JPH04248983A - 発酵法による芳香族アミノ酸の製造法 - Google Patents
発酵法による芳香族アミノ酸の製造法Info
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】芳香族アミノ酸は甘味料アスパル
テームの原料（Ｌ−フェニルアラニン）、飼料添加物（
Ｌ−トリプトファン）、輸液等の医薬品（Ｌ−トリプト
ファン、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシン）とし
て需要が急増している。本発明は、これら芳香族アミノ
酸の生産に関するものである。
テームの原料（Ｌ−フェニルアラニン）、飼料添加物（
Ｌ−トリプトファン）、輸液等の医薬品（Ｌ−トリプト
ファン、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシン）とし
て需要が急増している。本発明は、これら芳香族アミノ
酸の生産に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】微生物を用いて芳香族アミノ酸を製造す
る方法は多数知られている。たとえば、Ｌ−フェニルア
ラニンの製造法としては、組換え体エシェリヒア・コリ
を用いるものに、特開昭５６−１８９０、特開昭５８−
１０３３９８、特開昭６１−９２５６５、特開平１−１
０４１６０、国際公開Ｗ０８７／００２０２がある。ま
たＬ−フェニルアラニンまたはＬ−チロシンの製造法と
しては、コリネバクテリウム属の変異株を用いるものに
、特開昭６１−１２８８９７があり、組換え体コリネバ
クテリウムを用いるものに、特開昭６０−３４１９７、
特開昭６０−２４１９２、特開昭６１−２６０８９２、
特開昭６１−１２４３７５が知られている。Ｌ−トリプ
トファンの製造法としては、組換え体エシェリヒア・コ
リを用いるものに、特開昭５７−７１３９７、米国特許
４３７１６１４があり、バチルス・ズブチルスの変異株
を用いるものに特公昭５３−３９５１７、同６２−３４
３９９があり、組換え体バチルス・ズブチルスを用いる
ものに、特開昭６１−１０４７９０、同６２−３４３９
９があり、ブレビバクテリウム属の変異株を用いるもの
に、特開昭５７−１７４０９６があり、更に組換え体ブ
レビバクテリウム属を用いるものに特開昭６２−５１９
８０が報告されている。
る方法は多数知られている。たとえば、Ｌ−フェニルア
ラニンの製造法としては、組換え体エシェリヒア・コリ
を用いるものに、特開昭５６−１８９０、特開昭５８−
１０３３９８、特開昭６１−９２５６５、特開平１−１
０４１６０、国際公開Ｗ０８７／００２０２がある。ま
たＬ−フェニルアラニンまたはＬ−チロシンの製造法と
しては、コリネバクテリウム属の変異株を用いるものに
、特開昭６１−１２８８９７があり、組換え体コリネバ
クテリウムを用いるものに、特開昭６０−３４１９７、
特開昭６０−２４１９２、特開昭６１−２６０８９２、
特開昭６１−１２４３７５が知られている。Ｌ−トリプ
トファンの製造法としては、組換え体エシェリヒア・コ
リを用いるものに、特開昭５７−７１３９７、米国特許
４３７１６１４があり、バチルス・ズブチルスの変異株
を用いるものに特公昭５３−３９５１７、同６２−３４
３９９があり、組換え体バチルス・ズブチルスを用いる
ものに、特開昭６１−１０４７９０、同６２−３４３９
９があり、ブレビバクテリウム属の変異株を用いるもの
に、特開昭５７−１７４０９６があり、更に組換え体ブ
レビバクテリウム属を用いるものに特開昭６２−５１９
８０が報告されている。
【０００３】これらの方法に用いられる微生物の中で、
エシェリヒア・コリにおいて、芳香族アミノ酸の生合成
共通経路上における鍵酵素として、３−デオキシ−Ｄ−
アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ（以下「
ＤＳ」と略する）が知られ、３種類のアイソザイムが存
在する。これらは、ａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ａｒｏＨと呼
ばれる遺伝子にコードされ、それぞれＬ−チロシン、Ｌ
−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファンによるフィー
ドバック阻害を受ける。これらの遺伝子に関する塩基配
列及びアミノ酸配列は、既に報告されている［ａｒｏＦ
：Ｈｕｄｓｏｎ，Ｇ．Ｓ．ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ
，Ｂ．Ｅ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８０，１０２
３（１９８４）／ａｒｏＧ：Ｄａｖｉｅｓ，Ｗ．Ｄ．ａ
ｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｂ．Ｅ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ
ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１３，４０４５（１９８２）
／ａｒｏＨ：Ｒａｙ，Ｊ．Ｍ．ｅｔａｌ，Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．，１７０，５５００（１９８８）］。芳香
族アミノ酸を効率的に生産するためには、これらＤＳを
改良することが不可欠である。３種類のＤＳ遺伝子のう
ち、ａｒｏＨにコードされるＤＳについては、Ｌ−トリ
プトファンによるフィードバック阻害が解除された変異
型ａｒｏＨが報告されている［Ｒａｙ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ
ａｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７０，５５００
（１９８８）］。しかしながら、本来、ａｒｏＨ由来の
ＤＳ活性は、他のＤＳ活性に比して非常に低いため、組
換えＤＮＡ技術による改良には適さず、ａｒｏＦ、ａｒ
ｏＧにコードされるＤＳの脱感作型の利用がより効率的
であると考えられる。Ｌ−チロシンによるａｒｏＦのフ
イードバック阻害解除変異の例としてはウェーバーとハ
ーマンによる報告［Ｗｅａｖｅｒ，Ｌ．Ｍ．ａｎｄ
Ｈｅｒｒｍａｎｎ，Ｋ．Ｍ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
．，１７２，６５８１（１９９０）］があり、Ｎ末端よ
り１４８番目のＬ−プロリン残基がＬ−ロイシン残基に
置換している。変異部位が明示された脱感作型ＤＳ遺伝
子の芳香族アミノ酸に関する発酵生産への応用としては
、以下に示す２、３の例が知られるのみである。エドワ
ーズらが、ａｒｏＦにコードされるＤＳの１５２番目の
Ｌ−グルタミン残基をＬ−イソロイシン残基に置換する
ことでＬ−チロシンによるフィードバック阻害を解除し
、Ｌ−フェニルアラニンの発酵生産に利用している［国
際公開Ｗ０８７／００２０２］。また、シネンキらはａ
ｒｏＧにコードされるＤＳの７６番目のＬ−ロイシン残
基をＬ−バリン残基に置換することにより、Ｌ−フェニ
ルアラニンによるフィードバック阻害を解除したＤＳ（
ａｒｏＧ）を取得してＬ−フェニルアラニンの発酵生産
に利用している［特開昭５８−１０３３９８］。しかし
ながら、本報告では、Ｌ−フェニルアラニンによるフィ
ードバック阻害が解除されたＤＳの酵素活性のデータ及
びＬ−フェニルアラニンの生産量は記載されていない。 尚、Ｌ−トリプトファンの生産例について、これまでに
報告されていない。
エシェリヒア・コリにおいて、芳香族アミノ酸の生合成
共通経路上における鍵酵素として、３−デオキシ−Ｄ−
アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ（以下「
ＤＳ」と略する）が知られ、３種類のアイソザイムが存
在する。これらは、ａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ａｒｏＨと呼
ばれる遺伝子にコードされ、それぞれＬ−チロシン、Ｌ
−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファンによるフィー
ドバック阻害を受ける。これらの遺伝子に関する塩基配
列及びアミノ酸配列は、既に報告されている［ａｒｏＦ
：Ｈｕｄｓｏｎ，Ｇ．Ｓ．ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ
，Ｂ．Ｅ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８０，１０２
３（１９８４）／ａｒｏＧ：Ｄａｖｉｅｓ，Ｗ．Ｄ．ａ
ｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｂ．Ｅ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ
ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１３，４０４５（１９８２）
／ａｒｏＨ：Ｒａｙ，Ｊ．Ｍ．ｅｔａｌ，Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．，１７０，５５００（１９８８）］。芳香
族アミノ酸を効率的に生産するためには、これらＤＳを
改良することが不可欠である。３種類のＤＳ遺伝子のう
ち、ａｒｏＨにコードされるＤＳについては、Ｌ−トリ
プトファンによるフィードバック阻害が解除された変異
型ａｒｏＨが報告されている［Ｒａｙ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ
ａｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７０，５５００
（１９８８）］。しかしながら、本来、ａｒｏＨ由来の
ＤＳ活性は、他のＤＳ活性に比して非常に低いため、組
換えＤＮＡ技術による改良には適さず、ａｒｏＦ、ａｒ
ｏＧにコードされるＤＳの脱感作型の利用がより効率的
であると考えられる。Ｌ−チロシンによるａｒｏＦのフ
イードバック阻害解除変異の例としてはウェーバーとハ
ーマンによる報告［Ｗｅａｖｅｒ，Ｌ．Ｍ．ａｎｄ
Ｈｅｒｒｍａｎｎ，Ｋ．Ｍ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
．，１７２，６５８１（１９９０）］があり、Ｎ末端よ
り１４８番目のＬ−プロリン残基がＬ−ロイシン残基に
置換している。変異部位が明示された脱感作型ＤＳ遺伝
子の芳香族アミノ酸に関する発酵生産への応用としては
、以下に示す２、３の例が知られるのみである。エドワ
ーズらが、ａｒｏＦにコードされるＤＳの１５２番目の
Ｌ−グルタミン残基をＬ−イソロイシン残基に置換する
ことでＬ−チロシンによるフィードバック阻害を解除し
、Ｌ−フェニルアラニンの発酵生産に利用している［国
際公開Ｗ０８７／００２０２］。また、シネンキらはａ
ｒｏＧにコードされるＤＳの７６番目のＬ−ロイシン残
基をＬ−バリン残基に置換することにより、Ｌ−フェニ
ルアラニンによるフィードバック阻害を解除したＤＳ（
ａｒｏＧ）を取得してＬ−フェニルアラニンの発酵生産
に利用している［特開昭５８−１０３３９８］。しかし
ながら、本報告では、Ｌ−フェニルアラニンによるフィ
ードバック阻害が解除されたＤＳの酵素活性のデータ及
びＬ−フェニルアラニンの生産量は記載されていない。 尚、Ｌ−トリプトファンの生産例について、これまでに
報告されていない。
【０００４】
【本発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、Ｄ
Ｓの１ないし２アミノ酸残基を他のアミノ酸に置換する
ことにより得られる脱感作型ＤＳをコードする遺伝子及
び芳香族アミノ酸固有系の脱感作型酵素をコードする遺
伝子を造成し、これら遺伝子を含む組換えＤＮＡで形質
転換された微生物を培養することにより生産された芳香
族アミノ酸を取得することを特徴とする芳香族アミノ酸
の製造法を提供することである。
Ｓの１ないし２アミノ酸残基を他のアミノ酸に置換する
ことにより得られる脱感作型ＤＳをコードする遺伝子及
び芳香族アミノ酸固有系の脱感作型酵素をコードする遺
伝子を造成し、これら遺伝子を含む組換えＤＮＡで形質
転換された微生物を培養することにより生産された芳香
族アミノ酸を取得することを特徴とする芳香族アミノ酸
の製造法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、まずエシ
ェリヒア・コリの天然型ＤＳ遺伝子をクローニングし、
これを変異させることにより脱感作型のＤＳをコードす
る新規遺伝子を取得し、これらと脱感作型のコリスミン
酸ムターゼープレフェン酸デヒドラターゼ（ＣＭ−ＰＤ
Ｔ）の遺伝子を組み合わせ利用して微生物を改良するこ
とにより、芳香族アミノ酸のひとつであるＬ−フェニル
アラニンの発酵生産を改善し、本発明を完成に到らしめ
た。以下、本発明を詳細に説明する。
ェリヒア・コリの天然型ＤＳ遺伝子をクローニングし、
これを変異させることにより脱感作型のＤＳをコードす
る新規遺伝子を取得し、これらと脱感作型のコリスミン
酸ムターゼープレフェン酸デヒドラターゼ（ＣＭ−ＰＤ
Ｔ）の遺伝子を組み合わせ利用して微生物を改良するこ
とにより、芳香族アミノ酸のひとつであるＬ−フェニル
アラニンの発酵生産を改善し、本発明を完成に到らしめ
た。以下、本発明を詳細に説明する。
【０００６】先ず、エシェリヒア・コリＫ−１２のＭＣ
１０６１株（ＡＴＣＣ５３３３８）の染色体ＤＮＡより
ＰＣＲ法を用いてａｒｏＦ、ａｒｏＧ遺伝子をクローニ
ングし、ヒドロキシルアミンを用いて目的の遺伝子を変
異させた。この際使用する染色体ＤＮＡはエシェリヒア
・コリ由来であればどの菌株でもよい。ａｒｏＦ及びａ
ｒｏＧとは、Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニンでそ
れぞれフィードバック阻害を受けるＤＳをコードする遺
伝子をいい、遺伝的多系性などによる変異型も含む。 尚、遺伝的多系性とは、遺伝子上の自然突然変異により
蛋白質のアミノ酸配列が一部変化している現象をいう。 遺伝子に変異を生じさせるには、リコンビナントＰＣＲ
法［ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏ
ｎ ｐｒｅｓｓ（１９８９）］、部位特異的変異法［
Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ａｎｄ Ｆｒｉｔｓ，Ｈ．Ｊ．，
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４
，３５０（１９８７）］や当該遺伝子を保有する菌株を
紫外線照射する方法もしくは化学薬剤処理（Ｎ−メチル
−Ｎ’−ニトロソグアニジン、亜硝酸など）する方法、
更に目的遺伝子を化学合成する方法がある。次に、該変
異型遺伝子を組換えＤＮＡとして適当な微生物に導入し
、発現させることにより、フィードバック阻害が実質的
に解除されたＤＳを保有する微生物を取得した。
１０６１株（ＡＴＣＣ５３３３８）の染色体ＤＮＡより
ＰＣＲ法を用いてａｒｏＦ、ａｒｏＧ遺伝子をクローニ
ングし、ヒドロキシルアミンを用いて目的の遺伝子を変
異させた。この際使用する染色体ＤＮＡはエシェリヒア
・コリ由来であればどの菌株でもよい。ａｒｏＦ及びａ
ｒｏＧとは、Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニンでそ
れぞれフィードバック阻害を受けるＤＳをコードする遺
伝子をいい、遺伝的多系性などによる変異型も含む。 尚、遺伝的多系性とは、遺伝子上の自然突然変異により
蛋白質のアミノ酸配列が一部変化している現象をいう。 遺伝子に変異を生じさせるには、リコンビナントＰＣＲ
法［ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏ
ｎ ｐｒｅｓｓ（１９８９）］、部位特異的変異法［
Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ａｎｄ Ｆｒｉｔｓ，Ｈ．Ｊ．，
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４
，３５０（１９８７）］や当該遺伝子を保有する菌株を
紫外線照射する方法もしくは化学薬剤処理（Ｎ−メチル
−Ｎ’−ニトロソグアニジン、亜硝酸など）する方法、
更に目的遺伝子を化学合成する方法がある。次に、該変
異型遺伝子を組換えＤＮＡとして適当な微生物に導入し
、発現させることにより、フィードバック阻害が実質的
に解除されたＤＳを保有する微生物を取得した。
【０００７】以上の方法で取得される組換えＤＮＡとは
、フィードバック阻害を解除したＤＳをコードする有用
遺伝子をパッセンジャーとして、プラスミドやファージ
ＤＮＡのベクターに組み込んだものをいう。その際、該
有用遺伝子の発現を効率的に実施するために、ｌａｃ、
ｔｒｐ、ＰＬ等の微生物内で働くプロモーターを用いて
もよい。尚、ここでいう組換えＤＮＡには、該有用遺伝
子をトランスポゾン［Ｂｅｒｇ，Ｄ．Ｅ．ａｎｄ Ｂ
ｅｒｇ，Ｃ．Ｍ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１，４
１７（１９８３）］、Ｍｕファージ［特開平２−１０９
９８５］または相同性組換え［Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂ
．（１９７２）］を用いた方法で染色体に組み込んだも
のも含まれる。
、フィードバック阻害を解除したＤＳをコードする有用
遺伝子をパッセンジャーとして、プラスミドやファージ
ＤＮＡのベクターに組み込んだものをいう。その際、該
有用遺伝子の発現を効率的に実施するために、ｌａｃ、
ｔｒｐ、ＰＬ等の微生物内で働くプロモーターを用いて
もよい。尚、ここでいう組換えＤＮＡには、該有用遺伝
子をトランスポゾン［Ｂｅｒｇ，Ｄ．Ｅ．ａｎｄ Ｂ
ｅｒｇ，Ｃ．Ｍ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１，４
１７（１９８３）］、Ｍｕファージ［特開平２−１０９
９８５］または相同性組換え［Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂ
．（１９７２）］を用いた方法で染色体に組み込んだも
のも含まれる。
【０００８】組換えＤＮＡを有する微生物としては、該
ＤＳといった目的の酵素をコードする遺伝子が発現する
もので、かつ芳香族アミノ酸を生産する微生物（Ｌ−フ
ェニルアラニンの場合は、Ｌ−フェニルアラニンアナロ
グ耐性等の付与によりＬ−フェニルアラニン生産性を獲
得したもの）であれば、エシェリヒア属、ブレビバクテ
リウム属、コリネバクテリウム属、バチルス属、セラチ
ア属、シュードモナス属等に属する微生物の種、菌株を
問わずどのようなものでもよい。
ＤＳといった目的の酵素をコードする遺伝子が発現する
もので、かつ芳香族アミノ酸を生産する微生物（Ｌ−フ
ェニルアラニンの場合は、Ｌ−フェニルアラニンアナロ
グ耐性等の付与によりＬ−フェニルアラニン生産性を獲
得したもの）であれば、エシェリヒア属、ブレビバクテ
リウム属、コリネバクテリウム属、バチルス属、セラチ
ア属、シュードモナス属等に属する微生物の種、菌株を
問わずどのようなものでもよい。
【０００９】また該ＤＳ遺伝子の効率的活用のため、他
の有用遺伝子（例えばＬ−フェニルアラニンの場合は脱
感作型ＣＭ−ＰＤＨの遺伝子が挙げられる）と組み合わ
せて利用するとよい。その際、該有用遺伝子は、該ＤＳ
遺伝子と同じく宿主の染色体上に存在しても、プラスミ
ド上に存在してもよい。
の有用遺伝子（例えばＬ−フェニルアラニンの場合は脱
感作型ＣＭ−ＰＤＨの遺伝子が挙げられる）と組み合わ
せて利用するとよい。その際、該有用遺伝子は、該ＤＳ
遺伝子と同じく宿主の染色体上に存在しても、プラスミ
ド上に存在してもよい。
【００１０】以上の方法で取得した脱感作型ＤＳ遺伝子
を含む組換えＤＮＡで形質転換された微生物を培養し、
培養液に目的の芳香族アミノ酸を生成蓄積せしめ、これ
を採取した。
を含む組換えＤＮＡで形質転換された微生物を培養し、
培養液に目的の芳香族アミノ酸を生成蓄積せしめ、これ
を採取した。
【００１１】使用する芳香族アミノ酸生産用の培地は、
炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有
機成分を含有する通常の培地である。炭素源としては、
グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース
やでんぷんの加水分解物などの糖類、グリセロールやソ
ルビトールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸
、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。窒素源
としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン
酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解
物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を
用いることができる。有機微量栄養源としては、ビタミ
ンＢ１、Ｌ−チロシンなどの要求物質または酵母エキス
等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必
要に応して、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イ
オン、マンガンイオン等が少量添加される。培養は好気
的条件下で１６〜７２時間実施するのがよく、培養温度
は３０℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜７に制御する。 尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアル
カリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することがで
きる。発酵液からの芳香族アミノ酸の採取は通常イオン
交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせる
ことにより実施できる。
炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有
機成分を含有する通常の培地である。炭素源としては、
グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース
やでんぷんの加水分解物などの糖類、グリセロールやソ
ルビトールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸
、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。窒素源
としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン
酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解
物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を
用いることができる。有機微量栄養源としては、ビタミ
ンＢ１、Ｌ−チロシンなどの要求物質または酵母エキス
等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必
要に応して、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イ
オン、マンガンイオン等が少量添加される。培養は好気
的条件下で１６〜７２時間実施するのがよく、培養温度
は３０℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜７に制御する。 尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアル
カリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することがで
きる。発酵液からの芳香族アミノ酸の採取は通常イオン
交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせる
ことにより実施できる。
【００１２】以上に述べた方法により、フィードバック
阻害が解除されたＤＳ及び固有系が脱感作された酵素を
有する形質転換株を培養すると、芳香族アミノ酸の生産
性について大幅な向上がみられた。このことは本発明の
有用性を実証したものである。
阻害が解除されたＤＳ及び固有系が脱感作された酵素を
有する形質転換株を培養すると、芳香族アミノ酸の生産
性について大幅な向上がみられた。このことは本発明の
有用性を実証したものである。
【００１３】
【発明の効果】本発明による微生物を用いれば、芳香族
アミノ酸共通の生合成系の最初の鍵酵素であるＤＳのａ
ｒｏＦ，ａｒｏＧが脱感作されているため、共通系での
代謝が改善される。これに脱感作型ＣＭ−ＰＤＴを組み
合わせた微生物は各々の酵素を別々に脱感作した場合に
比べ、相乗的にＬ−フェニルアラニンの生産量が増加す
る。
アミノ酸共通の生合成系の最初の鍵酵素であるＤＳのａ
ｒｏＦ，ａｒｏＧが脱感作されているため、共通系での
代謝が改善される。これに脱感作型ＣＭ−ＰＤＴを組み
合わせた微生物は各々の酵素を別々に脱感作した場合に
比べ、相乗的にＬ−フェニルアラニンの生産量が増加す
る。
【００１４】次に芳香族アミノ酸のひとつであるＬ−フ
ェニルアラニンについての実施例を示す。
ェニルアラニンについての実施例を示す。
【００１５】
【００１６】
【実施例１】
【００１７】（１）エシェリヒア・コリのａｒｏＦ由来
変異型ＤＳ遺伝子の取得
変異型ＤＳ遺伝子の取得
【００１８】エシェリヒア・コリＫ−１２のＭＣ１０６
１株から、通常の方法に従って染色体ＤＮＡを抽出した
。一方、公知の文献［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８０
，１０２３（１９８４）］に記載されているａｒｏＦ遺
伝子の塩基配列に基づいて配列番号１及び２に示すよう
な合成ＤＮＡプライマー２本を通常の方法で合成した。 これらはそれぞれａｒｏＦ遺伝子の上流及び下流に相同
な配列を有する。この染色体ＤＮＡとＤＮＡプライマー
を用いてエルリッチらの方法［ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ ｐｒｅｓｓ（１９８９
）］に従ってＰＣＲ反応を行ない、１．５ｋｂｐのＤＮ
Ａ断片を得た。以下、図１の左側に示すように、この断
片を制限酵素ＥｃｏＲＶとＥｃｏ４７ＩＩＩで切断した
後、ｐＨＳＧ３９８（宝酒造社製）のＳｍａＩ切断物を
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。この反応混合物
でエシェリヒア・コリＫ−１２のＪＭ１０９株（宝酒造
（株）より購入）を形質転換し、生育したクロラムフェ
ニコール耐性株の中でａｒｏＦ遺伝子が挿入されたプラ
スミドを保有する菌株からプラスミドを抽出し、プラス
ミドｐＨＳＧ−ａｒｏＦを取得した。更にｐＨＳＧ−ａ
ｒｏＦを制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断す
ることにより得たａｒｏＦ遺伝子含有ＤＮＡ断片を、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼでプラスミドｐＴＳ１（特願平２−１
９２１６２）のＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ切断フラグ
メントと連結した。この反応混合物でエシェリヒア・コ
リＫ−１２のＤＳ欠損（ａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ａｒｏＨ
）株ＡＢ３２５７を形質転換した。生育したアンピシリ
ン耐性株の中でＬ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニン、
Ｌ−トリプトファンの要求性が消失した株からプラスミ
ドを抽出し、プラスミドｐＴＳ−ａｒｏＦを取得した。
１株から、通常の方法に従って染色体ＤＮＡを抽出した
。一方、公知の文献［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８０
，１０２３（１９８４）］に記載されているａｒｏＦ遺
伝子の塩基配列に基づいて配列番号１及び２に示すよう
な合成ＤＮＡプライマー２本を通常の方法で合成した。 これらはそれぞれａｒｏＦ遺伝子の上流及び下流に相同
な配列を有する。この染色体ＤＮＡとＤＮＡプライマー
を用いてエルリッチらの方法［ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ ｐｒｅｓｓ（１９８９
）］に従ってＰＣＲ反応を行ない、１．５ｋｂｐのＤＮ
Ａ断片を得た。以下、図１の左側に示すように、この断
片を制限酵素ＥｃｏＲＶとＥｃｏ４７ＩＩＩで切断した
後、ｐＨＳＧ３９８（宝酒造社製）のＳｍａＩ切断物を
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。この反応混合物
でエシェリヒア・コリＫ−１２のＪＭ１０９株（宝酒造
（株）より購入）を形質転換し、生育したクロラムフェ
ニコール耐性株の中でａｒｏＦ遺伝子が挿入されたプラ
スミドを保有する菌株からプラスミドを抽出し、プラス
ミドｐＨＳＧ−ａｒｏＦを取得した。更にｐＨＳＧ−ａ
ｒｏＦを制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断す
ることにより得たａｒｏＦ遺伝子含有ＤＮＡ断片を、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼでプラスミドｐＴＳ１（特願平２−１
９２１６２）のＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ切断フラグ
メントと連結した。この反応混合物でエシェリヒア・コ
リＫ−１２のＤＳ欠損（ａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ａｒｏＨ
）株ＡＢ３２５７を形質転換した。生育したアンピシリ
ン耐性株の中でＬ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニン、
Ｌ−トリプトファンの要求性が消失した株からプラスミ
ドを抽出し、プラスミドｐＴＳ−ａｒｏＦを取得した。
【００１９】次に、プラスミドｐＴＳ−ａｒｏＦをヒド
ロキシルアミンを用いた方法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
，１７５，３３１（１９８４）］によって変異処理を行
なった後、ＡＢ３２５７株（エシェリヒア・コリ ジ
ェネティック ストック センターより入手）に形
質転換し、アンピシリン耐性株を取得後、１ｍＭのＬ−
チロシン添加の最少培地に生育した株を２株選択し、こ
れらの菌株よりフィードバック阻害が解除されたａｒｏ
Ｆ遺伝子を含有するプラスミドｐＴＳ−ａｒｏＦ１５及
びｐＴＳ−ａｒｏＦ３３を得た。フィードバック阻害が
解除されていないａｒｏＦを含むプラスミドを保有する
ＡＢ３２５７株は、最少培地に１ｍＭのＬ−チロシンを
加えると、該ＤＳ活性がフィードバック阻害を受け、Ｌ
−フェニルアラニンやＬ−トリプトファンといった芳香
族アミノ酸を合成できず、生育することができなくなる
。
ロキシルアミンを用いた方法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
，１７５，３３１（１９８４）］によって変異処理を行
なった後、ＡＢ３２５７株（エシェリヒア・コリ ジ
ェネティック ストック センターより入手）に形
質転換し、アンピシリン耐性株を取得後、１ｍＭのＬ−
チロシン添加の最少培地に生育した株を２株選択し、こ
れらの菌株よりフィードバック阻害が解除されたａｒｏ
Ｆ遺伝子を含有するプラスミドｐＴＳ−ａｒｏＦ１５及
びｐＴＳ−ａｒｏＦ３３を得た。フィードバック阻害が
解除されていないａｒｏＦを含むプラスミドを保有する
ＡＢ３２５７株は、最少培地に１ｍＭのＬ−チロシンを
加えると、該ＤＳ活性がフィードバック阻害を受け、Ｌ
−フェニルアラニンやＬ−トリプトファンといった芳香
族アミノ酸を合成できず、生育することができなくなる
。
【００２０】（２）エシェリヒア・コリのａｒｏＧ由来
変異型ＤＳ遺伝子の取得
変異型ＤＳ遺伝子の取得
【００２１】ａｒｏＦ遺伝子の場合と同様にして、変異
型ａｒｏＧ遺伝子を取得した。公知の文献［Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１０，４０４５（１
９８２）］に記載されているａｒｏＧ遺伝子の塩基配列
に基づいて配列番号３及び４に示すような合成ＤＮＡプ
ライマー２本を合成した。該プライマーとＭＣ１０６１
株の染色体ＤＮＡを用いて、ＰＣＲ反応を行ない、２．
１ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。以下、図１の右側に示す
ように、この断片を制限酵素ＳａｌＩとＥｃｏ４７ＩＩ
Ｉで切断した後、ｐＨＳＧ３９８（宝酒造社製）のＳａ
ｌＩとＳｍａＩ切断物をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連
結した。この反応混合物でＪＭ１０９株を形質転換し、
生育したクロラムフェニコール耐性株の中でａｒｏＧ遺
伝子が挿入されたプラスミドを保有する菌株からプラス
ミドを抽出し、プラスミドｐＨＳＧ−ａｒｏＧを取得し
た。 さらにｐＨＳＧ−ａｒｏＧを制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉ
ｎｄＩＩＩで切断することにより得られたａｒｏＧを含
有するＤＮＡ断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで、ｐＴＳ１
のＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ切断フラグメントと連結
した。この反応混合物でＡＢ３２５７株（ａｒｏＦ、ａ
ｒｏＧ、ａｒｏＨ）を形質転換し、生育したアンピシリ
ン耐性株の中でＬ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニン、
Ｌ−トリプトファンの要求性が消失している株からプラ
スミドを抽出し、プラスミドｐＴＳ−ａｒｏＧを取得し
た。
型ａｒｏＧ遺伝子を取得した。公知の文献［Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１０，４０４５（１
９８２）］に記載されているａｒｏＧ遺伝子の塩基配列
に基づいて配列番号３及び４に示すような合成ＤＮＡプ
ライマー２本を合成した。該プライマーとＭＣ１０６１
株の染色体ＤＮＡを用いて、ＰＣＲ反応を行ない、２．
１ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。以下、図１の右側に示す
ように、この断片を制限酵素ＳａｌＩとＥｃｏ４７ＩＩ
Ｉで切断した後、ｐＨＳＧ３９８（宝酒造社製）のＳａ
ｌＩとＳｍａＩ切断物をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連
結した。この反応混合物でＪＭ１０９株を形質転換し、
生育したクロラムフェニコール耐性株の中でａｒｏＧ遺
伝子が挿入されたプラスミドを保有する菌株からプラス
ミドを抽出し、プラスミドｐＨＳＧ−ａｒｏＧを取得し
た。 さらにｐＨＳＧ−ａｒｏＧを制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉ
ｎｄＩＩＩで切断することにより得られたａｒｏＧを含
有するＤＮＡ断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで、ｐＴＳ１
のＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ切断フラグメントと連結
した。この反応混合物でＡＢ３２５７株（ａｒｏＦ、ａ
ｒｏＧ、ａｒｏＨ）を形質転換し、生育したアンピシリ
ン耐性株の中でＬ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニン、
Ｌ−トリプトファンの要求性が消失している株からプラ
スミドを抽出し、プラスミドｐＴＳ−ａｒｏＧを取得し
た。
【００２２】次に、このプラスミドをａｒｏＦの場合と
同様にヒドロキシルアミンによる変異処理を行なった後
、ＡＢ３２５７株に形質転換し、アンピシリン耐性株を
取得した。これらの菌株から１０ｍＭのＬ−フェニルア
ラニン添加の最少培地に生育した菌株を６株選択し、こ
れらの菌株よりフィードバック阻害が解除されたａｒｏ
Ｇ遺伝子を含有するプラスミドｐＴＳ−ａｒｏＧ４、ｐ
ＴＳ−ａｒｏＧ８、ｐＴＳ−ａｒｏＧ１５、ｐＴＳ−ａ
ｒｏＧ１７、ｐＴＳ−ａｒｏＧ２９、ｐＴＳ−ａｒｏＧ
４０を得た。フィードバック阻害が解除されていないａ
ｒｏＧを含むプラスミドを保有するＡＢ３２５７株は、
最少培地に１０ｍＭのＬ−フェニルアラニンを添加する
と、該ＤＳ活性がフィードバック阻害を受け、Ｌ−トリ
プトファンやＬ−チロシンといった芳香族アミノ酸を合
成できず、生育することができなくなる。
同様にヒドロキシルアミンによる変異処理を行なった後
、ＡＢ３２５７株に形質転換し、アンピシリン耐性株を
取得した。これらの菌株から１０ｍＭのＬ−フェニルア
ラニン添加の最少培地に生育した菌株を６株選択し、こ
れらの菌株よりフィードバック阻害が解除されたａｒｏ
Ｇ遺伝子を含有するプラスミドｐＴＳ−ａｒｏＧ４、ｐ
ＴＳ−ａｒｏＧ８、ｐＴＳ−ａｒｏＧ１５、ｐＴＳ−ａ
ｒｏＧ１７、ｐＴＳ−ａｒｏＧ２９、ｐＴＳ−ａｒｏＧ
４０を得た。フィードバック阻害が解除されていないａ
ｒｏＧを含むプラスミドを保有するＡＢ３２５７株は、
最少培地に１０ｍＭのＬ−フェニルアラニンを添加する
と、該ＤＳ活性がフィードバック阻害を受け、Ｌ−トリ
プトファンやＬ−チロシンといった芳香族アミノ酸を合
成できず、生育することができなくなる。
【００２３】（３）ＤＳ酵素活性の測定
【００２４】上
述の変異型ａｒｏＦ（２種類）及び変異型ａｒｏＧ（６
種類）を含有するプラスミドを、ＤＳ活性を有しないエ
シェリヒア・コリＡＢ３２５７株に導入して形質転換株
を取得し、それぞれをＡＪ１２５９８（ＡＢ３２５７／
ｐＴＳ−ａｒｏＦ１５）、ＡＪ１２５９９（ＡＢ３２５
７／ｐＴＳ−ａｒｏＦ３３）、ＡＪ１２５６２（ＡＢ３
２５７／ｐＴＳ−ａｒｏＧ４）、ＡＪ１２６００（ＡＢ
３２５７／ｐＴＳ−ａｒｏＧ８）、ＡＪ１２５６３（Ａ
Ｂ３２５７／ｐＴＳ−ａｒｏＧ１５）、ＡＪ１２６０１
（ＡＢ３２５７／ｐＴＳ−ａｒｏＧ１７）、ＡＪ１２６
０２（ＡＢ３２５７／ｐＴＳ−ａｒｏＧ２９）及びＡＪ
１２６０３（ＡＢ３２５７／ｐＴＳ−ａｒｏＧ４０）と
命名した。これらの内、代表株としてＡＪ１２５６３、
ＡＪ１２６０３をそれぞれ、エシェリヒア・コリ Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１１９６８、 ＦＥＲＭ Ｐ−１１
９７４として微工研に寄託した。尚、比較のため、天然
型の遺伝子を含有するプラスミドも同株に導入した。こ
れらの菌株を既知のＬ−フェニルアラニン生産培地［Ｓ
ｕｇｉｍｏｔｏ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌ．，５，２３７（１９８９）］を用いて２４
時間培養した。この培養菌体より超音波破砕によって粗
酵素液を調製し、通常の方法［Ｇｏｌｌｕｂ，Ｅ．ｅｔ
ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１
７，３４９］に従って、ａｒｏＦの場合はＬ−チロシン
存在下で、ａｒｏＧの場合はＬ−フェニルアラニン存在
下でＤＳの酵素活性を測定した。その結果、図３と図４
に示すように、天然型のもの（エシェリヒア・コリＡＢ
３２５７／ｐＴＳ−ａｒｏＦ）ではＬ−チロシンの存在
下で酵素活性が強く阻害されているのに対し、それぞれ
の変異型のものではＬ−チロシンによるフィードバック
阻害が解除されていた。同様に、もう一方の天然型のも
の（エシェリヒア・コリＡＢ３２５７／ｐＴＳ−ａｒｏ
Ｇ）では、Ｌ−フェニルアラニンの存在下で酵素活性が
強く阻害されるのに対し、それぞれの変異型のものでは
Ｌ−フェニルアラニンによるフィードバック阻害が解除
されていた。さらに変異型のうちＡＪ１２５６２株のＤ
Ｓは、Ｌ−フェニルアラニンによるフィードバック阻害
が解除されているだけではなく、Ｌ−フェニルアラニン
の濃度に従って、酵素活性が上昇した。
述の変異型ａｒｏＦ（２種類）及び変異型ａｒｏＧ（６
種類）を含有するプラスミドを、ＤＳ活性を有しないエ
シェリヒア・コリＡＢ３２５７株に導入して形質転換株
を取得し、それぞれをＡＪ１２５９８（ＡＢ３２５７／
ｐＴＳ−ａｒｏＦ１５）、ＡＪ１２５９９（ＡＢ３２５
７／ｐＴＳ−ａｒｏＦ３３）、ＡＪ１２５６２（ＡＢ３
２５７／ｐＴＳ−ａｒｏＧ４）、ＡＪ１２６００（ＡＢ
３２５７／ｐＴＳ−ａｒｏＧ８）、ＡＪ１２５６３（Ａ
Ｂ３２５７／ｐＴＳ−ａｒｏＧ１５）、ＡＪ１２６０１
（ＡＢ３２５７／ｐＴＳ−ａｒｏＧ１７）、ＡＪ１２６
０２（ＡＢ３２５７／ｐＴＳ−ａｒｏＧ２９）及びＡＪ
１２６０３（ＡＢ３２５７／ｐＴＳ−ａｒｏＧ４０）と
命名した。これらの内、代表株としてＡＪ１２５６３、
ＡＪ１２６０３をそれぞれ、エシェリヒア・コリ Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１１９６８、 ＦＥＲＭ Ｐ−１１
９７４として微工研に寄託した。尚、比較のため、天然
型の遺伝子を含有するプラスミドも同株に導入した。こ
れらの菌株を既知のＬ−フェニルアラニン生産培地［Ｓ
ｕｇｉｍｏｔｏ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌ．，５，２３７（１９８９）］を用いて２４
時間培養した。この培養菌体より超音波破砕によって粗
酵素液を調製し、通常の方法［Ｇｏｌｌｕｂ，Ｅ．ｅｔ
ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１
７，３４９］に従って、ａｒｏＦの場合はＬ−チロシン
存在下で、ａｒｏＧの場合はＬ−フェニルアラニン存在
下でＤＳの酵素活性を測定した。その結果、図３と図４
に示すように、天然型のもの（エシェリヒア・コリＡＢ
３２５７／ｐＴＳ−ａｒｏＦ）ではＬ−チロシンの存在
下で酵素活性が強く阻害されているのに対し、それぞれ
の変異型のものではＬ−チロシンによるフィードバック
阻害が解除されていた。同様に、もう一方の天然型のも
の（エシェリヒア・コリＡＢ３２５７／ｐＴＳ−ａｒｏ
Ｇ）では、Ｌ−フェニルアラニンの存在下で酵素活性が
強く阻害されるのに対し、それぞれの変異型のものでは
Ｌ−フェニルアラニンによるフィードバック阻害が解除
されていた。さらに変異型のうちＡＪ１２５６２株のＤ
Ｓは、Ｌ−フェニルアラニンによるフィードバック阻害
が解除されているだけではなく、Ｌ−フェニルアラニン
の濃度に従って、酵素活性が上昇した。
【００２５】（４）脱感作型ＤＳの変異点の決定
【００
２６】脱感作型ＤＳの遺伝子であるａｒｏＦ１５、ａｒ
ｏＦ３３、ａｒｏＧ４、ａｒｏＧ８、ａｒｏＧ１５、ａ
ｒｏＧ１７、ａｒｏＧ２９、ａｒｏＧ４０の塩基配列を
通常の方法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（
Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）
］に従って決定した。具体的なアミノ酸配列上の置換部
位及びその対応塩基配列上の変異点を表１に示す。これ
らの配列はすべて、これまでに報告のないものであった
。
２６】脱感作型ＤＳの遺伝子であるａｒｏＦ１５、ａｒ
ｏＦ３３、ａｒｏＧ４、ａｒｏＧ８、ａｒｏＧ１５、ａ
ｒｏＧ１７、ａｒｏＧ２９、ａｒｏＧ４０の塩基配列を
通常の方法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（
Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）
］に従って決定した。具体的なアミノ酸配列上の置換部
位及びその対応塩基配列上の変異点を表１に示す。これ
らの配列はすべて、これまでに報告のないものであった
。
【００２７】
【表１】
【００２８】
【実施例２】
【００２９】エシェリヒア・コリの脱感作型ＣＭ−ＰＤ
Ｔ遺伝子の構築
Ｔ遺伝子の構築
【００３０】まず、エシェリヒア・コリＫ−１２のＲＲ
１株（ＢＲＬ社より購入）から、常法に従い染色体ＤＮ
Ａを抽出した。一方、公知文献［Ｈｕｄｓｏｎ，Ｇ．Ｓ
．ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｊ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．，１８０．１０２３（１９８４）］に記載され
るｐｈｅＡ遺伝子の塩基配列に基づいて、配列番号５、
６、７および８に示すような合成プライマーを常法によ
り合成した。配列番号５及び６は各々ｐｈｅＡの上流及
び下流と相同な塩基配列を示す。配列番号７及び８は互
いに相補的であり、Ｔ（チミン塩基）がＣ（シトシン塩
基）に置換した１塩基異なる以外、３３０番目のＬ−セ
リン残基の配列と相同性を有する。
１株（ＢＲＬ社より購入）から、常法に従い染色体ＤＮ
Ａを抽出した。一方、公知文献［Ｈｕｄｓｏｎ，Ｇ．Ｓ
．ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｊ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．，１８０．１０２３（１９８４）］に記載され
るｐｈｅＡ遺伝子の塩基配列に基づいて、配列番号５、
６、７および８に示すような合成プライマーを常法によ
り合成した。配列番号５及び６は各々ｐｈｅＡの上流及
び下流と相同な塩基配列を示す。配列番号７及び８は互
いに相補的であり、Ｔ（チミン塩基）がＣ（シトシン塩
基）に置換した１塩基異なる以外、３３０番目のＬ−セ
リン残基の配列と相同性を有する。
【００３１】次に、図２に示すように、染色休ＤＮＡと
配列番号５及び８、または配列番号６及び７の合成ＤＮ
Ａを用いて、ＰＣＲ反応を行い、それぞれ１．３ｋｂｐ
と０．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。これらのＤＮ
Ａ断片をアガロースゲル電気泳動し、ＤＮＡ回収キツト
（Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎ、フナコシ社製）を用いて回
収し、更にこれらの断片と配列番号５と６の合成ＤＮＡ
を用いてＰＣＲ反応を行い、１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片
を得た。この断片を制限酵素ＢａｍＨＩとＰｓｔＩで切
断した後、１．７ｋｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル
電気泳動により回収し、更にこの断片とプラスミドｐＨ
ＳＧ３９８（宝酒造社製）のＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ切断
物をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。この反応混
合物でエシェリヒア・コリＫ−１２のＫＡ１９７（ｐｈ
ｅＡ）株（エシェリヒア・コリ ジェネテイック
ストック センターより入手）を形質転換した。得ら
れたクロラムフェニコール耐性株の中でＬ−フェニルア
ラニンの要求性が消失している菌株からプラスミドを抽
出し、ｐＰＨＡＢと命名した。塩基配列の決定により、
該プラスミド中に、Ｎ−末端より３３０番目のＬ−セリ
ン残基がＬ−プロリン残基に置換した脱感作型ＣＭ−Ｐ
ＤＴ酵素をコードする遺伝子が保有されることを確認し
た。
配列番号５及び８、または配列番号６及び７の合成ＤＮ
Ａを用いて、ＰＣＲ反応を行い、それぞれ１．３ｋｂｐ
と０．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。これらのＤＮ
Ａ断片をアガロースゲル電気泳動し、ＤＮＡ回収キツト
（Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎ、フナコシ社製）を用いて回
収し、更にこれらの断片と配列番号５と６の合成ＤＮＡ
を用いてＰＣＲ反応を行い、１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片
を得た。この断片を制限酵素ＢａｍＨＩとＰｓｔＩで切
断した後、１．７ｋｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル
電気泳動により回収し、更にこの断片とプラスミドｐＨ
ＳＧ３９８（宝酒造社製）のＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ切断
物をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。この反応混
合物でエシェリヒア・コリＫ−１２のＫＡ１９７（ｐｈ
ｅＡ）株（エシェリヒア・コリ ジェネテイック
ストック センターより入手）を形質転換した。得ら
れたクロラムフェニコール耐性株の中でＬ−フェニルア
ラニンの要求性が消失している菌株からプラスミドを抽
出し、ｐＰＨＡＢと命名した。塩基配列の決定により、
該プラスミド中に、Ｎ−末端より３３０番目のＬ−セリ
ン残基がＬ−プロリン残基に置換した脱感作型ＣＭ−Ｐ
ＤＴ酵素をコードする遺伝子が保有されることを確認し
た。
【００３２】
【実施例３】
【００３３】（１）エシェリヒア・コリＫ−１２のｔｙ
ｒＡ遺伝子欠損性Ｗ３１１０株の造成
ｒＡ遺伝子欠損性Ｗ３１１０株の造成
【００３４】先ず、エシェリヒア・コリＫ−１２のＷ３
１１０株（国立遺伝研究所より入手）をストレプトマイ
シンを含む平板培地に塗布することにより、ストレプト
マイシン耐性株を取得した。次に、この株とエシェリヒ
ア・コリＫ−１２のＭＥ８４２４株（ＨｆｒＰＯ４５、
ｔｈｉ、ｒｅｌＡ１、ｔｙｒＡ：：Ｔｎ１０、ｕｎｇ−
１、ｎａｄＢ）（国立遺伝研究所より入手）の培養液を
混合し、３７℃で１５分間放置して接合伝達を行わせた
後、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、Ｌ−チロ
シンを含む平板培地に塗布し、生じたコロニー即ちエシ
ェリヒア・コリＫ−１２のＷ３１１０（ｔｙｒＡ）株を
取得した。
１１０株（国立遺伝研究所より入手）をストレプトマイ
シンを含む平板培地に塗布することにより、ストレプト
マイシン耐性株を取得した。次に、この株とエシェリヒ
ア・コリＫ−１２のＭＥ８４２４株（ＨｆｒＰＯ４５、
ｔｈｉ、ｒｅｌＡ１、ｔｙｒＡ：：Ｔｎ１０、ｕｎｇ−
１、ｎａｄＢ）（国立遺伝研究所より入手）の培養液を
混合し、３７℃で１５分間放置して接合伝達を行わせた
後、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、Ｌ−チロ
シンを含む平板培地に塗布し、生じたコロニー即ちエシ
ェリヒア・コリＫ−１２のＷ３１１０（ｔｙｒＡ）株を
取得した。
【００３５】（２）脱感作型ＤＳ及び脱感作型ＣＭ−Ｐ
ＤＴを保有するエシェリヒア・コリＫ−１２のＷ３１１
０（ｔｙｒＡ）の造成
ＤＴを保有するエシェリヒア・コリＫ−１２のＷ３１１
０（ｔｙｒＡ）の造成
【００３６】得られた脱感作型ＤＳ遺伝子を含有するｐ
ＴＳ−ａｒｏＧ４を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩ
ＩでａｒｏＧ４部分を切り出し、この断片をｐＢＲ３２
２のＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位に挿入してプ
ラスミドｐＢＲ−ａｒｏＧ４（アンピシリン耐性マーカ
ー）を取得した。また、脱感作型ＣＭ−ＰＤＨ遺伝子を
含有するｐＰＨＡＢを制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩ
ＩＩでＣＭ−ＰＤＴ遺伝子含有フラグメントを切り出し
、この断片をｐＡＣＹＣ１８４のＢａｍＨＩ、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ切断部位に挿入してプラスミドｐＡＣＭＡＢ（選
択マーカーはクロラムフェニコール耐性）を造成した。 該プラスミドをエシェリヒア・コリＫ−１２株由来のＷ
３１１０（ｔｙｒＡ）株に導入し、形質転換株Ｗ３１１
０（ｔｙｒＡ）／ｐＡＣＭＡＢを取得した。更に２種類
のプラスミドｐＡＣＭＡＢ及びｐＢＲ−ａｒｏＧ４をＷ
３１１０（ｔｙｒＡ）に導入して形質転換株Ｗ３１１０
（ｔｙｒＡ）／ｐＢＲ−ａｒｏＧ４、ｐＡＣＭＡＢを取
得した。該形質転換株をＡＪ１２６０４株と命名し、微
工研に寄託（ＦＥＲＭ Ｐ−１１９７５）した。
ＴＳ−ａｒｏＧ４を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩ
ＩでａｒｏＧ４部分を切り出し、この断片をｐＢＲ３２
２のＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位に挿入してプ
ラスミドｐＢＲ−ａｒｏＧ４（アンピシリン耐性マーカ
ー）を取得した。また、脱感作型ＣＭ−ＰＤＨ遺伝子を
含有するｐＰＨＡＢを制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩ
ＩＩでＣＭ−ＰＤＴ遺伝子含有フラグメントを切り出し
、この断片をｐＡＣＹＣ１８４のＢａｍＨＩ、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ切断部位に挿入してプラスミドｐＡＣＭＡＢ（選
択マーカーはクロラムフェニコール耐性）を造成した。 該プラスミドをエシェリヒア・コリＫ−１２株由来のＷ
３１１０（ｔｙｒＡ）株に導入し、形質転換株Ｗ３１１
０（ｔｙｒＡ）／ｐＡＣＭＡＢを取得した。更に２種類
のプラスミドｐＡＣＭＡＢ及びｐＢＲ−ａｒｏＧ４をＷ
３１１０（ｔｙｒＡ）に導入して形質転換株Ｗ３１１０
（ｔｙｒＡ）／ｐＢＲ−ａｒｏＧ４、ｐＡＣＭＡＢを取
得した。該形質転換株をＡＪ１２６０４株と命名し、微
工研に寄託（ＦＥＲＭ Ｐ−１１９７５）した。
【００３７】（３）Ｌ−フェニルアラニン生産性
【００
３８】前項で記載した形質転換株ＡＪ１２６０４をＬ−
フェニルアラニン生産用培地（グルコース２０ｇ、リン
酸水素２ナトリウム２９．４ｇ、リン酸２水素カリウム
６ｇ、塩化ナトリウム１ｇ、塩化アンモニウム２ｇ、ク
エン酸ナトリウム１０ｇ、グルタミン酸ナトリウム０．
４ｇ、硫酸マグネシウム７水和物３ｇ、塩化カルシウム
０．２３ｇ、サイアミン塩酸塩２ｍｇを水１Ｌに含む）
を用いて、３７℃で２４時間培養した。その結果を表２
に示す。尚、定量は高速液体クロマトグラフィーで実施
した。
３８】前項で記載した形質転換株ＡＪ１２６０４をＬ−
フェニルアラニン生産用培地（グルコース２０ｇ、リン
酸水素２ナトリウム２９．４ｇ、リン酸２水素カリウム
６ｇ、塩化ナトリウム１ｇ、塩化アンモニウム２ｇ、ク
エン酸ナトリウム１０ｇ、グルタミン酸ナトリウム０．
４ｇ、硫酸マグネシウム７水和物３ｇ、塩化カルシウム
０．２３ｇ、サイアミン塩酸塩２ｍｇを水１Ｌに含む）
を用いて、３７℃で２４時間培養した。その結果を表２
に示す。尚、定量は高速液体クロマトグラフィーで実施
した。
【００３９】
【表２】
【図１】ｐＴＳ−ａｒｏＦ、ｐＴＳ−ａｒｏＧの構築
【
図２】ｐＰＨＡＢの構築
図２】ｐＰＨＡＢの構築
【図３】天然型及び変異型ａｒｏＦのＤＳ活性における
、Ｌ−チロシンによる阻害度を示すものである。
、Ｌ−チロシンによる阻害度を示すものである。
【図４】天然型及び変異型ａｒｏＧのＤＳ活性における
、Ｌ−フェニルアラニンによる阻害度を示すものである
。
、Ｌ−フェニルアラニンによる阻害度を示すものである
。
【配列表】配列番号：１
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴
存在位置：１．．２０
特徴を決定した方法：Ｓ
他の情報：ＰＣＲ法に使用するｐｒｉｍｅｒ配列
ＧＣＴＡＡＣＣＡＧＴ ＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡ
２０配列
番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２０ 特徴を決定した方法：Ｓ 他の情報：ＰＣＲ法に使用するｐｒｉｍｅｒ配列 ＣＣＣＡＣＴＴＣＡＧ ＣＡＡＣＣＡＧＴＴＣ
２０配列
番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２０ 特徴を決定した方法：Ｓ 他の情報：ＰＣＲ法に使用するｐｒｉｍｅｒ配列 ＧＴＡＴＴＴＡＣＣＣ ＣＧＴＴＡＴＴＧＴＣ
２０配列
番号：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２０ 特徴を決定した方法：Ｓ 他の情報：ＰＣＲ法に使用するｐｒｉｍｅｒ配列 ＡＣＴＣＣＧＣＣＧＧ ＡＡＧＴＧＡＣＴＡＡ
２０配列
番号：５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２０ 特徴を決定した方法：Ｓ 他の情報：ＰＣＲ法に使用するｐｒｉｍｅｒ配列 ＴＣＡＡＣＡＡＧＣＴ ＧＧＡＡＣＧＧＡＣＧ
２０配列
番号：６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２０ 特徴を決定した方法：Ｓ 他の情報：ＰＣＲ法に使用するｐｒｉｍｅｒ配列 ＣＧＣＣＧＡＴＴＴＡ ＣＣＧＣＣＴＴＧＡＧ
２０配列
番号：７ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２１ 特徴を決定した方法：Ｓ 他の情報：ＰＣＲ法に使用するｐｒｉｍｅｒ配列 ＣＣＧＴＣＴＧＧＡＡ ＣＣＡＣＧＣＣＣＧＡ Ｔ
２１配列番
号：８ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２１ 特徴を決定した方法：Ｓ 他の情報：ＰＣＲ法に使用するｐｒｉｍｅｒ配列
２０配列
番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２０ 特徴を決定した方法：Ｓ 他の情報：ＰＣＲ法に使用するｐｒｉｍｅｒ配列 ＣＣＣＡＣＴＴＣＡＧ ＣＡＡＣＣＡＧＴＴＣ
２０配列
番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２０ 特徴を決定した方法：Ｓ 他の情報：ＰＣＲ法に使用するｐｒｉｍｅｒ配列 ＧＴＡＴＴＴＡＣＣＣ ＣＧＴＴＡＴＴＧＴＣ
２０配列
番号：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２０ 特徴を決定した方法：Ｓ 他の情報：ＰＣＲ法に使用するｐｒｉｍｅｒ配列 ＡＣＴＣＣＧＣＣＧＧ ＡＡＧＴＧＡＣＴＡＡ
２０配列
番号：５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２０ 特徴を決定した方法：Ｓ 他の情報：ＰＣＲ法に使用するｐｒｉｍｅｒ配列 ＴＣＡＡＣＡＡＧＣＴ ＧＧＡＡＣＧＧＡＣＧ
２０配列
番号：６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２０ 特徴を決定した方法：Ｓ 他の情報：ＰＣＲ法に使用するｐｒｉｍｅｒ配列 ＣＧＣＣＧＡＴＴＴＡ ＣＣＧＣＣＴＴＧＡＧ
２０配列
番号：７ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２１ 特徴を決定した方法：Ｓ 他の情報：ＰＣＲ法に使用するｐｒｉｍｅｒ配列 ＣＣＧＴＣＴＧＧＡＡ ＣＣＡＣＧＣＣＣＧＡ Ｔ
２１配列番
号：８ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２１ 特徴を決定した方法：Ｓ 他の情報：ＰＣＲ法に使用するｐｒｉｍｅｒ配列
Claims (11)
- 【請求項１】 エシェリヒア・コリの３−デオキシ−
Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ（以
下「ＤＳ」と略す）の１又は２アミノ酸置換により実質
的にフィードバック阻害が解除された酵素をコードする
遺伝子及び芳香族アミノ酸生合成系固有の１もしくは２
以上の酵素のフィードバック阻害が解除された酵素をコ
ードする遺伝子とを含有するプラスミドで形質転換され
た微生物。 - 【請求項２】 ＤＳがａｒｏＦにコードされるもので
ある請求項１記載の微生物。 - 【請求項３】 Ｎ末端より１４７番目のＬ−アスパラ
ギン酸または１８１番目のＬ−セリンが他のアミノ酸残
基に置換されたＤＳをコードする請求項１又は２記載の
微生物。 - 【請求項４】 置換される他のアミノ酸残基が、１４
７番目のＬ−アスパラギン酸の場合はＬ−アスパラギン
に、１８１番目のＬ−セリンの場合はＬ−フェニルアラ
ニンである請求項３記載の微生物。 - 【請求項５】 ＤＳがａｒｏＧにコードされる請求項
１記載の微生物。 - 【請求項６】 Ｎ末端より１４６番目のＬ−アスパラ
ギン酸、１４７番目のＬ−メチオニン、１５０番目のＬ
−プロリンもしくは２０２番目のＬ−アラニンの１アミ
ノ酸残基、または１５７番目のＬ−メチオニン及び２１
９番目のＬ−アラニンの２アミノ酸残基が他のアミノ酸
に置換されたＤＳをコードする請求項１又は５記載の微
生物。 - 【請求項７】 置換される他のアミノ酸残基が１４６
番目のＬ−アスパラギン酸の場合はＬ−アルパラギンに
、１４７番目のＬ−メチオニンの場合はＬ−イソロイシ
ンに、１５０番目のＬ−プロリンの場合はＬ−ロイシン
に、２０２番目のＬ−アラニンの場合はＬ−スレオニン
に、更に１５７番目がＬ−メチオニンで２１９番目がＬ
−アラニンの場合はそれぞれＬ−イソロイシン、Ｌ−ス
レオニンに置換されたＤＳをコードする請求項６記載の
遺伝子。 - 【請求項８】 固有系酵素がコリスミン酸ムターゼー
プレフェン酸デヒドラダーゼ（以下ＣＭ−ＰＤＴと略す
）である微生物。 - 【請求項９】 請求項１乃至８記載の微生物がエシェ
リヒア・コリであるもの。 - 【請求項１０】 請求項１乃至９記載の微生物を培養
することにより培地中に生産された芳香族アミノ酸を取
得することを特徴とする芳香族アミノ酸の製造法。 - 【請求項１１】 芳香族アミノ酸がＬ−フェニルアラ
ニンである請求項１０記載の製造法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3100630A JPH04248983A (ja) | 1991-02-05 | 1991-02-05 | 発酵法による芳香族アミノ酸の製造法 |
| JP19622691A JP3185261B2 (ja) | 1991-02-05 | 1991-05-02 | 発酵法による芳香族アミノ酸の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3100630A JPH04248983A (ja) | 1991-02-05 | 1991-02-05 | 発酵法による芳香族アミノ酸の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04248983A true JPH04248983A (ja) | 1992-09-04 |
Family
ID=14279160
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3100630A Pending JPH04248983A (ja) | 1991-02-05 | 1991-02-05 | 発酵法による芳香族アミノ酸の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04248983A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007515168A (ja) * | 2003-12-15 | 2007-06-14 | シージェイ コープ． | トリプトファン生合成に関連する変異遺伝子を含有する大腸菌変異体および同変異体を使用するトリプトファンの製造方法 |
| JP2022521384A (ja) * | 2019-06-17 | 2022-04-07 | シージェイ チェイルジェダン コーポレーション | Ｌ－チロシンを生産する微生物及びこれを用いたｌ－チロシンの生産方法 |
-
1991
- 1991-02-05 JP JP3100630A patent/JPH04248983A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007515168A (ja) * | 2003-12-15 | 2007-06-14 | シージェイ コープ． | トリプトファン生合成に関連する変異遺伝子を含有する大腸菌変異体および同変異体を使用するトリプトファンの製造方法 |
| JP2022521384A (ja) * | 2019-06-17 | 2022-04-07 | シージェイ チェイルジェダン コーポレーション | Ｌ－チロシンを生産する微生物及びこれを用いたｌ－チロシンの生産方法 |
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