JPH0759199B2 - 発酵法によるｌ−トリプトフアンの製造法 - Google Patents

発酵法によるｌ−トリプトフアンの製造法

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JPH0759199B2
JPH0759199B2 JP56130346A JP13034681A JPH0759199B2 JP H0759199 B2 JPH0759199 B2 JP H0759199B2 JP 56130346 A JP56130346 A JP 56130346A JP 13034681 A JP13034681 A JP 13034681A JP H0759199 B2 JPH0759199 B2 JP H0759199B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は試験管内で作り上げた組換えプラスミドを有す
るエシエリヒア属の微生物のＬ−トリプトフアンの発酵
生産への利用に関するものである。
野生型の菌株による炭水化物からＬ−トリプトフアンの
生産については、文献にはその人工変異株を経て得られ
るものが知られている。かかる人工変異株の公知の例と
して、ブレビバクテリウム属の5-メチル‐トリプトフア
ン耐性株（米国特許3700539号）、バチルス属の5-フル
オロトリプトフアン耐性株（特開昭49-20391）、及びエ
ンテロバクター属の5-メチル‐トリプトフアン耐性株
（特開昭51−57888）がある。
最も有力な公知のトリプトフアン生産菌は、コリネバク
テリウム・グルタミクムATCC21851であり、フエニルア
ラニン及びチロシン要求性で、4-メチル‐トリプトフア
ン、6-フルオロ‐トリプトフアン、4-アミノ‐フエニル
アラニン、4-フルオロ‐フエニルアラニン、チロシン‐
ヒドロキサメート、フエニルアラニン‐ヒドロキサメー
ト耐性菌である。この菌株はケーン ブラツクストラツ
プ モラセスの糖15g/dlからトリプトフアン16.8mg/ml
を生産した。しかしながらこの最良の方法にも拘らず、
トリプトフアンの収量は商業的生産の要求を満すにはな
お不充分である。
最近開発された遺伝子組換えの技術を利用して、トリプ
トフアンを高度に生産するように微生物を処理すること
ができるようになることは望ましいことである。遺伝子
導入の一般技術及び細菌内で増殖してそれを発明しうる
技術については、最近Gilbert and Villa-KomaroffがSc
ientific American,242:74-94（1980）に記述してい
る。概説すると、１個又は２個以上の遺伝子を供与菌例
えば原核細胞又は真核細胞から取出して、試験管内でベ
クター又はプラスミドに、エンドヌクレアーゼで切断
後、リガーゼで結合し、１個又は数個の遺伝子を含有す
るハイブリツドプラスミドは次いで宿主細胞、通常原核
細菌と混ぜる。塩化カルシウムの希薄溶液は細胞膜にプ
ラスミドの透過性を付与し、細胞はプラスミドを取込
む。プラスミドを有する宿主微生物は次いで増殖し、無
数の組換えDNAの同じコピーを生産する。若し適当な遺
伝子調整手法があれば、増大した遺伝子は宿主の蛋白合
成機構を利用して相当する酵素を生産するであろう。
Hershfield等は例えば（Proceedings of the National
Academy of Sciences、USA、71:3455-3459（1974））
に、トリプトフアン（trp）生産（trp A-Egene）に関
する遺伝情報を有するE.coliのDNA断片を、Col E1（col
icinogenic factor E1）プラスミドに挿入し、得られた
ハイブリツドプラスミド（Col E1 trp）によつてE.coli
のトリプトフアンオーキソトロフを形質転換したところ
トリプトフアンオーキソトロフがトリプトフアンプロト
トロフになつたことを報じている。これによつてトリプ
トフアン生合成酵素が高いレベルになつたとしている。
しかしながらこれらの著者がトリプトフアンの生産を更
に向上させようとしなかつたのは、彼等の目的がCol E1
プラスミドがDNAのクローン化とか増殖のための担体と
して利用できることを証明することだけであつたからで
ある。
細菌における芳香族アミノ酸（トリプトフアン、チロシ
ン、フエニルアラニン）の生合成の系路をチヤート１に
示す。
チロシン、フエニルアラニン及びトリプトフアンは何れ
も共通の合成中間体コリスミン酸を経て生成される。チ
ロシンとフエニルアラニンは更に他の共通の中間体プレ
フエン酸から生成される。トリプトフアン生成過程の最
初の主な酵素はアンスラニル酸合成酵素で、この酵素は
E.coliに於てはＬ−トリプトフアンによりフイードバツ
ク阻害を受ける。トリプトフアナーゼによるトリプトフ
アンがインドールになる分解についてもチヤート１に示
されている。
高いレベルのトリプトフアン生産能を有する微生物は引
続いて必要とされているし、又従来の変異の手法で得ら
れたものとは全く別の微生物を使い、高い収率でトリプ
トフアンを生産する方法も又ずつと必要とされているの
である。本発明のこれらの目的は下記の記載で容易に明
らかにされかつ達成されたのである。即ち酵素トリプト
フアナーゼを欠失し、トリプトフアン生成を調整する遺
伝情報をもつたプラスミドを有するエツシエリヒア属に
属する宿主細菌、及び前記細菌を培地に培養して発酵法
によりＬ−トリプトフアンを生成し、生成したＬ−トリ
プトフアンを培地から採取する方法を提供することによ
りこの目的は達成されたのである。
本発明及びこれに伴なう数々の利点については、下記の
詳細な説明と添付図面を併せて考察し、良く理解するこ
とによつてより完全な認識が容易に得られるであろう。
第１図はpBR322ベクターとE.coli serB遺伝子から得ら
れるプラスミドpSerB59-1を示す。略記号は下記の菌を
起源とする制限エンドヌクレアーゼ酵素を示す。
Bgl I:バチルス グロビツギイ Bam HI:バチルス アミロリクイフアシエンスＨ EcoR I:エツシエリヒア・コリRY13 Pst I:プロビデンシア スツアルテイ164 Hind III:ヘモフイラス インフルエンザ Rd Bat E II:バチルス ステアロサーモフイラス ET Hpa I:ヘモフイラス パラインフルエンザ Sal I:ストレプトマイセス アルビスＧ Xba I:キサントモナス バドリイ Sac I:ストレプトマイセス アクロモゲネス Sst I:ストレプトマイセス スタンフオード Bcl I:バチルス カルドリイテイクス Xho I:キサントモナス ホリコラ Kpn I:クレブシエラ ニユーモニエ Pvu II:プロテウス ブルガリス 第２図は遺伝子の運び手としてベクターpBR322を使い、
細胞DNAのMTR＃２trp遺伝子をクローン化する手法を示
す。略記号は下記の通りである。
Sau 3a:スタフイロコツカス オーレウス3aから得たエ
ンドヌクレアーゼ Amp:アムピシリン耐性遺伝子 第３図はserB遺伝子とMTR＃２trpE遺伝子の両方を有す
る複合プラスミドの調製法を示すフローチヤートであ
る。略記号は下記の通りである。
MTR＃2trp:メチルトリプトフアン耐性E.coli （フイードバツク耐性アンスラニル酸合成酵素を
有する） pGx:プラスミド記号方式 第４図は宿主菌株の造成を示すフローチヤートである。
略号及び記号は下記の通りである。
37-1:HfrH（gal-bio-attλ）▽deo＝serB-trpR）▽thi-
E.coli株、 SP338:trpED，tan2，thr- E.coli株、 61-1:（deoB−serB）▽thi-（gal−bio−attλ）▽E.co
li株、 5161:tyrA:tn10挿入株 P1:バクテリオフアージP1kc（transducing phage） tetR：テトラサイクリン耐性 AGx:菌株記号方式 本発明は発酵法によりＬ−トリプトフアンを高度に生産
する能力を有する大腸菌を提供する。DNA供与菌から得
たDNAを有するプラスミドの作成、受容菌株の作成及び
受容菌とDNA供与菌から形質転換菌を得た方法は下記の
如くである。
A.プラスミドの作成 本発明に於て使用するプラスミドはストリンジエント
（単一コピーのプラスミド）であつても又リラツクスド
（複数コピーのプラスミド）であつてもよい。複数コピ
ーのプラスミドの方がトリプトフアンの収率が高いので
望ましい。複数コピーのプラスミドを使うとできた形質
転換株の不安定化をおこし易くプラスミドの損失を招
く。（Herschfield et al,supra;Hallwell,R.A.,et al,
Gene 9:27-47（1980）参照）しかしながらこの損失を防
ぐために本発明の望ましい態様として、温度感受性のtr
pR遺伝子（trpRts ）、又はtrpR遺伝子を添加することが
できる。この遺伝子は生成物の生成を温度により調整す
ることができる。（下記参照）この遺伝子により複数コ
ピーのプラスミドを有する菌株の安定性を更に増大させ
ることができる。
本発明で使用するプラスミドは野性型又は変異型のアン
スラニル酸合成酵素等がフイードバツク阻害耐性となつ
ているtrpオペロン遺伝子を含んでいる。望ましい態様
としてプラスミドは更にserB+ 遺伝子を含有する。trpオ
ペロンを有するプラスミド又はtrpオペロンとserB+ 遺伝
子の双方を有するプラスミドは、公知のプラスミド又は
ベクターの何れかを使つて作り上げることができる。こ
れらプラスミドはE.coliプラスミド又はE.coliの中で複
製することのできるプラスミドである。使用できるプラ
スミドのうち下記のものをあげることができる。ColE1,
pSC101,pSF2124,pMB8,pMB9,ACYC184,pAcYC177,pCK1,R6
K,pBR312,pBR313,pBR317,pBR318,pBR320,pBR321,pBR32
2,pBR333,pBR341,pBR345,pBR350,pBR351,pML2,pML21,Co
lE1Ap,RSF1010,pVH51,pVH151,pVH153（Recombinant Mol
ecules:Impact on Science and Soceety:Beers,R.F.,an
d Bassett,E.G.eds.Raven Press,New York（1977）。其
他のプラスミドとしてpBR327,pBR325及びpBR328（Sober
on,et al,Gene9:287-305（1980））があり、又其他にも
“DNA Insertion Elements,Plasmids and Episomes",Bu
khari et al（eds）,Cold Spring Harbor Laboratory
（1977）に記載されたものがある。望ましいプラスミド
はpBR型の複数コピイプラスミド、その誘導体及びColE1
及びその誘導体である。
一つのプラスミドの中にserB+ とtrp遺伝子の両方が存在
すると、発酵中に若したまたまこのプラスミドが消失し
ても、ser要求性の宿主菌が増殖できず、又受容菌のあ
るものはtrp要求菌であり得るから、これらの菌は培地
がトリプトフアン源を含有しない限り当然増殖しない。
しかしながらtrp遺伝子含有プラスミドは失はれなけれ
ば菌は高いレベルでトリプトフアンを生産し続けるので
培地中にトリプトフアンが含有されていて、プラスミド
を失つたトリプトフアン要求性宿主菌は生長を続けるこ
とができる。このことは培地のトリプトフアンの望まし
くない消費を引起しアミノ酸の全収量を低下させる。tr
p+ 及びserB+ 遺伝子の両方を含む複合プラスミドを作つ
ておくと、若しtrp及びser要求菌を宿主として使えば、
複合プラスミドの消失が起つてもセリンが培地に含まれ
ていないので生長は止り、トリプトフアンの消費は起ら
ないことが確かめられた。serB 遺伝子を有するプラスミドは例えばpBR322からSome
rville（Roeder and Somerville,Molecular and Genera
l Genetics,176:361-368（1979））の方法によつて作る
ことができる。このプラスミドはpSerB59-1と呼ばれ確
認されたエンドヌクレアーゼの部位と共に第１図に記載
されている。プラスミドは凡そ9.4キロ塩基の長さを有
し、必要とするもの以上の遺伝情報を保有している。サ
イズを小さくし従つて細胞当りのプラスミドのコピイの
数を増やすにはpSerB59-1の不要部分を除くのが望まし
い。pSerB59-1DNAはエンドヌクレアーゼSau 3aによつて
種々の程度にわたり部分的に切断される。
即ちSau 3aは の所で切断して、各断片の５′のエンドにシングルスト
ランドのテトラヌクレオタイドGATCを生ずる。Sau 3aは
４塩基を認識するのでpSerB59-1の中を各所で切断す
る。部分的に切断するとプラスミドの幾分ランドムな断
片が得られる。切断されたものは次いでフアージT4リガ
ーゼによつて低濃度で結合し、環を形成するか又はエン
ドヌクレアーゼBam H1によつて切断されたpBR322DNAと
高濃度下で結合される。Bam HIはSau 3aのようにヘキサ
ヌクレオタイドを認識して の所で切断し、５′末端にSau 3aと同じシングルストラ
ンドのテトラヌクレオタイドを生成する。従つてSau 3a
で切断されたDNAは容易にBam HIで切断されたDNAと結合
させることができる。serB遺伝子を有するプラスミドを
選別するには、各種遺伝子断片を有するプラスミドの混
合物をセリン要求株に導入し、セリンを含まない培地に
増殖したコロニーを分離すればよい。例えばこの目的の
ためにstrain37-1E.coli W3110,HfrH，（gal-bio-at
tλ）▽（deo-serB-trpR）▽，thi-，（Roeder and Som
erville,Molecular and General Genetics 176:361-368
（1979）を宿主菌として形質転換する。serB遺伝子を有
するプラスミドは上のようにコロニイ（Eckhardt,T.,Pl
asmid,1:584-588（1978））分離することができる。こ
のような方法によつてpSerB59-1より小さい即ちpSerB59
-1のサイズの85〜51％の範囲で除去が観察される数個の
プラスミドを分離することができる。得られた小さなプ
ラスミドについてアムピシリン耐性、そのサイズ、制限
部位を調べることにより最も有効なクローニングビーク
ルを選択できる。例えばpSerB59-1の45％のサイズを有
するもの及び約4.2キロベースのサイズを有する２個の
プラスミドを分離することができる。これらのプラスミ
ドは何れもEco RIの切断部位はなく、Bg1 I 2個、Bst E
II 1個、Bgl II 1個、Sal Iなし、及びPst I 1個の切断
部位を有している。pBR322から得られたserB+ 遺伝子を
有するプラスミドの制限酵素切断点を示す地図をプラス
ミドの中のserB+ 遺伝子の予想位置と共に第１図に示
す。これが酵素Pst I存びBa1 IIが外来遺伝子をこのプ
ラスミドに挿入する際に使えることが確かめられた。Ps
t Iの部位はアムピシリン耐性遺伝子の残つている所に
位置している。Bgl IIの部位はプラスミドの中に優先的
に保持されているように見えるが、serB遺伝子の中に位
置していない。このことはSau 3aで切断される細胞DNA
をプラスミド６のBgl IIの部位に組込ませて、serB+遺
伝子の作用が保持されていることを証明することによつ
て示すことができる。このプラスミドは単に典型的な例
にすぎない。しかしながら好ましい態様としてこのプラ
スミドをクローニングビークルとして利用する。
（ａ）野生タイプのtrpオペロン及び（ｂ）フイードバ
ツク阻害耐性、アンスラニル酸シンテアーゼtrpオペロ
ンを単独でプラスミド中に入れるか、又はserB遺伝子を
含有するプラスミドの中に挿入して使うことができる。
後者の変異trp遺伝子に於ては、アンスラニル酸シンテ
アーゼがトリプトフアンによるフイードバツク阻害に対
し耐性を有している。これはトリプトフアン拮抗物質耐
性を有する変異株に高い頻度で見出すことができる。こ
れらの拮抗物質はエツシエリヒアの菌株の生育を阻害す
るが、この阻害作用はトリプトフアンが培地に存在する
と部分的又は完全に抑制される。トリプトフアン拮抗物
質の例としては、4-フルオロ‐トリプトフアン、5-フル
オロ‐トリプトフアン、6-フルオロ‐トリプトフアン、
7-フルオロ‐トリプトフアン、4-メチル‐トリプトフア
ン、5-メチル‐トリプトフアン、6-メチル‐トリプトフ
アン、7-メチル‐トリプトフアン、ナフチル‐アラニ
ン、インドール‐アクリル酸、インドール及びトリプタ
ザンなどがある。更にこのプラスミドはtrpオペロンの
アテヌエター領域が除かれているように調製してもよ
い。（Oxender et al,Proe.Nat.Acad.Sci.U.S.A.,76:55
24（1979））この領域はtrpオペレーターとtrp Eの間に
存在している。アテヌエター領域が適切に存在し、かつ
過剰のトリプトフアンと活性あるtRNAtrpが存在する
と、トリプトフアンリーダーの中の終点迄の８つの転写
のうち一つしか転写されない。このようなアテヌエータ
ーによる支配を除去すれば、trpオペロン酵素のレベル
を非常に高めることができる。早く終つた複写がなけれ
ば代謝エネルギーの節約になり、それだけトリプトフア
ンの生産に使われるからである。
フイードバツク阻害耐性trp遺伝子は、trpオペロン中を
切断しないエンドヌクレアーゼによつてE.coli変異株tr
pオペロンを部分的又は充分に切断し、次いでDNA断片と
プラスミド断片が略同様の分子濃度になるような濃度
で、例えばT4フアージDNAリガーゼを使つてプラスミド
と結合することによつてクローン化することができる。
第２図にはかかる技術をMTR＃２（Somerville,R.and Ya
nofsky,C.,J.Mol.Biol,11:747（1965）をDNA供与菌と
し、pBR322をプラスミドとして使つて例示している。最
初の結合は高いDNAの濃度で行なうのが望ましく、かく
して長鎖状分子が主に生成する。得られたDNAはベクタ
ーは切断するがtrpオペロンを切断しない制限酵素によ
つて切断され、ついで低い濃度にまで薄められて再結合
する。濃度の低い方が環形成に有利である。変異トリプ
トフアンオペロン含有プラスミドの検出と選別は、これ
により（trp A-E）▽株（Zalkin,H.,et al,J.Biol.Che
m.,249:466-475（1974））を形質転換し、最小培地で菌
を増殖させることによつて行われる。5-メチルトリプト
フアン耐性はMTR＃株のtrpオペロンの特性である。生成
したプラスミドはフイードバツク耐性trpオペロンをser
B+ 含有プラスミドの中への組換えに使うことができるの
は既に述べた通りである。MTR＃２trp+ オペロンは単に
例示にすぎないのであり、フイードバツク阻害耐性アン
スラニル酸シンテアーゼ発現遺伝子の何れも使用するこ
とができる。
変異trpオペロン（例えばMTR＃２）含有プラスミドとse
rB含有プラスミドとの組換えによりtrp+ ‐ser+複合プラ
スミドができる。例えばMTR＃２trp含有DNAの部分切断
物は、高いDNA濃度に於て過剰の切断されたserB+ 含有プ
ラスミドDNAとT4フアージDNAリガーゼにより結合させる
ことができる。高分子量の結合DNAは、trpオペロン中を
切断することのない第２の制限酵素で切断し、低濃度に
希釈し再び結合させて環を形成させる。生成したプラス
ミドはtrp及びserのE.coliを形質転換するものとして選
別され、serB+ ／変異trp含有プラスミドはこれらの細胞
にトリプトフアンとセリン欠の培地に増殖する能力を与
える。serB+ 遺伝子含有のプラスミドから作られる同様
のプラスミド及び野生タイプのtrpオペロン含有プラス
ミド、例えばpCC 3（Collins,C.J.,Proc.Nat.Acad,of S
ci.,USA 73:3838（1976））もまた作ることができ、同
じ方法でテストされた。野生タイプのtrp+ オペロン遺伝
子もまたクロモゾームから直接採取することができる。
この複合プラスミドはその中にserB+ と野生又は変異型
のtrp遺伝子が結合して含まれている。
B.宿主菌株の造成 本発明に於てはハイブリツドDNAプラスミドの受容菌と
してE.coliのトリプトフアナーゼ欠失変異株が用いられ
る。望ましくはtrpオペロン欠失株（trpoperon▽）及び
又は非復帰型トリプトフアナーゼ変異株（tna）を使う
とよい。トリプトフアナーゼがなければトリプトフアン
は分解されず分泌したL-トリプトフアンの収量は高くな
る。トリプトフアン要求株を受容株として使用すればト
リプトフアンを生産する形質転換株を受容株から容易に
選別できる。プラスミドの上にserB+ 遺伝子が存在する
ときには、セリン要求株を又宿主株としてもよい。本発
明で使用する宿主は下記（１）のaroP遺伝子を欠失する
ものであり、望ましくは下記の（２）〜（６）の１又は
２以上の遺伝子欠失を有する方がよい。（１）aroP遺伝
子：この遺伝子は芳香族アミノ酸の細胞膜透過性を調節
する。aroP変異株に於てはトリプトフアンの分泌がアン
スラニル酸シンテアーゼの作用に比例している。（２）
trpR遺伝子（トリプトフアンリプレツサー遺伝子）：こ
の遺伝子はトリプトフアン生合成系路のリプレツシヨン
を調節する。trpR変異株に於ては生産されるトリプトフ
アンの量の如何に拘らずトリプトフアンによるリプレツ
シヨンは解除されている。（３）trpR遺伝子は又望まし
くは温度感受性即ちtrpRts であつてもよい。この場合低
温ではtrpリプレツサーが生成されるが細胞の生育は正
常である。細胞が増殖して充分な程度に達した後温度を
高めると、リプレツサーは不活性化され其後のtrpR 産物
合成機能を阻止される。（４）tyrA：この遺伝子はチロ
シンの生合成系路が欠損したもので、tyrA変異株に於て
は芳香環を有する前駆物質（コリスミン酸）の流れをtr
p及びフエニルアラニン系路の方に転向させることがで
きる。（５）pheA：この遺伝子はフエニルアラニンの生
合成系路が欠損したものである。pheA変異株に於ては芳
香族の前駆物質（コリスミン酸）の流れをtrp及びtyr系
路の方に転向させることができる。（６）tyrA pheA：
この遺伝子はフエニルアラニン及びチロシン両方の系路
が欠損したものである。
宿主株はトリプトフアンの生合成の流れとその分泌を最
大に発揮させるために、上記の変異の１種以上を保有す
るのがよい。trp オペロン欠失株としてtrpED102株を使うことができ
る。スレオニン要求性trpED ▽株、E.coli SP338（trpED
▽102,tna2,thr-）（Roeder and Somerville,Molecular
and general Genetics,176:361-368（1979））はフア
ージP1リゼート（Rosner,J.L.,Virology49:679-689（19
72））を用いて形質導入により得ることができる。この
フアージP1はE.coli 61-1（Roeder and Somerville,Mol
ecular and General Genetics,176:361-368（1979））
〔（deoB‐serB），thi-，（gal-bio-attλ）▽〕か又
はE.coli37-1（Roeder and Somerville,supra.）〔Hfr
H，（gal-bio-attλ）▽（deo-serB-trpR）▽，thi-〕
の何れかを用いて調製される。トリプトフアン要求株と
してはもはやスレオニンを要求せずセリン要求株になつ
たものが選ばれる。これらの株はtrpR- 37-1P1リゼート
とtrpR+61-1リゼートを使つて作ることができる。
trpRts変異株はP1リゼートを本発明の野生型のE.coli又
は変異型のE.coli株に導入したtrp‐lac融合E.coli株か
ら得ることができる。
（Reznikoff et al J.of Bact.,109:526-532（197
2））。trp‐lac融合株の中のtrpRts 変異株の同定は容
易である。
aroP変異（Kuhn,J.C.and Somerville,R.L.,Bioch.Bioph
ys.Acta 332:298-312（1974）;Brown K.D.,J.Bact.106;
70-81（1971））をtrpR+ 61-1のE.coliに挿入するには、
E.coliKB3100（Brown,K.D.,J.Bacteriol.106:71-81（19
71））からP1による形質導入を行いβ‐2-チエニル‐DL
-アラニル（Brown,K.D.,J.Bact.104:177-188（1970））
耐性株を選択すればよい。trp-ser 欠失細胞がtrp-serプラスミドの一つを含有し、
そしてトリプトフアンの補給がないときには、β‐2-チ
エニル‐DL-アラニンによつて生育が阻害されるので充
分aroP変異株を選択することができる。E.coliKB3100
（aroP- ）のフアージP1リゼートはプラスミド含有のtrp
-ser- 株に感染させβ‐2-チエニル‐DL-アラニンのプレ
ートに速かに生育するコロニーを選別する。速かに生育
しトリプトフアンの優れた分泌能力を有する菌株がaroP
変異を含有しているものである。tyrA 位に挿入されたトランスポゾンTn10（Kleckner,N.e
t al.Proc.Nat.Acad.Sci.USA 73:3838-3842（1976））
を有するE.coli（E.coli5161）株を使つて、菌株にtyrA
とtyrA-pheA変異を導入することができる。このような
E.coliのフアージP1リゼートはtrpR+及びtrpR-を形質導
入により得るのに使用される。テトラサイクリン耐性チ
ロシン要求株（tetRtyr-）が選択されるがテトラサイク
リン感受性誘導株を選別するには、アムピシリンを増強
するか（Miller,J.H.Experiments in Molecular Geneti
cs（1972），supra）又はtetS コロニーだけが生育する
条件で平板培養を行えばよい。このようにしてtn10が挿
入子された遺伝子は非復帰型変異株となる。tetSコロニ
ーをスクリーニングすることによりtyrA位だけ又はtyrA
位とpheA位の両方の欠損又は再配置されたものを得るこ
とができる。pheA地図の位置はtyrAに極めて接近してい
るので二重変異株が通常得られる。（Bachman B.J.and
Low,K.B.Microbiological Review,44:1-56（1980）） C.宿主菌株の形質転換 宿主菌はプラスミドDNA（野生型trp,野生型trp-ser,変
異型trp，変異型trp-serB及びアテヌエター領域の除去
されたプラスミドを含む）によりカルシウムシヨツク法
によつて形質転換が行われる。この方法によつて宿主菌
はDNAを取込むことができる。（Morrison,D.A.,J.Bact.
132:349-351（1977）参照）。アンスラニル酸シンテタ
ーゼの比活性の測定はプラスミドを含有する菌株を培養
して行なう。又トリプトフアンのレベルについても酵素
的に又はマイクロバイオアツセイ法により検出すること
ができる。これらの菌株はトリプトフアン欠であるがセ
リンを含むカザミノ酸含有培地又はセリンとトリプトフ
アンの除く総てのアミノ酸を含有する合成培地に生育す
る。trp遺伝子のみを含む複数コピイのプラスミドを有
する菌株はアンスラニル酸シンテターゼの活性を相当に
向上させる。trpR+菌株に於てはフイードバツク阻害耐
性変異trp含有プラスミドは、野生タイプE.coliW3110に
於て認められるよりも高いアンスラニル酸シンテターゼ
の比活性の増大を示した。
トリプトフアン生成試験によれば、aroP変異又はtyrA，
tyrApheA変異の何れかを含有するこれらの菌株はトリプ
トフアンを分泌することを示している。これらの変異が
ないと極めて少量のトリプトフアン、10μg/ml以下しか
生産しない。トリプトフアンの高収量を得るには、aroP
が変異した宿主と変異trp-serBプラスミド又は野生タイ
プのtrp-serBプラスミドを組み合わせることによつて得
られる。
かくの如く得られたL-トリプトフアン生産菌の培養方法
は常法によればよいし、公知のL-トリプトフアン生産菌
の培養法に類似した方法でよい。従つて使用する培地は
炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じて微量の有
機栄養素例えばビタミン類又はアミノ酸類を含有する培
地である。適当な炭素源の例としてはグルコース、ラク
トース、澱粉加水分解物及びモラセス等がある。アンモ
ニアガス、アンモニア及びアンモニウム塩の水溶液及び
其他の窒素含有物質の窒素源として使うことができる。
組換え菌の培養は好気的条件で行ない、培地のpH及び温
度は好適のレベルに調整し、L-トリプトフアンの生成が
停止するまで培養を続ける。
培養基中に蓄積したL-トリプトフアンは常法によつて回
収することができる。（特願74293/1979） 本発明方法によれば、エツシエリヒアの変異株を使う既
に知られている方法によつて得られるよりも高い収率で
L-トリプトフアンを生産することができる。
本発明について一般的に記述してきたが、更にいくつか
の特別な例を参照することによつて一層の理解が得られ
ると思うが、これら実施例は単に例示を目的とするもの
であつて特記しない限り本発明を限定しようとするもの
ではない。
A.試験法 第Ｉ表は下記の試験に使用した菌株とプラスミドを示
す。
下記の菌株は1980年８月14日米国合衆国、イリノイ州、
ペオーリア所在のNRRLに寄託された。
E.coli 37-1 NRRL B-4568 E.coli SP 338 NRRL B-4569 E.coli 61-1 NRRL B-4570 E.coli 5161 NRRL B-4571 E.coliMTR＃２ NRRL B-4572 E.coli AE1 NRRL B-4573 E.coli KB3100 NRRL B-4574 E.coli trp-lacfusion NRRL B-4575 培地組成 FUSZIN PLATES per liter 寒天 15g DifcoRトリプトン 10g DifcoRイースト エキストラクト 5g 食塩 10g グルコース 2g クロロテトラサイクリン 50mg NaH2PO4・H2O オートクレーブ処理、冷却、次いでフサール酸6ml、2mg
/ml及びZnCl5ml20mMを添加。
LB per liter トリプトン 10g イースト エキストラクト 5g 食塩 10g LB platcs＝LB＋１％寒天 LB Mg＝LB＋0.01MMgCl2 LB Ca＝LB＋0.005MCaCl2 LB Topagar＝LB＋0.75％寒天 塩類＝0.85％Nacl minimal platcs（最小平板培地） per liter K2HPO4 10.5g KH2PO4 4.5g (NH4)2SO4 1.0g Na3C6H5O7・2H2O 0.5g グルコース 4g（別殺菌） 寒天 1.5g（別殺菌） 冷却後MgCl21mM,Fe2SO410μＭを添加 最小平板培地への添加物 アミノ酸 20μg/ml テトラサイクリン 25μg/ml β‐2-チエニル‐DL-アラニン 22μg/ml DifcoRカザミノ酸 0.4％ ビオチン １μg/ml チアミン １μg/ml 形質変換のための溶液 洗浄： 10mM NaCl 溶液： 5mM MgCl2 5mM Tris HCl p
H7.6 カルシウム溶液： 100mM CaCl2 250mM KCl 5mM MgCl2 5mM Tris TC
l pH7.6 M9カザミノ酸培地 per liter カザミノ酸 4g Na2HPO4 6g KH2PO4 3g NaCl 0.5g NH4Cl 1.0g CaCl20.1mM、グリコース0.4％とする。何れも殺菌後 DNA生成用溶液 緩衝液:B 5mM Tris pH8.0、20％シユークロース 緩衝液:C 0.25M EDTA pH8.0 リゾチームＡ 0.25M Tris/HCl pH8.0当り５μg/mlリゾ
チーム リゾチームＢ 0.25M Tris/HCl pH8.0当り10μg/mlリゾ
チーム SDS緩衝液E: 50mM Tris pH8.0 20mM EDTA 10％ SDS 緩衝液F: 10mM Tris 1mM EDTA pH プラスミドの造成 第３図はserB-trp+ オペロンを含有するプラスミドpG×3
1-59の造成を示す図式である。プラスミド（例えばpG×
６、pCC、pG×16又はpG×20）を含有する細胞を37℃でM
9カザミノ酸培地（時には100μg/mlになるようにアムピ
シリンを添加する。）に生育させ、O.D.550（希釈せ
ず）となし次いでクロラムフエニコールを添加して100
μg/mlとした。更に37℃で約10〜15時間培養を続け8,00
0回転で５分間遠心分離して細胞を集め、洗液Ａの中に
再度懸濁させ再び遠心分離した。細胞ペレツトはこの時
点で時々冷凍した。１の培養液から得られた細胞を15
mlの緩衝液Ｂに懸濁し、3mlのリゾチームＡ液及び6mlの
緩衝液Ｃを加え、スフエロプラストが生成するまで氷上
に静置した。Lysis緩衝液（12ml）を加え混合物を37℃
で10分間保持し、次いで氷上で冷却して20,000回転で40
分間遠心分離を行なつた。プラスミド含有上澄液にエチ
ジウム ブロマイドを加え0.02mg/ml濃度となし、同量
のCsClを加え混合し、40,000回転のバーテイカル又はア
ングル型超遠心分離機のローターの中で平衡状態に至ら
しめた。スーパーコイルドプラスミドDNAバンドを集
め、エチジウムブロマイドは4M NaClで飽和のイソプロ
パノールで抽出し、DNAをエタノールで沈澱させ更に緩
衝液Ｅに再び溶解した。収量は普通１の培養細胞当り
500〜800μgDNAである。
E.coliMTR＃２から染色体DNAの分離 5-メチル‐トリプトフアンを添加した最小寒天平板培地
に生育した単一のコロニーを取上げ、5mlのLB培地中で
一夜生育させた。これを１のLB培地に接種しO.D.550
（希釈せず）まで生育させた。細胞を遠心分離で集め塩
水で洗浄し、−20℃で冷凍した。1.5から得た細胞を
緩衝液Ｄ（20ml）中に溶解し、4mlのリゾチームＢ液（4
ml）を添加し37℃に保持した。90％以上の細胞がスフエ
ロブラスト化したときにSDS緩衝液（20ml）を加え、細
胞を混和して完全に溶菌せしめた。プロテイナーゼＫ
（2mg）を加え溶液を50℃で30分間保持した。フエノー
ル‐クロロフオルム（1:1）と混和してDNAを抽出し、8,
000回転で10分間遠心分離を行なつた。抽出を繰返し
て、遠心分離後に水層とフエノール層の間に中間層がな
くなるまで続けた。DNA溶液はエーテル3Xで抽出し次い
で緩衝液Ｆで一夜透析を行なつた。DNAは溶液を酢酸ソ
ーダで0.2M（pH5.0）となすことにより沈澱し2.5倍容量
のエタノールを加え、−20℃に冷却して8,000回転で10
分間遠心分離を行なつた。DNAは緩衝液Ｆの中に溶解し
た。
制限エンドヌクレアーゼによる消化は市販の酵素を使つ
て行つた。消化の条件は生産者の勧める条件に従つた。
通常2-10μｇのDNAを消化するには、20〜100μｌの緩衝
液中で２〜10ユニツトの酵素を用い37℃で１時間消化し
た。Sau 3aによる部分消化は１μｇのDNA当り略0.05ユ
ニツトの酵素を使い通常10〜20分行つた。部分消化DNA
の分子量サイズ範囲はアガロースゲル電気泳動法によつ
て測定した。
T4フアージリガーゼによる結合は市販のリガーゼによつ
て行つた。緩衝条件は生産者の勧める条件に従つた。高
濃度のDNAの結合反応は、一個の試験管の中に約5-10μ
ｇのベクターDNAと12〜15μｇの部分消化DNAの両者を沈
澱させ、20μｌのリゲーシヨン緩衝液中で溶解、結合さ
せることによつて行つた。第２次の結合反応（低濃度DN
A）は、エンドヌクレアーゼ消化後のこれらのサンプル
を25倍希釈のDNA濃度に於て行つた。其他の結合反応は
それぞれ50μｌの結合反応混液当り1.6μｇのDNA濃度及
び100μｌの結合反応混液当り0.5μｇのDNA濃度で行つ
た。
第II表はMTR＃2trp含有プラスミドを示し、第III表は野
生型又はMTR＃２trp+ オペロン及びserB+遺伝子を含む複
合プラスミドを示す。第III表は又複合プラスミドによ
る形質転換を示す。
カルシウムシヨツクを受けた細胞の作成及び形質転換に
ついては下記の菌株作成の項に記載されている。
菌株の作成 第４図は菌の作成を示すフローチヤートである。
菌株の作成は総てフアージP1Kcによる形質導入によつて
行われ、時にはトランスポゾンTn10も又使用した。総て
のP1KcリゼートはRosner（T.L.Virology49:679-689（19
72）の方法で調製した。基本的には、目的とする細菌の
単一コロニーからLBMg培地に一夜生育させた3mlの培養
液をCaCl2を加えて5mMとなし、0.1mlの前記P1Kcリゼー
ト（〜titer＝３×108pfu/ml、W3110を使い作成）と共
に37℃で30分間保持した。10mlのLBMg培養液と10mlのLB
上層寒天（45℃で溶融）を加え約7.5mlの混液をLBCaプ
レート上に注加した。プレートを37℃で８時間保持し
た。上層寒天を除去しクロロホルムで殺菌して寒天と細
胞残渣を遠心分離した。リゼートはSH16Shigella株を指
示体として力価を定めた。
形質導入試験も又上記Rosnerの方法に従つて行つた。対
数増殖期のLB培地中に発育した受容細菌の培養液にCaCl
2を加え10mMとした。培養液を等量のP1Kcライゼートと
混和し37℃で30分保持した。この培養物を洗浄して塩水
中に懸濁させ選択プレート上に散布した。E.coliSP338
の感染にはグルコース、セリン及びトリプトフアン含有
の最小寒天プレートを使い、スレオニン要求の非感染SP
338と選別した。これらの菌株は次いでレプリカ平板培
養法でスクリーニングを行ないセリン及びトリプトフア
ン要求株であることを確認した。
〔AG×６（pG×35）〕の如き株のKB3100P1ライゼートに
よる感染にあたつては、形質導入株はβ‐2-チエニル‐
DL-アラニンを含むプレートに散布して選別した。5161P
1ライゼートでAG×６及び類似の株を形質導入する場合
には、培養物をグルコース、テトラサイクリン、トリプ
トフアン、セリン及びチロシンを含有する最小寒天プレ
ート上に散布した。生成するコロニーをチロシンを含有
しないプレート上でレプリカ法によりこれらはチロシン
要求株であることを確認した。tyrA 及びpheA遺伝子の非復帰変異株はTn10トランスポゾ
ンの自然消失の後で要求性のスクリーニングによつて得
られる。これらの培養物の取扱いはKleckner et al,J.M
ol.Biol.127:89-115（1979）を参考にした。tetS とtyrA
又はtetS とtyrA pheAの自然選別にあたつては、tetS tyr
細胞の単一コロニーをLB培養液中で約２×108個/mlまで
生育させた。テトラサイクリン耐性株を除去するためア
ムピシリン選別を行なつた。培養液にテトラサイクリン
を加え10μ/mlとなし、60分生育させ、アムピシリンを
加え200μg/mlとして更に60分間保持した。培養物を洗
浄しL-ブロス中に再び懸濁して一夜生育させた。アムピ
シリン選別を繰返し、細胞をグルコース、トリプトフア
ン、セリン、チロシン及びフエニルアラニンを含有する
最小平板培地に接種した。これらの細胞はレプリカ法に
よりチロシン又はチロシン‐フエニルアラニル要求性の
テストを行つた。
AG×16及びAG×17の調製においては、tetS ，tyrA又はty
rApheA変異株を分離するための少し異つた実験方法によ
つた。テトラサイクリン耐性チロシン要求性の単一コロ
ニイを一夜5mlのLB培地中に生育させる。その一部（0.1
ml）をFuszinプレート（このプレートはテトラサイクリ
ン感受性コロニイだけが生育できる）上に接種した。こ
れらのコロニイを適当なプレート上にてレプリカして、
ser trp tyr（AG×16）又はser trp tyr phe（AG×17）のコ
ロニイを検出した。
細胞はカルシウムシヨツクを与えDNAの取込ができるよ
うにするが、その方法はMorrison（J.Bact.132:349-351
（1977））の方法によつた。所望の細胞は500mlのLB培
地に生育し、O.D.0.32（at550nm）に達する迄増殖させ
次いで氷で冷却する。以下の操作はすべて０〜４℃に於
て行つた。細胞は２度洗浄（8,000回転10分間遠心分離
し、200mlの洗浄液中に再懸濁し再び遠心分離した）を
行つて、200mlのカルシウム溶液中に再懸濁した。これ
を氷上に25分間保持し、遠心分離して再び4mlのカルシ
ウム溶液中に懸濁した。細胞懸濁液は０℃に一夜放置
し、グリセリンを加え20％とし、0.2〜0.3mlの部分を−
70℃に冷凍した。
形質転換はカルシウム処理し冷凍した菌体の一部分を解
凍し、これに0.1〜1.0μｇの精製したDNA又は組換えDNA
を加えることにより行なつた。細胞は氷上に10分間保持
し、37℃で５分間加熱し次いで室温で10分間静置した。
この時点で細胞を選別プレート上に接種するか又は3ml
のLB培地に37℃で90分間保持しプラスミドを発現させ、
塩水で洗浄し次いで選別プレート上に接種した。〔AG×
６（pG×35）〕及び類似の形質転換株を生成させる場合
は、転換処理した混液をカザミノ酸（Difco）を加えた
グルコース最小平板培地に接種し、pG×35プラスミドを
有するAG×６菌株だけを生育させた。
宿主菌株の形質転換と形質転換株の培養 転換株は前記の如く作成し、下記の如く生育させた。
主培養： 上記培地に生育した細胞の一白金耳量を下記L-トリプト
フアン生産培地に接種（各試験管に3ml宛）し、30℃で
３日間（70時間）振盪培養を行つた。
L-トリプトフアン生産培地の組成は次の通りである：グ
ルコース３％、(NH4)2SO4１％、KH2PO40.1％、MgSO4,7a
q0.1％、FeSO4,7aq0.001％、MnCl2,4aq0.001％、“カザ
ミノ酸”（DifcoR，ビタミンフリー）0.4％、CaCO34.0
％、KOHでpH7.0 L-トリプトフアンの検出と定量： 培養液中のL-トリプトフアンは紙上のスポツトにEhrl
ich試薬をスプレーし定性分析した。定量はトリプトフ
アンスポツトを与えるサンプルをロイコノストツク・メ
ゼンテロイデスを使いバイオアツセイ法で行なつた。
生育測定： 菌の生育は培養液を0.1NのHClで26倍に希釈した後、562
nmにおける吸光度（10mmガラスセル）を測定した。値は
−、±、＋、＋＋で示す。
第IV表は成功した形質転換株の数例と生育結果を示す。
下記の菌株はNorthern Regional Research Laboratory
（NRRL）,Peoria,Illinois,USAに1980年８月14日寄託さ
れた。
AG×６（pG×35）aroP NRRL B-12257 AG×16（pG×35） NRRL B-12258 AG×６（pG×35） NRRL B-12259 AG×１（pG×35） NRRL B-12260 AG×14（pG×44） NRRL B-12261 AG×15（pG×44） NRRL B-12262 AG×17（pG×44） NRRL B-12263 AG×６（pG×50）（aroP） NRRL B-12264 AG×６（pG×50）aroPは下記の遺伝子タイプを有する菌
株の一例である:tna,trpR-，tyrA-,aroP（MTR＃2trp-Se
rB）
【図面の簡単な説明】
第１図はpBR322ベクターとE.coliserB遺伝子から得られ
るプラスミドpSerB59-1を示す。 第２図は遺伝子の運び手としてベクターpBR322を使い、
細胞DNAのMTR＃２trp遺伝子をクローン化する手法を示
す。 第３図serB遺伝子とMTR＃２trpE遺伝子の両方を有する
複合プラスミドの調製法を示すフローチヤートである。 第４図は宿主菌株の造成を示すフローチヤートである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏ ｂｉｏｌ．，38（２）Ｐ．181−190 （1979) Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．, 158，Ｐ．263−270（1978) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，71（９），Ｐ．3455− 3459（1974) Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．, 114（２），Ｐ．471−475（1979)

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】トリプトファンの生成を調整する遺伝情報
    を有するプラスミドを含有し、酵素トリプトファナーゼ
    の欠失したエッシェリヒア属に属する宿主菌であって、
    更にaroPの遺伝子欠失を有する宿主菌を培養し、生成し
    たトリプトファンを培地から採取することを特徴とする
    発酵法によるＬ−トリプトファンの製造法。
  2. 【請求項２】宿主菌がトリプトファンアナログ耐性を有
    することを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の発
    酵法によるＬ−トリプトファンの製造法。
  3. 【請求項３】宿主菌が更にtrpR,tyrA,pheAの１種又は２
    種以上の遺伝子欠失を有することを特徴とする特許請求
    の範囲第１項又は第２項に記載の発酵法によるＬ−トリ
    プトファンの製造法。
  4. 【請求項４】宿主菌が更にtrpRts遺伝子の単独欠失又は
    tyrA,pheAの１種又は２種以上の遺伝子欠失を有するこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第１項又は第２項に記載
    の発酵法によるＬ−トリプトファンの製造法。
  5. 【請求項５】プラスミドがserB遺伝子、野性型trpオペ
    ロンの１種又は２種を有することを特徴とする特許請求
    の範囲第１項又は第２項に記載の発酵法によるＬ−トリ
    プトファンの製造法。
  6. 【請求項６】プラスミドがアンスラニル酸合成酵素がフ
    ィードバック阻害耐性となっているtrpEオペロン遺伝子
    又はこの遺伝子とserB遺伝子の両方を有することを特徴
    とする特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の発酵法
    によるＬ−トリプトファンの製造法。
  7. 【請求項７】プラスミドが更にアテヌエター領域が除か
    れたtrpオペロンを有することを特徴とする特許請求の
    範囲第５項又は第６項に記載の発酵法によるＬ−トリプ
    トファンの製造法。
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