KR20230041499A - 식물 생장 촉진 효능을 가지는 미세조류 균주 및 이의 용도 - Google Patents
식물 생장 촉진 효능을 가지는 미세조류 균주 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 출원은 식물 생장 촉진 효능을 가지는 신규한 미세조류 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 일 양상에 따른 신규한 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) CD02-3002 균주는 발효배기가스의 존재 하에서 배양 시 성장속도가 빠르고 광합성 효율이 높아 미생물 발효에 의한 배기가스를 효율적으로 저감시킬 수 있고, 상기 균주의 배양물 또는 배양 상등액 등을 식물에 처리하면 식물의 생장을 촉진하는 효능이 있어 식물용 비료로 사용될 수 있는 바, 친환경적이고 산업적 활용도가 높은 새로운 탄소 저감 기술로 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 출원은 식물 생장 촉진 효능을 가지는 신규한 미세조류 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
바이오 산업의 규모가 확대되면서 미생물의 발효 기술을 기반으로 다양한 산물을 만들어낼 수 있게 되었고, 특히, 최근 White Bio 분야의 성장에 따라 미생물 발효 분야의 산업도 크게 성장하고 있다. 다만, 발효는 기본적으로 이산화탄소를 배출하는 공정이기 때문에, 미생물 발효 분야의 산업이 발달하면서 발효로 인하여 발생하는 온실가스의 배출량이 크게 증대된다는 문제점이 수반되고 있다. 이와 더불어 전세계적으로 기후 변화 이슈가 대두되면서, 기후변화의 주요 원인으로 지목되는 온실가스를 저감하기 위한 노력이 다각도로 진행되고 있는 바, 미생물 발효에 의해 발생하는 온실가스를 저감하는 것 또한 주요 과제가 되고 있다.
현재까지 주로 온실가스의 배출 자체를 억제하여 탄소 저감에 기여할 수 있는 기술들이 상용화되어 있으나, 미생물 발효 공정 상에서 이산화탄소의 배출량을 감소시키는 것은 매우 어려운 일로 여겨지고 있다. 또한, 아직까지 온실가스를 직접 포집하여 저감할 수 있는 기술 개발은 미미한 수준이며, 특히, 이산화탄소는 대기 중에 매우 낮은 농도로 존재하고 반응성도 매우 낮은 안정한 물질이기 때문에 이미 배출된 이산화탄소를 저감하는 기술을 개발하는데 어려움이 있다. 이와 관련하여, 생물학적 탄소 저감 기술의 일종으로 광합성이 가능한 생물을 이용하는 방법이 고려될 수 있으나, 탄소 저감 목적 외에 수익구조가 불분명하여 실제 산업에 적용하기 어렵다는 문제가 있다. 이에, 환경친화적인 방법으로 미생물 발효에 의해 발생하는 이산화탄소를 감소시킬 수 있으면서도 산업적으로 적용 가능한 탄소 저감 기술의 개발이 필요한 실정이다.
본 출원의 목적은 수탁번호 KCTC14659BP로 기탁되고, 식물 생장 촉진 효능을 가지는 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) CD02-3002 균주를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은 수탁번호 KCTC14659BP로 기탁되고, 식물 생장 촉진 효능을 가지는 클로렐라 불가리스 CD02-3002 균주; 상기 균주의 배양물 또는 배양 상등액; 상기 배양물 또는 배양 상등액의 농축물; 상기 배양물, 배양 상등액 또는 농축물의 건조물; 및 상기 건조물의 파쇄물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 식물 생장 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 식물 생장 촉진용 조성물을 포함하는 식물용 비료를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 수탁번호 KCTC14659BP로 기탁되고, 식물 생장 촉진 효능을 가지는 클로렐라 불가리스 CD02-3002 균주를 발효배기가스의 존재 하에 배양하는 단계를 포함하는, 클로렐라 불가리스 CD02-3002 균주를 배양하는 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 수탁번호 KCTC14659BP로 기탁되고, 식물 생장 촉진 효능을 가지는 클로렐라 불가리스 CD02-3002 균주; 상기 균주의 배양물 또는 배양 상등액; 상기 배양물 또는 배양 상등액의 농축물; 상기 배양물, 배양 상등액 또는 농축물의 건조물; 및 상기 건조물의 파쇄물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 식물 생장 촉진용 조성물을 제조하는 단계; 및 상기 식물 생장 촉진용 조성물을 식물에 접촉시키는 단계를 포함하는, 식물 생장을 촉진하는 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 수탁번호 KCTC14659BP로 기탁되고, 식물 생장 촉진 효능을 가지는 클로렐라 불가리스 CD02-3002 균주의 식물용 비료 제조를 위한 용도, 또는 식물 생장 촉진을 위한 용도를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 수탁번호 KCTC14659BP로 기탁되고, 식물 생장 촉진 효능을 가지는 클로렐라 불가리스 CD02-3002 균주; 상기 균주의 배양물 또는 배양 상등액; 상기 배양물 또는 배양 상등액의 농축물; 상기 배양물, 배양 상등액 또는 농축물의 건조물; 및 상기 건조물의 파쇄물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 조성물의 식물 생장 촉진을 위한 식물용 비료 제조를 위한 용도, 또는 식물 생장 촉진을 위한 용도를 제공하는 것이다.
본 출원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.
일 양상은 수탁번호 KCTC14659BP로 기탁되고, 식물 생장 촉진 효능을 가지는 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) CD02-3002 균주를 제공한다.
상기 식물은 애기장대(Arabidopsis) 속의 식물인 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 애기장대 속 식물은 애기장대(Arabidopsis thaliana)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어, "식물 생장"은 식물의 씨앗이 발아하여 뿌리, 줄기, 잎을 내거나 또는 그 후 점차 크기와 무게를 더해가는 과정을 의미하며, 용어, "식물 생장 촉진"은 식물의 씨앗의 발아 또는 발아된 식물의 크기 및/또는 무게의 증가를 촉진하는 것을 의미한다.
상기 클로렐라 불가리스 CD02-3002 균주는 서열번호 1의 18S rRNA 염기서열을 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 클로렐라 불가리스 CD02-3002 균주는 서열번호 1의 염기서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 염기서열로 구성되는 18S rRNA를 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 양상은 수탁번호 KCTC14659BP로 기탁되고, 식물 생장 촉진 효능을 가지는 클로렐라 불가리스 CD02-3002 균주; 상기 균주의 배양물 또는 배양 상등액; 상기 배양물 또는 배양 상등액의 농축물; 상기 배양물, 배양 상등액 또는 농축물의 건조물; 및 상기 건조물의 파쇄물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 식물 생장 촉진용 조성물을 제공한다.
상기 클로렐라 불가리스 CD02-3002 균주는 상기한 바와 같다.
상기 균주의 "배양물"은 상기 균주를 배양하여 생성된 산물을 지칭하는 것으로, 구체적으로 균주를 포함하는 배양액일 수 있고, 상기 "배양 상등액"은 상기 균주의 배양물 또는 배양액으로부터 균주가 제거된 배양 여액일 수 있다. 상기 "농축물"은 상기 배양물 또는 배양 상등액을 농축한 것을 의미할 수 있다. 상기 "건조물"은 상기 균주의 배양물, 배양 상등액 또는 이의 농축물에서 수분이 제거된 것으로, 예를 들어, 상기 균주의 건조 균체 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 건조물의 "파쇄물"은 상기 수분이 제거된 건조물을 파쇄한 결과물을 총칭하는 것으로, 예를 들어 상기 균주의 건조 균체 분말일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 균주의 배양물은 배양 배지에 상기 균주를 접종하고, 당업계에 공지된 배양 방법에 따라 제조될 수 있고, 또는 상기 균주를 발효배기가스의 존재 하에 배양하는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다. 상기 농축물, 이의 건조물 또는 이의 파쇄물은 당업계에 공지된 미세조류 또는 이의 배양물의 처리 또는 건조 방법에 따라 제조될 수 있다.
상기 식물은 애기장대(Arabidopsis) 속의 식물인 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 애기장대 속 식물은 애기장대(Arabidopsis thaliana)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 식물 생장 촉진용 조성물은, 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 동결보호제, 또는 부형제 등을 함유할 수 있다.
상기 보존제, 안정화제, 또는 부형제는 상기 조성물의 품질 저하(deterioration)를 감소시키는데 충분한 유효량으로 조성물에 포함되는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "품질 저하"는 조성물 등에 포함되는 클로렐라 불가리스 CD02-3002 균주의 수 감소, 활성 감소, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다.
예를 들어, 상기 조성물은 조성물의 품질 저하를 감소시키는데 충분한 유효량의 보존제, 안정화제, 또는 부형제를 포함함으로써, 자연 상태에 존재하는 클로렐라 불가리스 CD02-3002 균주와 다르게, 조성물 내에서 클로렐라 불가리스 CD02-3002 균주가 보다 오랜 기간 동안 생존하거나 활성이 유지되는 것일 수 있다.
상기 보존제, 안정화제, 또는 부형제는 상기 조성물의 품질 저하를 감소시킬 수 있는 것이라면, 당업계에서 통상적으로 사용되는 것들이 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 안정화제는 알긴산염(alginate), 알긴산 나트륨(sodium alginate), 카제인, 카제인 나트륨, 셀룰로스, 메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스(carboxymethylcellulose), 카르복시메틸셀룰로스 나트륨(sodium carboxymethylcellulose), 펙틴, 젤라틴, 아라비아검, 잔탄검, 덱스트란, 사이클로덱스트린 및 전분으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 동결보호제는 상기 조성물이 동결건조된 상태일 때, 조성물의 품질 저하를 감소시키는데 충분한 유효량으로 조성물에 포함되는 것일 수 있다. 예를 들어, 자연 상태에 존재하는 클로렐라 불가리스 CD02-3002 균주와 다르게, 상기 조성물은 동결건조된 상태에서 조성물의 품질 저하를 감소시키는데 충분한 유효량의 동결보호제를 포함함으로써, 동결건조된 조성물 내에서 클로렐라 불가리스 CD02-3002 균주가 보다 오랜 기간 동안 생존하거나 활성이 유지되는 것일 수 있다.
상기 동결보호제는 동결건조된 상태인 조성물의 품질 저하를 감소시키기 위한 것이라면, 당업계에서 통상적으로 사용되는 것들이 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 동결보호제는 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 디메틸설폭시드(dimethyl sulfoxide: DMSO), 글루코스, 트레할로스, 말토덱스트린, 덱스트린, 스킴 밀크 및 전분으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 조성물은 침주, 분무 또는 혼합하여 식물의 비료에 첨가될 수 있다.
또 다른 양상은 상기 식물 생장 촉진용 조성물을 포함하는 식물용 비료를 제공한다.
상기 식물 생장 촉진용 조성물은 상기한 바와 같다.
상기 식물은 애기장대(Arabidopsis) 속의 식물인 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 애기장대 속 식물은 애기장대(Arabidopsis thaliana)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 식물용 비료는 당업계에서 통상적으로 사용되는 제조방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 식물용 비료는 당업계에서 통상적으로 사용되는 부형제 또는 담체를 더 포함할 수 있고, 당업계에 공지된 통상적인 식물용 비료의 제형으로 제조될 수 있다.
상기 식물용 비료는 화학비료를 대체할 수 있는 친환경 비료일 수 있다.
상기 식물용 비료는 식물의 생장을 촉진하기 위해 사용될 수 있다.
또 다른 양상은 수탁번호 KCTC14659BP로 기탁되고, 식물 생장 촉진 효능을 가지는 클로렐라 불가리스 CD02-3002 균주를 발효배기가스의 존재 하에 배양하는 단계를 포함하는, 클로렐라 불가리스 CD02-3002 균주를 배양하는 방법을 제공한다.
상기 클로렐라 불가리스 CD02-3002 균주는 상기한 바와 같다.
상기 발효배기가스는 0.5 내지 20 %(v/v)의 이산화탄소를 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 발효배기가스는 0.5 내지 18%(v/v), 0.5 내지 16%(v/v), 0.5 내지 14%(v/v), 0.5 내지 12%(v/v), 0.8 내지 18%(v/v), 0.8 내지 16%(v/v), 0.8 내지 14%(v/v), 또는 0.8 내지 12%(v/v)의 이산화탄소를 포함하는 것일 수 있다.
상기 발효배기가스는 미생물 발효에 의해 발생된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 발효배기가스는 미생물 발효에 의해 발생된 이산화탄소를 포함하는 것일 수 있다. 상기 미생물은 발효 또는 배양 과정 중에 이산화탄소를 발생시키는 모든 미생물을 제한없이 포함할 수 있다.
상기 배양하는 단계는 발효배기가스를 발효조에 공급하면서 수행하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 발효배기가스는 미생물 발효에 의해 발생된 가스를 여과하여 발효조에 공급하는 것일 수 있다. 상기 발효배기가스는 발효조에 0.001 내지 1 vvm의 속도로 공급되는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 발효배기가스는 발효조에 0.001 내지 1 vvm, 0.001 내지 0.7 vvm, 0.001 내지 0.5 vvm, 0.001 내지 0.3 vvm, 0.001 내지 0.2 vvm, 0.005 내지 1 vvm, 0.005 내지 0.7 vvm, 0.005 내지 0.5 vvm, 0.005 내지 0.3 vvm, 0.005 내지 0.2 vvm, 0.01 내지 1 vvm, 0.01 내지 0.7 vvm, 0.01 내지 0.5 vvm, 0.01 내지 0.3 vvm, 또는 0.01 내지 0.2 vvm의 속도로 공급되는 것일 수 있다.
상기 배양하는 단계는 20 내지 40℃에서 수행하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 배양하는 단계는 20 내지 30℃에서 수행하는 것일 수 있다.
상기 배양하는 단계는 빛의 존재 하에서 수행하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 배양하는 단계는 클로렐라 불가리스 CD02-3002 균주가 성장하기에 충분한 양의 광원을 조사하면서 수행하는 것일 수 있다. 상기 광원은 예를 들어 LED 광원일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 배양하는 단계는 30일 이하로 수행하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 배양하는 단계는 3 내지 30일, 3 내지 20일, 3 내지 15일, 3 내지 12일, 또는 3 내지 10일 동안 수행하는 것일 수 있다.
상기 배양하는 단계는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 본 출원의 클로렐라 불가리스 CD02-3002 균주의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 클로렐라 불가리스 균주의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있고, 예를 들어, BG-11 배지를 사용할 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 클로렐라 불가리스 CD02-3002 균주를 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다. 구체적으로, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH를 조절할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 양상은 수탁번호 KCTC14659BP로 기탁되고, 식물 생장 촉진 효능을 가지는 클로렐라 불가리스 CD02-3002 균주; 상기 균주의 배양물 또는 배양 상등액; 상기 배양물 또는 배양 상등액의 농축물; 상기 배양물, 배양 상등액 또는 농축물의 건조물; 및 상기 건조물의 파쇄물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 식물 생장 촉진용 조성물을 제조하는 단계; 및 상기 식물 생장 촉진용 조성물을 식물에 접촉시키는 단계를 포함하는, 식물 생장을 촉진하는 방법을 제공한다.
상기 클로렐라 불가리스 CD02-3002 균주, 및 상기 식물 생장 촉진용 조성물은 상기한 바와 같다.
상기 클로렐라 불가리스 CD02-3002 균주의 배양물 또는 배양 상등액은 당업계에 공지된 적합한 방법을 이용하여 회수하는 것일 수 있다. 또한, 상기 식물 생장 촉진용 조성물을 제조하는 단계는 당업계에 공지된 적합한 방법을 이용하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있고, 정제 공정을 더 포함하는 것일 수 있으며, 당업계에 공지된 미세조류 또는 이의 배양물의 농축, 건조 등의 방법을 포함할 수 있다.
상기 접촉시키는 단계는 상기 식물 생장 촉진용 조성물을 토양, 식물, 또는 식물의 종자에 처리하는 방법에 의해 수행되는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 접촉시키는 단계는 상기 식물 생장 촉진용 조성물을 식물의 잎에 분무하는 방법으로 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 양상은 수탁번호 KCTC14659BP로 기탁되고, 식물 생장 촉진 효능을 가지는 클로렐라 불가리스 CD02-3002 균주의 식물용 비료 제조를 위한 용도, 또는 식물 생장 촉진을 위한 용도를 제공한다.
또 다른 양상은 수탁번호 KCTC14659BP로 기탁되고, 식물 생장 촉진 효능을 가지는 클로렐라 불가리스 CD02-3002 균주; 상기 균주의 배양물 또는 배양 상등액; 상기 배양물 또는 배양 상등액의 농축물; 상기 배양물, 배양 상등액 또는 농축물의 건조물; 및 상기 건조물의 파쇄물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 조성물의 식물 생장 촉진을 위한 식물용 비료 제조를 위한 용도, 또는 식물 생장 촉진을 위한 용도를 제공한다.
일 양상에 따른 신규한 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) CD02-3002 균주는 발효배기가스의 존재 하에서 배양 시 성장속도가 빠르고 광합성 효율이 높아 미생물 발효에 의한 배기가스를 효율적으로 저감시킬 수 있고, 상기 균주의 배양물 또는 배양 상등액 등을 식물에 처리하면 식물의 생장을 촉진하는 효능이 있어 식물용 비료로 사용될 수 있는 바, 친환경적이고 산업적 활용도가 높은 새로운 탄소 저감 기술로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 클로렐라 불가리스 균주 각 4종의 배양 후 건조세포중량(dry cell weight: DCW)을 측정한 결과 그래프이다.
도 2는 DW, BG-11 액체배지, Acadian 29, 또는 클로렐라 불가리스 균주 각 4종의 배양 상등액의 희석액을 각각 처리한 후, 애기장대의 지상부 무게를 측정한 결과 그래프이다.
도 2는 DW, BG-11 액체배지, Acadian 29, 또는 클로렐라 불가리스 균주 각 4종의 배양 상등액의 희석액을 각각 처리한 후, 애기장대의 지상부 무게를 측정한 결과 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 신규한 야생형 녹조류의 분리
대한민국 경기도 수원시의 하천 총 5개 지역으로부터 시료를 채취하고, 다이렉트 플레이팅(direct plating) 기법을 이용하여 녹조류(green algae)에 속하는 미세조류를 분리하였다.
구체적으로, 시료를 채취 후 2~3일 이내에 이로부터 미세조류를 분리하였으며, 현미경 관찰을 통해 녹색을 띄며 구형의 형태(morphology)를 포함하는 시료를 미생물 분리용 BG-11 고체배지(1.5 g/L NaNO3, 40 mg/L K2HPO4, 75 mg/L MgSO4·7H2O, 36 mg/L CaCl2·2H2O, 6 mg/L citric acid·H2O, 6 mg/L ferric ammonium citrate, 1 mg/L Na2EDTA·2H2O, 20 mg/L Na2CO3, 2.86 mg/L H3BO3, 1.81 mg/L MnCl2·4H2O, 0.22 mg/L ZnSO4·7H2O, 0.39 mg/L Na2MoO4·2H2O, 0.079 mg/L CuSO4·5H2O, 0.049 mg/L Co(NO3)2·6H2O, 15 g/L agar)에 도말하였다. 얻어진 콜로니들은 항생제 칵테일 믹스(cocktail mix) 용액(0~500 mg/L Streptomycin sulfate, 0~500 mg/L Ampicillin, 0~500 mg/L Kanamycin sulfate)의 농도를 조절하여 투입한 BG-11 고체배지에서 계대배양을 통하여 순수 분리하였다.
실시예 2. 분리한 미세조류의 DNA 서열 동정
상기 실시예 1에서 분리한 미세조류의 분자생물학적 동정을 위하여 18s rRNA 서열을 분석하였다.
구체적으로, 순수 분리된 콜로니로부터 DNA를 추출한 후, 18s rRNA 부분의 유전자 증폭용 프라이머(표 1)를 이용하여 PCR을 진행하였다.
| 서열번호 | 프라이머 | 서열 (5' -> 3') |
| 2 | 18s-F | CGACTTCTGGAAGGGACGTA |
| 3 | 18s-R | CTAGGTGGGAGGGTTTAATG |
PCR 반응은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 2분간 중합을 35회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합 반응을 수행하였다. 증폭된 반응액을 활용하여 염기서열을 분석한 결과, 약 1,565 bp 크기의 염기서열을 확보하였다(서열번호 1). 이를 NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 BLAST 검색한 결과, 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) KMMCC FC-42 균주와 99.68%의 상동성을 가지는 것을 확인하여, 상기 분리된 균주를 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) CD02-3002로 명명하고, 2021년 8월 23일자로 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures: KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC14659BP를 부여 받았다.
실시예 3. 발효배기가스 기반의 광배양 조건 하에서 클로렐라 불가리스 CD02-3002 균주의 성장능 확인
분리된 신규 균주 클로렐라 불가리스 CD02-3002가 발효배기가스 기반의 광배양 조건 하에서 성장 가능한 균주인지 확인하고자, 여러 종의 클로렐라 불가리스 균주들과 성장능을 비교 평가하였다.
대조군 균주로 UTEX Culture Collection of Algae at UT-Austin 기관에서 분양받은 클로렐라 불가리스 UTEX265 균주를 사용하였고, 비교군으로 상기 실시예 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 분리한 클로렐라 불가리스 CD11-2001 및 CD11-2003 균주를 사용하였다. 각각의 균주는 멸균된 BG-11 액체배지(1.5 g/L NaNO3, 40 mg/L K2HPO4, 75 mg/L MgSO4·7H2O, 36 mg/L CaCl2·2H2O, 6 mg/L citric acid·H2O, 6 mg/L ferric ammonium citrate, 1 mg/L Na2EDTA·2H2O, 20 mg/L Na2CO3, 2.86 mg/L H3BO3, 1.81 mg/L MnCl2·4H2O, 0.22 mg/L ZnSO4·7H2O, 0.39 mg/L Na2MoO4·2H2O, 0.079 mg/L CuSO4·5H2O, 0.049 mg/L Co(NO3)2·6H2O) 100 mL에 접종한 후, LED 광원으로 빛을 지속적으로 조사하고, 1~10%(v/v) 농도의 CO2를 0.01~0.1 vvm으로 공급하며 4~7일 간 배양하였다. 이후, 배양액을 멸균된 새 BG-11 액체배지 900 mL에 접종하였으며, LED 광원으로 빛을 지속적으로 조사하면서 3~5일 간 배양하였고, 상기 배양기간동안 발효배기가스를 공기 여과기(air filter)를 거쳐 상기 배양액에 0.01~0.5 vvm으로 직접 공급하였다. 발효배기가스는 대장균(Escherichia coli) CJ181 (KFCC 10902) 균주(미국 공개특허 US 2008/0299644 A1)를 5 L 발효조에서 배양온도 30℃, 배양 pH 6.9~7.1 (암모니아수로 pH 조정), 통기량 0.5~1.0 vvm 및 교반 속도 500~700 rpm을 유지하면서 유가식으로 배양하는 동안 발생하는 가스를 사용하였다.
배양 종료 후, 각각의 균주 배양액 10 mL를 0.45 μm 필터로 여과한 뒤, 60
오븐에서 24시간 동안 건조한 후, 여과 전 필터의 무게와, 여과 및 건조 이후 건조된 세포를 포함한 필터의 무게 차이를 계산하여 건조세포중량(dry cell weight: DCW) 값을 산출하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 클로렐라 불가리스 CD02-3002 균주가 분양받은 클로렐라 불가리스 균주(UTEX265)나 신규 분리한 다른 클로렐라 불가리스 균주들(CD11-2001 및 CD11-2003)에 비하여 현저히 높은 건조세포중량을 가지는 것을 확인하였다. 이를 통하여, 클로렐라 불가리스 CD02-3002 균주가 다른 클로렐라 불가리스 균주들에 비하여 발효배기가스 기반의 광배양 조건 하에서 성장속도가 가장 우수한 균주임을 알 수 있었다.
실시예 4. 클로렐라 불가리스 CD02-3002 균주의 배양 상등액의 식물 생장 촉진 효능 확인
클로렐라 불가리스 CD02-3002 균주의 배양 상등액의 식물 생장 촉진 효능을 확인하기 위하여, 애기장대(Arabidopsis thaliana)를 대상으로 생장 촉진 여부를 평가하였다.
구체적으로, 야생형 애기장대 종자를 70% 에탄올에서 1분, 1% NaOCl 용액에서 3분간 표면 살균 후, 멸균된 증류수로 씻어 준비하였다. 애기장대는 2일간 냉장보관(4℃) 후 상토(㈜동부팜한농)에 심은 뒤, 21℃ 항온기에서 12시간은 빛을 비추고, 12시간은 빛을 조사하지 않은 어두운 상태로 1주일 정도 재배하였다.
클로렐라 불가리스 UTEX265, CD11-2001, CD02-3002, 및 CD11-2003 총 4종 균주를 멸균된 BG-11 액체배지 200 mL에 접종 후, LED 광원을 조사하고 1~10%(v/v) CO2를 0.1 vvm으로 지속적으로 공급하면서 25℃에서 5~7일 간 배양하였다. 배양된 종 배양물(seed culture)을 멸균된 BG-11 액체배지 1.8 L에 접종하고 동일한 조건에서 최대 10일 동안 배양하였다. 배양 종료 후 배양물을 원심분리하여 각 균주의 배양 상등액을 수득하였다.
식물 생장 촉진 효능을 평가하기 위하여, 재배한 애기장대에 각 균주 배양 상등액의 10~1000 배 희석액을 1mL/plant 수준으로 처리하였으며, 4일 간격으로 3회 엽면시비하였다. 대조군으로 증류수(DW)를 동일하게 처리한 군으로 설정하였고, 비교군으로 미세조류 광배양에 사용한 배지(BG-11 액체배지) 또는 상용화되어 있는 해조추출물 액체비료(Acadian 29)를 동일하게 처리한 군을 추가하였다. 애기장대의 생장 측정 지표로 지상부 생체중(지상부 무게)을 측정하였다. 각 시험군 별 애기장대 8 개체로 반복실험을 진행하여 지상부 생체중의 평균값 및 표준편차를 계산하여 나타내었다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 다른 클로렐라 불가리스 균주들은 대조군에 비하여 생장 촉진 효능이 미미하거나 거의 없는 것으로 나타난 반면, 클로렐라 불가리스 CD02-3002 균주는 현저히 우수한 생장 촉진 효능을 나타냈으며, 이는 상용화 비료인 Acadian 29보다도 현저히 우수한 효능임을 알 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> CJ CheilJedang Corporation
<120> Microalgae strain having an effect of promoting plant growth and
uses thereof
<130> PN140168KR
<160> 3
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1565
<212> DNA
<213> Chlorella vulgaris
<400> 1
tcgacttcct ggaagggacg tatttattag ataaaaggcc gaccgggctc tgcccgactc 60
gcggtgaatc atgataactt cacgaatcgc atggccttgt gccggcgatg tttcattcaa 120
atttctgccc tatcaacttt cgatggtagg atagaggcct accatggtgg taacgggtga 180
cggaggatta gggttcgatt ccggagaggg agcctgagaa acggctacca catccaagga 240
aggcagcagg cgcgcaaatt acccaatcct gacacaggga ggtagtgaca ataaataaca 300
atactgggcc ttttcaggtc tggtaattgg aatgagtaca atctaaaccc cttaacgagg 360
atcaattgga gggcaagtct ggtgccagca gccgcggtaa ttccagctcc aatagcgtat 420
atttaagttg ctgcagttaa aaagctcgta gttggatttc gggtggggcc tgccggtccg 480
ccgtttcggt gtgcactggc agggcccacc ttgttgccgg ggacgggctc ctgggcttca 540
ctgtccggga ctcggagtcg gcgctgttac tttgagtaaa ttagagtgtt caaagcaggc 600
ctacgctctg aatacattag catggaataa cacgatagga ctctggccta tcctgttggt 660
ctgtaggacc ggagtaatga ttaagaggga cagtcggggg cattcgtatt tcattgtcag 720
aggtgaaatt cttggattta tgaaagacga actactgcga aagcatttgc caaggatgtt 780
ttcattaatc aagaacgaaa gttgggggct cgaagacgat tagataccgt cctagtctca 840
accataaacg atgccgacta gggatcggcg gatgtttctt cgatgactcc gccggcacct 900
tatgagaaat caaagttttt gggttccggg gggagtatgg tcgcaaggct gaaacttaaa 960
ggaattgacg gaagggcacc accaggcgtg gagcctgcgg cttaatttga ctcaacacgg 1020
gaaaacttac caggtccaga catagtgagg attgacagat tgagagctct ttcttgattc 1080
tatgggtggt ggtgcatggc cgttcttagt tggtgggttg ccttgtcagg ttgattccgg 1140
taacgaacga gacctcagcc tgctaaatag tcacggttgg ttctccagcc ggcggacttc 1200
ttagagggac tattggcgac tagccaatgg aagcatgagg caataacagg tctgtgatgc 1260
ccttagatgt tctgggccgc acgcgcgcta cactgatgca ttcaacgagc ctagccttgg 1320
ccgagaggcc cgggtaatct ttgaaactgc atcgtgatgg ggatagatta ttgcaattat 1380
taatcttcaa cgaggaatgc ctagtaagcg caagtcatca gcttgcgttg attacgtccc 1440
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attggcgacc gggtgcggtc tccgctctcg gccgccgaga agttcattaa accctcccac 1560
ctaga 1565
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18s-F (primer)
<400> 2
cgacttctgg aagggacgta 20
<210> 3
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18s-R (primer)
<400> 3
ctaggtggga gggtttaatg 20
Claims (10)
- 수탁번호 KCTC14659BP로 기탁되고, 식물 생장 촉진 효능을 가지는 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) CD02-3002 균주.
- 수탁번호 KCTC14659BP로 기탁되고, 식물 생장 촉진 효능을 가지는 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) CD02-3002 균주; 상기 균주의 배양물 또는 배양 상등액; 상기 배양물 또는 배양 상등액의 농축물; 상기 배양물, 배양 상등액 또는 농축물의 건조물; 및 상기 건조물의 파쇄물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 식물 생장 촉진용 조성물.
- 청구항 2의 식물 생장 촉진용 조성물을 포함하는 식물용 비료.
- 수탁번호 KCTC14659BP로 기탁되고, 식물 생장 촉진 효능을 가지는 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) CD02-3002 균주를 발효배기가스의 존재 하에 배양하는 단계를 포함하는, 클로렐라 불가리스 CD02-3002 균주를 배양하는 방법.
- 청구항 4에 있어서, 상기 발효배기가스는 0.5 내지 20 %(v/v)의 이산화탄소를 포함하는 것인, 클로렐라 불가리스 CD02-3002 균주를 배양하는 방법.
- 청구항 4에 있어서, 상기 발효배기가스는 미생물 발효에 의해 발생된 것인, 클로렐라 불가리스 CD02-3002 균주를 배양하는 방법.
- 청구항 4에 있어서, 상기 배양하는 단계는 20 내지 40℃에서 수행하는 것인, 클로렐라 불가리스 CD02-3002 균주를 배양하는 방법.
- 청구항 4에 있어서, 상기 배양하는 단계는 30일 이하로 수행하는 것인, 클로렐라 불가리스 CD02-3002 균주를 배양하는 방법.
- 수탁번호 KCTC14659BP로 기탁되고, 식물 생장 촉진 효능을 가지는 클로렐라 불가리스 CD02-3002 균주; 상기 균주의 배양물 또는 배양 상등액; 상기 배양물 또는 배양 상등액의 농축물; 상기 배양물, 배양 상등액 또는 농축물의 건조물; 및 상기 건조물의 파쇄물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 식물 생장 촉진용 조성물을 제조하는 단계; 및
상기 식물 생장 촉진용 조성물을 식물에 접촉시키는 단계를 포함하는, 식물 생장을 촉진하는 방법. - 청구항 9에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 상기 식물 생장 촉진용 조성물을 토양, 식물, 또는 식물의 종자에 처리하는 방법에 의해 수행되는 것인, 식물 생장을 촉진하는 방법.
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