JP2021509808A - 新規l−トリプトファン排出タンパク質及びそれを用いたl−トリプトファンを生産する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
大腸菌由来EamA familyであるYdeDのアミノ酸配列をquery配列とし、NCBIとKEGG databaseに基づいたPSI−BLAST探索の結果、トリプトファンを排出する膜タンパク質と考えられる30種の候補遺伝子とそれを保有する生物を選定した。それらのうち生産菌株に適用できるバイオセーフティーレベル(Biosafety level)と確保可能性を考慮して、表1のように5種の生物を選定した。
実施例1で選定したヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来の膜タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号1で表されるアミノ酸配列を有する。米国国立衛生研究所の遺伝子バンク(NIH GenBank)から膜タンパク質をコードする遺伝子及びその周辺の塩基配列に関する情報(登録番号NZ_LFLU01000012.1)を得た。
配列番号3(wex−1)
TAGAGGAGACACAACATGAATAGCAAGAAGGCCAC
配列番号4(wex−2)
ggctcttcctgtttAGTCTACAAACAGTCCGCCAC
配列番号5(PgapA−1)
cccttccggtttAGTTTGAAGCCAGTGTGAGTTGC
配列番号6(PgapA(−wex)−2)
CTTCTTGCTATTCATGTTGTGTCTCCTCTAAAGATTGTA
配列番号7(Confirm_PgapA−wex−1)
CGGATTATGCCAATGATGTG
配列番号8(Confirm_PgapA−wex−2)
CACGATCACCAACATTCAGG
実施例1で選定したシュードモナス・スタッツェリ由来の膜タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号9で表されるアミノ酸配列を有する。米国国立衛生研究所の遺伝子バンク(NIH GenBank)から当該遺伝子及びその周辺の塩基配列に関する情報(登録番号NC_018177.1)を得た。
配列番号11(Pst−1)
TAGAGGAGACACAACATGAAAAACCAGCGTAAAGC
配列番号12(Pst−2)
ggctcttcctgtttAGTTTATCCGTTTCGACGCGG
配列番号13(PgapA(−Pst)−2)
ACGCTGGTTTTTCATGTTGTGTCTCCTCTAAAGATTGTA
実施例1で選定したアルカリゲネス・フェカリス由来の膜タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号14で表されるアミノ酸配列を有する。米国国立衛生研究所の遺伝子バンク(NIH GenBank)から当該遺伝子及びその周辺の塩基配列に関する情報(登録番号NZ_CP013119.1)を得た。
配列番号16(Afa−1)
TAGAGGAGACACAACATGAAGCAATCTGATAAGGC
配列番号17(Afa−2)
gctcttcctgtttAGTTCAGGCAGCGCTTTTTAGT
配列番号18(PgapA(−Afa)−2)
ATCAGATTGCTTCATGTTGTGTCTCCTCTAAAGATTGTA
実施例1で選定したカプリアビダス・ネカトール由来の膜タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号19で表されるアミノ酸配列を有する。米国国立衛生研究所の遺伝子バンク(NIH GenBank)から当該遺伝子及びその周辺の塩基配列に関する情報(登録番号AM260480.1)を得た。
配列番号21(Cne−1)
TAGAGGAGACACAACATGCAAAGCAAGAGCAAAGC
配列番号22(Cne−2)
ggctcttcctgtttAGTTCACGGTTCCTGGACACG
配列番号23(PgapA(−Cne)−2)
GCTCTTGCTTTGCATGTTGTGTCTCCTCTAAAGATTGTA
実施例1で選定した大腸菌由来の膜タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号24で表されるアミノ酸配列を有する。米国国立衛生研究所の遺伝子バンク(NIH GenBank)から前記遺伝子及びその周辺の塩基配列に関する情報(登録番号NC_000913.3)を得た。
配列番号26(Eco−1)
TAGAGGAGACACAACATGACACGACAAAAAGCAAC
配列番号27(Eco−2)
gctcttcctgtttAGTTTAACCACGACGTGTCGCC
配列番号28(PgapA(−Eco)−2)
TTTTTGTCGTGTCATGTTGTGTCTCCTCTAAAGATTG
実施例2〜6で作製した5種のコリネバクテリウム・グルタミカム菌株ATCC13869::PgapA−Hrh、ATCC13869::PgapA−Pst、ATCC13869::PgapA−Afa、ATCC13869::PgapA−Cne、ATCC13869::PgapA−Ecoがトリプトファン排出能の活性を有するか否かを確認するために、トリプトファンのアナログ(analogue)と他の芳香族アミノ酸であるフェニルアラニンのアナログを用いた最小阻止濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)実験を行った。5種の膜タンパク質をコードする遺伝子を導入した菌株を最小液体培地において30℃で24時間培養し、その後3×103個及び3×104個の細胞に希釈してトリプトファンのアナログ又はフェニルアラニンのアナログを添加した最小固体培地においてスポット(spotting)培養した。
最小培地(pH7.2)
グルコース10g,KH2PO4 1g,K2HPO4 2g,MgSO47H2O 0.4g,尿素2g,(NH4)2SO4 5g,NaCl 0.5g,ニコチンアミド5μg,パントテン酸カルシウム0.1μg,ビオチン0.2μg,チアミンHCl 3μg,Trace elements solution 1ml(蒸留水1リットル中)
Trace elements solution
Na2B4O710H2O 0.09g,(NH4)6Mo7O274H2O 0.04g,ZnSO47H2O 0.01g,CuSO45H2O 0.27g,MnCl24H2O 0.01g,FeCl36H2O 1g,CaCl2 0.01g(蒸留水1リットル中)
大腸菌菌株においても、実施例1で選択した様々な微生物由来の遺伝子のトリプトファン又はそのアナログ耐性の確認のために、各遺伝子を大腸菌発現ベクターであるpCL1920にクローニングし、大腸菌菌株W3110のyccAプロモーターで発現させた。
配列番号29(Hrh−3)
ATAGAGAGTGACTCAATGAATAGCAAGAAGGCCAC
配列番号30(Hrh−4)
TCGAGCTCGGTACCCCTACAAACAGTCCGCCAC
配列番号31(PyccA−1)
CTCTAGAGGATCCCCTTCCAGATCAAATGCGTAA
配列番号32(PyccA(−Hrh)−2)
CTTCTTGCTATTCATTGAGTCACTCTCTATGACAG
配列番号33(Pst−3)
ATAGAGAGTGACTCAATGAAAAACCAGCGTAAAGC
配列番号34(Pst−4)
TCGAGCTCGGTACCCTTATCCGTTTCGACGCGG
配列番号35(PyccA(−Pst)−2)
ACGCTGGTTTTTCATTGAGTCACTCTCTATGACAG
配列番号36(Afa−3)
ATAGAGAGTGACTCAATGAAGCAATCTGATAAGGC
配列番号37(Afa−4)
TCGAGCTCGGTACCCTCAGGCAGCGCTTTTTAGT
配列番号38(PyccA(−Afa)−2)
ATCAGATTGCTTCATTGAGTCACTCTCTATGACAG
配列番号39(Cne−3)
ATAGAGAGTGACTCAATGCAAAGCAAGAGCAAAGC
配列番号40(Cne−4)
TCGAGCTCGGTACCCTCACGGTTCCTGGACACG
配列番号41(PyccA(−Cne)−2)
GCTCTTGCTTTGCATTGAGTCACTCTCTATGACAG
配列番号42(Eco−3)
ATAGAGAGTGACTCAATGACACGACAAAAAGCAAC
配列番号43(Eco−4)
TCGAGCTCGGTACCCTTAACCACGACGTGTCGCC
配列番号44(PyccA(−Eco)−2)
TTTTTGTCGTGTCATTGAGTCACTCTCTATGACAG
実施例8で作製した5種の遺伝子を過剰発現する大腸菌菌株W3110/pCL1920−PyccA−Hrh、W3110/pCL1920−PyccA−Pst、W3110/pCL1920−PyccA−Afa、W3110/pCL1920−PyccA−Cne、W3110/pCL1920−PyccA−Ecoの耐性確認のために、トリプトファンとフェニルアラニンのアナログ(analogue)を用いた最小阻止濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)実験を行った。5種の遺伝子を過剰発現する大腸菌菌株は、50ug/mlのスペクチノマイシン(spectinomycin)を添加したM9最小液体培地において37℃で15時間培養し、その後104個及び105個の細胞に希釈してトリプトファンのアナログ又はフェニルアラニンのアナログを添加したM9グルコース最小固体培地(50ug/mlのスペクチノマイシン添加)においてスポット(spotting)培養した。最小阻止濃度実験のために、2mg/mlのパラフルオロフェニルアラニン(p’-fluoro-DL-phenylalanine)又は0.7ug/mlの5’−フルオロトリプトファン(5-fluoro-DL-trytophan)をM9最小固体培地に添加し、48時間後に細胞の成長を観察した(表3)。
L−トリプトファン生産菌株は、野生種のコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869から開発した。野生型のコリネバクテリウム・グルタミカムはL−トリプトファンを生産できないか、生産したとしても極微量のL−トリプトファンを生産するにすぎないので、生産に必須の生合成経路を強化した菌株を親株として用いることを試みた。具体的には、L−トリプトファン生合成遺伝子のオペロン(operon)におけてプロモーター強化により発現を向上させた。また、TrpEタンパク質のフィードバック阻害(feedback inhibition)を解消するために、trpEの38番目のアミノ酸であるセリン(Serine)をアルギニン(Arginine)に置換した(非特許文献8)。
配列番号45(Pspl7−trpE(S38R)_L−1)
TCGAGCTCGGTACCCAAACAACTGCGACGTGTGTC
配列番号46(Pspl7−trpE(S38R)_L−2)
CATGAAGCGCCGGTACCTTAATCATTTTTGGGTTC
配列番号47(Pspl7−trpE(S38R)_R−1)
GCCCTGTTGGAACGCGCTGATATCACCACCAAGAA
配列番号48(Pspl7−trpE(S38R)_R−2)
CTCTAGAGGATCCCCAGATGTCACCGTTGTAAATG
配列番号50(Pspl7−1)
CCCAAAAATGATTAAGGTACCGGCGCTTCATGTCA
配列番号51(Pspl7−2)
GGGATTCGTGCTCATGATATCTGTTTTGATCTCCTCC
配列番号52(trpE(S38R)−1)
ATCAAAACAGATATCATGAGCACGAATCCCCATGT
配列番号53(trpE(S38R)−2)
GTGGTGATATCAGCGCGTTCCAACAGGGCTGCATC
配列番号54(Confirm_Pspl7−trpE(S38R)−1)
GAAGAAGAGGCTGCAGATG
配列番号55(Confirm_Pspl7−trpE(S38R)−2)
GATCAGCGCCATCATGTT
配列番号56(Pn−tkt_L−1)
TCGAGCTCGGTACCCAAACTTTGAGTGGGTGCGTG
配列番号57(Pn−tkt_L−2)
TCGAGCTACGAGGGCGGTTCCCAGCCCTTCATTAG
配列番号58(Pn−tkt_R−1)
ATTAACGGTTAATTGATTCTGGACGTCATGACTAC
配列番号59(Pn−tkt_R−2)
CTCTAGAGGATCCCCGCCTCGATGATGCAGTCGTC
配列番号60(Pn−tkt−1)
GAAGGGCTGGGAACCGCCCTCGTAGCTCGAGAGTT
配列番号61(Pn−tkt−2)
CATGACGTCCAGAATCAATTAACCGTTAATGGAGTCC
配列番号62(Confirm_Pn−tkt−1)
ACCCAGAACCCCAAATTTTC
配列番号63(Confirm_Pn−tkt−2)
TTGAGTTCGACAACTTTGG
実施例7においてトリプトファンのアナログ(analogue)を用いた最小阻止濃度で優れた活性を示したヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来の遺伝子を、参考例1で作製したトリプトファン生産菌株であるCA04−8352に導入した。そのために、実施例2で作製したヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来の遺伝子導入用ベクターpDZTn−PgapA−Hrhをトリプトファン生産菌株であるCA04−8352菌株にエレクトロポレーションにより形質転換し、実施例2と同様の過程を経て、トランスポゾン遺伝子の間に1コピーのヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来の遺伝子を挿入した菌株を得た。これをCA04−8405と命名した。
種培地(pH7.0)
グルコース20g,ペプトン10g,酵母抽出物5g,尿素1.5g,KH2PO4 4g,K2HPO4 8g,MgSO47H2O 0.5g,ビオチン100μg,チアミンHCl 1000μg,パントテン酸カルシウム2000μg,ニコチンアミド2000μg(蒸留水1リットル中)
生産培地(pH7.0)
グルコース30g,(NH4)2SO4 15g,MgSO47H2O 1.2g,KH2PO4 1g,酵母抽出物5g,ビオチン900μg,チアミン塩酸塩4500μg,パントテン酸カルシウム4500μg,CaCO3 30g(蒸留水1リットル中)。
ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来の遺伝子を導入したコリネバクテリウム・グルタミカムトリプトファン生産菌株CA04−8405においてトリプトファン排出能が向上することにより細胞内のトリプトファン濃度が低下するかを明確に確認するために、CA04−8405と親株CA04−8352を対象として、有機溶媒を用いた抽出方法により細胞内のトリプトファン濃度を測定した。
エシェリキア属L−トリプトファン生産菌株は、野生型の大腸菌W3110から開発した。L−トリプトファン排出活性を有するタンパク質が発現するように改変することによりL−トリプトファンの生産量が画期的に増加するかを確認するために、L−トリプトファンを生産するように作製した菌株を親株として用いた。具体的には、コリスメート(Chorismate)からのL−トリプトファン生産に関与するL−トリプトファン生合成遺伝子の(trpEDCBA)発現は、TrpRにより抑制される。よって、それをコードするtrpR遺伝子を除去した。また、L−トリプトファン生産向上に伴うTrpEポリペプチドのフィードバック阻害(feedback inhibition)を解消するために、TrpEのN末端から21番目のアミノ酸であるプロリン(Proline)をセリン(Serine)に置換した(非特許文献10)。
配列番号64(△mtr cassette−1)
TGCAATGCATAACAACGCAGTCGCACTATTTTTCACTGGAGAGAAGCCCTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
配列番号65(△mtr cassette−2)
TGCAATGCATAACAACGCAGTCGCACTATTTTTCACTGGAGAGAAGCCCTGTCCATATGAATATCCTCCT
配列番号66(Confirm_Cassette−1)
GGGCAGGATCTCCTGTCATC
配列番号67(Confirm_△mtr−2)
AAATGTCGGATAAGGCACCG
配列番号68(△tnaA cassette−1)
TGTAATATTCACAGGGATCACTGTAATTAAAATAAATGAAGGATTATGTAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
配列番号69(△tnaA cassette−2)
TGTAGGGTAAGAGAGTGGCTAACATCCTTATAGCCACTCTGTAGTATTAAGTCCATATGAATATCCTCCT
配列番号70(Confirm_△tnaA−2)
ACATCCTTATAGCCACTCTG
配列番号71(△trpR cassette−1)
TACAACCGGGGGAGGCATTTTGCTTCCCCCGCTAACAATGGCGACATATTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
配列番号72(△trpR cassette−2)
GCATTCGGTGCACGATGCCTGATGCGCCACGTCTTATCAGGCCTACAAAAGTCCATATGAATATCCTCCT
配列番号73(Confirm_△trpR−2)
AGGACGGATAAGGCGTTCAC
配列番号74(trpE−1)
GAATTCATGCAAACACAAAAACCGAC
配列番号75(trpE−2)
GAATTCTCAGAAAGTCTCCTGTGCA
配列番号76(trpE(P21S)−1)
CGCTTATCGCGACAATTCCACCGCGCTTTTTCACCAG
配列番号77(trpE(P21S)−2)
CTGGTGAAAAAGCGCGGTGGAATTGTCGCGATAAGCG
実施例8で作製したpCL1920−PyccA−Hrhを参照例2で作製したCA04−4303に導入し、ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来の遺伝子が過剰発現する形質転換体であるCA04−4306を作製した。また、対照群としてpCL1920ベクターをCA04−4303に形質転換した。この2つの菌株CA04−4303/pCL1920、CA04−4306のL−トリプトファン生産量を確認するために、50mg/Lのスペクチノマイシン(Spectinomycin)を含むLB液体培地に12時間培養した。次に、生産培地25mlを含有する250mlのコーナーバッフルフラスコに初期OD600値が0.01になるように接種し、37℃、200rpmで48時間振盪培養した。培養終了後に、HPLCによりL−トリプトファンの生産量を測定した。
生産培地(pH7.0)
グルコース70g,(NH4)2SO4 20g,MgSO47H2O 1g,KH2PO4 2g,酵母抽出物2.5g,Na−citrate 5g,NaCl 1g,CaCO3 40g(蒸留水1リットル中)。
Claims (8)
- 配列番号1のアミノ酸配列を含む、L−トリプトファン排出活性を有するタンパク質が発現するように改変された、L−トリプトファンを生産する微生物。
- 前記微生物は、コリネバクテリウム属又はエシェリキア属である、請求項1に記載のL−トリプトファンを生産する微生物。
- 前記微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム又はエシェリキア・コリである、請求項2に記載のL−トリプトファンを生産する微生物。
- 配列番号1のアミノ酸配列を含む、L−トリプトファン排出活性を有するタンパク質が発現するように改変された、L−トリプトファンを生産する微生物を培地で培養するステップと、前記培養した微生物又は培地からL−トリプトファンを回収するステップとを含む、L−トリプトファンの生産方法。
- 前記微生物は、コリネバクテリウム属又はエシェリキア属である、請求項4に記載のL−トリプトファンの生産方法。
- 前記微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム又はエシェリキア・コリである、請求項5に記載のL−トリプトファンの生産方法。
- 配列番号1のアミノ酸配列を含む、L−トリプトファン排出活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
- 配列番号1のアミノ酸配列を含む、L−トリプトファン排出活性を有するタンパク質が微生物中で発現するように改変するステップを含む、微生物のトリプトファン排出能を向上させる方法。
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