir aminoácidos utilizando la descarbamilasa. La presente
invención se refiere adicionalmente a un método para incrementar, en
una o más, el número de mutaciones en los aminoácidos relacionados
con la termoestabilidad de una descarbamilasa.
Los
D-\alpha-aminoácidos ópticamente
activos son compuestos importantes como intermedios de medicamentos,
y en concreto, la D-fenilglicina, la
D-parahidroxifenilglicina y similares, que son
intermedios para la producción de penicilinas semisintéticas y
sefarospolinas semisintéticas, son compuestos útiles desde un punto
de vista industrial. En cuanto al procedimiento de producción de
tales D-\alpha-aminoácidos, se
conoce un procedimiento en el que estos compuestos son obtenidos
mediante la eliminación de los grupos carbamoilo de los
D-N-carbamoil-\alpha-aminoácidos
correspondientes, donde la eliminación de los grupos carbamoilo se
efectúa mediante un método químico (memoria de la Publicación de
Patente Japonesa Núm. 58-4707) o mediante la
utilización de reacciones enzimáticas de microorganismos (memorias
de las Publicaciones de Patentes Japonesas Núms.
57-18793, 63-20520 y
1-48758, y la Solicitud de Patente Japonesa Núm.
2-407922).
No obstante, puesto que se utiliza un ácido
mineral tal como el ácido sulfúrico en grandes cantidades en el
método químico empleado para la eliminación de los grupos
carbamoilo, pueden producirse graves problemas en el medio ambiente
relacionados con el tratamiento con el mismo y similares. Por otra
parte, el método en el que se utiliza una reacción enzimática tiene
las desventajas de que la cantidad de enzima producida no es
satisfactoria y existen algunas dificultades en sus propiedades
incluso si se hace posible la producción en masa, de manera que
todavía no se han encontrado enzimas con reactividad para los
sustratos y estabilidad enzimática.
En general, algunas enzimas tienen escasa
estabilidad, y cuando se preparan semejantes enzimas, se añade un
agente estabilizante o se emplea un medio para prevenir la
desactivación tal como el tratamiento a bajas temperaturas. Cuando
se utiliza una enzima en una reacción práctica a temperaturas
normales o elevadas, se deberá dirigir la atención a la estabilidad
de las enzimas. En el caso concreto de que se utilice una enzima a
escala industrial, su estabilidad tiene a menudo efecto sobre el
coste del producto. Asimismo, en el caso concreto en el que se
utiliza una enzima a escala industrial, como medio para hacer que
prosiga la reacción enzimática ventajosamente, la enzima se utiliza
repetidamente en la reacción como un denominado biorreactor tal como
una enzima inmovilizada o células bacterianas inmovilizadas, e
incluso en este momento, la estabilidad de la enzima producirá una
limitación en el número de usos y tendrá un importante efecto sobre
el coste del producto.
En la presente invención, se presta atención a la
termoestabilidad como índice de la estabilidad enzimática y se logra
una mejora de la termoestabilidad de una enzima utilizando métodos
de ingeniería genética, con lo que la estabilidad de esta enzima
aumenta y esto hace posible producir una enzima estabilizada que
tiene excelentes ventajas para las aplicaciones industriales.
Para resolver semejante problema, la presente
invención tiene como objeto preparar una descarbamilasa con elevada
reactividad con los
D-N-carbamoil-\alpha-aminoácidos
como sustrato y excelente estabilidad mediante una mejora de las
descarbamilasas asequibles actualmente y producir
D-\alpha-aminoácidos utilizando
esta enzima con alta eficacia.
Esto es, la presente invención proporciona un
procedimiento mejorado para producir
D-\alpha-aminoácidos, que
comprende convertir
D-N-carbamoil-\alpha-aminoácidos
en los correspondientes
D-\alpha-aminoácidos en un medio
acuoso mediante la acción de una enzima y recoger los
D-\alpha-aminoácidos producidos,
siendo producida dicha enzima por un transformante que ha sido
obtenido mediante la transformación de una célula bacteriana huésped
seleccionada entre los microorganismos del género Escherichia,
Pseudomonas, Flavobacterium, Bacillus, Serratia, Corynebacterium
o Brevibacterium con un gen que ha sido obtenido mediante un
procedimiento que comprende someter un fragmento de ADN que contiene
un gen de la descarbamilasa a mutagénesis química o enzimática,
introducir un ADN recombinante que tiene un ADN vector ligado a este
fragmento de ADN en una célula huésped y rastrear una cepa capaz de
producir una enzima con termoestabilidad mejorada.
De este modo, la presente invención también
proporciona un fragmento de ADN para conducir el procedimiento
mejorado para producir
D-\alpha-aminoácidos según la
presente invención, su procedimiento de producción y un vector de
expresión que contenga el fragmento, un microorganismo transformado
obtenido mediante transformación con el vector de expresión, así
como una descarbamilasa con termoestabilidad mejorada y su
procedimiento de producción. La presente invención proporciona
adicionalmente un método para incrementar, en una o más, el número
de mutaciones en aminoácidos relacionados con la termoestabilidad de
las descarbamilasas.
La presente invención se ilustrará más adelante
mediante la referencia a los dibujos adjuntos.
La Figura 1 es un gráfico que muestra la
actividad termoestable de una descarbamilasa tras el tratamiento
térmico, que es obtenida mediante la utilización de una cepa capaz
de producir la descarbamilasa con termoestabilidad mejorada según la
presente invención.
La Figura 2 es un gráfico que muestra los
resultados de estabilidad obtenidos mediante un ensayo continuo
repetido de termoestabilidad utilizando una resina que tiene
inmovilizada sobre ella una descarbamilasa con termoestabilidad
mejorada según la presente invención.
La Figura 3 muestra los mapas de restricción de
los plásmidos pKK233-2 y pKK NE.
La Figura 4 muestra los mapas de restricción de
los plásmidos pAD108 y pAD1086.
La Figura 5 muestra los mapas de restricción de
los plásmidos pAD402 y pAD4021.
La Figura 6 muestra los mapas de restricción de
los plásmidos pAD429 y pAD455.
La Figura 7 es un gráfico que muestra la relación
entre la temperatura de reacción de una descarbamilasa producida por
E. coli JM109 pAD108 o JM109 pAD455 y su actividad.
La Figura 8 es un gráfico que muestra la
estabilidad frente al pH, de una descarbamilasa producida por E.
coli JM109 pAD416 o E. coli JM109 pAD455.
La Figura 9 muestra un procedimiento para
preparar el vector pUC NT para la introducción de un gen foráneo y
el vector pNT4553 para la expresión de una descarbamilasa con
termoestabilidad mejorada.
La Figura 10 muestra el mapa de restricción del
plásmido pUC NT y pNT4553.
En general, se sabe que la termoestabilidad y la
estabilidad de una enzima están correlacionadas entre sí. También se
sabe que las diferentes enzimas producidas por termófilos son
aquellas que tienen una alta termoestabilidad y también tienen una
alta estabilidad casi sin excepciones, y que las enzimas que poseen
termoestabilidad producida por la sustitución de aminoácidos según
una técnica de recombinación génica también tienen excelente
estabilidad (Kagawa y col., Saibo Kogaku, vol. 7,
509-571 (1988)).
En cuanto al método para elaborar una enzima
termoestable, se puede emplear un método en el que se cambia una
secuencia de aminoácidos de la proteína enzimática o un método en el
que la enzima es modificada mediante tratamiento químico, reacción
enzimática o similares. En cuanto al método para mejorar la
termoestabilidad mediante un cambio en la secuencia de aminoácidos
de la proteína enzimática, se puede emplear un método en el que se
permite que en las células bacterianas se ocasione alguna mutación
con un agente químicamente mutagénico tal como nitrosoguanidina
(NTG) o mediante rayos ultravioleta, seguido de rastreo, o un método
en el que se obtiene un gen de interés mediante una técnica de
recombinación génica y después se permite que se ocasione alguna
mutación química o enzimática, devolviéndolo con posterioridad a la
célula bacteriana y después rastreando. Cuando se obtiene un gen y
se permite ocasionar alguna mutación, es más eficaz someter un
fragmento de ADN que codifica una proteína descarbamilasa a
mutagénesis en forma de una hebra sencilla. Para convertir el
fragmento en una forma de hebra sencilla, se puede emplear, por
ejemplo, un método para incorporar el fragmento a partículas de
fago. En cuanto al ADN de hebra sencilla, se puede utilizar una
hebra de ADN que contenga los codones correspondientes a la
secuencia de aminoácidos de una proteína descarbamilasa o la hebra
complementaria del mismo. Por otra parte, en cuanto a los sitios de
mutación, se puede emplear un método para introducir mutaciones al
azar o un método para introducir mutaciones de sitio específico.
En cuanto al agente para permitir ocasionar en un
gen alguna mutación al azar e introducir de ese modo alguna mutación
en la secuencia de aminoácidos de una proteína enzimática, se pueden
utilizar hidrocloruro de hidroxilamina, nitrito de sodio, ácido
fórmico, hidrazina o similares.
Por ejemplo, en la mutagénesis en la que se
utiliza hidrocloruro de hidroxilamina, se liga primero un gen de la
descarbamilasa con el ADN de doble hebra de un fago M13 tal como
M13mp19, con el que se infecta E. coli JM109 o similares, y
este cultivo bacteriano se incuba para preparar partículas de fago
para el uso en la mutagénesis. La mutación se puede efectuar
mediante la reacción utilizando hidrocloruro de hidroxilamina a una
concentración de 0,1 a 2 M, deseablemente 0,25 M, a un pH de 6,0 a
8,0, preferiblemente 6,0, a una temperatura de 37ºC durante un
período de 1 hora a 24 horas. Las partículas de fagos que
experimentan semejante reacción mutagénica se utilizan para la
infección de E. coli y se recuperan en forma de un ADN
recombinante de doble hebra, seguido de la transferencia de
semejante gen de la descarbamilasa mutante a un plásmido.
En la mutagénesis en la que se utiliza nitrito de
sodio, ácido fórmico, hidrazina o similares, se puede utilizar
básicamente un método descrito por R.M. Myers, y col. (Science, 229,
242-247 (1985)). Este método se puede realizar
mediante la preparación de un ADN de hebra sencilla del fago M13
recombinante que tiene un gen de la descarbamilasa incorporado en él
y la posterior mutagénesis. La mutación con nitrito de sodio se
puede efectuar mediante reacción utilizando nitrito de sodio a una
concentración de 0,5 a 2 M, preferiblemente 1 M, a un pH en el
margen ácido, preferiblemente un pH de 4,3, a una temperatura de 4ºC
a 37ºC, preferiblemente 25ºC, durante un período de 1 minuto a 5
horas, preferiblemente 30 minutos. La mutación con ácido fórmico se
puede efectuar mediante la reacción en la que se utiliza ácido
fórmico 12 M de 4ºC a 37ºC, preferiblemente 15ºC, durante un período
de 2 a 10 minutos. La mutación con hidrazina se puede utilizar
mediante el tratamiento en el que se utiliza hidrazina a una
concentración del 20% al 60% a 25ºC durante 3 a 10 minutos. Estos
ADN de hebra sencilla mutantes se convierten en formas de doble
hebra utilizando el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa de
E. coli, Sequenase® y similares, seguido de la incorporación
a un plásmido, lo que hace posible producir un gen de la
descarbamilasa mutante.
En cuanto al método para ocasionar alguna
mutación al azar utilizando una reacción enzimática, se puede
emplear un método en que se utiliza PCR (reacción en cadena de la
polimerasa) (D.W. Leung y col., A Journal of Methods in Cell and
Molecular Biology, 1, 11-15 (1989)) o similares.
Este es un método en el que se utiliza polimerasa TaqDNA para la
síntesis de un gen de un ADN sintético (ADN cebador) que tiene las
secuencias en ambos extremos del gen, momento en el cual se puede
preparar un gen mutante de la descarbamilasa ocasionando un error en
la síntesis génica utilizando polimerasa TaqDNA en condiciones de
reacción tales como concentraciones de MgCl_{2} y de sustratos
(dNTP) superiores en comparación con la reacción habitual o una
concentración extremadamente reducida sólo de un sustrato de las
cuatro clases de sustratos.
En cuanto al método para introducir una mutación
en un gen, que es específico para el sitio de una proteína
enzimática, se puede emplear un método in vitro para
introducir una mutación de sitio específico utilizando un
oligonucleótido, un método para reemplazar una casete en el sitio de
mutación, un método en el que se utiliza PCR o similares. El método
in vitro para introducir una mutación de sitio específico
utilizando un oligonucleótido se puede realizar preparando un ADN de
hebra sencilla a partir de un fago M13 recombinante que tenga un gen
de la descarbamilasa incorporado en él, y convirtiendo el ADN en una
forma de doble hebra utilizando un cebador de ADN sintético que
contenga una secuencia, tras la mutación, de una parte del gen en el
que se ha permitido ocasionar alguna mutación y utilizando una
enzima tal como un fragmento de Klenow de la ADN polimerasa, seguido
de la introducción en E. coli. Estas reacciones se pueden
efectuar fácilmente utilizando un estuche asequible comercialmente,
por ejemplo, "Mutan®-K" o "Mutan®-G" asequible de Takara
Shuzo, o "Oligonucleotide-directed in vitro
mutagenesis System, version 2.0" de Amersham Japan. El método
para reemplazar una casete en el sitio de mutación se puede realizar
reemplazando el fragmento de la enzima de restricción completo que
contiene el sitio en el que se va a permitir que se ocasiona una
mutación, por un ADN sintético que contenga semejante mutación. El
método en el que se utiliza una reacción PCR se puede realizar según
el método de W. Ito, y col., Gene, 102, 67-70 (1991)
o similares. En este método, la reacción PCR se efectúa utilizando
un cebador de ADN sintético que contiene la mutación y un ADN
sintético correspondiente al extremo del gen, tras lo cual se
permite que el fragmento de ADN resultante hibride con el ADN en
toda su longitud del gen, seguido de otra reacción PCR para la
elongación enzimática del fragmento hasta toda su longitud.
En la presente invención, el gen mutante de la
descarbamilasa preparado de la manera anteriormente descrita es
ligado a un vector plasmídico tal como pUC19 o
pKK-233-2, y el vector recombinante
resultante se incorpora a E. coli, por ejemplo JM109, seguido
de la formación de colonias en una placa que contiene un antibiótico
y similares. Después, esta colonia es replicada sobre un papel de
filtro esterilizado, y la placa se almacena. El papel de filtro,
tras el secado, se sumerge en una solución que contiene lisozima y
Triton X-100 o se mete y se saca repetidamente en un
baño de acetona-hielo seco (congelación y
descongelación), ocasionando de ese modo la lisis. Después, este
papel de filtro se sumerge en un baño de agua con termostato a una
temperatura tal como 65ºC o 70ºC durante un período de tiempo
constante, por ejemplo, 5 minutos, y luego se seca, después de lo
cual este papel de filtro se sumerge en una solución de reacción
susceptible de producir desarrollo de color mediante la actividad
descarbamilasa. En cuanto a la solución de reacción, se pueden
utilizar, por ejemplo, aquellas que contienen un
carbamil-D-aminoácido como sustrato
y también contienen fenol, 4-aminoantipirina,
D-aminoácido oxidasa y peroxidasa. La colonia que
muestra desarrollo de color puede ser separada como una cepa que
adquiere termoestabilidad.
Primero, como índice indicador de la
termoestabilidad de una enzima, se define la temperatura
termoestable. La temperatura termoestable se define como la
temperatura de tratamiento a la cual la actividad de una enzima se
inactiva en un 50% mediante el tratamiento térmico durante 10
minutos. Como fuente del gen de la descarbamilasa, se pueden
utilizar usualmente microorganismos que sean conocidos por tener una
descarbamilasa (v.g., los microorganismos descritos en la
Publicación Internacional Núm. WO92/10579). La temperatura
termoestable es diferente con las respectivas descarbamilasas de
estos microorganismos. Para lograr una estabilidad excelente
tolerable para el uso repetido mediante una mejora de la
termoestabilidad, se deben tener en cuenta, por supuesto, diferentes
propiedades distintas de la termoestabilidad, y es deseable utilizar
una descarbamilasa que manifieste una temperatura termoestable
elevada, por ejemplo, en el intervalo de 60ºC a 63ºC, desde el
principio. Desde este punto de vista, se prefiere una descarbamilasa
producida por Agrobacterium sp KNK712 (FERM
BP-1900) debido a su elevada temperatura
termoestable de aproximadamente 62ºC. La descarbamilasa de KNK712 y
el fragmento de ADN que codifica esta enzima tienen la secuencia de
aminoácidos y la secuencia de ADN, respectivamente, mostradas en el
Listado de Secuencias, SEC ID NUM: 1. Se ha encontrado que la
descarbamilasa con termoestabilidad mejorada obtenida mediante la
mutagénesis de este gen de la descarbamilasa contiene una reposición
de la histidina 57, la prolina 203 y la valina 236 con un aminoácido
diferente, como se muestra en el Listado de Secuencias, SEC ID Núms:
2-16. Por consiguiente, los aminoácidos de estas
tres posiciones como mínimo están relacionados con la
termoestabilidad. Se puede obtener una elevada termoestabilidad no
sólo mediante la reposición de un aminoácido sino también mediante
la reposición combinada de dos o tres aminoácidos. En la presente
invención, la temperatura termoestable podría ser incrementada en al
menos 2ºC, principalmente en aproximadamente 5ºC o más, y en algunos
casos, en 10ºC
o más.
o más.
Por ejemplo, es posible obtener una
descarbamilasa con termoestabilidad mejorada mediante la sustitución
de la histidina 57 por leucina o tirosina; de la prolina 203 por
leucina, asparragina, ácido glutámico, treonina o serina; o de la
valina 236 por alanina, treonina o serina, como aminoácido diferente
(Listado de Secuencias, SEC ID Núms: 2-30). En
cuanto a las secuencias de ADN que codifican estas descarbamilasas
con termoestabilidad mejorada, se obtuvieron aquellas que contenían
una sustitución de TAT, CTT o CTA por CAT, esto es, los nucleótidos
401 a 403 correspondientes a la histidina 57; de TCT, CTT, GAA, AAC
o ACC por CCT, esto es, los nucleótidos 839 a 841 correspondientes a
la prolina 203; de GCG, GCT, ACC, ACG, TCA, TCG o AGT por GTG, esto
es, los nucleótidos 938 a 940 correspondientes a la valina 236
(Listado de Secuencias, SEC ID Núms: 2-30). Una vez
identificados los aminoácidos relacionados con la termoestabilidad,
la utilización de mutagénesis de sitio específico hace posible
sustituir muchos aminoácidos por estos aminoácidos mediante la
sustitución de diferentes bases. De este modo, el fragmento de ADN
que codifica la descarbamilasa con termoestabilidad mejorada puede
ser sometido a mutagénesis para una mejora adicional de la
termoestabilidad.
En el caso de Agrobacterium sp KNK712
(FERM BP-1900), el derivado que tiene dos o tres
mutaciones de aminoácidos en tres aminoácidos que se ha encontrado
que tienen relación con la termoestabilidad, esto es, la histidina
57, la prolina 203 y la valina 236 (mutante múltiple) es producido,
por ejemplo, como sigue.
En las estructuras génicas de pAD108 (que
codifica una descarbamilasa de origen natural) y pAD402 (que
codifica una descarbamilasa que tiene la His 57 sustituida por Tyr),
respectivamente, como se muestra en las Figs. 4 y 5, SphI y SalI
están próximas entre sí en la vecindad del gen de la descarbamilasa;
por consiguiente, se forma un sitio de restricción NdeI en el codón
de iniciación del gen de la descarbamilasa mediante el método PCR.
De este modo, el aminoácido 57 está presente en el fragmento de ADN
NdeI-SacI de aproximadamente 190 pb; el aminoácido
203 en el fragmento de ADN SalI-ClaI de
aproximadamente 170 pb; y el aminoácido 236 en el fragmento de ADN
ClaI-SphI de aproximadamente 75 pb.
El mutante múltiple se prepara reemplazando estos
fragmentos de ADN libres de mutación por fragmentos de ADN que
tienen alguna mutación en los aminoácidos relacionados con la
termoestabilidad. El fragmento de ADN que tiene la mutación de algún
aminoácido se prepara a partir del transformante o del vector de
expresión obtenido en el Ejemplo 3 u 8.
Por otra parte, se obtiene un fragmento de ADN
NdeI-EcoRI de aproximadamente 1,6 kb que contiene un
gen de la descarbamilasa (que es de origen natural o que contiene la
mutación de un aminoácido) escindiendo pAD108, pAD402 o similares,
al que se ha conferido un sitio de restricción NdeI, e
incorporándolo después a un vector apropiado que tenga sitios de
restricción NdeI y EcoRI, tal como pKK NE (preparado a partir de
pKK233-2 mostrado en la Fig. 3) descrito en el
Ejemplo 9 y mostrado en la Fig. 3, obteniéndose de ese modo un
plásmido (v.g., pAD 1086 mostrado en la Fig. 4 a partir de pAD108; y
pAD4021 mostrado en la Fig. 5 a partir de pAD402). Los fragmentos de
ADN de este plásmido, que no tenían sitio de mutación para los tres
aminoácidos mencionados antes, son reemplazados por fragmentos de
ADN que contienen tales sitios de mutación de aminoácido,
obteniéndose de ese modo un vector de expresión para mutantes
múltiples.
En general, los mutantes múltiples preparados de
este modo tienen termoestabilidad mejorada de una manera adicional
dependiendo del grado de mejora de la termoestabilidad obtenido
mediante una sola mutación. Para la descarbamilasa que tiene dos o
más mutaciones de aminoácido en tres clases de aminoácidos, es
posible seleccionar cualquier combinación de los aminoácidos
sustituidos como se ha descrito antes.
El método anteriormente descrito no está limitado
al caso de Agrobacterium sp KNK712 (FERM
BP-1900), y se puede utilizar, en general, para una
mejora adicional de la termoestabilidad de una enzima
descarbamilasa. Esto es, conforme al método para elaborar una enzima
termoestable como se ha descrito antes, se pueden obtener varias
clases de descarbamilasas con termoestabilidad mejorada reemplazando
un aminoácido, a partir de las cuales se identifican los aminoácidos
relacionados con la termoestabilidad, y otra reposición más de este
aminoácido hace posible encontrar otros aminoácidos que produzcan
una mejora de la termoestabilidad. En las circunstancias en las que
ya se han obtenido los fragmentos de ADN correspondientes a las
descarbamilasas termoestables respectivas, se pueden introducir
mutaciones simultáneas en sitios de aminoácidos plurales
relacionados con la mejora de la termoestabilidad mediante las
operaciones de las siguientes etapas 1) a 5) (mutante múltiple), lo
que proporcionará una descarbamilasa con la termoestabilidad
mejorada adicionalmente.
1) Se encuentran enzimas de restricción, cada una
de las cuales puede producir un fragmento de ADN que comprende una
porción de ADN que codifica uno de los aminoácidos relacionados con
la termoestabilidad escindiendo el fragmento de ADN.
2) Se obtiene un fragmento de ADN que comprende
una porción de ADN que codifica un sitio de mutación de un
aminoácido a partir de todos los fragmentos de ADN que codifican una
descarbamilasa termoestable que tiene al menos una mutación de un
aminoácido o a partir de vectores que comprenden los fragmentos con
la enzima de restricción correspondiente de la etapa 1).
3) Se elimina el fragmento de ADN correspondiente
pero que no tiene mutación de aminoácido escindiendo un fragmento de
ADN que codifica una descarbamilasa o un vector que comprende el
fragmento con la misma enzima de restricción descrita antes.
4) El fragmento de ADN que contiene la mutación
obtenido en la etapa 2) es incorporado al fragmento de ADN restante
tras la escisión para eliminar el fragmento de ADN correspondiente
de la etapa 3) o al vector que comprende el fragmento restante.
5) Se repiten las operaciones de las etapas 2) a
4), si fuera necesario.
Conforme a esta serie de operaciones, es posible
incrementar, de una en una, el número de mutaciones en los
aminoácidos relacionados con la termoestabilidad.
En el caso de Agrobacterium sp. KNK712
(FERM BP-1900), en cuanto al vector de la etapa 2),
se puede utilizar cualquier vector con tal que haya sido preparado
produciendo un sitio de restricción NdeI en un vector de expresión
que es pUC19 en el que se ha incorporado uno de los fragmentos de
ADN mostrados en el Listado de Secuencias, SEC ID Núms.
2-30. En cuanto al vector que contiene un gen de la
descarbamilasa de la etapa 3), se pueden utilizar diferentes
vectores, incluyendo pAD4021 y pAD1086, que se obtienen utilizando
pKK NE en las mismas operaciones que para pAD4021 a partir del
vector preparado produciendo un sitio de restricción NdeI en
cualquier vector seleccionado a partir de diferentes ejemplos del
vector de expresión referido más abajo, excepto para todos los
vectores que contienen un fragmento de ADN que codifica una
descarbamilasa que ya ha recibido una sustitución de aminoácido para
una mejora de la termoestabilidad en cada uno de los tres sitios
relacionados con la termoestabilidad (esto es, pAD426, pAD427,
pAD454, pAD455 y pAD456 que contienen una mutación triple). Los
fragmentos de ADN obtenidos con enzimas de restricción son
NdeI-SacI, SalI-ClaI y
ClaI-SphI en cualquier caso de la etapa 2) o de la
etapa 3).
La preparación de todos los fragmentos de ADN que
codifican una descarbamilasa, de los vectores de expresión
obtenibles incorporando cada uno de los fragmentos de ADN a un
vector, y de los transformantes obtenibles incorporando cada uno de
los vectores de expresión a una célula huésped se puede realizar
utilizando una técnica de manipulación génica descrita, por ejemplo,
en la Publicación de la Patente Internacional Núm. WO92/10579.
A partir del vector de expresión obtenido
mediante la incorporación del fragmento de ADN mostrado en el
Listado de Secuencias, SEC ID Núms: 2-34 a pUC19 o
pKK NE, por ejemplo, la incorporación a pUC19 produce pAD402,
pAD404, pAD406, pAD416, pAD428, pAD429, pAD431, pAD434, pAD435,
pAD439, pAD441, pAD445, pAD447, pAD448, pAD450, pAD451, pAD452,
pAD453, pAD454 o pAD456; la incorporación a pKK NE produce pAD421,
pAD422, pAD423, pAD424, pAD425, pAD426, pAD427, pAD461 y pAD455; y
la incorporación a pUC NT (Fig. 10, parte superior) produce pNT4553
(Fig. 10, parte inferior). La reposición de aminoácidos en los
sitios relacionados con la termoestabilidad no produce cambios en
los sitios de restricción antes descritos para las enzimas de
restricción; por consiguiente, el vector de expresión obtenido
mediante la incorporación a pUC19 tiene el mismo mapa de restricción
que pAD429 (Fig. 6, parte superior) y el vector de expresión
obtenido mediante la incorporación a pKK NE tiene el mismo mapa de
restricción que pAD455 (Fig. 6, parte inferior). Estos vectores de
expresión fueron utilizados para la transformación de Escherichia
coli JM109 y HB101, lo que proporcionó los siguientes
transformantes capaces de producir una descarbamilasa con
termoestabilidad mejorada.
E. coli JM109 pAD402 (FERM
BP-3912),
E. coli JM109 pAD404 (FERM
BP-3913),
E. coli JM109 pAD406 (FERM
BP-3914),
E. coli JM109 pAD416 (FERM
BP-3915),
E. coli JM109 pAD428,
E. coli JM109 pAD429 (FERM
BP-4035),
E. coli JM109 pAD431,
E. coli JM109 pAD434,
E. coli JM109 pAD435,
E. coli JM109 pAD439,
E. coli JM109 pAD441,
E. coli JM109 pAD445,
E. coli JM109 pAD447,
E. coli JM109 pAD448,
E. coli JM109 pAD450,
E. coli JM109 pAD421,
E. coli JM109 pAD422,
E. coli JM109 pAD423,
E. coli JM109 pAD424 (FERM
BP-4034),
E. coli JM109 pAD425,
E. coli JM109 pAD426,
E. coli JM109 pAD427,
E. coli JM109 pAD451,
E. coli JM109 pAD452,
E. coli JM109 pAD453,
E. coli JM109 pAD461,
E. coli JM109 pAD454,
E. coli JM109 pAD455 (FERM
BP-4036),
E. coli JM109 pAD456,
E. coli JM109 pAD468,
E. coli JM109 pAD469,
E. coli JM109 pAD470, o
E. coli HB101 pNT4553 (FERM
BP-4368).
Para estas descarbamilasas de tipo mejorado, la
cantidad de la enzima de interés producida por un transformante
puede ser incrementada mediante la incorporación del gen
correspondiente aguas abajo del promotor fuerte de un vector.
El transformante puede ser cultivado en un medio
nutriente convencional para expresar un ADN transformante que haya
sido introducido en él. En caso de que se hayan conferido al ADN
transformante ciertas propiedades originadas en el ADN genético o
vector, el medio puede ser suplementado con diferentes agentes
dependiendo de las propiedades.
El transformante producido de este modo puede ser
obtenido como una fuente de enzima únicamente mediante la
preparación del cultivo en un medio convencional; si fuera
necesario, se pueden emplear diferentes tratamientos para la
inducción enzimática, tal como la adición de compuestos de
hidantoína,
D-N-carbamoil-\alpha-aminoácidos,
isopropil-1-tio-\beta-D-galatósido
(IPTG) o similares, y un incremento de temperatura.
El medio que se va a utilizar para la preparación
del cultivo de un transformante puede ser usualmente un medio
convencional que contenga fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno e
iones inorgánicos. Si a esto se añaden micronutrientes orgánicos
tales como vitaminas y aminoácidos, a menudo se obtienen los
resultados preferidos. En cuanto a las fuentes de carbono, se
utilizan adecuadamente carbohidratos tales como la glucosa y la
sacarosa, ácidos orgánicos tales como el ácido acético, alcoholes y
similares. En cuanto a las fuentes de nitrógeno, se utilizan
amoníaco gaseoso, agua amoniacal, sales de amonio y similares. En
cuanto a las sales inorgánicas, se pueden utilizar ión fosfato, ión
magnesio, ión potasio, ión férrico y similares.
La preparación del cultivo se puede llevar a cabo
en condiciones aerobias durante 1 a 10 días mientras se realiza un
ajuste apropiado del intervalo de pH de 4 a 8 y del intervalo de
temperatura de 25º a 45ºC, lo que hace posible obtener los
resultados deseables. La enzima producida por un transformante puede
ser aplicada en forma de una solución de cultivo del transformante,
de las células bacterianas, de las células bacterianas tratadas, de
extractos enzimáticos de las células bacterianas, de células
bacterianas inmovilizadas o similares.
En cuanto a las células bacterianas, se pueden
utilizar formas cualesquiera tales como una solución de cultivo no
tratada una vez completada la preparación del cultivo, células
bacterianas separadas de la solución de cultivo y células
bacterianas lavadas. En cuanto a las células bacterianas tratadas,
se pueden utilizar células bacterianas liofilizadas, células
bacterianas secadas con acetona, células bacterianas puestas en
contacto con tolueno o tensioactivo, células bacterianas tratadas
con lisozima, células bacterianas sometidas a ultrasonicación,
células bacterianas desorganizadas mecánicamente, extractos
enzimáticos que tienen una actividad enzimática para convertir
D-N-carbamoil-\alpha-aminoácidos
en los D-\alpha-aminoácidos
correspondientes mediante eliminación de los grupos carbamoilo, que
han sido obtenidos a partir de estas células bacterianas tratadas;
productos de inmovilización de estas células bacterianas; productos
de insolubilización de las células bacterianas tratadas; productos
de inmovilización de las células bacterianas tratadas sobre un
soporte para la inmovilización de una proteína enzimática (v.g., una
resina de intercambio aniónico), o similares. Para el método de
inmovilización, se hace referencia a la memoria de la Publicación de
Patente Japonesa Abierta a la Inspección Pública Núm.
63-185382.
En cuanto al soporte que se va a utilizar para la
inmovilización, son adecuadas diferentes resinas de intercambio
aniónico que tienen diferentes grupos funcionales de tipo amina, sal
de amonio o dietanolamina, tales como resinas de intercambio
aniónico de fenol-formaldehído, por ejemplo,
Duolite A568 y DS17186 (Rohm & Haas; nombres comerciales
registrados), y resinas de poliestireno, por ejemplo, Amberlite
IRA935, IRA945, IRA901 (Rohm & Haas; nombres comerciales
registrados), Lewatatit OC1037 (Bayer; nombre comercial registrado)
y Diaion EX-05 (Mitsubishi Chemical Industries;
nombre comercial registrado). Además de estos, también se puede
utilizar cualquier otro soporte tal como
DEAE-celulosa.
Adicionalmente, para asegurar la adsorción firme
y estable de una enzima, se utiliza usualmente un agente de
entrecruzamiento, y un ejemplo preferido del mismo es el
glutaraldehído. En cuanto a la enzima que se va a utilizar, se
pueden aplicar, además de enzimas purificadas, aquellas que hayan
sido purificadas hasta diferentes grados, por ejemplo enzimas
parcialmente purificadas, soluciones que contengan células
bacterianas desorganizadas y extractos libres de células.
Para la preparación de una enzima inmovilizada,
se pueden utilizar métodos convencionales, que comprenden, por
ejemplo, permitir que una enzima sea adsorbida desde una solución
enzimática sobre un soporte y después someter el soporte a un
tratamiento de entrecruzamiento.
Los
D-N-carbamoil-\alpha-aminoácidos
utilizados como sustrato de la reacción enzimática en la presente
invención pueden se expresados mediante la fórmula:
R-CH(NHCONH_{2})-COOH,
y sus formas que se va a someter a reacción en los casos prácticos
son las siguientes: en caso de que la enzima que se vaya a utilizar
tenga una estereoselectividad estricta sobre los
D-N-carbamoil-\alpha-aminoácidos,
se pueden utilizar en forma D o como una mezcla de las formas D y L;
y en caso de que la enzima tenga una pérdida de estereoselectividad
debida a su acción incluso sobre
L-carbamoilaminoácidos, o en caso de que se utilice
como una mezcla enzimática susceptible de actuar incluso sobre los
L-aminoácidos, se prefiere que estas sean utilizadas
únicamente en la forma D para la producción de
\alpha-aminoácidos en forma D.
El sustituyente R puede ser seleccionado en un
amplio intervalo como se describe en las memorias de las
Publicaciones de Patente Japonesas Núms. 57-18793,
63-20520 y 1-48758. En concreto,
para proporcionar compuestos útiles desde un punto de vista
industrial, por ejemplo como intermedios para medicamentos, se
prefiere que R sea fenilo, fenilo sustituido con hidroxi, alquilo,
alquilo sustituido, aralquilo o tienilo. Cuando R es fenilo
sustituido con hidroxi, puede estar sustituido con uno o más grupos
hidroxi en las posiciones o, m y/o p, y el ejemplo típico del mismo
es p-hidroxifenilo. El término alquilo hace
referencia a un grupo de 1 a 4 átomos de carbono, cuyo aminoácido
correspondiente es D-alanina,
D-valina, D-leucina,
D-isoleucina o similares. El término alquilo
sustituido hace referencia a un grupo alquilo de 1 a 4 átomos de
carbono, que está sustituido con hidroxi, alquiltio, carboxilo,
amino, fenilo, fenilo sustituido con hidroxi, amida o similares,
cuyo aminoácido correspondiente es D-serina,
D-treonina, D-metionina,
D-cisteína, D-asparragina,
D-glutamina, D-tirosina,
D-triptófano, ácido D-aspártico,
ácido D-glutámico, D-histidina,
D-lisina, D-arginina,
D-citrulina o similares. El término aralquilo hace
referencia a un grupo de 7 a 8 átomos de carbono, tal como bencilo o
fenetilo, cuyo aminoácido correspondiente es
D-fenilalanina o similares.
En cuanto al medio acuoso, se pueden utilizar
agua, tampón o aquellos que contengan un disolvente orgánico tal
como etanol. Si fuera necesario, también se pueden añadir al medio
acuoso diferentes aditivos tales como los nutrientes necesarios para
el crecimiento de los microorganismos, antioxidantes, tensioactivos,
coenzimas, hidroxilamina y metales.
En el caso en el que las células bacterianas de
los microorganismos antes descritos se cultivan en un medio acuoso,
durante lo cual las células bacterianas se ponen en contacto con
D-N-carbamoil-\alpha-aminoácidos
para la reacción, los
D-N-carbamoil-\alpha-aminoácidos
y los nutrientes necesarios para el crecimiento del microorganismo,
tales como las fuentes de carbono, las fuentes de nitrógeno y los
iones inorgánicos, están contenidos en el medio acuoso utilizado. Si
a esto se añaden micronutrientes orgánicos tales como vitaminas y
aminoácidos, a menudo se obtienen los resultados preferidos. En
cuanto a las fuentes de nitrógeno, se utilizan adecuadamente
carbohidratos tales como la glucosa y la sacarosa, ácidos orgánicos
tales como el ácido acético, alcoholes y similares. En cuanto a las
fuentes de nitrógeno, se utilizan amoníaco gaseoso, agua amoniacal,
sales de amonio y similares. En cuanto a las sales inorgánicas, se
pueden utilizar ión fosfato, ión magnesio, ión potasio, ión férrico
y similares.
La preparación del cultivo se puede llevar a cabo
en condiciones aerobias durante 1 a 10 días mientras se realiza un
ajuste apropiado del intervalo de pH de 4 a 8 y del intervalo de
temperatura de 25º a 45ºC, lo que hace posible que los
D-N-carbamoil-\alpha-aminoácidos
sean convertidos únicamente en
D-\alpha-aminoácidos con una alta
eficacia.
En contraste, cuando la reacción de una solución
de cultivo no tratada de los microorganismos anteriormente
descritos, las células bacterianas cultivadas, las células
bacterianas tratadas, los extractos enzimáticos, los productos de
inmovilización de las células bacterianas o los productos de
inmovilización de las proteínas enzimáticas se efectúa en un medio
acuoso que contiene
D-N-carbamoil-\alpha-aminoácidos
disueltos o suspendidos en él, el sistema de reacción se puede dejar
estar o se puede agitar durante un tiempo, mientras se ajusta la
temperatura a un intervalo apropiado de 10ºC a 80ºC y el pH se
mantiene en el intervalo de 4 a 9,5. De esta manera, tras un lapso
de 5 a 100 horas, los
D-\alpha-aminoácidos se producen
en grandes cantidades y se acumulan en el medio acuoso. Los
D-N-carbamoil-\alpha-aminoácidos
pueden ser añadidos en porciones separadas a medida que prosigue la
reacción. Los D-\alpha-aminoácidos
producidos pueden ser separados y purificados mediante un método de
separación convencional.
Los
D-\alpha-aminoácidos obtenidos
aquí pueden ser expresados mediante la fórmula:
R-CHNH_{2}-COOH
(donde R se define como
antes).
En lo siguiente se describirán las realizaciones
típicas de la presente invención. La detección y el análisis
cuantitativo de los
D-\alpha-aminoácidos producidos se
llevaron a cabo mediante cromatografía líquida de alta resolución
(HPLC) o cromatografía en capa fina (TLC).
El plásmido pAD108 que tenía el gen de la
descarbamilasa de KNK712 se digirió con las enzimas de restricción
HindIII y EcoRI, que se mezcló y se ligó con el producto digerido de
un ADN de doble hebra de M13mp18 con HindIII y EcoRI. Esto fue
transformado en E. coli JM109, que se mezcló con 2 ml de
medio de agar H en la capa superior (10 g/l de
Bacto-triptona, 8 g/l de NaCl, 8 g/l de
Bacto-agar) conteniendo 100 mM de
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido
(IPTG) y
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactosido
(X-Gal) al 0,2% añadidos ambos en una cantidad de 40
\mul, y después se cultivaron en placa en una placa de agar H (10
g/l de Bacto-triptona, 8 g/l de NaCl, 12 g/l de
Bacto-agar), seguido de incubación a 37ºC y
separación de una placa de color blanco. Este fago recombinante se
cultivó en 100 ml de medio 2YT (16 g/l de
Bacto-triptona, 10 g/l de extracto de levadura Bacto
"Bacto-yeast", 5 g/l de NaCl), y al
sobrenadante se añadió una solución de PEG-NaCl
(polietilenglicol 6000 al 20%, NaCl 2,5 M) a un volumen de 1/5, de
manera que las partículas precipitaron y se recogieron mediante
centrifugación. Estas partículas de fago recombinante se trataron en
NH_{2}OH que tenía una concentración final de 0,25 M (pH 6,0) a
37ºC durante 1 a 8 horas. Las partículas de fago precipitaron con
una solución de PEG-NaCl, y después se disolvieron
en agua esterilizada, con lo que se infectó E. coli JM109. El
microorganismo se cultivó en 800 ml de medio 2YT, y se preparó un
ADN de doble hebra que tenía alguna mutación mediante el método
alcalino con SDS y el método de ultracentrifugación con CsCl. Esto
se digirió con HindIII y EcoRI, y después se incorporó a pUC19, que
fue transformado en E. coli JM109, y después se cultivó en
placa en una placa de agar 2YT conteniendo 50 \mug/ml de
ampicilina. De este modo, se obtuvieron aproximadamente 15.000
transformantes de E. coli que tenían cada uno un gen de la
descarbamilasa mutante.
Las partículas del fago recombinante obtenidas
incorporando un gen de la descarbamilasa KNK712 en M13mp18 según se
prepararon en el Ejemplo 1 se cultivaron en 800 ml de medio 2YT para
la preparación, y después se sometieron a extracción con fenol y
precipitación con etanol, lo que proporcionó un ADN de fago de hebra
sencilla. Este ADN de hebra sencilla se trató con NaNO_{2} que
tenía una concentración final 0,9 M (pH 4,3) a 25ºC durante 30
minutos, permitiendo que se ocasionara alguna mutación en un gen.
Esto se realizó en una forma de doble hebra mediante el uso de
Sequenase® ver. 2.0 (United States Biochemical) y transcriptasa
inversa AMV (Life Science). Esto fue digerido con las enzimas de
restricción HindIII y EcoRI, e incorporado a pUC19, que fue
transformado en E. coli JM109 y después cultivado en placa en
una placa 2YT (conteniendo ampicilina). De este modo, se obtuvieron
aproximadamente 7.600 transformantes de E. coli que tenían
cada uno un gen de descarboxilasa mutante.
Las colonias de los transformantes de E.
coli que tenían cada uno un gen de la descarbamilasa mutante de
la placa fueron replicadas sobre un papel de filtro (Toyo Roshi, 5C,
\phi 83 mm), que se enjuagó con 1,5 ml de solución lítica
(Tris\cdotHCl 20 mM (pH 7,5), EDTA 10 mM, 2 mg/ml de lisozima,
Triton X-100 al 1%), seguido de una reacción a 37ºC
durante 30 minutos, lavado con agua y secado. Este papel de filtro
se sumergió en agua caliente a 65ºC para el tratamiento térmico, y
después de secar, se enjuagó con 1 ml de una solución de reacción
para el desarrollo de color (tampón fosfato K 30 mM (pH 7,4),
carbamil-D-fenilglicina al 0,3%,
fenol al 0,25%, 10 mg/ml de D-aminoácido oxidasa
(Sigma), 2,36 \mug/ml de peroxidasa (derivada de rábano picante,
CALZYME Lab.), 0,1 mg/ml de 4-aminoantipirina),
seguido de una reacción a 37ºC durante 30 minutos. Se separaron las
colonias correspondientes a los puntos que desarrollaban color rojo,
como la cepa con termoestabilidad mejorada, a partir de la placa
original.
A partir de 27.000 mutantes preparados mediante
la mutagénesis con hidroxilamina del Ejemplo 1 y 7.600 mutantes
preparados mediante la mutagénesis con ácido nitroso del Ejemplo 2,
se prepararon doce y siete mutantes con termoestabilidad mejorada,
respectivamente.
Se preparó un cultivo con sacudimiento que
contenía una de las cuatro cepas que producían descarbamilasa con
termoestabilidad mejorada obtenidas en el Ejemplo 3 (tres mutantes
obtenidos mediante mutagénesis con hidroxilamina y un mutante
obtenido mediante mutagénesis con ácido nitroso), junto con E.
coli recombinante JM109 pAD108 (FERM BP-3184)
que tenía un gen de la descarbamilasa de KNK712, en 10 ml de medio
líquido 2YT (conteniendo 50 \mug/ml de ampicilina e IPTG 1 mM) y
se incubó durante la noche. Tras la cosecha, las células bacterianas
se lavaron con tampón fosfato K 0,1 M (pH 7,0), y se suspendieron en
1 ml del mismo tampón, después de lo cual la suspensión se
desorganizó con un aparato de desorganización ultrasónico (Tomy
Seiko, modelo UR-20P) y el residuo se eliminó
mediante centrifugación. Una parte de esta solución enzimática bruta
se sometió a tratamiento térmico a una temperatura tal como 55ºC,
60ºC, 65ºC, 70ºC y 75ºC durante 10 minutos, y se eliminó algo de
proteína desnaturalizada mediante centrifugación. Después, se midió
la actividad descarbamilasa antes y después del tratamiento térmico.
En la medición, utilizando
carbamil-D-hidroxi-fenilglicina
al 1% como sustrato, la reacción se efectuó en tampón fosfato K 0,1
M (pH 7,0) a 40ºC durante 20 minutos, seguido de la
desnaturalización de las proteínas con TCA al 5% y eliminación de
las mismas, después de lo cual se determinó la cantidad de
D-hidroxifenilglicina mediante cromatografía de
líquidos de alta resolución. Los resultados se muestran en la Fig.
1.
El análisis génico se llevó a cabo para la
descarbamilasa mutante con termoestabilidad mejorada, para suponer
los sitios de mutación de la proteína descarbamilasa. El plásmido
que tenía un gen para la descarbamilasa con termoestabilidad
mejorada se hizo reaccionar en una incubadora programable (ASTEC,
modelo PC-700) utilizando Taq Dye Deoxy® Terminator
Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems), seguido de eliminación
del exceso de Dye Deoxy utilizando Bio Spin 30
(BIO-RAD). Esta muestra se sometió a electroforesis
y al análisis de datos con un secuenciador de ADN modelo 373A
(Applied Biosystems). Como resultado, se encontraron los sitios de
mutación como se muestra en la Tabla 1. En cada caso, la
termoestabilidad mejoró por la mutación de un aminoácido.
Se preparó un cultivo con sacudimiento que
contenía una de las cuatro cepas que producían descarbamilasa con
termoestabilidad mejorada, junto con E. coli recombinante
JM109 pAD108 (FERM BP-3184) que tenía un gen de la
descarbamilasa KNK712, en 1 litro de medio 2YT (conteniendo 50
\mug/ml de ampicilina e IPTG 1 mM) y se incubó durante la noche.
Tras la cosecha, las células bacterianas se lavaron con tampón
fosfato K 0,1 M (pH 7,0), y se suspendieron en 100 ml del mismo
tampón, después de lo cual la suspensión se desorganizó con un
aparato de desorganización ultrasónico (BRANSON, Sonifier modelo
250) y el residuo se eliminó mediante centrifugación para producir
una solución enzimática bruta. A esto, se añadió Duolite
A-568 (Rohm & Haas) equilibrada con tampón
fosfato K 0,1 M (pH 7,0) a una razón de 1 g de resina por 40 mg de
proteína, y la mezcla se agitó sellada con nitrógeno a 4ºC durante
20 horas para asegurar la adsorción. Esta resina adsorbente de
enzima se lavó con tampón fosfato K 0,1 M (pH 7,0) y ditiotreitol
(DTT) 10 mM, y se hizo reaccionar en glutaraldehído al 0,2% y tampón
fosfato K 0,1 M (pH 7,0) a 4ºC durante 10 minutos para el
entrecruzamiento de la proteína. Las actividades de la resina
obtenida de este modo se muestran en la Tabla 2.
| E. coli | E. coli | E. coli | E. coli | ||
| Mutante | JM109 | JM109 | JM109 | JM109 | 712 |
| pAD402 | pAD404 | pAD406 | pAD416 | ||
| Actividad | |||||
| (u/g de resina) | 12,4 | 9,4 | 10,0 | 14,6 | 9,6 |
La descarbamilasa mutante con termoestabilidad
mejorada fue evaluada mediante la reacción continua repetida
utilizando la misma resina que contiene enzima inmovilizada obtenida
en el Ejemplo 6. La reacción se efectuó (100 ml de mezcla de
reacción) utilizando 50 unidades de descarbamilasa inmovilizada y
carbamil-D-HPG al 3% como sustrato a
40ºC agitando en una corriente de gas nitrógeno mientras se ajustaba
el pH a 7,0. La muestra se recogió para la medición de la actividad
al cabo de 10 y 60 minutos, y la reacción continuó durante 23,5
horas en total. La mezcla de reacción se eliminó mediante succión,
después de lo cual se cargó otra mezcla de reacción de nueva
aportación y se dejó reaccionar de la misma manera que se ha
descrito antes; semejante operación se repitió 15 veces, y se
examinó el cambio en la actividad de la descabamilasa inmovilizada.
Los resultados se muestran en la Fig. 2. Se encontró que todas las
descarbamilasas con termoestabilidad mejorada tenían estabilidades
mejoradas cuando se utilizaban en la reacción en forma de resina que
contenía enzima inmovilizada, en comparación con las de antes de la
mutagénesis.
Se sustituyeron algunos aminoácidos para los tres
sitios que se había encontrado que estaban relacionados con la
termoestabilidad, es decir, la histidina que es el aminoácido 57, la
prolina que es el aminoácido 203, y la valina que es el aminoácido
236, para preparar diferentes derivados. La preparación de estos
derivados se llevó a cabo mediante el uso de un método en el que se
utilizaba la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (W. Ito, y
col., Gene, 102, 67-70 (1991)). Para cada uno de los
sitios relacionados con la termoestabilidad, se prepararon
diferentes cebadores sintéticos con una solución mixta de A, T, G y
C mediante el sintetizador de ADN modelo 391 (Applied Biosystems),
dichos cebadores tenían porciones de la secuencia de aproximadamente
10 bases que eran las mismas que las secuencias génicas
complementarias de ambos lados de la porción génica correspondiente
al aminoácido de cada sitio y tenían asimismo cualquier combinación
de A, T, G y C en la porción de 3 bases correspondiente al
aminoácido que se fuera a reemplazar, de modo que cada clase de
aminoácido se incorporaba a esta porción de tres bases tras la
reposición. Con el uso de pAD108 como molde, y utilizando este
cebador y el cebador de M13RV (Takara Shuzo), se efectuó la PCR
mediante la incubadora programable modelo PC-700
(ASTEC). Se preparó mediante reacción PCR un fragmento de ADN que
contenía el fragmento génico de la descarbamilasa en toda su
longitud (1.785 bases) y secuencias de longitud corta a ambos lados
y tenía una mutación en cada uno de los sitios de restricción
HindIII para que no fuera escindido utilizando pAD108 y cebadores
MUFT3 y M13M4 (ambos, de Takara Shuzo). Estas dos clases de
productos de la PCR se mezclaron entre sí, y se calentaron a 94ºC
durante 10 minutos, después de lo cual la mezcla se enfrió
gradualmente para el recocido, lo que proporcionó una forma
combinada de estas dos clases de ADN. Utilizando ADN polimerasa Taq,
las porciones de hebra sencilla se convirtieron en formas de doble
hebra. Utilizando este ADN y los cebadores M13M4 y M13RV, se efectuó
la reacción PCR, y el ADN producido fue digerido simultáneamente con
HindIII y EcoRI. El producto digerido fue ligado con pUC19 que había
sido digerido de la misma manera que se ha descrito antes, y
transformado en E. coli. Según el método que se ha descrito
en el Ejemplo 3, solo se rastrearon las cepas con termoestabilidad
mejorada, y se encontró que los derivados que tenían una sustitución
de la histidina 57 por leucina, los derivados que tenían una
sustitución de la prolina 203 por asparragina, ácido glutámico,
treonina, alanina, isoleucina o histidina, y los derivados que
tenían una sustitución de la valina 236 por treonina o serina tenían
termoestabilidad mejorada, como se muestra en las Tablas 3 y 4.
Los derivados (mutantes múltiples) que tenián una
combinación de mutaciones de dos o tres aminoácidos que se había
encontrado que mejoraban la termoestabilidad, en los tres sitios que
se había encontrado que estaban relacionados con la
termoestabilidad, es decir, la histidina que es el aminoácido 57, la
prolina que es el aminoácido 203, y la valina que es el aminoácido
236, se prepararon como sigue.
Los mutantes múltiples se prepararon reemplazando
los fragmentos sin mutación de un gen nativo por los fragmentos de
ADN digeridos con enzimas de restricción que contenían cada uno
algún sitio de mutación de un gen de la descarbamilasa mutante que
había sido mejorado en termoestabilidad por la sustitución de un
solo aminoácido, según se obtuvo en el Ejemplo 3 u 8. Primero,
puesto que pAD108, pAD402 y los otros plásmidos, que tenían los
mismos sitios de restricción, tenían cada uno dos sitios de
restricción SalI y dos sitios de restricción SphI para el uso en la
reposición de los fragmentos de ADN descritos antes, es necesario
convertir estos sitios en un único sitio de restricción. Por
consiguiente, como nuevo vector para la incorporación de genes, se
preparó pKK NE, al que se incorporó un fragmento génico de la
descarbamilasa, construyendo de ese modo un vector de expresión para
su uso en la reposición del fragmento de ADN.
El plásmido pKK NE fue preparado como sigue. El
plásmido pKK233-2 (Pharmacia) mostrado en la Fig. 3
fue digerido con EcoRI y NdeI, y sometido a electroforesis en gel de
agarosa para separar un fragmento de ADN de 2,7 kb, después de lo
cual se cambió el extremo cohesivo del fragmento de ADN a extremo
romo con un estuche para formación de extremos romos de ADN (Takara
Shuzo), seguido de ligadura y transformación en E. coli
JM109.
El sitio de restricción del vector preparado de
este modo fue cambiado por el sitio de restricción NdeI utilizando
el método PCR. El plásmido resultante fue digerido con HindIII, y el
extremo cohesivo del mismo fue cambiado por el extremo romo, seguido
de ligadura con el ligador pEcoRI (Takara Shuzo), lo que proporcionó
pKK NE mostrado en la Fig. 3. A continuación, en la porción del
codón de iniciación del gen de la descarbamilasa del plásmido pAD108
o pAD402, se generó el sitio de restricción NdeI mediante el método
PCR. El fragmento de ADN NdeI-EcoRI resultante de
1,6 kb fue incorporado después a pKK NE, lo que proporcionó los
vectores de expresión pAD1086 (derivado de pAD108; mostrado en la
Fig. 4) y pAD4021 (derivado de pAD402; mostrado en la Fig. 5).
La mutación del aminoácido 57 se localiza en el
fragmento de ADN NdeI-SacI de aproximadamente 190
pb; la mutación del aminoácido 203 en el fragmento de ADN
SalI-ClaI de aproximadamente 170 pb (este fragmento
de ADN es referido más adelante como fragmento A); y la mutación del
aminoácido 236 en el fragmento de ADN ClaI-SphI de
aproximadamente 75 pb (este fragmento de ADN es referido más
adelante como fragmento B). Por consiguiente, se eliminó un
fragmento A de pAD4021, en cuyo sitio se incorporó el mismo
fragmento de pAD404 o pAD406, produciendo pAD421 o pAD422,
respectivamente. Asimismo, el fragmento B de pAD1086, pAD4021,
pAD421 o pAD422 fue reemplazado por el mismo fragmento de pAD416,
produciendo pAD4161, pAD423, pAD426 o pAD427, respectivamente.
Adicionalmente, el fragmento A de pAD4161 fue reemplazado por el
mismo fragmento de pAD404, pAD406 o pAD429, produciendo pAD424,
pAD425 o pAD461, respectivamente; el fragmento A de pAD402 o pAD423
fue reemplazado por el mismo fragmento de pAD429 produciendo pAD451
o pAD455 (mostrado en la Fig. 6), respectivamente; el fragmento B de
pAD402, pAD429 (mostrado en la Fig. 6), pAD451 o pAD421 fue
reemplazado por el mismo fragmento de pAD447, produciendo pAD452,
pAD453, pAD454 o pAD456, respectivamente.
Los vectores de expresión preparados de la manera
anteriormente descrita fueron transformados separadamente en E.
coli JM109, a partir de la cual se prepararon los extractos de
las células bacterianas desorganizadas y se examinó su
termoestabilidad.
Como se ha mostrado en las Tablas 5 y 6, para los
mutantes múltiples, se encontró que la termoestabilidad resultaba
mejorada adicionalmente conforme al grado de mejora en la
termoestabilidad logrado por una sola mutación. Para la
descabamilasa producida por E. coli JM109 pAD455 (FERM
BP-4036) que tenía una elevada termoestabilidad, se
encontró que la termoestabilidad mejoraba incluso en aproximadamente
19ºC, en comparación con la descarbamilasa antes de la
mutagénesis.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Se preparó un cultivo con sacudimiento que
contenía una cepa productora de descarbamilasa con termoestabilidad
mejorada, E. coli JM109 pAD108 (FERM BP-3184)
o E. coli JM109 pAD455
(FERM-BP-4036), en 10 ml de medio
2YT y se incubó durante la noche. Tras la cosecha, las células
bacterianas se lavaron con tampón fosfato K 0,1 M (pH 7,0), y se
suspendieron en 1 ml del mismo tampón, después de lo cual la
suspensión se desorganizó con un aparato de desorganización
ultrasónico (Tomy Seiko, modelo UR-20P) y el residuo
se eliminó mediante centrifugación para producir una solución
enzimática bruta. Esta solución enzimática bruta se diluyó 10 veces
con una solución obtenida mediante la adición de ditiotreitol 5 mM
al mismo tampón. Varias soluciones sustrato de 1 ml
(carbamil-D-p-hidroxifenilglicina
al 1%, tampón fosfato K al 0,1% (pH 6,5)) se mantuvieron a
diferentes temperaturas de 30ºC a 85ºC durante 3 minutos,
respectivamente, a lo que se añadieron 100 \mul de la solución
enzimática bruta diluida (o cuando la temperatura estuvo en el
intervalo de 50ºC a 80ºC para la termoestabilidad más alta (la
temperatura estuvo en el intervalo de 50ºC a 65ºC para la solución
enzimática bruta de E. coli JM109 pAD108), 100 \mul de la
solución enzimática que había sido diluida adicionalmente de 2 a 3
veces), seguido de una reacción a las temperaturas respectivas
durante 20 minutos. Después, se dejó que se detuviera la reacción
mediante la adición de 250 \mul de una solución de ácido
tricloroacético al 20%, seguido de centrifugación, después de lo
cual se analizó el sobrenadante mediante cromatografía líquida de
alta presión (Nakalai tesque, columna Cosmosil
5C18-AR). tomando la actividad a 40ºC como el 100%,
se muestra la actividad relativa a cada temperatura en la Fig. 7.
Como se puede observar en la Fig. 7, la enzima producida por E.
coli JM109 pAD455 manifiesta la actividad más alta a una
temperatura de alrededor de 75ºC y tiene una estabilidad
extremadamente mejorada, indicando que esta fue mejorada dando una
enzima capaz de actuar a temperaturas más altas, en comparación con
la enzima producida por E. coli JM109 pAD108.
Se preparó un cultivo con sacudimiento que
contenía una cepa productora de descarbamilasa con termoestabilidad
mejorada, E. coli JM109 pAD416 (FERM BP-3915)
o E. coli JM109 pAD455 (FERM BP-4036), en 10
ml de medio 2YT y se incubó durante la noche. Tras la cosecha, las
células bacterianas se lavaron con tampón fosfato K 10 mM (pH 7,0),
y se suspendieron en 1 ml del mismo tampón, después de lo cual la
suspensión se desorganizó con un aparato de desorganización
ultrasónico de pequeño tamaño y el residuo se eliminó mediante
centrifugación para producir una solución enzimática bruta. Se
prepararon diferentes tampones para los pH respectivos a partir de
tampón fosfato K 0,1 M (pH 5,5, 6, 7, 8), tampón Tris\cdotHCl (pH
7,5, 8, 9) y tampón carbonato de sodio (pH 9, 10, 11). A 800 \mul
de cada uno de estos tampones, se añadieron 200 \mul de la
solución enzimática bruta, y la mezcla se incubó a 40ºC durante 12,5
horas. Después, se añadieron 100 \mul de la mezcla a 1 ml de la
solución sustrato
(carbamil-D-p-hidroxifenilglicina
al 1%, tampón fosfato K al 0,1% (pH 7,0)), seguido de reacción a
40ºC, después de lo cual la mezcla de reacción se analizó de la
misma manera que se ha descrito en el Ejemplo 10. Tomando la
actividad a pH 7,0 como el 100%, la actividad relativa de la muestra
tratada a cada pH se muestra en la Fig. 8.
Primero, se preparó un vector para la
incorporación de un gen de la descarbamilasa con termoestabilidad
mejorada y la expresión del mismo (Fig. 9). A partir de pUC19, se
preparó un fragmento HindIII-Cfr10I de 1,3 kb
mediante el método de la PCR, momento en el cual se utilizó para la
reacción, como cebador de la PCR, un cebador que tenía una secuencia
diseñada de manera que se formaba un sitio de restricción NdeI en el
sitio del codón de iniciación del gel lacZ en el interior del sitio
de restricción HindIII y la secuencia podía ser digerida
adicionalmente con HindIII y Cfr10I. Este fragmento de ADN obtenido
mediante PCR fue digerido con HindIII y Cfr10I, seguido de ligadura
con un fragmento de 1,4 kb obtenido mediante eliminación del
fragmento de 1,3 kb correspondiente de pUC19, produciendo un
plásmido pUC\cdotNde que corresponde a pUC19 que tiene un sitio de
restricción NdeI añadido a ello. A continuación, a partir de pTrc99A
(asequible comercialmente de Pharmacia), se preparó un fragmento
EcoRI-EcoRV de 0,6 kb mediante el método PCR,
momento en el cual se utilizó para la reacción, como cebador de la
PCR, un cebador que tenía una secuencia diseñada de manera que el
sitio de restricción NdeI era sustituido por el sitio de restricción
NcoI en el interior del sitio de restricción EcoRI, y la secuencia
podía ser digerida adicionalmente con EcoRI y EcoRV. Este fragmento
de ADN obtenido mediante PCR fue digerido con EcoRI y EcoRV, seguido
de ligadura con el fragmento de 3,6 kb obtenido mediante eliminación
del fragmento de 0,6 kb correspondiente de pTrc 99A, produciendo un
plásmido pTrcNde que corresponde a pTrc99A que tiene un sitio de
restricción NdeI añadido a ello. Después, el fragmento de 2,0 kb
obtenido mediante la digestión de pUC Nde con NdeI y SsPI fue ligado
con el fragmento de 0,6 kb obtenido mediante la digestión de pTrc
Nde con NdeI y SspI, lo que proporcionó el plásmido vector de
expresión pUCNT para la expresión de los genes foráneos (Fig.
10).
A partir de pAD455 que tenía un gen para una
clase de descarbamilasas con termoestabilidad mejorada, se preparó
únicamente la porción génica que codificaba la descarbamilasa
mediante el método PCR, momento en el cual se utilizó para la
reacción, como cebador para la PCR, un cebador que tenía una
secuencia diseñada de manera que se formaba un sitio de restricción
NdeI en la porción del codón de iniciación del gen y se elaboraba un
sitio de restricción PstI inmediatamente después del codón de
terminación del gen. Un fragmento de ADN de 0,9 kb obtenido mediante
esta PCR fue digerido con NdeI y PstI, seguido de ligadura con pUCNT
que también fue digerido con NdeI y PstI, lo que proporcionó el
plásmido del vector de expresión pNT4553 (Fig. 10) para la
descarbamilasa con termoestabilidad mejorada.
El pNT4553 preparado antes fue transformado en
Escherichia coli HB101 mediante el método del cloruro de
calcio. Se preparó un cultivo con sacudimiento de esta E.
coli HB101 pNT4553 (FERM BP-4368) transformante
en un medio 2YT y se incubó a 37ºC durante 16 horas. Después de
cosechar las células bacterianas, se preparó una solución de enzima
bruta mediante el método mostrado en el (Ejemplo 10), y se midió que
la actividad descarbamilasa era de 5,6 unidades/ml por solución de
cultivo.
Según la presente invención, se pueden obtener
todos los fragmentos de ADN que codifican una proteína
descarbamilasa con termoestabilidad mejorada, a partir de los cuales
se puede producir una descarbamilasa que tiene una elevada
reactividad con los
D-N-carbamoil-\alpha-aminoácidos
y excelente estabilidad, y con el uso de esta enzima, se pueden
producir D-\alpha-aminoácidos con
una alta eficacia.
SEC ID NUM: 1
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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1785
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TIPO DE SECUENCIA: ácido nucléico
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CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
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TOPOLOGIA: lineal
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TIPO DE MOLECULA: ADN genómico
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FUENTE ORIGINAL
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- ORGANISMO: Agrobacterium sp.
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- CEPA: KNK712 (FERM BP-1900)
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SEC ID NUM: 2
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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1785
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TIPO DE SECUENCIA: ácido nucléico
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CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
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TOPOLOGIA: lineal
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TIPO DE MOLECULA: ADN genómico
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FUENTE ORIGINAL
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- ORGANISMO: Escherichia coli
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- CEPA: JM109 pAD402 (FERM BP-3912)
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SEC ID NUM: 3
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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1785
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TIPO DE SECUENCIA: ácido nucléico
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CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
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TOPOLOGIA: lineal
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TIPO DE MOLECULA: ADN genómico
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FUENTE ORIGINAL
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- ORGANISMO: Escherichia coli
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- CEPA: JM109 pAD404 (FERM BP-3913)
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SEC ID NUM: 4
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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1785
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TIPO DE SECUENCIA: ácido nucléico
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CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
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TOPOLOGIA: lineal
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TIPO DE MOLECULA: ADN genómico
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FUENTE ORIGINAL
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- ORGANISMO: Escherichia coli
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- CEPA: JM109 pAD406 (FERM BP-3914)
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SEC ID NUM: 5
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TIPO DE SECUENCIA: ácido nucléico
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CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
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TOPOLOGIA: lineal
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TIPO DE MOLECULA: ADN genómico
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FUENTE ORIGINAL
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- ORGANISMO: Escherichia coli
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- CEPA: JM109 pAD416 (FERM BP-3915)
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SEC ID NUM: 6
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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1785
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TIPO DE SECUENCIA: ácido nucléico
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CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
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TOPOLOGIA: lineal
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TIPO DE MOLECULA: ADN genómico
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FUENTE ORIGINAL
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- ORGANISMO: Escherichia coli
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- CEPA: JM109 pAD428
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SEC ID NUM: 7
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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1785
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TIPO DE SECUENCIA: ácido nucléico
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CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
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TOPOLOGIA: lineal
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TIPO DE MOLECULA: ADN genómico
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FUENTE ORIGINAL
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- ORGANISMO: Escherichia coli
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- CEPA: JM109 pAD429
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SEC ID NUM: 8
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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1785
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TIPO DE SECUENCIA: ácido nucléico
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CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
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TOPOLOGIA: lineal
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TIPO DE MOLECULA: ADN genómico
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FUENTE ORIGINAL
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- ORGANISMO: Escherichia coli
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- CEPA: JM109 pAD431
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SEC ID NUM: 9
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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1785
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TIPO DE SECUENCIA: ácido nucléico
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CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
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TOPOLOGIA: lineal
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TIPO DE MOLECULA: ADN genómico
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FUENTE ORIGINAL
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- ORGANISMO: Escherichia coli
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- CEPA: JM109 pAD434
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SEC ID NUM: 10
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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1785
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TIPO DE SECUENCIA: ácido nucléico
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CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
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TOPOLOGIA: lineal
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TIPO DE MOLECULA: ADN genómico
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FUENTE ORIGINAL
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- ORGANISMO: Escherichia coli
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- CEPA: JM109 pAD435
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SEC ID NUM: 11
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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1785
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TIPO DE SECUENCIA: ácido nucléico
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CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
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TOPOLOGIA: lineal
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TIPO DE MOLECULA: ADN genómico
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FUENTE ORIGINAL
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- ORGANISMO: Escherichia coli
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- CEPA: JM109 pAD439
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SEC ID NUM: 12
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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1785
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TIPO DE SECUENCIA: ácido nucléico
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CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
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TOPOLOGIA: lineal
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TIPO DE MOLECULA: ADN genómico
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FUENTE ORIGINAL
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- ORGANISMO: Escherichia coli
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- CEPA: JM109 pAD441
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SEC ID NUM: 13
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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1785
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TIPO DE SECUENCIA: ácido nucléico
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CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
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TIPO DE MOLECULA: ADN genómico
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FUENTE ORIGINAL
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- ORGANISMO: Escherichia coli
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- CEPA: JM109 pAD445
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SEC ID NUM: 14
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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1785
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TIPO DE SECUENCIA: ácido nucléico
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CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
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TOPOLOGIA: lineal
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TIPO DE MOLECULA: ADN genómico
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FUENTE ORIGINAL
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- ORGANISMO: Escherichia coli
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- CEPA: JM109 pAD447
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SEC ID NUM: 15
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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1785
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TIPO DE SECUENCIA: ácido nucléico
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CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
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TOPOLOGIA: lineal
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TIPO DE MOLECULA: ADN genómico
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FUENTE ORIGINAL
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- ORGANISMO: Escherichia coli
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- CEPA: JM109 pAD448
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SEC ID NUM: 16
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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1785
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TIPO DE SECUENCIA: ácido nucléico
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CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
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TOPOLOGIA: lineal
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TIPO DE MOLECULA: ADN genómico
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FUENTE ORIGINAL
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- ORGANISMO: Escherichia coli
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- CEPA: JM109 pAD450
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SEC ID NUM: 17
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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1559
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TIPO DE SECUENCIA: ácido nucléico
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CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
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TOPOLOGIA: lineal
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TIPO DE MOLECULA: ADN genómico
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FUENTE ORIGINAL
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- ORGANISMO: Escherichia coli
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- CEPA: JM109 pAD421
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SEC ID NUM: 18
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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1559
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TIPO DE SECUENCIA: ácido nucléico
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CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
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TOPOLOGIA: lineal
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TIPO DE MOLECULA: ADN genómico
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FUENTE ORIGINAL
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- ORGANISMO: Escherichia coli
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- CEPA: JM109 pAD422
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SEC ID NUM: 19
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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1559
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TIPO DE SECUENCIA: ácido nucléico
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TIPO DE MOLECULA: ADN genómico
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FUENTE ORIGINAL
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- ORGANISMO: Escherichia coli
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- CEPA: JM109 pAD423
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SEC ID NUM: 20
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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1559
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TIPO DE SECUENCIA: ácido nucléico
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CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
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TOPOLOGIA: lineal
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TIPO DE MOLECULA: ADN genómico
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FUENTE ORIGINAL
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- ORGANISMO: Escherichia coli
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- CEPA: JM109 pAD424 (FERM BP-4034)
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SEC ID NUM: 21
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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1559
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TIPO DE SECUENCIA: ácido nucléico
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CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
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TOPOLOGIA: lineal
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TIPO DE MOLECULA: ADN genómico
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FUENTE ORIGINAL
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- ORGANISMO: Escherichia coli
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- CEPA: JM109 pAD425
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SEC ID NUM: 22
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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1559
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TIPO DE SECUENCIA: ácido nucléico
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CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
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TOPOLOGIA: lineal
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TIPO DE MOLECULA: ADN genómico
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FUENTE ORIGINAL
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- ORGANISMO: Escherichia coli
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- CEPA: JM109 pAD426
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SEC ID NUM: 23
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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1559
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TIPO DE SECUENCIA: ácido nucléico
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CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
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TOPOLOGIA: lineal
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TIPO DE MOLECULA: ADN genómico
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FUENTE ORIGINAL
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- ORGANISMO: Escherichia coli
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- CEPA: JM109 pAD427
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SEC ID NUM: 24
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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1785
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TIPO DE SECUENCIA: ácido nucléico
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CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
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TOPOLOGIA: lineal
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TIPO DE MOLECULA: ADN genómico
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FUENTE ORIGINAL
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- ORGANISMO: Escherichia coli
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- CEPA: JM109 pAD451
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SEC ID NUM: 25
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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1785
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TIPO DE SECUENCIA: ácido nucléico
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CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
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TOPOLOGIA: lineal
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TIPO DE MOLECULA: ADN genómico
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FUENTE ORIGINAL
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- ORGANISMO: Escherichia coli
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- CEPA: JM109 pAD452
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SEC ID NUM: 26
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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1785
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TIPO DE SECUENCIA: ácido nucléico
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CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
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TOPOLOGIA: lineal
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TIPO DE MOLECULA: ADN genómico
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FUENTE ORIGINAL
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- ORGANISMO: Escherichia coli
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- CEPA: JM109 pAD453
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SEC ID NUM: 27
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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1559
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TIPO DE SECUENCIA: ácido nucléico
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CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
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TOPOLOGIA: lineal
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TIPO DE MOLECULA: ADN genómico
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FUENTE ORIGINAL
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- ORGANISMO: Escherichia coli
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- CEPA: JM109 pAD461
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SEC ID NUM: 28
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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1785
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TIPO DE SECUENCIA: ácido nucléico
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CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
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TOPOLOGIA: lineal
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TIPO DE MOLECULA: ADN genómico
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FUENTE ORIGINAL
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- ORGANISMO: Escherichia coli
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- CEPA: JM109 pAD454
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SEC ID NUM: 29
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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1559
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TIPO DE SECUENCIA: ácido nucléico
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CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
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TOPOLOGIA: lineal
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TIPO DE MOLECULA: ADN genómico
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FUENTE ORIGINAL
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- ORGANISMO: Escherichia coli
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- CEPA: JM109 pAD455 (FERM BP-4036)
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SEC ID NUM: 30
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1785
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TIPO DE SECUENCIA: ácido nucléico
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CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
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TOPOLOGIA: lineal
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TIPO DE MOLECULA: ADN genómico
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FUENTE ORIGINAL
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- ORGANISMO: Escherichia coli
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- CEPA: JM109 pAD456
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SEC ID NUM: 31
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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1785
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TIPO DE SECUENCIA: ácido nucléico
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CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
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TOPOLOGIA: lineal
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TIPO DE MOLECULA: ADN genómico
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FUENTE ORIGINAL
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- ORGANISMO: Escherichia coli
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- CEPA: JM109 pAD468
\vskip1.000000\baselineskip
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SEC ID NUM: 32
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1785
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TIPO DE SECUENCIA: ácido nucléico
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CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
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TOPOLOGIA: lineal
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TIPO DE MOLECULA: ADN genómico
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FUENTE ORIGINAL
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- ORGANISMO: Escherichia coli
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- CEPA: JM109 pAD469
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID NUM: 33
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1785
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TIPO DE SECUENCIA: ácido nucléico
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CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
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TOPOLOGIA: lineal
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TIPO DE MOLECULA: ADN genómico
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FUENTE ORIGINAL
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\vskip0.800000\baselineskip
- ORGANISMO: Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- CEPA: JM109 pAD470
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID NUM: 34
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 926
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucléico
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CUALIDAD DE LA HEBRA: doble
\vskip1.000000\baselineskip
TOPOLOGIA: lineal
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TIPO DE MOLECULA: ADN genómico
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FUENTE ORIGINAL
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\vskip0.800000\baselineskip
- ORGANISMO: Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- CEPA: HB101 pNT4553 (FERM BP-4368)
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (26)
1. Una descarbamilasa derivada de
Agrobacterium sp. KNK712 (FERM BP-1900) que
tiene termoestabilidad mejorada conteniendo una sustitución de otro
aminoácido por al menos un aminoácido seleccionado entre la
histidina 57, la prolina 203 y la valina 236 como se ha mostrado en
la SEC ID Núm. 1.
2. Una descarbamilasa según la reivindicación 1,
donde al menos la histidina 57 es reemplazada por otro
aminoácido.
3. Una descarbamilasa según la reivindicación 1,
donde el otro aminoácido es la tirosina o la leucina.
4. Una descarbamilasa según la reivindicación 1,
donde al menos la prolina 203 es reemplazada por otro
aminoácido.
5. Una descarbamilasa según la reivindicación 4,
donde el otro aminoácido es la leucina, el ácido glutámico, la
serina, la asparragina, la treonina, la alanina, la isoleucina o la
histidina.
6. Una descarbamilasa según la reivindicación 1,
donde al menos la valina 236 es reemplazada por otro aminoácido.
7. Una descarbamilasa según la reivindicación 6,
donde el otro aminoácido es la alanina, la treonina o la serina.
8. Una descarbamilasa que tiene la secuencia de
aminoácidos mostrada en el Listado de Secuencias, SEC ID Núms:
2-34.
9. Un fragmento de ADN que codifica una proteína
descarbamilasa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
8.
10. Un fragmento de ADN según la reivindicación 9
que codifica una proteína descarbamilasa en la que al menos una de
citosina, adenina y timina (CAT) de una secuencia de bases que
codifica histidina que es el aminoácido con el número de aminoácido
57 es reemplazada por otra base de manera que la histidina es
reemplazada por tirosina o leucina.
11. Un fragmento de ADN según la reivindicación 9
que codifica una proteína descarbamilasa en la que al menos una de
citosina, citosina y timina (CCT) de una secuencia de bases que
codifica prolina que es el aminoácido con el número de aminoácido
203 es reemplazada por otra base de manera que la prolina es
reemplazada por serina, leucina, asparragina, ácido glutámico,
treonina, alanina, isoleucina o histidina.
12. Un fragmento de ADN según la reivindicación 9
que codifica una proteína descarbamilasa en la que al menos una de
guanina, timina y guanina (GTG) de una secuencia de bases que
codifica valina que es el aminoácido con el número de aminoácido 236
es reemplazada por otra base de manera que la valina es reemplazada
por alanina, serina o treonina.
13. Un fragmento de ADN según la reivindicación
10, donde la secuencia de bases CAT de la reivindicación 10 es
reemplazada por TAT, CTT o CTA.
14. Un fragmento de ADN según la reivindicación
11, donde la secuencia de bases CTT de la reivindicación 11 es
reemplazada por TCT, CTT, AAC, GAA, ACC, GCT, ATT o CAT.
15. Un fragmento de ADN según la reivindicación
12, donde la secuencia de bases GTG de la reivindicación 12 es
reemplazada por GCG, GCT, ACC, ACG, TCA, TCG o AGT.
16. Un vector de expresión que comprende un
fragmento de ADN según las reivindicaciones 9 a 15.
17. Un microorganismo transformante transformado
con un vector de expresión según la reivindicación 16.
18. Un microorganismo transformante, donde el
microorganismo transformante es E. coli, JM109 pAD402 (FERM
BP-3912), E. coli JM109 pAD404 (FERM
BP-3913), E. coli JM109 pAD406 (FERM
BP-3914), E. coli JM109 pAD416 (FERM
BP-3915), E. coli JM109 pAD429 (FERM
BP-4035), E. coli JM109 pAD424 (FERM
BP-4034), E. coli JM109 pAD455 (FERM
BP-4036) o E. coli HB101 pNT4553 (FERM
BP-4368).
19. Un procedimiento para producir una
descarbamilasa con termoestabilidad mejorada donde la descarbamilasa
derivada de Agrobacterium sp. KNK712 (FERM
BP-1900) con termoestabilidad mejorada es una
descarbamilasa que contiene una sustitución de otro aminoácido por
al menos un aminoácido seleccionado entre la histidina 57, la
prolina 203 y la valina 236 como se ha mostrado en la SEC ID Núm. 1,
que comprende la etapa de cultivar un microorganismo transformado
con un plásmido recombinante que contiene un fragmento de ADN que
codifica dicha descarbamilasa.
20. Un procedimiento según la reivindicación 19,
donde el otro aminoácido es la tirosina o la leucina para la
histidina 57, la leucina, la serina, la asparragina, el ácido
glutámico, la alanina, la isoleucina, la histidina o la treonina
para la prolina 203, y la alanina, la treonina o la serina para la
valina 236.
21. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 19 y 20, donde el microorganismo transformante es
E. coli JM109 pAD402 (FERM BP-3912), E.
coli JM109 pAD404 (FERM BP-3913), E. coli
JM109 pAD406 (FERM BP-3914), E. coli JM109
pAD416 (FERM BP-3915), E. coli JM109 pAD429
(FERM BP-4035), E. coli JM109 pAD424 (FERM
BP-4034), E. coli JM109 pAD455 (FERM
BP-4036) o E. coli HB101 pNT4553 (FERM
BP-4368).
22. Un procedimiento para producir un
D-\alpha-aminoácido,
caracterizado porque un
N-carbamil-D-\alpha-aminoácido
es convertido en el
D-\alpha-aminoácido
correspondiente en un medio acuoso mediante la acción de una
descarbamilasa con una temperatura termoestable de 65ºC o superior,
derivada de Agrobacterium sp. KNK712 (FERM
BP-1900) que contiene una sustitución de otro
aminoácido por al menos un aminoácido seleccionado entre la
histidina 57, la prolina 203 y la valina 236 como se ha mostrado en
la SEC ID Núm. 1 y se recoge el
D-\alpha-aminoácido
resultante.
23. Un procedimiento de producción según la
reivindicación 22 donde el otro aminoácido es tirosina o la leucina
para la histidina 57, la leucina, la serina, la asparragina, el
ácido glutámico, la alanina, la isoleucina, la histidina o la
treonina para la prolina 203, y la alanina, la treonina o la serina
para la valina 236.
24. Un procedimiento de producción según la
reivindicación 22, donde se permite que la descarbamilasa actúe en
una forma inmovilizada.
25. Un procedimiento de producción según la
reivindicación 24, donde la descarbamilasa inmovilizada es utilizada
repetidamente.
26. Un procedimiento de producción según una
cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25, donde el microorganismo
que produce la descarbamilasa con una temperatura termoestable de
65ºC o superior es un microorganismo transformante de E.
coli, donde el microorganismo transformante es E. coli,
JM109 pAD402 (FERM BP-3912), E. coli JM109
pAD404 (FERM BP-3913), E. coli JM109 pAD406
(FERM BP-3914), E. coli JM109 pAD416 (FERM
BP-3915), E. coli JM109 pAD429 (FERM
BP-4035), E. coli JM109 pAD424 (FERM
BP-4034), E. coli JM109 pAD455 (FERM
BP-4036) o E. coli HB101 pNT4553 (FERM
BP-4368).
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