JP5936545B2 - グルタミン酸に高活性を示す新規アミノ基転移酵素、およびこれをコードする遺伝子、ならびにこれらの利用法 - Google Patents
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Description
(1)作用:アミノ基供与体の存在下で1−ベンジル−3−ピロリジノンに作用して光学純度93%e.e.以上の(S)−1−ベンジル−3−アミノピロリジンを生成するアミノ基転移反応を触媒する。
(a)アミノ基供与体:(S)−1−フェネチルアミンに対し活性を示し、L−アラニンよりL−グルタミン酸に高い活性を示し、かつ、β−アラニン、4−アミノ酪酸に対し実質的に活性を示さない。
(4)至適温度:30〜50℃、
(5)熱安定性:pH8.0、30〜50℃で30分間処理したとき、処理前の全活性の70%以上の残存活性を保持する。
本発明のポリペプチドは、以下の理化学的性質を有するポリペプチドである
(1)作用:アミノ基供与体の存在下で1−ベンジル−3−ピロリジノンに作用して光学純度93%e.e.以上の(S)−1−ベンジル−3−アミノピロリジンを生成するアミノ基転移反応を触媒する。
(a)アミノ基供与体:(S)−1−フェネチルアミンに対し活性を示し、L−アラニンよりL−グルタミン酸に高い活性を示し、かつ、β−アラニン、4−アミノ酪酸に対し実質的に活性を示さない。
(4)至適温度:30〜50℃、
(5)熱安定性:pH8.0、30〜50℃で30分間処理したとき、処理前の全活性の70%以上の残存活性を保持する。
本発明のポリペプチドは、(S)−1−フェネチルアミンに対し活性を示す。ここで、活性を示すとは、以下の方法でアミノ基転移活性を測定した場合において、1分間に生成するアセトフェノンの量が粗精製ポリペプチド液1mlに対し0.01μmol以上、好ましくは0.1μmol以上、より好ましくは1μmol以上であることを意味する。
[基質溶液組成]
(S)−1−フェネチルアミン 25mM
2−ケトグルタル酸 25mM
ピリドキサルリン酸 2.5mM
トリス・塩酸緩衝液(pH8.0) 0.1M
カラム:Cosmosil 5C8−MS (ナカライテスク社製)
溶離液:蒸留水2000mL/アセトニトリル500mL/メタノール500ml/KH2PO4 6.1g/H3PO4 2.5g
流速:1mL/分
検出:254nm
カラム温度:30℃
本発明のポリペプチドは、β−アラニン、4−アミノ酪酸、5−アミノ吉草酸、6−アミノカプロン酸、±2,4−ジアミノ酪酸、L−オルニチン、L−リジンおよびプレットシンをアミノ基供与体とした場合には、実質的に活性を示さない。ここで、実質的に活性を示さないとは、以下の方法によりアミノ基転移活性を測定した場合において、上記アミノ化合物をアミノ基供与体として用いた場合の活性が(S)−1−フェネチルアミンを用いた場合の1/100以下、好ましくは1/1000以下、更に好ましくは1/10000以下であることを意味する。
各種アミノ化合物 14mM
2−ケトグルタル酸 14mM
ピリドキサルリン酸 0.5mM
リン酸カリウム緩衝液(pH7.0) 0.1M
カラム:YMC−Pack Pro C18 RS(YMC社製)
溶離液:アセトニトリル/45mM酢酸緩衝液(pH4.1)=35/65(体積比)
流速:0.9mL/分
検出:254nm
カラム温度:30℃
本発明のポリペプチドは、2-ケトグルタル酸に代えて、ピルビン酸をアミノ基受容体としても活性を示し、ピルビン酸より2−ケトグルタル酸をアミノ基受容体として高い活性を示す。ピルビン酸より2−ケトグルタル酸をアミノ基受容体として高い活性を示すとは、前述の「活性測定法A」において、2-ケトグルタル酸に換えてピルビン酸をアミノ基受容体として測定した場合のアミノ基転移活性が、2−ケトグルタル酸をアミノ基受容体として測定した活性の1/2以下、望ましくは1/5以下の活性を示すことを言う。
本発明のポリペプチドは、L−アラニンよりL−グルタミン酸をアミノ基供与体として高い活性を示す。L−アラニンよりL−グルタミン酸をアミノ基供与体として高い活性を示すとは、以下の方法でアミノ基転移活性を測定した場合において、L−グルタミン酸をアミノ基供与体として測定した場合のアミノ基転移活性が、L−アラニンをアミノ基供与体として測定した活性の2倍以上、望ましくは5倍以上、より望ましくは10倍以上の活性を示すことを言う。
1−ベンジル−3−ピロリジノン 29mM
各種アミノ化合物 290mM
ピリドキサルリン酸 0.5mM
リン酸カリウム緩衝液(pH7.0) 0.1M
カラム:Finepak SIL C18−T (日本分光社製)
溶離液:蒸留水 945mL/アセトニトリル 555mL/KH2PO4 7.5g/SDS 2.16g(H3PO4でpH3.6に調製)
流速:1mL/分
検出:254nm
カラム温度:40℃
本発明のポリペプチドは、アミノ基供与体の存在下で1−ベンジル−3−ピロリジノンに作用して光学純度93%e.e.以上、好ましくは95%e.e.以上、より好ましくは97%e.e.以上、最も好ましくは98%e.e.以上の(S)−1−ベンジル−3−アミノピロリジンを生成するアミノ基転移反応を触媒する活性を示す。
1−ベンジル−3−ピロリジノン 57mM
(S)−1―フェネチルアミン 57mM
ピリドキサルリン酸 0.5mM
リン酸カリウム緩衝液(pH7.0) 0.1M
<定量分析>
カラム:Finepak SIL C18−T (日本分光株社製)
溶離液:蒸留水 945mL/アセトニトリル 555mL/KH2PO4 7.5g/SDS 2.16g(H3PO4でpH3.6に調製)
流速:1mL/分
検出:254nm
カラム温度:40℃
<光学純度分析>
反応液を適量の炭酸ナトリウムで塩基性にしたのち、ジニトロベンゾイルクロライドで誘導体化した後、以下の条件で分析する。
溶離液:ヘキサン/エタノール/ジエチルアミン/アセトニトリル=800/200/1/5(体積比)
流速:0.8mL/分
検出:254nm
カラム温度:30℃
アミノ基転移反応の至適pHは、前述の「活性測定法A」に記載の方法でアミノ基転移活性を、pH4.0〜10の範囲で測定することで決定することができる。ただし、上記測定方法において、測定を行うpHに応じて基質溶液における緩衝液は下記のものを用いる。至適pHとは上記測定にて最も高い活性値を示すpHとする。
pH6.0〜8.5 :0.1Mリン酸カリウム緩衝液
pH8.0〜9.0 :0.1Mトリス−塩酸緩衝液
pH9.0〜10 :0.1M炭酸ナトリウム緩衝液
アミノ基転移反応の至適温度は、前述の「活性測定法A」に記載の方法でアミノ基転移活性を、30〜70℃の範囲で測定し、最大の活性値を示した温度と定義する。
ポリペプチドの熱安定性は、0.5mMピリドキサルリン酸、0.1Mリン酸カリウム緩衝液(pH8.0)中、温度30〜70℃それぞれで30分間処理した後、前述の「活性測定法A」に記載の方法でアミノ基転移活性を測定し、熱処理前の活性を100%としたとき、熱処理後70%以上の残存活性を有する範囲とする。
ポリペプチドの分子量は、10%ポリアクリルアミドゲルを用いたドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において標準タンパク質の移動度との比較により算出する。
本発明の実施形態のポリペプチドは、上記性質を示すポリペプチドであれば、いかなるポリペプチドであっても含まれるが、例えば、アルスロバクター(Arthrobacter)属の微生物から取得できる。本発明の実施形態のポリペプチドの起源となる微生物としては、好ましくは当業者が公的保存機関(例えばNBRC等)より容易に入手可能なアルスロバクター・エスピー(Arthrobacter sp.)が挙げられ、さらに好ましくは、アルスロバクター・エスピー(Arthrobacter sp.)KNK04−25が挙げられる。この、アルスロバクター・エスピー(Arthrobacter sp.)KNK04−25は、2010年6月11日付けで、受託番号NITE P−954として、独立行政法人製品評価技術基盤機構、特許微生物寄託センター(〒292−0818日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8)に寄託され、その後、2011年9月12日付で、受託番号NITE BP−954として、NITE P−954より移管された。
本発明のポリペプチドを有する微生物のための培養培地としては、その微生物が増殖する限り、通常の炭素原、窒素原、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地が用いられ得る。
本発明の実施形態のポリペプチドを生産する微生物からの該ポリペプチドの精製は、当業者に周知のタンパク質精製法により行ない得る。例えば、当該微生物の培養液から遠心分離、あるいは、濾過により菌体を集め、得られた菌体を、超音波破砕機あるいはグラスビーズ等を用いた物理的手法で破砕した後、遠心分離にて菌体残さを除いて無細胞抽出液を調製し、この無細胞抽出液を、分別沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外濾過等に供することにより、ポリペプチドを単離できる。
本発明のポリペプチドとしては以下の(a)〜(g)のポリペプチドを挙げることができる。
(b)配列表の配列番号1で示されるアミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、アミノ基供与体の存在下で1−ベンジル−3−ピロリジノンに作用して光学純度93%e.e.以上の(S)−1−ベンジル−3−アミノピロリジンを生成する活性を有するポリペプチド、
(c)配列表の配列番号1で示されるアミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、アミノ基供与体として(S)−1−フェネチルアミンに対し活性を示し、L―アラニンよりL−グルタミン酸に高い活性を示し、かつ、β−アラニン、4−アミノ酪酸に対し実質的に活性を示さず、アミノ基受容体としてピルビン酸より2−ケトグルタル酸に対し高い活性を有するポリペプチド、
(d)配列表の配列番号1で示されるアミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、至適pHが7.0〜8.0であり、至適温度が30〜50℃であり、30〜50℃で30分間処理したとき処理前の70%以上の残存活性を保持する、分子量がドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において約48kDaであるポリペプチド、
(e)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列と50%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、アミノ基供与体の存在下で1−ベンジル−3−ピロリジノンに作用して光学純度93%e.e.以上の(S)−1−ベンジル−3−アミノピロリジンを生成する活性を有するポリペプチド、
(f)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列と50%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、アミノ基供与体として(S)−1−フェネチルアミンに対し活性を示し、L―アラニンよりL−グルタミン酸に高い活性を示し、かつ、β−アラニン、4−アミノ酪酸に対し実質的に活性を示さず、アミノ基受容体としてピルビン酸より2−ケトグルタル酸に対し高い活性を有するポリペプチド、
(g)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列と50%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、至適pHが7.0〜8.0であり、至適温度が30〜50℃であり、30〜50℃で30分間処理したとき処理前の70%以上の残存活性を保持する、分子量がドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において約48kDaであるポリペプチド。
(第2群:中性極性アミノ酸)Ser, Thr, Gln, Asn, Trp, Tyr
(第3群:酸性アミノ酸)Glu, Asp
(第4群:塩基性アミノ酸)His, Lys, Arg。
本発明のDNAは、上記ポリペプチドをコードするDNAであり、後述する方法に従って導入された宿主細胞内で上記ポリペプチドを発現し得るものであればいかなるものでもよく、任意の非翻訳領域を含んでいてもよい。本発明のDNAは配列表の配列番号2に従い、当業者であれば化学合成法により容易に入手できる。他の方法としては、精製された上記ポリペプチドが取得できれば、当業者であれば公知の方法により、該ポリペプチドの起源となる微生物より上記DNAを取得することができる。
本発明のポリペプチドをコードするDNAとしては、例えば、以下の(A)〜(C)のDNAを挙げることができる。
(B)配列表の配列番号2に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA、
(C)配列表の配列番号2に記載の塩基配列において、1若しくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列からなるDNA。
本発明の実施形態のDNAを宿主微生物内に導入し、それをその導入された宿主微生物内で発現させるために用いられるベクターDNAとしては、適切な宿主微生物内で該DNAがコードするポリペプチドを発現できるものであればいずれでもよい。このようなベクターDNAとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられる。また、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用され得る。
本発明の実施形態のDNAを発現させるために用いる宿主生物は、各ポリペプチドをコードするDNAを含む発現ベクターにより形質転換され、DNAを導入したポリペプチドを発現することができる生物であれば、特に制限はされない。利用可能な微生物としては、例えば、エシェリヒア(Escherichia)属、バチルス(Bacillus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、セラチア(Serratia)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、コリネバクテリイウム(Corynebacterium)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、及びラクトバチルス(Lactobacillus)属など宿主ベクター系の開発されている細菌、ロドコッカス(Rhodococcus)属及びストレプトマイセス(Streptomyces)属など宿主ベクター系の開発されている放線菌、サッカロマイセス(Saccharomyces)属、クライベロマイセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、トリコスポロン(Trichosporon)属、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属、ピキア(Pichia)属、及びキャンディダ(Candida)属などの宿主ベクター系の開発されている酵母、ノイロスポラ(Neurospora)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、セファロスポリウム(Cephalosporium)属、及びトリコデルマ(Trichoderma)属などの宿主ベクター系の開発されているカビ、などが挙げられる。また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫(Nature315,592−594(1985))や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。これらのうち、導入及び発現効率から細菌が好ましく、大腸菌が特に好ましい。
次に、本発明の実施形態のポリペプチドまたは当該ポリペプチドの生産能を持つ微生物を用いて光学活性アミノ化合物を製造する方法について説明する。
製造方法Iは、ケトン化合物に、アミノ基供与体の存在下、本発明のポリペプチド、あるいは本発明のポリペプチドの生産能を持つ形質転換体の培養物を作用させ、光学活性アミノ化合物を製造する方法である。
アミノ基供与体としては、本発明のポリペプチドが作用するアミン化合物であればいかなるものでも使用できる。具体例としては1−フェネチルアミン、2−ブチルアミン、2−ペンチルアミン、2−ヘプチルアミン、3−ヘプチルアミン、n−エチルアミン、n−プロピルアミン、n−ブチルアミン、n−アミルアミン、イソプロピルアミン、イソブチルアミン、グリシン、アラニン、グルタミン酸、3−アミノ−1−フェニルブタン、ベンジルアミン、β−フェネチルアミン、シクロヘキシルアミンおよびそれらの光学活性体が挙げられる。なかでも、1−フェネチルアミン、特に、安価で、かつ、溶解度が高い点ではグルタミン酸が好ましい。
製造方法Iにおいては、前記ケトン化合物に、アミノ基供与体の存在下、前記本発明のポリペプチドまたは当該ポリペプチドの生成能を有する微生物の培養物を作用させる。
アミノ基転移反応を用いたアミノ化反応は一般的に可逆反応であるため、一般的に平衡点で見かけ上反応が停止する。これらの反応平衡を解消する公知の方法を組み合わせることで本発明のポリペプチドを用いた反応を改善することができる。
反応に用いる基質の濃度としては、ケトン化合物は、反応液組成中、0.1〜80重量%、好ましくは1〜50重量%であり、また、アミノ基供与体は、キラルアミンの場合は、ケトン化合物に対し、80〜1200モル%、好ましくは100〜600モル%の濃度になるように用いることが好ましい。なお、前記アミノ基供与体としてラセミ体のアミノ化合物の場合は、一方の立体が上記の濃度となるように使用することもできる。
本発明のポリペプチドを作用させる際のpHは、ポリペプチドの至適pHの観点から、下限は、好ましくはpH6.0以上であり、より好ましくはpH7.0以上であり、上限は、好ましくはpH9.0以下であり、より好ましくはpH8.0以下であることが望ましい。複数のポリペプチド(酵素)を共役させる場合には使用する全ての酵素が安定的かつ高活性に作用するpHを選択することが好ましい。
本発明のポリペプチドを作用させる際の温度は、ポリペプチドの至適温度および熱安定性の観点から、好ましくは25℃以上であり、より好ましくは30℃以上であり、好ましくは60℃以下であり、より好ましくは50℃以下である。複数のポリペプチド(酵素)を共役させる場合には使用する全ての酵素が安定的かつ高活性に作用する反応温度を選択することが好ましい。
反応溶媒は、通常、イオン交換水、緩衝液等の水性媒体を使用するが、有機溶媒を含んだ系でも反応を行なうことができる。有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール等のアルコール系溶媒、ペンタン、ヘキサン等の脂肪族炭化水素系溶媒、ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素系溶媒、塩化メチレン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素系溶媒、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル系溶媒、酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン系溶媒、その他、アセトニトリル等を適宜使用できる。
必要に応じて、上記の有機溶媒を水への溶解度以上に加えて2相系で反応を行なうこともできる。有機溶媒を反応系に共存させることで、選択率、変換率、収率などが向上する場合も多い。
反応は、通常、1時間〜1週間、好ましくは1〜72時間であり、そのような時間で反応が終了する反応条件を選択することが好ましい。
上記の反応により、光学活性アミノ化合物が生成する。生成した光学活性アミノ化合物は、反応混合液から抽出、蒸留、再結晶、カラム分離など公知の方法によって単離することができる。
本製造方法は、アミノ化合物のエナンチオマー混合物にアミノ基受容体の存在下、本発明のポリペプチド、または本発明のポリペプチドの生産能を持つ形質転換体の培養物を作用させる光学活性アミノ化合物の製造方法である。
本方法においては、ケトン化合物をアミノ基受容体として用いる。当該ケトン化合物としては、アミノ基受容体としての活性があればいかなるケトン化合物であってもよいが、好ましくは、2−ケトグルタル酸あるいはグリオキシル酸である。
(S)−1−フェネチルアミンをアミノ基供与体として1−ベンジル−3−ピロリジノンをアミノ化する微生物である、アルスロバクター・エスピー(Arthrobacter sp.)KNK04−25(NITE BP−954)を土壌より分離した。上記の反応を触媒するアミノ基転移活性をもつポリペプチドの精製、その構造遺伝子のクローニング、及び構造遺伝子を含む組換えベクターの構築を行った。以下、本ポリペプチドをTATと記載する。
酵素液0.2mLに下記組成を有する基質溶液0.8mLを添加し、30℃で60分間反応させた後、6規定塩酸を50μL添加して反応を停止させた。この反応液を、下記条件による高速液体クロマトグラフィーで分析し、生成したアセトフェノンを定量した。本反応条件において、1分間に1μmolのアセトフェノンが生成する活性を、1Uと定義した。
(S)−1−フェネチルアミン 25mM
2−ケトグルタル酸 25mM
ピリドキサルリン酸 2.5mM
トリス・塩酸緩衝液(pH8.0) 0.1M
[高速液体クロマトグラフィーによる測定条件]
カラム:Cosmosil 5C8−MS (ナカライテスク社製)
溶離液:蒸留水2000mL/アセトニトリル500mL/メタノール500ml/KH2PO4 6.1g/H3PO4 2.5g
流速:1mL/分
検出:254nm
カラム温度:30℃
(PCRプライマーの作成)
実施例1で得られた精製TATのN末端アミノ酸配列をPPSQ−33A型全自動タンパク質一次構造分析機(島津製作所製社製)により決定した。また、上記で得られた精製TATを8M尿素存在下で変性させた後、アクロモバクター由来のリシルエンドペプチダーゼ(和光純薬工業社製)で消化し、得られたペプチド断片のアミノ酸配列をN末端アミノ酸配列と同様の方法で決定した。このアミノ酸配列から予想される塩基配列を考慮し、TAT遺伝子の一部をPCRにより増幅するためのプライマー1(配列表の配列番号3)、および、プライマー2(配列表の配列番号4)を合成した。
上記アルスロバクター・エスピー(Arthrobacter sp.)KNK04−25の培養液から、Ausubel等の方法(Current Protocols in Molecular Biology, 1987)に記載の方法に従って染色体DNAを抽出した。得られた染色体DNAを鋳型に、上記で合成したプライマー1および2を用いてPCRを行った。その結果、遺伝子の一部と考えられる約450bpのDNA断片を取得した。PCRは、DNAポリメラーゼとしてTaKaRa Ex Taq(タカラバイオ社製)を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。
このDNA断片を、ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(Applied Biosystems社製)およびABI 3100 DNA Sequencer(Applied Biosystems社製)を用いてその塩基配列を決定した。その塩基配列を配列表の配列番号5に示した。
上記で得たアルスロバクター・エスピー KNK04−25の染色体DNAを制限酵素AatII、ApaLIまたはPstIを用いて完全消化し、得られた消化物をT4DNAリガーゼ(タカラバイオ社製)を用いて各々分子内環化させた。これを鋳型として用い、上記で判明したTAT遺伝子の部分塩基配列情報をもとに、inverse−PCR法(Nucl. Acids Res., 16, 8186 (1988))により、染色体DNA上のTAT遺伝子の全塩基配列を決定した。PCRは、TaKaRa LA Taq HS(タカラバイオ社製)を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。 決定した塩基配列を配列表の配列番号2に示した。また、該塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号1に示した。
実施例2で決定した塩基配列に基づき、TAT遺伝子の開始コドン部分にNdeI部位を付加したプライマー3(配列表の配列番号6)と、TAT遺伝子の終始コドンの直後にEcoRI部位を付加したプライマー4(配列表の配列番号7)とを合成した。実施例2で得たアルスロバクター・エスピー KNK04−25の染色体DNAを鋳型とし、これらのプライマーを用いてPCRを行い、TAT遺伝子の開始コドン部分にNdeI部位を付加し、かつ終始コドンの直後にEcoRI部位を付加した二本鎖DNAを取得した。PCRは、PrimeSTAR HS(タカラバイオ社製)を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。このDNAをNdeI及びEcoRIで消化し、プラスミドpUCNT(WO94/03613)のlacプロモーターの下流のNdeI認識部位とEcoRI認識部位の間に挿入し、組換えベクターpNTTATを得た。
実施例3で得た組換えプラスミドpNTTATを用いて、大腸菌 E. coli HB101(タカラバイオ社製)を形質転換し、組換え大腸菌E. coli HB101(pNTTAT)を得た。比較例として、上記プラスミドpUCNTを用いて、大腸菌E. coli HB101(タカラバイオ社製)を形質転換し、組換え大腸菌 E. coli HB101 (pUCNT)を得た。
実施例4で得た形質転換体E. coli HB101(pNTTAT)、および、比較例であるE. coli HB101(pUCNT)を、200μg/mlのアンピシリンを含む2YT培地(組成:16g/L トリプトン(ベクトン ディッキンソン社製)、10g/L イーストエキス(ベクトン ディッキンソン社製)、5g/L NaCl(pH 7.0))で培養し、集菌後、100mMリン酸緩衝液(pH7.0)に懸濁し、超音波破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。
実施例5で得た無細胞抽出液を用いて、TATの1−ベンジル−3−ピロリジノンに対する活性と生成(S)−1−ベンジル−3−アミノピロリジンの光学純度について調べた。
光学活性(S)−1−フェネチルアミンと1−ベンジル−3−ピロリジノンとに作用してアセトフェノンと(S)−1−ベンジル−3−アミノピロリジンとを生成するアミノ基転移反応を触媒する活性を調べた。実施例5で得られた無細胞抽出液に、最終濃度が下記基質溶液組成となるように各試薬を添加した。30℃で2時間反応させた後、反応液を下記条件のHPLCにて分析した。
1−ベンジル−3−ピロリジノン 57mM
(S)−1―フェネチルアミン 57mM
ピリドキサルリン酸 0.5mM
リン酸カリウム緩衝液(pH7.0) 0.1M
<定量分析>
カラム:Finepak SIL C18−T (日本分光社製)
溶離液:蒸留水 945mL/アセトニトリル 555mL/KH2PO4 7.5g/SDS 2.16g(H3PO4でpH3.6に調製)
流速:1mL/分
検出:254nm
カラム温度:40℃
<光学純度分析>
反応液を適量の炭酸ナトリウムで塩基性にしたのち、ジニトロベンゾイルクロリドで誘導体化した後、以下の条件で分析する。
溶離液:ヘキサン/エタノール/ジエチルアミン/アセトニトリル=800/200/1/5(体積比)
流速:0.8mL/分
検出:254nm
カラム温度:30℃
実施例5で得た無細胞抽出液を用いて、TATのアミノ基転移活性について、実施例1に示した(S)−1−フェネチルアミンと2−ケトグルタル酸を基質とした活性測定法により測定した。
pH4.0〜10の範囲で、上記と同様にしてアミノ基転移活性を測定し、TATの至適pHを調べた(ただし、測定するpHに応じて緩衝液は下記のものを用いた)。その結果、pH7での反応が最も活性が高く、pH7.0を100としたときの相対活性で70以上の値を示したpHはpH7.0およびpH8.0であった。
pH4.0、5.0の場合 :0.1M酢酸ナトリウム緩衝液
pH6.0、7.0の場合 :0.1Mリン酸カリウム緩衝液
pH8.0の場合 :0.1Mトリス−塩酸緩衝液
pH9.0、10の場合 :0.1M炭酸ナトリウム緩衝液
温度30、40、50、60、70℃の範囲で、前記の活性測定方法と同様にアミノ基転移活性を測定し、TATの至適温度を調べた。その結果、40℃での反応が最も活性が高く、40℃を100としたときの相対活性で70以上の値を示した温度は30、40、50℃であった。
酵素液を、0.5mMピリドキサルリン酸、0.1Mリン酸カリウム緩衝液(pH8.0)中、温度30、40、50、60、70℃で30分間処理した後、前記の活性測定方法でアミノ基転移活性を測定し、TATの熱安定性を調べた。その結果、処理前を100としたときの相対活性で70以上の値を示した温度は30、40、50℃であった。
実施例5で得た無細胞抽出液を用いて、TATの分子量について調べた。
実施例5で得た無細胞抽出液を用いて、TATのアミノ基供与体に対する基質特異性について調べた。
各種アミノ化合物 14mM
2−ケトグルタル酸 14mM
ピリドキサルリン酸 0.5mM
リン酸カリウム緩衝液(pH7.0) 0.1M
[高速液体クロマトグラフィーによる測定条件]
カラム:Cosmosil 5C8−MS (ナカライテスク社製)
溶離液:蒸留水2000mL/アセトニトリル500mL/メタノール500ml/KH2PO4 6.1g/H3PO4 2.5g
流速:1mL/分
検出:254nm
カラム温度:30℃
実施例5で得た無細胞抽出液を用いて、TATについて代表的なω―アミノ酸トランスアミナーゼの基質に対する反応性について調べた。
各種アミノ化合物 14mM
2−ケトグルタル酸 14mM
ピリドキサルリン酸 0.5mM
リン酸カリウム緩衝液(pH7.0) 0.1M
カラム:YMC−Pack Pro C18 RS(YMC社製)
溶離液:アセトニトリル/45mM酢酸緩衝液(pH4.1)=35/65(体積比)
流速:0.9mL/分
検出:254nm
カラム温度:30℃
実施例5で得られた無細胞抽出液を用いて、TATのアミノ基供与体に対する基質特異性について調べた。酵素液200μLに最終濃度が下記基質溶液組成となるように各試薬を添加し、0.1M リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)で反応液の体積を400μLに調製した。30℃で90分間反応させた後、6規定塩酸を15μL加えて反応を停止させる。次に、得られた反応液を生成した下記条件による高速液体クロマトグラフィーで分析した。
1−ベンジル−3−ピロリジノン 29mM
各種アミノ化合物 290mM
ピリドキサルリン酸 0.5mM
リン酸カリウム緩衝液(pH7.0) 0.1M
<定量分析>
カラム:Finepak SIL C18−T (日本分光社製)
溶離液:蒸留水 945mL/アセトニトリル 555mL/KH2PO4 7.5g/SDS 2.16g(H3PO4でpH3.6に調製)
流速:1mL/分
検出:254nm
カラム温度:40℃
<光学純度分析>
反応液を適量の炭酸ナトリウムで塩基性にしたのち、ジニトロベンゾイルクロライドで誘導体化した後、以下の条件で分析した。
溶離液:ヘキサン/エタノール/ジエチルアミン/アセトニトリル=800/200/1/5(体積比)
流速:0.8mL/分
検出:254nm
カラム温度:30℃
実施例5で得た無細胞抽出液を用いて、TATのアミノ基受容体に対する基質特異性について調べた。
各種ケトン化合物 14mM
(S)−1−フェネチルアミン 14mM
ピリドキサルリン酸 0.5mM
リン酸カリウム緩衝液(pH7.0) 0.1M
[高速液体クロマトグラフィーによる測定条件]
カラム:Cosmosil 5C8−MS (ナカライテスク社製)
溶離液:蒸留水2000mL/アセトニトリル500mL/メタノール500ml/KH2PO4 6.1g/H3PO4 2.5g
流速:1mL/分
検出:254nm
カラム温度:30℃
ラクトバシラス パラカゼイ サブエスピー パラカゼイ(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)JCM1181より、α−ケト酸還元酵素の一つであるD−ヒドロキシイソカプロン酸脱水素酵素(以下RLCと略す)の遺伝子を、以下の方法でクローニングした。このラクトバシラス パラカゼイ サブエスピー パラカゼイ(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)JCM1181株は、独立行政法人 理化学研究所 バイオリソースセンター(〒351−0198 埼玉県和光市広沢2−1)より当業者が入手可能である。このRLCは、本発明の「α−ケト酸還元酵素(β)」の一実施例である。
遺伝子データバンクに登録されている既知のD−ヒドロキシイソカプロン酸脱水素酵素の遺伝子配列情報(Genebank M26929)を参考に、RLC遺伝子の開始コドン部分にNdeI部位を付加したプライマー5(配列表の配列番号8)と、RLC遺伝子の終始コドンの直後にKpnI部位を付加したプライマー6(配列表の配列番号9)を合成した。また、RLC遺伝子内部に存在するNdeI部位を破壊するために165番目のAをGに置換したプライマー7(配列表の配列番号10)と8(配列表の配列番号11)を合成した。
上記ラクトバシラス パラカゼイ サブエスピー パラカゼイ(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)JCM1181の培養液から、Ausubel等の方法(Current Protocols in Molecular Biology, 1987)に記載の方法に従って染色体DNAを抽出した。得られた染色体DNAを鋳型に、上記で合成したプライマー5および7を用いてPCRを行った。その結果、遺伝子の一部と考えられる約200bpのDNA断片を取得した。さらに、プライマー6および8を用いてPCRを行った。その結果、遺伝子の一部と考えられる約1800bpのDNA断片を取得した。ついで、上記PCR断片2種類をQIAquick PCR purification Kit(QIAGEN社)の取り扱い説明書に従い精製し、混合してPCRを実施した。その結果、全長遺伝子に制限酵素部位を付加し、NdeI部位を破壊したと考えられる約2000bpのDNA断片を取得した。PCRは、DNAポリメラーゼとしてTaKaRa PrimeSTAR(タカラバイオ社製)を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。
このDNA断片を、ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(Applied Biosystems社製)およびABI 3100 DNA Sequencer(Applied Biosystems社製)を用いてその塩基配列を決定した。その塩基配列を配列表の配列番号12に示した。
実施例13で得たPCR断片を鋳型とし、前記プライマー5(配列表の配列番号8)とプライマー6(配列表の配列番号9)を用いてPCRを行い、RLC遺伝子の開始コドン部分にNdeI部位を付加し、終始コドンの直後にKpnI部位を付加し、かつRLC遺伝子内部のNdeI部位を破壊した二本鎖DNAを取得した。PCRは、PrimeSTAR(タカラバイオ社製)を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。このDNAをNdeI及びKpnIで消化し、プラスミドpUCNT(WO94/03613)のlacプロモーターの下流のNdeI認識部位とKpnI認識部位の間に挿入し、組換えベクターpNTLCを得た。
実施例14で作成した組換えプラスミドpNTLCを用いて、大腸菌 E. coli HB101(タカラバイオ社製)を形質転換し、組換え大腸菌E. coli HB101(pNTLC)を得た。
L−グルタミン酸と1−ベンジル−3−ピロリジノンを基質として(S)−1−ベンジル−3−アミノピロリジンとを生成するアミノ基転移反応を触媒する活性を調べた。
実施例5で得たTATポリペプチド無細胞抽出液を最終濃度がTAT5U/mLになるよう調製し、この酵素液に最終濃度が下記基質溶液組成1となるように各試薬を添加した。30℃で2時間反応させた後、反応液を下記条件のHPLCにて分析した。
実施例5で得たTATポリペプチド無細胞抽出液、実施例15で得たRLC酵素無細胞抽出液と市販グルコース脱水素酵素(天野エンザイム社製)を最終濃度がTAT5U/mL、RLC2U/mL、市販グルコース脱水素酵素8U/mLとなるように混合し、この酵素液に、最終濃度が下記基質溶液組成2となるように各試薬を添加した。30℃で2時間反応させた後、反応液を下記条件のHPLCにて分析した。
1−ベンジル−3−ピロリジノン 57mM
L−グルタミン酸ナトリウム 171mM
ピリドキサルリン酸 0.5mM
リン酸カリウム緩衝液(pH7.0) 0.1M
[基質溶液組成2]
1−ベンジル−3−ピロリジノン 57mM
L−グルタミン酸ナトリウム 171mM
D−グルコース 57mM
NADH 0.6mM
ピリドキサルリン酸 0.5mM
リン酸カリウム緩衝液(pH7.0) 0.1M
<定量分析>
カラム:Finepak SIL C18−T (日本分光社製)
溶離液:蒸留水 945mL/アセトニトリル 555mL/KH2PO4 7.5g/SDS 2.16g(H3PO4でpH3.6に調製)
流速:1mL/分
検出:254nm
カラム温度:40℃
実施例4で得たE. coli HB101(pNTTAT)株を200μg/mlのアンピシリンを含む2×YT培地(トリプトン1.6%、イーストエキス1.0%、NaCl 0.5%、pH7.0)で培養し、集菌した。また、実施例15で得たE. coli HB101(pNTLC)株を、200μg/mlのアンピシリンを含む2×YT培地(トリプトン1.6%、イーストエキス1.0%、NaCl 0.5%、pH7.0)で培養し、集菌した。
<定量分析>
カラム:Finepak SIL C18−T (日本分光社製)
溶離液:蒸留水 945mL/アセトニトリル 555mL/KH2PO4 7.5g/SDS 2.16g(H3PO4でpH3.6に調製)
流速:1mL/分
検出:254nm
カラム温度:40℃
<光学純度分析>
反応液を適量の炭酸ナトリウムで塩基性にしたのち、ジニトロベンゾイルクロライドで誘導体化した後、以下の条件で分析した。
溶離液:ヘキサン/エタノール/ジエチルアミン/アセトニトリル=800/200/1/5(体積比)
流速:0.8mL/分
検出:254nm
カラム温度:30℃
実施例4で得たE. coli HB101(pTTAT)200μg/mlのアンピシリンを含む2×YT培地(トリプトン1.6%、イーストエキス1.0%、NaCl 0.5%、pH7.0)で培養し、集菌した。
<定量分析>
カラム:Finepak SIL C18−T (日本分光社製)
溶離液:蒸留水 945mL/アセトニトリル 555mL/KH2PO4 7.5g/SDS 2.16g(H3PO4でpH3.6に調製)
流速:1mL/分
検出:254nm
カラム温度:40℃
<光学純度分析>
反応液を適量の炭酸ナトリウムで塩基性にしたのち、ジニトロベンゾイルクロライドで誘導体化した後、以下の条件で分析した。
溶離液:ヘキサン/エタノール/ジエチルアミン/アセトニトリル=800/200/1/5(体積比)
流速:0.8mL/分
検出:254nm
カラム温度:30℃
本明細書で引用した全ての刊行物、特許、及び特許出願をそのまま参考として本明細書に取り入れるものとする。
Claims (32)
- アルスロバクター・エスピー(Arthrobacter sp.)KNK04−25(NITE BP−954)から得られた、下記(1)及び(6)の理化学的性質を有するポリペプチド:
(1)作用:アミノ基供与体の存在下で1−ベンジル−3−ピロリジノンに作用して光学純度93%e.e.以上の(S)−1−ベンジル−3−アミノピロリジンを生成するアミノ基転移反応を触媒する、
(6)分子量:ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において、48kDa。 - さらに下記(2)の理化学的性質を有する請求項1のポリペプチド:
(2)基質特異性:
(a)アミノ基供与体:(S)−1−フェネチルアミンに対し活性を示し、L―アラニンよりL−グルタミン酸に高い活性を示し、かつ、β−アラニン、4−アミノ酪酸に対し実質的に活性を示さない、
(b)アミノ基受容体:ピルビン酸より2−ケトグルタル酸に対し高い活性を示す。 - さらに以下の(3)から(5)の理化学的性質を有する請求項1または2に記載のポリペプチド:
(3)至適pH:7.0〜8.0、
(4)至適温度:30〜50℃、
(5)熱安定性:30〜50℃で30分間処理したとき、処理前の70%以上の残存活性を保持する。 - 以下の(a)から(g)のいずれかに記載のポリペプチド:
(a)配列表の配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列表の配列番号1で示されるアミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、アミノ基供与体の存在下で1−ベンジル−3−ピロリジノンに作用して光学純度93%e.e.以上の(S)−1−ベンジル−3−アミノピロリジンを生成する活性を有するポリペプチド、
(c)配列表の配列番号1で示されるアミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、アミノ基供与体として(S)−1−フェネチルアミンに対し活性を示し、L―アラニンよりL−グルタミン酸に高い活性を示し、かつ、β−アラニン、4−アミノ酪酸に対し実質的に活性を示さず、アミノ基受容体としてピルビン酸より2−ケトグルタル酸に対し高い活性を有するポリペプチド、
(d)配列表の配列番号1で示されるアミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、至適pHが7.0〜8.0であり、至適温度が30〜50℃であり、(S)−1−フェネチルアミン及び2−ケトグルタル酸を基質としたアミノ基転移活性を、30〜50℃で30分間処理したとき処理前の70%以上保持する、分子量がドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において48kDaであるポリペプチド、
(e)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、アミノ基供与体の存在下で1−ベンジル−3−ピロリジノンに作用して光学純度93%e.e.以上の(S)−1−ベンジル−3−アミノピロリジンを生成する活性を有するポリペプチド、
(f)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、アミノ基供与体として(S)−1−フェネチルアミンに対し活性を示し、L―アラニンよりL−グルタミン酸に高い活性を示し、かつ、β−アラニン、4−アミノ酪酸に対し実質的に活性を示さず、アミノ基受容体としてピルビン酸より2−ケトグルタル酸に対し高い活性を有するポリペプチド、
(g)配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、至適pHが7.0〜8.0であり、至適温度が30〜50℃であり、(S)−1−フェネチルアミン及び2−ケトグルタル酸を基質としたアミノ基転移活性を、30〜50℃で30分間処理したとき処理前の70%以上保持する、分子量がドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において48kDaであるポリペプチド。 - 請求項1から4のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする塩基配列からなるDNA。
- 下記(A)から(C)のいずれかに記載の請求項5に記載のDNA:
(A)配列表の配列番号2に記載の塩基配列からなるDNA、
(B)配列表の配列番号2に記載の塩基配列と90%以上の配列同一性を有する塩基配列からなるDNA、
(C)配列表の配列番号2に記載の塩基配列において、1若しくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列からなるDNA。 - 請求項5または6に記載のDNAを含むベクター。
- 請求項7に記載のベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
- ケトン化合物に、アミノ基供与体の存在下、請求項1から4のいずれか1項に記載のポリペプチド、または請求項8に記載の形質転換体の培養物を作用させることを特徴とする、光学活性アミノ化合物の製造方法。
- アミノ化合物のエナンチオマー混合物にアミノ基受容体の存在下、請求項1から4のいずれか1項に記載のポリペプチド、または請求項8に記載の形質転換体の培養物を作用させることを特徴とする、光学活性アミノ化合物の製造方法。
- 前記式(1)で表されるケトン化合物が、1−テトラロン、2−テトラロン、5−メトキシ−2−テトラロン、6−メトキシ−2−テトラロン、7−メトキシ−2−テトラロン、8−メトキシ−2−テトラロン、1−ベンジル−3−ピロリジノン、1−Boc−3−ピロリジノン、1−Cbz−3−ピロリジノン、1−ベンジル−3−ピペリジノン、1−Boc−3−ピペリジノン、1−Cbz−3−ピペリジノン、アセトフェノン、3,4−ジメトキシフェニルアセトン、からなる群から選ばれる1以上のケトン化合物である、請求項10に記載の製造方法。
- 前記式(3)で表されるアミノ化合物が、1−アミノテトラリン、2−アミノテトラリン、5−メトキシ−2−アミノテトラリン、6−メトキシ−2−アミノテトラリン、7−メトキシ−2−アミノテトラリン、8−メトキシ−2−アミノテトラリン、1−ベンジル−3−アミノピロリジン、1−Boc−3−アミノピロリジン、1−Cbz−3−アミノピロリジン、1−ベンジル−3−アミノピペリジン、1−Boc−3−アミノピペリジン、1−Cbz−3−アミノピペリジン、1−フェネチルアミン、3,4−ジメトキシアンフェタミン、からなる群から選ばれる1以上のアミノ化合物である、請求項12に記載の製造方法。
- アミノ基供与体が、1−フェネチルアミン、2−ブチルアミン、2−ペンチルアミン、2−ヘプチルアミン、3−ヘプチルアミン、n−エチルアミン、n−プロピルアミン、n−ブチルアミン、n−アミルアミン、イソプロピルアミン、イソブチルアミン、グリシン、アラニン、グルタミン酸、3−アミノ−1−フェニルブタン、ベンジルアミン、β−フェネチルアミン、シクロヘキシルアミンおよびそれらの光学活性体からなる群より選ばれた化合物である、請求項9または10に記載の製造方法。
- アミノ基受容体が、2−ケトグルタル酸またはピルビン酸である、請求項11または12に記載の製造方法。
- アミノ基供与体から生成するケトン化合物(X)のカルボニル基を他の官能基に変換する活性を持つ少なくとも1つの酵素を、請求項1から4のいずれか1項に記載のポリペプチドと同一反応系中で利用することにより、ケトン化合物(Y)を、アミノ基供与体の存在下、アミノ基が結合する炭素原子が不斉点である対応する光学活性アミノ化合物(Z)へ変換することを特徴とする、光学活性アミノ化合物の製造方法。
- 下記(I)から(III)のポリペプチドおよび酵素を同一反応系中で利用することにより、ケトン化合物(Y)を、アミノ基供与体の存在下、アミノ基が結合する炭素原子が不斉点である対応する光学活性アミノ化合物(Z)へ変換することを特徴とする、請求項17に記載の製造方法:
(I)請求項1から4のいずれか1項に記載のポリペプチド、
(II)還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)もしくは還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADPH)を補酵素とし、前記ポリペプチド(I)の作用によってアミノ基供与体のα−アミノ酸より生じるケトン化合物(X)のα−ケト酸をα−アミノ酸へ還元する能力を有し、かつ前記ケトン化合物(Y)に対し作用しないα−アミノ酸脱水素酵素、
(III)前記α−アミノ酸脱水素酵素(II)の作用によって前記NADHから生じる酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)をNADHに変換する能力、または前記α−アミノ酸脱水素酵素(II)の作用によって前記NADPHから生じる酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP+)をNADPHに変換する能力を有する酵素。 - 前記(II)、(III)の酵素が、それぞれ下記の(II’)、(III’)の酵素である、請求項18に記載の製造方法:
(II’)還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)を補酵素とし、前記ポリペプチド(I)の作用によってアミノ基供与体のα−グルタミン酸より生じるケトン化合物(X)の2-ケトグルタル酸をα−グルタミン酸へ還元する能力を有し、かつ前記ケトン化合物(Y)に対し作用しないα−アミノ酸脱水素酵素、
(III’)前記α−アミノ酸脱水素酵素(II’)の作用によって前記NADHから生じる酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)をNADHに変換する能力を有する酵素。 - 前記(I)から(III)のポリペプチドおよび酵素をコードする各DNAを宿主細胞に導入することにより得られる形質転換体および/またはその培養物を酵素源として用いることを特徴とする、請求項18または19に記載の製造方法。
- 前記(I)から(III)のポリペプチドおよび酵素をコードする各DNAを別々に含有する複数の組換えベクター、もしくは前記(I)から(III)のポリペプチドおよび酵素をコードする各DNAの全てを含有する1つの組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換することにより得られる、前記(I)から(III)のポリペプチドおよび酵素を同一形質転換体内で発現する形質転換体および/またはその培養物を酵素源として用いることを特徴とする、請求項18または19に記載の製造方法。
- 前記(II)の酵素がグルタミン酸脱水素酵素であり、前記(III)の酵素がグルコース脱水素酵素もしくはギ酸脱水素酵素である、請求項18から21のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記(II)の酵素が、牛肝臓もしくは酵母もしくはバクテリア由来の酵素である、請求項18から22のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記(III)の酵素が、バシラス・メガテリウム(Bacillus megaterium)もしくはチオバシラス・エスピー(Thiobacillus sp.)に属する微生物由来の酵素である、請求項18から23のいずれか1項に記載の製造方法。
- 下記(α)から(γ)のポリペプチドおよび酵素を同一反応系中で利用することにより、ケトン化合物(Y)を、アミノ基供与体の存在下、アミノ基が結合する炭素原子が不斉点である対応する光学活性アミノ化合物(Z)へ変換することを特徴とする、請求項17に記載の製造方法:
(α)請求項1から4のいずれか1項に記載のポリペプチド、
(β)還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)もしくは還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADPH)を補酵素とし、前記ポリペプチド(α)の作用によってアミノ基供与体のα−アミノ酸より生じるケトン化合物(X)のα−ケト酸を2−ヒドロキシ酸へ還元する能力を有し、かつ前記ケトン化合物(Y)に対し作用しないα−ケト酸還元酵素、
(γ)前記α−ケト酸還元酵素(β)の作用によって前記NADHから生じる酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)をNADHに変換する能力、または前記α−ケト酸還元酵素(β)の作用によって前記NADPHから生じる酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP+)をNADPHに変換する能力を有する酵素。 - 前記(β)、(γ)の酵素が、下記(β’)、(γ’)の酵素である、請求項25に記載の製造方法:
(β’)還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)を補酵素とし、前記ポリペプチド(α)の作用によってアミノ基供与体のα−グルタミン酸より生じるケトン化合物(X)の2−ケトグルタル酸を2−ヒドロキシグルタル酸へ還元する能力を有し、かつ前記ケトン化合物(Y)に対し作用しないα−ケト酸還元酵素、
(γ’)前記α−ケト酸還元酵素(β’)の作用によって前記NADHから生じる酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)をNADHに変換する能力を有する酵素。 - 前記(α)から(γ)のポリペプチドおよび酵素をコードする各DNAを宿主細胞に導入することにより得られる形質転換体および/またはその培養物を酵素源として用いることを特徴とする、請求項25または26に記載の製造方法。
- 前記(α)から(γ)のポリペプチドおよび酵素をコードする各DNAを別々に含有する複数の組換えベクター、もしくは前記(α)から(γ)のポリペプチドおよび酵素をコードする各DNAの全てを含有する1つの組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換することにより得られる、前記(α)から(γ)のポリペプチドおよび酵素を同一形質転換体内で発現する形質転換体および/またはその培養物を酵素源として用いることを特徴とする、請求項25または26に記載の製造方法。
- 前記(β)の酵素がマンデル酸脱水素酵素あるいはヒドロキシイソカプロン酸脱水素酵素であり、前記(γ)の酵素がグルコース脱水素酵素もしくはギ酸脱水素酵素である、請求項25から28のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記(β)の酵素が、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacilus casei)もしくはワイセラ・コンフューサ(Weissela confusa)に属する微生物由来の酵素である、請求項25から29のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記(γ)の酵素が、バシラス・メガテリウム(Bacillus megaterium)もしくはチオバシラス・エスピー(Thiobacillus sp.)に属する微生物由来の酵素である、請求項25から30のいずれか1項に記載の製造方法。
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Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006126498A1 (ja) * | 2005-05-23 | 2006-11-30 | Kaneka Corporation | 新規アミノ基転移酵素、およびこれをコードする遺伝子、ならびにこれらの利用法 |
JP2007185133A (ja) * | 2006-01-12 | 2007-07-26 | Daicel Chem Ind Ltd | アミントランスアミナーゼ、および該アミントランスアミナーゼを利用した光学活性アミンの製造方法 |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3818851A1 (de) * | 1988-06-03 | 1989-12-14 | Hoechst Ag | Neue transaminase, ihre herstellung und ihre verwendung |
KR100266920B1 (ko) | 1992-08-10 | 2003-12-31 | 가네가후치 가가쿠고교 가부시키가이샤 | 내열성이 향상된 데카르바밀라아제를 코딩하는 dna 및 그의 용도 |
EP0987332B1 (en) * | 1997-04-23 | 2009-08-19 | Kaneka Corporation | DNA encoding a polypeptide having stereoselective transaminase activity, and transformants comprising said DNA |
EP1580268B1 (en) * | 2002-12-09 | 2013-10-02 | Ajinomoto Co., Inc. | Mutant d-aminotransferase and process for producing optically active glutamic acid derivative using the same |
EP1818411A1 (en) | 2006-02-13 | 2007-08-15 | Lonza AG | Process for the preparation of optically active chiral amines |
US8168412B2 (en) | 2006-05-29 | 2012-05-01 | Kaneka Corporation | Method for producing optically-active amine compound, recombinant vector, and transformant containing the vector |
US7588923B2 (en) | 2007-03-02 | 2009-09-15 | Richmond Chemical Corporation | Method to increase the yield and improve purification of products from transaminase reactions |
DE102007042600A1 (de) | 2007-09-07 | 2009-03-12 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur Herstellung von enantiomerenangereichten Aminen |
JP2010216546A (ja) | 2009-03-16 | 2010-09-30 | Ntn Corp | 転がり軸受 |
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JP2007185133A (ja) * | 2006-01-12 | 2007-07-26 | Daicel Chem Ind Ltd | アミントランスアミナーゼ、および該アミントランスアミナーゼを利用した光学活性アミンの製造方法 |
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