JP2007515168A

JP2007515168A - トリプトファン生合成に関連する変異遺伝子を含有する大腸菌変異体および同変異体を使用するトリプトファンの製造方法

Info

Publication number: JP2007515168A
Application number: JP2006545226A
Authority: JP
Inventors: パク，ヨン−フン; リム，サン−チョ; キム，ビョン−フン; キム，ソン−ジン; リム，ホ−スー
Original assignee: シージェイコープ．
Priority date: 2003-12-15
Filing date: 2004-11-23
Publication date: 2007-06-14
Also published as: KR20050059685A; BRPI0417288B1; US20080299644A1; CN100582220C; EP1709157A4; US7638312B2; BRPI0417288A; KR101142885B1; CN1926232A; WO2005056776A1; EP1709157A1

Abstract

本発明は、トリプトファン生合成に関連する単一または複数の変異遺伝子を含有するトリプトファン産生大腸菌変異株ＣＪ２８５（ＫＣＣＭ−１０５３４）および同菌株を使用するトリプトファンの製造方法に関する。より具体的には、トリプトファン産生大腸菌変異株ＣＪ２８５（ＫＣＣＭ−１０５３４）由来の、トリプトファン生合成に関連するａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ｔｒｐＲ、およびｔｙｒＲのＤＮＡ塩基配列およびアミノ酸配列を開示し、該変異遺伝子の少なくとも１つを含有する大腸菌ＣＪ２８５をグルコース含有発酵培地中で直接培養し、これによりＬ−トリプトファンを培養培地中に蓄積させることができる。

Description

本発明は、トリプトファン生合成に関連する単一または複数の変異遺伝子を含有するトリプトファン産生大腸菌（E.coli）変異株ＣＪ２８５（ＫＣＣＭ−１０５３４）および同菌株を使用するトリプトファンの製造方法に関する。より具体的には、Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（本明細書中、以後ＮＴＧと称する）を繰り返し処理し、トリプトファン産生変異遺伝子ＣＪ２８５由来の遺伝子、例えばトリプトファンアナログであるヒドロキサム酸トリプトファン（Tryptophan Hydroxamate）（本明細書中、以後ＴＨＸと称する）に耐性のＤＡＨＰシンターゼのアイソザイムをエンコードするａｒｏＦおよびａｒｏＧ、ｔｒｐの調節に関するｔｒｐＲ、トリプトファン生合成に関連するａｒｏＨ、ｍｔｒ、ｔｒｐＲ、およびａｒｏＬオペロン、およびａｒｏＦ−ｔｙｒＡ、ａｒｏＧ、およびａｒｏＰオペロンの調節に関するｔｙｒＲタンパク質の塩基配列およびアミノ酸配列を見出す。その後、上記遺伝子（群）を含有する変異株をグルコース含有培地中で発酵させ、Ｌ−トリプトファンを製造する。

トリプトファンは必須アミノ酸の１つであり、多岐にわたる分野で広く使用されている。前記分野には、飼料添加物、医療用物質、例えば睡眠薬または精神安定薬またはリンガー溶液、および健康食品用物質が含まれる。トリプトファンの典型的な製造方法は、化学合成、酵素反応、および微生物を使用する発酵である。化学合成の場合、高温および高圧空間で製造が行われ、Ｄ−トリプトファンおよびＬ−トリプトファンがともに生産されるため、所望のトリプトファンを取得するために追加の精製工程が必要とされる。酵素反応、例えばMatsui Doatsuiに付与された日本特許（韓国特許公開第９０−００５７７３号）の場合、反応の基質として使用されるインドールおよびセリンが非常に高価であり、また酵素自体が安全ではない。

一方、微生物を使用する発酵では、多様な微生物、例えば大腸菌（E.coli）およびコリネバクテリウム（Corynebacterium）の栄養要求株および調節変異株を使用する。１９８０年代の遺伝子組換え分野における急速な技術の進歩により、代謝およびその制御メカニズムに関する大量の情報が提供されている。多数の研究者らが注目すべき成功を収め、遺伝子操作によって優れた組換え株を開発し、生産性を向上させた（Matsui et al, 1988）。また韓国では、直接発酵に関連するいくつかのトリプトファン製造技術が開示された。これらの技術は、トリプトファン耐性または栄養要求性変異株（韓国特許公開第８７−１８１３号、第９０−８２５１号、および第９２−７４０５号）または組換え株（韓国特許公開第９０−５７７２号および第９１−５６２７号）の使用に基づくものである。主に、これらのトリプトファンアナログ耐性株はトリプトファン生合成時の酵素のフィードバック阻害を克服するためのものであり、また、組換え株はトリプトファン生合成時の酵素のクローニングに使用された。実際に、前記研究は注目すべき成功を収めた。例えば、大腸菌の人工変異体を使用する従来のＬ−トリプトファン製造の最大の利点は、Ｌ−トリプトファンの製造に安価な培養基質を使用することであった。しかし、生産性すなわちトリプトファン収率（量）は非常に低かった。したがって、遺伝子組換えに基づくトリプトファン収率を最大にするために、親株として優れている人工変異体を確保し、調節が解除されている遺伝子を取得する必要性が存在する。

したがって、本発明は上記問題を考慮して達成されており、本発明の目的は、ホスホエノールピルビン酸およびエリトロース（Erythorse）４−リン酸からの、大腸菌変異株ＣＪ２８５由来のトリプトファン生合成時の芳香族アミノ酸の第一前駆体である３−デオキシアラビオノヘプツロソン酸７−リン酸（3-deoxyarabionohep-tulosonate 7-phosphate）（本明細書中、以後ＤＡＨＰと称する）の合成において使用される酵素であるａｒｏＦおよびａｒｏＧ、およびトリプトファン合成に関連する遺伝子の調節転写に関するｔｒｐＲおよびｔｙｒＲをエンコードする変異遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列を同定することである。

本発明の別の目的は、単一または複数の上記変異遺伝子を含有するＬ−トリプトファン産生大腸菌変異株を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、該変異体をグルコース含有発酵培地中で直接培養することに基づく、高濃度および高収率（量）のＬ−トリプトファンの製造方法を提供することである。

本発明の一側面では、トリプトファン生合成に関連する変異遺伝子を含有する大腸菌変異株を提供することによって上記および他の目的を達成することができ、この場合、トリプトファン産生親株である大腸菌ＣＪ１８１（ＫＦＣＣ１０９０２）中でＮＴＧを繰り返し処理して変異を誘発し、該変異体（ＣＪ２８５）を、トリプトファンアナログであるＴＨＸに耐性にし、これにより該変異株のトリプトファン生産を親株と比べて著しく向上させることができる。また、ＤＮＡ塩基配列およびアミノ酸配列を解析するために、トリプトファン生合成時の芳香族アミノ酸の第一前駆体ＤＡＨＰの合成に関する酵素であるａｒｏＦおよびａｒｏＧ、ｔｒｐの調節に関するｔｒｐＲタンパク質、トリプトファン生合成に関連するａｒｏＨ、ｍｔｒ、ｔｒｐＲ、およびａｒｏＬオペロン、およびａｒｏＦ−ｔｙｒＡ、ａｒｏＧ、ａｒｏＰオペロンの調節に関するｔｙｒＲタンパク質をエンコードする遺伝子をクローニングし、そのＤＮＡ塩基配列を野生型遺伝子の塩基配列と比較する。この様式で、遺伝子変異の位置を決定することが可能になる。その後、ａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ｔｒｐＲおよびｔｙｒＲの少なくとも１つを含有するＣＪ２８５株をグルコース含有発酵培地中で直接培養する。親株と比較して、ＣＪ２８５ははるかに大量のトリプトファンを生産した。

換言すると、大腸菌ＣＪ２８５株は遺伝子組換え技術によってトリプトファン収率を最大にするのに役立ち、決して開示されていない新規株である。

本発明は、Ｌ−トリプトファンの製造方法であって、下記段階を含む方法を提供する：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって遺伝子のプライマーを増幅し、この場合、該遺伝子は３−デオキシアラビオノヘプツロソン酸７−リン酸（ＤＡＨＰ）の合成に関与する酵素、ｔｒｐの調節に関するｔｒｐＲタンパク質、トリプトファン生合成に関連するａｒｏＨ、ｍｔｒ、ｔｒｐＲ、およびａｒｏＬオペロン、およびａｒｏＦ−ｔｙｒＡ、ａｒｏＧ、およびａｒｏＰオペロンの調節に関するｔｙｒＲタンパク質をエンコードするものであり、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターによって該遺伝子をクローニングして、予想サイズのバンドと反応するプラスミドクローンを検索する段階；双方向塩基配列解析に基づいてａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ｔｒｐＲ、およびｔｙｒＲ遺伝子の塩基配列を決定し、この場合、鋳型として上記４遺伝子を含有するプラスミドクローンを使用し、該塩基配列からアミノ酸配列を決定し、ならびに該遺伝子の塩基配列を野生型遺伝子の塩基配列と比較して変異の位置を決定する段階；および変異遺伝子ａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ｔｒｐＲ、およびｔｙｒＲの１つまたはそれ以上を含有する大腸菌変異株ＣＪ２８５をグルコース含有発酵培地中で発酵させて、Ｌ−トリプトファンを製造する段階。

本発明で使用される遺伝子操作はMolecular Cloning Laboratory Manual（T. Maniatis E.F., Flitch, J. Sambrook）にしたがう。

トリプトファン産生親株大腸菌ＣＪ１８１（ＫＦＣＣ１０９０２）を、トリプトファンアナログである０．３ｇ／ｌのＴＨＸを含有するプレート最少培地中、恒温下で５日間培養した。成長速度を増加させ、ＴＨＸに対するＣＪ１８１の感受性を解除するために、変異誘発物質である５００μｇ／ｍｌのＮＴＧを培地中に加えた。０．３ｇ／ｌのＴＨＸを含有する最少培地中で生育した任意の菌株を一次選択し、０．５ｇ／ｌのＴＨＸを含有する最少培地中でこれらの選択株を再度培養した。最後に、高度にＴＨＸ耐性である菌株を選択し、ＣＪ２８５と命名した。最少培地の成分を下記表1に示す。それぞれ１００ｍｇ／ｌの栄養要求性アミノ酸を培地に加えた。

大腸菌最少培地（Ｍ９培地）の組成

本発明の変異株ＣＪ２８５を３７℃のＬＢ培地中での１２時間振盪培養に付した。ＬＢ培地（ｐＨ＝７．４）は、１％のバクトトリプトン、０．５％のバクトイーストエクストラクト、および１％のＮａＣｌを含有した。培地からミコビオント（mycobiont）を収集し、Quiagen染色体ＤＮＡ単離キットを用いて染色体ＤＮＡを取得した。こうして得られた染色体ＤＮＡをエタノールに浸し、乾燥して精製した。鋳型であるこの精製済み染色体ＤＮＡをＰＣＲに付した。Quiagenゲル抽出キットを用いて、約１．３ｋｂ、２ｋｂ、５３０ｂｐ、および１．９ｋｂのａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ｔｒｐＲ、およびｔｙｒＲ変異遺伝子を１％のアガロースゲルからそれぞれ分離し、その遺伝子断片を精製して、クローニング用の遺伝子リソースとして使用した。ＴＯＰＯクローニングキット（Invitrogen Company製）を用いて、ＣＪ２８５株由来の前記変異遺伝子断片をｐＣＲ２．１−ＴＯＴＯベクターにクローニングし、その結果、該遺伝子を含有するクローンを同定した。

ａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ｔｒｐＲ、およびｔｙｒＲタンパク質をエンコードする遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列を決定するために、変異遺伝子（群）を含有するプラスミドを単離および精製し、プロモーターに続く配列、遺伝暗号領域、タンパク質合成終結コドンを含む遺伝子配列全体を決定した。本発明の遺伝子のＤＮＡ塩基配列を決定するために、前記単離精製済みプラスミドＤＮＡをシークエンシングプライマーおよびポリメラーゼと混合し、ＰＣＲによって増幅した。こうして増幅されたプラスミドＤＮＡをエタノールに浸して精製し、Ｈｉ−Ｄｉ溶液と混合した。結果として、プラスミドＤＮＡを、一本鎖を含有するｄｓＤＮＡに変換し、塩基配列解析装置ABI 3100（Applied Biosystem製）を用いてＤＮＡ塩基配列の解析を行った。ＤＮＡ塩基配列の解析は、U.S. NCBI（National Center for Biotechnology Information）ウェブサイトのBLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）検索プログラムおよびExPasyウェブサイトのTools PROGRAM（http://us.expasy.org/tools/dna.html）に基づいて実施した。その後、こうして決定された遺伝子の塩基配列を野生型遺伝子の塩基配列と比較して、何らかの変異が存在するかどうかを調べ、翻訳によって変異アミノ酸を同定した。

変異遺伝子ａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ｔｒｐＲ、およびｔｙｒＲの少なくとも１つを含有するＣＪ２８５変異株をグルコース含有発酵培地中で直接発酵させ、Ｌ−トリプトファンを生産させた。より具体的には、好気性条件（２００−３００ｒｐｍのフラスコ振盪または４００−１０００ｒｐｍの発酵槽、および気流の量＝０．５−１．５ｖｖｍ）、発酵温度＝３０℃およびｐＨ＝６．０〜８．０の条件下で前記変異株を培養し、生じたＬ−トリプトファンを培養培地中に蓄積させた。フラスコを使用する場合、３０℃および２２０ｒｐｍで４８−６０時間、変異株を培養し、生じたＬ−トリプトファンを培養培地中に蓄積させた。発酵槽を使用する場合は流加培養法（fed batch cultivation）を使用する。そしてグルコースを複数回追加供給して、Ｌ−トリプトファンを製造した。発酵培地の成分を下記表２に挙げる。

発酵培地の組成

培養培地のミコビオントの成長速度を調べるために、６００ｎｍで吸光度を測定した。また、ベルトラン（Bertrand）法に基づいて糖分析を実施した。同時に、ＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）を用いてＬ−トリプトファンの量を分析した。

本発明の好ましい実施態様を例証のために開示してきたが、特許請求の範囲に開示される本発明の範囲および思想から逸脱することなく種々の修飾、付加および置換が可能であることが当業者には認識されよう。

本発明では、大腸菌ＣＪ１８１においてＮＴＧを繰り返し処理することによって新規大腸菌変異株ＣＪ２８５（ＫＣＣＭ−１０５３４）を開発する。この菌株は、トリプトファンアナログであるヒドロキサム酸トリプトファンに耐性である。トリプトファン生合成に関連する変異遺伝子ａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ｔｒｐＲ、およびｔｙｒＲのＤＮＡ塩基配列およびアミノ酸を解析することによって、重要な変異を同定することができ、組換え株の開発において使用するのに適した変異遺伝子を取得することができる。さらに、親株ＣＪ１８１と比較して、該変異遺伝子の少なくとも１つを含有するその変異株ＣＪ２８５は多量（約１０％増）のトリプトファンを生産する能力を有する。したがって本発明のＣＪ２８５は、組換え株の開発用の適切な母株として、ならびにアミノ酸発酵産業および医薬品製造に関して非常に有益に使用することができる。

実施例１：ＴＨＸ耐性変異株ＣＪ２８５の選択
トリプトファン産生親株大腸菌ＣＪ１８１（ＫＦＣＣ１０９０２）を３７℃のＬＢ培地中での１２時間振盪培養に付し、滅菌生理食塩水溶液中で２回すすいだ。この場合、ＬＢ培地（ｐＨ＝７．４）は、１％のバクトトリプトン（Bacto-Trypton）、０．５％のバクトイーストエクストラクト（Bacto-yeast extract）、および１％のＮａＣｌを含有した。このＣＪ１８１を０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝５．５）中で希釈し、最終的にＯＤ＝１．０にした。０．３ｇ／ｌのＴＨＸを含有する最少培地（表１を参照のこと）中で５日間、ＣＪ１８１を培養した。成長速度を増加させ、ＴＨＸ耐性ＣＪ１８１を作成するために、変異誘発物質である５００μｇ／ｍｌのＮＴＧを培地中に加えた。溶液を３７℃恒温槽に入れて３０分間反応させ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）中で３回すすいだ。次いで、０．５ｇ／ｌのＴＨＸを含有する最少培地（表１を参照のこと）中で５日間、ＣＪ１８１を培養し、その結果、約１００コロニーを取得した。こうして得られた変異株および元の親株をフラスコ中のトリプトファン発酵試験の対象とした。結果的に、元の大腸菌親株ＣＪ１８１より優れたトリプトファン生産能力を特徴とする大腸菌ＣＪ２８５を選択することができた。該菌株からＬ−トリプトファン生産用の最良の菌株を単離し、三角フラスコに入れた。フラスコ中の菌株に関してトリプトファン生産試験を実施した後、下記実施例６に記載のように５Ｌ発酵槽中で発酵実験を実施した。

新規開発の人工変異株についてのフラスコ中での実験結果

表３に見られるように、大腸菌変異株ＣＪ２８５から生産されるＬ−トリプトファンの濃度は元の親株大腸菌ＫＦＣＣ１０９０２より高濃度であった。ＣＪ２８５は、２００３年１１月２８日付けでＫＣＣＭ（Korean Culture Center of Microorganisms）に寄託され、番号ＫＣＣＭ−１０５３４を付与された。

実施例２：変異株ＣＪ２８５のａｒｏＦ遺伝子クローニングおよび配列解析
ＣＪ２８５から単離された染色体ＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲによってａｒｏＦ遺伝子を増幅するために、下記プライマー（２１量体）を使用した。5'-GTATTTACCCCGTTATTGTC-3'をセンスプライマーとして使用し、5'-CACTTCAGCAACCAGTTCCAG-3'をアンチセンスプライマーとして使用した。ＰＣＲでは、約３０ｎｇのＣＪ２８５ゲノムＤＮＡおよび２５ｐｍｏｌの各プライマーを、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび反応バッファーを含有するAccupower PCR HL-Premixに加え、終濃度を２０μｌにした。ＰＣＲプログラムを２５回実行した。このプログラムは９４℃で５分間で開始され、その後３５秒、５５℃で４０秒間、および７２℃で９０秒間であった。最後に、最終伸長を７２℃で７分間実施した。次いでその結果を１％アガロースゲル電気泳動によって検査した。

遺伝子断片をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにクローニングするために、Quiagenゲル抽出キットを用いて約１．３ｋｂ（ａｒｏＦ変異遺伝子のサイズに相当する）の遺伝子断片を１％アガロースゲルから単離した。次いで、こうして得られた遺伝子断片を精製し、クローニング用の遺伝子リソースとして使用した。ＴＯＰＯクローニングキット（Invitrogen Company製）を使用することによって、ＣＪ２８５株から得られた変異遺伝子断片をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター溶液と１：４の割合で混合した。その後、１μｌの生理食塩水溶液を混合物に加え、室温で２０分間反応を継続した。この反応溶液を、キットに含まれる４０μｌのＴＯＰ１０コンピテント細胞と混合し、氷中に２０分間置いた。以後、４２℃で３０秒間熱ショックを適用し、すぐに、再度氷中に２分間溶液を入れた。２５０μｌのＳＯＣ培地を加え、３７℃で１時間変異遺伝子を培養した。５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に１００μｌの培養培地を塗布し、３７℃で約１２時間、変異遺伝子を培養した。白色コロニーのみを選択し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ液体培地中で再度約１２時間培養した。プラスミドを単離し、ＥｃｏＲＩ制限酵素で２時間処理し、１％アガロースゲル電気泳動によって展開した。ＵＶイルミネーターを使用して、変異遺伝子（群）を含有するクローンを同定した。

遺伝子のＤＮＡ塩基配列を決定するために、前記同定クローンからプラスミドを単離し、精製した。その単離精製済みプラスミドを下記物質と混合した：相補的水素結合によってａｒｏＦ遺伝子と結合できる２ｐｍｏｌの配列解析用プライマー、２μｌのBig dye含有ポリメラーゼ、および１μｌのプラスミドＤＮＡ（約２００ｎｇ）。次いで、はじめに９６℃で３０秒間、５０℃で１５秒間、および６０℃で４分間で、２５回、ＰＣＲを実行した。プラスミドＤＮＡをエタノールに浸して精製し、１０μｌのＨｉ−Ｄｉ溶液と混合した。結果として、プラスミドＤＮＡを、一本鎖を含有するｄｓＤＮＡに変換し、塩基配列解析装置ABI 3100（Applied Biosystem製）を用いてＤＮＡ塩基配列の解析を実施した。ＤＮＡ塩基配列の解析は、U.S. NCBI（National Center for Biotechnology Information）ウェブサイトのBLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）検索プログラムおよびExPasyウェブサイトのTools PROGRAM（http://us.expasy.org/tools/dna.html）に基づいて実施した。その後、こうして決定された遺伝子の塩基配列を野生型遺伝子の塩基配列と比較して、何らかの変異が存在するかどうかを調べ、翻訳によって変異アミノ酸を同定した。

実施例３：変異株ＣＪ２８５のａｒｏＧ遺伝子クローニングおよび配列解析
ＣＪ２８５から単離された染色体ＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲによってａｒｏＧ遺伝子を増幅するために、下記プライマー（２１量体）を使用した。5'-GTATTTACCCCGTTATTGTC-3'（配列番号５）をセンスプライマーとして使用し、5'-ACTCCGCCGGAAGTGACTAA-3'（配列番号６）をアンチセンスプライマーとして使用した。ＰＣＲでは、約３０ｎｇのＣＪ２８５ゲノムＤＮＡおよび２５ｐｍｏｌの各プライマーを、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび反応バッファーを含有するAccupower PCR HL-Premixに加え、終濃度を２０μｌにした。ＰＣＲプログラムを２５回実行した。このプログラムは９４℃で５分間で開始され、その後３５秒、５５℃で４０秒間、および７２℃で２分２０秒間であった。最後に、最終伸長を７２℃で７分間実施した。次いでその結果を１％アガロースゲル電気泳動によって検査した。

遺伝子断片をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにクローニングするために、Quiagenゲル抽出キットを用いて約２ｋｂ（ａｒｏＧ変異遺伝子のサイズに相当する）の遺伝子断片を単離した。次いで、こうして得られた遺伝子断片を精製し、クローニング用の遺伝子リソースとして使用した。この時点以後の実験手順および塩基配列の決定後の塩基配列解析は実施例２と同一である。

実施例４：変異株ＣＪ２８５のｔｒｐＲ遺伝子クローニングおよび配列解析
ＣＪ２８５から単離された染色体ＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲによってｔｒｐＲ遺伝子を増幅するために、下記プライマー（２１量体）を使用した。5'-CGCCACGGAATGGGGACGTCG-3'（配列番号７）をセンスプライマーとして使用し、5'-CCGCGTCTTATCATGCCTACC-3'（配列番号８）をアンチセンスプライマーとして使用した。ＰＣＲでは、約３０ｎｇのＣＪ２８５ゲノムＤＮＡおよび２５ｐｍｏｌの各プライマーを、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび反応バッファーを含有するAccupower PCR HL-Premixに加え、終濃度を２０μｌにした。ＰＣＲプログラムを２５回実行した。このプログラムは９４℃で５分間で開始され、その後１分、６０℃で３０秒間、および７２℃で１分間であった。最後に、最終伸長を７２℃で７分間実施した。次いでその結果を１％アガロースゲル電気泳動によって検査した。

遺伝子断片をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにクローニングするために、Quiagenゲル抽出キットを用いて約５３０ｂｐ（ｔｒｐＲ変異遺伝子のサイズに相当する）の遺伝子断片を単離した。次いで、こうして得られた遺伝子断片を精製し、クローニング用の遺伝子リソースとして使用した。この時点以後の実験手順および塩基配列の決定後の塩基配列解析は実施例２と同一である。

実施例５：変異株ＣＪ２８５のｔｙｒＲ遺伝子クローニングおよび配列解析
ＣＪ２８５から単離された染色体ＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲによってｔｙｒＲ遺伝子を増幅するために、下記プライマー（２１量体）を使用した。5'-GGATTGACGATGACAAACCT-3'（配列番号９）をセンスプライマーとして使用し、5'-CTGGTGGATGAAATCACCAC -3'（配列番号１０）をアンチセンスプライマーとして使用した。ＰＣＲでは、約３０ｎｇのＣＪ２８５ゲノムＤＮＡおよび２５ｐｍｏｌの各プライマーを、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび反応バッファーを含有するAccupower PCR HL-Premixに加え、終濃度を２０μｌにした。ＰＣＲプログラムを２５回実行した。このプログラムは９４℃で５分間で開始され、その後１分、５３℃で３０秒間、および７２℃で２分２０秒間であった。最後に、最終伸長を７２℃で７分間実施した。次いでその結果を１％アガロースゲル電気泳動によって検査した。

遺伝子断片をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにクローニングするために、Quiagenゲル抽出キットを用いて約１．９ｋｂ（ｔｙｒＲ変異遺伝子のサイズに相当する）の遺伝子断片を単離した。次いで、こうして得られた遺伝子断片を精製し、クローニング用の遺伝子リソースとして使用した。この時点以後の実験手順および塩基配列の決定後の塩基配列解析は実施例２と同一である。

実施例６：５Ｌ発酵槽での変異株ＣＪ２８５の発酵
実施例２〜５に開示される塩基配列を有する変異遺伝子の少なくとも１つを含有する大腸菌ＣＪ２８５、および親株ＣＪ１８１（ＫＦＣＣ１０９０２）を５Ｌ発酵槽で流加培養した（発酵温度＝３０℃、培養ｐＨ＝６．９−７．１（ｐＨはアンモニア水によって調節できる）、気流の量＝０．５−１．０ｖｖｍ、および撹拌速度＝５００−７００ｒｐｍ）。ＣＪ２８５の発酵濃度は２８．２ｇ／ｌであり、親株ＣＪ１８１の発酵濃度は２５．１ｇ／ｌであることが判明した。したがって大腸菌ＣＪ２８５の発酵時間はわずかに減少し、Ｌ−トリプトファン生産性の毎時約１０％の増加が生じた。

５Ｌ発酵槽でのＣＪ２８５変異株の発酵

上記および他の本発明の目的、特徴および他の利点は、添付の図面と併せて解釈される下記の詳細な説明からさらに明確に理解されよう。

図１は、ａｒｏＦ遺伝子の内部配列中のＣＣＴが［ＴＣＴ］に変異し、その結果、２８０番目のアミノ酸プロリンがセリンに変化している変異遺伝子（配列番号１）を示す；図２は、ａｒｏＧ遺伝子のプロモーター領域のＴ塩基が［Ｃ］塩基に変異し、該遺伝子の内部配列中のＧＴＧが［ＧＣＧ］に変異し、ＴＧＣが［ＣＧＣ］に変異し、その結果、それぞれ、５７番目のアミノ酸バリンがアラニンに変化し、６１番目のアミノ酸システインがアルギニンに変化している変異遺伝子（配列番号２）を示す；図３は、ｔｒｐＲ遺伝子の内部配列中の７０４番目のＧ塩基が欠失し、その結果、タンパク質翻訳時のフレームが変化し、野生型遺伝子と比べて２３アミノ酸[cgattgattttgtaggcctgataagacgtggcgcatcaggcatcgtgcaccgaatgccggatgcggcgtga]が追加されている変異遺伝子（配列番号３）を示す；ならびに図４は、ｔｙｒＲ遺伝子の内部配列中のＧＧＣが［ＧＡＣ］に変異し、ＣＴＧが［ＣＴＡ］に変異し、その結果、２５番目アミノ酸グリシンがアスパラギン酸に変化し、８６番目のアミノ酸ロイシンがナンセンス変異に変化している変異遺伝子（配列番号４）を示す。

Claims

トリプトファン生合成に関連するａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ｔｒｐＲ、およびｔｙｒＲからなる変異遺伝子の少なくとも１つを含有するＬ−トリプトファン産生大腸菌変異株。
大腸菌変異株が大腸菌ＣＪ２８５ＫＣＣＭ−１０５３４である、請求項１に記載の変異株。
請求項１または請求項２の大腸菌変異株を使用するＬ−トリプトファンの製造方法。