CN110418843B

CN110418843B - 新型l-色氨酸输出蛋白及使用其生产l-色氨酸的方法

Info

Publication number: CN110418843B
Application number: CN201980001405.8A
Authority: CN
Inventors: 郑武泳; 徐昌一; 金孝珍; 金泰延; 金贤雅; 孙晟光; 柳慧连; 李在旼; 丁起龙
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2018-02-23
Filing date: 2019-02-22
Publication date: 2021-04-20
Anticipated expiration: 2039-02-22
Also published as: HUE055339T2; ES2883824T3; RU2761871C1; BR112020014626B1; EP3561061A4; CA3091331A1; US10995378B2; CN110418843A; EP3561061B1; BR112020014626A2; EP3561061A1; WO2019164348A1; MX2020007924A; JP7098731B2; DK3561061T3; CA3091331C; KR101968317B1; US20200063219A1; JP2021509808A

Abstract

本公开涉及一种生产L‑色氨酸的微生物以及使用该微生物生产L‑色氨酸的方法，其中该微生物被修饰以使得表达包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的具有L‑色氨酸输出活性的蛋白质。

Description

新型L-色氨酸输出蛋白及使用其生产L-色氨酸的方法

技术领域

本公开涉及一种生产L-色氨酸的微生物，其中该微生物被修饰以使得表达具有色氨酸输出活性的蛋白质，并且涉及使用该微生物生产L-色氨酸的方法。

背景技术

L-色氨酸是一种必需氨基酸，已被广泛用作饲料添加剂、药物(例如输液溶液)、保健食品材料等的原料。目前，使用微生物的直接发酵方法主要用于生产L-色氨酸。

以前，已主要用于生产L-色氨酸的微生物是通过化学或物理突变表现出对类似物抗性的选择菌株。然而，20世纪90年代基因重组技术的快速发展和分子水平调控机制的鉴定已使得能够使用基因工程技术使用重组菌株。

同时，能够输出特定氨基酸的基因的表达已有助于提高微生物中相应氨基酸的产率。棒杆菌属微生物中L-赖氨酸输出基因(lysE)的增强已提高了赖氨酸的产率(WO9723597A2)。另外，大肠杆菌中rhtC基因的增强已提高了对L-苏氨酸的抗性，并同时也已提高了L-高丝氨酸、L-苏氨酸和L-亮氨酸的产率(EP1013765A1)。EP1016710B1公开了通过增强yahN、yeaS、yfiK和yggA基因提高L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-缬氨酸和L-异亮氨酸的产率，这些基因的功能尚未在大肠杆菌中被鉴定。

然而，尚未报道对L-色氨酸显示出特异性的输出蛋白。尽管大肠杆菌的yddG基因是已知的，但它对L-苯丙氨酸比对L-色氨酸显示出更高的特异性(FEMS Microbiol Lett275(2007)312-318)。另外，在主要用作生产L-氨基酸发酵菌株的棒杆菌属的微生物中，尚未报道能够输出L-色氨酸或芳香族氨基酸的蛋白(J Ind MicrobiolBiotechnol.2015May；42(5):787-97)。

在这种情况下，本公开的发明人已经成功地在生产L-色氨酸的微生物中表达了对L-色氨酸具有特异性的新型色氨酸输出蛋白，并且已经发现L-色氨酸的生产量显著提高，从而完成了本公开。

发明内容

[技术问题]

本公开的目的是提供一种生产L-色氨酸的微生物，其中该微生物被修饰以使得表达具有L-色氨酸输出活性的蛋白质。

本公开的另一个目的是提供一种方法，其包括在培养基中培养微生物；并从培养的微生物或培养基中回收L-色氨酸。

本公开的另一个目的是提供一种包含编码具有L-色氨酸输出活性的新型蛋白质的多核苷酸的载体，该蛋白质包含氨基酸序列SEQ ID NO：1。

本发明的另一个目的是提供一种用于增加微生物的L-色氨酸输出活性的方法，其包括修饰微生物使得在微生物中表达包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的具有L-色氨酸输出活性的蛋白质。

[技术方案]

在下文中，将详细描述本公开的示例性实施方式。同时，本文所公开的每个解释和示例性实施方式可以应用于其它解释和示例性实施方式。也就是说，本文所公开的各种因素的所有组合都属于本公开的范围。此外，本公开的范围不应受下文提供的具体公开的限制。

为了实现上述目的，本公开的一个方面涉及一种生产L-色氨酸的微生物，其中该微生物被修饰以使得表达包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的具有L-色氨酸输出活性的蛋白质。

如本文所用，术语“L-色氨酸”(α-氨基酸)是指未在体内合成的必需氨基酸，并且它是指具有化学式C₁₁H₁₂N₂O₂的芳香族L-氨基酸。

在本公开中，“具有L-色氨酸输出活性的蛋白质”是指具有从细胞中特异性地输出L-色氨酸活性的膜蛋白。

具有L-色氨酸输出活性的蛋白质可以是例如包括氨基酸序列SEQ ID NO：1的蛋白质。包括氨基酸序列SEQ ID NO：1的蛋白质可以与具有氨基酸序列SEQ ID NO：1的蛋白质和由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的蛋白质互换使用。

具体地，在本公开中，具有L-色氨酸输出活性的包括氨基酸序列SEQ ID NO：1的蛋白质是指源自根际草螺菌的蛋白质中具有L-色氨酸输出活性的蛋白质。特别地，“根际草螺菌”是属于草螺菌属的革兰氏阴性细菌。在韩国，它可以从土壤的根际中分离，作为从郁陵岛等分离的菌株。

另外，尽管具有本公开的L-色氨酸输出活性的蛋白质被定义为包括氨基酸序列SEQ ID NO：1的蛋白质，它不排除在氨基酸序列SEQ ID NO：1的上游或下游添加序列、可天然发生的突变或其沉默突变，当蛋白质具有与包括氨基酸序列SEQ ID NO：1的蛋白质相同或相应的活性时，该蛋白质属于具有本公开的L-色氨酸输出活性的蛋白质对于本领域技术人员是显而易见的。例如，具有本公开的L-色氨酸输出活性的蛋白质可以是由氨基酸序列SEQ ID NO：1，或与氨基酸序列SEQ ID NO：1具有80％、90％、95％、97％或更高同源性的氨基酸序列组成的蛋白质。另外，显而易见的是任何在部分序列中具有缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列的蛋白质也可以属于本公开的范围，只要该蛋白质具有任何上述同源性的氨基酸序列，并表现出对应于上述蛋白质的效果。

术语“同源性”是指两个多核苷酸或多核苷酸部分之间的同一性百分比(即与给定氨基酸序列或核苷酸序列匹配的程度)，并且它可以表示为百分比。在本公开中，将具有与给定氨基酸或核苷酸序列相同或相似活性的同源序列表示为“％同源性”。可以通过本领域已知的技术确定从一部分到另一部分序列之间的同源性。例如，可以使用标准软件(具体为BLAST 2.0)鉴定同源性以用于计算例如评分、同一性和相似性的参数，或者通过在限定的严格条件下由Southern杂交比较序列。可以在本领域范围内定义适当的杂交条件，并且可以通过本领域技术人员熟知的方法确定该杂交条件(例如J.Sambrook等人，MolecularCloning,A Laboratory Manual,第二次编辑,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,纽约,1989；F.M.Ausubel等人，Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,Inc.,纽约)。

可以包括编码具有源自根际草螺菌的L-色氨酸输出活性的蛋白质的任何基因，但不限于此，只要该基因包含编码蛋白的序列即可。具体地，可以包括可以编码包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的具有L-色氨酸输出活性的蛋白质的任何序列，但不限于此。更具体地，该序列可以是包含多核苷酸序列SEQ ID NO：2的多核苷酸。包含多核苷酸序列SEQ ID NO：2的多核苷酸可以与具有多核苷酸序列SEQ ID NO：2的多核苷酸和由多核苷酸序列SEQ ID NO：2的组成的多核苷酸互换使用。

另外，考虑到密码子简并性和生物有机体中优选的密码子，可以在编码蛋白质的多核苷酸的编码区中进行各种修饰，其中在不改变蛋白质的氨基酸序列的范围内表达蛋白质。同时，编码蛋白质的多核苷酸可以是与多核苷酸序列SEQ ID NO：2具有80％、90％、95％、97％或更高同源性的多核苷酸。另外，显而易见的是任何在部分序列中具有缺失、修饰、取代或添加的多核苷酸序列也可以包括在本公开的范围内，只要该多核苷酸序列具有上述同源性，并表现出与蛋白质相同或对应于蛋白质的效果。可替换地，可以包括可以从已知基因序列(例如通过在严格条件下与互补序列杂交至上述多核苷酸序列的全部或部分)制得的任何探针和编码具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的蛋白活性相同或对应于蛋白活性的蛋白质的任何序列，但不限于此。术语“严格条件”是指能够在多核苷酸之间进行特异性杂交的条件。在参考文献(例如J Sambrook等人，同上)中具体描述了这些条件。例如，条件可以包括在具有高同源性的基因之间进行杂交，同源性为80％或更高，特别是90％或更高，更特别是95％或更高，甚至更特别是97％或更高，最特别是99％或更高，而不是在具有同源性低于上述同源性的基因之间进行杂交；或者在常规洗涤条件下进行一次(特别是两次或三次)杂交，在盐浓度和温度(对应于60℃，1×SSC和0.1％SDS，具体为60℃，0.1×SSC和0.1％SDS，更具体为68℃，0.1×SSC和0.1％SDS)下进行Southern杂交。杂交需要两个核酸含有互补序列，尽管碱基之间的错配可能依赖于杂交的严格性。术语“互补”用于描述可相互杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，就DNA而言，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开还可以包括与整个序列互补的分离的核酸片段以及基本相似的核苷酸序列。具体地，可以使用包括杂交步骤的杂交条件和使用上述条件，在55℃的T_m值下检测具有同源性的多核苷酸。另外，T_m值可以是60℃、63℃或65℃，但是温度不限于此，并且可以由本领域技术人员根据预期目的适当地调节。适合于多核苷酸杂交的严格性依赖于多核苷酸的长度和互补程度，并且相关变量是本领域熟知的(参见Sambrook等人，同上，9.50-9.51和11.7-11.8)。

如本文所用，术语“待表达/表达”是指其中将靶标蛋白引入到微生物中的状态，或在蛋白质存在于微生物中的情况下，与其内源蛋白活性或其修饰前的蛋白活性相比，蛋白质的活性增强。

具体地，术语“蛋白质的引入”意味着微生物表现出其最初未具有的特定蛋白质的活性，或与其内源蛋白活性或修饰前的蛋白活性相比，微生物表现出增强的活性。例如，它可以意味着将编码特异性蛋白的多核苷酸引入到微生物的染色体中，或者将含有编码特异性蛋白的多核苷酸的载体引入到微生物中，从而表现出其活性。另外，术语“活性的增强”意味着与其内源活性或其修饰前的活性相比，特定蛋白质的活性得到提高。术语“内源蛋白”是指当微生物的性状由于天然或人工因素引起的遗传修饰而改变时，微生物亲本菌株最初具有的特定蛋白活性。

具体地，在本公开中，可以通过以下一种或多种方法来实现活性的增强：增加编码具有L-色氨酸输出活性的蛋白质的基因的细胞内拷贝数的方法；将修饰引入到编码具有L-色氨酸输出活性的蛋白质的染色体上的基因表达控制序列的方法；用具有强活性的序列替换编码具有L-色氨酸输出活性的蛋白质的染色体上的基因表达控制序列的方法；用突变的基因替换编码具有L-色氨酸输出活性的蛋白质的染色体上的基因使得具有L-色氨酸输出活性的蛋白质的活性增加；以及将修饰引入到编码具有L-色氨酸输出活性的蛋白质的染色体上的基因使得具有L-色氨酸输出活性的蛋白质的活性增强。

在上文中，可以以基因与载体可操作地连接的形式或通过将基因插入到宿主细胞的染色体中的形式进行增加基因拷贝数的方法，但是该方法不特别限于此。具体地，可以通过将载体引入到宿主细胞增加基因的拷贝数，其中该载体可操作地连接至编码本公开的蛋白的多核苷酸，并且无论宿主细胞如何都能够复制和起作用。可替换地，增加基因拷贝数的方法可以通过将能够将多核苷酸插入到染色体中并可操作连接至多核苷酸的载体引入到宿主细胞的染色体中来进行。可以通过本领域已知的方法(例如同源重组)实现多核苷酸插入到染色体中。

然后，为了增加多核苷酸的表达，可以通过缺失、插入、非保守或保守取代或其组合在其中诱导修饰；或者通过用具有更强活性的核酸序列替换表达控制序列来修饰表达控制序列以进一步增强表达控制序列的活性，但是修饰方法不特别限于此。表达控制序列可以包括启动子、操纵基因序列、编码核糖体结合区的序列、间隔区和控制转录和翻译终止的序列，但不限于此。

强启动子可以与多核苷酸的表达单元的上游区域而不是原始启动子连接，但不限于此。本领域已知的强启动子的示例可以包括cj1至cj7启动子(韩国专利号10-0620092)、lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体PR启动子、PL启动子、tet启动子、gapA启动子、SPL7启动子、SPL13(sm3)启动子(韩国专利号10-1783170)、O2启动子(韩国专利号10-1632642)、tkt启动子、yccA启动子等，但启动子不限于此。

进一步地，可以通过缺失、插入、非保守或保守取代或其组合在表达控制序列上诱导修饰；或者通过用修饰为具有更强活性的多核苷酸序列替换多核苷酸序列来修饰染色体上的多核苷酸序列以进一步增强多核苷酸序列的活性，但是修饰方法不特别限于此。

基于野生型或未经修饰的微生物菌株中蛋白质的活性或浓度，如上所述的蛋白活性的引入和增强通常可以将相应蛋白质的活性或浓度增加至少1％、至少10％、至少25％、至少50％、至少75％、至少100％、至少150％、至少200％、至少300％、至少400％、或至少500％和至多1000％或2000％，但范围不限于此。

本公开的另一个目的提供了一种编码包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的具有L-色氨酸输出活性的新型蛋白质的多核苷酸或包含该多核苷酸的载体。

如本文所用，术语“多核苷酸”是指具有超过一定长度作为核苷酸聚合物的DNA或RNA链，其是通过共价键连接的核苷酸单体的长链。

如本文所用，术语“载体”是指包含编码靶标蛋白的多核苷酸的核苷酸序列的DNA构建体，在其中靶标蛋白可操作地连接至合适的控制序列，使得它可以在适当的宿主中表达。控制序列包括能够启动转录的启动子、用于控制转录的任何操纵基因序列、编码适当的mRNA核糖体结合结构域的序列以及控制转录和翻译终止的序列。转化到合适的宿主细胞中后的载体，无论宿主基因组如何都可以复制或起作用，或者可以整合到宿主基因组本身中。

本公开中所用的载体不受特别限制，只要其能够在宿主细胞中复制，并且可以使用本领域已知的任何载体。常规载体的示例可以包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、Charon21A等可以用作噬菌体载体或粘粒载体；基于pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL、pET等的那些可以用作质粒载体。具体地，可以使用载体pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC等。

例如，可以通过用于细胞中染色体插入的载体用变体多核苷酸替换编码染色体中靶标蛋白的多核苷酸。可以使用本领域已知的任何方法(例如通过同源重组)进行多核苷酸插入到染色体中，但该方法不限于此。可以进一步包括用于证实载体成功插入到染色体中的选择标记。选择标记用于选择用载体转化的细胞，即以便证实靶标核酸分子是否已经成功插入，并且可以使用能够提供可选择表型的标记(例如抗药性、营养缺陷型、对细胞毒性试剂的抗性和表面蛋白的表达)。在处理选择性试剂的情况下，只有能够表达选择标记的细胞才能够存活或表达其它表型性状，因此可以容易地选择经转化的细胞。

如本文所用，术语“生产L-色氨酸的微生物”是指与野生型或未经修饰的微生物菌株相比，能够在过量培养基中从碳源生产L-色氨酸的微生物。另外，生产L-色氨酸的微生物可以是重组微生物。具体地，该微生物可以是肠杆菌属的微生物、埃希氏菌属的微生物、欧文氏菌属的微生物、沙雷氏菌属的微生物、普罗维登西亚属的微生物、棒杆菌属的微生物或短杆菌属的微生物，但微生物的类型不受特别限制，只要该微生物生产L-色氨酸即可。更具体地，微生物可以是棒杆菌属的微生物或埃希氏菌属的微生物，甚至更具体地，埃希氏菌属的微生物可以是大肠杆菌，棒杆菌属的微生物可以是谷氨酸棒杆菌，但是可以包括其中引入具有L-色氨酸输出活性的蛋白质或活性增强且因此增加L-色氨酸产生的棒杆菌属的微生物或棒杆菌属，但不限于此。

在上述微生物中，可以使用通过增强tktA基因的表达或阻断L-色氨酸生物合成途径中的分支途径以连续供应前体(例如赤藓糖-4-磷酸(E4P))和有效利用能量来增加L-色氨酸生物合成的方法；或使用较少量ATP的方法等增加L-色氨酸产生。

具体地，在本公开中，生产L-色氨酸的微生物(其中该微生物被修饰以使得表达具有L-色氨酸输出活性的蛋白质)的亲本菌株不受特别限制，只要该微生物生产L-色氨酸。生产L-色氨酸的微生物可以是其中削弱或失活竞争途径中的基因、L-色氨酸操纵子的定向途径中的调控子或用于引入和分解L-色氨酸的基因的活性以便增强L-色氨酸生物合成途径；和/或过表达L-色氨酸操纵子活性的微生物。具体地，与其内源活性相比，可以削弱或除去trpR(用于调控色氨酸合成的酶基团的基因，其可抑制L-色氨酸生物合成基因(trpEDCBA)的表达)或将细胞外L-色氨酸导入到细胞中的Mtr(即膜蛋白)的活性。

为了实现上述目的，本公开的另一方面提供了一种用于生产L-色氨酸的方法，其包括在培养基中培养生产L-色氨酸的微生物，其中该微生物被修饰以使得表达包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的具有L-色氨酸输出活性的蛋白质；以及从培养的微生物或培养基中回收L-色氨酸。

L-色氨酸(包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的具有L-色氨酸输出活性的蛋白质)、蛋白质的表达和微生物与上述相同。

如本文所用，术语“培养”意味着微生物在适当控制的环境条件下生长。本公开的培养过程可以在本领域已知的合适培养基和培养条件下进行。根据待选择的菌株，本领域技术人员可以容易地调节这种培养过程以供使用。具体地，培养过程可以以本领域已知的分批培养、连续培养和补料分批培养进行，但培养过程不限于此。

如本文所用，术语“培养基”是指含有培养微生物所需的营养物质作为主要成分的物质混合物，并且它提供了营养物质、生长因子等以及对生存和生长至关重要的水。具体地，用于培养本公开微生物的培养基和其它培养条件可以是用于常规培养微生物的任何培养基，而不受任何特别限制。然而，可以在需氧条件下在含有适当碳源、氮源、磷源、无机化合物、氨基酸和/或维生素等的常规培养基中培养本公开的微生物，同时调节温度、pH等。

在本公开中，碳源可以包括碳水化合物(例如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等)；糖醇(例如甘露醇、山梨糖醇等)；有机酸(例如丙酮酸、乳酸、柠檬酸等)；氨基酸(例如谷氨酸、蛋氨酸、赖氨酸等)等。另外，碳源可以包括天然有机营养，如淀粉水解物、糖蜜、黑糖蜜、米糠、木薯、甘蔗废糖蜜、玉米浆等。具体地，可以使用如葡萄糖和灭菌的预处理糖蜜(即将糖蜜转化为还原糖)的碳水化合物，另外，可以使用适当量的各种其它碳源，但不限于此。可以单独使用或以两种或多种的组合使用这些碳源，但碳源不限于此。

氮源的示例可以包括无机氮源(例如氨、硫酸铵、氯化铵、乙酸铵、磷酸铵、碳酸铵、硝酸铵等)；氨基酸(谷氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺等)；和有机氮源(例如蛋白胨、N-Z胺、肉提取物、酵母提取物、麦芽提取物、玉米浆、酪蛋白水解产物、鱼或其分解产物、脱脂大豆饼或其分解产物等)。可以单独使用或以两种或多种的组合使用这些氮源，但氮源不限于此。

磷源的示例可以包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、相应的含钠盐等。无机化合物的示例可以包括氯化钠、氯化钙、氯化铁、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰、碳酸钙。另外，可以包括氨基酸、维生素和/或适当的前体。可以将这些构成成分或前体添加到分批培养或连续培养的培养基中，但不限于此。

在本公开中，通过以适当的方式向培养基中添加如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸、硫酸等的化合物，可以在培养微生物期间调节培养基的pH值。另外，在培养期间，可以添加消泡剂(例如脂肪酸聚乙二醇酯)以防止泡沫产生。另外，可以将氧气或含氧气体注入到培养基中以便保持培养基的需氧状态；或者，可以在没有注入气体的情况下注入氮、氢或二氧化碳气体以便保持培养基的厌氧或微需氧状态，但气体不限于此。

培养基温度可以在20℃至50℃的范围内，并特别是在30℃至37℃的范围内，但温度不限于此。可以继续培养直至获得所需量的有用物质，并特别是10至100小时，但培养不限于此。

在回收色氨酸的步骤中，根据分批培养过程、连续培养过程或补料分批培养过程，可以使用培养本公开的微生物的方法(例如使用本领域已知的合适方法)从培养基中回收所需的色氨酸。可以单独或组合使用例如离心、过滤、用蛋白结晶沉淀剂处理(盐析法)、萃取、超声波破碎、超滤、透析、各种色谱(例如分子筛色谱(凝胶过滤)、吸附色谱、离子交换色谱、亲和色谱法等)和高效液相色谱法(HPLC)的方法，但是方法不限于此。

回收步骤可以进一步包括纯化过程。可以使用本领域已知的适当纯化方法纯化回收的L-色氨酸。

本公开的另一个目的提供了一种用于增加微生物的L-色氨酸输出活性的方法，其包括将包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的具有L-色氨酸输出活性的蛋白质引入到微生物中或增强其活性。

本公开的另一个目的提供了一种包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的具有L-色氨酸输出活性的蛋白质用于增加微生物中L-色氨酸输出活性的用途。

包含氨基酸序列SEQ ID No：1的具有L-色氨酸输出活性的蛋白质、蛋白质的引入和蛋白活性的增强如上所述。

[本发明的有益效果]

本公开的发明人已经发现了一种对L-色氨酸具有特异性的新型输出基因，并已经试图在生产L-色氨酸的微生物中表达该基因。因此，他们已经证实了与其亲本菌株(其中基因不表达)相比，微生物可以显著提高L-色氨酸产生，从而证实了可以在上述微生物中有效生产L-色氨酸。

附图说明

图1显示了CA04-8352和CA04-8405(其是谷氨酸棒杆菌的修饰菌株)中根据葡萄糖消耗的色氨酸的细胞内浓度。

具体实施方式

在下文中，将通过示例性实施方式详细描述本公开。然而，提供这些示例性实施方式仅是为了说明的目的，而不旨在限制本公开的范围。

实施例1：筛选和选择输出基因

作为基于NCBI和KEGG数据库的PSI-BLAST筛选结果，具有氨基酸序列YdeD(即源自大肠杆菌的EamA家族)作为查询序列，选择被考虑是能够输出色氨酸的膜蛋白的30个候选基因和具有这些基因的生物有机体。在它们中，考虑到适用于生产菌株的生物安全水平和可用性，选择了5种生物有机体，如下表1所示。

[表1]预期具有能够输出芳香族氨基酸的膜蛋白的微生物

实施例2：制备其中引入源自根际草螺菌的基因的棒杆菌属微生物

编码实施例1中选择的源自根际草螺菌的膜蛋白的基因具有氨基酸序列SEQ IDNO：1。关于编码膜蛋白的基因及其相邻核苷酸序列的信息(登记号NZ_LFLU01000012.1)获自NIH基因库(GenBank)。

基于获得的核苷酸序列信息合成将源自根际草螺菌的基因插入到谷氨酸棒杆菌的基因组DNA中的引物。为了扩增源自根际草螺菌的基因，使用根际草螺菌菌株的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的引物进行PCR。将Solg^TM Pfu-X DNA聚合酶用作聚合酶，并如下进行PCR：95℃变性2分钟；27个循环的95℃变性20秒，62℃退火40秒，72℃聚合1分钟；并且72℃聚合5分钟。

因此，获得956bp的基因片段，其包含924bp的基因(SEQ ID NO：2)。

SEQ ID NO：3(wex-1)

TAGAGGAGACACAACATGAATAGCAAGAAGGCCAC

SEQ ID NO：4(wex-2)

ggctcttcctgtttAGTCTACAAACAGTCCGCCAC

为了获得源自谷氨酸棒杆菌的gapA启动子，使用谷氨酸棒杆菌的基因组DNA作为模板以及SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的引物进行PCR。将Solg^TM Pfu-X DNA聚合酶(SolGentCo.,Ltd.)用作聚合酶，并如下进行PCR：95℃变性2分钟；27个循环的95℃变性20秒，62℃退火40秒，72℃聚合30秒；并且72℃聚合5分钟。

SEQ ID NO：5(PgapA-1)

cccttccggtttAGTTTGAAGCCAGTGTGAGTTGC

SEQ ID NO：6(PgapA(-wex)-2)

CTTCTTGCTATTCATGTTGTGTCTCCTCTAAAGATTGTA

通过Gibson组装方法(DG Gibson等人，NATURE METHODS,VOL.6NO.5,MAY 2009,NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix)克隆扩增的gapA启动子区域、源自根际草螺菌的基因片段和用ScaI限制性酶切割的pDZTn载体(韩国专利号10-1126041)，从而获得重组质粒。将重组质粒命名为pDZTn-PgapA-Hrh。通过以计算的摩尔数将Gibson组装试剂和每个基因片段混合，然后通过在50℃下温育1小时进行克隆。

通过电穿孔将制得的pDZTn-PgapA-Hrh载体转化到野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13869菌株中(Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52:541-545)并进行二次交叉以获得其中将一个拷贝的PgapA-Hrh基因插入到染色体上的转座子中的菌株。通过基因组测序和使用SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的引物的PCR方法证实了相应的遗传操作，每个引物可以分别扩增插入相应基因的同源重组的上游区域和下游区域的外部区域。

SEQ ID NO：7(证实_PgapA-wex-1)

CGGATTATGCCAATGATGTG

SEQ ID NO：8(证实_PgapA-wex-2)

CACGATCACCAACATTCAGG

将由此获得的菌株命名为谷氨酸棒杆菌ATCC13869::PgapA-Hrh。

实施例3：制备其中引入源自斯氏假单胞菌的基因的棒杆菌属微生物

编码实施例1中选择的源自斯氏假单胞菌的膜蛋白的基因具有氨基酸序列SEQ IDNO：9。关于相应基因及其相邻核苷酸序列的信息(登记号NC_018177.1)获自NIH基因库(GenBank)。

基于获得的核苷酸序列信息合成将源自斯氏假单胞菌的基因插入到谷氨酸棒杆菌的基因组DNA中的引物。为了扩增源自斯氏假单胞菌的基因，使用斯氏假单胞菌菌株的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的引物以与实施例2中相同的方式进行PCR。

因此，获得977bp的基因片段，其包含945bp的输出基因(SEQ ID NO：10)。

SEQ ID NO：11(Pst-1)

TAGAGGAGACACAACATGAAAAACCAGCGTAAAGC

SEQ ID NO：12(Pst-2)

ggctcttcctgtttAGTTTATCCGTTTCGACGCGG

对于使用源自谷氨酸棒杆菌的gapA启动子，使用谷氨酸棒杆菌ATCC13869的基因组DNA作为模板以及SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：13的引物以与实施例2中相同的方式进行PCR。

SEQ ID NO：13(PgapA(-Pst)-2)

ACGCTGGTTTTTCATGTTGTGTCTCCTCTAAAGATTGTA

通过Gibson组装方法克隆扩增的gapA启动子区域、源自斯氏假单胞菌的基因片段和用ScaI限制性酶切割的pDZTn载体，从而获得重组质粒。将重组质粒命名为pDZTn-PgapA-Pst。通过以计算的摩尔数将Gibson组装试剂和每个基因片段混合，然后通过在50℃下温育1小时进行克隆。

通过电穿孔将制得的pDZTn-PgapA-Pst载体转化到野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13869菌株中(Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52:541-545)并进行二次交叉以获得其中将一个拷贝的PgapA-Pst基因插入到染色体上的转座子中的菌株。通过基因组测序和使用SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的引物的PCR方法证实了相应的遗传操作，每个引物可以分别扩增插入相应基因的同源重组的上游区域和下游区域的外部区域。

将由此获得的菌株命名为谷氨酸棒杆菌ATCC13869::PgapA-Pst。

实施例4：制备其中引入源自粪产碱菌的基因的棒杆菌属微生物

编码实施例1中选择的源自粪产碱菌的膜蛋白的基因具有氨基酸序列SEQ ID NO：14。关于相应基因及其相邻核苷酸序列的信息(登记号NZ_CP013119.1)获自NIH基因库(GenBank)。

基于获得的核苷酸序列信息合成将源自粪产碱菌的基因插入到谷氨酸棒杆菌的基因组DNA中的引物。为了扩增源自粪产碱菌的基因，使用粪产碱菌菌株的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17的引物以与实施例2中相同的方式进行PCR。

因此，获得943bp的基因片段，其包含912bp的输出基因(SEQ ID NO：15)。

SEQ ID NO：16(Afa-1)

TAGAGGAGACACAACATGAAGCAATCTGATAAGGC

SEQ ID NO：17(Afa-2)

gctcttcctgtttAGTTCAGGCAGCGCTTTTTAGT

为了获得源自谷氨酸棒杆菌的gapA启动子，使用谷氨酸棒杆菌的基因组DNA作为模板以及SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：18的引物以与实施例2中相同的方式进行PCR。

SEQ ID NO：18(PgapA(-Afa)-2)

ATCAGATTGCTTCATGTTGTGTCTCCTCTAAAGATTGTA

通过Gibson组装方法克隆扩增的gapA启动子区域、源自粪产碱菌的基因片段和用ScaI限制性酶切割的pDZTn载体，从而获得重组质粒。将重组质粒命名为pDZTn-PgapA-Afa。通过以计算的摩尔数将Gibson组装试剂和每个基因片段混合，然后通过在50℃下温育1小时进行克隆。

通过电穿孔将制得的pDZTn-PgapA-Afa载体转化到野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13869菌株中并进行二次交叉以获得其中将一个拷贝的PgapA-Afa基因插入到染色体上的转座子中的菌株。通过基因组测序和使用SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的引物的PCR方法证实了相应的遗传操作，每个引物可以分别扩增插入相应基因的同源重组的上游区域和下游区域的外部区域。

将由此获得的菌株命名为谷氨酸棒杆菌ATCC13869::PgapA-Afa。

实施例5：制备其中引入源自钩虫贪铜菌的基因的棒杆菌属微生物

编码实施例1中选择的源自钩虫贪铜菌的膜蛋白的基因具有氨基酸序列SEQ IDNO：19。关于相应基因及其相邻核苷酸序列的信息(登记号AM260480.1)获自NIH基因库(GenBank)。

基于获得的核苷酸序列信息合成将源自钩虫贪铜菌的基因插入到谷氨酸棒杆菌的基因组DNA中的引物。为了扩增源自钩虫贪铜菌的基因，使用钩虫贪铜菌菌株的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22的引物以与实施例2中相同的方式进行PCR。

因此，获得977bp的基因片段，其包含源自钩虫贪铜菌的945bp的输出基因(SEQ IDNO：20)。

SEQ ID NO：21(Cne-1)

TAGAGGAGACACAACATGCAAAGCAAGAGCAAAGC

SEQ ID NO：22(Cne-2)

ggctcttcctgtttAGTTCACGGTTCCTGGACACG

为了获得源自谷氨酸棒杆菌的gapA启动子，使用谷氨酸棒杆菌的基因组DNA作为模板以及SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：23的引物以与实施例2中相同的方式进行PCR。

SEQ ID NO：23(PgapA(-Cne)-2)

GCTCTTGCTTTGCATGTTGTGTCTCCTCTAAAGATTGTA

通过Gibson组装方法克隆扩增的gapA启动子区域、源自钩虫贪铜菌的基因片段和用ScaI限制性酶切割的pDZTn载体，从而获得重组质粒。将重组质粒命名为pDZTn-PgapA-Cne。通过以计算的摩尔数将Gibson组装试剂和每个基因片段混合，然后通过在50℃下温育1小时进行克隆。

通过电穿孔将制得的pDZTn-PgapA-Cne载体转化到野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13869菌株中并进行二次交叉以获得其中将一个拷贝的PgapA-Cne基因插入到染色体上的转座子基因之间的菌株。通过基因组测序和使用SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的引物的PCR方法证实了相应的遗传操作，每个引物可以分别扩增插入相应基因的同源重组的上游区域和下游区域的外部区域。

将由此获得的菌株命名为谷氨酸棒杆菌ATCC13869::PgapA-Cne。

实施例6：制备其中引入源自大肠杆菌str.K-12 substr.MG1655的基因的棒杆菌属微生物

编码实施例1中选择的源自大肠杆菌str.K-12substr.MG1655的膜蛋白的基因具有氨基酸序列SEQ ID NO：24。关于相应基因及其相邻核苷酸序列的信息(登记号NC_000913.3)获自NIH基因库(GenBank)。

基于获得的核苷酸序列信息合成将源自大肠杆菌的基因插入到谷氨酸棒杆菌的基因组DNA中的引物。为了扩增源自大肠杆菌的基因，使用大肠杆菌菌株的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27的引物以与实施例2中相同的方式进行PCR。

因此，获得913bp的基因片段，其包含882bp的输出基因(SEQ ID NO：25)。

SEQ ID NO：26(Eco-1)

TAGAGGAGACACAACATGACACGACAAAAAGCAAC

SEQ ID NO：27(Eco-2)

gctcttcctgtttAGTTTAACCACGACGTGTCGCC

为了获得源自谷氨酸棒杆菌的gapA启动子，使用谷氨酸棒杆菌的基因组DNA作为模板以及SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：28的引物以与实施例2中相同的方式进行PCR。

SEQ ID NO：28(PgapA(-Eco)-2)

TTTTTGTCGTGTCATGTTGTGTCTCCTCTAAAGATTG

通过Gibson组装方法克隆扩增的gapA启动子区域、源自大肠杆菌的基因片段和用ScaI限制性酶切割的pDZTn载体，从而获得重组质粒。将重组质粒命名为pDZTn-PgapA-Eco。通过以计算的摩尔数将Gibson组装试剂和每个基因片段混合，然后通过在50℃下温育1小时进行克隆。

通过电穿孔将制得的pDZTn-PgapA-Eco载体转化到野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13869菌株中并进行二次交叉以获得其中将一个拷贝的PgapA-Eco基因插入到染色体上的转座子基因之间的菌株。通过基因组测序和使用SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的引物的PCR方法证实了相应的遗传操作，每个引物可以分别扩增插入相应基因的同源重组的上游区域和下游区域的外部区域。

将由此获得的菌株命名为谷氨酸棒杆菌ATCC13869::PgapA-Eco。

实施例7：测量其中引入源自各种微生物的基因的棒杆菌属微生物菌株中的MIC

为了证实在实施例2-6中制得的5种类型谷氨酸棒杆菌菌株(即ATCC13869::PgapA-Hrh、ATCC13869::PgapA-Pst、ATCC13869::PgapA-Afa、ATCC13869::PgapA-Cne和ATCC13869::PgapA-Eco)中存在的色氨酸输出活性，使用色氨酸类似物和苯丙氨酸类似物(即另一种芳香族氨基酸)进行最小抑制浓度(MIC)实验。将谷氨酸棒杆菌的5种不同菌株(每种引入编码膜蛋白的基因)在最小液体培养基中于30℃培养24小时，分别稀释至3×10³个细胞和3×10⁴个细胞的浓度，然后在其中添加色氨酸类似物和苯丙氨酸类似物的最小固体培养基中进行点样培养。

对于最小抑制浓度(MIC)实验，将p-氟-DL-苯丙氨酸(2.5mg/mL)或5-氟-DL-色氨酸(0.25μg/mL)添加到最小固体培养基中，60小时后观察细胞生长(表2)。

所选择的5种类型基因的全部引入能够在其中以2.5mg/mL的浓度添加苯丙氨酸类似物的条件下使细胞生长。在它们中，源自根际草螺菌、粪产碱菌和大肠杆菌的基因的引入显示出最高的细胞生长。源自斯氏假单胞菌的基因的引入显示出细胞生长略微减少，并且源自钩虫贪铜菌的基因的引入显示出最低的细胞生长。在相同条件下，野生型ATCC13869菌株不生长。另外，在以0.25μg/mL的浓度添加色氨酸类似物的条件下仅源自根际草螺菌的基因的引入能够使细胞生长。

从上述结果可以看出，据观察即使引入之间存在活性差异，所选择的5种类型基因的全部引入显示出对苯丙氨酸和苯丙氨酸类似物的抗性。相反，关于色氨酸和色氨酸类似物，仅源自根际草螺菌的基因的引入显示出对其具有特异性和优异的抗性。基于这些结果，可以解释为仅由源自根际草螺菌的基因编码的膜蛋白可以作为色氨酸的输出蛋白。

最小培养基(pH 7.2)

葡萄糖10g、KH₂PO₄1g、K₂HPO₄2g、MgSO₄7H₂O 0.4g、尿素2g、(NH₄)₂SO₄ 5g、NaCl0.5g、烟酰胺5μg、泛酸钙0.1μg、生物素0.2μg、硫胺素盐酸盐(Thiamine HCl)3μg、微量元素溶液1mL(基于1L蒸馏水)

微量元素溶液

Na₂B₄O₇10H₂O 0.09g、(NH₄)₆Mo₇O₂₇4H₂O 0.04g、ZnSO₄7H₂O 0.01g、CuSO₄ 5H₂O0.27g、MnCl₂4H₂O 0.01g、FeCl₃6H₂O 1g、CaCl₂0.01g(基于1L蒸馏水)

[表2]谷氨酸棒杆菌菌株的生长，其中在含有苯丙氨酸类似物或色氨酸类似物的最小培养基中引入源自各种微生物的基因

实施例8：制备其中引入源自各种微生物的基因的用于大肠杆菌的表达载体

为了证实源自实施例1中所选择的各种微生物的基因对大肠杆菌中的色氨酸或其类似物的抗性，将每种基因克隆到pCL1920(即大肠杆菌表达载体)中并用大肠杆菌W3110的yccA启动子表达。

为了获得源自根际草螺菌的基因片段，使用根际草螺菌菌株的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30的引物进行PCR。将Solg^TM Pfu-X DNA聚合酶(SolGentCo.,Ltd.)用作聚合酶，并如下进行PCR：95℃变性2分钟；27个循环的95℃变性20秒，62℃退火40秒，72℃聚合1分钟；并且72℃聚合5分钟。

SEQ ID NO：29(Hrh-3)

ATAGAGAGTGACTCAATGAATAGCAAGAAGGCCAC

SEQ ID NO：30(Hrh-4)

TCGAGCTCGGTACCCCTACAAACAGTCCGCCAC

为了获得源自大肠杆菌W3110的yccA启动子，使用大肠杆菌W3110的基因组DNA作为模板以及SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32的引物进行PCR。将Solg^TM Pfu-X DNA聚合酶(SolGent Co.,Ltd.)用作聚合酶，并如下进行PCR：95℃变性2分钟；27个循环的95℃变性20秒，62℃退火40秒，72℃聚合10秒；并且72℃聚合5分钟。

SEQ ID NO：31(PyccA-1)

CTCTAGAGGATCCCCTTCCAGATCAAATGCGTAA

SEQ ID NO：32(PyccA(-Hrh)-2)

CTTCTTGCTATTCATTGAGTCACTCTCTATGACAG

通过Gibson组装方法克隆扩增的yccA启动子区域、源自根际草螺菌的基因片段和用SmaI限制性酶切割的pCL1920载体(pSC101ori，Sp^r)，从而获得重组质粒。将重组质粒命名为pCL1920-PyccA-Hrh。通过以计算的摩尔数将Gibson组装试剂和每个基因片段混合，然后通过在50℃下温育1小时进行克隆。将获得的pCL1920-PyccA-Hrh引入到野生型大肠杆菌W3110中，从而制得W3110/pCL1920-PyccA-Hrh(即其中表达基因的转化体)。

为了获得源自斯氏假单胞菌的基因片段，使用斯氏假单胞菌菌株的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34的引物进行PCR。另外，以与从上述根际草螺菌菌株获得基因片段相同的方式进行PCR，不同之处在于使用SEQ ID No：35的引物，该引物用于获得源自大肠杆菌W3110的yccA启动子供使用。

SEQ ID NO：33(Pst-3)

ATAGAGAGTGACTCAATGAAAAACCAGCGTAAAGC

SEQ ID NO：34(Pst-4)

TCGAGCTCGGTACCCTTATCCGTTTCGACGCGG

SEQ ID NO：35(PyccA(-Pst)-2)

ACGCTGGTTTTTCATTGAGTCACTCTCTATGACAG

因此，获得了重组质粒并将其命名为pCL1920-PyccA-Pst。将表达载体pCL1920-PyccA-Pst转化到野生型大肠杆菌W3110中，从而制得W3110/pCL1920-PyccA-Pst(即其中表达基因的转化体)。

其中表达源自粪产碱杆菌菌株的基因的转化体的制备过程与上述相同，不同之处在于使用粪产碱菌的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37的引物进行PCR，使用用于获得yccA启动子的SEQ ID NO：38的引物。

SEQ ID NO：36(Afa-3)

ATAGAGAGTGACTCAATGAAGCAATCTGATAAGGC

SEQ ID NO：37(Afa-4)

TCGAGCTCGGTACCCTCAGGCAGCGCTTTTTAGT

SEQ ID NO：38(PyccA(-Afa)-2)

ATCAGATTGCTTCATTGAGTCACTCTCTATGACAG

因此，获得了克隆源自粪产碱菌的基因的重组质粒并将其命名为pCL1920-PyccA-Afa。将表达载体pCL1920-PyccA-Afa转化到野生型大肠杆菌W3110中，从而制得W3110/pCL1920-PyccA-Afa(即转化体)。

为了获得源自钩虫贪铜菌菌株的基因片段，使用钩虫贪铜菌菌株的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40的引物进行PCR。另外，以与从上述根际草螺菌菌株获得基因片段相同的方式进行PCR，不同之处在于使用SEQ ID No：41的引物，该引物用于获得源自大肠杆菌W3110的yccA启动子供使用。

SEQ ID NO：39(Cne-3)

ATAGAGAGTGACTCAATGCAAAGCAAGAGCAAAGC

SEQ ID NO：40(Cne-4)

TCGAGCTCGGTACCCTCACGGTTCCTGGACACG

SEQ ID NO：41(PyccA(-Cne)-2)

GCTCTTGCTTTGCATTGAGTCACTCTCTATGACAG

因此，获得了重组质粒并将其命名为pCL1920-PyccA-Cne。将表达载体pCL1920-PyccA-Cne转化到野生型大肠杆菌W3110中，从而制得W3110/pCL1920-PyccA-Cne(即其中表达基因的转化体)。

为了获得源自大肠杆菌菌株的基因片段，使用大肠杆菌str.K-12substr.MG1655菌株的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43的引物进行PCR。另外，以与从上述根际草螺菌菌株获得基因片段相同的方式进行PCR，不同之处在于使用SEQ ID No：44的引物，该引物用于获得源自大肠杆菌W3110的yccA启动子供使用。

SEQ ID NO：42(Eco-3)

ATAGAGAGTGACTCAATGACACGACAAAAAGCAAC

SEQ ID NO：43(Eco-4)

TCGAGCTCGGTACCCTTAACCACGACGTGTCGCC

SEQ ID NO：44(PyccA(-Eco)-2)

TTTTTGTCGTGTCATTGAGTCACTCTCTATGACAG

因此，获得了重组质粒并将其命名为pCL1920-PyccA-Eco。将表达载体pCL1920-PyccA-Eco转化到野生型大肠杆菌W3110中，从而制得W3110/pCL1920-PyccA-Cne(即其中表达基因的转化体)。

实施例9：测量其中过表达源自各种微生物的膜蛋白的基因的大肠杆菌的MIC

为了证实其中过表达实施例8中制得的5种类型基因的大肠杆菌菌株的抗性(即W3110/pCL1920-PyccA-Hrh、W3110/pCL1920-PyccA-Pst、W3110/pCL1920-PyccA-Afa、W3110/pCL1920-PyccA-Cne和W3110/pCL1920-PyccA-Eco)，使用色氨酸类似物和苯丙氨酸类似物进行最小抑制浓度(MIC)实验。将其中过表达5种类型基因的大肠杆菌菌株在含有壮观霉素(50μg/mL)的M9最小液体培养基中于37℃培养15小时，分别以10⁴个细胞和10⁵个细胞的浓度稀释，然后在其中添加色氨酸类似物或苯丙氨酸类似物含有壮观霉素(50μg/mL)的M9葡萄糖最小固体培养基中点样培养。对于最小抑制浓度(MIC)实验，将p-氟-DL-苯丙氨酸(2mg/mL)或5-氟-DL-色氨酸(0.7μg/mL)添加到M9最小固体培养基中，48小时后观察细胞生长(表3)。

当过表达源自大肠杆菌的基因时，在添加苯丙氨酸类似物的条件下，大肠杆菌菌株显示出优异的生长，并且源自粪产碱菌的基因的过表达也显示出显著的生长。然而，源自根际草螺菌、斯氏假单胞菌和钩虫贪铜菌的基因的过表达未显示出与W3110/pCL1920(即对照组)相当的生长。相反，全部5种类型所选择的基因的过表达使得在添加色氨酸类似物的条件下使全部细胞生长成为可能。它们中，源自根际草螺菌的基因的过表达显示出最高的生长，并且源自粪产碱菌和大肠杆菌的输出基因的过表达显示出第二高的生长。源自斯氏假单胞菌和钩虫贪铜菌的输出基因的过表达显示出可忽略的生长。

关于大肠杆菌菌株中5种类型基因的MIC实验结果与谷氨酸棒杆菌中的相似。源自根际草螺菌的基因在谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌菌株中均显示出对色氨酸及其类似物的特异性和优异的抗性，源自大肠杆菌的输出基因显示出对苯丙氨酸及其类似物的输出抗性高于对色氨酸的输出抗性。从这些结果可以看出，源自根际草螺菌的基因显示出对谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌菌株中的色氨酸具有特异性和优异的输出能力。

[表3]大肠杆菌菌株的生长，其中每个基因在含有苯丙氨酸类似物或色氨酸类似物的最小培养基中过表达

参考例1：制备生产L-色氨酸的谷氨酸棒杆菌属微生物

生产L-色氨酸的菌株是从野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13869中开发的。由于野生型谷氨酸棒杆菌不能生产L-色氨酸，或者如果可能的话，只能生产非常少量的色氨酸，因此尝试使用其中增强生产L-色氨酸所必需的生物合成途径的菌株作为亲本菌株。具体地，通过增强启动子增加L-色氨酸生物合成基因的操纵子的表达。另外，为了释放TrpE蛋白的反馈抑制，trpE的第38个氨基酸(即丝氨酸)被精氨酸取代(Journal of Bacteriology,Nov.1987,p.5330-5332)。

对于上述遗传操作，首先，获得trpE启动子的上游区域和trpE的第38个氨基酸突变的下游区域以用于染色体上的同源重组。具体地，通过使用谷氨酸棒杆菌的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO：45和SEQ ID No：46的引物进行PCR以获得trpE启动子上游区域的遗传片段，而通过使用谷氨酸棒杆菌的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48的引物进行PCR以获得trpE的第38个氨基酸突变的下游区域的遗传片段。

SEQ ID NO：45(Pspl7-trpE(S38R)_L-1)

TCGAGCTCGGTACCCAAACAACTGCGACGTGTGTC

SEQ ID NO：46(Pspl7-trpE(S38R)_L-2)

CATGAAGCGCCGGTACCTTAATCATTTTTGGGTTC

SEQ ID NO：47(Pspl7-trpE(S38R)_R-1)

GCCCTGTTGGAACGCGCTGATATCACCACCAAGAA

SEQ ID NO：48(Pspl7-trpE(S38R)_R-2)

CTCTAGAGGATCCCCAGATGTCACCGTTGTAAATG

将Solg^TM Pfu-X DNA聚合酶(SolGent Co.,Ltd.)用作聚合酶，并如下进行PCR：95℃变性5分钟；30个循环的95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃聚合60秒；并且72℃聚合5分钟。

使用合成的启动子SPL7(SEQ ID NO：49)作为模板以及SEQ ID NO：50和SEQ IDNO：51的引物进行PCR。

SEQ ID NO：50(Pspl7-1)

CCCAAAAATGATTAAGGTACCGGCGCTTCATGTCA

SEQ ID NO：51(Psp17-2)

GGGATTCGTGCTCATGATATCTGTTTTGATCTCCTCC

将Solg^TM Pfu-X DNA聚合酶(SolGent Co.,Ltd.)用作聚合酶，并如下进行PCR：95℃变性5分钟；30个循环的95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃聚合30秒；并且72℃聚合5分钟。

为了获得源自谷氨酸棒杆菌的trpE的前序列片段(包括第1个至第38个氨基酸突变)，使用谷氨酸棒杆菌的基因组DNA作为模板以及SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53的引物进行PCR。

SEQ ID NO：52(trpE(S38R)-1)

ATCAAAACAGATATCATGAGCACGAATCCCCATGT

SEQ ID NO：53(trpE(S38R)-2)

GTGGTGATATCAGCGCGTTCCAACAGGGCTGCATC

使用Gibson组装方法通过克隆trpE启动子的扩增上游区域和trpE的第38个氨基酸突变的下游区域、SPL7启动子和trpE的前序列片段以及通过SmaI限制性酶切割的pDZ载体获得重组质粒。将重组质粒命名为pDZ-PSPL7-trpE(S38R)。通过以计算的摩尔数将Gibson组装试剂和每个基因片段混合，然后通过在50℃下温育1小时进行克隆。

通过电穿孔将制得的pDZ-PSPL7-trpE(S38R)载体转化到谷氨酸棒杆菌ATCC13869菌株中并进行二次交叉。然后获得染色体上的trpE的启动子被SPL7启动子(即更强的启动子)替换和trpE的第38个氨基酸(即丝氨酸)被精氨酸取代的菌株。通过基因组测序和使用SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55的引物的PCR方法证实了相应的遗传操作，该引物可以扩增插入基因的同源重组的上游区域和下游区域，并且将所得菌株命名为CA04-8325。

SEQ ID NO：54(证实_Pspl7-trpE(S38R)-1)

GAAGAAGAGGCTGCAGATG

SEQ ID NO：55(证实_Pspl7-trpE(S38R)-2)

GATCAGCGCCATCATGTT

色氨酸生产通过芳香族氨基酸代谢途径发生，并且该代谢途径从磷酸烯醇丙酮酸和赤藓糖4-磷酸之间的缩合反应开始。因此，这两种前体的平稳供应对于色氨酸的生产是必需的，并且为了平稳供应已知相对缺乏的赤藓糖4-磷酸而进行tkt基因的过表达。

对于上述遗传操作，使用谷氨酸棒杆菌的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO：56和SEQ ID No：57的引物进行PCR以获得用于额外插入tkt基因的上游区域，以及使用SEQ IDNO：58和SEQ ID NO：59的引物以获得用于额外插入tkt基因的下游区域。

SEQ ID NO：56(Pn-tkt_L-1)

TCGAGCTCGGTACCCAAACTTTGAGTGGGTGCGTG

SEQ ID NO：57(Pn-tkt_L-2)

TCGAGCTACGAGGGCGGTTCCCAGCCCTTCATTAG

SEQ ID NO：58(Pn-tkt_R-1)

ATTAACGGTTAATTGATTCTGGACGTCATGACTAC

SEQ ID NO：59(Pn-tkt_R-2)

CTCTAGAGGATCCCCGCCTCGATGATGCAGTCGTC

将Solg^TM Pfu-X DNA聚合酶用作聚合酶，并如下进行PCR：95℃变性2分钟；27个循环的95℃变性20秒，62℃退火40秒，72℃聚合30秒；并且72℃聚合5分钟。

为了获得tkt基因及其启动子，使用野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13869的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：61的引物进行PCR，从而获得包含其启动子的tkt基因。

SEQ ID NO：60(Pn-tkt-1)

GAAGGGCTGGGAACCGCCCTCGTAGCTCGAGAGTT

SEQ ID NO：61(Pn-tkt-2)

CATGACGTCCAGAATCAATTAACCGTTAATGGAGTCC

将Solg^TM Pfu-X DNA聚合酶用作聚合酶，并如下进行PCR：95℃变性2分钟；27个循环的95℃变性20秒，62℃退火40秒，72℃聚合1分20秒；并且72℃聚合5分钟。

使用Gibson组装方法通过克隆用于额外插入tkt基因的扩增上游区域和用于额外插入tkt基因的下游区域、包含tkt启动子的tkt基因、通过SmaI限制性酶切割的用于染色体转化的pDZ载体获得重组质粒，并且将所得重组质粒命名为pDZ-Pn-tkt。通过以计算的摩尔数将Gibson组装试剂和每个基因片段混合，然后通过在50℃下温育1小时进行克隆。

通过电穿孔将制得的pDZ-Pn-tkt载体转化到CJ04-8325菌株中并进行二次交叉以获得其中将包含tkt启动子的tkt基因插入到染色体上的菌株。通过基因组测序和使用SEQID NO：62和SEQ ID NO：63的引物的PCR方法证实了相应的遗传操作，该引物可以分别扩增插入相应基因的同源重组的上游区域和下游区域的外部区域。将所得菌株命名为CA04-8352。

SEQ ID NO：62(证实_Pn-tkt-1)

ACCCAGAACCCCAAATTTTC

SEQ ID NO：63(证实_Pn-tkt-2)

TTGAGTTCGACAACTTTGG

实施例10：其中引入源自根际草螺菌和大肠杆菌的基因的棒杆菌属微生物的色氨酸产生

将源自根际草螺菌的基因引入到CA04-8352中，该基因对实施例7中的色氨酸类似物的最小抑制浓度显示出优异的活性，CA04-8352是参考例1中制得的生产色氨酸的菌株。为此目的，通过电穿孔将用于引入实施例2中制得的源自根际草螺菌的基因的pDZTn-PgapA-Hrh载体转化到CA04-8352(即生产色氨酸的菌株)中并进行如实施例2的过程，从而获得其中将一个拷贝的源自根际草螺菌的基因插入到转座子基因之间的菌株。将所得菌株命名为CA04-8405。

另外，将源自大肠杆菌的基因引入到CA04-8352(即生产色氨酸的菌株)中作为对照组。通过电穿孔将用于引入实施例6中制得的源自大肠杆菌的基因的pDZTn-PgapA-Eco载体转化到CA04-8352(即生产色氨酸的菌株)中并进行如实施例6的过程，从而获得其中将一个拷贝的源自大肠杆菌的基因插入到转座子基因之间的菌株。将所得菌株命名为CA04-8406。

通过以下方法培养由上述过程获得的菌株CA04-8405和CA04-8406以便证实相对于参考例1中制得的CA04-8352菌株作为对照组的色氨酸产生。将每个菌株接种到含有种子培养基(25mL)的250mL拐角-挡板烧瓶中并在30℃在200rpm下振荡培养20小时。然后，将每种种子培养溶液(1mL)接种到含有生产培养基(25mL)的250mL拐角-挡板烧瓶中并在30℃在200rpm下振荡培养24小时。培养完成后，通过高效液相色谱法(HPLC)测量L-色氨酸产生的量。

种子培养基(pH 7.0)

葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、尿素1.5g、KH₂PO₄4g、K₂HPO₄8g、MgSO₄7H₂O0.5g、生物素100μg、硫胺素盐酸盐1000μg、泛酸钙2000μg、烟酰胺2000μg(基于1L蒸馏水)

生产培养基(pH 7.0)

葡萄糖30g、(NH₄)₂SO₄15g、MgSO₄7H₂O 1.2g、KH₂PO₄1g、酵母提取物5g、生物素900μg、硫胺素盐酸盐4500μg、泛酸钙4500μg、CaCO₃30g(基于1L蒸馏水)

[表4]通过CA04-8352(生产L-色氨酸的谷氨酸棒杆菌菌株)、CA04-8405(其中插入源自根际草螺菌的基因的菌株)和CA04-8406(其中插入源自大肠杆菌的基因的菌株)证实L-色氨酸产生的量。

在培养基中CA04-8352、CA04-8405和CA04-8406菌株的L-色氨酸产生的结果显示于上表4中。

其中引入源自根际草螺菌的基因的CA04-8405菌株在烧瓶培养中生产最终浓度为1.52g/L的L-色氨酸，并且与对照组CA04-8352菌株相比，这是约5倍的提高。这表明源自根际草螺菌的基因显著提高了谷氨酸棒杆菌菌株中的L-色氨酸产生。相反，其中引入源自大肠杆菌基因的CA04-8406菌株生产浓度为0.23g/L的L-色氨酸，这几乎与CA04-8352菌株(即CA04-8406菌株的亲本菌株)的L-色氨酸产生的量相同。如在实施例7和9中证实的色氨酸类似物和苯丙氨酸类似物的最小抑制浓度(MIC)实验中所证实的，源自大肠杆菌的基因被认为是输出基因，其显示出对苯丙氨酸的特异性高于对色氨酸的特异性。

根据布达佩斯条约的规定，CA04-8405菌株于2017年8月21日国际保藏于国际保藏中心韩国微生物培养中心(KCCM)并指定保藏号KCCM12099P(CA04-8405)。

实施例11：分析其中引入源自根际草螺菌的基因的谷氨酸棒杆菌中的细胞内色氨酸代谢物

为了明确证实细胞内色氨酸浓度是否随着CA04-8405菌株(即生产色氨酸的菌株)的色氨酸输出能力的提高而降低，使用有机溶剂并使用萃取方法测量了CA04-8405菌株及其亲本菌株(即CA04-8352)的细胞内色氨酸浓度。

用于分析细胞内代谢物的方法根据参考文献中所述的方法进行(Nakamura J等人，Appl.Environ.Microbiol.73(14):4491-4498,2007)。

首先，关于修饰的谷氨酸棒杆菌菌株CA04-8352和CA04-8405，将每个菌株接种到含有种子培养基(25mL)的250mL拐角-挡板烧瓶中并在30℃在200rpm下振荡培养20小时。然后，将每种种子培养溶液(1mL)接种到含有生产培养基(25mL)的250mL拐角-挡板烧瓶中并在30℃在200rpm下振荡培养。根据葡萄糖消耗分析细胞内色氨酸浓度三次。通过快速真空过滤(Durapore HV，0.45μm；Millipore，Billerica，MA，USA)将每个步骤中的培养细胞与培养液分离。将吸附有细胞的过滤器用蒸馏水(10mL)洗涤两次，并在含有5μM吗啉乙磺酸和5μM蛋氨酸砜的甲醇中浸泡10分钟。将氯仿(1.6mL)和蒸馏水(0.64μL)添加到上面获得的细胞提取物(1.6mL)中并充分混合，并且仅将水相施加到旋转柱上以除去蛋白质杂质。使用毛细管电泳质谱法分析过滤的提取物，结果显示在图1中。

如图1所示，证实了与其亲本菌株CA04-8352相比，CA04-8405菌株显示出细胞内色氨酸浓度降低至33％至41％的水平。由此可以解释为，由于源自根际草螺菌的基因的表达，谷氨酸棒杆菌菌株细胞内生产的色氨酸在细胞外平稳地输出，因而CA04-8405菌株的细胞内色氨酸浓度降低。从上述结果可以证实，源自根际草螺菌的基因是编码具有色氨酸特异性输出能力的膜蛋白的基因。

参考例2：制备生产L-色氨酸的埃希氏菌属微生物

生产L-色氨酸的埃希氏菌属的微生物是从野生型大肠杆菌W3110中开发的。为了证实色氨酸产生的量是否由于修饰具有L-色氨酸输出活性的蛋白以表达而显著增加，将制备生产L-色氨酸的菌株用作亲本菌株。具体地，L-色氨酸生物合成基因(trpEDCBA)的表达受TrpR抑制，该基因参与由分支酸生产L-色氨酸。因此，除去编码TrpR的trpR基因。另外，为了根据L-色氨酸产生的提高释放TrpE多肽的反馈抑制，TrpE的N-末端的第21个氨基酸(即脯氨酸)被丝氨酸取代(J.Biochem.Mol.Biol.32,20-24(1999))。

Mtr膜蛋白具有将细胞外L-色氨酸引入到细胞的作用，并且TnaA蛋白具有将细胞内L-色氨酸和水分子分离成吲哚、丙酮酸和氨(NH₃)的作用。因此，除去抑制L-色氨酸产生并分解L-色氨酸的mtr和tnaA基因。

为了除去这些基因，使用λ-red重组方法(使用PCR产物在大肠杆菌K-12中一步灭活染色体基因，Datsenko KA,Wanner BL.,Proc Natl Acad Sci USA.2000Jun 6；97(12):6640-6645)。为了除去mtr基因，使用pKD4载体作为模板以及SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：65的引物进行PCR，从而获得基因片段(1580bp)，在该基因片段中结合了其中其间发生染色体同源重组的FRT-卡那霉素-FRT盒和mtr基因侧翼的一对50bp同源核苷酸。pKD4载体的卡那霉素抗生素标记用于证实靶标基因的除去和抗生素基因的插入，并且FRT区域具有在除去靶标基因后除去抗生素标记的作用。将Solg^TM Pfu-X DNA聚合酶用作聚合酶，并如下进行PCR：95℃变性2分钟；27个循环的95℃变性20秒，62℃退火40秒，72℃聚合1分钟；并且72℃聚合5分钟。

SEQ ID NO：64(Δmtr盒-1)

TGCAATGCATAACAACGCAGTCGCACTATTTTTCACTGGAGAGAAGCCCTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC

SEQ ID NO：65(Δmtr盒-2)

TGCAATGCATAACAACGCAGTCGCACTATTTTTCACTGGAGAGAAGCCCTGTCCATATGAATATCCTCCT

通过电穿孔将表达λred重组酶(gam、bet和exo基因)的pKD46载体转化到大肠杆菌W3110菌株中，并将每个菌株涂布在含有卡那霉素(50mg/L)的LB固体培养基上。当OD₆₀₀达到约0.1时，通过添加10mM L-阿拉伯糖，其中证实了pKD46载体转化的大肠杆菌W3110菌株诱导重组酶的表达。当OD₆₀₀达到约0.6时，将菌株制备成感受态细胞，并通过电穿孔转化上述过程中获得的线性基因片段，在该线性基因片段中结合了FRT-卡那霉素-FRT盒和mtr基因侧翼的一对50bp同源核苷酸。对于在含有卡那霉素(25mg/L)的LB固体培养基上生长的菌落，使用SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67的引物进行菌落PCR，并选择其中制得782bp基因片段的菌落。

SEQ ID NO：66(证实_盒-1)

GGGCAGGATCTCCTGTCATC

SEQ ID NO：67(证实_Δmtr-2)

AAATGTCGGATAAGGCACCG

将由于同源重组除去mtr基因的菌株制备成感受态细胞以便除去卡那霉素抗生素标记，然后通过电穿孔用pCP20载体转化。pCP20载体表达FLP蛋白，从而识别卡那霉素抗生素侧翼的FRT位点并在染色体上与其结合，从而除去FRT位点之间的抗生素标记。在LB液体培养基中将含有氨苄青霉素(100mg/L)和氯霉素(25mg/L)的LB固体培养基上生长的pCP20载体转化菌株于30℃培养1小时，在42℃再培养15小时，并在LB固体培养基上涂布。在含有氨苄青霉素(100mg/L)和氯霉素(25mg/L)的LB固体培养基；含有卡那霉素(12.5mg/L)的LB固体培养基和不含有抗生素的LB固体培养基中培养生长的菌落。仅选择在不含有抗生素的LB固体培养基中生长的菌落。最终通过基因组测序证实了mtr基因的除去，并将该菌株命名为CA04-9300。

通过上述方法进行遗传操作以便除去tnaA基因。使用pKD4载体作为模板以及SEQID NO：68和SEQ ID NO：69的引物进行PCR，从而获得基因片段(1580bp)，在该基因片段中结合了其中其间发生染色体同源重组的FRT-卡那霉素-FRT盒和tnaA基因侧翼的一对50bp同源核苷酸。将Solg^TM Pfu-X DNA聚合酶用作聚合酶，并如下进行PCR：95℃变性2分钟；27个循环的95℃变性20秒，62℃退火40秒，72℃聚合1分钟；并且72℃聚合5分钟。

SEQ ID NO：68(ΔtnaA盒-1)

TGTAATATTCACAGGGATCACTGTAATTAAAATAAATGAAGGATTATGTAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC

SEQ ID NO：69(ΔtnaA盒-2)

TGTAGGGTAAGAGAGTGGCTAACATCCTTATAGCCACTCTGTAGTATTAAGTCCATATGAATATCCTCCT

将pKD46质粒转化到CA04-9300中。通过电穿孔用上述过程中获得的线性基因片段转化CA04-9300，CA04-9300中通过添加10mM L-阿拉伯糖表达重组酶，在该线性基因片段中结合了FRT-卡那霉素-FRT盒和tnaA基因侧翼的一对50bp同源核苷酸。对于在含有卡那霉素(25mg/L)的LB固体培养基上生长的菌落，使用SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：70的引物进行菌落PCR，并选择其中制得787bp基因片段的菌落。

SEQ ID NO：70(证实_ΔtnaA-2)

ACATCCTTATAGCCACTCTG

将其中由于同源重组除去tnaA基因的菌株制备成感受态细胞以便除去卡那霉素抗生素标记，然后用pCP20载体转化，制备其中通过表达FLP蛋白除去卡那霉素抗生素标记的菌株。最终通过基因组测序证实了tnaA基因的除去，并将该菌株命名为CA04-9301。

为了除去trpR基因，使用pKD4载体作为模板以及SEQ ID NO：71和SEQ ID NO：72的引物进行PCR，从而获得基因片段(1580bp)，在该基因片段中结合了其中其间发生染色体同源重组的FRT-卡那霉素-FRT盒和trpR基因侧翼的一对50bp同源核苷酸。将Solg^TM Pfu-XDNA聚合酶用作聚合酶，并如下进行PCR：95℃变性2分钟；27个循环的95℃变性20秒，62℃退火40秒，72℃聚合1分钟；并且72℃聚合5分钟。

SEQ ID NO：71(ΔtrpR盒-1)

TACAACCGGGGGAGGCATTTTGCTTCCCCCGCTAACAATGGCGACATATTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC

SEQ ID NO：72(ΔtrpR盒-2)

GCATTCGGTGCACGATGCCTGATGCGCCACGTCTTATCAGGCCTACAAAAGTCCATATGAATATCCTCCT

将pKD46质粒转化到CA04-9301中。通过电穿孔用上述过程中获得的线性基因片段转化CA04-9301，在CA04-9301中通过添加10mM L-阿拉伯糖表达重组酶，在该线性基因片段中结合了FRT-卡那霉素-FRT盒和trpR基因侧翼的一对50bp同源核苷酸。对于在含有卡那霉素(25mg/L)的LB固体培养基上生长的菌落，使用SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：73的引物进行菌落PCR，并选择其中制得838bp基因片段的菌落。

SEQ ID NO：73(证实_ΔtrpR-2)

AGGACGGATAAGGCGTTCAC

将其中由于同源重组除去trpR基因的菌株制备成感受态细胞以便除去卡那霉素抗生素标记，然后用pCP20载体转化，制备其中通过表达FLP蛋白除去卡那霉素抗生素标记的菌株。最终通过基因组测序证实了trpR基因的除去，并将该菌株命名为CA04-9307。

为了向CA04-9307菌株提供反馈抗性trpE性状，使用大肠杆菌W3110gDNA作为模板以及SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：75的引物进行PCR，该引物中含有EcoRI限制性位点，从而获得含有EcoRI限制性位点(1575bp)的trpE基因片段。将Solg^TM Pfu-X DNA聚合酶用作聚合酶，并如下进行PCR：95℃变性2分钟；27个循环的95℃变性20秒，62℃退火1分钟，72℃聚合1分钟；并且72℃聚合5分钟。

SEQ ID NO：74(trpE-1)

GAATTCATGCAAACACAAAAACCGAC

SEQ ID NO：75(trpE-2)

GAATTCTCAGAAAGTCTCCTGTGCA

在用EcoRI限制性酶分别处理通过上述方法获得的trpE基因片段和pSG76-C质粒(Journal of Bacteriology,July 1997,p.4426-4428)后进行克隆。通过电穿孔将克隆的质粒转化到大肠杆菌DH5α中，在含有氯霉素(25μg/mL)的LB平板上选择经转化的大肠杆菌DH5α菌株，从而获得pSG76-C-trpE质粒。

使用获得的pSG76-C-trpE质粒以及SEQ ID NO：76和SEQ ID NO：77的引物通过定点诱变(Stratagene，USA)制备pSG76-C-trpE(P21S)。

SEQ ID NO：76(trpE(P21S)-1)

CGCTTATCGCGACAATTCCACCGCGCTTTTTCACCAG

SEQ ID NO：77(trpE(P21S)-2)

CTGGTGAAAAAGCGCGGTGGAATTGTCGCGATAAGCG

将pSG76-C-trpE(P21S)质粒转化到CA04-9307菌株中，在LB-Cm培养基(酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L、胰蛋白胨10g/L、氯霉素25μg/L)中培养，并选择对氯霉素具有抗性的菌落。所选择的转化体是其中通过首次插入将pSG76-C-trpE(P21S)质粒掺入基因组的trpE区域的菌株。用pAScep质粒转化其中插入所获得的trpE(P21S)基因的菌株(Journal ofBacteriology,July 1997,p.4426-4428)，该菌株表达切割pSG76-C质粒中存在的I-SceI区域的限制性酶I-SceI，并且选择在LB-Ap(酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L、胰蛋白胨10g/L和氨苄青霉素100μg/L)中生长的菌株。使用SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：75的引物扩增所选择的菌株中的trpE基因，并且通过测序证实了扩增的trpE基因被替换为trpE(P21S)基因。将由此制得的菌株命名为CA04-4303。

实施例12：其中引入源自根际草螺菌的基因的埃希氏菌属微生物的L-色氨酸产生

将实施例8中制得的pCL1920-PyccA-Hrh引入到参考例2中制得的CA04-4303菌株中，从而制得其中过表达源自根际草螺菌的基因的CA04-4306菌株。另外，将作为对照组的pCL1920载体转化到CA04-4303菌株中。为了检查两种菌株中L-色氨酸产生的量(即CA04-4303/pCL1920和CA04-4306)，将这些菌株在含有壮观霉素(50mg/L)的LB液体培养基中培养12小时。然后，将这些菌株各自接种到含有25mL生产培养基的250mL拐角-挡板烧瓶中，使得初始OD₆₀₀值变为0.01，然后在37℃在200rpm下振荡培养48小时。培养完成后，通过高效液相色谱法(HPLC)测量L-色氨酸产生的量。

关于培养基中CA04-4303/pCL1920和CA04-4306菌株中L-色氨酸产生的结果显示在下表5中。其中引入源自根际草螺菌的基因并过表达该基因的菌株CA04-4306在烧瓶培养中显示出最终2.1g/L的L-色氨酸，其比对照组高约50％。这表明源自根际草螺菌的基因即使在大肠杆菌中也能输出L-色氨酸，从而显著提高其L-色氨酸产生。

生产培养基(pH 7.0)

葡萄糖70g、(NH₄)₂SO₄20g、MgSO₄7H₂O 1g、KH₂PO₄2g、酵母提取物2.5g、柠檬酸钠5g、NaCl 1g、CaCO₃40g(基于1L蒸馏水)

[表5]证实源自大肠杆菌的L-色氨酸生产菌株(CA04-4303)和其中过表达源自根际草螺菌的输出基因的L-色氨酸生产菌株(CA04-4306)中的L-色氨酸产生

因此，从实施例7和9的结果可以看出，源自根际草螺菌的基因显示出对L-色氨酸及其类似物的较高特异性和优异的抗性，而从实施例10和12的结果中可以看出，源自根际草螺菌的基因均提高了谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌菌株中的L-色氨酸产生。另外，在实施例11中观察到源自根际草螺菌的基因基本上在细胞外输出色氨酸。因此，将源自根际草螺菌的基因命名为wex(色氨酸(W)输出蛋白)。

根据前述内容，本公开所属领域的技术人员将能够理解的是，在不修饰本公开的技术概念或必需特征的情况下，本公开可以以其它特定形式实施。在这方面，本文所公开的示例性实施方式仅用于说明目的，不应被解释为限制本公开的范围。相反，本公开旨在不仅涵盖示例性实施方式，还涵盖可以包括在由所附权利要求限定的本公开的精神和范围内的各种替换、修饰、等同和其它实施方式。

国际表

关于在专利程序中国际承认微生物保藏的布达佩斯条约

在原件情况下的收据：根据规定7.1由本页底部确定的国际保藏机构签发

至：韩国首尔DONGHO-RO JUNG-GU CJ第一制糖中心330

¹在适用条款6.4(d)的情况下，该日期是获得国际保藏机构身份的日期

表格BP/4(单页)

<110> CJ第一制糖株式会社

<120> 新型L-色氨酸输出蛋白及使用其生产L-色氨酸的方法

<130> OPA18282

<150> KR 10-2018-0022054

<151> 2018-02-23

<160> 77

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 307

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> wex AA 序列

<400> 1

Met Asn Ser Lys Lys Ala Thr Leu Ile Gly Leu Thr Ala Val Val Leu

1 5 10 15

Trp Ser Ser Ile Val Gly Leu Ile Arg Gly Val Ser Glu His Leu Gly

20 25 30

Ala Thr Gly Gly Ala Ala Met Met Tyr Ser Val Ala Ser Leu Phe Leu

35 40 45

Leu Leu Ser Val Gly Phe Pro Lys Leu Gly Ser Phe Pro Lys Lys Tyr

50 55 60

Leu Leu Trp Gly Ser Leu Leu Phe Val Ser Tyr Glu Leu Cys Leu Ser

65 70 75 80

Leu Ser Ile Gly Tyr Ala Asn Thr Gly Arg Gln Ala Ile Glu Val Ser

85 90 95

Met Val Asn Tyr Leu Trp Pro Ala Phe Thr Leu Ile Ala Ala Ile Ala

100 105 110

Phe Asn Arg Gln Arg Ala Asn Trp Met Val Val Pro Gly Phe Ile Leu

115 120 125

Ser Ile Ile Gly Ile Cys Trp Val Leu Gly Gly Asp Gln Gly Leu Asp

130 135 140

Leu Ala Gly Met Leu Gly Asn Val Gln Asp Asn Pro Leu Ser Tyr Gly

145 150 155 160

Leu Ala Phe Leu Gly Ala Val Ile Trp Ala Ala Tyr Cys Thr Val Thr

165 170 175

Ala Arg Leu Ala Lys Gly Lys Asn Gly Val Thr Leu Phe Phe Ile Leu

180 185 190

Val Ala Leu Thr Leu Trp Val Lys Phe Phe Phe Gly Asp His Arg Pro

195 200 205

Met Ser Phe Ser Leu Pro Ala Ile Val Tyr Leu Leu Leu Ala Ala Ala

210 215 220

Ala Met Gly Phe Gly Tyr Ala Ala Trp Asn Val Gly Ile Leu His Gly

225 230 235 240

Asn Val Thr Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Phe Ile Pro Val Phe Ser

245 250 255

Ala Ala Leu Ser Ala Met Val Leu His Ala Pro Leu Pro Arg Ser Phe

260 265 270

Trp Val Gly Ala Ser Leu Val Cys Ala Gly Ser Ile Leu Cys Trp Leu

275 280 285

Ala Thr Arg Ala Arg Arg Ala Ser Ala Ala Gln Glu Asp Ala Val Ala

290 295 300

Asp Cys Leu

305

<210> 2

<211> 924

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> wex NT 序列

<400> 2

atgaatagca agaaggccac gctgatcgga cttactgcag tggtcctctg gagttccatt 60

gtcggattga ttcgcggcgt cagcgaacat ctcggcgcta ccgggggcgc ggcgatgatg 120

tatagcgttg cctcgctgtt tctgctgttg tcggtcggtt tcccgaaact gggttccttt 180

ccgaaaaaat acctcttgtg gggcagcctg ctgtttgtgt cctacgaact ctgcctgtcg 240

ctctccatcg gttatgccaa tacaggcagg caagcaatcg aagtcagcat ggtcaactat 300

ctgtggccgg cattcacgct catcgccgcc attgcattca accggcagag agcgaactgg 360

atggtggtgc ccggattcat cctctcgatt atcggtatct gctgggtgct gggcggtgac 420

caggggctgg acctggcggg catgcttggc aacgtgcagg acaatccgct cagttatggg 480

ctggcttttt tgggcgccgt gatctgggcc gcctattgca ctgtgacggc ccgcctcgcg 540

aaggggaaga acggagtgac gctgttcttc attcttgtgg cattgacgct ctgggtgaag 600

tttttcttcg gcgatcaccg cccgatgtct ttcagcctgc cggcaattgt ctacctgctc 660

ctggcggcgg ccgcgatggg cttcggctat gcggcatgga atgtcgggat cttgcacggt 720

aacgtgaccg tgctggcggg cgtgtcgtac tttatcccgg ttttttcggc ggcgttgtcc 780

gcgatggtgt tgcatgcgcc gttgccgcga tcgttttggg tgggggcgtc gctggtatgc 840

gccggttcga tactgtgctg gctggcaacc agggccaggc gcgcttcggc cgcgcaagaa 900

gatgcggtgg cggactgttt gtag 924

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> wex-1

<400> 3

tagaggagac acaacatgaa tagcaagaag gccac 35

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> wex-2

<400> 4

ggctcttcct gtttagtcta caaacagtcc gccac 35

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PgapA(-wex)-1

<400> 5

cccttccggt ttagtttgaa gccagtgtga gttgc 35

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PgapA(-wex)-2

<400> 6

cttcttgcta ttcatgttgt gtctcctcta aagattgta 39

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 证实_PgapA-wex-1

<400> 7

cggattatgc caatgatgtg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 证实_PgapA-wex-2

<400> 8

cacgatcacc aacattcagg 20

<210> 9

<211> 314

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Pst AA 序列

<400> 9

Met Lys Asn Gln Arg Lys Ala Thr Leu Ile Gly Leu Val Ala Ile Val

1 5 10 15

Leu Trp Ser Ser Ile Val Gly Leu Ile Arg Gly Val Ser Glu Ser Leu

20 25 30

Gly Ala Thr Gly Gly Ala Val Met Met Tyr Ser Val Ala Ser Val Met

35 40 45

Leu Leu Phe Thr Val Gly Phe Pro Arg Ile Arg Glu Phe Pro Arg Arg

50 55 60

Tyr Leu Val Trp Gly Ser Leu Leu Phe Val Ser Tyr Glu Leu Cys Leu

65 70 75 80

Ala Leu Ser Ile Gly Tyr Ala Asn Ser Ser Arg Gln Ala Ile Glu Val

85 90 95

Gly Met Val Asn Tyr Leu Trp Pro Ala Phe Thr Ile Leu Ala Ala Ile

100 105 110

Leu Phe Asn Arg Gln Gln Ala Asn Leu Leu Ile Val Pro Gly Phe Leu

115 120 125

Ile Ala Ile Leu Gly Ile Cys Trp Val Leu Gly Gly Glu Gln Gly Leu

130 135 140

Asp Leu Ser Gly Met Thr Ala Asn Ile Arg Asp Asn Pro Leu Ser Tyr

145 150 155 160

Gly Leu Ala Phe Ala Gly Ala Val Ile Trp Ala Ala Tyr Cys Thr Val

165 170 175

Thr Thr Arg Ile Ala Gly Gly Lys Asn Gly Val Thr Leu Phe Phe Met

180 185 190

Leu Thr Ala Leu Ala Leu Trp Ala Lys Tyr Leu Ala Ile Gly Gly Glu

195 200 205

Thr Met Glu Phe Ser Tyr His Ala Leu Ile Tyr Leu Val Leu Ala Ala

210 215 220

Ser Ala Met Gly Phe Gly Tyr Ala Ala Trp Asn Val Gly Ile Leu His

225 230 235 240

Gly Asn Val Thr Val Leu Ala Gly Ala Ser Tyr Phe Ile Pro Val Leu

245 250 255

Ser Ala Ala Leu Ala Ala Val Leu Leu Arg Thr Pro Leu Ser Leu Ser

260 265 270

Phe Trp Gln Gly Ala Ala Met Val Cys Ile Gly Ser Ile Leu Cys Trp

275 280 285

Phe Ala Thr Arg Ala Lys Pro Pro Glu Ser Ala Gln Ser Gly Asp Gln

290 295 300

Ala Ser Ala Thr Thr Pro Arg Arg Asn Gly

305 310

<210> 10

<211> 945

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Pst NT 序列

<400> 10

atgaaaaacc agcgtaaagc gaccctcatc gggctcgttg caattgtctt gtggagctcg 60

atcgtcggcc tgatccgggg cgtcagcgag agcctcggcg cgaccggtgg tgccgtcatg 120

atgtacagcg tcgcatcggt aatgctgttg ttcacggtcg gctttccgcg gatacgggag 180

ttcccccgac gctatcttgt ctggggcagc ctgctgttcg tctcgtacga gctgtgcctt 240

gccctgtcca tcggctacgc caacagcagc cgacaggcca tcgaggtcgg catggtcaat 300

tacctgtggc cggccttcac gatcctggcg gcgatcctgt tcaacaggca gcaggccaac 360

ctgctcatcg ttcccggctt cctcatcgcg atcctcggga tctgctgggt gctcggcggg 420

gaacaggggc tggacctgtc cgggatgacg gcgaacatcc gcgacaatcc cctcagctac 480

gggctggcct tcgccggcgc ggtgatctgg gcggcatact gcacggtgac cacgcggatc 540

gccggcggca agaacggtgt cacgctgttc ttcatgctga cggcattggc gctatgggcc 600

aagtacctgg ccatcggcgg ggaaacgatg gaattcagct accacgcgct gatctacctg 660

gtgctggccg cctccgcgat gggcttcggc tatgcggcgt ggaacgtcgg catcctgcac 720

ggcaatgtca ccgtcctcgc tggtgcttcg tatttcatcc cggtgctgtc cgccgccctg 780

gcggccgtac tgttgcgtac gccgctgtcg ctgtcgttct ggcagggtgc cgccatggtc 840

tgcatcgggt cgatcctctg ctggttcgcc acccgtgcga aaccgccaga atcggcgcag 900

tcgggtgacc aggccagcgc aaccacgccg cgtcgaaacg gataa 945

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Pst-1

<400> 11

tagaggagac acaacatgaa aaaccagcgt aaagc 35

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Pst-2

<400> 12

ggctcttcct gtttagttta tccgtttcga cgcgg 35

<210> 13

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PgapA(-Pst)-2

<400> 13

acgctggttt ttcatgttgt gtctcctcta aagattgta 39

<210> 14

<211> 303

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Afa AA 序列

<400> 14

Met Lys Gln Ser Asp Lys Ala Thr Leu Ile Gly Leu Ile Ala Ile Val

1 5 10 15

Leu Trp Ser Thr Ile Val Gly Leu Ile Arg Ser Val Ser Asp Ser Leu

20 25 30

Gly Val Thr Gly Gly Ala Ala Leu Ile Tyr Thr Leu Ala Ser Val Phe

35 40 45

Leu Leu Leu Ser Val Gly Trp Val Arg Leu Arg Asp Phe Pro Arg Arg

50 55 60

Tyr Leu Ile Trp Gly Ser Val Leu Phe Val Cys Tyr Glu Leu Cys Leu

65 70 75 80

Ala Leu Ser Ile Gly Tyr Ala His Asn Ser Gln Gln Ala Ile Glu Val

85 90 95

Gly Met Val Asn Tyr Leu Trp Pro Thr Phe Thr Ile Val Ala Ala Ile

100 105 110

Leu Phe Asn Lys Gln Lys Ala Asn Gly Leu Leu Ala Pro Gly Leu Leu

115 120 125

Leu Ser Met Met Gly Ile Ser Trp Ile Leu Gly Gly Glu Gln Gly Leu

130 135 140

Ser Leu His Asn Ile Trp Leu Asn Val Gln Asp Asn Pro Leu Ser Tyr

145 150 155 160

Gly Leu Ala Phe Ser Gly Ala Leu Ile Trp Ala Gly Tyr Ser Thr Met

165 170 175

Thr Ala Arg Ile Ala Gln Gly Lys Asn Gly Ile Thr Leu Phe Phe Met

180 185 190

Leu Thr Ala Ala Ala Leu Trp Val Lys Tyr Leu Val Gln Gly Ala Pro

195 200 205

Ala Met Thr Phe Thr Val Pro Ala Leu Val Tyr Leu Leu Leu Ala Ala

210 215 220

Met Ala Met Gly Phe Gly Tyr Ala Ala Trp Asn Val Gly Ile Leu His

225 230 235 240

Gly Asn Val Thr Ile Leu Ala Gly Ala Ser Tyr Phe Ile Pro Val Phe

245 250 255

Ser Ala Ala Leu Ser Thr Val Leu Leu Gln Ala Pro Leu Thr Leu Thr

260 265 270

Phe Trp Gln Gly Ser Ser Met Val Cys Leu Gly Ala Leu Leu Cys Trp

275 280 285

Leu Ala Ile Arg Val Arg Lys Pro Arg Ser Leu Lys Ser Ala Ala

290 295 300

<210> 15

<211> 912

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Afa NT 序列

<400> 15

atgaagcaat ctgataaggc aaccctgatc gggctgatcg ccattgtcct ttggagcacg 60

attgtcggcc tgatacgcag cgtcagcgac tctctgggcg taaccggcgg cgctgccctg 120

atttacaccc tggcctcggt ctttcttctt ttatcagtgg gctgggtacg cttgcgcgac 180

ttcccgcgtc gctacctgat ctggggcagt gtgctgtttg tctgctatga actctgcctg 240

gccctgtcca tcggctatgc ccacaacagc cagcaggcaa ttgaagtggg gatggtcaac 300

tatctgtggc cgacctttac cattgtggcc gccatcttgt tcaataagca aaaagccaat 360

gggctgcttg cacccggcct gctcttgtcc atgatgggaa tcagctggat tctgggcggc 420

gagcaaggct tgagcctgca caacatctgg ctgaatgtgc aggacaatcc cttgagctac 480

ggcctggcct ttagcggcgc gctgatctgg gccggctaca gcaccatgac cgcccgcatc 540

gcccagggca aaaatggcat caccctgttt ttcatgctga cggcagcggc cttgtgggtg 600

aagtacctgg tccaaggtgc tcctgccatg acgtttacgg ttcccgcctt ggtgtatttg 660

ctgctggcgg ccatggcgat gggctttggc tatgccgcct ggaatgtcgg tattttgcat 720

ggcaatgtca ccatcctggc cggcgcttcc tactttattc cggtattttc agccgccctg 780

tccaccgttt tgctgcaagc tccgttgacg ctgaccttct ggcaaggctc gtccatggtg 840

tgtttgggtg ccctgctatg ctggctggcc atccgggttc gcaaaccccg gtcactaaaa 900

agcgctgcct ga 912

<210> 16

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Afa-1

<400> 16

tagaggagac acaacatgaa gcaatctgat aaggc 35

<210> 17

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Afa-2

<400> 17

gctcttcctg tttagttcag gcagcgcttt ttagt 35

<210> 18

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PgapA(-Afa)-2

<400> 18

atcagattgc ttcatgttgt gtctcctcta aagattgta 39

<210> 19

<211> 314

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Cne AA 序列

<400> 19

Met Gln Ser Lys Ser Lys Ala Thr Leu Ile Gly Leu Ile Ala Ile Leu

1 5 10 15

Leu Trp Ser Ser Ile Val Gly Leu Ile Arg Gly Val Ser Glu Asn Leu

20 25 30

Gly Ala Thr Gly Gly Ala Ala Met Ile Tyr Thr Val Ala Ser Ala Leu

35 40 45

Leu Leu Leu Thr Val Gly Phe Val Arg Met Gln Asp Phe Pro Arg Arg

50 55 60

Tyr Leu Val Trp Gly Ser Ile Leu Phe Val Ser Tyr Glu Leu Cys Leu

65 70 75 80

Ser Leu Ser Ile Gly Tyr Ala Asn Ser Ser Arg Gln Ala Ile Glu Val

85 90 95

Gly Met Val Asn Tyr Leu Trp Pro Ser Phe Thr Met Leu Cys Ala Ile

100 105 110

Ala Phe Asn Lys Gln Lys Ala Asn Leu Leu Ile Ile Pro Gly Phe Leu

115 120 125

Ile Ala Ile Leu Gly Ile Cys Trp Val Leu Gly Gly Asp Gln Gly Leu

130 135 140

Asp Phe Ala Gly Met Ala Glu Asn Ile Gln Asp Asn Pro Leu Ser Tyr

145 150 155 160

Gly Leu Ala Phe Leu Gly Ala Leu Ile Trp Ala Ala Tyr Cys Thr Val

165 170 175

Thr Asn Arg Ile Ala Glu Gly Arg Asn Gly Ile Thr Leu Phe Phe Met

180 185 190

Leu Thr Ala Leu Ala Leu Trp Ile Lys Tyr Phe Ala Thr Glu Ser Gly

195 200 205

Ser Met Glu Phe Ser Tyr Gln Ala Val Ile Tyr Leu Ala Leu Ala Ala

210 215 220

Ser Ala Met Gly Phe Gly Tyr Ala Ala Trp Asn Val Gly Ile Leu His

225 230 235 240

Gly Asn Val Thr Val Leu Ala Gly Ala Ser Tyr Phe Ile Pro Val Leu

245 250 255

Ser Ala Ala Leu Ala Ala Met Leu Leu Arg Thr Pro Leu Ser Ile Ala

260 265 270

Phe Trp Lys Gly Ala Ser Met Val Cys Ala Gly Ser Ile Leu Cys Trp

275 280 285

Leu Ala Thr Arg Gly Gln Arg Ser Lys Ala Pro Pro Leu Pro Glu Leu

290 295 300

Pro Gln Ser Arg Glu Arg Val Gln Glu Pro

305 310

<210> 20

<211> 945

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Cne NT 序列

<400> 20

atgcaaagca agagcaaagc aactctcatc gggctcatcg cgattctgtt atggagctcg 60

attgtcggcc tgattcgcgg tgtcagcgaa aaccttgggg caaccggtgg ggcggcaatg 120

atctataccg tcgcctcggc cctgctcttg ctgacagtcg gtttcgtcag aatgcaggat 180

tttccccggc gctatctggt ttggggaagc attctgttcg tttcgtacga gctgtgtctt 240

tccttgtcca ttggctacgc caacagcagc aggcaagcca ttgaggtggg gatggtcaac 300

tacttgtggc cgagcttcac catgctgtgt gccatcgcat tcaacaagca gaaggccaac 360

ttgctgatca ttcccggctt cctgatcgcc attctcggga tctgctgggt gcttggcggg 420

gatcagggcc tggacttcgc cgggatggcg gagaacatcc aggacaatcc gctcagctat 480

gggctggcct tccttggtgc cctgatctgg gcggcgtatt gcactgtgac caaccggatt 540

gccgaaggca ggaatggcat cacgctgttc ttcatgctga cagcgctggc gttgtggatc 600

aagtatttcg ccacagagag cgggtcgatg gaatttagct atcaggcagt gatttatctt 660

gcgttggccg cctctgcgat gggattcggc tatgcggcct ggaatgttgg catcctgcat 720

ggcaatgtca ccgtccttgc cggcgcttcc tacttcattc cggtactttc cgccgccctg 780

gcggccatgc tcttgcgtac acccctgtcg atcgccttct ggaagggcgc atccatggta 840

tgtgcggggt cgatcctctg ttggctggca acacgtgggc aacgttccaa ggcacctccg 900

ttgccggaat taccgcagtc gcgcgaacgt gtccaggaac cgtga 945

<210> 21

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Cne-1

<400> 21

tagaggagac acaacatgca aagcaagagc aaagc 35

<210> 22

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Cne-2

<400> 22

ggctcttcct gtttagttca cggttcctgg acacg 35

<210> 23

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PgapA(-Cne)-2

<400> 23

gctcttgctt tgcatgttgt gtctcctcta aagattgta 39

<210> 24

<211> 293

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Eco AA 序列

<400> 24

Met Thr Arg Gln Lys Ala Thr Leu Ile Gly Leu Ile Ala Ile Val Leu

1 5 10 15

Trp Ser Thr Met Val Gly Leu Ile Arg Gly Val Ser Glu Gly Leu Gly

20 25 30

Pro Val Gly Gly Ala Ala Ala Ile Tyr Ser Leu Ser Gly Leu Leu Leu

35 40 45

Ile Phe Thr Val Gly Phe Pro Arg Ile Arg Gln Ile Pro Lys Gly Tyr

50 55 60

Leu Leu Ala Gly Ser Leu Leu Phe Val Ser Tyr Glu Ile Cys Leu Ala

65 70 75 80

Leu Ser Leu Gly Tyr Ala Ala Thr His His Gln Ala Ile Glu Val Gly

85 90 95

Met Val Asn Tyr Leu Trp Pro Ser Leu Thr Ile Leu Phe Ala Ile Leu

100 105 110

Phe Asn Gly Gln Lys Thr Asn Trp Leu Ile Val Pro Gly Leu Leu Leu

115 120 125

Ala Leu Val Gly Val Cys Trp Val Leu Gly Gly Asp Asn Gly Leu His

130 135 140

Tyr Asp Glu Ile Ile Asn Asn Ile Thr Thr Ser Pro Leu Ser Tyr Phe

145 150 155 160

Leu Ala Phe Ile Gly Ala Phe Ile Trp Ala Ala Tyr Cys Thr Val Thr

165 170 175

Asn Lys Tyr Ala Arg Gly Phe Asn Gly Ile Thr Val Phe Val Leu Leu

180 185 190

Thr Gly Ala Ser Leu Trp Val Tyr Tyr Phe Leu Thr Pro Gln Pro Glu

195 200 205

Met Ile Phe Ser Thr Pro Val Met Ile Lys Leu Ile Ser Ala Ala Phe

210 215 220

Thr Leu Gly Phe Ala Tyr Ala Ala Trp Asn Val Gly Ile Leu His Gly

225 230 235 240

Asn Val Thr Ile Met Ala Val Gly Ser Tyr Phe Thr Pro Val Leu Ser

245 250 255

Ser Ala Leu Ala Ala Val Leu Leu Ser Ala Pro Leu Ser Phe Ser Phe

260 265 270

Trp Gln Gly Ala Leu Met Val Cys Gly Gly Ser Leu Leu Cys Trp Leu

275 280 285

Ala Thr Arg Arg Gly

290

<210> 25

<211> 882

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Eco NT 序列

<400> 25

atgacacgac aaaaagcaac gctcataggg ctgatagcga tcgtcctgtg gagcacgatg 60

gtaggattga ttcgcggtgt cagtgagggg ctcggcccgg tcggcggcgc agctgctatc 120

tattcattaa gcgggctgct gttaatcttc acggttggat ttccgcgtat tcggcaaatc 180

ccgaaaggct atttactcgc cgggagtctg ttattcgtca gctatgaaat ctgtctggcg 240

ctttccttag ggtatgcggc gacccatcat caggcgattg aagtgggtat ggtgaactat 300

ctgtggccca gcctgacaat tctctttgcc attctgttta atggtcagaa aaccaactgg 360

ttgattgtac ctggattatt attagccctc gtcggcgtct gttgggtgtt aggcggtgac 420

aatgggttac attatgatga aatcatcaat aatatcacca ccagcccatt gagttatttc 480

ctggcgttca ttggtgcgtt tatctgggca gcctattgca cagtaacgaa taaatacgca 540

cgcggattta atggaattac cgtttttgtc ctgctaacgg gagcaagtct gtgggtttac 600

tattttctta cgccacaacc agaaatgata tttagcacgc ccgtcatgat taaactcatc 660

tctgcggcat ttaccttagg atttgcttat gctgcatgga atgtcggtat attgcatggc 720

aatgtcacca ttatggcggt aggttcgtat tttacgcctg tactttcctc agcgcttgca 780

gccgtgctgc tcagcgcccc gctgtcgttc tcgttctggc aaggcgcgct gatggtctgc 840

ggcggttccc tgctctgctg gctggcgaca cgtcgtggtt aa 882

<210> 26

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Eco-1

<400> 26

tagaggagac acaacatgac acgacaaaaa gcaac 35

<210> 27

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Eco-2

<400> 27

gctcttcctg tttagtttaa ccacgacgtg tcgcc 35

<210> 28

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PgapA(-Eco)-2

<400> 28

tttttgtcgt gtcatgttgt gtctcctcta aagattg 37

<210> 29

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Hrh-3

<400> 29

atagagagtg actcaatgaa tagcaagaag gccac 35

<210> 30

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Hrh-4

<400> 30

tcgagctcgg tacccctaca aacagtccgc cac 33

<210> 31

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PyccA-1

<400> 31

ctctagagga tccccttcca gatcaaatgc gtaa 34

<210> 32

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PyccA(-Hrh)-2

<400> 32

cttcttgcta ttcattgagt cactctctat gacag 35

<210> 33

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Pst-3

<400> 33

atagagagtg actcaatgaa aaaccagcgt aaagc 35

<210> 34

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Pst-4

<400> 34

tcgagctcgg tacccttatc cgtttcgacg cgg 33

<210> 35

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PyccA(-Pst)-2

<400> 35

acgctggttt ttcattgagt cactctctat gacag 35

<210> 36

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Afa-3

<400> 36

atagagagtg actcaatgaa gcaatctgat aaggc 35

<210> 37

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Afa-4

<400> 37

tcgagctcgg taccctcagg cagcgctttt tagt 34

<210> 38

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PyccA(-Afa)-2

<400> 38

atcagattgc ttcattgagt cactctctat gacag 35

<210> 39

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Cne-3

<400> 39

atagagagtg actcaatgca aagcaagagc aaagc 35

<210> 40

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Cne-4

<400> 40

tcgagctcgg taccctcacg gttcctggac acg 33

<210> 41

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PyccA(-Cne)-2

<400> 41

gctcttgctt tgcattgagt cactctctat gacag 35

<210> 42

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Eco-3

<400> 42

atagagagtg actcaatgac acgacaaaaa gcaac 35

<210> 43

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Eco-4

<400> 43

tcgagctcgg tacccttaac cacgacgtgt cgcc 34

<210> 44

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PyccA(-Eco)-2

<400> 44

tttttgtcgt gtcattgagt cactctctat gacag 35

<210> 45

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Pspl7-trpE(S38R)_L-1

<400> 45

tcgagctcgg tacccaaaca actgcgacgt gtgtc 35

<210> 46

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Pspl7-trpE(S38R)_L-2

<400> 46

catgaagcgc cggtacctta atcatttttg ggttc 35

<210> 47

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Pspl7-trpE(S38R)_R-1

<400> 47

gccctgttgg aacgcgctga tatcaccacc aagaa 35

<210> 48

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Pspl7-trpE(S38R)_R-2

<400> 48

ctctagagga tccccagatg tcaccgttgt aaatg 35

<210> 49

<211> 294

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> spl7 启动子序列

<400> 49

ggcgcttcat gtcaacaatc tttaacgttt tcaagttcac aagtcgtgtt caaatggtga 60

caagattgga cactgtgctg aattggcacc aagccctcat aaatgataga tctaaatcga 120

atatcaatat atggtctgtt tattggaacg cgtcccagtg gctgagacgc atccgctaaa 180

gccccaggaa ccctgtgcag aaagaacaaa taatcgtgaa ttttggcagc aacagcaatt 240

cctgctacaa ttgaaaacgt gcaaaagcat agattattgg aggagatcaa aaca 294

<210> 50

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Pspl7-1

<400> 50

cccaaaaatg attaaggtac cggcgcttca tgtca 35

<210> 51

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Pspl7-2

<400> 51

gggattcgtg ctcatgatat ctgttttgat ctcctcc 37

<210> 52

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> trpE(S38R)-1

<400> 52

atcaaaacag atatcatgag cacgaatccc catgt 35

<210> 53

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> trpE(S38R)-2

<400> 53

gtggtgatat cagcgcgttc caacagggct gcatc 35

<210> 54

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 证实_Pspl7-trpE(S38R)-1

<400> 54

gaagaagagg ctgcagatg 19

<210> 55

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 证实_Pspl7-trpE(S38R)-2

<400> 55

gatcagcgcc atcatgtt 18

<210> 56

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Pn-tkt_L-1

<400> 56

tcgagctcgg tacccaaact ttgagtgggt gcgtg 35

<210> 57

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Pn-tkt_L-2

<400> 57

tcgagctacg agggcggttc ccagcccttc attag 35

<210> 58

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Pn-tkt_R-1

<400> 58

attaacggtt aattgattct ggacgtcatg actac 35

<210> 59

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Pn-tkt_R-2

<400> 59

ctctagagga tccccgcctc gatgatgcag tcgtc 35

<210> 60

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Pn-tkt-1

<400> 60

gaagggctgg gaaccgccct cgtagctcga gagtt 35

<210> 61

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Pn-tkt-2

<400> 61

catgacgtcc agaatcaatt aaccgttaat ggagtcc 37

<210> 62

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 证实_Pn-tkt-1

<400> 62

acccagaacc ccaaattttc 20

<210> 63

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 证实_Pn-tkt-2

<400> 63

ttgagttcga caactttgg 19

<210> 64

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 64

tgcaatgcat aacaacgcag tcgcactatt tttcactgga gagaagccct gtgtaggctg 60

gagctgcttc 70

<210> 65

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 65

tgcaatgcat aacaacgcag tcgcactatt tttcactgga gagaagccct gtccatatga 60

atatcctcct 70

<210> 66

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 66

gggcaggatc tcctgtcatc 20

<210> 67

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 67

aaatgtcgga taaggcaccg 20

<210> 68

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 68

tgtaatattc acagggatca ctgtaattaa aataaatgaa ggattatgta gtgtaggctg 60

gagctgcttc 70

<210> 69

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 69

tgtagggtaa gagagtggct aacatcctta tagccactct gtagtattaa gtccatatga 60

atatcctcct 70

<210> 70

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 70

acatccttat agccactctg 20

<210> 71

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 71

tacaaccggg ggaggcattt tgcttccccc gctaacaatg gcgacatatt gtgtaggctg 60

gagctgcttc 70

<210> 72

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 72

gcattcggtg cacgatgcct gatgcgccac gtcttatcag gcctacaaaa gtccatatga 60

atatcctcct 70

<210> 73

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 73

aggacggata aggcgttcac 20

<210> 74

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> trpE-1

<400> 74

gaattcatgc aaacacaaaa accgac 26

<210> 75

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> trpE-2

<400> 75

gaattctcag aaagtctcct gtgca 25

<210> 76

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> trpE(P21S)-1

<400> 76

cgcttatcgc gacaattcca ccgcgctttt tcaccag 37

<210> 77

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> trpE(P21S)-2

<400> 77

ctggtgaaaa agcgcggtgg aattgtcgcg ataagcg 37

Claims

1.一种生产L-色氨酸的微生物，其中，所述微生物中被引入和/或增强具有L-色氨酸输出活性的蛋白质，所述蛋白质由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成，

其中，与属于棒杆菌属或埃希氏菌属的相应野生型微生物相比，所述微生物的L-色氨酸输出活性增强，并且

其中，所述微生物来源于谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌。

2.一种用于生产L-色氨酸的方法，其包括：

在培养基中培养生产L-色氨酸的微生物，其中所述微生物来源于谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌，并且其中所述微生物被修饰以使得表达由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成的具有L-色氨酸输出活性的蛋白质；并且

从所培养的微生物或所培养的培养基中回收所述L-色氨酸。