KR20090092373A - 피루베이트 옥시다아제가 불활성화된 ｌ-트립토판 생산미생물 및 이를 이용한 ｌ-트립토판 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 L-트립토판을 생산하는 미생물, 구체적으로는 L-트립토판의 생산능을 가진 미생물의 피루베이트 옥시다아제(pyruvate oxidase)를 불활성화시킴으로서 L-트립토판의 생산효율이 증가된 것을 특징으로 하는 미생물, 및 이를 이용한 L-트립토판의 생산방법에 관한 것이다.

Description

피루베이트 옥시다아제가 불활성화된 Ｌ-트립토판 생산 미생물 및 이를 이용한 Ｌ-트립토판 생산 방법{A MICROORGANISM WHOSE ENZYME ACTIVITY FOR PYRUVATE OXIDASE IS INACTIVATED AND METHOD FOR PRODUCING L-TRYPTOPHAN USING THE SAME}

본 발명은 L-트립토판을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 L-트립토판 생산방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 대장균의 피루베이트 옥시다아제를 암호화하는 유전자인 poxB를 불활성화시켜 L-트립토판을 고수율로 생산하는 미생물을 생산하고, 그 미생물을 이용하여 L-트립토판을 생산하는 방법에 관한 것이다.

L-트립토판은 필수 아미노산의 일종으로 사료 첨가제, 수면 효과나 정신안정효과가 있어 수액제 등의 의약품 원료 및 건강식품 소재 등으로 널리 사용되어 왔다. L-트립토판의 제조 방법에는 화학 합성법, 효소 반응법, 미생물에 의한 발효법 등이 있다. 화학 합성법의 경우에는 고온, 고압의 조건이 필요하고, 그 산물에 D형, L형이 혼재하기 때문에 정제과정이 쉽지 않다. 효소 반응법의 경우, 예컨대 일본에서 공보된 바 있는 마쓰이 도오아쓰이 특허(대한민국 특허 공고 90-005773)에서의 효소 반응법의 경우는 기질로 사용되는 인돌과 세린의 가격이 고가일 뿐만 아니라 효소가 안정하지 못하다는 문제가 있었다.

한편, 종래의 미생물에 의한 L-트립토판의 생산은 대장균과 코리네박테리움 등 다양한 미생물의 영양요구성 균주와 조절 변이 균주에서 이루어져 왔으며, 1980년대에 들어서면서 유전자 재조합 기술을 이용하여 우수한 재조합 균주들을 개발하는데 큰 성과를 거두었고, 높은 수준의 생산성 향상을 가져왔다. 미생물을 이용한 직접 발효법으로 L-트립토판을 생산하는 국내 특허로는 L-트립토판 내성을 갖거나 영양 요구성을 갖는 변이 균주를 이용한 경우 (대한민국 특허 공고 87-1813, 90-8251, 92-7405)와 재조합 균주를 이용한 경우(대한민국 특허 공고 90-5772, 91-5627)가 있다. 이러한 L-트립토판 유사체 내성균주들은 주로 트립토판 생합성 과정에서 대사물질에 의한 피드백 저해(feedback inhibition)를 극복하는 것을 주된 목표로 하였고, 유전자 재조합 균주들의 경우 중요한 효소들의 증폭을 통한 트립토판 생산성/수율 향상을 목표로 두었으며, 실제로 괄목할 만한 성과를 가져왔다. 그러나 종래의 대장균 인공 변이주를 이용한 L-트립토판 생산 방법은 L-트립토판 생산성이 낮다는 문제점이 있었다.

다른 아미노산 발효와는 달리 L-트립토판의 발효에는 여러 가지 전구체들이 사용되어지며, 이들의 밸런스가 굉장히 중요하다. 그러나, L-트립토판의 생산 과정 중 아세트산과 같은 부산물의 생성으로 인해 트립토판 전구체인 포스포에놀 피루베이트(phosphoenol pyruvate; 이하 PEP라 칭한다)의 양이 감소하여 L-트립토판의 생산이 감소한다는 문제점이 있다.

이러한 아세트산의 생성에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자에는 아세테이트 키나아제(acetate kinase)를 암호화하는 ackA 유전자, 포스포트랜스아세틸라아제(phosphotransacetylase)를 암호화하는 pta 유전자, 아세테이트 신테타아제(acetate synthetase)를 암호화하는 acs 유전자 및 피루베이트 옥시다아제(pyruvate oxidase)를 암호화하는 poxB 유전자 등이 보고되어 있다(LEE SJ et al., Metabolic engineering of Escherichia coli for enhanced production of succinic acid, based on genome comparison and in silico gene knockout simulation. Applied and Environmental Microbiology, December 2005, p. 7880-7887, Vol. 71, No. 12; Chang, Y. Y., and J. E. Cronan, Jr. 1983. Genetic and biochemical analyses of Escherichia coli strains having a mutation in the structural gene (poxB) for pyruvate oxidase. J. Bacteriol . 154:756-762. ; Grabau, C., and J. E. Cronan, Jr. 1984. Molecular cloning of the gene (poxB) encoding the pyruvate oxidase of Escherichia coli , a lipid-activated enzyme. J. Bacteriol . 160:1088-1092).

종래의 아세트산의 생성을 촉매하는 효소의 활성이 감소되거나 제거된 균주를 사용한 발효 방법에 대한 특허의 예로는 포스포아세틸 트랜스퍼라제(pta) 및 락테이트 데하이드로게나제(ldh)의 활성이 결핍된 대장균을 사용한 L-아미노산의 생산 방법 (WO99/06532), 피루베이트 옥시다아제(poxB)의 활성이 결핍된 엔테로박테리아세애 과를 사용한 L-아미노산의 생산 방법 및 피루베이트 옥시다아제(poxB)의 활성이 결핍된 엔테로박테리아세애를 사용한 D-판토텐산의 생산 방법 (WO02/36797) 등이 있다. 그러나, 종래에 피루베이트 옥시다아제의 활성이 결핍된 대장균을 사용하여 L-트립토판 생산에 적용한 특허는 없었다.

이에 본 발명자들은 poxB 유전자의 불활성화는 아세트산 생성억제의 목적도 크지만, 한걸음 더 나아가 아세트산 억제에 의한 트립토판 전구체인 PEP의 양을 늘리는 효과를 가져오기 때문에, 이를 이용하여 L-트립토판 생산성을 보다 극대화할 필요가 있다고 판단하였다.

상기 종래기술에서는 L-트립토판의 생산 과정 중 아세트산과 같은 부산물이 생성되고, 이에 따라 트립토판의 전구체인 PEP의 양이 감소되어 L-트립토판을 충분히 합성할 수 없다는 문제점이 있었다.

이에 본 발명자들은 마이크로 어레이 기술을 이용하여 트립토판 생산균주의 부산물인 아세트산 생성 원인 유전자를 탐색한 결과, 피루브산을 아세트산으로 전환시키는 피루베이트 옥시다아제를 암호화하는 poxB 유전자의 발현이 아세트산 생성과 관련된 것을 발견하였다. 이러한 결과로부터 트립토판 생산 대장균에서의 피루베이트 옥시다아제를 불활성화시킴으로써 L-트립토판 생산성이 증가한다는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 피루베이트 옥시다아제를 암호화하는 유전자인 poxB를 결손시켜, 피루베이트 옥시다아제가 불활성화된 L-트립토판 생산능을 가진 재조합 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 L-트립토판 생산능을 가진 재조합 미생물을 배양하여 L-트립토판을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은, L-트립토판의 생산능을 가진 미생물의 피루베이트 옥시다아제를 암호화하는 유전자인 poxB를 불활성화시킴으로써 L-트립토판의 생산효율이 증가된 재조합 미생물, 및 이를 이용하여 아세트산 생산을 억제하고 트립토판의 전구체인 PEP의 양을 증가시켜 L-트립토판의 생산효율이 증가된 L-트립토판의 생산방법을 제공한다.

본 발명에 따라 피루베이트 옥시다아제를 암호화하는 유전자인 poxB 유전자를 불활성화시킴으로써 L-트립토판 생산능을 증가시킬 수 있다. 구체적으로는, L-트립토판 생산능을 가진 대장균(Escherichia Coli) CJ285에서 poxB 유전자가 불활성화된 미생물인 대장균(Escherichia Coli) CA04-1002(KCCM10928P)를 제조하고, 이대장균의 배양을 통해 L-트립토판을 고농도로 생산하여 그 생산성을 증가시킬 수 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 L-트립토판의 생산능을 가진 미생물로서, 상기 미생물 내의 poxB 유전자를 결손시켜 피루베이트 옥시다아제를 불활성화시킴으로써 L-트립토판의 생산효율이 증가된 것을 특징으로 하는 미생물을 제공한다.

본 발명에서 사용 가능한 숙주세포로는 그람 음성 (Gram negative) 박테리아 (bacteria)에 속하는 미생물을 사용할 수 있으며, 에세리키아 (Escherichia) 속에 속하는 미생물을 사용하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 트립토판 유사체인 트립토판 하이드록사메이트 (tryptophan hydroxamate) 내성을 갖는 L-트립토판 생산 대장균 CJ285 (대한민국 특허 공고 10-2005-0059685)를 사용 할 수 있다.

본 발명의 poxB 유전자는(http://ecocyc.org)(서열번호 5) 대장균에서 트립토판의 전구체인 PEP가 피루베이트(pyruvate)를 거쳐 아세트산으로 전환되는 과정에서, 피루베이트를 아세트산으로 전환시키는 피루베이트 옥시다아제를 암호화하는 유전자이다. 아세트산이 생성되면 트립토판의 전구체인 PEP가 감소되어 L-트립토판의 생산이 감소되며, 또한 아세트산이 5g/L 이상인 농도에서는 세포에 치명적이기 때문에 아세트산의 생성을 억제하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, "불활성화"란 세포 내의 활성이 있는 피루베이트 옥시다아제가 결여되어 있거나, 그 단백질의 수준이 감소되도록 유전적으로 변이되어 있는 것을 의미한다.

본 발명의 미생물은 L-트립토판을 생산할 수 있는 미생물의 염색체에 존재하는 poxB 유전자를 결손시킴으로써 제조될 수 있다. 이러한 불활성화 방법에는, 자외선과 같은 빛 또는 화학물질을 이용하여 돌연변이를 유발하고, 얻어진 돌연변이체로부터 poxB를 암호화하는 유전자가 불활성화된 균주를 선별할 수 있다. 또한, 상기 불활성화 방법에는 DNA 재조합 기술에 의한 방법이 포함된다. 상기 DNA 재조합 기술에는 예를 들면, 상기 poxB를 암호화하는 유전자와 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터를 상기 미생물에 주입하여 상동 재조합 (homologous recombination)이 일어나게 함으로써 이루어질 수 있다. 또한, 상기 주입되는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터에는 우성 선별 마커를 포함할 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 불활성화된 poxB 유전자 또는 그의 DNA 단편이란, 숙주 내의 poxB 유전자와 서열 상동성을 가지고 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 또한, 절단 (truncation), 결실, 치환, 삽입, 및 역위와 같은 돌연변이가 도입되어 활성이 있는 poxB 유전자가 암호화하는 산물을 발현할 수 없는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다.

상기 불활성화된 poxB 유전자 또는 그의 단편을 숙주세포 내로 도입하는 과정은 예를 들면, 형질전환 (transformation), 접합 (conjugation), 형질도입 (transduction) 또는 전기천공 (electroporation)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

상기 불활성화된 poxB 유전자 또는 그의 DNA 단편이 형질전환에 의하여 숙주 세포 내로 도입되는 경우, 불활성화 절차는 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 균주의 배양물과 혼합하여 수행할 수 있다. 이 경우, 균주는 천연적으로 DNA 유입에 대해 컴피턴트 (competent) 하여 형질전환될 수 있으나, 사전에 균주를 적절한 방법에 의해 DNA 유입에 컴피턴트하도록 만드는 것이 바람직하다 (LeBlanc 등, Plasmid 28, 130-145, 1992; Pozzi 등, J. Bacteriol. 178, 6087-6090, 1996 참조). 상동 재조합을 위하여 poxB 유전자의 단편은 게놈 DNA 내의 poxB 유전자 일부분을 제거하거나, 외래 DNA 조각을 도입하고, 이 서열의 야생형 염색체 카피를 불활성화 상태로 치환시킨다.

본 발명은 또한, poxB 유전자가 불활성화된 미생물을 배양하고 이를 이용하여 L-트립토판을 고수율로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 L-트립토판을 생산하는 방법에서, 상기 미생물의 배양 과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양 방법의 예에는, 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 이러한 다양한 배양 방법은 예를 들면, "Biochemical Engineering" (James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176) 에 개시되어 있다.

배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한다. 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 사용될 수 있는 탄소원의 예에는, 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토즈, 전분 및 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산 및 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 탄소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원의 예에는, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액 (CSL) 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원이 포함된다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소디움-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그외에, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 배양 기간은 원하는 L-트립토판의 생성량이 얻어질 때까지 계속할 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 160 시간이다.

배양물로부터의 L-트립토판의 분리는 당업계에 알려진 통상적인 방법에 의하여 분리될 수 있다. 이러한 분리 방법에는, 원심분리, 여과, 이온교환 크로마토그래피 및 결정화 등의 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을, 이온교환 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 국한되는 것은 아니다.

실시 예 1 : DNA 마이크로 어레이 기술을 이용한 트립토판 생산균주의 정상발효와 비정상 발효의 비교

본 실시예에서는 트립토판 생산균주인 대장균(Escherichia Coli) CJ285의 발효조건에서 부산물인 아세트산을 비정상적으로 5 g/L이상 생성시키게 하는 원인 유전자를 동정하기 위해서, 대장균 CJ285의 정상 발효 (아세트산 비생성 발효)와 비정상 발효 (아세트산 생성 발효) 샘플을 사용하였다.

대장균 마이크로 어레이는 유리재질로 된 슬라이드 위에 일정한 간격을 두고 집적되어 있으며, 대장균 K12 균주 4288개의 ORF(open reading frame)가 올리고뉴클레오티드 상태(약 60~70mer)로 심어져있다. 30 L 발효조에서의 샘플 추출 시점은 6시간, 33시간, 42시간에서 실시하였으며, 각 시점의 샘플을 형광물질인 시아닌 3(대조군: 정상발효)과 시아닌 5(실험군: 비정상발효)를 이용하여 직접비교를 수행하였다.

트립토판 생산균주의 총 RNA는 카이젠 RNeasy 미디 키트(Qiagen RNeasy midi kit; cat.no. 75144)를 이용하여 추출 및 정제(clean up)를 실시하였으며, 스펙트로포토미터(spectrophotometer)와 정렬 프로그램(Agilent Bioanalyzer2100)을 사용하여 rRNA 비(28S/18S ribosomal RNA)의 측정 시 1.8 이상의 비를 얻을 수 있었다. 마이크로 어레이 한번의 실험을 위해 각 샘플은 30μg의 RNA가 준비되어 실시되었다. 결과는 제네픽스 소프트웨어(GenePix software; Axon Instruments)와 제네스프링GX(genespringGX)를 이용하여 분석하였다.

정상발효 샘플과 비정상 발효 샘플의 직접적인 비교에 따르면, 아세트산 대사관련 유전자 중 poxB 유전자가 42시간째의 비정상 발효 샘플에서 정상 발효 샘플보다 로그 비 시그널(log ratio signal)값이 0.98로 거의 두 배가 증가하는 것을 확인하였다.

정상 및 비정상 발효조건에서의 아세트산 대사 유전자의 발현량 비교

	log2(비정상 발효 시그날 /정상 발효 시그날)
유전자	6시간 경과	33시간 경과	42시간 경과
ackA	0.3	-0.01	0.18
poxB	0.29	0.28	0.98
pta	0.2	0.22	0.6
acs	0.33	0.76	N.D.

N.D. ; 측정되지 않음

결과적으로, 비정상 발효 샘플의 poxB 유전자의 마이크로 어레이 시그날 증가는 poxB 유전자 발현의 증가를 의미하며, 이는 피루브산에서 아세트산의 생산을 증가시키는 가능성을 의미한다.

실시예 2 : poxB 가 불활성화된 재조합 L-트립토판 생산 균주의 제작

본 실시예에서는 대장균에서의 poxB 유전자를 상동 재조합에 의하여 결손시켰다. 실시예 1에서 보듯이, 트립토판 생산균주에서 부산물인 아세트산 생성에 가장 많은 관련이 있는 원인 유전자를 탐색한 결과, 피루브산으로부터 아세트산으로 전환시키는 피루베이트 옥시다아제를 암호화하는 poxB 유전자의 발현이 아세트산 생성과 가장 큰 관련이 있다는 것을 발견하였고, 이 유전자를 결손 시킬 경우 L-트립토판의 생산성을 향상시켜줄 것으로 예상되어 선정하였다.

이를 위하여, Datsenko KA 등이 개발한 람다 레드 레컴비나제 (lambda Red recombinase) 를 이용한 1단계 불활성화 (one step inactivation) 방법을 사용하였다(One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Datsenko KA, Wanner BL., Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Jun 6;97(12):6640-5).

양쪽에 상기의 poxB 유전자의 일부를 포함하고, 중간에 클로람페니콜 (chloramphenicol) 내성 유전자를 갖는 DNA 단편을 얻기 위해, pKD3 플라스미드를 주형으로 PCR HL 프리믹스 키트(PCR HL premix kit; BIONEER사 제품)을 사용하여 중합효소 연쇄반응법 (polymerase chain reaction, 이하 PCR법이라 칭함) [Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories] 을 수행하였다. 이 때 사용한 프라이머는 상기 poxB 유전자의 일부분과 pKD3 유전자의 클로람페니콜 내성 유전자의 일부 염기서열을 갖는 표 2의 프라이머 1과 프라이머 2이며, 조건은 변성(denaturation) 94℃ 30초, 어닐링 (annealing) 55℃ 30초, 신장(polymerization) 72℃ 1분을 30회 반복 수행하였다.

프라이머 1 및 2의 염기서열

프라이머 1	5'- gatgaactaaacttgttaccgttatcacattcaggagatggagaaccatggtgtaggctggagctgcttc -3'(서열번호 1)
프라이머 2	5'-ccttattatgacgggaaatgccaccctttttaccttagccagtttgttttcatatgaatatcctccttag -3'(서열번호 2)

이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 젤 (agarose gel) 에서 전기 영동 후 원하는 크기의 밴드 (약 1100 염기쌍)를 용리하여 얻었다.

Datsenko KA 등이 개발한 방법에 따라 pKD46으로 형질전환된 L-트립토판 생산 대장균 CJ285 (대한민국 특허 공고 10-2005-0059685)를 컴피턴트 상태로 제조 후, PCR법으로 얻어진 1100 염기쌍 크기의 유전자 단편을 형질전환시켰다. 클로람페니콜 (15mg/L) 이 든 고체 배지에 도말하여 30℃에서 밤새 배양하였다.

얻어진 콜로니는 다시 PCR법을 통한 결과물 (1100 염기쌍)로 poxB가 결손되었다는 것을 확인하였다. 이 때 사용한 프라이머는 표3의 프라이머 3과 프라이머 4이며, 조건은 변성 94℃ 30초, 어닐링 55℃ 30초, 신장 72℃ 2분을 30회 반복 수행하였다. 이후 얻어진 재조합 균주를 대장균(Escherichia Coli) CA04-1002로 명명하였으며, 그를 2008년 2월 18일자로 대한민국 서울특별시 서대문구 홍제 1동 361-221번지에 소재하는 국제기탁기관인 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터에 수탁번호 KCCM10928P로 기탁하였다.

프라이머 3 및 4의 염기서열

프라이머 3	5'- cgaccagcggtctgaaattcaccaa -3'(서열번호 3)
프라이머 4	5'- tcaaacccgacgatatccatttcgc -3'(서열번호 4)

실시예 3 : poxB 가 불활성화된 재조합 미생물의 L-트립토판 생산능 비교

본 실시예에서는 실시예 1에서 제작된 재조합 균주인 대장균 CA04-1002(KCCM10928P)의 콜로니를 백금이를 이용하여 LB (Lurina-Bertani. 조성: 박토 트립톤 10 g/l, 박토 효모엑기스 5 g/l, 염화나트륨 10 g/l) 고체 배지에서 밤새 배양한 후, 성장한 균주를 표 4에서와 같은 조성을 갖는 플라스크 역가 배지에 한 백금이 씩 접종하였다. 균주 접종 후 37℃, 200rpm에서 48시간 동안 배양하고, 그로부터 얻어진 트립토판 농도와 대장균 CJ285에서 얻어진 트립토판 농도를 비교하였다. 얻어진 L-트립토판 농도는 3개의 플라스크 결과의 평균값을 사용하였다.

플라스크 역가 배지

조성	농도(g/L)
글루코오스 (glucose)	60
효모 추출물 (Yeast extract)	2.5
암모늄 설페이트 ((NH4)2SO4)	10
마그네슘 설페이트 (MgSO4 ·H20)	1
구연산 나트륨 (Sodium citrate)	5
소디움 클로라이드 (NaCl)	1
타이로신 (L-tyrosine)	0.1
페닐알라닌 (L-phenylalanine)	0.15
칼슘 카르보네이트 (CaCO3)	40
포타슘 디하이드로겐포스페이트 (K2HPO4)	1

그 결과, 표 5와 같이 역가를 측정한 대장균 CA04-1002의 L-트립토판 농도가 대장균 CJ285에서보다 11.3% 증가한 것이 확인되었다.

L-트립토판 농도 비교

균주	배양시간 (24시간)		배양시간 (48시간)
	L-트립토판(g/L)	아세트산(g/L)	L-트립토판(g/L)	아세트산(g/L)
CJ285	5.93	3.90	8.21	0.80
CA04-1002(KCCM10928P)	5.95	0.45	9.14	0.70

<110> CJ Cheiljedang Corporation <120> A microorganism whose enzyme activity for pyruvate oxidase is inactivated and method for producing L-tryptophan using the same <130> PA07-0339 <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1 <400> 1 gatgaactaa acttgttacc gttatcacat tcaggagatg gagaaccatg gtgtaggctg 60 gagctgcttc 70 <210> 2 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2 <400> 2 ccttattatg acgggaaatg ccaccctttt taccttagcc agtttgtttt catatgaata 60 tcctccttag 70 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 3 <400> 3 cgaccagcgg tctgaaattc accaa 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 4 <400> 4 tcaaacccga cgatatccat ttcgc 25 <210> 5 <211> 1719 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 5 atgaaacaaa cggttgcagc ttatatcgcc aaaacactcg aatcggcagg ggtgaaacgc 60 atctggggag tcacaggcga ctctctgaac ggtcttagtg acagtcttaa tcgcatgggc 120 accatcgagt ggatgtccac ccgccacgaa gaagtggcgg cctttgccgc tggcgctgaa 180 gcacaactta gcggagaact ggcggtctgc gccggatcgt gcggccccgg caacctgcac 240 ttaatcaacg gcctgttcga ttgccaccgc aatcacgttc cggtactggc gattgccgct 300 catattccct ccagcgaaat tggcagcggc tatttccagg aaacccaccc acaagagcta 360 ttccgcgaat gtagtcacta ttgcgagctg gtttccagcc cggagcagat cccacaagta 420 ctggcgattg ccatgcgcaa agcggtgctt aaccgtggcg tttcggttgt cgtgttacca 480 ggcgacgtgg cgttaaaacc tgcgccagaa ggggcaacca tgcactggta tcatgcgcca 540 caaccagtcg tgacgccgga agaagaagag ttacgcaaac tggcgcaact gctgcgttat 600 tccagcaata tcgccctgat gtgtggcagc ggctgcgcgg gggcgcataa agagttagtt 660 gagtttgccg ggaaaattaa agcgcctatt gttcatgccc tgcgcggtaa agaacatgtc 720 gaatacgata atccgtatga tgttggaatg accgggttaa tcggcttctc gtcaggtttc 780 cataccatga tgaacgccga cacgttagtg ctactcggca cgcaatttcc ctaccgcgcc 840 ttctacccga ccgatgccaa aatcattcag attgatatca acccagccag catcggcgct 900 cacagcaagg tggatatggc actggtcggc gatatcaagt cgactctgcg tgcattgctt 960 ccattggtgg aagaaaaagc cgatcgcaag tttctggata aagcgctgga agattaccgc 1020 gacgcccgca aagggctgga cgatttagct aaaccgagcg agaaagccat tcacccgcaa 1080 tatctggcgc agcaaattag tcattttgcc gccgatgacg ctattttcac ctgtgacgtt 1140 ggtacgccaa cggtgtgggc ggcacgttat ctaaaaatga acggcaagcg tcgcctgtta 1200 ggttcgttta accacggttc gatggctaac gccatgccgc aggcgctggg tgcgcaggcg 1260 acagagccag aacgtcaggt ggtcgccatg tgcggcgatg gcggttttag catgttgatg 1320 ggcgatttcc tctcagtagt gcagatgaaa ctgccagtga aaattgtcgt ctttaacaac 1380 agcgtgctgg gctttgtggc gatggagatg aaagctggtg gctatttgac tgacggcacc 1440 gaactacacg acacaaactt tgcccgcatt gccgaagcgt gcggcattac gggtatccgt 1500 gtagaaaaag cgtctgaagt tgatgaagcc ctgcaacgcg ccttctccat cgacggtccg 1560 gtgttggtgg atgtggtggt cgccaaagaa gagttagcca ttccaccgca gatcaaactc 1620 gaacaggcca aaggtttcag cctgtatatg ctgcgcgcaa tcatcagcgg acgcggtgat 1680 gaagtgatcg aactggcgaa aacaaactgg ctaaggtaa 1719

Claims (3)

1. 아세트산 합성에 관여하는 피루베이트 옥시다아제(Pyruvate Oxidase)를 암호화하는 poxB 유전자가 불활성화된 것을 특징으로 하는 L-트립토판 생산능을 가진 대장균.
2. 1항에 있어서,

   상기 poxB 유전자가 불활성화된 대장균은 대장균(Escherichia coli) CA04-1002 (KCCM10928P)인 것인 특징으로 하는 대장균.
3. 제1항 또는 제2항 중 어느 한 항의 대장균을 배양하는 단계를 포함하는 L-트립토판을 생산하는 방법.