JP3185261B2 - 発酵法による芳香族アミノ酸の製造法 - Google Patents
発酵法による芳香族アミノ酸の製造法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】芳香族アミノ酸は甘味料アスパル
テームの原料（Ｌ−フェニルアラニン）、飼料添加物
（Ｌ−トリプトファン）、輸液等の医薬品（Ｌ−トリプ
トファン、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシン）と
して需要が急増している。本発明は、これら芳香族アミ
ノ酸の生産に関するものである。
テームの原料（Ｌ−フェニルアラニン）、飼料添加物
（Ｌ−トリプトファン）、輸液等の医薬品（Ｌ−トリプ
トファン、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシン）と
して需要が急増している。本発明は、これら芳香族アミ
ノ酸の生産に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】微生物を用いて芳香族アミノ酸を製造す
る方法は多数知られている。たとえば、Ｌ−フェニルア
ラニンの製造法としては、組換え体エシェリヒア・コリ
を用いるものに、特開昭５６−１８９０、特開昭５８−
１０３３９８、特開昭６１−９２５６５、特開平１−１
０４１６０、国際公開ＷＯ８７／００２０２がある。ま
たＬ−フェニルアラニンまたはＬ−チロシンの製造法と
しては、コリネバクテリウム属の変異株を用いるもの
に、特開昭６１−１２８８９７があり、組換え体コリネ
バクテリウムを用いるものに、特開昭６０−３４１９
７、特開昭６０−２４１９２、特開昭６１−２６０８９
２、特開昭６１−１２４３７５が知られている。Ｌ−ト
リプトファンの製造法としては、組換え体エシェリヒア
・コリを用いるものに、特開昭５７−７１３９７、米国
特許４３７１６１４があり、バチルス・ズブチルスの変
異株を用いるものに特公昭５３−３９５１７、同６２−
３４３９９があり、組換え体バチルス・ズブチルスを用
いるものに、特開昭６１−１０４７９０、同６２−３４
３９９があり、ブレビバクテリウム属の変異株を用いる
ものに、特開昭５７−１７４０９６があり、更に組換え
体ブレビバクテリウム属を用いるものに特開昭６２−５
１９８０が報告されている。
る方法は多数知られている。たとえば、Ｌ−フェニルア
ラニンの製造法としては、組換え体エシェリヒア・コリ
を用いるものに、特開昭５６−１８９０、特開昭５８−
１０３３９８、特開昭６１−９２５６５、特開平１−１
０４１６０、国際公開ＷＯ８７／００２０２がある。ま
たＬ−フェニルアラニンまたはＬ−チロシンの製造法と
しては、コリネバクテリウム属の変異株を用いるもの
に、特開昭６１−１２８８９７があり、組換え体コリネ
バクテリウムを用いるものに、特開昭６０−３４１９
７、特開昭６０−２４１９２、特開昭６１−２６０８９
２、特開昭６１−１２４３７５が知られている。Ｌ−ト
リプトファンの製造法としては、組換え体エシェリヒア
・コリを用いるものに、特開昭５７−７１３９７、米国
特許４３７１６１４があり、バチルス・ズブチルスの変
異株を用いるものに特公昭５３−３９５１７、同６２−
３４３９９があり、組換え体バチルス・ズブチルスを用
いるものに、特開昭６１−１０４７９０、同６２−３４
３９９があり、ブレビバクテリウム属の変異株を用いる
ものに、特開昭５７−１７４０９６があり、更に組換え
体ブレビバクテリウム属を用いるものに特開昭６２−５
１９８０が報告されている。
【０００３】これらの方法に用いられる微生物の中で、
エシェリヒア・コリにおいて、芳香族アミノ酸の生合成
共通経路上における鍵酵素として、３−デオキシ−Ｄ−
アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ（以下
「ＤＳ」と略する）が知られ、３種類のアイソザイムが
存在する。これらは、ａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ａｒｏＨと
呼ばれる遺伝子にコードされ、それぞれＬ−チロシン、
Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファンによるフィ
ードバック阻害を受ける。これらの遺伝子に関する塩基
配列及びアミノ酸配列は、既に報告されている［ａｒｏ
Ｆ：Ｈｕｄｓｏｎ，Ｇ．Ｓ．ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏ
ｎ，Ｂ．Ｅ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８０，１０
２３（１９８４）／ａｒｏＧ：Ｄａｖｉｅｓ，Ｗ．Ｄ．
ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｂ．Ｅ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ
ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１３，４０４５（１９８２）／
ａｒｏＨ：Ｒａｙ，Ｊ．Ｍ．ｅｔａｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ．，１７０，５５００（１９８８）］。芳香族
アミノ酸を効率的に生産するためには、これらＤＳを改
良することが不可欠である。３種類のＤＳ遺伝子のう
ち、ａｒｏＨにコードされるＤＳについては、Ｌ−トリ
プトファンによるフィードバック阻害が解除された変異
型ａｒｏＨが報告されている［Ｒａｙ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ
ａｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７０，５５００
（１９８８）］。しかしながら、本来、ａｒｏＨ由来の
ＤＳ活性は、他のＤＳ活性に比して非常に低いため、組
換えＤＮＡ技術による改良には適さず、ａｒｏＦ、ａｒ
ｏＧにコードされるＤＳの脱感作型の利用がより効率的
であると考えられる。Ｌ−チロシンによるａｒｏＦのフ
ィードバック阻害解除変異の例としてはウェーバーとハ
ーマンによる報告［Ｗｅａｖｅｒ，Ｌ．Ｍ．ａｎｄ Ｈ
ｅｒｒｍａｎｎ，Ｋ．Ｍ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．，１７２，６５８１（１９９０）］があり、Ｎ末端
より１４８番目のＬ−プロリン残基がＬ−ロイシン残基
に置換している。変異部位が明示された脱感作型ＤＳ遺
伝子の芳香族アミノ酸に関する発酵生産への応用として
は、以下に示す２、３の例が知られるのみである。エド
ワーズらが、ａｒｏＦにコードされるＤＳの１５２番目
のＬ−グルタミン残基をＬ−イソロイシン残基に置換す
ることでＬ−チロシンによるフィードバック阻害を解除
し、Ｌ−フェニルアラニンの発酵生産に利用している
［国際公開ＷＯ８７／００２０２］。また、シネンキら
はａｒｏＧにコードされるＤＳの７６番目のＬ−ロイシ
ン残基をＬ−バリン残基に置換することにより、Ｌ−フ
ェニルアラニンによるフィードバック阻害を解除したＤ
Ｓ（ａｒｏＧ）を取得してＬ−フェニルアラニンの発酵
生産に利用している［特開昭５８−１０３３９８］。し
かしながら、本報告では、Ｌ−フェニルアラニンによる
フィードバック阻害が解除されたＤＳの酵素活性のデー
タ及びＬ−フェニルアラニンの生産量は記載されていな
い。尚、Ｌ−トリプトファンの生産例について、これま
でに報告されていない。
エシェリヒア・コリにおいて、芳香族アミノ酸の生合成
共通経路上における鍵酵素として、３−デオキシ−Ｄ−
アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ（以下
「ＤＳ」と略する）が知られ、３種類のアイソザイムが
存在する。これらは、ａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ａｒｏＨと
呼ばれる遺伝子にコードされ、それぞれＬ−チロシン、
Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファンによるフィ
ードバック阻害を受ける。これらの遺伝子に関する塩基
配列及びアミノ酸配列は、既に報告されている［ａｒｏ
Ｆ：Ｈｕｄｓｏｎ，Ｇ．Ｓ．ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏ
ｎ，Ｂ．Ｅ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８０，１０
２３（１９８４）／ａｒｏＧ：Ｄａｖｉｅｓ，Ｗ．Ｄ．
ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｂ．Ｅ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ
ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１３，４０４５（１９８２）／
ａｒｏＨ：Ｒａｙ，Ｊ．Ｍ．ｅｔａｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ．，１７０，５５００（１９８８）］。芳香族
アミノ酸を効率的に生産するためには、これらＤＳを改
良することが不可欠である。３種類のＤＳ遺伝子のう
ち、ａｒｏＨにコードされるＤＳについては、Ｌ−トリ
プトファンによるフィードバック阻害が解除された変異
型ａｒｏＨが報告されている［Ｒａｙ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ
ａｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７０，５５００
（１９８８）］。しかしながら、本来、ａｒｏＨ由来の
ＤＳ活性は、他のＤＳ活性に比して非常に低いため、組
換えＤＮＡ技術による改良には適さず、ａｒｏＦ、ａｒ
ｏＧにコードされるＤＳの脱感作型の利用がより効率的
であると考えられる。Ｌ−チロシンによるａｒｏＦのフ
ィードバック阻害解除変異の例としてはウェーバーとハ
ーマンによる報告［Ｗｅａｖｅｒ，Ｌ．Ｍ．ａｎｄ Ｈ
ｅｒｒｍａｎｎ，Ｋ．Ｍ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．，１７２，６５８１（１９９０）］があり、Ｎ末端
より１４８番目のＬ−プロリン残基がＬ−ロイシン残基
に置換している。変異部位が明示された脱感作型ＤＳ遺
伝子の芳香族アミノ酸に関する発酵生産への応用として
は、以下に示す２、３の例が知られるのみである。エド
ワーズらが、ａｒｏＦにコードされるＤＳの１５２番目
のＬ−グルタミン残基をＬ−イソロイシン残基に置換す
ることでＬ−チロシンによるフィードバック阻害を解除
し、Ｌ−フェニルアラニンの発酵生産に利用している
［国際公開ＷＯ８７／００２０２］。また、シネンキら
はａｒｏＧにコードされるＤＳの７６番目のＬ−ロイシ
ン残基をＬ−バリン残基に置換することにより、Ｌ−フ
ェニルアラニンによるフィードバック阻害を解除したＤ
Ｓ（ａｒｏＧ）を取得してＬ−フェニルアラニンの発酵
生産に利用している［特開昭５８−１０３３９８］。し
かしながら、本報告では、Ｌ−フェニルアラニンによる
フィードバック阻害が解除されたＤＳの酵素活性のデー
タ及びＬ−フェニルアラニンの生産量は記載されていな
い。尚、Ｌ−トリプトファンの生産例について、これま
でに報告されていない。
【０００４】
【本発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、Ｄ
Ｓの１ないし２アミノ酸残基を他のアミノ酸に置換する
ことにより得られる脱感作型ＤＳをコードする遺伝子及
び芳香族アミノ酸固有系の脱感作型酵素をコードする遺
伝子を造成し、これら遺伝子を含む組換えＤＮＡで形質
転換された微生物を培養することにより生産された芳香
族アミノ酸を取得することを特徴とする芳香族アミノ酸
の製造法を提供することである。
Ｓの１ないし２アミノ酸残基を他のアミノ酸に置換する
ことにより得られる脱感作型ＤＳをコードする遺伝子及
び芳香族アミノ酸固有系の脱感作型酵素をコードする遺
伝子を造成し、これら遺伝子を含む組換えＤＮＡで形質
転換された微生物を培養することにより生産された芳香
族アミノ酸を取得することを特徴とする芳香族アミノ酸
の製造法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、まずエシ
ェリヒア・コリの天然型ＤＳ遺伝子をクローニングし、
これを変異させることにより脱感作型のＤＳをコードす
る新規遺伝子を取得し、芳香族アミノ酸のひとつである
Ｌ−フェニルアラニンの発酵生産の場合には、該ＤＳ遺
伝子とＬ−フェニルアラニン生合成固有系の脱感作型コ
リスミン酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼ（Ｃ
Ｍ−ＰＤＴ）の遺伝子を組合わせ利用して、また他の芳
香族アミノ酸であるＬ−トリプトファンの発酵生産の場
合には、該ＤＳ遺伝子とＬ−トリプトファン生合成固有
系の脱感作型アントラニル酸合成酵素（ＡＳ）を含むト
リプトファンオペロンを組合せ利用して、微生物を改良
することにより、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプト
ファンといった代表的な芳香族アミノ酸の発酵生産を改
善し、本発明を完成に到らしめた。以下、本発明を詳細
に説明する。
ェリヒア・コリの天然型ＤＳ遺伝子をクローニングし、
これを変異させることにより脱感作型のＤＳをコードす
る新規遺伝子を取得し、芳香族アミノ酸のひとつである
Ｌ−フェニルアラニンの発酵生産の場合には、該ＤＳ遺
伝子とＬ−フェニルアラニン生合成固有系の脱感作型コ
リスミン酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼ（Ｃ
Ｍ−ＰＤＴ）の遺伝子を組合わせ利用して、また他の芳
香族アミノ酸であるＬ−トリプトファンの発酵生産の場
合には、該ＤＳ遺伝子とＬ−トリプトファン生合成固有
系の脱感作型アントラニル酸合成酵素（ＡＳ）を含むト
リプトファンオペロンを組合せ利用して、微生物を改良
することにより、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプト
ファンといった代表的な芳香族アミノ酸の発酵生産を改
善し、本発明を完成に到らしめた。以下、本発明を詳細
に説明する。
【０００６】先ず、エシェリヒア・コリＫ−１２のＭＣ
１０６１株（ＡＴＣＣ５３３３８）の染色体ＤＮＡより
ＰＣＲ法を用いてａｒｏＦ、ａｒｏＧ遺伝子をクローニ
ングし、ヒドロキシルアミンを用いて目的の遺伝子を変
異させた。この際使用する染色体ＤＮＡはエシェリヒア
・コリ由来であればどの菌株でもよい。ａｒｏＦ及びａ
ｒｏＧとは、Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニンでそ
れぞれフィードバック阻害を受けるＤＳをコードする遺
伝子をいい、遺伝的多系性などによる変異型も含む。
尚、遺伝的多系性とは、遺伝子上の自然突然変異により
蛋白質のアミノ酸配列が一部変化している現象をいう。
遺伝子に変異を生じさせるには、リコンビナントＰＣＲ
法［ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ
ｐｒｅｓｓ（１９８９）］、部位特異的変異法［Ｋｒ
ａｍｅｒ，Ｗ．ａｎｄ Ｆｒｉｔｓ，Ｈ．Ｊ．，Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３５０
（１９８７）］や当該遺伝子を保有する菌株を紫外線照
射する方法もしくは化学薬剤処理（Ｎ−メチル−Ｎ’−
ニトロソグアニジン、亜硝酸など）する方法、更に目的
遺伝子を化学合成する方法がある。次に、該変異型遺伝
子を組換えＤＮＡとして適当な微生物に導入し、発現さ
せることにより、フィードバック阻害が実質的に解除さ
れたＤＳを保有する微生物を取得した。
１０６１株（ＡＴＣＣ５３３３８）の染色体ＤＮＡより
ＰＣＲ法を用いてａｒｏＦ、ａｒｏＧ遺伝子をクローニ
ングし、ヒドロキシルアミンを用いて目的の遺伝子を変
異させた。この際使用する染色体ＤＮＡはエシェリヒア
・コリ由来であればどの菌株でもよい。ａｒｏＦ及びａ
ｒｏＧとは、Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニンでそ
れぞれフィードバック阻害を受けるＤＳをコードする遺
伝子をいい、遺伝的多系性などによる変異型も含む。
尚、遺伝的多系性とは、遺伝子上の自然突然変異により
蛋白質のアミノ酸配列が一部変化している現象をいう。
遺伝子に変異を生じさせるには、リコンビナントＰＣＲ
法［ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ
ｐｒｅｓｓ（１９８９）］、部位特異的変異法［Ｋｒ
ａｍｅｒ，Ｗ．ａｎｄ Ｆｒｉｔｓ，Ｈ．Ｊ．，Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３５０
（１９８７）］や当該遺伝子を保有する菌株を紫外線照
射する方法もしくは化学薬剤処理（Ｎ−メチル−Ｎ’−
ニトロソグアニジン、亜硝酸など）する方法、更に目的
遺伝子を化学合成する方法がある。次に、該変異型遺伝
子を組換えＤＮＡとして適当な微生物に導入し、発現さ
せることにより、フィードバック阻害が実質的に解除さ
れたＤＳを保有する微生物を取得した。
【０００７】以上の方法で取得される組換えＤＮＡと
は、フィードバック阻害を解除したＤＳをコードする有
用遺伝子をパッセンジャーとして、プラスミドやファー
ジＤＮＡのベクターに組み込んだものをいう。その際、
該有用遺伝子の発現を効率的に実施するために、ｌａ
ｃ、ｔｒｐ、ＰＬ等の微生物内で働くプロモーターを用
いてもよい。尚、ここでいう組換えＤＮＡには、該有用
遺伝子をトランスポゾン［Ｂｅｒｇ，Ｄ．Ｅ．ａｎｄ
Ｂｅｒｇ，Ｃ．Ｍ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１，
４１７（１９８３）］、Ｍｕファージ［特開平２−１０
９９８５］または相同性組換え［Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂ．（１９７
２）］を用いた方法で染色体に組み込んだものも含まれ
る。
は、フィードバック阻害を解除したＤＳをコードする有
用遺伝子をパッセンジャーとして、プラスミドやファー
ジＤＮＡのベクターに組み込んだものをいう。その際、
該有用遺伝子の発現を効率的に実施するために、ｌａ
ｃ、ｔｒｐ、ＰＬ等の微生物内で働くプロモーターを用
いてもよい。尚、ここでいう組換えＤＮＡには、該有用
遺伝子をトランスポゾン［Ｂｅｒｇ，Ｄ．Ｅ．ａｎｄ
Ｂｅｒｇ，Ｃ．Ｍ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１，
４１７（１９８３）］、Ｍｕファージ［特開平２−１０
９９８５］または相同性組換え［Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂ．（１９７
２）］を用いた方法で染色体に組み込んだものも含まれ
る。
【０００８】組換えＤＮＡを有する微生物としては、該
ＤＳといった目的の酵素をコードする遺伝子が発現する
もので、かつ芳香族アミノ酸を生産する微生物（Ｌ−フ
ェニルアラニンの場合は、Ｌ−フェニルアラニンアナロ
グ耐性等の付与によりＬ−フェニルアラニン生産性を獲
得したもの）であれば、エシェリヒア属、ブレビバクテ
リウム属、コリネバクテリウム属、バチルス属、セラチ
ア属、シュードモナス属等に属する微生物の種、菌株を
問わずどのようなものでもよい。
ＤＳといった目的の酵素をコードする遺伝子が発現する
もので、かつ芳香族アミノ酸を生産する微生物（Ｌ−フ
ェニルアラニンの場合は、Ｌ−フェニルアラニンアナロ
グ耐性等の付与によりＬ−フェニルアラニン生産性を獲
得したもの）であれば、エシェリヒア属、ブレビバクテ
リウム属、コリネバクテリウム属、バチルス属、セラチ
ア属、シュードモナス属等に属する微生物の種、菌株を
問わずどのようなものでもよい。
【０００９】また該ＤＳ遺伝子の効率的活用のため、他
の有用遺伝子（例えばＬ−フェニルアラニンの場合は脱
感作型ＣＭ−ＰＤＨの遺伝子、Ｌ−トリプトファンの場
合には脱感作型ＡＳを含むトリプトファンオペロンが挙
げられる）と組み合わせて利用するとよい。その際、該
有用遺伝子は、該ＤＳ遺伝子と同じく宿主の染色体上に
存在しても、プラスミド上に存在してもよい。
の有用遺伝子（例えばＬ−フェニルアラニンの場合は脱
感作型ＣＭ−ＰＤＨの遺伝子、Ｌ−トリプトファンの場
合には脱感作型ＡＳを含むトリプトファンオペロンが挙
げられる）と組み合わせて利用するとよい。その際、該
有用遺伝子は、該ＤＳ遺伝子と同じく宿主の染色体上に
存在しても、プラスミド上に存在してもよい。
【００１０】以上の方法で取得した脱感作型ＤＳ遺伝子
を含む組換えＤＮＡで形質転換された微生物を培養し、
培養液に目的の芳香族アミノ酸を生成蓄積せしめ、これ
を採取した。
を含む組換えＤＮＡで形質転換された微生物を培養し、
培養液に目的の芳香族アミノ酸を生成蓄積せしめ、これ
を採取した。
【００１１】使用する芳香族アミノ酸生産用の培地は、
炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有
機成分を含有する通常の培地である。炭素源としては、
グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース
やでんぷんの加水分解物などの糖類、グリセロールやソ
ルビトールなどのアルコール類、フマール酸、クエン
酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。窒素
源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リ
ン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分
解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等
を用いることができる。有機微量栄養源としては、ビタ
ミンＢ１、Ｌ−チロシンなどの要求物質または酵母エキ
ス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、
必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄
イオン、マンガンイオン等が少量添加される。培養は好
気的条件下で１６〜７２時間実施するのがよく、培養温
度は３０℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜７に制御す
る。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいは
アルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用すること
ができる。発酵液からの芳香族アミノ酸の採取は通常イ
オン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わ
せることにより実施できる。
炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有
機成分を含有する通常の培地である。炭素源としては、
グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース
やでんぷんの加水分解物などの糖類、グリセロールやソ
ルビトールなどのアルコール類、フマール酸、クエン
酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。窒素
源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リ
ン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分
解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等
を用いることができる。有機微量栄養源としては、ビタ
ミンＢ１、Ｌ−チロシンなどの要求物質または酵母エキ
ス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、
必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄
イオン、マンガンイオン等が少量添加される。培養は好
気的条件下で１６〜７２時間実施するのがよく、培養温
度は３０℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜７に制御す
る。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいは
アルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用すること
ができる。発酵液からの芳香族アミノ酸の採取は通常イ
オン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わ
せることにより実施できる。
【００１２】以上に述べた方法により、フィードバック
阻害が解除されたＤＳ及び固有系が脱感作された酵素を
有する形質転換株を培養すると、芳香族アミノ酸の生産
性について大幅な向上がみられた。このことは本発明の
有用性を実証したものである。
阻害が解除されたＤＳ及び固有系が脱感作された酵素を
有する形質転換株を培養すると、芳香族アミノ酸の生産
性について大幅な向上がみられた。このことは本発明の
有用性を実証したものである。
【００１３】
【発明の効果】本発明による微生物を用いれば、芳香族
アミノ酸共通の生合成系の最初の鍵酵素であるＤＳのａ
ｒｏＦ，ａｒｏＧが脱感作されているため、共通系での
代謝が改善される。これに例えば、脱感作型ＣＭ−ＰＤ
Ｔを組み合わせた微生物は各々の酵素を別々に脱感作し
た場合に比べ、相乗的にＬ−フェニルアラニンの生産量
が増加する。Ｌ−トリプトファンについても同様であ
る。
アミノ酸共通の生合成系の最初の鍵酵素であるＤＳのａ
ｒｏＦ，ａｒｏＧが脱感作されているため、共通系での
代謝が改善される。これに例えば、脱感作型ＣＭ−ＰＤ
Ｔを組み合わせた微生物は各々の酵素を別々に脱感作し
た場合に比べ、相乗的にＬ−フェニルアラニンの生産量
が増加する。Ｌ−トリプトファンについても同様であ
る。
【００１４】次に芳香族アミノ酸の代表としてＬ−フェ
ニルアラニン及びＬ−トリプトファンについての実施例
を示す。
ニルアラニン及びＬ−トリプトファンについての実施例
を示す。
【００１５】
【００１６】
【実施例１】
【００１７】（１）エシェリヒア・コリのａｒｏＦ由来
変異型ＤＳ遺伝子の取得
変異型ＤＳ遺伝子の取得
【００１８】エシェリヒア・コリＫ−１２のＭＣ１０６
１株から、通常の方法に従って染色体ＤＮＡを抽出し
た。一方、公知の文献［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８
０，１０２３（１９８４）］に記載されているａｒｏＦ
遺伝子の塩基配列に基づいて配列番号１及び２に示すよ
うな合成ＤＮＡプライマー２本を通常の方法で合成し
た。これらはそれぞれａｒｏＦ遺伝子の上流及び下流に
相同な配列を有する。この染色体ＤＮＡとＤＮＡプライ
マーを用いてエルリッチらの方法［ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ ｐｒｅｓｓ（１９８
９）］に従ってＰＣＲ反応を行ない、１．５ｋｂｐのＤ
ＮＡ断片を得た。以下、図１の左側に示すように、この
断片を制限酵素ＥｃｏＲＶとＥｃｏ４７ＩＩＩで切断し
た後、ｐＨＳＧ３９８（宝酒造社製）のＳｍａＩ切断物
をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。この反応混合
物でエシェリヒア・コリＫ−１２のＪＭ１０９株（宝酒
造（株）より購入）を形質転換し、生育したクロラムフ
ェニコール耐性株の中でａｒｏＦ遺伝子が挿入されたプ
ラスミドを保有する菌株からプラスミドを抽出し、プラ
スミドｐＨＳＧ−ａｒｏＦを取得した。更にｐＨＳＧ−
ａｒｏＦを制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断
することにより得たａｒｏＦ遺伝子含有ＤＮＡ断片を、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼでプラスミドｐＴＳ１（特願平２−
１９２１６２）のＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ切断フラ
グメントと連結した。この反応混合物でエシェリヒア・
コリＫ−１２のＤＳ欠損（ａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ａｒｏ
Ｈ）株ＡＢ３２５７を形質転換した。生育したアンピシ
リン耐性株の中でＬ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニ
ン、Ｌ−トリプトファンの要求性が消失した株からプラ
スミドを抽出し、プラスミドｐＴＳ−ａｒｏＦを取得し
た。
１株から、通常の方法に従って染色体ＤＮＡを抽出し
た。一方、公知の文献［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８
０，１０２３（１９８４）］に記載されているａｒｏＦ
遺伝子の塩基配列に基づいて配列番号１及び２に示すよ
うな合成ＤＮＡプライマー２本を通常の方法で合成し
た。これらはそれぞれａｒｏＦ遺伝子の上流及び下流に
相同な配列を有する。この染色体ＤＮＡとＤＮＡプライ
マーを用いてエルリッチらの方法［ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ ｐｒｅｓｓ（１９８
９）］に従ってＰＣＲ反応を行ない、１．５ｋｂｐのＤ
ＮＡ断片を得た。以下、図１の左側に示すように、この
断片を制限酵素ＥｃｏＲＶとＥｃｏ４７ＩＩＩで切断し
た後、ｐＨＳＧ３９８（宝酒造社製）のＳｍａＩ切断物
をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。この反応混合
物でエシェリヒア・コリＫ−１２のＪＭ１０９株（宝酒
造（株）より購入）を形質転換し、生育したクロラムフ
ェニコール耐性株の中でａｒｏＦ遺伝子が挿入されたプ
ラスミドを保有する菌株からプラスミドを抽出し、プラ
スミドｐＨＳＧ−ａｒｏＦを取得した。更にｐＨＳＧ−
ａｒｏＦを制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断
することにより得たａｒｏＦ遺伝子含有ＤＮＡ断片を、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼでプラスミドｐＴＳ１（特願平２−
１９２１６２）のＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ切断フラ
グメントと連結した。この反応混合物でエシェリヒア・
コリＫ−１２のＤＳ欠損（ａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ａｒｏ
Ｈ）株ＡＢ３２５７を形質転換した。生育したアンピシ
リン耐性株の中でＬ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニ
ン、Ｌ−トリプトファンの要求性が消失した株からプラ
スミドを抽出し、プラスミドｐＴＳ−ａｒｏＦを取得し
た。
【００１９】次に、プラスミドｐＴＳ−ａｒｏＦをヒド
ロキシルアミンを用いた方法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，１７５，３３１（１９８４）］によって変異処理
を行なった後、ＡＢ３２５７株（エシェリヒア・コリ
ジェネティック ストック センターより入手）に形質
転換し、アンピシリン耐性株を取得後、１ｍＭのＬ−チ
ロシン添加の最少培地に生育した株を２株選択し、これ
らの菌株よりフィードバック阻害が解除されたａｒｏＦ
遺伝子を含有するプラスミドｐＴＳ−ａｒｏＦ１５及び
ｐＴＳ−ａｒｏＦ３３を得た。フィードバック阻害が解
除されていないａｒｏＦを含むプラスミドを保有するＡ
Ｂ３２５７株は、最少培地に１ｍＭのＬ−チロシンを加
えると、該ＤＳ活性がフィードバック阻害を受け、Ｌ−
フェニルアラニンやＬ−トリプトファンといった芳香族
アミノ酸を合成できず、生育することができなくなる。
ロキシルアミンを用いた方法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，１７５，３３１（１９８４）］によって変異処理
を行なった後、ＡＢ３２５７株（エシェリヒア・コリ
ジェネティック ストック センターより入手）に形質
転換し、アンピシリン耐性株を取得後、１ｍＭのＬ−チ
ロシン添加の最少培地に生育した株を２株選択し、これ
らの菌株よりフィードバック阻害が解除されたａｒｏＦ
遺伝子を含有するプラスミドｐＴＳ−ａｒｏＦ１５及び
ｐＴＳ−ａｒｏＦ３３を得た。フィードバック阻害が解
除されていないａｒｏＦを含むプラスミドを保有するＡ
Ｂ３２５７株は、最少培地に１ｍＭのＬ−チロシンを加
えると、該ＤＳ活性がフィードバック阻害を受け、Ｌ−
フェニルアラニンやＬ−トリプトファンといった芳香族
アミノ酸を合成できず、生育することができなくなる。
【００２０】（２）エシェリヒア・コリのａｒｏＧ由来
変異型ＤＳ遺伝子の取得
変異型ＤＳ遺伝子の取得
【００２１】ａｒｏＦ遺伝子の場合と同様にして、変異
型ａｒｏＧ遺伝子を取得した。公知の文献［Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１０，４０４５（１９８
２）］に記載されているａｒｏＧ遺伝子の塩基配列に基
づいて配列番号３及び４に示すような合成ＤＮＡプライ
マー２本を合成した。該プライマーとＭＣ１０６１株の
染色体ＤＮＡを用いて、ＰＣＲ反応を行ない、２．１ｋ
ｂｐのＤＮＡ断片を得た。以下、図１の右側に示すよう
に、この断片を制限酵素ＳａｌＩとＥｃｏ４７ＩＩＩで
切断した後、ｐＨＳＧ３９８（宝酒造社製）のＳａｌＩ
とＳｍａＩ切断物をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し
た。この反応混合物でＪＭ１０９株を形質転換し、生育
したクロラムフェニコール耐性株の中でａｒｏＧ遺伝子
が挿入されたプラスミドを保有する菌株からプラスミド
を抽出し、プラスミドｐＨＳＧ−ａｒｏＧを取得した。
さらにｐＨＳＧ−ａｒｏＧを制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉ
ｎｄＩＩＩで切断することにより得られたａｒｏＧを含
有するＤＮＡ断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで、ｐＴＳ１
のＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ切断フラグメントと連結
した。この反応混合物でＡＢ３２５７株（ａｒｏＦ、ａ
ｒｏＧ、ａｒｏＨ）を形質転換し、生育したアンピシリ
ン耐性株の中でＬ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニン、
Ｌ−トリプトファンの要求性が消失している株からプラ
スミドを抽出し、プラスミドｐＴＳ−ａｒｏＧを取得し
た。
型ａｒｏＧ遺伝子を取得した。公知の文献［Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１０，４０４５（１９８
２）］に記載されているａｒｏＧ遺伝子の塩基配列に基
づいて配列番号３及び４に示すような合成ＤＮＡプライ
マー２本を合成した。該プライマーとＭＣ１０６１株の
染色体ＤＮＡを用いて、ＰＣＲ反応を行ない、２．１ｋ
ｂｐのＤＮＡ断片を得た。以下、図１の右側に示すよう
に、この断片を制限酵素ＳａｌＩとＥｃｏ４７ＩＩＩで
切断した後、ｐＨＳＧ３９８（宝酒造社製）のＳａｌＩ
とＳｍａＩ切断物をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し
た。この反応混合物でＪＭ１０９株を形質転換し、生育
したクロラムフェニコール耐性株の中でａｒｏＧ遺伝子
が挿入されたプラスミドを保有する菌株からプラスミド
を抽出し、プラスミドｐＨＳＧ−ａｒｏＧを取得した。
さらにｐＨＳＧ−ａｒｏＧを制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉ
ｎｄＩＩＩで切断することにより得られたａｒｏＧを含
有するＤＮＡ断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで、ｐＴＳ１
のＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ切断フラグメントと連結
した。この反応混合物でＡＢ３２５７株（ａｒｏＦ、ａ
ｒｏＧ、ａｒｏＨ）を形質転換し、生育したアンピシリ
ン耐性株の中でＬ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニン、
Ｌ−トリプトファンの要求性が消失している株からプラ
スミドを抽出し、プラスミドｐＴＳ−ａｒｏＧを取得し
た。
【００２２】次に、このプラスミドをａｒｏＦの場合と
同様にヒドロキシルアミンによる変異処理を行なった
後、ＡＢ３２５７株に形質転換し、アンピシリン耐性株
を取得した。これらの菌株から１０ｍＭのＬ−フェニル
アラニン添加の最少培地に生育した菌株を６株選択し、
これらの菌株よりフィードバック阻害が解除されたａｒ
ｏＧ遺伝子を含有するプラスミドｐＴＳ−ａｒｏＧ４、
ｐＴＳ−ａｒｏＧ８、ｐＴＳ−ａｒｏＧ１５、ｐＴＳ−
ａｒｏＧ１７、ｐＴＳ−ａｒｏＧ２９、ｐＴＳ−ａｒｏ
Ｇ４０を得た。フィードバック阻害が解除されていない
ａｒｏＧを含むプラスミドを保有するＡＢ３２５７株
は、最少培地に１０ｍＭのＬ−フェニルアラニンを添加
すると、該ＤＳ活性がフィードバック阻害を受け、Ｌ−
トリプトファンやＬ−チロシンといった芳香族アミノ酸
を合成できず、生育することができなくなる。
同様にヒドロキシルアミンによる変異処理を行なった
後、ＡＢ３２５７株に形質転換し、アンピシリン耐性株
を取得した。これらの菌株から１０ｍＭのＬ−フェニル
アラニン添加の最少培地に生育した菌株を６株選択し、
これらの菌株よりフィードバック阻害が解除されたａｒ
ｏＧ遺伝子を含有するプラスミドｐＴＳ−ａｒｏＧ４、
ｐＴＳ−ａｒｏＧ８、ｐＴＳ−ａｒｏＧ１５、ｐＴＳ−
ａｒｏＧ１７、ｐＴＳ−ａｒｏＧ２９、ｐＴＳ−ａｒｏ
Ｇ４０を得た。フィードバック阻害が解除されていない
ａｒｏＧを含むプラスミドを保有するＡＢ３２５７株
は、最少培地に１０ｍＭのＬ−フェニルアラニンを添加
すると、該ＤＳ活性がフィードバック阻害を受け、Ｌ−
トリプトファンやＬ−チロシンといった芳香族アミノ酸
を合成できず、生育することができなくなる。
【００２３】（３）ＤＳ酵素活性の測定
【００２４】上述の変異型ａｒｏＦ（２種類）及び変異
型ａｒｏＧ（６種類）を含有するプラスミドを、ＤＳ活
性を有しないエシェリヒア・コリＡＢ３２５７株に導入
して形質転換株を取得し、それぞれをＡＪ１２５９８
（ＡＢ３２５７／ｐＴＳ−ａｒｏＦ１５）、ＡＪ１２５
９９（ＡＢ３２５７／ｐＴＳ−ａｒｏＦ３３）、ＡＪ１
２５６２（ＡＢ３２５７／ｐＴＳ−ａｒｏＧ４）、ＡＪ
１２６００（ＡＢ３２５７／ｐＴＳ−ａｒｏＧ８）、Ａ
Ｊ１２５６３（ＡＢ３２５７／ｐＴＳ−ａｒｏＧ１
５）、ＡＪ１２６０１（ＡＢ３２５７／ｐＴＳ−ａｒｏ
Ｇ１７）、ＡＪ１２６０２（ＡＢ３２５７／ｐＴＳ−ａ
ｒｏＧ２９）及びＡＪ１２６０３（ＡＢ３２５７／ｐＴ
Ｓ−ａｒｏＧ４０）と命名した。これらのうち、代表株
としてＡＪ１２５６３、ＡＪ１２６０３をそれぞれ、エ
シェリヒア・コリ ＦＥＲＭ Ｐ−１１９６８、 ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１１９７４として微工研に寄託した。尚、比
較のため、天然型の遺伝子を含有するプラスミドも同株
に導入した。これらの菌株を既知のＬ−フェニルアラニ
ン生産培地［Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５，２３７（１９８
９）］を用いて２４時間培養した。この培養菌体より超
音波破砕によって粗酵素液を調製し、通常の方法［Ｇｏ
ｌｌｕｂ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ．，１７，３４９］に従って、ａｒｏＦの場合
はＬ−チロシン存在下で、ａｒｏＧの場合はＬ−フェニ
ルアラニン存在下でＤＳの酵素活性を測定した。その結
果、図３と図４に示すように、天然型のもの（エシェリ
ヒア・コリＡＢ３２５７／ｐＴＳ−ａｒｏＦ）ではＬ−
チロシンの存在下で酵素活性が強く阻害されているのに
対し、それぞれの変異型のものではＬ−チロシンによる
フィードバック阻害が解除されていた。同様に、もう一
方の天然型のもの（エシェリヒア・コリＡＢ３２５７／
ｐＴＳ−ａｒｏＧ）では、Ｌ−フェニルアラニンの存在
下で酵素活性が強く阻害されるのに対し、それぞれの変
異型のものではＬ−フェニルアラニンによるフィードバ
ック阻害が解除されていた。さらに変異型のうちＡＪ１
２５６２株のＤＳは、Ｌ−フェニルアラニンによるフィ
ードバック阻害が解除されているだけではなく、Ｌ−フ
ェニルアラニンの濃度に従って、酵素活性が上昇した。
型ａｒｏＧ（６種類）を含有するプラスミドを、ＤＳ活
性を有しないエシェリヒア・コリＡＢ３２５７株に導入
して形質転換株を取得し、それぞれをＡＪ１２５９８
（ＡＢ３２５７／ｐＴＳ−ａｒｏＦ１５）、ＡＪ１２５
９９（ＡＢ３２５７／ｐＴＳ−ａｒｏＦ３３）、ＡＪ１
２５６２（ＡＢ３２５７／ｐＴＳ−ａｒｏＧ４）、ＡＪ
１２６００（ＡＢ３２５７／ｐＴＳ−ａｒｏＧ８）、Ａ
Ｊ１２５６３（ＡＢ３２５７／ｐＴＳ−ａｒｏＧ１
５）、ＡＪ１２６０１（ＡＢ３２５７／ｐＴＳ−ａｒｏ
Ｇ１７）、ＡＪ１２６０２（ＡＢ３２５７／ｐＴＳ−ａ
ｒｏＧ２９）及びＡＪ１２６０３（ＡＢ３２５７／ｐＴ
Ｓ−ａｒｏＧ４０）と命名した。これらのうち、代表株
としてＡＪ１２５６３、ＡＪ１２６０３をそれぞれ、エ
シェリヒア・コリ ＦＥＲＭ Ｐ−１１９６８、 ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１１９７４として微工研に寄託した。尚、比
較のため、天然型の遺伝子を含有するプラスミドも同株
に導入した。これらの菌株を既知のＬ−フェニルアラニ
ン生産培地［Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５，２３７（１９８
９）］を用いて２４時間培養した。この培養菌体より超
音波破砕によって粗酵素液を調製し、通常の方法［Ｇｏ
ｌｌｕｂ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ．，１７，３４９］に従って、ａｒｏＦの場合
はＬ−チロシン存在下で、ａｒｏＧの場合はＬ−フェニ
ルアラニン存在下でＤＳの酵素活性を測定した。その結
果、図３と図４に示すように、天然型のもの（エシェリ
ヒア・コリＡＢ３２５７／ｐＴＳ−ａｒｏＦ）ではＬ−
チロシンの存在下で酵素活性が強く阻害されているのに
対し、それぞれの変異型のものではＬ−チロシンによる
フィードバック阻害が解除されていた。同様に、もう一
方の天然型のもの（エシェリヒア・コリＡＢ３２５７／
ｐＴＳ−ａｒｏＧ）では、Ｌ−フェニルアラニンの存在
下で酵素活性が強く阻害されるのに対し、それぞれの変
異型のものではＬ−フェニルアラニンによるフィードバ
ック阻害が解除されていた。さらに変異型のうちＡＪ１
２５６２株のＤＳは、Ｌ−フェニルアラニンによるフィ
ードバック阻害が解除されているだけではなく、Ｌ−フ
ェニルアラニンの濃度に従って、酵素活性が上昇した。
【００２５】（４）脱感作型ＤＳの変異点の決定
【００２６】脱感作型ＤＳの遺伝子であるａｒｏＦ１
５、ａｒｏＦ３３、ａｒｏＧ４、ａｒｏＧ８、ａｒｏＧ
１５、ａｒｏＧ１７、ａｒｏＧ２９、ａｒｏＧ４０の塩
基配列を通常の方法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ（Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］
に従って決定した。具体的なアミノ酸配列上の置換部位
及びその対応塩基配列上の変異点を表１に示す。これら
の配列はすべて、これまでに報告のないものであった。
５、ａｒｏＦ３３、ａｒｏＧ４、ａｒｏＧ８、ａｒｏＧ
１５、ａｒｏＧ１７、ａｒｏＧ２９、ａｒｏＧ４０の塩
基配列を通常の方法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ（Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］
に従って決定した。具体的なアミノ酸配列上の置換部位
及びその対応塩基配列上の変異点を表１に示す。これら
の配列はすべて、これまでに報告のないものであった。
【表１】
【００２７】
【実施例２】
【００２８】エシェリヒア・コリの脱感作型ＣＭ−ＰＤ
Ｔ遺伝子の構築
Ｔ遺伝子の構築
【００２９】まず、エシェリヒア・コリＫ−１２のＲＲ
１株（ＢＲＬ社より購入）から、常法に従い染色体ＤＮ
Ａを抽出した。一方、公知文献［Ｈｕｄｓｏｎ，Ｇ．
Ｓ．ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｊ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．，１８０．１０２３（１９８４）］に記載され
るｐｈｅＡ遺伝子の塩基配列に基づいて、配列番号５、
６、７および８に示すような合成プライマーを常法によ
り合成した。配列番号５及び６は各々ｐｈｅＡの上流及
び下流と相同な塩基配列を示す。配列番号７及び８は互
いに相補的であり、Ｔ（チミン塩基）がＣ（シトシン塩
基）に置換した１塩基異なる以外、３３０番目のＬ−セ
リン残基の配列と相同性を有する。
１株（ＢＲＬ社より購入）から、常法に従い染色体ＤＮ
Ａを抽出した。一方、公知文献［Ｈｕｄｓｏｎ，Ｇ．
Ｓ．ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｊ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．，１８０．１０２３（１９８４）］に記載され
るｐｈｅＡ遺伝子の塩基配列に基づいて、配列番号５、
６、７および８に示すような合成プライマーを常法によ
り合成した。配列番号５及び６は各々ｐｈｅＡの上流及
び下流と相同な塩基配列を示す。配列番号７及び８は互
いに相補的であり、Ｔ（チミン塩基）がＣ（シトシン塩
基）に置換した１塩基異なる以外、３３０番目のＬ−セ
リン残基の配列と相同性を有する。
【００３０】次に、図２に示すように、染色体ＤＮＡと
配列番号５及び８、または配列番号６及び７の合成ＤＮ
Ａを用いて、ＰＣＲ反応を行い、それぞれ１．３ｋｂｐ
と０．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。これらのＤＮ
Ａ断片をアガロースゲル電気泳動し、ＤＮＡ回収キット
（Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎ、フナコシ社製）を用いて回収
し、更にこれらの断片と配列番号５と６の合成ＤＮＡを
用いてＰＣＲ反応を行い、１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を
得た。この断片を制限酵素ＢａｍＨＩとＰｓｔＩで切断
した後、１．７ｋｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電
気泳動により回収し、更にこの断片とプラスミドｐＨＳ
Ｇ３９８（宝酒造社製）のＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ切断物
をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。この反応混合
物でエシェリヒア・コリＫ−１２のＫＡ１９７（ｐｈｅ
Ａ）株（エシェリヒア・コリ ジェネティック ストッ
ク センターより入手）を形質転換した。得られたクロ
ラムフェニコール耐性株の中でＬ−フェニルアラニンの
要求性が消失している菌株からプラスミドを抽出し、ｐ
ＰＨＡＢと命名した。塩基配列の決定により、該プラス
ミド中に、Ｎ−末端より３３０番目のＬ−セリン残基が
Ｌ−プロリン残基に置換した脱感作型ＣＭ−ＰＤＴ酵素
をコードする遺伝子が保有されることを確認した。
配列番号５及び８、または配列番号６及び７の合成ＤＮ
Ａを用いて、ＰＣＲ反応を行い、それぞれ１．３ｋｂｐ
と０．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。これらのＤＮ
Ａ断片をアガロースゲル電気泳動し、ＤＮＡ回収キット
（Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎ、フナコシ社製）を用いて回収
し、更にこれらの断片と配列番号５と６の合成ＤＮＡを
用いてＰＣＲ反応を行い、１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を
得た。この断片を制限酵素ＢａｍＨＩとＰｓｔＩで切断
した後、１．７ｋｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電
気泳動により回収し、更にこの断片とプラスミドｐＨＳ
Ｇ３９８（宝酒造社製）のＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ切断物
をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。この反応混合
物でエシェリヒア・コリＫ−１２のＫＡ１９７（ｐｈｅ
Ａ）株（エシェリヒア・コリ ジェネティック ストッ
ク センターより入手）を形質転換した。得られたクロ
ラムフェニコール耐性株の中でＬ−フェニルアラニンの
要求性が消失している菌株からプラスミドを抽出し、ｐ
ＰＨＡＢと命名した。塩基配列の決定により、該プラス
ミド中に、Ｎ−末端より３３０番目のＬ−セリン残基が
Ｌ−プロリン残基に置換した脱感作型ＣＭ−ＰＤＴ酵素
をコードする遺伝子が保有されることを確認した。
【００３１】
【実施例３】
【００３２】（１）エシェリヒア・コリＫ−１２のｔｙ
ｒＡ遺伝子欠損性Ｗ３１１０株の造成
ｒＡ遺伝子欠損性Ｗ３１１０株の造成
【００３３】先ず、エシェリヒア・コリＫ−１２のＷ３
１１０株（国立遺伝研究所より入手）をストレプトマイ
シンを含む平板培地に塗布することにより、ストレプト
マイシン耐性株を取得した。次に、この株とエシェリヒ
ア・コリＫ−１２のＭＥ８４２４株（ＨｆｒＰＯ４５、
ｔｈｉ、ｒｅｌＡ１、ｔｙｒＡ：：Ｔｎ１０、ｕｎｇ−
１、ｎａｄＢ）（国立遺伝研究所より入手）の培養液を
混合し、３７℃で１５分間放置して接合伝達を行わせた
後、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、Ｌ−チロ
シンを含む平板培地に塗布し、生じたコロニー即ちエシ
ェリヒア・コリＫ−１２のＷ３１１０（ｔｙｒＡ）株を
取得した。
１１０株（国立遺伝研究所より入手）をストレプトマイ
シンを含む平板培地に塗布することにより、ストレプト
マイシン耐性株を取得した。次に、この株とエシェリヒ
ア・コリＫ−１２のＭＥ８４２４株（ＨｆｒＰＯ４５、
ｔｈｉ、ｒｅｌＡ１、ｔｙｒＡ：：Ｔｎ１０、ｕｎｇ−
１、ｎａｄＢ）（国立遺伝研究所より入手）の培養液を
混合し、３７℃で１５分間放置して接合伝達を行わせた
後、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、Ｌ−チロ
シンを含む平板培地に塗布し、生じたコロニー即ちエシ
ェリヒア・コリＫ−１２のＷ３１１０（ｔｙｒＡ）株を
取得した。
【００３４】（２）脱感作型ＤＳ及び脱感作型ＣＭ−Ｐ
ＤＴを保有するエシェリヒア・コリＫ−１２のＷ３１１
０（ｔｙｒＡ）の造成
ＤＴを保有するエシェリヒア・コリＫ−１２のＷ３１１
０（ｔｙｒＡ）の造成
【００３５】得られた脱感作型ＤＳ遺伝子を含有するｐ
ＴＳ−ａｒｏＧ４を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩ
ＩでａｒｏＧ４部分を切り出し、この断片をｐＢＲ３２
２のＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位に挿入してプ
ラスミドｐＢＲ−ａｒｏＧ４（アンピシリン耐性マーカ
ー）を取得した。また、脱感作型ＣＭ−ＰＤＨ遺伝子を
含有するｐＰＨＡＢを制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩ
ＩＩでＣＭ−ＰＤＴ遺伝子含有フラグメントを切り出
し、この断片をｐＡＣＹＣ１８４のＢａｍＨＩ、Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ切断部位に挿入してプラスミドｐＡＣＭＡＢ
（選択マーカーはクロラムフェニコール耐性）を造成し
た。該プラスミドをエシェリヒア・コリＫ−１２株由来
のＷ３１１０（ｔｙｒＡ）株に導入し、形質転換株Ｗ３
１１０（ｔｙｒＡ）／ｐＡＣＭＡＢを取得した。更に２
種類のプラスミドｐＡＣＭＡＢ及びｐＢＲ−ａｒｏＧ４
をＷ３１１０（ｔｙｒＡ）に導入して形質転換株Ｗ３１
１０（ｔｙｒＡ）／ｐＢＲ−ａｒｏＧ４、ｐＡＣＭＡＢ
を取得した。該形質転換株をＡＪ１２６０４株と命名
し、微工研に寄託（ＦＥＲＭ Ｐ−１１９７５）した。
ＴＳ−ａｒｏＧ４を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩ
ＩでａｒｏＧ４部分を切り出し、この断片をｐＢＲ３２
２のＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位に挿入してプ
ラスミドｐＢＲ−ａｒｏＧ４（アンピシリン耐性マーカ
ー）を取得した。また、脱感作型ＣＭ−ＰＤＨ遺伝子を
含有するｐＰＨＡＢを制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩ
ＩＩでＣＭ−ＰＤＴ遺伝子含有フラグメントを切り出
し、この断片をｐＡＣＹＣ１８４のＢａｍＨＩ、Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ切断部位に挿入してプラスミドｐＡＣＭＡＢ
（選択マーカーはクロラムフェニコール耐性）を造成し
た。該プラスミドをエシェリヒア・コリＫ−１２株由来
のＷ３１１０（ｔｙｒＡ）株に導入し、形質転換株Ｗ３
１１０（ｔｙｒＡ）／ｐＡＣＭＡＢを取得した。更に２
種類のプラスミドｐＡＣＭＡＢ及びｐＢＲ−ａｒｏＧ４
をＷ３１１０（ｔｙｒＡ）に導入して形質転換株Ｗ３１
１０（ｔｙｒＡ）／ｐＢＲ−ａｒｏＧ４、ｐＡＣＭＡＢ
を取得した。該形質転換株をＡＪ１２６０４株と命名
し、微工研に寄託（ＦＥＲＭ Ｐ−１１９７５）した。
【００３６】（３）Ｌ−フェニルアラニン生産性
【００３７】前項で記載した形質転換株ＡＪ１２６０４
をＬ−フェニルアラニン生産用培地（グルコース２０
ｇ、リン酸水素２ナトリウム２９．４ｇ、リン酸２水素
カリウム６ｇ、塩化ナトリウム１ｇ、塩化アンモニウム
２ｇ、クエン酸ナトリウム１０ｇ、グルタミン酸ナトリ
ウム０．４ｇ、硫酸マグネシウム７水和物３ｇ、塩化カ
ルシウム０．２３ｇ、サイアミン塩酸塩２ｍｇを水１Ｌ
に含む）を用いて、３７℃で２４時間培養した。その結
果を表２に示す。尚、定量は高速液体クロマトグラフィ
ーで実施した。
をＬ−フェニルアラニン生産用培地（グルコース２０
ｇ、リン酸水素２ナトリウム２９．４ｇ、リン酸２水素
カリウム６ｇ、塩化ナトリウム１ｇ、塩化アンモニウム
２ｇ、クエン酸ナトリウム１０ｇ、グルタミン酸ナトリ
ウム０．４ｇ、硫酸マグネシウム７水和物３ｇ、塩化カ
ルシウム０．２３ｇ、サイアミン塩酸塩２ｍｇを水１Ｌ
に含む）を用いて、３７℃で２４時間培養した。その結
果を表２に示す。尚、定量は高速液体クロマトグラフィ
ーで実施した。
【００３８】
【表２】
【００３９】
【実施例４】
【００４０】（１）脱感作型ＤＳを保有するプラスミド
の構築。
の構築。
【００４１】プラスミドｐＡＣＹＣ１７７（国立遺伝研
究所より入手；アンピシリン耐性、３．６ｋｂ））を制
限酵素ＸｈｏＩで切断しｋｌｅｎｏｗ処理により切断部
位を平滑末端とした後、ＥｃｏＲＩリンカーを、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼで連結してＸｈｏＩサイトがＥｃｏＲＩと
なったプラスミドｐＡＣＹＣ１７７Ｅを得た。 次に実
施例１の（２）および（３）で述べた脱感作型ＤＳ遺伝
子のうちａｒｏＧ４を含むプラスミドｐＴＳ−ａｒｏＧ
４を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断しａｒ
ｏＧ４を含む断片を得た 。本断片とＥｃｏＲＩ及びＨ
ｉｎｄＩＩＩで切断したｐＡＣＹＣ１７７ＥをＴ４ＤＮ
Ａリガーゼで連結し、この反応混合物でＡＢ３２５７株
（実施例１に記載）を形質転換し、生育したアンピシリ
ン耐性株のなかでＬ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニン
およびＬ−トリプトファンの要求性が消失している株か
らプラスミドを抽出し、プラスミドｐＡＣＥＧ４（５．
１ｋｂｐ）を得た。 本プラスミドのＥｃｏＲＩサイト
にカナマイシン耐性遺伝子を含むＥｃｏＲＩフラグメン
ト（カナマイシンジーンブロック；１．３ｋｂｐ、ファ
ルマシアより購入）をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結
し、ｐＡＣＫＧ４（アンピシリン及びカナマイシン耐
性、６．４ｋｂｐ）を得た。 ｐＡＣＫＧ４の構築過程
を図５に示す。
究所より入手；アンピシリン耐性、３．６ｋｂ））を制
限酵素ＸｈｏＩで切断しｋｌｅｎｏｗ処理により切断部
位を平滑末端とした後、ＥｃｏＲＩリンカーを、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼで連結してＸｈｏＩサイトがＥｃｏＲＩと
なったプラスミドｐＡＣＹＣ１７７Ｅを得た。 次に実
施例１の（２）および（３）で述べた脱感作型ＤＳ遺伝
子のうちａｒｏＧ４を含むプラスミドｐＴＳ−ａｒｏＧ
４を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断しａｒ
ｏＧ４を含む断片を得た 。本断片とＥｃｏＲＩ及びＨ
ｉｎｄＩＩＩで切断したｐＡＣＹＣ１７７ＥをＴ４ＤＮ
Ａリガーゼで連結し、この反応混合物でＡＢ３２５７株
（実施例１に記載）を形質転換し、生育したアンピシリ
ン耐性株のなかでＬ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニン
およびＬ−トリプトファンの要求性が消失している株か
らプラスミドを抽出し、プラスミドｐＡＣＥＧ４（５．
１ｋｂｐ）を得た。 本プラスミドのＥｃｏＲＩサイト
にカナマイシン耐性遺伝子を含むＥｃｏＲＩフラグメン
ト（カナマイシンジーンブロック；１．３ｋｂｐ、ファ
ルマシアより購入）をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結
し、ｐＡＣＫＧ４（アンピシリン及びカナマイシン耐
性、６．４ｋｂｐ）を得た。 ｐＡＣＫＧ４の構築過程
を図５に示す。
【００４２】（２）脱感作型ＤＳ遺伝子及びトリプトフ
ァンオペロンを保有するエシェリヒア・コリＫ−１２株
の構築。
ァンオペロンを保有するエシェリヒア・コリＫ−１２株
の構築。
【００４３】トリプトファンオペロンを担うプラスミド
ｐＧＸ５０を保有するエシェリヒア・コリＫ−１２のＡ
ＧＸ６ａｒｏＰ株（米国特許４３７１６１４号記載、寄
託番号；ＮＲＲＬ Ｂ−１２２６４）を上記ｐＡＣＫＧ
４で形質転換し，ＡＧＸ６ａｒｏＰ／ｐＧＸ５０，ｐＡ
ＣＫＧ４を得た。尚、ＡＧＸ６ａｒｏＰ株の遺伝型はｔ
ｎａ，ｔｒｐＲ＋ ，ａｒｏＰである。
ｐＧＸ５０を保有するエシェリヒア・コリＫ−１２のＡ
ＧＸ６ａｒｏＰ株（米国特許４３７１６１４号記載、寄
託番号；ＮＲＲＬ Ｂ−１２２６４）を上記ｐＡＣＫＧ
４で形質転換し，ＡＧＸ６ａｒｏＰ／ｐＧＸ５０，ｐＡ
ＣＫＧ４を得た。尚、ＡＧＸ６ａｒｏＰ株の遺伝型はｔ
ｎａ，ｔｒｐＲ＋ ，ａｒｏＰである。
【００４４】（３）Ｌ−トリプトファン生産性
【００４５】前項記載の形質転換株，ＡＧＸ６ａｒｏＰ
／ｐＧＸ５０，ｐＡＣＫＧ４をＬ−トリプトファン用生
産培地（グルコース４０ｇ，硫酸アンモニウム１５ｇ，
リン酸１水素カリウム１ｇ，硫酸マグネシウム７水和物
１ｇ，硫酸第一鉄７水和物０．０１ｇ，塩化マンガン４
水和物０．０１ｇ、酵母抽出物２ｇ，炭酸カルシウム４
０ｇを水１リットルに含む，ｐＨ７）を用いて、３０°
Ｃで７２時間培養した。その結果を表３に示す。尚、Ｌ
−トリプトファンの定量は高速液体クロマトグラフィー
を用いて行った。
／ｐＧＸ５０，ｐＡＣＫＧ４をＬ−トリプトファン用生
産培地（グルコース４０ｇ，硫酸アンモニウム１５ｇ，
リン酸１水素カリウム１ｇ，硫酸マグネシウム７水和物
１ｇ，硫酸第一鉄７水和物０．０１ｇ，塩化マンガン４
水和物０．０１ｇ、酵母抽出物２ｇ，炭酸カルシウム４
０ｇを水１リットルに含む，ｐＨ７）を用いて、３０°
Ｃで７２時間培養した。その結果を表３に示す。尚、Ｌ
−トリプトファンの定量は高速液体クロマトグラフィー
を用いて行った。
【００４６】
【表３】
【図１】ｐＴＳ−ａｒｏＦ、ｐＴＳ−ａｒｏＧの構築
【図２】ｐＰＨＡＢの構築
【図３】天然型及び変異型ａｒｏＦのＤＳ活性におけ
る、Ｌ−チロシンによる阻害度を示すものである。
る、Ｌ−チロシンによる阻害度を示すものである。
【図４】天然型及び変異型ａｒｏＧのＤＳ活性におけ
る、Ｌ−フェニルアラニンによる阻害度を示すものであ
る。
る、Ｌ−フェニルアラニンによる阻害度を示すものであ
る。
【図５】ｐＡＣＫＧ４の構築
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 倉橋 修 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味 の素株式会社中央研究所内 (72)発明者 松井 裕 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味 の素株式会社中央研究所内 審査官 本間 夏子 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 1/21 C12N 15/00 - 15/90 C12P 13/00 - 13/24 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (10)
- 【請求項１】エシェリヒア・コリのａｒｏＧまたはａｒ
ｏＦ遺伝子であってい、１または２アミノ酸置換により
実質的にフィードバック阻害が解除された３−デオキシ
−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ
（以下「ＤＳ」と略す）をコードする遺伝子および実質的
にフィードバック阻害が解除したコリズミン酸ムターゼ
−プレフェン酸デヒドラターゼ（以下ＣＭ−ＰＤＴと略
す）をコードする遺伝子若しくは実質的にフィードバッ
ク阻害が解除したトリプトファンオペロン遺伝子とを含
有するプラスミドで形質転換された微生物。 - 【請求項２】ＤＳがａｒｏＦにコードされるものである
請求項１記載の微生物。 - 【請求項３】Ｎ末端より１４７番目のＬ−アスパラギン
酸または１８１番目のＬ−セリンが他のアミノ酸残基に
置換されたＤＳをコードする請求項２記載の微生物。 - 【請求項４】置換される他のアミノ酸残基が、１４７番
目のＬ−アスパラギン酸の場合はＬ−アスパラギンに、
１８１番目のＬ−セリンの場合はＬ−フェニルアラニン
である請求項３記載の微生物。 - 【請求項５】ＤＳがａｒｏＧにコードされる請求項１記
載の微生物。 - 【請求項６】Ｎ末端より１４６番目のＬ−アスパラギン
酸、１４７番目のＬ−メチオニン、１５０番目のＬ−プ
ロリンもしくは２０２番目のＬ−アラニンの１アミノ酸
残基、または１５７番目のＬ−メチオニンおよび２１９
番目のＬ−アラニンの２アミノ酸残基が他のアミノ酸に
置換されたＤＳをコードする請求項５記載の微生物。 - 【請求項７】置換される他のアミノ酸残基が１４６番目
のＬ−アスパラギン酸の場合はＬ−アスパラギンに、１
４７番目のＬ−メチオニンの場合はＬ−イソロイシン
に、１５０番目のＬ−プロリンの場合はＬ−ロイシン
に、２０２番目のＬ−アラニンの場合はＬ−スレオニン
に、１５７番目のＬ−メチオニン並びに２１９番目のＬ
−アラニンの場合はそれぞれＬ−イソロイシン、Ｌ−ス
レオニンに、または１４７番目のＬ−メチオニン並びに
３３２番目のＬ−グルタミン酸の場合はそれぞれＬ−イ
ソロイシン、Ｌ−リジンに置換されたＤＳをコードする
請求項６記載の微生物。 - 【請求項８】 微生物がエシェリヒア・コリである請求
項１ないし８記載の微生物。 - 【請求項９】 請求項１ないし８記載の微生物を培養す
ることにより培地中に生産された芳香属アミノ酸を取得
することを特徴とする芳香属アミノ酸の製造法。 - 【請求項１０】 芳香属アミノ酸がＬ−フェニルアラニ
ンまたはＬ−トリプトファンである請求項９記載の製造
法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19622691A JP3185261B2 (ja) | 1991-02-05 | 1991-05-02 | 発酵法による芳香族アミノ酸の製造法 |
| EP91120685A EP0488424B1 (en) | 1990-11-30 | 1991-12-02 | Recombinant DNA sequences encoding feedback inhibition released enzymes, plasmids comprising the recombinant DNA sequences, transformed microorganisms useful in the production of aromatic amino acids, and a process for preparing aromatic amino acids by fermentation |
| EP02018390A EP1270721B1 (en) | 1990-11-30 | 1991-12-02 | Recombinant DNA sequences encoding feedback inhibition released enzymes, plasmids comprising the recombinant DNA sequences, transformed microorganisms useful in the production of aromatic amino acids, and a process for preparing aromatic amino acids by fermentation |
| DE69133342T DE69133342T2 (de) | 1990-11-30 | 1991-12-02 | Rekombinante DNS-Sequenzen kodierend für Enzyme frei von Feedback-Inhibition, Plasmide, die diese Sequenzen enthalten, transformierte Mikroorganismen, nützlich für Produktion aromatischer Aminosäuren, und deren Verfahren zur Herstellung durch Fermentation |
| EP96105800A EP0745671B1 (en) | 1990-11-30 | 1991-12-02 | Recombinant DNA sequences encoding feedback inhibition released enzymes, plasmids comprising the recombinant DNA sequences, transformed microorganisms useful in the production of aromatic amino acids, and a process for preparing aromatic amino acids by fermentation |
| DE69133587T DE69133587D1 (de) | 1990-11-30 | 1991-12-02 | Rekombinante DNS-Sequenzen kodierend für Enzyme frei von Feedback-Inhibition, Plasmide, die diese Sequenzen enthalten, transformierte Mikroorganismen, nützlich für Produktion aromatischer Aminosäuren, und deren Verfahren zur Herstellung durch Fermentation |
| DE69124939T DE69124939T2 (de) | 1990-11-30 | 1991-12-02 | Rekombinante DNS-Sequenzen kodierend für Enzyme frei von Feedback Inhibition, Plasmide diese Sequenzen enthaltend, transformierte Mikroorganismen nützlich für Produktion von aromatischen Aminosäuren, und deren Verfahren zur Herstellung durch Fermentation |
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|---|---|---|---|
| JP3-100630 | 1991-02-05 | ||
| JP3100630A JPH04248983A (ja) | 1991-02-05 | 1991-02-05 | 発酵法による芳香族アミノ酸の製造法 |
| JP19622691A JP3185261B2 (ja) | 1991-02-05 | 1991-05-02 | 発酵法による芳香族アミノ酸の製造法 |
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|---|---|
| JPH05236947A JPH05236947A (ja) | 1993-09-17 |
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|---|---|---|---|
| JP19622691A Expired - Fee Related JP3185261B2 (ja) | 1990-11-30 | 1991-05-02 | 発酵法による芳香族アミノ酸の製造法 |
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|---|---|
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102134418B1 (ko) * | 2019-06-17 | 2020-07-16 | 씨제이제일제당 주식회사 | L-타이로신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 l-타이로신 생산 방법 |
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| KR20220107795A (ko) * | 2021-01-26 | 2022-08-02 | 씨제이제일제당 (주) | aroG 알돌라아제 (Phospho-2-dehydro-3-deoxyheptonate aldolase) 변이체 및 이를 이용한 분지쇄 아미노산 생산 방법 |
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| JP2009095237A (ja) * | 2006-02-02 | 2009-05-07 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2009153382A (ja) | 2006-03-30 | 2009-07-16 | Ajinomoto Co Inc | メタノール資化性細菌を用いたカルボン酸の製造法 |
-
1991
- 1991-05-02 JP JP19622691A patent/JP3185261B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| KR102134418B1 (ko) * | 2019-06-17 | 2020-07-16 | 씨제이제일제당 주식회사 | L-타이로신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 l-타이로신 생산 방법 |
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