JPH0471489A - アセチルポリアミンアミドヒドロラーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、エシェリヒア属に属し、アセチルポリアミン
アミドヒドロラーゼ（以下、ＡＰＨと略記する。）産生
に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ（以下、ＡＰＩ遺伝子
ＤＮＡと略記する。）断片を保有する微生物を用いるＡ
ＰＲの製造法に関する。

ＡＰＲは、たとえば＠瘍マーカーである尿中ポリアミン
定量用臨床診断酵素として用いられる。

従来の技術 ＡＰＨを製造する方法としては、ストレプトマイセス属
（特開昭５６−１４４０８８号公報）、ミコプラナ属（
特開昭６４−８５０８０号公報）などに属する微生物を
用いる方法が知られている。

これらの微生物を、通常酵素生産に利用される培地で培
養しても、その生産量は極めて少なく、経済的に不利で
ある。

発明が解決しようとする課題 本発明の目的は、微生物を用いることにより、安価にか
つ大量にＡＰＲを製造する方法を提供することにある。

課題を解決するための手段 本発明によれば、エシェリヒア属に属し、かつミコプラ
ナ属に属する微生物由来のＡＰＲ遺伝子ＤＮＡをベクタ
ーＤＮＡに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有す
る微生物を培地に培養することにより、ＡＰＲを安価に
かつ大量に製造する方法を提供することができる。

以下に本発明の詳細な説明する。

ＡＰＨ遺伝子ＤＮＡは、ミコプラナ属に属し、ＡＰＨ産
生能を有する微生物の染色体ＤＮＡから得ることができ
る。具体的には、ミコプラナ・ブラタ（Ｍｙｃｏｐｌａ
ｎａ　ｂｕｌｌａｔａ）　ＦＥＲＭ　ＢＰ　−１８４５
株から得られる染色体ＤＮＡをあげることができる。

ミコプラナ属に属し、ＡＰＨ産生能を有する微生物の染
色体ＤＮＡからＡＰＩ遺伝子ＤＮＡ０単離は、常法、た
とえばカレント・トピックス・イン・マイクロバイオロ
ジー・アンド・イムノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐ
ｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）Ｖｏ！、９６（１９８２年〉に記
載の方法に従ってふこなうことができる。

得られたＡＰＩ遺伝子ＤＮＡをベクターＤＮＡに組み込
んで組換え体ＤＮＡを調製する。ＡＰＲ遺伝子ＤＮＡの
ベクターＤＮＡへの組込みは常法に従って、たとえば染
色体ＤＮＡおよびベクターＤＮＡを制限酵素で切断して
ＡＰＲ遺伝子ＤＮＡ断片およびベクターＤＮＡ断片を調
製したのち、両者の混合物をＤ　Ｎ　Ａ　リガーゼで処
理することによりおこなうことができる。

ここで用いられるベクターＤＮＡとしては、エシェリヒ
ア・コリを宿主とすることが可能なベクターであればい
ずれでもよく、とりわけｐＵＣ１１８、ｐＢＲ３２２な
どが好適に用いられる。

制限酵素としては、たとえばＢａｍＨＩ、５ａｕ３ΔＩ
、ＢｇＲＩ　Ｉ、ＥｃｏＲＩ、Ｐｓ　ｔ　Ｉなどがあげ
られる。５ａｕ３ＡＩの切断部位はＢｇＩＩＩやＢａｍ
ＨＩの切断部位と同じ構造の突出末端を生じるため、組
換えのための結合が可能である。染色体ＤＮＡを５ａｕ
３ＡＩやＢｇｌｌＩで限定分解または完全分解して得ら
れるＤＮＡ断片はＢａｍＨＩで切断したベクターＤＮＡ
断片と連結することは好適である。

ＤＮＡＩＪガーゼとしてはＴ４ファージ感染大腸菌由来
のＴ４ＤＮＡ’Ｊガーゼが好適に用いられる。

上記の方法で得られた組換え体ＤＮＡは、常法、たとえ
ばジャーナル　オブ　モレキュラ　）々イオロジー（Ｊ
、　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）　Ｖ
　ｏ　Ｒ、１６６Ｐ、５５７　（１９８３）に記載の方
法によってエシェリヒア・コリに導入することができる
。組換え体ＤＮＡ　（すなわちＡＰＨ産生に関与する遺
伝情報を担うＤＮＡを組み込んだベクターＤＮＡ）を含
有する菌株の選択方法は常法、たとえばモレキュラーク
ローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　　
：Ｔマニアチス、Ｅ、Ｆ、フリッチ、Ｊ、サムプルツク
著、コールドスプリングハーバ−出版社、１９ｇ２　：
以下本明細書中においてはモレキュラー・クローニング
は本書のことを示す。）に記載された方法により次のよ
うにおこなうことができる。

Ｍ換え体ＤＮＡを含有する菌株をＬＭ培地（１％バクト
ドリプトン、０．５％イーストエキストラクト、１０ｍ
Ｍ　　ＮａＣ１，１０ｍＭ　　Ｍｇ５Ｏ，，５０ｍｇ／
Ｉ　アンピシリン、１．５％　バクトアガー）上で培養
し、生じたコロニーをフィルターに転写、溶菌した後、
そのＤＮＡをフィルターに固定し、特開昭６４−８５０
８０号公報に記載されているミコプラナ属微生物の生産
するＡＰＨタンパク質のＮ末アミノ酸配列に基づいて作
製したＤＮＡプローブが結合するコロニーを選択する。

このようにして選択したコロニーからさらにＡＰＨ活性
をもつものの選択をおこないＡＰＩ遺伝子ＤＮＡを完全
に組み込んだベクターＤＮＡを含む微生物を得ることが
できる。

得られた微生物から、モレキュラー・クローニングに記
載の常法により、組換え体ＤＮＡを得ることができる。

得られた微生物に含まれる紐換え体ＤＮＡを用い、エシ
ェリヒア・コリを宿主微生物として大量にＡＰＩを発現
させるためには次のようにおこなう。

得られた組換え体ＤＮＡはまず常法、たとえばモレキュ
ラー・クローニングに記載された方法を用いて、その制
限酵素地図の作製をおこない、へＰＨタンパク質のＮ末
アミノ酸配列に基づいて作製したＤＮＡプローブが結合
するＤＮＡ断片をサザンハイブリダイゼーションにより
見いだす。

へＰＨ遺伝子の５′側非翻訳領域を含むこのＤＮＡ断片
をＭ１３ファージＤＮＡに組み込み、その塩基配列をユ
ナイテッド・ステイト・バイオケミカル・コーポレーシ
ョン（［Ｉｎ１ｔｅｄ　５ｔａｔｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｃ
ｌａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が勧めるシークナー
ゼ■を用いた方法により決定する。

得られた塩基配列の情報から、ＡＰＲ遺伝子のプロモー
ター、ＳＤ配列を含まないＡＰＨ構造遺伝子領域を組換
え体ＤＮＡから切り出し、エシェリヒア・コリの高発現
プロモーターとＳＤ配列の下流にＡＰ）ｆ遺伝子の開始
コドンをブロモ−クーＳＤ配列の距離が適当になるよう
につなぎ込む。

ここで用いられるプロモーターとしてはエシェリヒア・
コリで働くものはすべて有効であるがとりわけトリク　
（ｔ　ｒ　ｃ）プロモーター、トリク（ｔｒｐ）ｙプロ
モーター、ラムダＰＬプロモーターなどがあげられる。

このようにして得られた組換え体ＤＮＡを含有する微生
物のＡＰＨ産生能を調べ、より高いＡＰＨ産生能を有す
る微生物を選択する。微生物の具体的な例としては、ミ
コプラナ・ブラタ由来のＡＰＨ遺伝子ＤＮＡ断片をＰＵ
Ｃ１１８（全酒造社製）に組込んで得られた組換え体Ｄ
　Ｎ　Ａ　　ｐｔｒｃＮＭＡＰＨを保有するエシェリヒ
ア・コリられる。

本発明で得られる形質転換株は、通常の細菌培養法で培
養することによってＡＰＨを培養物中に生成蓄積する。

本発明微生物の培養に用いられる培地としては、炭素源
、窒素源、無機物、その他の栄養源を含有する合成培地
または天然培地のいずれも使用できる。

炭素源としては、たとえばグルコース、でんぶん、でん
ぷん加水分解物、糖蜜など種々の炭水化物が用いられ、
その使用量は５〜１０ｇ／ｊ！程度が好ましい。

窒素源としては、たとえば硫酸アンモニウム、リン酸ア
ンモニウム、炭酸アンモニウムなどの各種無機および有
機アンモニウム塩類、あるいはペプトン、酵母エキス、
コーン・スチーブ・リカーカゼイン加水分解物などの窒
素含有有機物などが用いられ、その使用量は５〜７０ｇ
／ｎ程度が好ましい。

無機物としては、たとえばリン酸第−水素カリウム、リ
ン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、
硫酸亜鉛などが用いられ、その使用量は０．０５〜５　
ｇ／ｊ！程度が好ましい。

培養は振盪培養あるいは通気攪拌培養などの好気的条件
下におこなわれる。培養温度は２５〜３７℃が好適であ
り、培養は通常１６〜４８時間程度で終了する。

培養を終了した菌体からＡＰＲを精製するにあたっては
、上記培養液から遠心分離などの方法で菌体を集め、得
られた菌体を超音波処理、ガラスピーズを用いる摩砕処
理、フレンチプレス処理などによって破砕し、酵素を抽
出する。抽出液を硫安塩析法、イオン交換樹脂を用いる
クロマトグラフィー、ゲル沖過法などの常法により処理
して、精製ＡＰＨを得ることができる。

本発明で得られる組換え体の生産するＡＰＨは特開昭６
４−８５０８０号公報に記載されたＡＰＨと同じ酵素活
性を有する。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例１．　　ＡＰＨ遺伝子のクローニング（１）　　
へＰＨ遺伝子を含む染色体ＤＮＡの調製ミコプラナ・ブ
ラタＦＥＲＭ　　ＢＰ−１８４５株をＫＭ１０２培地（
１０ｇ／ｆ　　ペプトン、７ｇ／Ｒ肉エキス、５ｇ／ｌ
　　イースト・エキストラクトおよび３ｇ／ｉ！　Ｎａ
Ｃ１）３０−中に植菌し、３０℃で２日間振盪培養して
得られた菌体を日立製冷却遠心機（ＲＰＲ２０−２０−
ター）を用いて４℃で１０，０００ｒｐｍ。

１０分間遠心して集菌した。菌体をカレント・トピック
ス・イン・マイクロバイオロジー　アンド　イムノロジ
ーＶｏ１．９６　（１９８２）に記載されている方法で
処理し染色体ＤＮＡを抽出し、約ＩＩＩＩｇの染色体Ｄ
ＮＡを得た。

（２）染色体ＤＮＡ断片のベクターＤＮＡへの導入前項
（１）で得られた染色体ＤＮＡ１０■をとり、Ｍ緩衝液
［１０ｍＭ　　）リス−塩酸緩衝液（ｐ）Ｉ７．５）、
１０ｍＭ　　Ｍｇ（ｌｚ　、５０ｍＭＮａＣｊ！、１ｍ
Ｍ　　ジチオスレイトール（ＤＴＴ）〕５００ρに溶解
して、制限酵素Ｂｇｆｌｌを５０単位添加し、３７℃で
４時間保温して完全分解をおこなった。ついで、これを
モレキュラー・クローニングに記載されている方法に従
って、１０〜４０％ショ糖蜜度勾配遠心により分画をお
こなった。遠心は日立製超遠心機（ＳＲＰ２８０−ター
）を用い、２０℃で２６，０００ｒｐｍ、１６時間おこ
なった。遠心後、分画をおこない、各分画の一部をモレ
キュラー・クローニングに記載されている方法に従って
アガロース電気泳動をおこない、ＤＮＡ断片の大きさを
測定した。

さらに５〜３ＫｂのＤＮＡ断片を含む分画のみを集めて
エタノール沈殿をおこなった後、ライゲーション緩衝液
［６６ｍＭ　　）！Ｊスス−酸緩衝液（ｐＨ７，６）　
、５ｍＭ　　ＭｇＣ１ｔ　、５ｍＭＤＴＴ、１ｍＭ　　
ＡＴＰ）５Ｑ、ｉｃｌ＋に溶解して約４ｔｔｇのＡＰＲ
遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。

また、ベクターｐＵｃ１１８（宝酒造社製）５■をＭ緩
衝液１５０〃に溶解して、制限酵素ＢａｍＨ１２０単位
を添加し、３７℃で３時間反応をおこなって、完全分解
した。その後、１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，６）
２０ＪＩＩｌと小生小腸由来アルカリ性フォスファター
ゼ（ベーリンガー・マンハイム社製）２単位を添加し３
７℃で１時間反応をおこない、脱リン酸化をおこなった
。さらに６５℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、エ
タノール沈殿を右こない、４０〃のライゲーション緩衝
液に溶解した。ついで、Ｂｇｊ！ＩＩで完全分解して得
られた４■のＡＰＨ遺伝子ＤＮＡを含む溶液１６ρとＢ
ａｍＨＩで分解して得られた５■のｐＵｃ１１８を含む
溶液２０〃を混合し、ライゲーション緩衝液で全量７５
ｄにしたのち、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２単位を添加し、１
６℃で１６時間、連結反応をおこない、組換え体ＤＮＡ
を含む溶液を得た。

（３）エシェリヒア・コリＭＭ２９４株の形質転換得ら
れた組換え体ＤＮＡを含む溶液をエシェリヒア・コｌＪ
ＭＭ２９４株の形質転換に供した。

エシェリヒア・コリＭＭ２９４株のコンビプント・セル
を、ジャーナル　オブ　モレキュラバイオロジ−（Ｊ、
　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）Ｖｏｗ
、１６６　　Ｐ、５５７　　（１９８３）に記載の方法
に従って調製した。前項（２）で得られた組換え体ＤＮ
Ａを含む溶液１０４と２１０４のＭＭ２９４株コンビプ
ント・セルを混合し、氷上に３０分間静置後、４２℃で
９０秒間熱処理をし、８００ρのＳＯＣ培地（２％バク
ト・トリプトン、０．５％イースト・エキストラクト、
１０ｍＭ　　ＮａＣ１，２，５ｍＭ　　ＫＣＣ１０ｍＭ
　　ＭｇＣｊ７２．１０ｍＭ　　Ｍｇ　Ｓ０４．２０ｍ
Ｍ　　グルコース）を加えて３７℃で１時間振盪培養し
た後、これをＬＭプレー）　　（ＬＭ培地にバタトアガ
ーを終濃度１．５％になるよう加えたもの）に１００ρ
ずつ塗布した。これを、３７℃で１６時間培養し、生育
してきた形質転換株を１０１枚のプレートに合計３１４
３株得た０ （４）形質転換株の選択 前項（３）のようにして得られたエシェリヒア・コ！Ｉ
ＭＭ２９４株の形質転換株をレプリカ法に従ってナイロ
ン・フィルター（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ、　７マ一シヤム社
製）に転写した。得られた１０１枚のフィルターはモレ
キュラー・クローニングに記載された方法により、溶菌
、ＤＮＡの変性および固定を右こなった後、３２ｐで標
識したプローブを用いてコロニー・ハイブリダイゼーシ
ョンをおこなった。

コロニー・ハイブリダイゼーションに用いたプローブは
特開昭６４−８５０８０号公報に記載されているＡＰＩ
のＮ末から１３番目のアスパラギン酸より、２９番目の
アラニンのアミノ酸配列に対応するＤＮＡ塩基配列を持
つ５０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドであり、その配列は
５′側よりＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＧＡＧＣＴＣＴＡ
ＣＧＧＣＧＧＣＧＡＧＣＴＧＧＴＣＣＣＣＣＣＧＴＴＣ
ＧＡＧＧＣである。

得られたフィルターをオートラジオグラフィーにかけプ
ローブの結合したコロニーの判別をおこない、７つのコ
ロニーを選択した。得られた７つのコロニー（すなわち
形質転換株）を６０ｍ？７）ＬＢ培地（１０ｇ／ｊ！　
　　）リプトン、５ｇ／β　イースト・エキストラクト
、５ｇ／βＮａ（１り中でそれぞれ１６時間、振盪培養
をおこなった。その後、常法に従い集菌をし、ＴＥ緩衝
液Ｃｌ０ｍＭ　　）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）　
、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ）６ｍｆ’に懸濁し超音波処理に
より溶菌をおこなった。得られた抽出液を用いて特開昭
６４−８５０８０号公報に記載された方法によりアセチ
ルプトレッシンを基質としてＡＰＨの酵素活性を測定し
た。その結果ある形質転換株から得られたクローンが約
１〔ミリ単位／−培養液〕の活性を示した。その形質転
換株をエシェリヒア・コリＡＰＨＷと命名した。ＡＰＨ
Ｗ株が含有するプラスミドを単離し、構造を解析した結
果、第１図に示すような構造を有していることが判明し
た。このプラスミドをｐＡＰＨＷと命名した。

実施例２．ＡＰＨ高発現プラスミドの作製（１）ＡＰＨ
遺伝子のプロモーター、ＳＤ配列、開始コドンの構造解
析 ＡＰＨ［［ｉｔのプロモーターはエシェリヒア・コリ内
では有効に働かないことからエシェリヒア・コリで働く
プロモーターをもつ発現ベクターＤＮＡにＡＰＨ遺伝子
を挿入することが必要である。そのとき、挿入したＡＰ
Ｒ遺伝子の翻訳開始コドンとベクターのＳＤ配列との間
が適当な距離になるように構築することが必要である。

そのためには、ＡＰＲ遺伝子の翻訳開始部位を含む５′
上流領域のＤＮＡ塩基配列の情報が必要となる。以下に
そのＤＮＡ塩基配列を決定する方法を示す。

まず、１０ｍＭ　　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）
　、５ｍＭ　　ＭｇＣＲｘ　、１００ｍＭＮａＣｆおよ
び１ｍＭ　　２−メルカプトエタノールからなる溶液（
以下、Ａ溶液という。）５θρ中で、１■のプラスミド
ＤＮＡｐＡＰＨＷを１０４４１位のＥＣ０ＲＩおよび１
０単位のＢａｍＨＩと、３７℃で３時間反応させ、完全
に消化させた。この溶液を０．７％アガロースゲルを用
いて電気泳動をおこない、常法により０．５．ｑ／ｒｎ
ｆ！臭化エチジウム溶液中で染色後、キャピラリートラ
ンスファー法に従ってナイロン・フィルター（Ｇｅｑｅ
　５ｃｒｅｅｎ　Ｐｌｕｓ、デュポン社製）に転写した
。得られたフィルターを、ｒ”Ｐ−ＡＴＰ（３０００Ｃ
ｉ／ｍ　ｍｏｌ、アマー／ヤム社製）とＴ４キナーゼ（
宝酒造社製）を用いて１．　ＯＸ１０’ｃｐｍ／ｐｍｏ
ｌに末端標識したプローブ〔実施例１（４））と、５　
ｘＳＳＣ溶液、５　ｘＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、０．
５％ＳＤＳ溶液および１００■　子牛胸腺のＤＮＡ（シ
グマ社製）からなる溶液５０−中で、６５℃、１２時間
パイプリダイゼーンヨンをおこなった。その後０．３　
Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ溶液および１．０％ＳＤＳ溶液からなる
溶液５０−中で５５℃、３０分間洗浄後、Ｘ線フィルム
（フジカラー社製）によるオートラジオグラフィーのシ
グナルを、臭化エチジウム染色で得られたパターンと比
較することで第１図に示したＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断
片にプローブが結合することがわかった。

このことからこの領域にへＰＨ遺伝子の開始コドンを含
む構造遺伝子の５′側領域および上流の副筋領域が存在
することが予想された。つぎにこの断片のＤＮＡ塩基配
列をユナイテッド・ステイト・バイオケミカル・コーポ
レーション（Ｉｌｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅ　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が勧めている
シークナーゼ＠を用いた方法により決定した。このよう
にして決定した断片の塩基配列および翻訳開始コドンの
下流については対応するアミノ酸配列を第２表に示した
。塩基配列より求められるＡＰＨタンパク質のＮ末アミ
ノ酸配列は特開昭６４−８５０８０号公報に示されてい
るＡＰＨの４８個のＮ末アミノ酸配列と一致する。

第２表 ＥＣ０ＲＩ　　ＡＣＧＧＣＴＣＧＡＣＣＡＣＴＴＣＧＣ
ＴＡＡＡＧＧＣＣＡＧＧＧＡＧＡＧＣＴＧＴＣＧＡＣＧ
ＣＡＡＧＡＡＡＣＧＧＡＡＴＧＧＴＣＧＧＣＴＧＴＣＧ
ＴＣＣＧＣＧＴＡＡＴＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＴＧＴＧＧ
ＣＧＧＣＧＧＴＧＡＴＴＧＣＧＣＣＡＴＴＴＧＣＴＧＣ
ＧＣＧＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＧＴＣＧＧＣＧＧＣＴＧＴ
ＣＧＧＣＧＣＧＧＡＧＣＣＴＧＴＡＡＣＣＴＧＴＣＧＣ
ＡＴＧＣＴＡＣＴＣＴＧＧＴＡＧＧＴＣＣＡＴＣＡＴＣ
ＴＴＧＧＣＧＧＴＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＴＧＴＧＧＴＡ
ＣＧＡＧＣＡＡＡＧＡＴＣＡＴＡＣＧＧＣＧＧＧＴＧＧ
ＣＡＡＧＣＧＴＧＴＧＧＡＡＡＣＧＧＣＣＡＴＣＧＧＣ
ＧＣＴＴＣ１ＡＡＧＧＣＴＡＡＣＧＴＣＣＧＣＧＣＡＡ
ＣＣＡＡＣＧＣＡＧＧＧＧＡＣＡ１ａＰｒｏＰｈｅＡｒ
ｇＡｌａＧｌｕＴｒｐＨｅ（２）ｔｒｃプロモーターを
用いたＡＰＨ発現ベクターの構築 実施例２．　（１）で得られた塩基配列の情報よりｔｒ
ｃプロモーターをもつ高発現プラスミドｐＫＫ２３３−
２（ファルマシア社製）のＮｃｏ　ｌ−Ｈｌ　ｎｄＩＩ
Ｉ制限酵素サイトに第１図に示したプラスミドｐＡＰＨ
ＷのＮｄｅｌ）（ｉｎｄｌＩ断片を挿入した。

その方法として、まずＩＪｌｇのｐＫＫ２３３２を、５
０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ　
　ＭｇＣＣ１０，１００ｍＭ　　ＮａＣ１および１ｍＭ
　　ジチオエリスリトールからなる溶液（以下、Ｂ溶液
という。）５０４中で３単位のＮｃａｌを用いて３７℃
、３７時間反応させた後、Ｎｃｏｌで切断されたプラス
ミドを３０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，０）　、１０
０ｍＭＮａＣ１，ｌｒｎＭ酢酸亜鉛および１０％グリセ
ロールからなる溶液５０β中で５０単位のマング・ビー
ン・ヌクレアーゼにより突出末端を削り落して末端を平
滑にした。ＮｃｏＩ切断面が平滑になったプラスミドを
Ａ溶液５０ρ中てｌＯ単位のＨｉｎｄ［を用いて３７℃
、３時間反応させＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩｌ断片を得た
。

次に、１■のｐＡＰＨＷをＢ溶液５０ρ中で、５単位の
ＮｄｅＩを用いて３７℃、３時間反応させ、その後、Ｎ
ｃｌｅｌで切断されたプラスミドを７ｍＭ　　）リス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）、０．１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、
２０ｍＭ　　ＮａＣ１！、７ｍＭ　　ＭｇＣＣ１０，１
ｍＭ　　ｄＡＴＰ、０．１ｍＭｄＧＴＰ、０．１ｍＭ　
　ｄＣＴＰおよび０．１ｍＭｄＴＴＰからなる溶液（以
下、Ｃ溶液という。）５０ρ中で、２単位のＤＮＡポリ
メラーゼのクレノーフラグメントを用いて３７℃、１５
分間反応させて末端を平滑にした。その後Ｎｄｅｌ切断
面が平滑になったプラスミドをＡ溶液５０β中で、１０
単位のＨｉｎｄｌを用いて３７℃、３時間反応させてＮ
ｄ　ｅ　Ｉ−Ｈｉ　ｎｄＩＩＩ断片を獲得した。

このようにして得られたプラスミドｐＫＫ２３３−２　
　Ｎｃｏｌ−ＨｉｎｄＩｎ断片とプラスミドｐＡＰＨＷ
　　ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩ［断片はＤＮＡＩＪガーゼ
を用いた常法により連結し、プラスミドｐ　ｔ　ｒ　ｃ
ＮＨＡＰＨを得た。このようにして、繋ぎ合わせてＡ　
Ｐ　Ｒの開始コドンはベクターＤＮＡのＳＤ配列の下流
の最適な位置に配置することができる。

次に挿入断片の３′側の余分な部分を除くため得られた
組換えプラスミドｐｔｒｃＮＨＡＰ８１■をＡ溶液５０
ρ中で５単位のＨｉｎｄＩ［ｌで３７℃、３時間反応さ
せた後、Ｈｉ　ｎｄｌＩｌで切断されたプラスミドをＢ
溶液５０〃中で５単位のＭｊ！ｕＩで３７℃３時間反応
させた。さらにＭｆｕｒで切断されたプラスミドをＣ溶
液５０ρ中で２単位のクレノーフラグメントを用いて３
７℃、１５分間反応させ両末端を平滑にした。平滑にな
った両末端をＤＮＡ！Ｊガーゼを用いた常法により繋ぎ
合わせた。

以上の方法により構築されたプラスミドｐｔｒｃＮＭＡ
ＰＨの構造を第２図に示す。

このようにして得られたプラスミドｐｔｒｃＨＭＡＰＨ
を常法に従ってエンエリヒア・コリＭＭ２９４株に形質
転換することで、Ａ　Ｐ　Ｒ生産株、エンエリヒア・コ
リＴＲＣ−ＡＰＨを得た。

エンエリヒア・コリＴＲＣ−ＡＰＨはブタペスト条約に
基づいて平成２年６月２５日付で工業技術院微生物工業
技術研究所に微工研条寄第２９８６号（ＦＥＲＭ　　Ｂ
Ｐ−２９８６）として寄託されている。

実施例３．各種菌株の生産力価の比較 第３表に示す３菌株を、同じく第３表に示す培地６０−
を含む３００ｒｎ１容三角フラスコに植菌し、３０℃で
１８時間振盪培養した。

■培地の組成：１％　ブイヨン、１％　イーストエキス
トラクト、（ｐＨ７，０） ■培地の組成；０．５％イーストエキストラクト、０．
５％　トリプトン、０．０５％　ＮａＣｆ、０．１％　
Ｋ　Ｈ２Ｐ　Ｏ，，０，０１％　Ｍｎ　Ｓ　０４．１．
０％アセチル・ブトレッンン ２ＸＹＴ培地の組成＋１６ｇ／β　トリプトン、１０ｇ
／ｉ’　　イーストエキストラクト、５ｇ／！ＮａＣｆ
１ 培養終了後、遠心分離により菌体を集め、ＴＥ緩衝液に
懸濁後、超音波処理により破砕し、菌体抽出液を調製し
、その抽出液中のＡＰＨ活性を特開昭６４−８５０８０
号公報に記載されている方法に従って測定した。結果を
第３表に示す。

第　　　３　　　表 実施例４．紐換え株ＴＲＣ−ＡＰＨによるＡＰＩの生産 （１）　　Ｔ　ＲＣ−Ａ　Ｐ　Ｈ株の５β培養槽におけ
る培養ＴＲＣ−ＡＰＨ株を１．５％　Ｎａ２ＨＰＯ＊、
０．３％　Ｋ　Ｈ２Ｐ　０４．０．５％　ＮａＣ１，０
，１％　ＮＨ，ＣＩ、０．５％　ペプトン、０．１％微
量元素液［：２５ｇ／Ｒ（ＮＨ，）　２ＨＰＯ，，５ｇ
　／　ｊ！　　Ｋ２　Ｓ　０４．０．１５ｇ／Ｉ　　Ｎ
ａＣＲ。

５ｇ／４１！　　Ｍｇ５Ｏ＜・７Ｈ２０，０，７５ｇ／
ＪＦｅＳ○４’７Ｈ２０，０，１７ｇ／ｊ！　　Ｚｎ５
Ｏ。

・７Ｈ２０，０，０７５ｇ／ｆ　　Ｃｕ５Ｏ−・５Ｈ２
０，０，０３８ｇ＃　　Ｍｎ５ｏ、・４〜５Ｈ，Ｏ１０
，１５ｇ／ｌ　　ＣａＣｌ２・２Ｈ２０，０，０１７ｇ
／ｉ！　　Ｎ　ａｚＢ、ｏ、・１０　ＨａＯｌｏ、００
７５ｇ　／　Ｒ（Ｎ　Ｈ４）　６　Ｍ　Ｏ’ｌ　０２４
・１０Ｈ，Ｏ）、０．５％　グルコース、　０．０２４
６％　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・７Ｈ，０１４ｍｇ／ｊ！　　
ビタミンＢ　１．５０ｍｇ／　Ｒ。

アンピシリンからなる培地（ｐＨ６，６）　２．０１２
を含む５１容培養槽に植菌し、２８℃で３０時間通気攪
拌培養した。培養開始８時間後より１６．７％ペプトン
、１６．７％グルコースおよび０．４％微量元素液の組
成からなるフィード培地を連続的に全量約７０−注入し
た。

本菌は本条件下で３８〔単位／−培養液〕のへＰＨ生産
性を示した。。

（２）ＡＰＨの精製 実施例４．　（１）で得られた培養液より遠心分離にて
菌体を集めた。得られた菌体を０．０１ＭＩＪスー塩酸
緩衝液（ｐＨ８，０）２００艷に懸濁して超音波処理を
おこない細胞を破砕し、菌体内の酵素を抽出した。得ら
れた粗抽出液を１２．００Ｏｒｐｍで２０分間遠心して
可溶性画分を得た。

つぎに得られた可溶性画分に固形硫酸アンモニウムを４
０％飽和になるように添加後、沈澱した部分を採取した
。

この沈殿物を５０ｍｆの０．０１　Ｍ　）　ＩＪスス−
酸緩衝液（ｐＨ８，０）および０．００５Ｍメルカプト
エタノールからなる溶液に溶解した。この溶液を同緩衝
液１０１で２４時間透析した。透析液を同緩衝液で平衡
化したＤＥＡＥ−セファロース（ファルマシア社製）（
１０００ｒｎ１．口径１０ｃｍ）に通塔し、ＡＰＲを吸
着した。さらに同緩衝液で不純蛋白質を洗い流した。次
に同緩衝液中で０から０．５　Ｍまでの食塩による濃度
勾配液で溶出をおこなった。溶出してくる活性画分をあ
わせ、これに硫酸アンモニウムを加えて９０％飽和で沈
殿する部分を遠心分離（１２，０００ｘｇ、２０分間）
で集め、０．０１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐｌ（８，０
）５０−に溶解した。この溶液を同緩衝液２βで２４時
間透析した。透析液を凍結乾燥し、ＡＰＲの粉末精製酵
素標品２ｇ（比活性２９単位／ｍｇ）を得た。

発明の効果 本発明によれば、エシェリヒア属に属し、ミフブラナ属
に属する微生物由来のＡＰＲ産生に関与する遺伝情報を
担うＤＮＡ断片をベクターＤＮＡに組み込んで得られる
組換え体ＤＮＡを保有する微生物を用いることにより、
安価にかつ大量にＡＰＨを製造する方法を提供すること
ができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、エシェリヒア・コリＡＰＨＷ株の含有する組
換え体プラスミドｐＡＰＨＷの制限酵素切断地図である
。 第２図は、 プラスミドｐ　ｔ　ｒ　ｃＮＭＡＰＨの構造を示す。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）エシェリヒア属に属し、かつミコプラナ属に属す
   る微生物由来のアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼ
   産生に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片をベクターに
   組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有する微生物を
   培地に培養し、培養物中にアセチルポリアミンアミドヒ
   ドロラーゼを生成蓄積させ、該培養物からアセチルポリ
   アミンアミドヒドロラーゼを採取することを特徴とする
   アセチルポリアミンアミドヒドロラーゼの製造法。
2. （２）エシェリヒア属に属し、かつミコプラナ属に属す
   る微生物由来のアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼ
   産生に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片をベクターに
   組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有する微生物。
3. （３）ミコプラナ属に属する微生物由来のアセチルポリ
   アミンアミドヒドロラーゼ産生に関与する遺伝情報を担
   うＤＮΛ断片をベクターに組み込んで得られる組換え体
   ＤＮＡ。
4. （４）下記第１表に示されるアミノ酸配列で表されるミ
   コプラナ属に属する微生物由来のアセチルポリアミンア
   ミドヒドロラーゼポリペプチドをコードする遺伝子。
5. （５）ミコプラナ属に属する微生物由来のアセチルポリ
   アミンアミドヒドロラーゼポリペプチドをコードする下
   記第１表に示される塩基配列で表される遺伝子。 第１表 【遺伝子配列があります。】