JPH08191694A

JPH08191694A - アミノ酸合成用の複合プラスミド

Info

Publication number: JPH08191694A
Application number: JP7263336A
Authority: JP
Inventors: Mark Richard Edwards; リチャードエドワーズ，マーク; Paul Phillip Taylor; フィリップテイラー，ポール; Michael George Hunter; ジョージハンター，マイクル; Ian Graham Fotheringham; グラハムフォザーリンガム，アイアン
Original assignee: Nutrasweet Co
Current assignee: Nutrasweet Co
Priority date: 1985-06-24
Filing date: 1995-10-11
Publication date: 1996-07-30
Also published as: EP0229161A4; EP0229161A1; JPS63500215A; WO1987000202A1; EP0229161B1

Abstract

(57)【要約】【課題】複合プラスミドを利用したアミノ酸の合成【解決手段】自律複製単位（レプリコン）を含む第一
のＤＮＡ断片、及び二つ以上の遺伝子及びプロモーター
を有する人工的な遺伝子群（オペロン）であってこれら
遺伝子とプロモーターとの組合わせは本来一つの遺伝子
群中には存在していないものである該人工的な遺伝子群
を含む第二のＤＮＡ断片を含有する複合プラスミドであ
って；上記遺伝子は、フィードバック阻害抵抗性であっ
て芳香族アミノ酸の合成で機能する酸素をコードする変
異ｐｈｅＡ、ｔｙｒＡ、ａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ａｒｏ
Ｈ、ａｒｏＬ及びｔｒｐＥ遺伝子からなる群より選ばれ
るものである上記複合プラスミドを利用して得られる形
質転換体を培養することによりアミノ酸を効率良く製造
することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本明細書においては、個々に
変異された後に転写単位に組み入れられた多数の遺伝子
を含む複合プラスミドの製造方法について記載される。
これらの複合プラスミドは、アミノ酸や他の代謝物質の
生産及び優れた宿主細胞のスクリーニングに有用であ
る。

【０００２】

【従来の技術】細菌による発酵は、アミノ酸の如き一次
代謝物質や抗生物質の如き二次代謝物質の双方を工業的
に生産するのに広く使用されている。これらの代謝物質
の生産は、大きな経済的意味を持つ産業上の工程であ
る。天然に見られる微生物においては、生合成経路が資
源の消費を避けるように強く調節されているので、如何
なる代謝物質も、一般に過剰生産されることはない。産
業上有用な菌株の開発には、突然変異とその後の改良菌
株の選択を含む広範なプログラムが必要である。その様
な選択工程は、菌株開発の終段階において極度に大変な
工程である。発酵によって個々の単離菌株をスクリーニ
ングすることも必要である。

【０００３】組換えＤＮＡ技術によれば、今では生合成
経路に於る重要遺伝子を単離し、それらを生体外で調節
を受けない様にすることが可能であるので、菌株開発が
大いに促進された。加えて、コピー数の多いプラスミド
に遺伝子をクローニングすることにより、遺伝子の発現
が高められ、それにより細胞内での蛋白質レベルが上が
り、それ故効果的な方法である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかし、多くの生合成
経路は、１０以上の個々の段階を含んでいるため複雑で
ある。この様な場合、組換えＤＮＡ法による菌株開発を
考える際に、遺伝子を選びそれらをベクター上に組み合
わせることが最も重要となる。本発明は、菌株最適化に
組換えＤＮＡ法の有用性を最大限に利用し、それにより
菌株開発を大いに促進するように、生合成経路からの遺
伝子をベクター上に組み合わせる工程に関する。該工程
により得られる製造物は、複合プラスミドと呼ばれる。

【０００５】個々の遺伝子又は天然のオペロンを含むプ
ラスミドについて記載されている。例えばＬ−フェニル
アラニンの生産については、ＦＲ２４８６９６１−Ａ、
ＥＰ８５９５８−Ａ、ＧＢ２０５３９０６Ａ、ＥＰ７７
１９６−Ａ；Ｌ−プロリン生産についてはＧＢ２０７５
０５６−Ａ、ＥＰ８５９５８−Ａ；インターフェロン生
産についてはＥＤ１２６３３８−Ａ；トリプトファン生
産についてはＪ５９１２５８９２−Ａ、ＥＰ８０３７８
Ａ、Ｊ５７０８０３９８−Ａ、ＵＳ４，３７１，６１
４、ＥＰ１２４０４８Ａに記載されている。これらの引
例には、本明細書で述べる複合プラスミドが明らかにさ
れていない。アミノ酸生合成の概要については、Ａｍｉ
ｎｏＡｃｉｄｓ：Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄ
ＧｅｎｅｔｉｃＲｅｇｕｌａｔｉｏｎ〔Ｋ．Ｍ．Ｈ
ｅｒｒｍａｎｎとＲ．Ｌ．Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ編集、
ＡｄｄｉｓｏｎＷｅｓｌｅｙＰｕｂ．Ｃｏ．出版
（１９８３年）〕に述べられている。組換えＤＮＡ手順
の総説については、“ＡｍｉｎｏＡｃｉｄ：Ｂｉｏｓ
ｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄＧｅｎｅｔｉｃＲｅｇｕ
ｌａｔｉｏｎ”，Ｋ．Ｍ．Ｈｅｒｒｍａｎｎ及びＲ．
Ｌ．Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，ＡｄｄｉｓｏｎＷｅｓｌ
ｅｙＰｕｂ．Ｃｏ．（１９８３）に記載されている。
Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎｏ．４，５１４，５０２号、薬剤耐性遺
伝子と、大腸菌又は枯草菌の内で増殖可能でコリネ型の
グルタミン酸生産細菌から得たドライブユニット（ｄｒ
ｉｖｅ−ｕｎｉｔ）領域とを含むプラスミドについて記
載している。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明により次のものか
らなる複合プラスミドが提供される。即ち、（ａ）一つ
以上の転写単位を含む第２のＤＮＡ断片に共有結合した
レプリコンを含む第一のＤＮＡ断片；及び（ｂ）もし一
つのみの転写単位を含む場合には、アミノ酸合成で機能
する二つ以上の酵素をコードするフィードバック抵抗性
遺伝子を二つ以上含む転写単位あるいは（ｃ）もし二つ
以上の転写単位を含む場合には、アミノ酸合成で機能す
る一つ以上の酵素をコードするフィードバック抵抗性遺
伝子の一つ以上を含む第一の転写単位と、アミノ酸生産
に役立つ酵素をコードする一つ以上の遺伝子を含む一つ
以上の付加的な転写単位から成る。アミノ酸で、好まし
いものは芳香族アミノ酸であり、特に好ましくはフェニ
ルアラニン、トリプトファン及びチロシンである。

【０００７】本発明の好ましい態様としては、付加した
転写単位が、異化酵素（ｃａｔａｂｏｌｉｃｅｎｚｙ
ｍｅ）或いは輸送タンパクの遺伝子を含んでいる複合プ
ラスミドである。より好ましい態様としては、次の遺伝
子、即ちｐｈｅＡ、ａｒｏＦ、ｔｙｒＡ、ｐｈｅＲ、ｔ
ｙｒＲ、ｔｙｒＢ、ａｒｏＬ、ａｒｏＨ、ａｒｏＧ、ｔ
ｙｐＥ、ａｓｐＣ、又はｔｒｙＢＡＤ又はＣの変異体
（ｍｕｔａｎｔ）から選ばれた二つ以上のフィードバッ
ク抵抗性遺伝子を含む複合プラスミドである。本発明の
複合プラスミドは、原核生物又は真核生物の細胞内で複
製可能で、各々の細胞型に特異的な転写単位中で複製可
能である。

【０００８】本発明の一つの目的は、アミノ酸合成に有
用な異化酵素又は透過酵素を含む転写単位を提供するこ
とである。発明の好ましい態様として、複合プラスミド
の転写単位の一つにおいて、アミラーゼを利用すること
である。本発明の更に一つの目的は、アミノ酸生産の律
速段階を触媒するフィードバック抵抗性酵素をコードす
る遺伝子を含む複合プラスミドを細胞の形質転換に使
い、アミノ酸生産に役立つ微生物をスクリーニングし、
しかる後に望ましいアミノ酸の生産を定量化する方法を
提供することである。

【０００９】本発明の複合プラスミドは如何なるグラム
陰性生物のスクリーニングにも使用し得る。同様に如何
なるグラム陰性の微生物にも、本発明の複合プラスミド
を使用してアミノ酸生産に利用し得る。本明細書で例示
する複合プラスミドは、芳香族アミノ酸、特にＬ−フェ
ニルアラニンとＬ−トリプトファンの生産用としてグラ
ム陰性の微生物に使用し得る。

【００１０】使用し得るグラム陰性の微生物には次の属
のものがある、即ち、ネイセリア（Ｎｅｉｓｅｒｉ
ａ）、ベエイロネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）、ブル
セラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、ボルデエテラ（Ｂｏｒｄｅ
ｔｅｌｌａ）、パスツーレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌ
ａ）、ハエモフィラス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、エ
ッシャリイヒヤ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エルウニ
ア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、
サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐ
ｒｏｔｅｕｓ）、イエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、
エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、セラ
チア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、アゾトバクター（Ａｚｏｔ
ｏｂａｃｔｅｒ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕ
ｍ）、ニトロソモナス（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）、
ニトロバクター（Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、チオバシ
ラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュードモナス
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アセトバクター（Ａｃｅ
ｔｏｂａｃｔｅｒ）、フォトバクテリウム（Ｐｈｏｔｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎ
ａｓ）、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、ヴィブ
リオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、デスルフォヴィブリオ（Ｄｅｓ
ｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）及びスピリラム（ｓｐｉｒｉｌ
ｌｕｍ）である。

【００１１】また、本発明は、生産される酵素が過剰の
アミノ酸生産物の存在下でさえもアミノ酸合成の活性を
残す様なフィードバック抵抗性条件に合う様に個々の遺
伝子を変異させ、次いでその変異遺伝子を転写単位に連
結することにより複合プラスミドを製造する方法にも関
する。好ましい複合プラスミドの態様としてはｐＭＥ２
０２、ｐＭＥ２１９、ｐＭＥ２１４及びｐＰＴ１１２が
挙げられる。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明の目的の一つは、興味ある
生合成経路下の炭素の流れ（ｆｌｕｘｏｆｃａｒｂｏ
ｎ）に影響を与える最も重要な酵素をコードする遺伝子
を、適当なベクター上に連結することである。かかる酵
素は、通常調節が原則的に起こる経路で重要なものにな
っている。かかる調節を受ける遺伝子の外にも、調節段
階を調整する他の酵素の遺伝子も含む必要がある。かか
る遺伝子は、通常興味ある生合成経路内にあるが、中間
的物質代謝においても存在し得、結果的に生合成経路へ
の前駆体の供給を左右する作用を有する。他の遺伝子
も、間接的であるが、重要かも知れない。例えば、次の
ものを含む必要がある場合もあり得る。即ち、興味ある
流れを増加させるか或いは好ましくない競争経路の流れ
を低下させる様な合成経路調節物の遺伝子；反応基質又
は生産物のいずれかの細胞膜透過性に影響する遺伝子；
より望ましい基質での生物の生育を可能にする遺伝子；
発酵を促進する為にオン・オフできる様にクローン化遺
伝子を調節するのに含まれる遺伝子；プラスミドの安定
性に影響を与えるのに使用し得る、或いはプラスミドの
選択に使用し得る遺伝子である。

【００１３】複合プラスミド用の興味ある遺伝子は、最
適には、全遺伝子が望ましい調節特性のプロモーターか
ら転写される、合成或いは半合成のオペロンとして、組
立ててもよい（チャート１参照）。理想的には、遺伝子
は、内在する制限酵素部位を使って簡単に組立てられる
様に修飾する。有用な制限酵素部位と、機能性あるリボ
ソーム結合部位とをオーバーラップ出来る制限酵素Ｂａ
ｍＨＩを用いた。最後に、転写範囲を限る為に、オペロ
ンの最終遺伝子の下流に転写終結配列を含むことが最良
である。全体のオペロンは、理想的には、“カセット”
として扱える様に制限酵素部位が隣接しており、大きさ
を最小にする為に出来るだけ余分なＤＮＡを少なく含ん
でいるのが好い。かかるオペロンは、通常の組換えＤＮ
Ａ技術、即ち、最初に遺伝子のクローニング、次にＤＮ
Ａ塩基配列の決定、望ましい制限酵素部位を導入する為
の部位指定変異（ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅ
ｓｉｓ）、及び合成オリゴヌレオチドを使った最適リン
カー、プロモーター、ターミネーターを組合わせた組換
えＤＮＡ技術により構築できる。かかる組換えＤＮＡ技
術は、遺伝子工学上の当業者には公知である。

【００１４】転写単位は、概略的にチャート１で定義さ
れる。それは、天然では一緒には見出されない組立てら
れた成分を含み、またそれはプロモーター／オペレータ
ー領域を含む調節領域、フィードバック抵抗性に変異さ
れた一つ以上の遺伝子、転写単位の成分間にある一つ以
上の制限部位、及び最終の遺伝子の後の転写ターミネー
タから成っている。

【００１５】

【化１】

【００１６】複合プラスミドの長所複合プラスミドは、非常に多用途に亘っており、次に示
す如く、菌株開発に使える組換えＤＮＡ法の多様性は大
きく広がっている。１．もし反応経路での調節段階のクローン化遺伝子が
まだフィードバック阻害抵抗性（ＦＢＩ^R）の誘導体を
生じる様変異していない場合には、プラスミドへの変異
導入と生産体のスクリーニングによってすぐに望ましい
変異体を作ることが出来る。該方法は、受容体（ｒｅｃ
ｉｐｉｅｎｔｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）が突然変異を受
けずそれ故に通常の菌株開発で起こる未知で多分有害な
変異が避けられるという長所を有する。２．オペロンは、最適生産の為の発現レベルを評価す
るために、種々のコピー数のベクター間で簡単に取り換
え得る。

【００１７】３．同様にオペロンは、安定性を最適化
するために種々のベクター間で取り替え得る。もし必要
ならば、オペロンは、宿主の遺伝的受容体（ｇｅｎｅｔ
ｉｃｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）に簡単に再び取り込ませ得
る。４．発現レベルは、プロモーターの簡単な修飾によっ
てコピー数を変動せしめて、変え得る。５．種々の遺伝子産物の割合は、リボソーム結合部位
（ＲＢＳ）の効率を変えることで、詳細に調整し得る。
このことは、リボソーム結合配列内に、制限酵素部位が
あることで大いに促進される。もし必要ならば、求める
発現レベルでの大きな相異は、アテニュエーターを利用
することによって或いは強さの異なるプロモーターを持
った二つのオペロンに構築体を分けて入れることによっ
て、調整できよう。６．その様な構築体を有するプラスミドで形質転換す
ることによって、効率よく即座に菌株が調節を受けない
様にされるので、かかるプラスミドは、生産性に影響す
る菌株間のはっきりしない相異点をスクリーニングし生
産株に最良の受容体（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）を選ぶ非
常に敏速な方法に有用である。

【００１８】７．その様なプラスミドは、反応経路で
知られていることすべてを具体化可能であるので、それ
は変異導入と結びついて生産性の増加した特定菌株の変
異体のスクリーニングに使用し得る。菌株は突然変異さ
せられ次に形質転換し、更に生産性のある株がスクリー
ニングされる。このことにより、第一に、プラスミドと
同程度に反応経路の調節を受けない様にするに必要な何
回もの変異導入を、第二にクローン化遺伝子に対する変
異の潜在的に有害な影響を避けることができる。８．オペロンは、異なる種や属で生産できる様に、異
なる又は拡大した宿主範囲を持つプラスミドにクローン
化し得る。該プラスミドをかかる背景で最適化すること
は、単一のプロモーターとＲＢＳ配列に制限部位がある
ことによって比較的簡単であろう。９．重要な付加的遺伝子は、発酵の必要性に応じて又
はシステムの理解が進むのに従い、組み込むことができ
る。１０．競合する転写／発現の複雑さが避けられるの
で、生産物の生合成に関係する多くの遺伝子を持つプラ
スミドの構築及び最適化が遙かに行い易い。

【００１９】実施例の説明本発明応用の実施例として、アミノ酸のフェニルアラニ
ンとチロシンの生合成が如何にしてうまく調節を受けな
い様に出来得るか、また合成オペロンプラスミドが如何
にしてＬ−フェニルアラニン又はＬ−チロシンの如き芳
香族アミノ酸を生産する菌株の開発に有用に使い得るか
を以下に述べる。芳香族アミノ酸の生合成は、コリスメ
ート迄の共通経路を経て、そこから枝分れしてフェニル
アラニンを生じる経路（１０段階）、チロシンを生じる
経路（１０段階）、トリプトファン（１２段階）、芳香
族ビタミン及びエンテロケリンを生じる経路となる複雑
な経路の一例である（第１図を参照）。

【００２０】大腸菌（及び他の腸内生物）での共通経路
の調節で決定的な段階は、三つのＤＡＨＰ合成酵素のア
イソザイムで触媒される第一番目の反応である。この反
応速度は、炭素が前駆体ホスホエノール（ピルベイト
（ＰＥＰ）及びエリスローズ−４−ホスフェート（Ｅ４
Ｐ）から反応経路へ与えられる速度を律する。三種のア
イソザイムは、各々芳香族アミノ酸生合成の最終生産物
の一つにより阻害され、遺伝子ａｒｏＦ（チロシン感受
性）、ａｒｏＧ（フェニルアラニン感受性）及びａｒｏ
Ｈ（トリプトファン感受性）である。フェニルアラニン
分枝で調節を受ける酵素は、コリスメートミュテース即
ちプレフェネートデヒドラテース、ｐｈｅＡ遺伝子の生
産物であり、これは、それのプレフェネートデヒドラテ
ース活性が、フェニルアラニンによるフィードバック阻
害に非常に感受性な二官能性酵素である。同様に、チロ
シン分枝で、ｔｙｒＡ遺伝子産物のコリスメートミュテ
ース即ちプレフェネートデヒドロゲネースは、チロシン
によるフィードバック阻害に感受性である。

【００２１】反応経路を通して炭素の流れを調節するよ
うに主に統制しているフィードバック阻害に加えて、上
述の酵素やシキメートカイネース（ａｒｏＬ）は、すべ
て転写レベルでの統制により調節されている。ｐｈｅＡ
の発現は、フェニルアラニンリプレッサー、即ちｐｈｅ
Ｒ遺伝子産物及び減衰統制（ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎｃ
ｏｎｔｒｏｌ）により支配されている。ａｒｏＦ及びｔ
ｙｒＡ遺伝子は、一緒に天然のオペロンを構成してお
り、その発現は、チロシンリプレッサー、即ちｔｙｒＲ
遺伝子産物により調節されている。このｔｙｒＲは、ａ
ｒｏＧの発現の調節も行なう。結局ａｒｏＨ遺伝子発現
は、トリプトファンリプレッサー即ちｔｒｐＲ遺伝子産
物により調節されている。

【００２２】複合プラスミドによるアミノ酸生産の例と
して、大腸菌Ｋ１２株から得たａｒｏＦ、ｐｈｅＡ及び
ｔｙｒＡ遺伝子を適当に操作してフェニルアラニン又は
チロシン生産のいずれかが調節を受けない様にしたプラ
スミドを構築した。これらの遺伝子源として、遺伝子ラ
イブラリーから、ｐｈｅＡ及びａｒｏＦＧＨでの損傷を
相補い合える能力により単離した６キロ塩基対ＥｃｏＲ
Ｉ断片を用いた。この断片は本質的にＺｕｒａｗｓｋｉ
らが述べているものと同一であり、高コピー数ベクター
ｐＡＴ１５３にクローン化して、ｐＭＥ６５を得た。ｐ
ｈｅＡ及びａｒｏＦ遺伝子を見つけ出して、確立された
方法で塩基配列を決定し、実施例に記載した如く調節を
受けないものにした。好ましい複合プラスミド及び宿主
ＨＷ７７大腸菌株は（本株は、ＤＡＨＰ及びフェニルア
ラニンのいずれについても栄養要求性でなく、そのｔｙ
ｒＡ遺伝子に唯一の変異を有しておりそのためチロシン
についてのみ栄養要求性を示す。）寄託され、下記寄託
プラスミドの表に掲げる。

【００２３】

【表１】アメリカンタイプカルチャーコレクションは米国メリー
ランド州、ロックビル、パークタウンドライブ１２
３０１（ＭＤ２０８５２）にある。ＡＴＣＣ５３１３
６，ＡＴＣＣ５３１３７，ＡＴＣＣ５３１３８及びＡＴ
ＣＣ５３１３９は、いずれもブタペスト条約に基づく国
際寄託である。

【００２４】

【実施例】実施例１ＰｈｅＡ、ＡｒｏＦ、ＡｓｐＣ及びアミラー
ゼ遺伝子の調製１．ｐｈｅＡ遺伝子の調製ｐｈｅＡ遺伝子の塩基配列はチャート２．に示した。Ｎ
ｃｏＩ部位にＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩリンカーを挿入す
ることにより、Ｌ−フェニルアラニン（Ｌ−ｐｈｅ）に
よるフィードバック阻害に対し十分に抵抗性を有する、
プレフェネート・デハイドラテース（ｐｒｅｐｈｅｎａ
ｔｅｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）活性が得られることが
わかった。更に、酵素のコリスメート・ミュテエースと
プレフェネート・デハイドラテースの両活性も強められ
ることがわかった。転写の脱調節は、プロモーターとア
テニュエーターの塩基配列を、天然のｐｈｅＡプロモー
ターを基にして“プリブノーボックス”配列（−１０）
と重なる二回回転対称（ｄｙａｄｓｙｍｍｅｔｒｙ）を
欠く合成プロモーターで置き換えることによりなし得
た。この置換は、ｐｈｅＡ遺伝子の前のＥｃｏＲＩ部位
と、ｐｈｅＡ遺伝子のＮ末端にあるＨａｅＩＩ部位との
間で行なった。最終的には、ＢａｍＨＩ部位を、部位特
異的変異（ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉ
ｓ）によりｐｈｅＡ遺伝子の３′側に導入した。得られ
た最適のｐｈｅＡ塩基配列をチャート３に示す。

【００２５】２．ａｒｏＦ遺伝子の調製ａｒｏＦ遺伝子の塩基配列をチャート４に示す。フィー
ドバック阻害抵抗性の誘導体を次の様にして単離した。
ａｒｏＦ遺伝子を、中間コピー数のベクターｐＬＧ３３
８を用いて、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片でまずサ
ブクローニングした。これを三種のＤＡＨＰ合成酵素ア
イソザイムすべてを欠損した菌株（ＨＷ２９５）に形質
転換した。この形質転換株は、芳香族アミノ酸やシキメ
ートを含まない最少培地でも、ａｒｏＦ遺伝子の生産物
によって、生育できる様になった。しかし、チロシン１
００ｍｃｇ／ｍｌが含まれていると、ａｒｏＦ遺伝子の
生産物は阻害を受け、結果的に菌株は生育に十分なＰｈ
ｅやＴｒｐを合成出来なくなる。最少培地で生育出来る
変異体を単離し、採集して、ＨＷ２９５を、再び形質転
換し、得られた形質転換体を、チロシンを添加した最少
培地での生育性によりスクリーニングした。この培地で
生育出来る形質転換体は、変異プラスミドが導入された
と推定され、そのＤＡＨＰ合成酵素活性を調べた。フィ
ードバック阻害抵抗性の充分なａｒｏＦ遺伝子を持つ変
異体については更に解析した。

【００２６】

【化２】

【００２７】

【化３】

【００２８】

【化４】

【００２９】

【化５】

【００３０】

【化６】

【００３１】

【化７】

【００３２】制限酵素断片の切り替え実験から、そのフ
ィードバック損傷部はＢｓｔＸＩ−ＰｖｕＩＩ断片上に
あることがわかった。次にＤＮＡ塩基配列決定により、
一塩基の変化で１５２番目のグルタミン残基がアルギニ
ン残基に変っていることがわかった。プロモーターとｔ
ｙｒＲ結合部位は、ａｒｏＦリボソーム結合部位にＢａ
ｍＨＩ部位を導入することにより取り除いた。ａｒｏＦ
遺伝子の下流の塩基配列については、ＰｖｕＩＩ−Ｓａ
ｌＩ部分を、ＰｖｕＩＩ−ＳａｌＩ断片に合成ターミネ
ーターを持つもので置き換えた。最適化したａｒｏＦの
塩基配列をチャート５に示す。ｐｈｅＡ、ａｒｏＦ及び
ｔｙｒＡ遺伝子に加えて、大腸菌Ｋ１２株から取ったａ
ｓｐＣ遺伝子及びＢ．ｌｉｃｈｅｎｏｆｏｒｍｉｓから
取ったα−アミラーゼ遺伝子も複合プラスミドに使用す
る為に調製した。Ｈｕｄｓｏｎ，Ｇ．Ｓ．ａｎｄＤａ
ｖｉｄｓｏｎ，Ｂ．Ｅ．，Ｊ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢ
ｉｏｌ．１８０：１０２３−１０５１（１９８４）に
は、ａｒｏＦ、ｔｒｙＡ及びｐｈｅＡ遺伝子の全領域に
ついて記載されており、またｔｒｙＡ遺伝子の制限酵素
地図及びヌクレオチド配列も記載されている。

【００３３】３．ａｓｐＣ遺伝子の調製ａｓｐＣ遺伝子のクローニングはヨーロッパ特許出願番
号第８４１００５２１．８（公開Ｎｏ．１１６８６０）
に記載されている。本発明のためには、遺伝子の塩基配
列を決定し便利な制限酵素部位を導入することが必要で
あった。そのＤＮＡの塩基配列をチャート６に示す。Ｂ
ａｍＨＩ部位を部位特異的変異によりリボソーム結合部
位に導入した。ａｓｐＣ遺伝子下流のＳｔｕＩ部位を使
いＢｇｌＩＩリンカーを挿入し、ＢｇｌＩＩ部位を導入
した。これらにより、ａｓｐＣ遺伝子を、便利なＢａｍ
ＨＩ−ＢｇｌＩＩ断片で分離出来る様になった。最適化
したａｓｐＣ遺伝子をチャート７．でリボソーム結合部
位とともに示す。

【００３４】４．アミラーゼ遺伝子の調製Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｏｆｏｒｍｉｓのクローニングは、ヨ
ーロッパ特許出願番号第８４３０８８６８．３号（ヨー
ロッパ特許公開番号１４９，９１５号）に記載されてい
る。アミラーゼ遺伝子の塩基配列はチャート８．に示さ
れる。リボソーム結合領域に、本発明者らは部位特異的
変異によりＢａｍＨＩ部位を導入した。アミラーゼ遺伝
子の下流において、ＨｉｎｄＩＩＩ部位へＢａｍＨＩリ
ンカーを挿入することにより、第二のＢａｍＨＩ部位を
導入した。これらの修飾の詳細をチャート９．に示し
た。

【００３５】複合プラスミド及びその応用の実施例実施例２遺伝子を高コピー数により転写で脱調節性とした構築体プラスミドｐＭＥ１５７は、高コピー数ベクターｐＡＴ
１５３でクローン化した野生型プロモーターから転写さ
れるＦＢＩ^RｐｈｅＡ遺伝子を持つ。ＨｉｎｄＩＩＩ−
ＢｇｌＩＩ断片上に存在するｔｙｒＡ遺伝子並びにａｒ
ｏＦ遺伝子は、まずＨｉｎｄＩＩＩ末にＢｇｌＩＩリン
カーを付加して修飾し、次いでｐＭＥ１５７のＢａｍＨ
Ｉ部位にクローン化した。この過程で２組のプラスミド
が得られた。第１組（ｐＭＥ１７１）では、ｐｈｅＡと
ａｒｏＦの遺伝子が同一線的（ｃｏｌｉｎｅａｒｌｙ）
に転写される。第２組（ｐＭＥ１７０）では両遺伝子は
収束的（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔｌｙ）に転写される。ｐ
ＭＥ１７１は、更にＢｓｔＸＩ断片をＦＢＩ^RａｒｏＦ
プラスミドｐＭＥＸ１３で取り替えて、脱調節プラスミ
ドｐＳＴ３５を生じるＦＢＩ^RａｒｏＦ産物を含む様に
修飾した。これらのプラスミドのＤＡＨＰ合成酵素及び
プレフェネートデヒドラテースへの影響を第１表に要約
した。

【００３６】

【化８】

【００３７】

【化９】

【００３８】

【化１０】

【００３９】

【化１１】

【００４０】

【表２】

【００４１】第１表において、「検出せず」とは、活性
が存在するものの、その活性が低いために検出できなか
ったことを意味する。ＨＷ７７を所定のプラスミドで形
質転換した。各々の株は、０．５％カザミノ酸を添加し
た最少培地でＯＤ₆₀₀が１．０となる迄生育させた。次
に細胞抽出物を調製しプレフェネートデヒドラテース及
びＤＡＨＰ合成酵素の活性を評価した。プレフェネート
・デヒドラテース活性はＬ−フェニルアラニンの存在下
で測定した。ＤＡＨＰ合成活性はフィードバック阻害剤
のない所で測定したので、全体のＤＡＨＰ合成活性を示
している。酵素活性はｍｕ／ｍｉｎ・ｍｇタンパクで表
示した。三つのプラスミドｐＭＥ１７１、ｐＭＥ１７０
及びｐＳＴ３５を、ｔｙｒＡ遺伝子含有ＨＷ７７（本株
は、ＤＡＨＰ及びフェニルアラニンの両者について栄養
要求を示す。）へ導入した。これらの株に対する栄養共
生実験（第２表）からプラスミドｐＭＥ１７０とｐＭＥ
１７１は十分にＬ−フェニルアラニンを生産することが
示された。しかし、ｐＳＴ３５を持つＨＷ７７は、最少
培地上で非常に生育が悪く、その結果としてほとんど栄
養共生を示さない。高レベルのＦＢＩ^RａｒｏＦは細胞
にとって有害であり、すなわち、ＦＢＩ^RａｒｏＦが高
濃度に存在する場合には細胞にとって有害であり、ま
た、該酵素が低いレベル、すなわちより低い濃度で存在
することが、本条件下で最適のＬ−フェニルアラニン生
産に必要であると思われる。

【００４２】実施例３転写において脱調節性のｐｈｅＡ遺伝子を含む複合プラ
スミドプラスミドｐＪＷ２は合成プロモーターから転写される
ＦＢＩ^RｐｈｅＡ遺伝子を持つ。プラスミドｐＭＥ２２
７は、自分のプロモーターから転写し、上述の合成ター
ミネーターで終わるＦＢＩ^RａｒｏＦ遺伝子を持つ。両
プラスミドとも高コピー数のプラスミドｐＡＴ１５３を
基にしている。ｐｈｅＡを持つＥｃｏＲＩ断片は、ｐｈ
ｅＡを持つｐＪＷ２のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片にＥ
ｃｏＲＩリンカーを付加することにより構築した。この
ＥｃｏＲＩ断片をｐＭＥ２２７のＥｃｏＲＩ部位にクロ
ーン化した。ａｒｏＦに対して両方向に転写するｐｈｅ
Ａを持つプラスミドが得られ、ｐＭＥ２３８（分散型ｄ
ｉｖｅｒｇｅｎｔ）及びｐＭＥ２３７（同一線型ｃｏｌ
ｉｎｅａｒ）と名づけた。これらのプラスミドを持つ菌
株のＤＡＨＰ合成酵素及びプレフェネート・デヒドラテ
ースの活性を第２表に示す。第２表フェニルアラニン生産に関係するクローン化遺
伝子（Ｐｈｅプラスミド）を持つＨＷ７７の栄養共生実
験ＨＷ７７を実施例において記載する下記リストのプラス
ミドすべてで形質転換した。２４時間及び４８時間後の
栄養共生相対度合を示す。

【００４３】

【表３】

【００４４】両方のプラスミドは、ＨＷ７７（ＡＴＣＣ
１３２８１）へ導入すると最少培地上での菌株生育を妨
げた。このことは多分ＦＢＩ^RａｒｏＦ遺伝子の過剰発
現に依るものであろう。この結果としていずれの株もフ
ェニルアラニン栄養要求体と共に加えた最少培地上では
十分な栄養共生の分布域を作らなかった。

【００４５】

【化１２】

【００４６】

【化１３】

【００４７】

【化１４】

【００４８】

【化１５】

【００４９】

【化１６】

【００５０】

【化１７】

【００５１】実施例４半合成オペロンの構築本実施例では、ｐｈｅＡとａｒｏＦ遺伝子は、単一の転
写単位内で結合している。プラスミドｐＪＷ２は、合成
プロモーターから転写されるｐｈｅＡ遺伝子を持つ。ｐ
ｈｅＡの下流の変異で作ったＢａｍＨＩ部位は、リボソ
ーム結合部位にＢａｍＨＩ部位を持つａｒｏＦ遺伝子を
クローニングするのに使った。最終的には、ＰｖｕＩＩ
部位とＳａｌＩＩ部位の間に存在するｔｙｒＡ塩基配列
は合成ターミネーターを付加して取り除いた。このプラ
スミドｐＭＥ２０２は、２，４００塩基対のＥｃｏＲＩ
−ＳａｌＩ断片上に半合成オペロンを持っている。この
断片の有用性を一層増す為に、ＳａｌＩ部位にＥｃｏＲ
Ｉリンカーを持つｐＭＥ２０２の誘導体（ｐＭＥ２０
４）を構築した。第３表で、見つかったおよその数を示
す。プラスミドｐＭＥ２０２（ＡＴＣＣ５３１３６）
は、多くの菌株に導入され、それにより多くの培地上で
の生育時のＤＡＨＰ合成酵素及びプレフエネート・デヒ
ドラテースの程度が決定された。これらの一例を第１表
に示した。プラスミドは二つの活性物質を過剰生産して
いるのが明らかであり、フェニルアラニン存在下、非存
在下の生育で酵素レベルを比較することにより、二つの
遺伝子の発現が充分に脱調節となっていると確認され
る。

【００５２】

【表４】

【００５３】ｐＭＥ２０２（ＦＢＩ^RａｒｏＦを保持し
ている）を持つ大腸菌ＨＷ７７を用いて栄養共生実験
で、Ｌ−フェニルアラニン生産テストを行った。（第２
表）。形質転換してないコントロールに対して極端に大
きいコロニー分布域（ｚｏｎｅ）が得られた。このこと
は、オペロン構築で二つの遺伝子の発現を同調させるこ
とが有利なことを示す。ＦＢＩ^RａｒｏＦ生産物のレベ
ルは、最少培地上でのＨＷ７７の生育に十分なものであ
る。

【００５４】実施例５さまざまなプラスミドコピー数の効果評価における半合
成フェニルアラニンオペロン構築体の利用発現へのプラスミドコピー数の効果を確認する為に、ａ
ｒｏＦｐｈｅＡオペロンを持つｐＭＥ２０４からＥｃ
ｏＲＩ断片を次のベクターに再クローン化した。ｐＢＲ
３２２（コピー数５０）に再クローン化してｐＭＨ１９
を得、ｐＬＧ３３８（コピー数１０）にｐＭＥ２０８を
得、ＲＰ４（コピー数１〜３）にｐＭＥ２１４を得た。
これらのプラスミドをｔｙｒＡ株のＨＷ７７及びＨＷ７
６０へ導入し、得られた形質転換体については、最少培
地上での生育性と栄養共生実験でＬ−ｐｈｅの生産性の
テストを行なった。尚、ｔｙｒＡ株のＨＷ７７はチロシ
ンについてのみ栄養要求性である。ｔｙｒＡ株のＨＷ７
６０は、原栄養株ＨＷ７９から誘導されるものであり、
ｔｙｒＡ遺伝子上に欠失を有しておりそのため不活性化
されており、ＨＷ７７の類似体でもある。これらの実験
結果を第４表に要約した。高コピー数の誘導体は明らか
にＨＷ７６０の生育に有害である一方、ＨＷ７７はすべ
てのプラスミドに耐え得ることがわかった。更によりコ
ピー数の少ない誘導体ｐＭＥ２０８とｐＭＥ２１４はＨ
Ｗ７６０の生育を妨げなかった。ｐＭＥ２１４又はｐＭ
２０８を持つＨＷ７６０は栄養共生の非常に大きな分布
域（ｚｏｎｅ）を作った。本実施例は、うまくベクター
を選びｐｈｅＡａｒｏＦオペロンのコピー数を変える
ことにより最適発現レベルを如何に得られるかをよく示
している。

【００５５】実施例６半合成フェニルアラニンオペロンの宿主域の拡大ｐｈｅＡａｒｏＦオペロンを含むｐＭＥ２０４からの
ＥｃｏＲＩ断片を、次の広域宿主ベクターに再クローン
化した。即ち、ＲＰ４に再クローン化して、ｐＭＥ２１
４を、ｐＣＴ４６０に再クローン化して、ｐＭＥ２１１
を、ｐＫＴ２３１に再クローン化してｐＭＥ２１２を得
た。

【００５６】

【表５】第４表の最初のプラスミドｐＭＥ２１４からｐＡＴ１５
３まではＨＷ７７の形質転換体に相当し、その次のプラ
スミドｐＭＥ２１４からｐＭＥ２０２まではＨＷ７６０
の形質転換体に相当する。

【００５７】菌株は、それにふさわしい適当な抗生物質
を添加したＬ−培地で終夜生育させた。終夜培養液の１
ミリリットルを５０μｇ／ｍｌチロシン及び適当な抗生
物質を補った最少乾天培地の上に縞条に流した。生育性
は２４時間と４８時間後に調べた。これらのプラスミド
を、各種の菌株に形質転換、接合又は吸着（ｍｏｂｉｌ
ｉｚａｔｉｏｎ）により導入して、大腸菌Ｌ−ｐｈｅ栄
養要求株の栄養共生（ｃｒｏｓｓ−ｆｅｅｄｉｎｇ）に
ついて調べて、各種菌株のＬ−ｐｈｅ生産性を検出し
た。第５表に、種々の生物／プラスミド組み合わせと栄
養共生を詳しく示した。意味ある栄養共生が、ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｄｓと条件的メチロトローフスを含む生物
で、認められた。

【００５８】原理的には、適当なプラスミドに人工オペ
ロンの様なものを単に導入するだけで反応経路が調節を
受けない様にする本発明の方法は、有益な特性を持つほ
とんどの微生物にも拡張できるであろう。発現は多分、
例えばグラム陽性の生物に対しては再び最適化する必要
があろう。またこのことは合成プロモーターと種々のリ
ボゾーム結合部位に変更を必要とするであろう。そのよ
うな企ては、オペロンのモジュラー構造やリボゾーム結
合部位に制限酵素部位のあることにより非常に行ない易
いであろう。

【００５９】実施例７オペロンの拡張−α−アミラーゼ遺伝子の取込み修飾したα−アミラーゼ遺伝子は、リボソーム結合部位
にＢａｍＨＩ部位が、遺伝子下流のＨｉｎｄＩＩＩ部位
にはＢａｍＨＩリンカーが隣接している。ａｍｙ遺伝子
を運ぶＢａｍＨＩ断片は、ｐＭＥ２０２の下流のＢａｍ
ＨＩ部位にクローン化し、人工的な三遺伝子オペロンｐ
ＰＴ１１２（ＡＴＣＣ５３１３９として寄託）（チャー
ト１１参照）が得られた。このプラスミドをＨＷ７７へ
形質転換し、澱粉での生育性を調べた。澱粉とブドウ糖
でのＨＷ７７／ｐＰＴ１１２の生育性の比較から、澱粉
でもブドウ糖でも生育速度の違いは小さいが澱粉での生
育の方は遙かに長い対数期を必要とする（第２図）こと
が明らかになった。５０ｇ／ｌの可溶性澱粉で生育した
ＨＷ７７／ｐＰＴ１１２による発酵でＬ−ｐｈｅの意味
ある蓄積が見られた（第３図）。発酵条件は、初期培地
にブドウ糖を含めなかったことと蔗糖供給を行なわなか
ったことの他は実施例１０で記載したと同じであった。
可溶性澱粉は５０ｇ／ｌをオートクレーブに先だち発酵
槽に仕込んだ。

【００６０】

【表６】第５表他の属の菌のＬ−ｐｈｅ生産を高める
為に広域宿主プラスミドへのｐｈｅオペロンの利用プラスミド：ｐＭＥ２０２ｐＡＴ１５３におけるｐｈ
ｅオペロン。ｐＭＥ２０４ＳａｌＩ部位にＥｃｏＲＩリンカーを持
つｐＭＥ２０４として。ｐＭＥ２１１ｐＭＥ２０４からのｐｈｅオペロンをｐ
ＣＴ４６０のＥｃｏＲＩ部位にクローン化したもの。ｐＭＥ２１２ｐＭＥ２０４からのｐｈｅオペロン（Ｈ
ｉｎｄIII へ向かって転写される）をｐＫＴ２３１のＥ
ｃｏＲＩ部位にクローン化したもの。ｐＭＥ２１３ｐＭＥ２０４からのｐｈｅオペロン（ｓ
ｔｒ．に向かって転写される）をｐＫＴ２３１のＥｃｏ
ＲＩ部位にクローン化したもの。ＲＰ４ｐＭＥ２０４からのｐｈｅオペロン（Ｈ
ｉｎｄIII 部位に向かって転写される）ＲＰ４のＥｃｏ
ＲＩ部位にクローン化したもの。

【００６１】

【表７】

【００６２】実施例８オペロンの拡張−ａｓｐＣ遺伝子の取り込み人工のｐｈｅＡａｒｏＦオペロンは、更に修飾しアス
パラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐＣ）遺伝
子を含むべく次の様にした。即ち、リボソーム結合部位
にＢａｍＨＩ部位が、またａｓｐＣ遺伝子の下流にＢｇ
ｌＩＩ部位が隣接するａｓｐＣ遺伝子を持つｐＩＦ１８
を、ａｓｐＣを内包するＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ断片の
源として使った。この断片は次にＢａｍＨＩで部分分解
したｐＭＥ２０２へクローン化して、誘導体ｐＭＥ２１
９（ＡＴＣＣ５３１３８として寄託してある）を得た。
このものは三遺伝子の人工オペロンを生じる様にａｒｏ
Ｆの下流にａｓｐＣ遺伝子を持っている（チャート１
０）。ＨＷ７７へ導入すると、このプラスミドは栄養共
生で検出された如くＬ−ｐｈｅを生産する。細胞フリー
の抽出物解析によりａｓｐＣ活性レベルが向上している
ことがわかる（第６表）。

【００６３】

【表８】

【００６４】菌株は０．５％カザミノ酸を補ったブドウ
糖最少培地でＯ．Ｄ．６００になる迄生育させた。本構
築体の有益性は、本プラスミドがフェニルアラニンの経
路を単に調節しないだけでなくａｓｐＣレベルの向上を
もたらすということにある。このことは、Ｌ−フェニル
アラニンの力価を上げる為にはアスパラギン酸塩又はグ
ルタミン酸塩とともに化学合成したＰＰＡをＬ−ｐｈｅ
醗酵に補給出来ることに役立つ。この様な発酵とバイオ
コンバージョンの組み合わせは、Ｌ−ｐｈｅ単離がより
一層容易なることとＬ−ｐｈｅのより高生産性なことを
包含する特徴を有している。

【００６５】

【化１８】

【００６６】

【化１９】

【００６７】

【化２０】

【００６８】

【化２１】

【００６９】

【化２２】

【００７０】

【化２３】

【００７１】

【化２４】

【００７２】実施例９フェニルアラニンオペロンプラスミドの菌株スクリーニ
ングへの応用全部で３１ヶの大腸菌株を他の腸内種のものの外にｐＭ
Ｅ２０２で形質転換し、最少培地上での生育性とＬ−ｐ
ｈｅ栄養要求体の栄養共生によりスクリーニングした。
その結果を第４表に要約したｐｈｅＡとａｒｏＦの完全
な脱調節は、通常の突然変異法の５〜６回を要するかも
知れないので、複合プラスミド法は速さの点で非常に大
きい長所があると見ることが出来る。４５菌株のこの程
度の突然変異を達成するには、これまでの方法では、１
０年が必要であろう、また損傷（ｌｅｓｉｏｎｓ）が直
接に比較出来る保証がないかも知れない。複合プラスミ
ド法を使い、菌株は同じ損傷で容易に脱調節することが
出来、最初のスクリーニングにより二週間以内で評価す
ることが出来る。

【００７３】実施例１０Ｐｈｅプラスミドの発酵での有用性Ｐｈｅプラスミドを持つ菌株のＬ−フェニルアラニン生
産能力を調べる為に、１０リットル発酵槽でのＨＷ１０
５７（ＨＷ７７・ｐＭＥ２０２）とＨＷ７７との生産性
を比較した。両方の菌株を単一コロニーからＬ−培地で
１５時間培養した。ＨＷ１０５７培地は、アンピシリン
１００μｇ／ｍｌを補った。これらの終夜培養液を、次
の最少培地を含む振盪フラスコに加えた。最少培地：ブドウ糖１９．４（ＮＨ₄）₂ＨＰＯ₄ ２．０Ｋ₂ＰＯ₄ ６．６ＦｅＡｍｍＣｉｔ０．１チロシン０．２２５ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ２．２５添加割合はグラム／リッターである。微量成分溶液も１
ｍｌ／ｌ加えた。ＨＷ７７ｐＭＥ２０２の生育培地には
アンピシリンを加えた。

【００７４】この種培地（ｓｅｅｄｃｕｌｔｕｒｅ）
は３３℃で１２時間培養し、同じ培地の１０リットル攪
拌発酵槽に加えた。発酵はチロシンが消費する迄、即ち
ブドウ糖供給が始まるまで約１１時間続けた。チロシン
欠乏により、生育はＡ₆₇₀＝約２０に限られた。７０％
のブドウ糖供給は０．６３ｇ／ｌ・時間の割合で行なっ
た。Ｌ−フェニルアラニン濃度は、発酵の間つねにモニ
ターした。第５図でＨＷ７７とＰｈｅプラスミドｐＭＥ
２０２を持つＨＷ７７との典型的な比較を詳しく示す。
本発明のプラスミドの存在で、Ｌ−フェニルアラニンの
蓄積速度と最終力価が高くなっているのは明らかであ
る。生産性と最終的な培地での力価の詳細を要約すると
次の表のようである。

【００７５】

【表９】

【００７６】尚、前記第１表において示したように、Ｈ
Ｗ７７はＬ−フェニルアラニンをその量はわずかではあ
るが、合成することができる。発酵槽の培地を解析し
て、ＨＷ７７はプレフエネート及びコリスメートの両方
をかなりの量蓄積するのに対し、ＨＷ７７・ｐＭＥ２０
２は蓄積しないということも明らかになった。このこと
はｐＭＥ２０２上の脱調節化されたｐｈｅＡ遺伝子が、
ｉｎｖｉｖｏのプレフエネートデヒドラテース活性を
上げることにより反応経路のＬ−フェニルアラニン分岐
枝の流れを増大させるという望ましい効果を持つことを
示している。

【図面の簡単な説明】

【図１】芳香族アミノ酸生合成経路の概略図を示す。第
１図において、ｒは抑制、ａはアテニュエーション（減
弱）、ｆはフィードバック抑制を示す。

【図２】フドウ糖と澱粉でのＨＷ７７／ｐＰＴ１１２の
生育曲線を示す。

【図３】可溶性澱粉でのＨＷ７７／ｐＰＴ１１２の発酵
を示す。Ａ６７０は６７０ｎｍの光の吸光度を示し、◇
Ａ６７０は６７０ｎｍの光の吸光度の経時変化を示す。

【図４】Ｌ−フェニルアラニン生産用複合プラスミド
（ｐＭＥ２０２）を使い４８時間後測定の分布域サイズ
（ｚｏｎｅｓｉｚｅ）を用いたフェニルアラニン生産
株のスクリーニングを示す。

【図５】ＨＷ７７及びＨＷ７７／ｐＭＥ２０２による発
酵時のフェニルアラニン生産の比較を示す。Ａ６７０は
６７０ｎｍの光の吸光度を示し、◇Ａ６７０は６７０ｎ
ｍの光の吸光度の経時変化を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｐ 13/22 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者ハンター，マイクルジョージイギリス国エイリスベリィ，タマークロース８ (72)発明者フォザーリンガム，アイアングラハムイギリス国オックスフォード，ヘッディントン，エイロンドンロード 101

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】芳香族アミノ酸を製造する方法であっ
て、（ａ）自律複製単位（レプリコン）を含む第一のＤＮＡ
断片、及び二つ以上の遺伝子及びプロモーターを有する
人工的な遺伝子群（オペロン）であってこれら遺伝子と
プロモーターとの組合わせは本来一つの遺伝子群中には
存在していないものである該人工的な遺伝子群を含む第
二のＤＮＡ断片を含有する複合プラスミドであって；上
記遺伝子は、フィードバック阻害抵抗性であって芳香族
アミノ酸の合成で機能する酸素をコードする変異ｐｈｅ
Ａ、ｔｙｒＡ、ａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ａｒｏＨ、ａｒｏ
Ｌ及びｔｒｐＥ遺伝子からなる群より選ばれるものであ
る上記複合プラスミドを含む細菌細胞カルチャーを用い
て醗酵を実施し；（ｂ）次いで該アミノ酸を単離する；ことを含む上記方
法。
【請求項２】該アミノ酸がフェニルアラニンである請
求項第１項記載の方法。
【請求項３】該アミノ酸がチロシンである請求項第１
項記載の方法。
【請求項４】該アミノ酸がトリプトファンである請求
項第１項記載の方法。
【請求項５】芳香族アミノ酸の製造方法であって、ｉ）（ａ）チャート３、（ｂ）チャート５、（ｃ）チャ
ート７、（ｄ）チャート９、（ｅ）チャート１０及び
（ｆ）チャート１１に示すＤＮＡ配列からなる群より選
ばれる精製され単離されたＤＮＡ配列を含むプラスミド
を有する細菌細胞カルチャーを用いて醗酵し；ｉｉ）次いでアミノ酸を単離する；ことを含む上記方
法。
【請求項６】芳香族アミノ酸がフェニルアラニンであ
る請求項第５項記載の方法。
【請求項７】芳香族アミノ酸がチロシンである請求項
第５項記載の方法。
【請求項８】芳香族アミノ酸がトリプトファンである
請求項第５項記載の方法。
【請求項９】フェニルアラニンによるフィードバック
阻害に抵抗性を示し、第８図に示すポリペプチドのアミ
ノ酸配列を有する、フェニルアラニンの合成で機能する
酵素。
【請求項１０】チロシンによるフィードバック阻害に
抵抗性を示し、第１０図に示すポリペプチドのアミノ酸
配列を有する、芳香族アミノ酸の合成で機能する酵素。