CN117616111A - 具有促进植物生长作用的微藻类品系及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种具有促进植物生长功效的新型微藻类品系及其用途。当根据一个方面的新型小球藻(Chlorella vulgaris)CD02‑3002品系在发酵废气的存在下培养时生长快且光合作用的效率高，因此可有效减少由微生物发酵产生的废气。应用于植物时具有促进植物生长的作用，该品系的培养物或培养物上清液可用作植物的肥料，且因此，其可有利地用作新型减碳技术。

Description

具有促进植物生长作用的微藻类品系及其用途
技术领域
相关申请的交叉引用
本申请主张基于2021年9月17日提交的韩国专利申请第10-2021-0125207号的优先权，且相应的韩国专利申请文件中所公开的全部内容以引用的方式并入本文中作为本说明书的一部分。
本申请涉及一种具有促进植物生长作用的新型微藻类品系及其用途。
背景技术
随着生物产业规模的扩大，基于微生物的发酵技术可生产各种产品，且尤其随着近年来White Bio领域的发展，微生物发酵产业亦在发展。然而，由于发酵基本上是排放二氧化碳的过程，因此随着微生物发酵领域产业的发展，存在发酵产生的温室气体排放大大增加的问题。另外，随着气候变化问题在世界各地不断出现，人们正自不同角度努力减少被指出为气候变化的主要原因的温室气体，且因此减少微生物发酵产生的温室气体亦成为一个重要问题。
迄今为止，主要通过抑制温室气体本身的排放可促进减碳的技术已经商业化，但在微生物发酵过程中减少二氧化碳的排放被认为是非常困难的。另外，可直接捕获及减少温室气体的技术开发仍处于最低水平，特别是，由于二氧化碳在大气中以极低浓度存在且为具有极低反应性的稳定物质，因此开发用于减少已排放二氧化碳的技术存在困难。就此而言，作为一种生物减碳技术，可考虑使用光合生物的方法，但存在难以应用于实际产业的问题，因为除减碳目的之外的利润结构不明确。因此，需要开发工业上适用的减碳技术，同时能够以对环境友好的方式减少微生物发酵产生的二氧化碳。
发明内容
技术问题
本发明的一个目的为提供一种具有促进植物生长作用的小球藻(Chlorellavulgaris)CD02-3002品系，其保藏编号为KCTC14659BP。
本发明的另一个目的为提供一种用于促进植物生长的组合物，其包含选自由以下组成的组中的任一种或多种：具有促进植物生长作用的小球藻CD02-3002品系，该品系的保藏编号为KCTC14659BP；该品系的培养物或培养物上清液；该培养物或培养物上清液的浓缩物；该培养物、培养物上清液或浓缩物的干燥物；及该干燥物的裂解物。
本发明的另一目的为提供一种植物肥料，其包含用于促进植物生长的组合物。
本发明的另一目的为提供一种培养小球藻CD02-3002品系的方法，其包括在发酵废气的存在下培养具有促进植物生长作用的小球藻CD02-3002品系，该品系的保藏编号为KCTC14659BP。
本发明的另一目的为提供一种促进植物生长的方法，其包括制备用于促进植物生长的组合物，该组合物包含选自由以下组成的组中的任一种或多种：具有促进植物生长作用的小球藻CD02-3002品系，该品系的保藏编号为KCTC14659BP；该品系的培养物或培养物上清液；该培养物或培养物上清液的浓缩物；该培养物、培养物上清液或浓缩物的干燥物；及该干燥物的裂解物；以及使该用于促进植物生长的组合物与植物接触。
本发明的另一目的为提供一种具有促进植物生长作用的小球藻CD02-3002品系用于制造植物肥料的用途或用于促进植物生长的用途，该品系的保藏编号为KCTC14659BP。
本发明的另一目的为提供一种组合物用于制造植物肥料的用途或用于促进植物生长的用途，该组合物包含选自由以下组成的组中的任一种或多种：具有促进植物生长作用的小球藻CD02-3002品系，该品系的保藏编号为KCTC14659BP；该品系的培养物或培养物上清液；该培养物或培养物上清液的浓缩物；该培养物、培养物上清液或浓缩物的干燥物；及该干燥物的裂解物。
技术方案
本申请中所公开的各描述及实施方式可应用于各其他描述及实施方式。换言之，本申请中所公开的各种要素的所有组合均属于本发明的范围内。另外，可发现本发明的范围不受下文所描述的具体描述限制。此外，本领域技术人员可仅使用普通实验来识别或确认本申请中所描述的本发明的特定方面的许多等效物。此外，此类等效物意欲包含于本发明中。
本发明的一种实施方式提供一种具有促进植物生长作用的小球藻CD02-3002品系，其保藏编号为KCTC14659BP。
植物可为拟南芥属(Arabidopsis)植物。举例而言，拟南芥属植物可为拟南芥(Arabidopsis thaliana)，但不限于此。
本说明书中所使用的术语“植物生长(plant growth)”是指植物种子发芽以产生根、茎及叶，或此后大小及重量逐渐增加的过程，而术语“促进植物生长(promoting plantgrowth)”是指促进植物种子发芽或发芽植物的大小及/或重量增加。
小球藻CD02-3002品系可具有SEQ ID NO:1的18S rRNA核苷酸序列，但不限于此。举例而言，小球藻CD02-3002品系可具有由与SEQ ID NO:1的核苷酸序列具有80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、98％或更高或99％或更高的序列一致性的核苷酸序列组成的18S rRNA，但不限于此。
本发明的另一方面提供一种用于促进植物生长的组合物，其包含选自由以下组成的组中的任一种或多种：具有促进植物生长作用的小球藻CD02-3002品系，该品系的保藏编号为KCTC14659BP；该品系的培养物或培养物上清液；该培养物或培养物上清液的浓缩物；该培养物、培养物上清液或浓缩物的干燥物；及该干燥物的裂解物。
小球藻CD02-3002品系如上文所描述。
品系的“培养物(culture)”是指通过培养该品系产生的产物，且特定言之，可为包含该品系的培养溶液，而“培养物上清液(culture supernatant)”可为从该品系的培养物或培养溶液中移除该品系的培养物滤液。“浓缩物(concentrate)”可指培养物或培养物上清液的浓缩物。“干燥物(dried water)”为移除水分的品系的培养物、培养物上清液或其浓缩物，且举例而言，其可呈品系的干燥微生物细胞的形式，但不限于此。另外，干燥物的“裂解物(lysate)”为裂解移除水分的干燥物的所得物的通用术语，且举例而言，其可为品系的干燥微生物细胞粉末，但不限于此。品系的培养物可根据本领域中已知的培养方法，通过在培养基中接种该品系来制备，或可通过包括在发酵废气的存在下培养该品系的方法来制备。浓缩物、其干燥物或其裂解物可根据本领域中已知的微藻类的处理或干燥方法或其培养物制备。
植物可为拟南芥属植物。举例而言，拟南芥属植物可为拟南芥，但不限于此。
用于促进植物生长的组合物可含有防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、低温保护剂或赋形剂等。
防腐剂、稳定剂或赋形剂可以足以减少组合物恶化的有效剂量包含于组合物中。
本说明书中所使用的术语“恶化(deterioration)”可包括组合物中所包含的小球藻CD02-3002品系的数量减少、活性降低或其组合等。
举例而言，不同于自然界中存在的小球藻CD02-3002品系，组合物可为小球藻CD02-3002品系在组合物中存活或保持活性更长时间的组合物，其通过包含足以减少组合物恶化的有效剂量的防腐剂、稳定剂或赋形剂。
本领域中常用的防腐剂、稳定剂或赋形剂可不受限制地使用，只要其可减少组合物的恶化即可。举例而言，稳定剂可为选自由以下组成的组中的任一种或多种：海藻酸盐、海藻酸钠、酪蛋白、酪蛋白钠、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、果胶、明胶、阿拉伯胶、黄原胶、葡聚糖、环糊精及淀粉。
当组合物经冷冻干燥时，低温保护剂可以足以减少组合物恶化的有效剂量包含于组合物中。举例而言，不同于自然界中存在的小球藻CD02-3002品系，组合物可为小球藻CD02-3002品系在组合物中存活或保持活性更长时间的组合物，其通过包含足以减少组合物在冷冻干燥状态下恶化的有效剂量的低温保护剂。
本领域中常用的低温保护剂可不受限制地使用，只要其可减少组合物在冷冻干燥状态下的恶化即可。举例而言，低温保护剂可为选自由以下组成的组中的任一种或多种：甘油、乙二醇、丙二醇、二甲亚砜(DMSO)、葡萄糖、海藻糖、麦芽糊精、糊精、脱脂奶及淀粉。
组合物可通过浸渍、喷洒或混合添加至植物肥料中。
其他方面提供一种植物肥料，其包含用于促进植物生长的组合物。
用于促进植物生长的组合物如上文所描述。
植物可为拟南芥属植物。举例而言，拟南芥属植物可为拟南芥，但不限于此。
植物肥料可通过本领域中常用的制备方法制备。举例而言，植物肥料可进一步包含本领域中常用的赋形剂或载体，且可以本领域中已知的常见植物肥料的配方制备。
植物肥料可为能够替代化学肥料的环保肥料。
植物肥料可用于促进植物生长。
其他方面提供一种培养小球藻CD02-3002品系的方法，其包含在发酵废气的存在下培养具有促进植物生长作用的小球藻CD02-3002品系，该品系的保藏编号为KCTC14659BP。
小球藻CD02-3002品系如上文所描述。
发酵废气可包含0.5％至20％(v/v)的二氧化碳。举例而言，发酵废气可包含0.5％至18％(v/v)、0.5％至16％(v/v)、0.5％至14％(v/v)、0.5％至12％(v/v)、0.8％至18％(v/v)、0.8％至16％(v/v)、0.8％至14％(v/v)或0.8％至12％(v/v)的二氧化碳。
发酵废气可由微生物发酵产生。举例而言，发酵废气可包含由微生物发酵产生的二氧化碳。微生物可包括但不限于在发酵或培养过程中产生二氧化碳的所有微生物。
培养可通过将发酵废气供应至发酵槽中来进行。举例而言，发酵废气可通过过滤将微生物发酵产生的气体供应至发酵槽中。发酵废气可以0.001至1vvm的速率供应至发酵槽中。举例而言，发酵废气可以0.001至1vvm、0.001至0.7vvm、0.001至0.5vvm、0.001至0.3vvm、0.001至0.2vvm、0.005至1vvm、0.005至0.7vvm、0.005至0.5vvm、0.005至0.3vvm、0.005至0.2vvm、0.01至1vvm、0.01至0.7vvm、0.01至0.5vvm、0.01至0.3vvm或0.01至0.2vvm的速率供应至发酵槽中。
培养可在20至40℃下进行。举例而言，培养可在20至30℃下进行。
培养可在光存在下进行。举例而言，培养可在照射足够量用于小球藻CD02-3002品系生长的光源的同时进行。光源可为例如LED光源，但不限于此。
培养可进行30天或更短时间。举例而言，培养可进行3至30天、3至20天、3至15天、3至12天或3至10天。
培养可通过已知的分批培养方法、连续培养方法、分批补料培养方法等进行，但不特别限于此。用于培养本申请的小球藻CD02-3002品系的任何培养基及其他培养条件可不受特别限制地使用，只要其为用于培养常见小球藻品系的培养基即可，且举例而言，可使用BG-11培养基。具体地，本申请的小球藻CD02-3002品系可在含有适当碳源、氮源、磷源、无机化合物、氨基酸及/或维生素等的常见培养基中，通过调节温度、pH等来培养。具体地，可使用碱性化合物(例如：氢氧化钠、氢氧化钾或氨)或酸性化合物(例如：磷酸或硫酸)调节适当pH，但不限于此。
其他方面提供一种促进植物生长的方法，其包括制备用于促进植物生长的组合物，该组合物包含选自由以下组成的组中的任一种或多种：具有促进植物生长作用的小球藻CD02-3002品系，该品系的保藏编号为KCTC14659BP；该品系的培养物或培养物上清液；该培养物或培养物上清液的浓缩物；该培养物、培养物上清液或浓缩物的干燥物；及该干燥物的裂解物；及使该用于促进植物生长的组合物与植物接触。
小球藻CD02-3002品系及用于促进植物生长的组合物如上文所描述。
小球藻CD02-3002品系的培养物或培养物上清液可使用本领域中已知的适当方法回收。另外，制备用于促进植物生长的组合物可使用本领域中已知的适当方法。举例而言，可使用离心、过滤、阴离子交换色谱、结晶及HPLC等，且可进一步包含纯化，且其可包括本领域中已知的微藻类或其培养物的浓缩、干燥等的方法。
接触可通过将用于促进植物生长的组合物处理至土壤、植物或植物种子的方法进行。举例而言，接触可通过将用于促进植物生长的组合物喷洒至植物叶子的方法进行，但不限于此。
其他方面提供一种具有促进植物生长作用的小球藻CD02-3002品系用于制备植物肥料的用途或用于促进植物生长的用途，该品系的保藏编号为KCTC14659BP。
其他方面提供一种组合物用于制备植物肥料的用途或用于促进植物生长的用途，该组合物包含选自由以下组成的组中的任一种或多种：具有促进植物生长作用的小球藻CD02-3002品系，该品系的保藏编号为KCTC14659BP；该品系的培养物或培养物上清液；该培养物或培养物上清液的浓缩物；培养物、培养物上清液或浓缩物的干燥物；及该干燥物的裂解物。
有益效果
根据一个方面的新型小球藻CD02-3002品系在发酵废气存在下培养时，生长速率快且光合作用效率高，因此可有效减少因微生物发酵产生的废气，且将该品系的培养物或培养物上清液处理至植物上时，存在促进植物生长的作用，且因此可用作植物肥料，因此，其可有效地用作一种对环境友好且具有高工业用途的新的减碳技术。
附图说明
图1为在培养4种小球藻品系中的每种后测量细胞干重(DCW)的结果图。
图2为在分别处理4种DW、BG-11液体培养基、Acadian 29或小球藻中的每种的培养物上清液的稀释溶液后测量拟南芥的地上部分(顶部)重量的结果图。
具体实施方式
在下文中，将通过实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例旨在说明性地描述一或多个特定实施例，且本发明的范围不受这些实施例的限制。
实施例1.新型野生型绿藻的分离
从韩国京畿道水原市(Suwon,Gyeonggi-do,Korea)共5个河流区采集样品，且使用直接种植法分离属于绿藻的微藻。
具体地，在采集样品后，在2至3天内从其分离出微藻，且将显示绿色且包含球形形态的样品涂抹在BG-11固体培养基(1.5g/L NaNO3，40mg/L K2HPO4，75mg/L MgSO4·7H2O，36mg/L CaCl2·2H2O，6mg/L柠檬酸·H2O，6mg/L柠檬酸铁铵，1mg/L Na2EDTA·2H2O，20mg/LNa2CO3，2.86mg/L H3BO3，1.81mg/L MnCl2·4H2O，0.22mg/L ZnSO4·7H2O，0.39mg/LNa2MoO4·2H2O，0.079mg/L CuSO4·5H2O，0.049mg/L Co(NO3)2·6H2O，15g/L琼脂)上进行微生物分离。所获得的菌落在通过调整抗生素调配混合物溶液的浓度(0至500mg/L硫酸链霉素，0至500mg/L胺苄青霉素，0至500mg/L硫酸卡那霉素)而插入的BG-11固体培养基中通过继代培养完全分离。
实施例2.经分离的微藻的DNA序列的鉴别
为了对以上实施例1中分离的微藻进行分子生物学鉴别，对18S rRNA序列进行分析。
具体地，在从完全分离的菌落提取DNA后，使用引物扩增18S rRNA区域的基因(表1)，进行PCR。
[表1]
SEQ ID NO: 引物 序列(5'->3')
2 18s-F CGACTTCTGGAAGGGACGTA
3 18s-R CTAGGTGGGAGGGTTTAATG
PCR反应通过在95℃下变性5分钟，接着在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒且在72℃下聚合2分钟，重复35次，且接着在72℃下聚合5分钟来进行。作为利用扩增反应溶液分析核苷酸序列的结果，获得约1,565bp大小的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。作为在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上对其进行BLAST搜寻的结果，确认其与小球藻KMMCCFC-42品系具有99.68％的同源性，且经分离的品系命名为小球藻CD02-3002，于2021年8月23日保藏在布达佩斯条约(Budapest Treaty)下的国际保藏单位，位于韩国生命工学研究院(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)的韩国典型培养物保藏中心(Korean Collection for Type Cultures,KCTC)，保藏编号为KCTC14659BP。
实施例3.小球藻CD02-3002品系在基于发酵废气的光培养条件下的生长能力的确认
为了确认经分离的新型品系小球藻CD02-3002是否为能够在基于发酵废气的光培养条件下生长的品系，对各种小球藻品系的生长能力进行比较及评估。
使用从UT-Austin机构的UTEX培养中心接收的小球藻UTEX265品系作为对照品系，且使用通过如实施例1中所描述的相同方法分离的小球藻CD11-2001及CD11-2003品系作为比较组。将各品系接种于100mL经灭菌的BG-11液体培养基(1.5g/L NaNO3，40mg/L K2HPO4，75mg/L MgSO4·7H2O，36mg/L CaCl2·2H2O，6mg/L柠檬酸·H2O，6mg/L柠檬酸铁铵，1mg/LNa2EDTA·2H2O，20mg/L Na2CO3，2.86mg/L H3BO3，1.81mg/L MnCl2·4H2O，0.22mg/L ZnSO4·7H2O，0.39mg/L Na2MoO4·2H2O，0.079mg/L CuSO4·5H2O，0.049mg/L Co(NO3)2·6H2O)中，且随后培养4至7天，同时用LED光源连续照射，并且以0.01至0.1vvm供应1至10％(v/v)浓度的CO2。此后，将培养溶液接种至900mL新灭菌的BG-11液体培养基，且在LED光源连续照射光下培养3至5天，在培养期间，发酵废气在通过空气过滤器之后以0.01至0.5vvm直接供应至培养溶液。作为发酵废气，使用在发酵槽中分批补料培养大肠杆菌(Escherichia coli)CJ181(KFCC 10902)品系(美国专利公开US 2008/0299644A1)期间产生的气体，同时维持培养温度30℃，培养pH 6.9至7.1(用氨水调节pH)，充气量0.5至1.0vvm且搅拌速率500至700rpm。
在培养完成后，各品系培养溶液10mL用0.45μm过滤器过滤，随后在60℃烘箱中干燥24小时，且随后通过计算过滤前过滤器的重量与干燥后包含干燥细胞的过滤器的重量的差值来计算细胞干重(DCW)值。
因此，如图1所示，确认相较于接收的小球藻品系(UTEX265)或经分离的其他新型小球藻品系(CD11-2001及CD11-2003)，小球藻CD02-3002品系的细胞干重显著较高。经由此，可发现相较于其他小球藻品系，小球藻CD02-3002品系是在基于发酵废气的光照培养条件下生长速率最优异的品系。
实施例4.小球藻CD02-3002品系的培养物上清液促进植物生长作用的确认
为了确认小球藻CD02-3002品系的培养物上清液促进植物生长的作用，对拟南芥的促进生长进行评估。
具体地，野生型拟南芥种子通过在70％乙醇中1分钟及1％ NaOCl溶液3分钟进行表面灭菌，且随后用经灭菌的蒸馏水洗涤来制备。将拟南芥冷藏(4℃)2天，且随后种植于表土(Dongbu Farm Hannong有限公司)中，且随后在黑暗状态下在21℃恒温器中培养约1周，其中照射光12小时且不照射光12小时。
将小球藻UTEX265、CD11-2001、CD02-3002及CD11-2003共4种接种至200mL经灭菌的BG-11液体培养基中，且随后在25℃下培养5至7天，同时照射LED光源且以0.1vvm连续供应1至10％(v/v)CO2。将经培养的种子培养物接种至1.8L经灭菌的BG-11液体培养基中，且在相同条件下最多培养10天。培养完成后，将培养物离心以获得各品系的培养物上清液。
为了评估促进植物生长的作用，将培养的拟南芥用各品系的培养物上清液的10至1000倍稀释液以1mL/株的含量处理，且叶面施肥三次，间隔时间为4天。设置蒸馏水(DW)同等处理组作为对照组，且添加用于微藻类光照培养的培养基(BG-11液体培养基)或商业化海藻提取物液体肥料(Acadian 29)同等处理组作为比较组。作为拟南芥的生长量测指标，量测地上部分活重(地上部分重量)。通过对各测试组的拟南芥8个受试者进行重复实验来计算且显示顶部活重的平均值及标准偏差。
结果，如图2所示，其展示相较于对照组，其他小球藻品系具有很小或没有促进生长的作用，而小球藻CD02-3002品系展示显著优异的促进生长的作用，且可确认此为比商业化肥料Acadian 29显著优异的作用。
根据以上描述，本申请所属技术领域中具有通常知识的技术人员能够理解，本申请可以其他特定形式实施而不改变其技术精神或基本特征。就此而言，应理解，上文所描述的实施例在所有方面为例示性的而非限制性的。本申请的范围应解释为包括本申请的范围内的所有变化或修改，其来源于下文将要描述的权利要求书的含义和范围及等效概念而非以上详细描述。
保藏编号
保藏单位名称：韩国典型培养物保藏中心(KCTC)
保藏编号：KCTC14659BP
保藏日期：2021年8月23日。

Claims (10)

1.一种具有促进植物生长作用的小球藻(Chlorella vulgaris)CD02-3002品系，其保藏编号为KCTC14659BP。
2.一种用于促进植物生长的组合物，其包含选自由以下组成的组中的任一种或多种：具有促进植物生长作用的小球藻CD02-3002品系，所述品系的保藏编号为KCTC14659BP；所述品系的培养物或培养物上清液；所述培养物或培养物上清液的浓缩物；所述培养物、培养物上清液或浓缩物的干燥物；以及所述干燥物的裂解物。
3.一种植物肥料，其包含根据权利要求2所述的用于促进植物生长的组合物。
4.一种培养小球藻CD02-3002品系的方法，其包括在发酵废气的存在下培养具有促进植物生长作用的小球藻CD02-3002品系，该品系的保藏编号为KCTC14659BP。
5.根据权利要求4所述的培养小球藻CD02-3002品系的方法，其中，所述发酵废气包含0.5至20％v/v的二氧化碳。
6.根据权利要求4所述的培养小球藻CD02-3002品系的方法，其中，所述发酵废气由微生物发酵产生。
7.根据权利要求4所述的培养小球藻CD02-3002品系的方法，其中，所述培养在20至40℃下进行。
8.根据权利要求4所述的培养小球藻CD02-3002品系的方法，其中，所述培养进行30天或更短时间。
9.一种促进植物生长的方法，其包括：
制备用于促进植物生长的组合物，所述组合物包含选自由以下组成的组中的任一种或多种：具有促进植物生长作用的小球藻CD02-3002品系，所述品系的保藏编号为KCTC14659BP；所述品系的培养物或培养物上清液；所述培养物或培养物上清液的浓缩物；所述培养物、培养物上清液或浓缩物的干燥物；及所述干燥物的裂解物；以及
使所述用于促进植物生长的组合物与植物接触。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述接触通过将用于促进植物生长的组合物处理至土壤、植物或植物种子的方法进行。
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