CN1083528A - 编码可提高耐热性的脱氨基甲酰酶的dna及其用途 - Google Patents
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Abstract
公开了由于编码来自微生物的脱氨基甲酰酶蛋
白的DNA片段的至少1个碱基用其他的碱基置换
后，对应的氨基酸的至少1个被置换，而编码耐热性
提高了的脱氨基甲酰酶蛋白的DAN片段、其制备方
法、含有该DAN片段的载体、用该载体转化了的转
化体、以及耐热性提高了的脱氨基甲酰酶及其制备方
法。另外，也公开了由于耐热温度65℃以上的脱氨
基甲酰酶的作用，在水性溶剂中，把N-氨基甲酰
-D-α-氨基酸转化成对应的D-α-氨基酸，获取生
成的D-α-氨基酸的D-α-氨基酸的制备方法。
Description
本发明是关于DNA片段，更详细地说是关于编码可提高耐热性的、把D-N-氨基甲酰-α-氨基酸转化成对应的D-α-氨基酸的酶（以下称脱氨基甲酰酶）DNA片段。另外，本发明还是关于该DNA片段的制备方法、含有该DNA片段的载体、用该载体转化的转化体、耐热性提高的脱氨基甲酰酶及其制备方法、及使用该脱氨基甲酰酶的氨基酸的改良和制备方法。进而，本发明是关于将参与脱氨基甲酰酶的耐热性的氨基酸的突变数增加1个以上的方法。
旋光性的D-α-氨基酸类是医药中间体中的重要化合物，特别可以举出的半合成青霉素类和半合成先锋霉素类的制备中间体的甘氨酸、D-对羟基苯基甘氨酸等在工业上有用的化合物。作为这样的D-α-氨基酸类的制备方法已经知道的是将对应的D-N-氨基甲酰-α-氨基酸类的氨基甲酰基除去后，而得到D-α-氨基酸类的方法，此时，氨基甲酰基的除去，可通过化学的方法（特公昭58-4707号说明书）和利用微生物酶反应的方法（特公昭57-18793号说明书、特公昭63-20520号说明书、特公平1-48758号说明书及特申平2-407922号说明书）来进行的。
可是，为了除去此氨基甲酰基所采用的化学方法由于使用了大量的硫酸等无机酸，在其处理等方面存在着环境上的问题。另外，利用酶反应的方法，存在着酶的生产量尚不充足，即使可能大量生产，其性质上有某些不足处，到目前为止，尚未发现对基质的反应性和酶的稳定性二者兼顾的酶。
一般，酶的稳定性大多不好，所以通常在配制时，采用了加入稳定剂、在低温下处理等的防止失活手段。因此，在常温或高温下将酶实际上应用于反应时，酶的稳定性将成为问题，特别是用于工业生产时，其稳定性会直接影响的产品的成本。另外，特别是用于工业上时，作为有利地进行酶反应的手段，反复地将固定化酶和固定化菌体等所谓的生物反应剂用于反应中，但是由于酶的稳定性，使用的次数受到了限制，对产物成本的影响很大。
因此，本发明中，作为酶的稳定性之一的指标，着眼于其耐热性，通过使用遗传工程的手段，提高酶的耐热性，来增加酶的稳定性，制作工业利用上有利的稳定性酶。
本发明的目的在于为了解决这样的课题，改良现在所使用的脱氨基甲酰酶，制备成对基质D-N-氨基甲酰-α-氨基酸的反应性高、而且稳定性优良的脱氨基甲酰酶，使用此酶可高效地生产D-α-氨基酸。
也就是本发明提供了把含有脱氨基甲酰酶的基因的DNA片段进行化学或酶的诱变处理，使结合了此DNA片段和载体DNA的重组DNA导入宿主细胞，筛选耐热性提高了的生产株，用此基因转化由属于埃希式属、假单胞菌属、黄杆菌属、杆菌属、沙雷式菌属、棒状杆菌属或短颈细菌属微生物中选出来的宿主菌体，由于得到的转化体产生的酶作用，把D-N-氨基甲酰-α-氨基酸，在水性介质中变换成D-α-氨基酸，收集生成的D-α-氨基酸的D-α-氨基酸的改良制备方法。
因此，本发明也提供了为了实施本发明的、改良了的制备D-α-氨基酸的DNA片段、其制法以及含有该片段的表达载体、用该表达载体转化了的转化微生物及耐热性提高的脱氨基甲酰酶及其制备方法。进而，本发明也提供了将参与脱氨基甲酰酶耐热性的氨基酸的突变数增加1个以上的方法。
图的简单说明
以下，一边参照附图一边说明本发明。
图1表示了使用本发明得到的耐热性提高了的脱氨基甲酰酶的生产株，经热处理后的脱氨基甲酰酶的耐热活性图。
图2表示了对于本发明得到的耐热性提高了的脱氨基甲酰酶用固定的树脂对其耐热性反复连续试验的稳定性结果图。
图3表示质粒PKK233-2及pKK NE的限制图。
图4表示质粒pAD108及pAD1086的限制图。
图5表示质粒pAD402及pAD4021的限制图。
图6表示质粒pAD429及pAD455的限制图。
图7表示E.coli JM109 pAB108及E·coli JM 109pAD455产生脱氨基甲酰酶的反应温度和活性的关系图。
图8表示E.coli JM109 pAD416及E.coli JM109 pAD455对于产生的脱氨基甲酰酶的pH稳定性的图。
图9表示引入外来基因的载体pUC NT及耐热性提高了的脱氨基甲酰酶表达载体pNT4553的制备方法。
图10表示质粒pUC NT及pNT4553的限制图。
一般认为酶的耐热性和稳定性是相关的，嗜热菌生产的酶是耐热性高的酶，这些酶几乎无有例外的稳定性高，以及通过基因的重组技术，置换氨基酸，得到的耐热化酶，其稳定性也是优良的（香川等、细胞工学、7卷、509～571（1988））。
作为酶的耐热化方法，认为有改变酶蛋白的氨基酸序列的方法和化学处理和通过酶反应修饰酶的方法。作为通过改变酶蛋白的氨基酸序列提高耐热性方法有将菌体用亚硝基胍（NTG）等化学诱变剂和紫外线等进行诱变，通过筛选方法和基因重组技术后，取出目的基因，进行化学的或酶的诱变，而后使该基因回到菌中后进行筛选的方法等。取出基因使其诱变时，供给编码突变的脱氨基甲酰酶蛋白的DNA片段，用单链状态进行更有效果。制成单链状态时，例如可使用引入到噬菌体中的方法等。作为单链DNA，即使含有对应脱氨基甲酰酶蛋白的氨基酸序列密码的DNA链，其互补链的任何一个也都可以使用。另外，对于突变的部位，可认为有随机导入突变的方法，和把突变导入特异部位的导入方法。
通过化学反应，作为将基因随机的诱变、使酶蛋白的氨基酸序列突变的诱变剂有盐酸羟基胺、亚硝酸钠、甲酸、肼等。
例如，在使用盐酸羟基胺诱变时，若先在M13噬菌体、例如M13 mp19等的双链DNA上连接脱氨基甲酰酶基因，使其感染E.coli JM109等感染，培养后，制备噬菌体，将其用于突变。诱变反应使用0.1M到2M、最好是0.25M的盐酸羟基胺，其pH使用6.0到8.0，最好6.0，反应温度为37℃下，通过1小时到24小时的反应来得到。将进行此诱变反应的噬菌体感染E.Coli，作为双链重组DNA回收，通过转移到质粒中可以制备突变的脱氨基甲酰酶的基因。
另外，在使用亚硝酸钠、甲酸、肼等的诱变中，基本上可以使用Myers，R、M等所指示的方法（Science229、242～247（1985））。此方法是将由含有脱氨基甲酰酶基因的重组M13噬菌体制成单链DNA，并对其进行诱变处理。用亚硝酸钠诱变时，使用浓度为0.5M到2M，较好1M，其pH为酸性，较好地是pH为4.3的硝酸钠，在反应温度为4℃～37℃，较好地25℃，从1分钟～5小时，较好30分钟条件下进行反应。用甲酸进行诱变时，可通过使用12M甲酸，在4℃～37℃、较好15℃下反应2分～10分钟的条件来进行。另外，用肼诱变时，可通过使用20%～60%浓度的肼，在25℃下处理3至10分钟来完成的。这些突变的单链DNA，可通过使用大肠菌DNA多聚酶Klenow片段和SequenaseR等进行双链化，通过引入质粒制成突变的脱氨基甲酰酶基因。
另外，作为使用酶反应的随机诱变方法，可举出使用PCR反应（多聚酶链反应）的方法（Leung D、W等、A Journal of Methods in Cell and Molecular Biology，1，11-15（1989））等。这是使用Taq DNA多聚酶，是从基因的两端具有序列的合成DNA（DNA引物）分别合成基因，此时的反应条件要使用比通常反应高的Mgcl2浓度和基质（dNTPs）的浓度，4种基质中只有1种的浓度是极低的反应条件、通过在用Taq DNA多聚酶基因合成时发生的错误，可以制成具有突变的氨基甲酰酶基因。
作为将基因的突变导入酶蛋白特异部位的方法，可以举出使用寡聚核苷酸的体外部位特异的突变导入法、突变部位的插入（Cassette）置换法、使用PCR反应的方法等。使用寡聚核苷酸的体外部位特异的突变导入法是由插入脱氨基甲酰酶基因的M13重组噬菌体制成单链DNA、使用含有突变部分的突变序列合成DNA引物和使用DNA多聚酶Klenow片段样的酶，使之双链化，通过导入E.coli来制作的，这些反应若使用市售的试剂盒，例如，宝酒造（株）的“MutanTH-K”和“MutanTH-G”、Ama Sham·Japanc的“寡聚核苷酸的部位特异的体外突变体制作系统Version2.0”等时可以简单地进行。突变部位的插入式（Cassette）置换法，是用含有突变的合成DNA完全地置换含有想要突变部位的限制酶片段来进行的。使用PCR反应的方法，可按照伊藤等（Ito.W.etal）Gene 102，67～70（1991）的方法等来进行。此法是将含有合成DNA引物与基因末端的合成DNA进行PCR反应，将其与基因全长DNA杂交后，通过酶使之延伸，通过再次进行合成全长的PCR反应来得到。
在本发明中，将用以上方法制作的突变脱氨基甲酰酶基因连接在pUC 19和pKK-233-2等的质粒载体上，导入E.Coli，例如JM109等中，在含有抗生素等的琼脂平板培养基上获得菌落。接着在灭菌的滤纸上复制此菌落后，保存于平板培养基。干燥后，通过将此滤纸浸在含有溶菌酶和Triton X-100的液体中或者是反复地从丙酮-干冰法存入和取出（解溶冻结）使之溶菌。接着，将此滤纸，在设定为65℃、70℃等温度浴中浸渍一定时间，例如5分钟，干燥后，将其浸渍在由于脱氨基甲酰酶活性而引起显色的反应液中。此反应液含有氨基甲酰-D-氨基酸的基质，也可以使用含有苯酚、4-氨基安替比林、D-氨基酸氧化酶及过氧化酶的物质等。显色的菌落可以耐热性获得株分离出。
首先，作为表示酶耐热性的指标，定义其耐热温度。所谓的耐热温度是指在10分钟热处理时，当活性有50%失活时的处理温度。作为脱氨基甲酰酶基因的获取源可以使用通常具有脱氨基甲酰酶的公知微生物。（例如，国际公开号WO92/10579中记载的微生物）各个微生物的脱氨基甲酰酶的耐热温度是不同的，但是在提高耐热性后，为了得到耐受反复使用的优良稳定性的物质，当然也要必须考虑耐热性以外的各种性质，最好使用原来耐热性高，例如，显示60～63℃耐热温度的脱氨基甲酰酶。从此观点出发，放射土壤杆菌KNK712（FERM BP-1900）产生的脱氨基甲酰酶由于耐热温度约62℃，所以比较合适。该KNK712的脱氨基甲酰酶及编码此酶的DNA片段具有记载在序列表、序列号1上的氨基酸序列及DNA序列。对此脱氨基甲酰酶基因施以前述的诱变处理后得到的耐热性提高了的脱氨基甲酰酶，由序列表、序列号2～16所示那样可知道是57位的组氨酸、203位的脯氨酸、或236位的缬氨酸被其他氨基酸置换了的产物。因此，对于耐热性，至少与三个位置的氨基酸有关。不仅1个氨基酸的置换，进而联合2或3个氨基酸的置换物也可以得到高耐热性。本发明中，对于耐热温度至少提高2℃以上，多的约5℃以上，有时可提高到10℃以上。
例如，作为其他的氨基酸，通过将57位的组氨酸置换为亮氨酸或酪氨酸、203位的脯氨酸置换成组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸、丝氨酸、236位的缬氨酸置换成丙氨酸或丝氨酸来得的耐热性提高了的脱氨基甲酰酶（序列表、序列号2～30）。编码此耐热性提高了的脱氨基甲酰酶的DNA序列，也可将对应57位的组氨酸的401位～403位的CAT被置换为TAT、CTT或CTA、对应于203位的脯氨酸的839～841位的CCT被置换为TCT、CTT、GAA、AAC或ACC、对应于236位的缬氨酸的938～940位的GTG被置换成GCG、GCT、ACC、ACG、TCA、TCG或AGT后，而得到（序列表、序列号2～30）。一旦，明确了有关耐热的氨基酸，由于可能施以部位特异的诱变技术，所以通过种种碱基的置换，可以置换为很多的氨基酸。这样一来，可将编码的耐热性提高的脱氨基甲酰酶DNA片段进一步加以诱变处理，使得耐热性提高。
对于放射土壤杆菌-KNK712（FERM BP-1900），判明与耐热性相关的57位组氨酸、203位的脯氨酸及236位的缬氨酸的3个氨基酸中的2个或3个的氨基酸产生突变的衍生物（多重突变体），可按如以下的方法制作。
PAD108（编码天然脱氨基甲酰酶）和pAD402（编码为57位的His置换成Tyr的脱氨基甲酰酶）的基因结构，分别可按图4及图5那样，由于SphpI及SalI在脱氨基甲酰酶的基因附近重复，所以可用PCR法在脱氨基甲酰酶基因开始密码部位制作NdeI切点。这样一来，第57位氨基酸存在于Ndel-Sacl的约190bpDNA片段上，203位的氨基酸存在于SalI-ClaI的约170bpDNA片段上，236位的氨基酸存在于ClaI-Sphl的约75bpDNA片段上。
多重突变体是通过将这些无突变DNA片段用参加耐热性氨基酸突变的DNA片段置换后，而制作的。突变氨基酸的DNA片段，可由用实施例3及8得到的转化体或者表达载体来制备。
另一方面，将含有脱氨基甲酰酶基因（天然物、1个氨基酸变异了的）NdeI-EcoRI的约1.6Kb DNA片段从含有Ndel位点的pAD108和pAD402等切取，插入到具有Ndel和EcoRI切点的适当载体，如实施例9及图3所示的pKK NE（由图3所示的pKK233-2制备）中，制备质粒（由pAD108制作如图4所示pAD1086、由pAD402制作如图5所示pAD4021）。将含有此质粒的上述3种的氨基酸无突变部位的DNA片段通过与含有氨基酸突变部位DNA片段进行置换来制备多重突变体的表达载体。
这样制得的多重突变体的耐热性，一般地随着由于单一突变而产生的耐热性提高，取得了多重相加效果。3种氨基酸中的2种以上的氨基酸突变的脱氨基甲酰酶，可以进行上述氨基酸组合。
此种方法，不限于放射土壤杆菌-KNK712（FERM BP-1900）的情况，也可以使用在进一步提高脱氨基甲酰酶耐热性的场合。也就是说，通过上述提高酶耐热的方法，置换1个氨基酸，可以得到数种提高了耐热性的脱氨基甲酰酶，明确了与耐热性相关的氨基酸部位，进而，置换此氨基酸，明确了可提高耐热性的其他氨基酸，在得到了对应于各个耐热性脱氨基甲酰酶DNA片段的情况下，按下述操作1）～5），使得参与耐热性提高的多个氨基酸部位，同时接受突变（多重突变体），得到了耐热性相加地提高了的脱氨基甲酰酶。
1）对于含有编码参与耐热性的每一个氨基酸的DNA片段，找出可以切出每个DNA片段的限制性酶。
2）从至少编码一个氨基酸突变的耐热性脱氨基甲酰酶的DNA片段或含有此片段的载体，使用1）的限制性酶切出含有编码一个突变氨基酸部位的DNA部分的DNA片段。
3）使用同样的限制性酶，从含有编码氨基甲酰酶的DNA片段或含有此片段载体中切出氨基酸还未突变的对应的DNA片段。
4）在3）中切出的对应的DNA片段而剩下的DNA片段或含有此片段的载体中，插入接受突变2）的DNA片段。
5）必要时，可重复2）～4）的操作。
通过一系列操作，可以将参与耐热性氨基酸的突变数增加1个以上。
在放射土壤杆菌-KNK712（FERM BP-1900）时，作为2）的载体，只要是将序列表、序列号2～30的DNA片段引入pUC19的表达载体上制作NdeI切点后的物质，任何的载体都可以使用。另外，作为含有3）的脱氨基甲酰酶基因的载体，除了pAD4021、pAD1086之外，从下记列举的上述表达载体的具体例中，从除去含有编码参与耐热性3个部位耐热性提高的氨基酸上突变完毕的脱氨基甲酰酶的DNA片段载体（即，具有3个突变位点的pAD426、pAD427、pAD454、pAD455、pAD456）的所有的载体中，制作的NdeI切点上，使用pKK NE后，与pAD4021同样操作可以得的载体等。另外，用限制酶切出的DNA片段，对于2）或3）任何场合都是NdeI-SacI、SalI-ClaI、及ClaI-SphI。
对于编码脱氨基甲酰酶的DNA片段、引入载体的表达载体、将表达载体转化到宿主细胞的转化体的制备，可按照例如，国际公开号WO92/10579上记载的基因操作技术而得到。
将序列表、序列号2～34的DNA片段引入pUC19或pKKNE的表达载体，例如引入pUC19中后可得到pAD402、pAD404、pAD406、pAD416、pAD428、pAD429、pAD431、pAD434、pAD435、pAD439、pAD441、pAD445、pAD447、pAD448、pAD450、pAD451、pAD452、pAD453、pAD454或pAD456，
若引入pKK NE中可得到
pAD421、pAD422、pAD423、pAD424、pAD425、pAD426、pAD427、pAD461、pAD455，
进而，若引入pUC NT（图10上）中时，可得到pNT4553（图10下）。通过耐热部位氨基酸的置换，由于上述限制性酶而引起的切点不变化，所以，引入pUC19中的物质显示了与pAD429（图6上）相同的限制图，引入pKK NE的物质，显示了与pAD455（图6下）相同的限制图。用这些表达载体，转化（Escherichia Coli）JM109或HB101可以得到产生耐热性提高了的脱氨基甲酰酶的以下的转化体。
E.coli JM109 PAD402(FERM BP-3912)
E.coli JM109 pAD404 (FERM BP-3913)
〃 JM109 pAD406 (FERM BP-3914)
〃 JM109 pAD416 (FERM BP-3915)
〃 JM109 pAD428
〃 JM109 pAD429 (FERM BP-4035)
〃 JM109 pAD431
〃 JM109 pAD434
〃 JM109 pAD435
〃 JM109 pAD439
〃 JM109 pAD441
〃 JM109 pAD445
〃 JM109 pAD447
〃 JM109 pAD448
〃 JM109 pAD450
〃 JM109 pAD421
〃 JM109 pAD422
〃 JM109 pAD423
E.coli JM109 pAD424(FERM BP-4034)
〃 JM109 pAD425
〃 JM109 pAD426
〃 JM109 pAD427
〃 JM109 pAD451
〃 JM109 pAD452
〃 JM109 pAD453
〃 JM109 pAD461
〃 JM109 pAD454
〃 JM109 pAD455(FERM BP-4036)
〃 JM109 pAD456
〃 JM109 pAD468
〃 JM109 pAD469
〃 JM109 pAD470或
〃 HB101 pNT4553(FERM BP-4368)
这些改良型的脱氨基甲酰酶，通过插入到载体的强启动基因的下段，可以提高目的转化株的酶生产量。
转化株通过在通常的营养培养基中，可以使其表达导入的重组体DNA的产物。向重组DNA中含有基因DNA或来自载体DNA性质时，可根据其性质即使向培养基中补加药剂也无什么影响。
作为酶源得到的转化株时，可使用通常的培养基进行培养，但必要时，可添加已内酰脲化合物、D-N-氨基甲酰-α-氨基酸、异丙基-1-硫代（テオ）-β-D-半乳糖（IPTG）等，提高温度等来进行酶的衍生处理。
为了进行转化株培养而使用的培养基可以使用通常含有碳源、氮源及无机离子的普通培养基。向其中若加入维生素、氨基酸等有机微量营养素时，大多可以得到更好的结果。作为碳源可以适当地使用葡萄糖和蔗糖等碳水化合物、醋酸样的有机酸、醇类等。作为氮源可以使用氨气、氨水、铵盐等。作为无机离子可以使用磷酸离子、镁离子、钾离子、铁离子等。
培养是在好气的条件下，控制在pH4-8，温度25-45℃的适当范围，进行1～10日的培养时，可以得到所希望的效果。作为处理转化株产生酶的具体形式，可举出从该转化株的培养液、菌体、菌体处理物、由菌体提取出来的酶、固定化菌体等。
作为菌体，可以使用培养终了后直接得到的培养液、从培养液分离出的菌体、洗涤后的菌体中的任何一种。作为菌体处理物除了冷冻干燥菌体、丙酮干燥菌体、与甲苯和界面活性剂接触了的菌体、用溶菌酶处理过的菌体、超声波处理过的菌体、机械地磨碎了的菌体等之外，还可以使用具有从这些菌体处理物中除去相当于D-N-氨基甲酰-α-氨基酸中的氨基甲酰基后，变换成D-α-氨基酸酶活性的酶提取液、进而使用这些菌体的固定化物、菌体处理物的不溶化物、向酶蛋白的固定化载体（例如，阴离子交换树脂）的固定化物等。此外，对于固定化方法，可参照如特开昭63-185382号说明书。
作为固定化所使用的载体合适的有Duolite A568或DS 17186（罗姆-哈斯社：注册商标）等的苯酚-甲醛阴离子交换树脂、Amberlite IRA 935、IRA 945、IRA 901（罗姆-哈斯社：注册商标）、Lewatatit OC 1037（拜耳社：注册商标）、Diaion EX-05（三菱化成工业：注册商标）等聚苯乙烯树脂类的各种胺和铵盐或具有二乙醇胺型官能团的各种阴离子交换树脂。其他，也可以使用DEAE-纤维素等载体。
进而，为了使酶的吸附更坚固和稳定，通常要使用交联剂，作为合适的例子可举出戊二醛。使用的酶，不仅是精制酶，还可使用部分精制酶、菌体破碎液、无细胞提取液等种种精制程度的酶。
固定化酶的制备，可以使用把酶吸附在酶液和载体上后，采用交联处理等的通常制备方法。
构成本发明酶反应基质的D-N-氨基甲酰-α-氨基酸，可用式：R-CH（NHCONH2）-COOH表示，但实际上供给反应的形式，在使用的酶对于D-N-氨基甲酰-α-氨基酸具有严格的立体选择性时，可以D-体或者D-体和L-体的混合物形式使用。另外，在酶与L-氨基甲酰氨基酸也作用，立体选择性不严格时和使用也作用于L-体的酶混合物时，考虑到了使生成的α-氨基酸为D-体，最好只使用D-体。
取代基R可按照在特公昭57-18793号说明书、特公昭63-20520号说明书、特公平1-48758号说明书等中所描述的那样可在广范围内选择，但是，作为医药中间体为了得到产业上有用的化合物，R是用苯基、羟基取代了的苯基、烷基、取代烷基、芳烷基或噻吩时比较好。用羟基取代苯基时，羟基可以是一个或多于一个，可在邻、间、对的任何位置上取代，但具有代表性的是对-羟基苯基。烷基中的碳数是1～4，对应的氨基酸是D-丙氨酸、D-缬氨酸、D-亮氨酸、D-异亮氨酸等的基。取代烷基是碳数1～4个的烷基被羟基、烷基硫代基、羧基、氨基、苯基、用羟基取代了的苯基、酰胺基等取代了的烷基，对应的氨基酸是D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-蛋氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-酪氨酸、D-色氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-组氨酸、D-赖氨酸、D-精氨酸、D-瓜氨酸等的基。芳烷基是碳数7～8的，例如，苄基、苯乙基、对应的氨基酸构成3D-苯基丙氨酸的基。
作为水性溶剂可使用含有水、缓冲剂、乙醇类有机溶剂的物质。进而，必要时，可向水性溶剂中加入微生物生长时所必要的营养素、抗氧化剂、表面活性剂、补助剂、羟胺、金属等。
在上述水溶性溶剂中一边培养上述微生物的菌体，一边使菌体和D-N-氨基甲酰-α-氨基酸接触，作用时，可以使用含有D-N-氨基甲酰-α-氨基酸、而且是微生物生长时所必要的碳源、氮源、无机离子等营养素的水性溶剂。进而，若添加维生素、氨基酸等的有机微量营养素时，还可以得到更好的结果。作为碳源，可适宜地使用葡萄糖、蔗糖等类的碳水化合物、醋酸类的有机酸、醇类等。作为氮源可以使用氮气、氨水、铵盐等。作为无机离子可使用磷酸离子、镁离子、钾离子、铁离子等。
培养是在好气的条件下，pH为4～8，温度控制在25～45℃的适当范围内进行。若进行1～10日的培养时，可高效地把D-N-氨基甲酰-α-氨基酸只是变换成D-α-氨基酸。
对此，将上述微生物的培养液直接与培养菌体、菌体处理物、酶提取液、菌体的固定化物、菌体的不溶物或者酶蛋白质固定物在溶解或悬浮了D-N-氨基甲酰-α-氨基酸的水性溶剂中进行反应时，可调节在10～80℃的适当温度下，PH保持在4～9.5，可用暂时静置或搅拌下来完成。这样，经过5～100小时后，在水性溶剂中生成了大量的D-α-氨基酸，并且积累下来。另外，随着反应的进行也可以分批地加入D-N-氨基甲酰-α-氨基酸。生成的D-α-氨基酸可用常规的方法分离、精制。
此外，这里生成的D-α-氨基酸可用式：
R-CHNH2-COOH
表示（R与前定义相同）。
以下表示本发明具体的实施状态。再者，生成的D-α-氨基酸可通过高效液相色谱（HPLC）或薄层色谱（TLC）检出、定量。
实施例1
放射土壤杆菌-KNK712株脱
氨基甲酰酶基因的羟胺的突变处理
用限制酶HindⅢ及EcoRI酶切具有KNK712株脱氨基甲酰酶基因的PAD108并与用HindⅢ及EcoRI酶切的M13mp18的双链DNA的物质混合，进行连接。通过这种连接物，转化E.coli JM 109，与分别添加了40μl 100mM异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃甙（IPTG）及0.25%5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖甙（X-Gal）的2ml的H上层琼脂培养基（10g/lバクト胰蛋白栋、8g/l Nacl、g/lバクト琼脂）混合后，在H琼脂培养基（10g/lバクト胰蛋白栋、8g/l Nacl、12g/lバクト琼脂）上散布、在37℃下培养后，分离出白色斑点。将此重组噬菌体在100ml的2YT培养基（16g/lバクト胰蛋白栋、10g/lバクト酵母浸出液、5g/l Nacl）上培养，在其上清液中添加5分之1量的PEG-NaCl（20%聚乙二醇6000、2.5M NaCl）溶液，使噬菌体沉淀、离心分离。将此重组噬菌体在经浓度0.25M NH2OH（PH6.0）中、37℃下处理1～8小时，用PEG-Nacl溶液沉淀噬菌体粒子后，溶解在无菌水中后，感染E.coli JM109，在800ml的2YT培养基上培养，用碱-SDS法及CsCl超离心法制备双链的变异导入DNA。将此用HindⅢ及EcoRI酶切断后，插入的pUC19中，转化入E.Coli JM109，散布在含有50μg/ml的安替比啉的2YT琼脂培养基上，得到具有突变脱氨基甲酰酶基因的E·Coli重组株约15000株。
实施例2
放射土壤杆菌-KNK712株
脱氨基甲酰酶基因的亚硝酸诱变处理
将引入实施例1制备的M13mp18的KNK712株脱氨基甲酰酶基因的噬菌体用800ml的2YT培养基培养制备后，通过苯酚抽提及乙醇沉淀而得到单链的噬菌体DNA。此单链DNA用最终浓度0.9M NaNO2（PH4.3），在25℃下处理30分钟，诱变基因，将此用ミ-クエネ-スRver.2.0（UnitedStates Biochemic al社制）及AMV逆转录酶（Life Science社制）双链化。用限制酶HindⅢ及EcoRI酶切后，引入到pUC19中，转入E·coli JM109中，散布在2YT平板培养基上（含有安替比啉），得到具有突变脱氨基甲酰酶基因的E·Coli重组株约7600株。
实施例3
耐热性提高了的脱氨基甲酰酶生产株的筛选
将具有突变脱氨基甲酰基因的E·Coli重组体的平板培养基上的菌落复制在滤纸（东洋滤纸、5C、φ83mm）上，浸渍在1.5ml的溶菌液（20mM Tris·HCl（PH7.5）、10mM EDTA、2mg/ml溶菌酶、1%TritonX-100），在37℃、反应30分钟后，水洗、干燥。将此滤纸，通过在65℃的温水中，浸渍5分钟，热处理、干燥后，浸入1ml的显色反应液（30mMK-磷酸缓冲液（PH7.4）、0.3%氨基甲酰-D-苯基甘氨酸、0.25%苯酚、10mg/mlD-氨基酸氧化酶（西格玛社制）、2.36μg/ml过氧化酶（来自西洋山葵、GAL2YME Lab社制）、0.1mg/ml4-氨基安替比啉），在37℃下反应30分钟。把对应于显出红色点的菌落，作为耐热性提高株，从原来的平板培养基中分离出来。
这样就从实施例1中的用羟胺进行诱变了的27000株得到12株、从实施例2中的用亚硝酸进行诱变了的7600株中得到了7株耐热性提高了的菌株。
实施例4
耐热性提高了的脱氨基甲酰酶的耐热性评价
将实施例3得到的耐热性提高了的脱氨基甲酰酶的生产株4株（羟胺诱变株3株、亚硝酸诱变株1株）及具有KNK712株脱氨基甲酰酶基因的重组E·coli JM 109 pAD 108（FERM Bp-3184），分别在10ml的2YT液体培养基（含有50μg/ml安替比啉及1mM IPTG）中，振动培养一夜。集菌后，用0.1MK-磷酸缓冲液（pH7.0）洗涤、悬浮在1ml的同样缓冲液中后，用超声波破碎机（富-精工、UR-20P型）破碎、离心分离后，除去残渣。将此粗酶液的一部分在55℃、60℃、65℃、70℃及75℃等的温度下热处理10分钟，用离心分离、热变性后除去不溶蛋白接着，测定此热处理前后的脱氨基甲酰酶活性，测定是以1%的氨基甲酰-D-羟基-苯基甘氨酸为基质，在0.1MK-磷酸缓冲液（pH7.0）中、40℃下反应20分钟，用5%TCA使蛋白变性、除去后，用高效液相色谱对生成的D-羟基苯基甘氨酸的量进行定量。结果表示在图1中。
实施例5
耐热性提高了的脱氨基甲酰酶的基因解析
对耐热性提高了的突变脱氨基甲酰酶进行基因解析，推定脱氨基甲酰酶蛋白的突变部位。将具有耐热性提高了的脱氨基甲酰酶基因的质粒，使用Taq Dye DeoxyTMTerminater Cycle シ-ケンシンゲ.キシト（应用·生物系统社）、在程序保温箱中（ァステツク社、PC-700型）反应后，使用生物·旋转机30（バイオラツド社）除去过剩的Dye Deoxy。对此试样用373A型DNA测序仪（应用·生物系统社）进行脉冲及数据解析。其结果，如表1所示，判明了突变部位、耐热性提高均是由于1处氨基酸突变而导致的。
表1
实施例6
将耐热性提高了的脱氨基甲酰酶向树脂上固定
将耐热性提高了的脱氨基甲酰酶生产株4株及具有KNK712株脱氨基甲酰酶基因的重组E·coli JM109 pAD108（FERM Bp-3184）分别在1升的2YT培养基（含有50μg/ml安替比啉、1mM IPTG）中，振动培养一夜。集菌后，用0.1M K-磷酸缓冲液（pH7.0）洗净菌后，悬浮在100ml该缓冲液中，用超声波破碎机（BRANSON社制、Sonifier 250型）破碎，用离心分离除去残渣，作为粗酶液。向其中加入用0.1MK-磷酸缓冲液（pH7.0）平衡了的Duolite A-568（罗姆-哈斯社），其量相对于40mg蛋白加入1g树脂，在氮密封下、4℃条件下，搅拌20小时，使其吸附。把此吸附树脂用0.1MK-磷酸缓冲液（pH7.0）及10mM二硫苏糖醇（DTT）洗涤后，在0.2%戊二醛、0.1MK-磷酸缓冲液（PH7.0）中，4℃下反应10分钟，交联蛋白，制成固定化树脂，在表2中表示了得到的树脂活性。
表2
实施例7
使用固定化脱氨基甲酰酶的重复连续反应
使用实施例6得到的固定化树脂，通过重复连续化反应进行耐热化突变脱氨基甲酰酶的评价。使用50单位的固定化脱氨基甲酰酶，以3%氨基甲酰-D-HPG为基质，在氮气下，一边搅拌，一边在40℃下调整pH为7.0使之进行反应（100ml反应液）。10分钟及60分钟后，取出测定活性用试样，合计进行23.5小时反应。吸滤除去反应液后，加入同样的反应液使之反应，这种操作进行15次，检查固定脱氨基甲酰酶活性的推移。此结果如图2所示，耐热性提高了的脱氨基甲酰酶，以固定化树脂用于反应时的稳定性，与突变前相比，均得到改良。
实施例8
参与耐热性部位的氨基酸置换
对于已判明参与耐热性的3个位置，即，57位氨基酸的组氨酸部分、203位氨基酸的脯氨酸部分及236位的缬氨酸部分，把它们分别制成置换为各种氨基酸的衍生物。这些衍生物的制作利用了多聚酶链反应（PCR）方法（伊藤等（I to，W，et al.）Gene 102，67-70（1991））来进行的。对于每个耐热化部位，对应于该部位氨基酸基因两侧分别具有互补链基因约10个碱基，对应于置换氨基酸的3个碱基部分分别具有A、T、G、C的所有的组分，使用使得置换后所有的氨基酸都进入该部位的A、T、G、C的混合液，用391型DNA合成仪（应用、生物系统社制）制作合成的DNA引物。以pAD108作为模板，使用此引物和M13RV引物（宝酒造制），用PC-700型程序恒温箱（ァステツク社制）进行PCR反应。另外，含有少量脱氨基甲酰酶基因片段全长（1785碱基）和两侧的序列的HindⅢ切点突变后不能切断的DNA片段可使用PAD108和MUTF3引物及M13M4引物（均为宝酒造制），通过PCR反应制作。混合这2种PCR产物、在94℃、加热10分钟后，通过缓慢降温，制作此2种DNA的连接物，使用Taq DNA多聚酶，将单链DNA部分作成双链。使用此DNA和M13M 4及M13RV的两引物进行PCR反应，用HindⅢ、EcoRI同时酶切，与同样酶切的PUC19连接，转化E.coli。用实施例3方法只是筛选出了耐热性提高了的菌株，如表3及表4所示那样，57位组氨酸置换为亮氨酸衍生物、203位脯氨酸分别置换成天冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸、丙氨酸、异亮氨酸或组氨酸的衍生物、236位的缬氨酸分别置换成苏氨酸或丝氨酸的衍生物，其耐热性得到了提高。
表3
表4
实施例9
参与耐热性部位的多重突变
对于判明参与耐热性的三个位置，即57位氨基酸组氨酸、203位氨基酸的脯氨酸及236位氨基酸的缬氨酸，按以下方法将判明为耐热化氨基酸突变成以下的2个或3个突变组合衍生物（多重突变体）。
通过将实施例3及实施例8得到的含有单一氨基酸置换的耐热化突变脱氨基甲酰酶基因部位的限制酶酶切DNA片段与天然型基因的无突变DNA片段进行交换来制备多重突变体。首先，对于pAD108及PAD402等，由于其各存在用于上述DNA片段交换的SalI及SphI的二处切点，所以有必要使之成为单一切点。因此，作为新基因导入用载体，制作pKK NE，向其插入脱氨基甲酰酶基因片段后，构建可能交换DNA片段的表达载体。
pKK NE的制备，按以下进行。用EcoRI及Ndel酶切如图3所示的pKK233-2（ファルマシァ社制），用琼脂糖凝胶电泳，分离出2.7Kb的DNA片段后，使用DNAブランテイングキシキ试剂盒（宝酒造制），将其DNA片段的粘性末端弄成平末端，连接后，转化大肠菌JM109。
使用PCR法，将这样制作的载体的NcoI切点变成NdeI切点质粒，将其用HindIII酶切，粘性末端钝化后，和PEcoRIリンヵ-（宝酒造制）连接，得到图3所示的pKK NE。接着，用PCR法将NdeI切点导入pAD108及pAD402的脱氨基甲酰酶基因的起始密码子部分，分别制作了将由此得到的NdeI-EcoRI1.6Kb DNA片段导入pKK NE表达载体PAD1086（来自pAD108，图4所示）及pAD4021（来自PAD402、图5所示）。
57位的氨基酸突变存在于NdeI-SacI的约190bp DNA片段上、203位的氨基酸突变存在于SalI-ClaI的约170bp DNA片段上（以后，将此DNA片段称为片段A）、236位的氨基酸突变存在于ClaI-SphI的约75bp DNA片段上，（以后称为片段B）。因此，除去pAD4021的片段A，通过向其插入pAD404及pAD406的该片段，分别制作PAD421、pAD422。另外，通过将PAD1086、PAD4021、pAD421及PAD422的片段B与PAD416的该片段交换、分别制作PAD4161、PAD423、PAD426及PAD427，进而，通过PAD4161的片段A与PAD404、PAD406及PAD429的该片段的交换分别制作PAD424、PAD425及PAD461，通过PAD402及PAD423的A片段与PAD429的该片段的交换，制作出PAD451及PAD455（图6所示），通过PAD402、PAD429（图6所示）、PAD451及PAD421的B片段与PAD447的该片段交换，分别制作出PAD452、PAD453、PAD454。
将以上制作的表达载体分别转化入大肠杆菌JM109，制备这些菌体的破碎提取液，检查其耐热性。
如图5及图6所示，对于多重突变体，对应于每个单一突变体的耐热程度，可以相加地提高其耐热性，对于耐热性最高的，由大肠菌JM109 pAD455（FERM PB-4036）生产的脱氨基甲酰酶，比突变前的脱氨基甲酰酶，其耐热性提高约19℃。
表5
表6
实施例10
耐热性提高了的脱氨基甲酰酶的反应温度特性
将耐热性提高了的脱氨基甲酰酶产生株E·Coli JM 109 pAD108（FERM BP-3184）及E·coli JM 109 PAD455（FERM BP-4036）在10ml的2YT培养基中振荡培养一夜。集菌后，用0.1MK-磷酸缓冲液（pH7.0）洗涤菌体后，悬浮在1ml的该缓冲液中，用小型超声波破碎机（富-精工制、UR-20P型）破碎、用离心分离除去残渣，制成粗酶液。此粗酶液，用在该缓冲液中添加了5mM的二硫苏糖醇的液体稀释到10倍。将1ml的基质溶液（1%氨基甲酰-D-P-羟基苯基甘氨酸、0.1%K-磷酸缓冲液（PH6.5）在30℃～85℃下分别保温3分钟后，加入100μl的稀释粗酶液（在活性高的50～80℃（在E·coli JM109 pAD108的粗酶液中50-65℃）时，需进一步稀释2～3倍的酶液100μl），在各温度下反应20分钟。添加250μl的20%三氯醋酸溶液终止反应，离心后，上清液用高效液相色谱（ナヵライテヌク（株）、COSMOSIL 5C18-AR柱）分析。以在40℃的活性为100%，在第7图中表示了各温度下的相对活性。从图7可明显看出，由E·coli JM109 pAD455生产的酶，在75℃附近的活性最高、与由E·coli JM109 pAD108生产的酶相比较，酶的稳定性有很大的提高，改良成在高温下可进行反应的酶。
实施例11
耐热性提高了的脱氨基甲酰酶的pH稳定性
将耐热性提高了的脱氨基甲酰酶产生株E·Coli JM109 pAD416（FERM BP-3915）及E·Coli JM109 pAD455（FERM BP-4036）在10ml的2YT培养基中振荡培养一夜。集菌后，用10mMK-磷酸缓冲液（含有pH7.0、0.5mM二硫苏糖醇）洗涤菌体后，悬浮在1ml的该缓冲液中，用小型超声波破碎机破碎，用离心分离除去残渣，制得粗酶液。各PH的缓冲液都是用0.1M的K-磷酸缓冲液（PH5.5、6、7、8）、Tris·HCl缓冲液（PH7.5、8、9）及碳酸钠缓冲液（PH9、10、11）制作的，向800μl的这些缓冲液中分别加入200μl的上述粗酶液，在40℃下，保温12.5小时。而且，将其100μl加到1ml的基质溶液中（1%氨基甲酰-D-P-羟基苯基甘氨酸、0.1%K-磷酸缓冲液（PH7.0）、在40℃下反应，用与实施例10同样方法进行分析。以PH7.0的活性为100%，在图8中表示了各PH下处理试样的相对活性。
实施例12
耐热性提高了的脱氨基甲酰酶的表达载体的制备和表达。
（1）表达外源基因的载体的制备
最初制备插入耐热性提高了的脱氨基甲酰酶基因的表达载体（图9）。首先，使用PCR法从PUC19制作1.3Kb的HindⅢ、Cfr10I片段，但此时，作为PCR用引物，是在HindⅢ切点的内侧的1acZ基因的起始密码子部位形成NdeI切点，进而，设计用HindⅢ、Cfr101I可酶切的序列，并将此用于反应。用此PCR得到的片段，用HindⅢ、Cfr10I酶切后，通过与从PUC19除去对应的1.3Kb片段的1.4Kb片段连接，在PUC19上加入1个NdeI切点制成质粒PUC·Nde。接着，由PTrc99A（由ファルマシァ市售），同样使用PCR法，制备0.6Kb的EcoRI、EcoRV片段，但此时作为PCR用引物，EcoRI切点的内侧的NcoI切点变成了NdeI切点，进而设计可用EcoRI、EcoRV酶切的序列，并将此用于反应。将用此PCR得到的片段，用EcoRI、EcoRV酶切后，与从PTrc 99A除去对应的0.6Kb片段的3.6Kb片段连接，在PTrc 99A上加入一个NdeI切点制成质粒PTrc Nde。而且通过连接用NdeI、SspI酶切PUC Nde的2.0Kb片段和用NdeI、SspI酶切Trc Nde的0.6Kb片段，制作外源基因表达用载体质粒（图10）。
（2）耐热性提高了的脱氨基甲酰酶的基因向载体的引入
对于具有耐热性提高了的脱氨基甲酰酶的基因的AD455，使用PCR法，制作只是编码脱氨基甲酰酶基因部分，但此时作为引物，设计为基因起始密码子部分形成NdeI切点、基因的终止密码子后紧接可以形成PstI切点的序列，并将共用于反应。用此PCR得到的0.9Kb的DNA片段以NdeI、PstI酶切，与同样用NdeI、PstI酶切的PUCNT连接，制作出耐热性提高了的脱氨基甲酰酶的表达载体质粒NT4553（图10）。
（3）耐热性提高了的脱氨基甲酰酶的表达载体的表达
将上述制作的PNT4553用氯化钙法形质转化大肠杆菌（Escherichia Coli）HB101。而且将此形质转化株E·coli HB101 pNT 4553（FERM）BP-4368）在2YT培养基上，在37℃下培养振荡16小时，用集菌后实施例10所示的方法制备粗酶液、测定脱氨基甲酰酶活性，每份培养液显示5.6单位/ml的活性。
按照本发明，可以得到编码耐热性提高了的脱氨基甲酰酶蛋白的DNA片段，由此可制备出对于D-N-氨基甲酰-α-氨基酸的反应性高、且稳定性优良的脱氨基甲酰酶，使用此酶可以高效地生产出D-α-氨基酸。
序列表
序列号：1
序列长：1785
序列类型：核酸
链数：双链
拓扑结构：直链状
序列的种类：Genomic DNA
起源
生物名：放射土壤杆菌
株名：KNK712（FERM BP-1900）
序列号：2
序列的长度：1785
序列类型：核酸
链数：双链
拓扑结构：直链状
序列的种类：Genomic DNA
起源
生物名：大肠杆菌
株名：JM109 pAD402（FERM BP-3912）
序列号：3
序列的长度：1785
序列类型：核酸
链数：双链
拓扑结构：直链状
序列的种类：Genomic DNA
起源
生物名：大肠杆菌
株名：JM109 pAD404（FERM BP-3913）
序列号：4
序列的长度：1785
序列类型：核酸
链数：双链
拓扑结构：直链状
序列的种类：Genomic DNA
起源
生物名：大肠杆菌
株名：JM109 pAD406（FERM BP-3914）
序列号：5
序列的长度：1785
序列类型：核酸
链数：双链
拓扑结构：直链状
序列的种类：Genomic DNA
起源
生物名：大肠杆菌
株名：JM109 pAD416（FERM BP-3915）
序列号：6
序列的长度：1785
序列类型：核酸
链数：双链
拓扑结构：直链状
序列的种类：Genomic DNA
起源
生物名：大肠杆菌
株名：JM109 pAD428
序列号：7
序列的长度：1785
序列类型：核酸
链数：双链
拓扑结构：直链状
序列的种类：Genomic DNA
起源
生物名：大肠杆菌
株名：JM109 pAD429
序列号：8
序列的长度：1785
序列类型：核酸
链数：双链
拓扑结构：直链状
序列的种类：Genomic DNA
起源
生物名：大肠杆菌
株名：JM109 pAD431
序列号：9
序列的长度：1785
序列类型：核酸
链数：双链
拓扑结构：直链状
序列的种类：Genomic DNA
起源
生物名：大肠杆菌
株名：JM109 pAD434
序列号：10
序列的长度：1785
序列类型：核酸
链数：双链
拓扑结构：直链状
序列的种类：Genomic DNA
起源
生物名：大肠杆菌
株名：JM109 pAD435
序列号：11
序列长：1785
序列类型：核酸
链数：双链
拓扑结构：直链状
序列的种类：Genomic DNA
起源
生物名：大肠杆菌
株名：JM109 pAD439
序列号：12
序列长：1785
序列类型：核酸
链数：双链
拓扑结构：直链状
序列的种类：Genomic DNA
起源
生物名：大肠杆菌
株名：JM109 pAD441
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序列类型：核酸
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起源
生物名：大肠杆菌
株名：JM109 pAD445
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起源
生物名：大肠杆菌
株名：JM109 pAD447
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生物名：大肠杆菌
株名：JM109 pAD448
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起源
生物名：大肠杆菌
株名：JM109 pAD450
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生物名：大肠杆菌
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生物名：大肠杆菌
株名：JM109 pAD422
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生物名：大肠杆菌
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生物名：大肠杆菌
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生物名：大肠杆菌
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生物名：大肠杆菌
株名：JM109 pAD426
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生物名：大肠杆菌
株名：JM109 pAD427
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生物名：大肠杆菌
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生物名：大肠杆菌
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生物名：大肠杆菌
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生物名：大肠杆菌
株名：JM109 pAD461
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生物名：大肠杆菌
株名：JM109 pAD454
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起源
生物名：大肠杆菌
株名：JM109 pAD455（FERM BP-4036）
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起源
生物名：大肠杆菌
株名：JM109 pAD456
序列号：31
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起源
生物名：大肠杆菌
株名：JM109 pAD468
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起源
生物名：大肠杆菌
株名：JM109 pAD469
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起源
生物名：大肠杆菌
株名：JM109 pAD470
序列号：34
序列长：926
序列类型：核酸
链数：双链
拓扑结构：直链状
序列的种类：Genomic DNA
起源
生物名：大肠杆菌
株名：HB101 pNT4553（FERM BP-4368）
Claims (52)
1、编码耐热性提高了的脱氨基甲酰酶蛋白的DNA片段的制备方法，其特征是诱变处理编码来自微生物的酶(以下称脱氨基甲酰酶)蛋白的DNA片段，该酶可除去N-氨基甲酰-D-α-氨基酸的基甲酰基变换成对应的-D-α-氨基酸。
2、根据权利要求1记载的制备方法，在单链状态下诱变处理编码来自微生物的脱氨基甲酰酶蛋白的DNA片段。
3、根据权利要求1或2记载的制备方法，诱变处理时的诱变异部位是随机诱变。
4、根据权利要求3记载的制备方法，其中的随机诱变是化学诱变。
5、根据权利要求2～4中记载的任何之一的方法，其中是把编码来自微生物的脱氨基甲酰酶蛋白的DNA片段引入到噬菌体，制成单链状态进行诱变处理。
6、根据权利要求2～5记载的任何之一的制备方法，其中单链的DNA片段是含有对应于脱氨基甲酰酶蛋白的氨基酸序列密码子的DNA链。
7、根据权利要求2～5记载的任何一个制备方法，其中单链的DNA片段是含有对应于脱氨基甲酰酶蛋白的氨基酸序列密码的DNA互补链。
8、根据权利要求5记载的制备方法，其中用羟胺进行诱变处理。
9、根据权利要求5记载的制备方法，其中用亚硝酸进行诱变处理。
10、根据权利要求1～9中任何之一的制备方法，其中的微生物是放射土壤杆菌-KNK712（FERM BP-1900）。
11、根据权利要求1或2记载的制备方法，其中诱变处理的诱变部位是定点诱变。
12、根据权利要求11记载的方法，其中定点诱变是使用了多聚酶链反应（PCR反应）。
13、根据权利要求11或12记载的制备方法，其中的微生物是放射土壤杆菌-KNK712（FERM BP-1900）。
14、耐热性提高了的脱氨基甲酰酶的制备方法，其特征是培养用含有用DNA片段重组质粒转化的微生物，该DNA片段编码用权利要求1记载的方法制备的耐热性提高了的脱氨基甲酰酶蛋白。
15、根据权利要求14记载的方法，其中来自微生物的脱氨基甲酰酶的耐热温度是63℃以下，耐热性提高了的脱氨基甲酰酶的耐热温度是65℃以上。
16、根据权利要求14记载的方法，其中使用了耐热性的耐热温度提高了2℃以上的脱氨基甲酰酶。
17、根据权利要求14记载的方法，其中耐热性提高了的脱氨基甲酰酶是来自放射土壤杆菌-KNK712（FERM BP-1900）的脱氨基甲酰酶的57位组氨酸、203位的脯氨酸或者236位的缬氨酸之中的至少一个氨基酸被其他氨基酸置换的脱氨基甲酰酶。
18、根据权利要求17记载的制备方法，其中的其他氨基酸，对于57位组氨酸是指酪氨酸或亮氨酸、对于203位的脯氨酸是指亮氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、组氨酸或者苏氨酸、对于236位的缬氨酸是指丙氨酸、苏氨酸或者丝氨酸。
19、权利要求14～18记载的任何一种制备方法，其中的转化微生物是大肠杆菌（E·Coli）（Escheri chia coli）JM109 pAD402（FERM BP-3912）、E·Coli JM109 PAD4
04（FERM BP-3913）、E·Coli JM109 pAD406（FERM BP-3914）、E·Coli JM109 pAD416（FERM BP-3915）、E·Coli JM109 pAD428、E·Coli JM109 pAD429（FERM BP-4035）、E·Coli JM109 pAD431、E·Coli JM109 pAD434、E·Coli JM109 pAD435、E·Coli JM109 pAD439、E·Coli JM109 pAD441、E·Coli JM109 pAD445、E·Coli JM109 pAD447、E·Coli JM109 pAD448、E·Coli JM109 pAD450、E·Coli JM109 pAD421、E·Coli JM109 pAD422、E·Coli JM109 pAD423、E·Coli JM109 pAD424（FERM BP-4034）、E·Coli JM109 pAD425、E·Coli JM109 pAD426、E·Coli JM109 pAD427、E·Coli JM109 pAD451、E·Coli JM109 pAD452、E·ColiJM109 pAD453、E·Coli JM109 pAD461、E·Coli JM109 pAD454、E·Coli JM109 pAD455（FERM BP-4036）、E·Coli JM109 pAD456、E·Coli JM109 pAD468、E·Coli JM109 pAD469、E·Coli JM109 pAD470或E·Coli HB101 pNT4553（FERM BP-4368）。
20、D-α-氨基酸的制备方法，其特征是将N-氨基甲酰-D-α-氨基酸在水性溶剂中，通过耐热温度65℃以上的脱氨基甲酰酶的作用变换成D-α-氨基酸，再收集生成的D-α-氨基酸。
21、根据权利要求20记载的方法，其中是在固定化脱氨基甲酰酶后，使其发挥作用。
22、根据权利要求21记载的方法，其中是反复使用固定化脱氨基甲酰酶。
23、根据权利要求20记载的方法，其中耐热温度65℃以上的脱氨基甲酰酶是来自放射土壤杆菌-KNK712（FERM BP-1900）的57位的组氨酸、203位的脯氨酸或236位的缬氨酸中的至少一个氨基酸被其他氨基酸置换的脱氨基甲酰酶。
24、根据权利要求23的制备方法，其他的氨基酸，对于57位组氨酸是指酪氨酸或亮氨酸、对于203位的脯氨酸是指亮氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、组氨酸或苏氨酸、对于236位的缬氨酸是指丙氨酸、苏氨酸或丝氨酸。
25、根据权利要求20～23记载的任何一种制备方法，其中耐热温度65℃以上的脱氨基甲酰酶是由以下的转化微生物生产的，即转化微生物的大肠杆菌（E·Coli）JM109 PAD402（FERM BP-3912、
E·Coli JM109 pAD404（FERM BP-3913）、E·Coli JM109 pAD406（FERM BP-3914）、E·Coli JM109 pAD416（FERM BP-3915）、E·Coli JM109 pAD428、E·Coli JM109 pAD429（FERM BP-4035）、E·Coli JM109 pAD431、E·Coli JM109 pAD434、E·Coli JM109 pAD435、E·Coli JM109 pAD439、E·Coli JM109 pAD441、E·Coli JM109 pAD445、E·Coli JM109 pAD447、E·Coli JM109 pAD448、E·Coli JM109 pAD450、E·Coli JM109 pAD421、E·Coli JM109 pAD422、E·Coli JM109 pAD423、E·Coli JM109 pAD424（FERM BP-4034）、E·Coli JM109 pAD425、E·Coli JM109 pAD426、E·Coli JM109 pAD427、E·Coli JM109 pAD451、E·Coli JM109 pAD452、E·Coli JM109 pAD453、E·Coli JM109 pAD461、E·Coli JM109 pAD454、E·Coli JM109 pAD455（FERM BP-4036）、E·Coli JM109 pAD456、E·Coli JM109 pAD468、E·Coli JM109 pAD469、E·Coli JM109 pAD470或者E·Coli HB101 pNT4553（FERM BP-4368）。
26、D-α-氨基酸的制备方法，其特征是将N-氨基甲酰-D-α-氨基酸，在水性溶剂中，通过耐热温度提高2℃以上的脱氨基甲酰酶的作用，转化成D-α-氨基酸，再收集生成的D-α-氨基酸。
27、脱氨基甲酰酶，其特征是耐热温度提高2℃以上。
28、脱氨基甲酰酶，其特征是耐热温度在65℃以下的脱氨基甲酰酶中的至少一个氨基酸被其他的氨基酸置换，成为耐热温度为65℃以上的酶。
29、根据权利要求28记载的脱氨基甲酰酶，其中被置换了的氨基酸是1～3个。
30、脱氨基甲酰酶，其中来自放射土壤杆菌-KNK712（FERM BP-1900）的脱氨基甲酰酶的57位组氨酸、203位的脯氨酸或236位的缬氨酸中的至少一个氨基酸被其他的氨基酸置换。
31、根据权利要求30记载的脱氨基甲酰酶，其中至少57位的组氨酸被其他的氨基酸置换。
32、根据权利要求31记载的脱氨基甲酰酶，其中的其他氨基酸是酪氨酸、亮氨酸。
33、根据权利要求30记载的脱氨基甲酰酶，其中至少203位的脯氨酸被其他的氨基酸置换。
34、根据权利要求33记载的脱氨基甲酰酶，其他的氨基酸是亮氨酸、谷氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、异亮氨酸或者组氨酸。
35、根据权利要求30记载的脱氨基甲酰酶，其中至少236位的缬氨酸被其他的氨基酸置换。
36、根据权利要求35记载的脱氨基甲酰酶，其中其他的氨基酸是丙氨酸、苏氨酸或丝氨酸。
37、脱氨基甲酰酶，其具有记载在序列表中序列号2～34的氨基酸序列。
38、编码耐热性提高了的脱氨基甲酰酶蛋白的DNA片段，其中是通过编码来自微生物的脱氨基甲酰醇蛋白DNA片段的至少1个碱基被其他碱基置换，对应的氨基酸至少1个可被置换。
39、根据权利要求38记载的DNA片段，其中是在编码来自放射土壤杆菌-KNK712（FERM BP-1900）的脱氨基甲酰酶蛋白的DNA片段中，构造编码对应于该脱氨基甲酰酶57位氨基酸的组氨酸、20位氨基酸的脯氨酸或236位缬氨酸密码子的碱基的至少1个被其他碱基置换，该氨基酸的至少1个被其他氨基酸置换后，耐热性提高了的脱氨基甲酰酶蛋白的DNA片段。
40、根据权利要求39记载的DNA片段，其中，编码氨基酸57位组氨酸的碱基序列的胞嘧啶、腺嘌呤及胸腺嘧啶（CAT）中的至少一个被其他的碱基置换，该组氨酸被酪氨酸或亮氨酸置换后的编码脱氨基甲酰酶蛋白的DNA片段。
41、根据权利要求39记载的DNA片段，其中编码氨基酸203位的脯氨酸的碱基序列的胞嘧啶、胞嘧啶及胸腺嘧啶（CCT）中的至少一个被其他的碱基置换，该脯氨酸被丝氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸、丙氨酸、异亮氨酸或组氨酸置换后的编码脱氨基甲酰酶蛋白的DNA片段。
42、根据权利要求39记载的DNA片段，其中编码氨基酸236位的缬氨酸的碱基序列的鸟嘌呤、胸腺嘧啶、及鸟嘌呤中的至少一个被其他的碱基置换，该缬氨酸被丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸置换了的编码脱氨基甲酰酶蛋白的DNA片段。
43、根据权利要求40记载的DNA片段，其中，权利要求40的碱基序列CAT是被TAT、CTT或CTA置换了的。
44、权利要求41记载的DNA片段，其中权利要求41的碱基序列CCT是被TCT、CTT、AAC、GAA、ACC、GCT、ATT或CAT置换的。
45、根据权利要求42记载的DNA片段，其中权利要求42的碱基序列是由GCG、GCT、ACC、ACG、TCA、TCG或AGT置换的。
46、序列表中序列号2～16、24～26、28及33记载的DNA片段的233～1141位的碱基序列及序列号17-23、2729及34中记载的DNA片段7～915位的碱基序列。
47、含有权利要求38～45记载的DNA片段的表达载体。
48、用权利要求47记载的表达载体转化了的微生物。
49、表达载体，它们是：
pAD402、pAD404、pAD406、pAD416、pAD428、pAD429、pAD431、pAD434、pAD435、pAD439、pAD441、pAD445、pAD447、pAD448、pAD450、pAD421、pAD422、pAD423、pAD424、pAD425、pAD426、pAD427、pAD451、pAD452、pAD453、pAD461、pAD454、pAD455、pAD456、pAD468、pAD469、pAD470 pNT4553
50、转化微生物，是E.coli JM109 pAD402（FERM BP-3912）、E.Coli JM109 pAD404（FERM BP-3913）、E.Coli JM109 pAD406（FERM BP-3914）、E.Coli JM109 pAD416（FERM BP-3915）、E.Coli JM109 pAD428、E.Coli JM109 pAD429（FERM BP-4035）、E.Coli JM109 pAD431、E.Coli JM109 pAD434、E.ColiJM109 pAD435、E.Coli JM109 pAD439、E·Coli JM109 pAD441、E·Coli JM109 pAD445、E·Coli JM109 pAD447、E·Coli JM109 pAD448、E·Coli JM109 pAD450、E·Coli JM109 pAD421、E·Coli JM109 pAD422、E·Coli JM109 pAD423、E·Coli JM109 pAD424（FERM BP-4034）、E·Coli JM109 pAD425、E·Coli JM109 pAD426、E·Coli JM109 pAD427、E·Coli JM109 pAD451、E·Coli JM109 pAD452、E·Coli JM109 pAD453、E·Coli JM109 pAD461、E·Coli JM109 pAD454、E·Coli JM109 pAD455（FERM BP-4036）、E·Coli JM109 pAD456、E·Coli JM109 pAD468、E·Coli JM109 pAD469、E·Coli JM109 pAD470或E·Coli HB101 pNT4553（FERM BP-4368）。
51、将有关脱氨基甲酰酶的耐热性的氨基酸的突变数增加1个以上的方法，其特征是
1）通过反复使用权利要求1的方法，对于多个氨基酸部位，各个部位的一个氨基酸接受突变得到含有编码耐热性提高了的脱氨基甲酰酶的DNA片段或含有此片段的载体，
2）对于含有编码参与耐热性的每个氨基酸的DNA部分，找出可切出每个DNA片段的限制酶，
3）从含1）的DNA片段或含有此片段的载体，使用2）的限制酶切出含有编码1个突变氨基酸部位的DNA部分的DNA片段，
4）.使用同样的限制酶，把氨基酸还未变异的对应的DNA片段，从含有编码脱氨基甲酰酶DNA片段或含有此片段的载体中切出，
5）.在4）切出对应的DNA片段而剩下的DNA片段或含有此片段的载体中，插入在3）切出的DNA片段，
6）.3）～5）的操作，必要时可反复进行。
52、表达外源基因的载体质粒pUONT。
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