WO2022231027A1 - 신규한 변이체 및 이를 이용한 l-트립토판 생산 방법 - Google Patents

신규한 변이체 및 이를 이용한 l-트립토판 생산 방법 Download PDF

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WO2022231027A1
WO2022231027A1 PCT/KR2021/005387 KR2021005387W WO2022231027A1 WO 2022231027 A1 WO2022231027 A1 WO 2022231027A1 KR 2021005387 W KR2021005387 W KR 2021005387W WO 2022231027 A1 WO2022231027 A1 WO 2022231027A1
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polypeptide
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장진숙
서창일
김현아
정무영
허란
유혜련
김비나
손성광
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씨제이제일제당 (주)
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine

Definitions

  • the present application relates to a novel variant, an Escherichia coli strain comprising the variant, and a method for producing L-tryptophan using the strain.
  • the present inventors completed the present application by developing a novel variant that increases L-tryptophan production, an Escherichia coli strain containing the variant, and a method for producing L-tryptophan using the strain.
  • One object of the present application is to include (i) one or more variants of the present application, (ii) one or more polynucleotides encoding the variants, or (iii) a combination thereof, and having L-tryptophan-producing ability, Querichia coli ( Escherichia coli ) It is to provide a strain.
  • Another object of the present application is to include (i) one or more variants of the present application, (ii) one or more polynucleotides encoding the variant, or (iii) a combination thereof, and having L-tryptophan-producing ability, It is to provide a method for producing L- tryptophan, comprising the step of culturing an Escherichia coli strain in a medium.
  • One aspect of the present application is (i) any one or more variants selected from the group consisting of the following (a) to (k), (ii) one or more polynucleotides encoding the variant, or (iii) a combination thereof It provides an Escherichia coli strain comprising a.
  • cytosine permease variant consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17, wherein isoleucine, an amino acid corresponding to position 401 of SEQ ID NO: 19, is substituted with threonine;
  • a tautomerase pptA variant consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21 in which arginine, an amino acid corresponding to position 31 of SEQ ID NO: 23, is substituted with histidine;
  • (k) a water-soluble pyridine nucleotide transhydrogenase mutant comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 41 in which alanine, an amino acid corresponding to position 145 of SEQ ID NO: 43, is substituted with valine.
  • one or more may be 1 or more, 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, 10 or more, or 11 or more, but is not limited thereto.
  • the strain of the present application is (i) 1 or more, 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more selected from the group consisting of (a) to (k), 9 or more, 10 or more, or 11 or more variants, (ii) 1 or more, 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, 10 or more, or 11 or more encoding said variant polynucleotides, or (iii) a combination thereof, but is not limited thereto.
  • the variant and the variant of (ii) above may be selected from the group consisting of (a) to (k), but may be the same or different, but is not limited thereto.
  • the strain of the present application may include (a) a polynucleotide encoding the variant; and (b) a strain comprising a combination of variants, but is not limited thereto.
  • variants of the present application are set forth in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 37 and SEQ ID NO: 41 1 or more, 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, 10 or more, or 11 or more of the amino acid sequence; essentially consisting of).
  • variant of the present application may include any one or more amino acid sequences selected from the group consisting of the following (aa) to (kk).
  • amino acid corresponding to position 100 based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is asparagine, and at least 70%, 75%, 80% of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 , an amino acid sequence having at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% or 99.9% homology or identity;
  • the amino acid corresponding to position 786 based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 is asparagine, and at least 70%, 75%, 80% of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 , an amino acid sequence having at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% or 99.9% homology or identity;
  • amino acid corresponding to position 137 based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9 is aspartic acid, and at least 70%, 75%, 80% of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9 an amino acid sequence having at least %, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% or 99.9% homology or identity;
  • the amino acid corresponding to position 149 based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 is leucine, and at least 70%, 75%, 80% of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13 , an amino acid sequence having at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% or 99.9% homology or identity;
  • the amino acid corresponding to position 401 based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17 is threonine, and at least 70%, 75%, 80% of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17 , an amino acid sequence having at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% or 99.9% homology or identity;
  • the amino acid corresponding to position 31 based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 21 is histidine, and at least 70%, 75%, 80% from the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 21 , an amino acid sequence having at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% or 99.9% homology or identity;
  • (gg) the amino acid corresponding to position 156 based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25 is isoleucine, and at least 70%, 75%, 80% with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25 an amino acid sequence having at least %, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% or 99.9% homology or identity;
  • amino acid corresponding to position 133 based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31 is phenylalanine, and at least 70%, 75%, 80% of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 29 , an amino acid sequence having at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% or 99.9% homology or identity;
  • the amino acid corresponding to position 259 based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 is asparagine, and at least 70%, 75%, 80% of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 33 , an amino acid sequence having at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% or 99.9% homology or identity;
  • the amino acid corresponding to position 26 based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39 is lysine, and at least 70%, 75%, 80% of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 37 , 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% or an amino acid sequence having at least 99.9% homology or identity, and
  • the amino acid corresponding to position 145 based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43 is valine, and at least 70%, 75%, 80% from the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 41 , 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% or an amino acid sequence having at least 99.9% homology or identity.
  • variants having an amino acid sequence in which some sequences are deleted, modified, substituted, conservatively substituted or added are also included within the scope of the present application. is self-evident
  • sequence additions or deletions naturally occurring mutations, silent mutations or conservation within the N-terminus, C-terminal and/or within the amino acid sequence that do not alter the function of the variants of the present application It is a case of having an enemy substitution.
  • conservative substitution means substituting an amino acid for another amino acid having similar structural and/or chemical properties. Such amino acid substitutions may generally occur based on similarity in the polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and/or amphipathic nature of the residues. Typically, conservative substitutions may have little or no effect on the activity of the protein or polypeptide.
  • variant means that one or more amino acids are conservatively substituted and/or modified so that they differ from the amino acid sequence before the mutation of the variant, but have functions or properties. refers to a polypeptide that is maintained. Such variants can generally be identified by modifying one or more amino acids in the amino acid sequence of the polypeptide and evaluating the properties of the modified polypeptide. That is, the ability of the variant may be increased, unchanged, or decreased compared to the polypeptide before the mutation. In addition, some variants may include variants in which one or more portions, such as an N-terminal leader sequence or a transmembrane domain, have been removed.
  • variants may include variants in which a portion is removed from the N- and/or C-terminus of the mature protein.
  • variant may be used interchangeably with terms such as mutant, modified, mutant polypeptide, mutated protein, mutant and mutant (in English, modified, modified polypeptide, modified protein, mutant, mutein, divergent, etc.) and, as long as it is a term used in a mutated sense, it is not limited thereto.
  • the variant includes a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in which aspartic acid, which is the amino acid corresponding to the 100th position of SEQ ID NO: 3, is substituted with asparagine; a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 in which serine, an amino acid corresponding to position 786 of SEQ ID NO: 7, is substituted with asparagine; a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9 in which glycine, an amino acid corresponding to position 137 of SEQ ID NO: 11, is substituted with aspartic acid; a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13 in which proline, an amino acid corresponding to position 149 of SEQ ID NO: 15, is substituted with leucine; a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17 in which isoleucine, an amino acid corresponding to position 401 of
  • variants may include deletions or additions of amino acids that have minimal effect on the properties and secondary structure of the polypeptide.
  • a signal (or leader) sequence involved in protein translocation may be conjugated to the N-terminus of the mutant, either co-translationally or post-translationally.
  • the variants may also be conjugated with other sequences or linkers for identification, purification, or synthesis.
  • the term 'homology' or 'identity' refers to the degree of similarity between two given amino acid sequences or nucleotide sequences and may be expressed as a percentage.
  • the terms homology and identity can often be used interchangeably.
  • Sequence homology or identity of a conserved polynucleotide or polypeptide is determined by standard alignment algorithms, with default gap penalties established by the program used may be used. Substantially homologous or identical sequences are generally capable of hybridizing with all or part of a sequence under moderate or high stringent conditions. It is apparent that hybridization also includes hybridization with polynucleotides containing common codons or codons taking codon degeneracy into account in the polynucleotide.
  • a GAP program can be defined as the total number of symbols in the shorter of the two sequences divided by the number of similarly aligned symbols (ie, nucleotides or amino acids).
  • Default parameters for the GAP program are: (1) a binary comparison matrix (containing values of 1 for identity and 0 for non-identity) and Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation , pp. 353-358 (1979), Gribskov et al (1986) Nucl. Acids Res. 14: weighted comparison matrix of 6745 (or EDNAFULL (EMBOSS version of NCBI NUC4.4) substitution matrix); (2) a penalty of 3.0 for each gap and an additional 0.10 penalty for each symbol in each gap (or a gap open penalty of 10, a gap extension penalty of 0.5); and (3) no penalty for end gaps.
  • the variants of the present application are deoxyguanosine triphosphate triphosphohydrolase, copper exporting P-type ATP A, ferrocheratase, hydrolase, cytosine permease, tautomerase pptA, Protein HtrL, H(+)/Cl(-) exchange transporter, cyanate transporter family protein, isocitrate dehydrogenase kinase/phosphatase, and water-soluble pyridine nucleotide transhydrogenase may have at least one activity.
  • one or more variants or a combination thereof of the present application may have an activity such that L-tryptophan production capacity is increased compared to the wild-type polypeptide.
  • deoxyguanosinetriphosphate triphosphohydrolase is a polypeptide that catalyzes the hydrolysis of dGTP.
  • deoxyguanosine triphosphate triphosphohydrolase of the present application may be used in combination with dGTPase, dGTP triphosphatase or deoxyguanosine triphosphatase.
  • sequence of the deoxyguanosine triphosphate triphosphohydrolase can be obtained from GenBank of NCBI, a known database. Specifically, it may be a polypeptide having deoxyguanosine triphosphate triphosphohydrolase activity encoded by dgt, but is not limited thereto.
  • the term "copper-exporting P-type ATPase A” is a polypeptide that catalyzes the release of copper ions from the cytoplasm to the periplasm.
  • Cooper Exporting P-type ATP AIDS A of the present application may be used interchangeably as CopA.
  • the cooper-exporting P-type ATP A sequence can be obtained from a known database, GenBank of NCBI. Specifically, it may be a polypeptide having P-type ATP A activity encoded by copA, but is not limited thereto.
  • ferrochelatase is a polypeptide that catalyzes the production of protoheme (heme).
  • ferrochelatase of the present application may be used in combination with protoporphyrin ferrochelatase or FECH.
  • the ferrocheratase sequence can be obtained from GenBank of NCBI, which is a known database. Specifically, it may be a polypeptide having a ferrocheratase activity encoded by hemH, but is not limited thereto.
  • hydrolase is a polypeptide that catalyzes hydrolysis.
  • the hydrolase of the present application may be used in combination as a hydrolase.
  • the hydrolase sequence can be obtained from GenBank of NCBI, which is a known database. Specifically, it may be a polypeptide having a hydrolase activity encoded by ynbC, but is not limited thereto.
  • cytosine permease is a polypeptide that transports cytosine into a cell.
  • the cytosine permease of the present application may be used in combination as a cytosine permease.
  • the cytosine permease sequence can be obtained from GenBank of NCBI, which is a known database. Specifically, it may be a polypeptide having cytosine permease activity encoded by codB, but is not limited thereto.
  • tautomerase pptA refers to the enol isomer of phenylpyruvate, 2-hydroxy-2,4-pentadienoate and (p-hydroxyphenyl)pyruvate as a substrate. It is a mutagenic enzyme (isomerase). Specifically, tautomerase pptA of the present application may be used in combination with 4-oxalocrotonate tautomerase or 4-OT. In the present application, the sequence of the tautomerase pptA can be obtained from GenBank of NCBI, which is a known database. Specifically, it may be a polypeptide having tautomerase pptA activity encoded by pptA, but is not limited thereto.
  • protein HtrL (Protein HtrL) is a polypeptide involved in lipopolysaccharide biosynthesis.
  • the protein HtrL of the present application may be used interchangeably with the protein YibB or HtrL.
  • sequence of the protein HtrL can be obtained from GenBank of NCBI, which is a known database. Specifically, it may be a polypeptide having a protein HtrL activity encoded by yibB, but is not limited thereto.
  • H(+)/Cl(-) exchange transporter (H(+)/Cl(-) exchange transporter) is a polypeptide that mediates the exchange of protons and chloride (chlorine) ions.
  • the H(+)/Cl(-) exchange transporter of the present application may be used interchangeably as a voltage-gated ClC-type chloride channel ClcB (ClcB) or ClcB.
  • the sequence of the H(+)/Cl(-) exchange transporter can be obtained from GenBank of NCBI, a known database. Specifically, it may be a polypeptide having H(+)/Cl(-) exchange transporter activity encoded by clcB, but is not limited thereto.
  • cyanate transporter family protein is a polypeptide responsible for transport in the cell membrane.
  • the cyanate transporter family protein of the present application may be used in combination with the cyanate transport protein CynX (Cyanate transport protein CynX).
  • CynX CynX
  • the sequence of the cyanate transporter family protein can be obtained from GenBank of NCBI, a known database. Specifically, it may be a polypeptide having a cyanate transporter family protein activity encoded by cynX, but is not limited thereto.
  • isocitric acid dehydrogenase kinase/phosphatase enzyme is an enzyme with a unique dual function that inactivates or activates isocitrate dehydrogenase (ICDH), respectively, in response to environmental changes.
  • ICDH isocitrate dehydrogenase
  • the isocitrate dehydrogenase kinase/phosphatase enzyme of the present application may be used in combination with AceK.
  • the sequence of the isocitrate dehydrogenase kinase/phosphatase enzyme can be obtained from GenBank of NCBI, a known database. Specifically, it may be a polypeptide having isocitrate dehydrogenase kinase/phosphatase enzyme activity encoded by aceK, but is not limited thereto.
  • water-soluble pyridine nucleotide transhydrogenase is an enzyme that catalyzes a reaction that converts NADPH into NADH that can enter the respiratory chain for energy production.
  • the water-soluble pyridine nucleotide transhydrogenase of the present application may be used in combination with SthA.
  • the sequence of the water-soluble pyridine nucleotide transhydrogenase protein in the present application can be obtained from NCBI's GenBank, a known database. Specifically, it may be a polypeptide having a water-soluble pyridine nucleotide transhydrogenase activity encoded by sthA, but is not limited thereto.
  • corresponding to refers to an amino acid residue at a listed position in a polypeptide, or to an amino acid residue that is similar, identical or homologous to a listed residue in a polypeptide. Identifying an amino acid at a corresponding position may be determining a specific amino acid in a sequence that refers to a specific sequence.
  • corresponding region generally refers to a similar or corresponding position in a related protein or reference protein.
  • any amino acid sequence is aligned with SEQ ID NO: 3, and based on this, each amino acid residue of the amino acid sequence can be numbered with reference to the numerical position of the amino acid residue corresponding to the amino acid residue of SEQ ID NO: 3 .
  • a sequence alignment algorithm such as that described in this application can identify the position of an amino acid, or a position at which modifications, such as substitutions, insertions, or deletions, occur compared to a query sequence (also referred to as a "reference sequence").
  • Such alignments include, for example, the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), the Needleman program in the EMBOSS package (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al. , 2000), Trends Genet. 16: 276-277), etc., but is not limited thereto, and a sequence alignment program known in the art, a pairwise sequence comparison algorithm, etc. may be appropriately used.
  • polynucleotide refers to a DNA or RNA strand of a certain length or longer as a polymer of nucleotides in which nucleotide monomers are linked in a long chain by covalent bonds, and more specifically, encoding the variant. polynucleotide fragments.
  • Polynucleotides encoding the variants of the present application are SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 37, It may include one or more base sequences encoding any one or more of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 41.
  • the polynucleotide of the present application is SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 42 may have, comprise, consist of, or consist essentially of any one or more sequences.
  • the polynucleotides of the present application are various in the coding region within the range that does not change the amino acid sequence of the variants of the present application. Deformation can be made.
  • polynucleotide of the present application is SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: At least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, and has or contains less than 100% nucleotide sequence, or SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 38, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% homology or identity to any one or more sequences of
  • the codon encoding the amino acid corresponding to the 100th position of SEQ ID NO: 1 is one of the codons encoding asparagine;
  • the codon encoding the amino acid corresponding to position 786 of SEQ ID NO: 5 is one of the codons encoding asparagine;
  • the codon encoding the amino acid corresponding to position 137 of SEQ ID NO: 9 is one of the codons encoding aspartic acid;
  • the codon encoding the amino acid corresponding to position 149 of SEQ ID NO: 13 is one of the codons encoding leucine;
  • the codon encoding the amino acid corresponding to position 401 of SEQ ID NO: 17 is one of the codons encoding threonine;
  • the codon encoding the amino acid corresponding to position 31 of SEQ ID NO: 21 is one of the codons encoding histidine;
  • polynucleotide of the present application may be included without limitation as long as it can hybridize under stringent conditions with a probe that can be prepared from a known gene sequence, for example, a sequence complementary to all or part of the polynucleotide sequence of the present application.
  • stringent condition means a condition that enables specific hybridization between polynucleotides. These conditions are described in J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8).
  • polynucleotides with high homology or identity 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or a condition in which polynucleotides having 99% or more homology or identity hybridize with each other and polynucleotides with lower homology or identity do not hybridize, or a washing condition of conventional Southern hybridization at 60°C, 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, specifically 60°C, 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, more specifically 68°C, 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS at a salt concentration and temperature equivalent to once, specifically twice The conditions for washing to 3 times can be enumerated.
  • Hybridization requires that two nucleic acids have complementary sequences, although mismatch between bases is possible depending on the stringency of hybridization.
  • complementary is used to describe the relationship between nucleotide bases capable of hybridizing to each other.
  • adenine is complementary to thymine
  • cytosine is complementary to guanine.
  • the polynucleotides of the present application may also include substantially similar nucleic acid sequences as well as isolated nucleic acid fragments complementary to the overall sequence.
  • a polynucleotide having homology or identity to the polynucleotide of the present application can be detected using the hybridization conditions including a hybridization step at a Tm value of 55°C and using the above-described conditions.
  • the Tm value may be 60 °C, 63 °C, or 65 °C, but is not limited thereto and may be appropriately adjusted by those skilled in the art according to the purpose.
  • the appropriate stringency for hybridizing the polynucleotides depends on the length of the polynucleotides and the degree of complementarity, and the parameters are well known in the art (eg, J. Sambrook et al., supra).
  • the term "vector” refers to a DNA preparation comprising the base sequence of a polynucleotide encoding the target polypeptide operably linked to a suitable expression control region (or expression control sequence) so that the target polypeptide can be expressed in a suitable host.
  • the expression control region may include a promoter capable of initiating transcription, an optional operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and a sequence regulating the termination of transcription and translation.
  • the vector After transformation into an appropriate host cell, the vector can replicate or function independently of the host genome, and can be integrated into the genome itself.
  • the vector used in the present application is not particularly limited, and any vector known in the art may be used.
  • Examples of commonly used vectors include plasmids, cosmids, viruses and bacteriophages in a natural or recombinant state.
  • pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, and Charon21A may be used as phage vectors or cosmid vectors, and pDZ-based, pBR-based, and pUC-based plasmid vectors may be used.
  • pBluescript II-based pGEM-based, pTZ-based, pCL-based, pET-based and the like
  • pDZ pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC vectors and the like
  • pC1BAC vectors and the like can be used.
  • a polynucleotide encoding a target polypeptide may be inserted into a chromosome through a vector for intracellular chromosome insertion.
  • the insertion of the polynucleotide into the chromosome may be performed by any method known in the art, for example, homologous recombination, but is not limited thereto.
  • It may further include a selection marker (selection marker) for confirming whether the chromosome is inserted.
  • the selection marker is used to select cells transformed with the vector, that is, to determine whether a target nucleic acid molecule is inserted, and selectable phenotypes such as drug resistance, auxotrophy, resistance to cytotoxic agents, or surface polypeptide expression. Markers to be given can be used. In an environment treated with a selective agent, only the cells expressing the selectable marker survive or exhibit other expression traits, so that the transformed cells can be selected.
  • the term "transformation” refers to introducing a vector including a polynucleotide encoding a target polypeptide into a host cell or microorganism so that the polypeptide encoded by the polynucleotide can be expressed in the host cell.
  • the transformed polynucleotide may include all of them regardless of whether they are inserted into the chromosome of the host cell or located outside the chromosome, as long as they can be expressed in the host cell.
  • the polynucleotide includes DNA and/or RNA encoding a target polypeptide.
  • the polynucleotide may be introduced in any form as long as it can be introduced and expressed into a host cell.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a gene construct including all elements necessary for self-expression.
  • the expression cassette may include a promoter operably linked to the polynucleotide, a transcription termination signal, a ribosome binding site, and a translation termination signal.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self-replication.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in its own form and operably linked to a sequence required for expression in the host cell, but is not limited thereto.
  • operably linked means that a promoter sequence that initiates and mediates transcription of a polynucleotide encoding the target variant of the present application and the polynucleotide sequence are functionally linked.
  • the strain of the present application is one or more, 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, 10 or more, or 11 or more variant polypeptides of the present application, 1 encoding the polypeptide One or more, 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, 10 or more, or 11 or more polynucleotides, 1 or more, 2 or more, 3 or more including the polynucleotide of the present application , 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, 10 or more, or 11 or more vectors, or a combination thereof.
  • strain or microorganism
  • strain includes both wild-type microorganisms and microorganisms in which genetic modification has occurred naturally or artificially.
  • a specific mechanism is weakened or enhanced as a microorganism, and may be a microorganism including genetic modification for the production of a desired polypeptide, protein or product.
  • the strain of the present application includes a strain comprising any one or more of one or more variants of the present application, one or more polynucleotides of the present application, and one or more vectors comprising the polynucleotides of the present application; strains modified to express one or more variants of the present application or one or more polynucleotides of the present application; a strain expressing one or more variants of the present application, or one or more polynucleotides of the present application (eg, a recombinant strain); Or it may be a strain (eg, a recombinant strain) having one or more variant activities of the present application, but is not limited thereto.
  • the strain of the present application may be a strain having L-tryptophan-producing ability.
  • the strain of the present application is naturally deoxyguanosine triphosphate triphosphohydrolase, cooper exporting P-type ATP A, ferrocheratase, hydrolase, cytosine permease, tautomerase pptA, protein HtrL, H (+)/Cl(-) exchange transporter, cyanate transporter family protein, isocitrate dehydrogenase kinase/phosphatase, a microorganism having the ability to produce water-soluble pyridine nucleotide transhydrogenase or L-tryptophan, or deoxyguano Syntriphosphate triphosphohydrolase, Cooper exporting P-type ATPase A, ferrocheratease, hydrolase, cytosine permease, tautomerase pptA, protein HtrL, H(+)/Cl(-) exchange trans Porter, cyanate transporter family protein, isocitrate dehydrogenase kinase / phosphatase
  • the strain of the present application is a cell or microorganism that is transformed with one or more polynucleotides encoding one or more variants of the present application or one or more vectors comprising the same, and expresses one or more variants of the present application
  • the strain of the present application may include all microorganisms capable of producing L-tryptophan, including one or more variants of the present application.
  • the strain of the present application may be a recombinant strain having an increased L-tryptophan-producing ability by introducing a polynucleotide encoding one or more variants of the present application into a natural wild-type microorganism or a microorganism producing L-tryptophan.
  • the recombinant strain having an increased ability to produce L-amino acids may be a microorganism having an increased ability to produce L-tryptophan compared to a natural wild-type microorganism or an unmodified microorganism (ie, a microorganism that does not express the mutant), but is not limited thereto. .
  • the strain with increased L-tryptophan-producing ability of the present application is SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 35 , SEQ ID NO: 39, may be a microorganism having an increased L-tryptophan-producing ability compared to Escherichia coli comprising a polypeptide of SEQ ID NO: 39 or a polynucleotide encoding the same, but is not limited thereto.
  • the non-modified microorganism which is the target strain for comparing whether the increase in the L-tryptophan production ability is increased, may be the CJ600 strain (KCCM 10812P, KR10-0792095), but is not limited thereto.
  • the recombinant strain with increased production capacity is about 1% or more, about 5% or more, about 10% or more, about 15% or more, or about 20% or more compared to the L-tryptophan production capacity of the parent strain or unmodified microorganism before mutation.
  • the upper limit is not particularly limited, for example, it may be about 200% or less, about 150% or less, about 100% or less, or about 50% or less) It may be increased, but the production capacity of the parent strain or unmodified microorganism before mutation It is not limited thereto, as long as it has an increase amount of + value compared to it.
  • the recombinant strain with increased production capacity has an L-tryptophan production capacity of about 1.01 times or more, about 1.05 times or more, about 1.1 times or more, 1.15 times or more, or about 1.2 times compared to the parent strain or unmodified microorganism before mutation. It may be increased by more than twice (the upper limit is not particularly limited, for example, it may be about 20 times or less), but is not limited thereto.
  • the term "about” is a range including all of ⁇ 0.5, ⁇ 0.4, ⁇ 0.3, ⁇ 0.2, ⁇ 0.1, etc., including all numerical values in a range equal to or similar to the numerical value following the term about, but not limited
  • the term "unmodified microorganism” does not exclude a strain containing a mutation that can occur naturally in a microorganism, it is a wild-type strain or a natural-type strain itself, or a genetic variation caused by natural or artificial factors. It may mean the strain before being changed.
  • the unmodified microorganism may refer to a strain into which one or more variants described herein have not been introduced or have been introduced.
  • the "unmodified microorganism” may be used interchangeably with "strain before modification", “microbe before modification”, “unmodified strain”, “unmodified strain”, “unmodified microorganism” or "reference microorganism”.
  • the microorganism of the present application may be Escherichia coli .
  • the term "weakened" in polypeptide activity is a concept that includes both reduced or no activity compared to intrinsic activity.
  • the attenuation may be used interchangeably with terms such as inactivation, deficiency, down-regulation, decrease, reduce, attenuation, and the like.
  • the attenuation is when the activity of the polypeptide itself is reduced or eliminated compared to the activity of the polypeptide possessed by the original microorganism due to mutation of the polynucleotide encoding the polypeptide, etc.
  • the overall polypeptide activity level and/or concentration (expression amount) in the cell is lower than that of the native strain due to (translation) inhibition, etc., when the expression of the polynucleotide is not made at all, and/or when the expression of the polynucleotide is Even if there is no activity of the polypeptide, it may also be included.
  • the "intrinsic activity” refers to the activity of a specific polypeptide originally possessed by the parent strain, wild-type or unmodified microorganism before transformation when the trait is changed due to genetic mutation caused by natural or artificial factors. This may be used interchangeably with “activity before modification”. "Inactivation, deficiency, reduction, downregulation, reduction, attenuation” of the activity of the polypeptide compared to the intrinsic activity means that the activity of the specific polypeptide originally possessed by the parent strain or unmodified microorganism before transformation is lowered.
  • Attenuation of the activity of such a polypeptide may be performed by any method known in the art, but is not limited thereto, and may be achieved by application of various methods well known in the art (eg, Nakashima N et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014;15(2):2773-2793, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012, etc.).
  • the attenuation of the polypeptide activity of the present application is
  • an antisense oligonucleotide eg, antisense RNA
  • an antisense oligonucleotide that complementarily binds to the transcript of said gene encoding the polypeptide
  • deletion of a part or all of the gene encoding the polypeptide may be the removal of the entire polynucleotide encoding the endogenous target polypeptide in the chromosome, replacement with a polynucleotide in which some nucleotides are deleted, or replacement with a marker gene.
  • the expression control region includes, but is not limited to, a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, and a sequence regulating the termination of transcription and translation.
  • the base sequence modification encoding the start codon or 5'-UTR region of the gene transcript encoding the polypeptide is, for example, a base encoding another start codon having a lower expression rate of the polypeptide compared to the intrinsic start codon It may be substituted with a sequence, but is not limited thereto.
  • the modification of the amino acid sequence or polynucleotide sequence of 3) and 4) above deletes, inserts, non-conservative or conservative substitution of the amino acid sequence of the polypeptide or the polynucleotide sequence encoding the polypeptide so as to weaken the activity of the polypeptide.
  • a combination thereof may result in a mutation in sequence, or replacement with an amino acid sequence or polynucleotide sequence improved to have weaker activity or an amino acid sequence or polynucleotide sequence improved to have no activity, but is not limited thereto.
  • the expression of a gene may be inhibited or attenuated, but is not limited thereto.
  • antisense oligonucleotide eg, antisense RNA
  • antisense RNA an antisense oligonucleotide that complementarily binds to the transcript of the gene encoding the polypeptide
  • Weintraub, H. et al. Antisense-RNA as a molecular tool. for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986].
  • RTE reverse transcription engineering
  • the term "enhancement" of a polypeptide activity means that the activity of the polypeptide is increased compared to the intrinsic activity.
  • the reinforcement may be used interchangeably with terms such as activation, up-regulation, overexpression, and increase.
  • activation, enhancement, up-regulation, overexpression, and increase may include all of those exhibiting an activity that was not originally possessed, or exhibiting an improved activity compared to an intrinsic activity or an activity prior to modification.
  • intrinsic activity refers to the activity of a specific polypeptide originally possessed by the parent strain or unmodified microorganism before transformation when the trait is changed due to genetic mutation caused by natural or artificial factors.
  • Enhance, "up-regulation”, “overexpression” or “increase” in the activity of a polypeptide compared to its intrinsic activity means the activity of a specific polypeptide originally possessed by the parent strain or unmodified microorganism before transformation. And / or concentration (expression amount) means improved compared to.
  • the enrichment can be achieved by introducing an exogenous polypeptide, or by enhancing the activity and/or concentration (expression amount) of the endogenous polypeptide. Whether or not the activity of the polypeptide is enhanced can be confirmed from the increase in the level of activity, expression level, or the amount of product excreted from the polypeptide.
  • the enhancement of the activity of the polypeptide can be applied by various methods well known in the art, and is not limited as long as it can enhance the activity of the target polypeptide compared to the microorganism before modification. Specifically, it may be one using genetic engineering and/or protein engineering well known to those skilled in the art, which is a routine method of molecular biology, but is not limited thereto (eg, Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell). Biology 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012, etc.).
  • modification of the polynucleotide sequence encoding the polypeptide to enhance the activity of the polypeptide eg, modification of the polynucleotide sequence of the polypeptide gene to encode the modified polypeptide to enhance the activity of the polypeptide
  • the increase in the intracellular copy number of the polynucleotide encoding the polypeptide is achieved by introduction into the host cell of a vector to which the polynucleotide encoding the polypeptide is operably linked, which can replicate and function independently of the host it may be Alternatively, the polynucleotide encoding the polypeptide may be achieved by introducing one copy or two or more copies into a chromosome in a host cell.
  • the introduction into the chromosome may be performed by introducing a vector capable of inserting the polynucleotide into the chromosome in the host cell into the host cell, but is not limited thereto.
  • the vector is the same as described above.
  • Replacing the gene expression control region (or expression control sequence) on the chromosome encoding the polypeptide with a sequence with strong activity is, for example, deletion, insertion, non-conservative or Conservative substitution or a combination thereof may result in a mutation in the sequence, or replacement with a sequence having a stronger activity.
  • the expression control region is not particularly limited thereto, but may include a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, and a sequence controlling the termination of transcription and translation.
  • the original promoter may be replaced with a strong promoter, but is not limited thereto.
  • Examples of known strong promoters include CJ1 to CJ7 promoters (US 7662943 B2), lac promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, lambda phage PR promoter, PL promoter, tet promoter, gapA promoter, SPL7 promoter, SPL13 (sm3) promoter (US Patent US 10584338 B2), O2 promoter (US Patent US 10273491 B2), tkt promoter, yccA promoter, etc., but is not limited thereto.
  • Modification of the nucleotide sequence encoding the start codon or 5'-UTR region of the gene transcript encoding the polypeptide is, for example, a nucleotide sequence encoding another start codon having a higher expression rate of the polypeptide compared to the intrinsic start codon. It may be a substitution, but is not limited thereto.
  • the modification of the amino acid sequence or polynucleotide sequence of 4) and 5) above may include deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution of the amino acid sequence of the polypeptide or the polynucleotide sequence encoding the polypeptide to enhance the activity of the polypeptide;
  • a combination thereof may result in sequence mutation, or replacement with an amino acid sequence or polynucleotide sequence improved to have stronger activity or an amino acid sequence or polynucleotide sequence improved to increase activity, but is not limited thereto.
  • the replacement may be specifically performed by inserting a polynucleotide into a chromosome by homologous recombination, but is not limited thereto.
  • the vector used may further include a selection marker for confirming whether or not the chromosome is inserted.
  • the selection marker is the same as described above.
  • the introduction of the foreign polynucleotide exhibiting the activity of the polypeptide may be the introduction of the foreign polynucleotide encoding the polypeptide exhibiting the same/similar activity as the polypeptide into a host cell.
  • the foreign polynucleotide is not limited in its origin or sequence as long as it exhibits the same/similar activity as the polypeptide.
  • the method used for the introduction can be performed by appropriately selecting a known transformation method by those skilled in the art, and the introduced polynucleotide is expressed in a host cell to generate a polypeptide and increase its activity.
  • Codon optimization of the polynucleotide encoding the polypeptide is codon-optimized so that the transcription or translation of the endogenous polynucleotide is increased in the host cell, or the transcription and translation of the foreign polynucleotide is optimized in the host cell. It may be that its codons are optimized so that the
  • Selecting an exposed site by analyzing the tertiary structure of the polypeptide and modifying or chemically modifying it is, for example, by comparing the sequence information of the polypeptide to be analyzed with a database in which sequence information of known proteins is stored to determine the degree of sequence similarity. Accordingly, it may be to determine a template protein candidate, check the structure based on this, and select an exposed site to be modified or chemically modified and modified or modified.
  • Such enhancement of polypeptide activity is to increase the activity or concentration of the corresponding polypeptide based on the activity or concentration of the polypeptide expressed in the wild-type or pre-modified microbial strain, or increase the amount of product produced from the polypeptide.
  • the present invention is not limited thereto.
  • Modification of part or all of the polynucleotide in the microorganism of the present application is (a) homologous recombination using a vector for chromosome insertion in the microorganism or genome correction using engineered nuclease (e.g., CRISPR-Cas9) and/or (b) It may be induced by light and/or chemical treatments such as, but not limited to, ultraviolet and radiation.
  • the method for modifying part or all of the gene may include a method by DNA recombination technology.
  • a part or all of the gene may be deleted.
  • the injected nucleotide sequence or vector may include a dominant selection marker, but is not limited thereto.
  • Another aspect of the present application is (i) one or more variants of the present application (ii) one or more polynucleotides encoding the variant or (iii) an Escherichia coli strain comprising a combination thereof in a culture medium. It provides a method for producing L-amino acids, comprising the steps.
  • the L-amino acid of the present application may include the step of culturing an Escherichia coli strain comprising the variant of the present application or the polynucleotide of the present application or the vector of the present application in a medium.
  • L-amino acid of the present application may be L-tryptophan.
  • the term "culturing” means growing the Escherichia coli strain of the present application under moderately controlled environmental conditions.
  • the culture process of the present application may be performed according to a suitable medium and culture conditions known in the art. Such a culture process can be easily adjusted and used by those skilled in the art according to the selected strain.
  • the culture may be a batch, continuous and/or fed-batch, but is not limited thereto.
  • the term "medium” refers to a material in which nutrients required for culturing the Escherichia coli strain of the present application are mixed as a main component, and nutrients and growth factors, including water, which are essential for survival and growth supply, etc.
  • the medium and other culture conditions used for culturing the Escherichia coli strain of the present application may be used without any particular limitation as long as it is a medium used for culturing conventional microorganisms, but the Escherichia coli strain of the present application It can be cultured under aerobic conditions while controlling temperature, pH, etc. in a conventional medium containing an appropriate carbon source, nitrogen source, phosphorus, inorganic compound, amino acid, and/or vitamin.
  • the culture medium for the Escherichia coli strain can be found in the literature ["Manual of Methods for General Bacteriology” by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)].
  • the carbon source includes carbohydrates such as glucose, saccharose, lactose, fructose, sucrose, maltose, and the like; sugar alcohols such as mannitol and sorbitol; organic acids such as pyruvic acid, lactic acid, citric acid and the like; amino acids such as glutamic acid, methionine, lysine, and the like may be included.
  • natural organic nutrient sources such as starch hydrolyzate, molasses, blackstrap molasses, rice winter, cassava, sugar cane offal and corn steep liquor can be used, specifically glucose and sterilized pre-treated molasses (i.e., converted to reducing sugar). molasses) may be used, and other appropriate amounts of carbon sources may be variously used without limitation. These carbon sources may be used alone or in combination of two or more, but is not limited thereto.
  • nitrogen source examples include inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, anmonium carbonate, and ammonium nitrate; Amino acids such as glutamic acid, methionine, glutamine, and organic nitrogen sources such as peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract, malt extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, fish or its degradation products, defatted soybean cake or its degradation products, etc. can be used These nitrogen sources may be used alone or in combination of two or more, but is not limited thereto.
  • inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, anmonium carbonate, and ammonium nitrate
  • Amino acids such as glutamic acid, methionine, glutamine
  • organic nitrogen sources such as peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract
  • the phosphorus may include potassium first potassium phosphate, second potassium phosphate, or a sodium-containing salt corresponding thereto.
  • potassium first potassium phosphate potassium phosphate
  • second potassium phosphate or a sodium-containing salt corresponding thereto.
  • sodium chloride, calcium chloride, iron chloride, magnesium sulfate, iron sulfate, manganese sulfate, calcium carbonate, etc. may be used, and in addition, amino acids, vitamins and/or suitable precursors may be included. These components or precursors may be added to the medium either batchwise or continuously. However, the present invention is not limited thereto.
  • the pH of the medium may be adjusted.
  • an antifoaming agent such as fatty acid polyglycol ester may be used to suppress bubble formation.
  • oxygen or oxygen-containing gas may be injected into the medium, or nitrogen, hydrogen or carbon dioxide gas may be injected without or without gas to maintain anaerobic and microaerobic conditions, it is not
  • the culture temperature may be maintained at 20 to 45° C., specifically, 25 to 40° C., and may be cultured for about 10 to 160 hours, but is not limited thereto.
  • the L-amino acid produced by the culture of the present application may be secreted into the medium or may remain in the cell.
  • the L-amino acid production method of the present application includes the steps of preparing the Escherichia coli strain of the present application, preparing a medium for culturing the strain, or a combination thereof (regardless of the order, in any order), For example, before the culturing step, it may be further included.
  • the method for producing L-amino acids of the present application may further include recovering L-amino acids from the culture medium (cultured medium) or the Escherichia coli strain of the present application.
  • the recovering step may be further included after the culturing step.
  • the recovery may be to collect the desired L-amino acid using a suitable method known in the art according to the culture method of the microorganism of the present application, for example, a batch, continuous or fed-batch culture method, etc. .
  • a suitable method known in the art according to the culture method of the microorganism of the present application, for example, a batch, continuous or fed-batch culture method, etc. .
  • chromatography such as island chromatography, HPLC, or a combination thereof may be used, and a desired L-amino acid may be recovered from a medium or a microorganism using a suitable method known in the art.
  • the L-amino acid production method of the present application may include an additional purification step.
  • the purification may be performed using a suitable method known in the art.
  • the recovery step and the purification step are performed continuously or discontinuously, regardless of the order, or integrated into one step may be performed, but is not limited thereto.
  • variants, polynucleotides, vectors, strains, L-tryptophan, and the like are as described in the other aspects above.
  • Escherichia coli comprising one or more variants of the present application, one or more polynucleotides encoding the variants, one or more vectors including the polynucleotides, or one or more polynucleotides of the present application strain; the culture medium; Or to provide a composition for the production of L- amino acids comprising a combination of two or more of them.
  • composition of the present application may further include any suitable excipients commonly used in compositions for the production of L-amino acids, and these excipients include, for example, preservatives, wetting agents, dispersing agents, suspending agents, buffering agents, stabilizing agents or isotonic agents. and the like, but is not limited thereto.
  • composition of the present application variants, polynucleotides, vectors, strains, L-amino acids, and the like are as described in the other aspects above.
  • Example 1 Evaluation of L-tryptophan-producing ability of microorganisms expressing deoxyguanosine triphosphate triphosphohydrolase variants
  • Example 1-1 Deoxyguanosine triphosphate triphosphohydrolase mutant expression strain production
  • E. coli W3110 gDNA was used as a template, and the primer pair of SEQ ID NOs: 45 and 46 and the primer pair of SEQ ID NOs: 47 and 48 were used to form the E. coli dgt D100N mutant Fragments of the upstream region and the downstream region were obtained through PCR, respectively.
  • SolgTM Pfu-X DNA polymerase was used as the polymerase, and PCR amplification conditions were repeated 27 times of denaturation at 95°C for 2 minutes, denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 1 minute, and polymerization at 72°C for 1 minute.
  • CJ600 strain (KR10-0792095) was transformed with the above pSG76-C-dgt(D100N) plasmid and LB-Cm (Yeast extract 10g/L, NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Chlororamphenicol 25ug/L) solid medium After culturing in , colonies with chloramphenicol resistance were selected. The selected transformant was confirmed to be a strain in which the pSG76-C-dgt(D100N) plasmid was inserted into the dgt gene region in the chromosome using the primer pair of SEQ ID NOs: 49 and 50.
  • pST76-AsceP Nucleic Acids Research, Volume 27, Issue 22, 1 November 1999, Pages 4409-4415
  • LB-Amp Yeast extract 10g/L , NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Ampicillin 100ug/L
  • Colonies that grew on LB solid medium but did not grow on LB-Amp or LB-Cm solid medium were confirmed that the pST76-AsceP plasmid was cured.
  • colonies whose pST76-AsceP plasmid was confirmed to be cured were amplified by using a pair of primers of SEQ ID NOs: 49 and 50, respectively, and a strain replaced with dgt (D100N) was selected through sequencing.
  • the strain produced in this way was named CJ600_dgt_D100N.
  • Example 1-2 Evaluation of L-tryptophan-producing ability of microorganisms expressing deoxyguanosine triphosphate triphosphohydrolase variants
  • the L-tryptophan production ability was analyzed by evaluating the flask fermentation titer of each strain and the control parent strain prepared in Example 1-1.
  • Colonies of the control parent strain CJ600 and the recombinant strain CJ600_dgt_D100N prepared in Example 1-1 were cultured overnight in LB solid medium using platinum.
  • the grown strains were inoculated one by one in a 250ml corner-baffle flask containing 25ml of the production medium, and cultured with shaking at 37°C for 48 hours at 200rpm. After the type of culture, the production capacity of L-tryptophan was measured by HPLC.
  • the CJ600_dgt_D100N was named CA04-4588, and was deposited with the Korea Microorganism Conservation Center, a trustee institution under the Budapest Treaty, on December 2, 2020, and was given an accession number KCCM12880P.
  • Example 2 Evaluation of L-tryptophan production ability of microorganisms expressing Cooper-Exporting P-type ATP AIDS A mutant
  • Example 2-1 Cooper exporting P-type ATP AIDS A mutant expression strain production
  • E. coli W3110 gDNA was used as a template, and the primer pair of SEQ ID NOs: 51 and 52 and the primer pair of SEQ ID NOs: 53 and 54 were used. Fragments of the upstream region and the downstream region were obtained through PCR, respectively.
  • SolgTM Pfu-X DNA polymerase was used as the polymerase, and PCR amplification conditions were repeated 27 times of denaturation at 95°C for 2 minutes, denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 1 minute, and polymerization at 72°C for 1 minute. Polymerization was performed at 72° C. for 5 minutes.
  • the vector pSG76-C plasmid for chromosomal transformation cut with the upstream and downstream regions of the copA S786N mutant amplified, and SmaI restriction enzyme obtained a recombinant plasmid by cloning using the Gibson assembly method, and named it pSG76-C-copA (S786N). Cloning was performed by mixing the Gibson assembly reagent and each gene fragment with the calculated number of moles, and then storing at 50° C. for 1 hour.
  • CJ600 strain (KR10-0792095) was transformed with the above pSG76-C-copA (S786N) plasmid in LB-Cm (Yeast extract 10g/L, NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Chlororamphenicol 25ug/L) medium. After culturing, colonies with chloramphenicol resistance were selected. The selected transformant was confirmed to be a strain in which the pSG76-C-copA(S786N) plasmid was inserted into the copA gene portion in the chromosome using the primer pair of SEQ ID NOs: 55 and 56.
  • pST76-AsceP Nucleic Acids Research, Volume 27, Issue 22, 1 November 1999, Pages 4409-4415
  • LB-Amp Yeast extract 10g/L , NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Ampicillin 100ug/L
  • Colonies that grew on LB solid medium but did not grow on LB-Amp or LB-Cm solid medium were confirmed that the pST76-AsceP plasmid was cured.
  • colonies in which the pST76-AsceP plasmid was confirmed to be cured were amplified by using the primer pair of SEQ ID NOs: 55 and 56, respectively, and the strain replaced with copA (S786N) was selected through sequencing.
  • the strain produced in this way was named CJ600_copA_S786N.
  • Example 2-2 Evaluation of L-tryptophan-producing ability of microorganisms expressing Cooper-Exporting P-type ATP AIDS A mutant
  • the L-tryptophan production ability was analyzed by evaluating the flask fermentation titer of each strain and the control parent strain prepared in Example 2-1.
  • Colonies of the control parent strain CJ600 and the recombinant strain CJ600_copA_S786N prepared in Example 2-1 were cultured overnight in LB solid medium using platinum.
  • the grown strains were inoculated one by one in a 250ml corner-baffle flask containing 25ml of the production medium, and cultured with shaking at 37°C for 48 hours at 200rpm. After the type of culture, the production capacity of L-tryptophan was measured by HPLC.
  • the CJ600_copA_S786N strain exhibited increased L-tryptophan production ability compared to the control group.
  • the CJ600_copA_S786N was named CA04-4591, and was deposited at the Korea Microorganism Conservation Center, an institution under the Budapest Treaty, as of December 2, 2020. Therefore, it was given an accession number KCCM12883P.
  • Example 3 Evaluation of L-tryptophan-producing ability of microorganisms expressing ferrocheratase variants
  • E. coli W3110 gDNA was used as a template, and a primer pair of SEQ ID NOs: 57 and 58 and a primer pair of SEQ ID NOs: 59 and 60 were used. Fragments of the upstream region and the downstream region were obtained through PCR, respectively.
  • SolgTM Pfu-X DNA polymerase was used as the polymerase, and PCR amplification conditions were repeated 27 times of denaturation at 95°C for 2 minutes, denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 1 minute, and polymerization at 72°C for 1 minute. Polymerization was performed at 72° C. for 5 minutes.
  • the vector pSG76-C plasmid for chromosomal transformation digested with the upstream and downstream regions of the amplified hemH G137D mutant, and SmaI restriction enzyme obtained a recombinant plasmid by cloning using the Gibson assembly method, and named it pSG76-C-hemH (G137D). Cloning was performed by mixing the Gibson assembly reagent and each gene fragment with the calculated number of moles, and then storing at 50° C. for 1 hour.
  • CJ600 strain (KR10-0792095) was transformed with the above pSG76-C-hemH (G137D) plasmid in LB-Cm (Yeast extract 10g/L, NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Chlororamphenicol 25ug/L) medium. After culturing, colonies with chloramphenicol resistance were selected. It was confirmed that the selected transformant was a strain in which the pSG76-C-hemH(G137D) plasmid was inserted into the hemH gene portion in the chromosome using the primer pair of SEQ ID NOs: 61 and 62.
  • pST76-AsceP Nucleic Acids Research, Volume 27, Issue 22, 1 November 1999, Pages 4409-4415
  • hemH (G137D) variant identified as the primary was inserted
  • LB-Amp Yeast extract 10g/L
  • NaCl 5g/L NaCl 5g/L
  • Tryptone 10g/L Ampicillin 100ug/L
  • Colonies that grew on LB solid medium but did not grow on LB-Amp or LB-Cm solid medium were confirmed that the pST76-AsceP plasmid was cured.
  • colonies whose pST76-AsceP plasmid was confirmed to be cured were amplified by using the primer pair of SEQ ID NOs: 61 and 62, respectively, and the strain replaced with hemH (G137D) was selected through sequencing.
  • the strain produced in this way was named CJ600_hemH_G137D.
  • Example 3-2 Evaluation of L-tryptophan-producing ability of microorganisms expressing ferrocheratase variants
  • the L-tryptophan production ability was analyzed by evaluating the flask fermentation titer of each strain and the control parent strain prepared in Example 3-1.
  • Colonies of the control parent strain CJ600 and the recombinant strain CJ600_hemH_G137D prepared in Example 3-1 were cultured overnight in LB solid medium using platinum.
  • the grown strains were inoculated one by one in a 250ml corner-baffle flask containing 25ml of the production medium, and cultured with shaking at 37°C for 48 hours at 200rpm. After the type of culture, the production capacity of L-tryptophan was measured by HPLC.
  • the CJ600_hemH_G137D strain exhibited increased L-tryptophan production ability compared to the control group.
  • the CJ600_hemH_G137D was named CA04-4590, and was deposited at the Korea Microorganism Conservation Center, a trust institution under the Budapest Treaty, as of December 2, 2020. Therefore, it was given accession number KCCM12882P.
  • Example 4 Evaluation of L-tryptophan-producing ability of microorganisms expressing hydrolase mutants
  • E. coli W3110 gDNA was used as a template, and the primer pair of SEQ ID NOs: 63 and 64 and the primer pair of SEQ ID NOs: 65 and 66 were used to obtain E. coli ynbC P149L mutant Fragments of the upstream region and the downstream region were obtained through PCR, respectively.
  • SolgTM Pfu-X DNA polymerase was used as the polymerase, and PCR amplification conditions were repeated 27 times of denaturation at 95°C for 2 minutes, denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 1 minute, and polymerization at 72°C for 1 minute.
  • CJ600 strain (KR10-0792095) was transformed with the above pSG76-C-ynbC (P149L) plasmid in LB-Cm (Yeast extract 10g/L, NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Chlororamphenicol 25ug/L) medium. After culturing, colonies with chloramphenicol resistance were selected. The selected transformant was confirmed to be a strain in which the pSG76-C-ynbC(P149L) plasmid was inserted into the ynbC gene region in the chromosome using the primer pair of SEQ ID NOs: 67 and 68.
  • pST76-AsceP Nucleic Acids Research, Volume 27, Issue 22, 1 November 1999, Pages 4409-4415
  • ynbC (P149L) mutant identified as the primary was inserted
  • LB-Amp Yeast extract 10g/L
  • NaCl 5g/L NaCl 5g/L
  • Tryptone 10g/L Ampicillin 100ug/L
  • Colonies that grew on LB solid medium but did not grow on LB-Amp or LB-Cm solid medium were confirmed that the pST76-AsceP plasmid was cured.
  • colonies in which the pST76-AsceP plasmid was confirmed to be cured were amplified by using the primer pair of SEQ ID NOs: 67 and 68, respectively, and the strain replaced with ynbC (P149L) was selected through sequencing.
  • the strain produced in this way was named CJ600_ynbC_P149L.
  • Example 4-2 Evaluation of L-tryptophan-producing ability of microorganisms expressing hydrolase mutants
  • the L-tryptophan production ability was analyzed by evaluating the flask fermentation titer of each strain and the control parent strain prepared in Example 4-1.
  • Colonies of the control parent strain CJ600 and the recombinant strain CJ600_ynbC_P149L prepared in Example 4-1 were cultured overnight in LB solid medium using platinum.
  • the grown strains were inoculated one by one in a 250ml corner-baffle flask containing 25ml of the production medium, and cultured with shaking at 37°C for 48 hours at 200rpm. After the type of culture, the production capacity of L-tryptophan was measured by HPLC.
  • the CJ600_ynbC_P149L strain exhibited increased L-tryptophan production ability compared to the control group.
  • the CJ600_ynbC_P149L was named CA04-4592, and was deposited at the Korea Microorganism Conservation Center under the Budapest Treaty as of December 2, 2020. Therefore, it was given an accession number KCCM12884P.
  • Example 5 Evaluation of L-tryptophan-producing ability of microorganisms expressing cytosine permease variants
  • the vector pSG76-C plasmid for chromosomal transformation digested with the upstream region and downstream region of the codB I401T mutant amplified, and SmaI restriction enzyme obtained a recombinant plasmid by cloning using the Gibson assembly method, and named it pSG76-C-codB (I401T). Cloning was performed by mixing the Gibson assembly reagent and each gene fragment with the calculated number of moles, and then storing at 50° C. for 1 hour.
  • CJ600 strain (KR10-0792095) was transformed with the above pSG76-C-codB(I401T) plasmid in LB-Cm (Yeast extract 10g/L, NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Chlororamphenicol 25ug/L) medium. After culturing, colonies with chloramphenicol resistance were selected. The selected transformant was confirmed to be a strain in which the pSG76-C-codB(I401T) plasmid was inserted into the codB gene portion in the chromosome using the primer pair of SEQ ID NOs: 73 and 74.
  • pST76-AsceP Nucleic Acids Research, Volume 27, Issue 22, 1 November 1999, Pages 4409-4415
  • LB-Amp Yeast extract 10g/L , NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Ampicillin 100ug/L
  • Colonies that grew on LB solid medium but did not grow on LB-Amp or LB-Cm solid medium were confirmed that the pST76-AsceP plasmid was cured.
  • colonies in which the pST76-AsceP plasmid was confirmed to be cured were amplified by using a pair of primers of SEQ ID NOs: 73 and 74, respectively, and a strain replaced with codB (I401T) was selected through sequencing.
  • the strain produced in this way was named CJ600_codB_I401T.
  • Example 5-2 Evaluation of L-tryptophan-producing ability of microorganisms expressing cytosine permease mutants
  • the L-tryptophan production ability was analyzed by evaluating the flask fermentation titer of each strain and the control parent strain prepared in Example 5-1.
  • Colonies of the control parent strain CJ600 and the recombinant strain CJ600_codB_I401T prepared in Example 5-1 were cultured overnight in LB solid medium using platinum.
  • the grown strains were inoculated one by one in a 250ml corner-baffle flask containing 25ml of the production medium, and cultured with shaking at 37°C for 48 hours at 200rpm. After the type of culture, the production capacity of L-tryptophan was measured by HPLC.
  • the CJ600_codB_I401T strain exhibited increased L-tryptophan production ability compared to the control group.
  • the CJ600_codB_I401T was named CA04-4589, and was deposited at the Korea Microorganism Conservation Center under the Budapest Treaty as of December 2, 2020. Therefore, it was given accession number KCCM12881P.
  • Example 6 Evaluation of L-tryptophan-producing ability of microorganisms expressing tautomerase pptA variants
  • Example 6-1 Production of tautomerase pptA mutant expression strain
  • E. coli W3110 gDNA was used as a template, and the primer pair of SEQ ID NOs: 75 and 76 and the primer pair of SEQ ID NOs: 77 and 78 were used to form E. coli pptA R31H variants Fragments of the upstream region and the downstream region were obtained through PCR, respectively.
  • SolgTM Pfu-X DNA polymerase was used as the polymerase, and PCR amplification conditions were repeated 27 times of denaturation at 95°C for 2 minutes, denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 1 minute, and polymerization at 72°C for 1 minute.
  • CJ600 strain (KR10-0792095) was transformed with the above pSG76-C-pptA (R31H) plasmid in LB-Cm (Yeast extract 10g/L, NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Chlororamphenicol 25ug/L) medium. After culturing, colonies with chloramphenicol resistance were selected. The selected transformant was confirmed to be a strain in which the pSG76-C-pptA(R31H) plasmid was inserted into the pptA gene portion in the chromosome using the primer pair of SEQ ID NOs: 79 and 80.
  • pST76-AsceP Nucleic Acids Research, Volume 27, Issue 22, 1 November 1999, Pages 4409-4415
  • LB-Amp yeast extract 10g/L
  • NaCl 5g/L NaCl 5g/L
  • Tryptone 10g/L Ampicillin 100ug/L
  • Colonies that grew on LB solid medium but did not grow on LB-Amp or LB-Cm solid medium were confirmed that the pST76-AsceP plasmid was cured.
  • colonies in which the pST76-AsceP plasmid was confirmed to be cured were amplified by using a pair of primers of SEQ ID NOs: 79 and 80, respectively, and a strain replaced with pptA (R31H) was selected through sequencing.
  • the strain produced in this way was named CJ600_pptA_R31H.
  • Example 6-2 Evaluation of L-tryptophan-producing ability of microorganisms expressing tautomerase pptA variants
  • the L-tryptophan production capacity was analyzed by evaluating the flask fermentation titer of each strain and the control parent strain prepared in Example 6-1.
  • Colonies of the control parent strain CJ600 and the recombinant strain CJ600_pptA_R31H prepared in Example 6-1 were cultured overnight in LB solid medium using platinum.
  • the grown strains were inoculated one by one in a 250ml corner-baffle flask containing 25ml of the production medium, and cultured with shaking at 37°C for 48 hours at 200rpm. After the type of culture, the production capacity of L-tryptophan was measured by HPLC.
  • the CJ600_pptA_R31H strain exhibited increased L-tryptophan production ability compared to the control group.
  • the CJ600_pptA_R31H was named CA04-4593, and was deposited at the Korea Microorganism Conservation Center under the Budapest Treaty as of December 2, 2020. Therefore, it was given accession number KCCM12885P.
  • Example 7 Evaluation of L-tryptophan-producing ability of microorganisms expressing protein HtrL variants
  • E. coli W3110 gDNA was used as a template, and the primer pair of SEQ ID NOs: 81 and 82 and the primer pair of SEQ ID NOs: 83 and 84 were used to obtain E. coli yibB T156I mutant Fragments of the upstream region and the downstream region were obtained through PCR, respectively.
  • SolgTM Pfu-X DNA polymerase was used as the polymerase, and PCR amplification conditions were repeated 27 times of denaturation at 95°C for 2 minutes, denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 1 minute, and polymerization at 72°C for 1 minute.
  • CJ600 strain (KR10-0792095) was transformed with the above pSG76-C-yibB(T156I) plasmid in LB-Cm (Yeast extract 10g/L, NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Chlororamphenicol 25ug/L) medium. After culturing, colonies with chloramphenicol resistance were selected. The selected transformant was confirmed to be a strain in which the pSG76-C-yibB(T156I) plasmid was inserted into the yibB gene portion in the chromosome using the primer pair of SEQ ID NOs: 85 and 86.
  • Transformation of pST76-AsceP into the strain into which the yibB(T156I) mutant identified as the primary was inserted was transformed to LB-Amp (Yeast extract 10g/L , NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Ampicillin 100ug/L) solid medium, colonies growing at 30°C were selected. The selected colonies were picked in LB, LB-Amp, and LB-Cm solid medium, respectively, and cultured at 42°C for 16 hours.
  • LB-Amp Yeast extract 10g/L , NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Ampicillin 100ug/L
  • Colonies that grew on LB solid medium but did not grow on LB-Amp or LB-Cm solid medium were confirmed that the pST76-AsceP plasmid was cured.
  • colonies in which the pST76-AsceP plasmid was confirmed to be cured were amplified by using the primer pair of SEQ ID NOs: 85 and 86, respectively, and the strain replaced with yibB (T156I) was selected through sequencing.
  • the strain produced in this way was named CJ600_yibB_T156I.
  • Example 7-2 Evaluation of L-tryptophan-producing ability of microorganisms expressing protein HtrL variants
  • L-tryptophan production capacity was analyzed through the evaluation of flask fermentation titer of each strain and control parent strain prepared in Example 7-1.
  • Colonies of the control parent strain CJ600 and the recombinant strain CJ600_yibB_T156I prepared in Example 7-1 were cultured overnight in LB solid medium using platinum.
  • the grown strains were inoculated one by one in a 250ml corner-baffle flask containing 25ml of the production medium, and cultured with shaking at 37°C for 48 hours at 200rpm. After the type of culture, the production capacity of L-tryptophan was measured by HPLC.
  • the CJ600_yibB_T156I strain exhibited increased L-tryptophan production ability compared to the control group.
  • the CJ600_yibB_T156I was named CA04-4597, and was deposited at the Korea Microorganism Conservation Center under the Budapest Treaty as of December 2, 2020. Therefore, it was given an accession number KCCM12887P.
  • Example 8 Evaluation of L-tryptophan-producing ability of microorganisms expressing H (+) / Cl (-) exchange transporter variants
  • E. coli W3110 gDNA was used as a template, and the primer pair of SEQ ID NOs: 87 and 88 and the primer pair of SEQ ID NOs: 89 and 90 were used. Fragments of the upstream region and the downstream region were obtained through PCR, respectively.
  • SolgTM Pfu-X DNA polymerase was used as the polymerase, and PCR amplification conditions were repeated 27 times of denaturation at 95°C for 2 minutes, denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 1 minute, and polymerization at 72°C for 1 minute. Polymerization was performed at 72° C. for 5 minutes.
  • the vector pSG76-C plasmid for chromosomal transformation digested with the upstream and downstream regions of each amplified clcB C133F mutant, and SmaI restriction enzyme obtained a recombinant plasmid by cloning using the Gibson assembly method, and named it pSG76-C-clcB (C133F). Cloning was performed by mixing the Gibson assembly reagent and each gene fragment with the calculated number of moles, and then storing at 50° C. for 1 hour.
  • CJ600 strain (KR10-0792095) was transformed with the above pSG76-C-clcB(C133F) plasmid in LB-Cm (Yeast extract 10g/L, NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Chlororamphenicol 25ug/L) medium. After culturing, colonies with chloramphenicol resistance were selected. The selected transformant was confirmed to be a strain in which the pSG76-C-clcB(C133F) plasmid was inserted into the clcB gene region in the chromosome using the primer pair of SEQ ID NOs: 91 and 92.
  • pST76-AsceP Nucleic Acids Research, Volume 27, Issue 22, 1 November 1999, Pages 4409-4415
  • LB-Amp Yeast extract 10g/L , NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Ampicillin 100ug/L
  • Colonies that grew on LB solid medium but did not grow on LB-Amp or LB-Cm solid medium were confirmed that the pST76-AsceP plasmid was cured.
  • colonies whose pST76-AsceP plasmid was confirmed to have cured were amplified the clcB gene using the primer pair of SEQ ID NOs: 91 and 92, respectively, and the strain replaced with clcB (C133F) was selected through sequencing.
  • the strain produced in this way was named CJ600_clcB_C133F.
  • Example 8-2 Evaluation of L-tryptophan-producing ability of microorganisms expressing H (+) / Cl (-) exchange transporter variants
  • the L-tryptophan production ability was analyzed by evaluating the flask fermentation titer of each strain and the control parent strain prepared in Example 8-1.
  • Colonies of the control parent strain CJ600 and the recombinant strain CJ600_clcB_C133F prepared in Example 8-1 were cultured overnight in LB solid medium using platinum.
  • the grown strains were inoculated one by one in a 250ml corner-baffle flask containing 25ml of the production medium, and cultured with shaking at 37°C for 48 hours at 200rpm. After the type of culture, the production capacity of L-tryptophan was measured by HPLC.
  • the CJ600_clcB_C133F strain exhibited increased L-tryptophan production ability compared to the control group.
  • the CJ600_clcB_C133F was named CA04-4594, and was deposited at the Korea Microorganism Conservation Center under the Budapest Treaty as of December 2, 2020. Therefore, it was given an accession number KCCM12886P.
  • Example 9 Evaluation of L-tryptophan-producing ability of microorganisms expressing cyanate transporter family protein variants
  • Example 9-1 Construction of cyanate transporter family protein mutant expression strain
  • E. coli W3110 gDNA was used as a template, and the primer pair of SEQ ID NOs: 93 and 94 and the primer pair of SEQ ID NOs: 95 and 96 were used. Fragments of the upstream region and the downstream region were obtained through PCR, respectively.
  • SolgTM Pfu-X DNA polymerase was used as the polymerase, and PCR amplification conditions were repeated 27 times of denaturation at 95°C for 2 minutes, denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 1 minute, and polymerization at 72°C for 1 minute. Polymerization was performed at 72° C. for 5 minutes.
  • the vector pSG76-C plasmid for chromosomal transformation cut with the upstream region and downstream region of each amplified cynX D259N mutant, and SmaI restriction enzyme obtained a recombinant plasmid by cloning using the Gibson assembly method, and named it pSG76-C-cynX (D259N). Cloning was performed by mixing the Gibson assembly reagent and each gene fragment with the calculated number of moles, and then storing at 50° C. for 1 hour.
  • CJ600 strain (KR10-0792095) was transformed with the above pSG76-C-cynX (D259N) plasmid in LB-Cm (Yeast extract 10g/L, NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Chlororamphenicol 25ug/L) medium. After culturing, colonies with chloramphenicol resistance were selected. The selected transformant was confirmed to be a strain in which the pSG76-C-cynX(D259N) plasmid was inserted into the cynX gene region in the chromosome using the primer pair of SEQ ID NOs: 97 and 98.
  • pST76-AsceP Nucleic Acids Research, Volume 27, Issue 22, 1 November 1999, Pages 4409-4415
  • cynX D259N
  • LB-Amp Yeast extract 10g/L , NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Ampicillin 100ug/L
  • Colonies that grew on LB solid medium but did not grow on LB-Amp or LB-Cm solid medium were confirmed that the pST76-AsceP plasmid was cured.
  • colonies in which the pST76-AsceP plasmid was confirmed to be cured were amplified by using the primer pair of SEQ ID NOs: 97 and 98, respectively, and the strain replaced with cynX (D259N) was selected through sequencing.
  • the strain produced in this way was named CJ600_cynX_D259N.
  • Example 9-2 Evaluation of L-tryptophan-producing ability of microorganisms expressing cyanate transporter family protein variants
  • the L-tryptophan production capacity was analyzed by evaluating the flask fermentation titer of each strain and the control parent strain prepared in Example 1.
  • Colonies of the control parent strain CJ600 and the recombinant strain CJ600_cynX_D259N prepared in Example 1 were cultured overnight in LB solid medium using platinum.
  • the grown strains were inoculated one by one in a 250ml corner-baffle flask containing 25ml of the production medium, and cultured with shaking at 37°C for 48 hours at 200rpm. After the type of culture, the production capacity of L-tryptophan was measured by HPLC.
  • the CJ600_cynX_D259N strain exhibited increased L-tryptophan production ability compared to the control group.
  • the CJ600_cynX_D259N was named CA04-4595, and was deposited at the Korea Microorganism Conservation Center under the Budapest Treaty as of December 22, 2020. Therefore, it was given an accession number KCCM12914P.
  • Example 10-1 Isocitrate dehydrogenase kinase / phosphatase enzyme mutant expression strain production
  • E. coli W3110 gDNA was used as a template, and the primer pair of SEQ ID NOs: 99 and 100 and the primer pair of SEQ ID NOs: 101 and 102 were used. Fragments of the upstream region and the downstream region were obtained through PCR, respectively.
  • SolgTM Pfu-X DNA polymerase was used as the polymerase, and PCR amplification conditions were repeated 27 times of denaturation at 95°C for 2 minutes, denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 1 minute, and polymerization at 72°C for 1 minute. Polymerization was performed at 72° C. for 5 minutes.
  • the vector pSG76-C plasmid for chromosomal transformation digested with the upstream region and downstream region of each amplified aceK E26K mutant, and SmaI restriction enzyme obtained a recombinant plasmid by cloning using the Gibson assembly method, and named it pSG76-C-aceK (E26K). Cloning was performed by mixing the Gibson assembly reagent and each gene fragment with the calculated number of moles, and then storing at 50° C. for 1 hour.
  • CJ600 strain (KR10-0792095) was transformed with the above pSG76-C-aceK (E26K) plasmid in LB-Cm (Yeast extract 10g/L, NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Chlororamphenicol 25ug/L) medium. After culturing, colonies with chloramphenicol resistance were selected. The selected transformant was confirmed to be a strain in which the pSG76-C-aceK(E26K) plasmid was inserted into the aceK gene region in the chromosome using the primer pair of SEQ ID NOs: 103 and 104.
  • pST76-AsceP Nucleic Acids Research, Volume 27, Issue 22, 1 November 1999, Pages 4409-4415
  • aceK E26K
  • LB-Amp Yeast extract 10 g/L , NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Ampicillin 100ug/L
  • Colonies that grew on LB solid medium but did not grow on LB-Amp or LB-Cm solid medium were confirmed that the pST76-AsceP plasmid was cured.
  • colonies whose pST76-AsceP plasmid was confirmed to be cured were amplified by using a pair of primers of SEQ ID NOs: 103 and 104, respectively, and a strain replaced with aceK (E26K) was selected through sequencing.
  • the strain produced in this way was named CJ600_aceK_E26K.
  • Example 2 Evaluation of L-tryptophan-producing ability of microorganisms expressing isocitrate dehydrogenase kinase/phosphatase mutants
  • the L-tryptophan production capacity was analyzed by evaluating the flask fermentation titer of each strain and the control parent strain prepared in Example 1.
  • Colonies of the control parent strain CJ600 and the recombinant strain CJ600_aceK_E26K prepared in Example 1 were cultured overnight in LB solid medium using platinum.
  • the grown strains were inoculated one by one in a 250ml corner-baffle flask containing 25ml of the production medium, and cultured with shaking at 37°C for 48 hours at 200rpm. After the type of culture, the production capacity of L-tryptophan was measured by HPLC.
  • the CJ600_aceK_E26K strain exhibited an increased L-tryptophan-producing ability compared to the control.
  • Example 11 Evaluation of L-tryptophan-producing ability of microorganisms expressing water-soluble pyridine nucleotide transhydrogenase variants
  • Example 11-1 Construction of water-soluble pyridine nucleotide transhydrogenase mutant expression strain
  • E. coli W3110 gDNA was used as a template and the primer pair of SEQ ID NOs: 105 and 106 and the primer pair of SEQ ID NOs: 107 and 108 were used to form E. coli sthA A145V mutant Fragments of the upstream region and the downstream region were obtained through PCR, respectively.
  • SolgTM Pfu-X DNA polymerase was used as the polymerase, and PCR amplification conditions were repeated 27 times of denaturation at 95°C for 2 minutes, denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 1 minute, and polymerization at 72°C for 1 minute.
  • CJ600 strain (KR10-0792095) was transformed with the above pSG76-C-sthA (A145V) plasmid in LB-Cm (Yeast extract 10g/L, NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Chlororamphenicol 25ug/L) medium. After culturing, colonies with chloramphenicol resistance were selected. The selected transformant was confirmed to be a strain in which the pSG76-C-sthA(A145V) plasmid was inserted into the sthA gene portion in the chromosome using the primer pair of SEQ ID NOs: 109 and 110.
  • pST76-AsceP Nucleic Acids Research, Volume 27, Issue 22, 1 November 1999, Pages 4409-4415
  • sthA A145V
  • LB-Amp Yeast extract 10g/L
  • NaCl 5g/L NaCl 5g/L
  • Tryptone 10g/L Ampicillin 100ug/L
  • Colonies that grew on LB solid medium but did not grow on LB-Amp or LB-Cm solid medium were confirmed that the pST76-AsceP plasmid was cured.
  • colonies in which the pST76-AsceP plasmid was confirmed to be cured were amplified by using a pair of primers of SEQ ID NOs: 109 and 110, respectively, and a strain replaced with sthA (A145V) was selected through sequencing.
  • the strain produced in this way was named CJ600_sthA_A145V.
  • Example 11-2 Evaluation of L-tryptophan-producing ability of microorganisms expressing water-soluble pyridine nucleotide transhydrogenase variants
  • the L-tryptophan production ability was analyzed by evaluating the flask fermentation titer of each strain and the control parent strain prepared in Example 11-1.
  • Colonies of the control parent strain CJ600 and the recombinant strain CJ600_sthA_A145V prepared in Example 11-1 were cultured overnight in LB solid medium using platinum.
  • the grown strains were inoculated one by one in a 250ml corner-baffle flask containing 25ml of the production medium, and cultured with shaking at 37°C for 48 hours at 200rpm. After the type of culture, the production capacity of L-tryptophan was measured by HPLC.
  • the CJ600_sthA_A145V strain exhibited increased L-tryptophan-producing ability compared to the control.

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Abstract

본 출원은 신규한 변이체, 상기 변이체를 포함하는 에스케리치아 콜라이 균주 및 상기 균주를 이용한 L-트립토판 생산 방법에 관한 것이다.

Description

신규한 변이체 및 이를 이용한 L-트립토판 생산 방법
본 출원은 신규한 변이체, 상기 변이체를 포함하는 에스케리치아 콜라이 균주 및 상기 균주를 이용한 L-트립토판 생산 방법에 관한 것이다.
L-아미노산 및 기타 유용물질을 생산하기 위하여, 고효율 생산 미생물 및 발효공정기술 개발을 위한 다양한 연구들이 수행되고 있다. 예를 들어, L-트립토판 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키거나 또는 생합성에 불필요한 유전자를 제거하는 것과 같은 목적 물질 특이적 접근 방법이 주로 이용되고 있다(US 8945907 B2).
다만, L-트립토판 수요 증가에 따라 효과적인 L-트립토판 생산능 증가를 위한 연구가 여전히 필요한 실정이다.
본 발명자들은 L-트립토판 생산을 증대시키는 신규한 변이체, 상기 변이체를 포함하는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 균주 및 상기 균주를 이용한 L-트립토판 생산 방법을 개발하여 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 하나의 목적은 (i) 본 출원의 하나 이상의 변이체, (ii) 상기 변이체를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 (iii) 이들의 조합을 포함하고, L-트립토판 생산능을 가진, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 균주를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 (i) 본 출원의 하나 이상의 변이체, (ii) 상기 변이체를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 (iii) 이들의 조합을 포함하고, L-트립토판 생산능을 가진, 에스케리치아 콜라이 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-트립토판 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 변이체를 포함하는, 에스케리치아 콜라이 균주를 배양하는 경우, 기존 비변형 폴리펩티드를 갖는 미생물에 비해 고수율의 L-트립토판 생산이 가능하다.
본 출원을 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 출원의 하나의 양태는 (i) 하기 (a) 내지 (k)로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 변이체, (ii) 상기 변이체를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 (iii) 이들의 조합을 포함하는, 에스케리치아 콜라이 균주를 제공한다.
(a) 서열번호 3의 100번째 위치에 상응하는 아미노산인 아스파르트산이 아스파라긴으로 치환된, 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 데옥시구아노신트리포스페이트 트리포스포하이드로레이즈 변이체;
(b) 서열번호 7의 786번째 위치에 상응하는 아미노산인 세린이 아스파라긴으로 치환된, 서열번호 5로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 쿠퍼익스포팅 P-type 에이티피에이즈 A 변이체;
(c) 서열번호 11의 137번째 위치에 상응하는 아미노산인 글리신이 아스파르트산으로 치환된, 서열번호 9로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 페로체라테이즈 변이체;
(d) 서열번호 15의 149번째 위치에 상응하는 아미노산인 프롤린이 루신으로 치환된, 서열번호 13으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 하이드로레이즈 변이체;
(e) 서열번호 19의 401번째 위치에 상응하는 아미노산인 이소루신이 트레오닌으로 치환된, 서열번호 17로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 사이토신 퍼미에이즈 변이체;
(f) 서열번호 23의 31번째 위치에 상응하는 아미노산인 아르기닌이 히스티딘으로 치환된, 서열번호 21로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 타우토머레이즈 pptA 변이체;
(g) 서열번호 27의 156번째 위치에 상응하는 아미노산인 트레오닌이 이소루신으로 치환된, 서열번호 25로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질 HtrL 변이체;
(h) 서열번호 31의 133번째 위치에 상응하는 아미노산인 시스테인이 페닐알라닌으로 치환된, 서열번호 29로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 H(+)/Cl(-) 익스체인지 트랜스포터 변이체;
(i) 서열번호 35의 259번째 위치에 상응하는 아미노산인 아스파르트산이 아스파라긴으로 치환된, 서열번호 33으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 시아네이트 트랜스포터 패밀리 단백질 변이체;
(j) 서열번호 39의 26번째 위치에 상응하는 아미노산인 글루탐산이 라이신으로 치환된, 서열번호 37로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 아이소시트르산 디하이드로게네이즈 키나아제/포스파타제 변이체 및
(k) 서열번호 43의 145번째 위치에 상응하는 아미노산인 알라닌이 발린 으로 치환되고, 서열번호 41로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 수용성 피리딘 뉴클레오티드 트랜스수소효소 변이체.
본 출원에서 하나 이상은 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상 또는 11 이상일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 본 출원의 균주는 (i) 상기 (a) 내지 (k)로 구성되는 군에서 선택되는 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상 또는 11 이상의 변이체, (ii) 상기 변이체를 코딩하는 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상 또는 11 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 (iii) 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 (i) 상기 (a) 내지 (k)로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 변이체 및 (ii) 상기 변이체를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 조합을 포함하는 균주에서 상기 (i)의 변이체와 상기 (ii)의 변이체는 (a) 내지 (k)로 구성되는 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 동일하거나 상이할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 본 출원의 균주는 상기 (a) 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (b) 변이체 조합을 포함하는 균주도 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 변이체는 서열번호 1, 서열번호 5, 서열번호 9, 서열번호 13, 서열번호 17, 서열번호 21, 서열번호 25, 서열번호 29, 서열번호 33, 서열번호 37 및 서열번호 41로 기재된 아미노산 서열 중 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상 또는 11 이상을 가지거나, 포함하거나, 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어질(essentially consisting of) 수 있다.
또한, 본 출원의 변이체는 하기 (aa) 내지 (kk) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
(aa) 상기 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열에서 서열번호 3의 아미노산 서열을 기준으로 100번 위치에 상응하는 아미노산은 아스파라긴이고, 상기 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열;
(bb) 상기 서열번호 5로 기재된 아미노산 서열에서 서열번호 7의 아미노산 서열을 기준으로 786번 위치에 상응하는 아미노산은 아스파라긴이고, 상기 서열번호 5로 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열;
(cc) 상기 서열번호 9로 기재된 아미노산 서열에서 서열번호 11의 아미노산 서열을 기준으로 137번 위치에 상응하는 아미노산은 아스파르트산이고, 상기 서열번호 9로 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열;
(dd) 상기 서열번호 13으로 기재된 아미노산 서열에서 서열번호 15의 아미노산 서열을 기준으로 149번 위치에 상응하는 아미노산은 루신이고, 상기 서열번호 13로 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열;
(ee) 상기 서열번호 17으로 기재된 아미노산 서열에서 서열번호 19의 아미노산 서열을 기준으로 401번 위치에 상응하는 아미노산은 트레오닌이고, 상기 서열번호 17로 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열;
(ff) 상기 서열번호 21로 기재된 아미노산 서열에서 서열번호 23의 아미노산 서열을 기준으로 31번 위치에 상응하는 아미노산은 히스티딘이고, 상기 서열번호 21로 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열;
(gg) 상기 서열번호 25로 기재된 아미노산 서열에서 서열번호 27의 아미노산 서열을 기준으로 156번 위치에 상응하는 아미노산은 이소루신이고, 상기 서열번호 25로 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열;
(hh) 상기 서열번호 29로 기재된 아미노산 서열에서 서열번호 31의 아미노산 서열을 기준으로 133번 위치에 상응하는 아미노산은 페닐알라닌이고, 상기 서열번호 29로 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열;
(ii) 상기 서열번호 33으로 기재된 아미노산 서열에서 서열번호 35의 아미노산 서열을 기준으로 259번 위치에 상응하는 아미노산은 아스파라긴이고, 상기 서열번호 33으로 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열;
(jj) 상기 서열번호 37로 기재된 아미노산 서열에서 서열번호 39의 아미노산 서열을 기준으로 26번 위치에 상응하는 아미노산은 라이신이고, 상기 서열번호 37로 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열 및
(kk) 상기 서열번호 41로 기재된 아미노산 서열에서 서열번호 43의 아미노산 서열을 기준으로 145번 위치에 상응하는 아미노산은 발린이고, 상기 서열번호 41로 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열.
또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 본 출원의 변이체에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 변이체도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단, C-말단 그리고/또는 내부에 본 출원의 변이체의 기능을 변경하지 않는 서열 추가 또는 결실, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 잠재성 돌연변이(silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우이다.
상기 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 통상적으로, 보존적 치환은 단백질 또는 폴리펩티드의 활성에 거의 영향을 미치지 않거나 또는 영향을 미치지 않을 수 있다.
본 출원에서 용어, "변이체(variant)"는 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 변형(modification)되어 상기 변이체의 변이 전 아미노산 서열과 상이하나 기능(functions) 또는 특성(properties)이 유지되는 폴리펩티드를 지칭한다. 이러한 변이체는 일반적으로 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산을 변형하고, 상기 변형된 폴리펩티드의 특성을 평가하여 동정(identify)될 수 있다. 즉, 변이체의 능력은 변이 전 폴리펩티드에 비하여 증가되거나, 변하지 않거나, 또는 감소될 수 있다. 또한, 일부 변이체는 N-말단 리더 서열 또는 막전이 도메인(transmembrane domain)과 같은 하나 이상의 부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 다른 변이체는 성숙 단백질(mature protein)의 N- 및/또는 C-말단으로부터 일부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 상기 용어 "변이체"는 변이형, 변형, 변이형 폴리펩티드, 변이된 단백질, 변이 및 변이체 등의 용어(영문 표현으로는 modification, modified polypeptide, modified protein, mutant, mutein, divergent 등)가 혼용되어 사용될 수 있으며, 변이된 의미로 사용되는 용어라면 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 목적상 상기 변이체는 서열번호 3의 100번째 위치에 상응하는 아미노산인 아스파르트산이 아스파라긴으로 치환된, 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 서열번호 7의 786번째 위치에 상응하는 아미노산인 세린이 아스파라긴으로 치환된, 서열번호 5로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 서열번호 11의 137번째 위치에 상응하는 아미노산인 글리신이 아스파르트산으로 치환된, 서열번호 9로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 서열번호 15의 149번째 위치에 상응하는 아미노산인 프롤린이 루신으로 치환된, 서열번호 13으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 서열번호 19의 401번째 위치에 상응하는 아미노산인 이소루신이 트레오닌으로 치환된, 서열번호 17로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 서열번호 23의 31번째 위치에 상응하는 아미노산인 아르기닌이 히스티딘으로 치환된, 서열번호 21로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 서열번호 27의 156번째 위치에 상응하는 아미노산인 트레오닌이 이소루신으로 치환된, 서열번호 25로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 서열번호 31의 133번째 위치에 상응하는 아미노산인 시스테인이 페닐알라닌으로 치환된, 서열번호 29로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 서열번호 35의 259번째 위치에 상응하는 아미노산인 아스파르트산이 아스파라긴으로 치환된, 서열번호 33으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 서열번호 39의 26번째 위치에 상응하는 아미노산인 글루탐산이 라이신으로 치환된, 서열번호 37로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 서열번호 43의 145번째 위치에 상응하는 아미노산인 알라닌이 발린으로 치환된, 서열번호 41로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 또한, 변이체는 폴리펩티드의 특성과 2차 구조에 최소한의 영향을 갖는 아미노산들의 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 예를 들면 변이체의 N-말단에는 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 이동(translocation)에 관여하는 시그널(또는 리더) 서열이 컨쥬게이트 될 수 있다. 또한 상기 변이체는 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트 될 수 있다.
본 출원에서 용어, '상동성(homology)' 또는 '동일성(identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열 상호간 유사한 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 일부분과 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 일반 코돈 또는 코돈 축퇴성을 고려한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드와의 하이브리드화 역시 포함됨이 자명하다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al(1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387(1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math(1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al.(1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의할 수 있다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358(1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.
본 출원의 일 예로, 본 출원의 변이체는 데옥시구아노신트리포스페이트 트리포스포하이드로레이즈, 쿠퍼익스포팅 P-type 에이티피에이즈 A, 페로체라테이즈, 하이드로레이즈, 사이토신 퍼미에이즈, 타우토머레이즈 pptA, 단백질 HtrL, H(+)/Cl(-) 익스체인지 트랜스포터, 시아네이트 트랜스포터 패밀리 단백질, 아이소시트르산 디하이드로게네이즈 키나아제/포스파타제, 수용성 피리딘 뉴클레오티드 트랜스수소효소 중 어느 하나 이상의 활성을 가질 수 있다. 또한, 본 출원의 하나 이상의 변이체 또는 이들의 조합은 야생형 폴리펩티드에 비해 L-트립토판 생산능이 증가되도록 하는 활성을 가질 수 있다.
본 출원에서 용어, "데옥시구아노신트리포스페이트 트리포스포하이드로레이즈(deoxyguanosinetriphosphate triphosphohydrolase)"는 dGTP의 가수분해를 촉매하는 폴리펩티드이다. 구체적으로, 본 출원의 데옥시구아노신트리포스페이트 트리포스포하이드로레이즈는 dGTPase, dGTP 삼인산가수분해효소 또는 데옥시구아노신 트리포스파테이즈(deoxyguanosine triphosphatase)로 혼용하여 사용될 수 있다. 본 출원에서 상기 데옥시구아노신트리포스페이트 트리포스포하이드로레이즈는 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다. 구체적으로 dgt에 의해 코딩되는 데옥시구아노신트리포스페이트 트리포스포하이드로레이즈 활성을 갖는 폴리펩티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "쿠퍼익스포팅 P-type 에이티피에이즈 A(copper-exporting P-type ATPase A)"는 세포질에서 세포주변질(periplasm)로 구리 이온의 방출을 촉매하는 폴리펩티드이다. 구체적으로, 본 출원의 쿠퍼익스포팅 P-type 에이티피에이즈 A는 CopA로 혼용하여 사용될 수 있다. 본 출원에서 상기 쿠퍼익스포팅 P-type 에이티피에이즈 A는 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다. 구체적으로 copA에 의해 코딩되는 쿠퍼익스포팅 P-type 에이티피에이즈 A 활성을 갖는 폴리펩티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "페로체라테이즈(ferrochelatase)"는 프로토헴(heme)의 생성을 촉매하는 폴리펩티드이다. 구체적으로, 본 출원의 페로체라테이즈는 프로토포르피린 페로체라테이즈(protoporphyrin ferrochelatase) 또는 FECH로 혼용하여 사용될 수 있다. 본 출원에서 상기 페로체라테이즈는 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다. 구체적으로 hemH에 의해 코딩되는 페로체라테이즈 활성을 갖는 폴리펩티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "하이드로레이즈(hydrolase)"는 가수분해를 촉매하는 폴리펩티드이다. 구체적으로, 본 출원의 하이드로레이즈는 가수분해효소로 혼용하여 사용될 수 있다. 본 출원에서 상기 하이드로레이즈는 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다. 구체적으로 ynbC에 의해 코딩되는 하이드로레이즈 활성을 갖는 폴리펩티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "사이토신 퍼미에이즈(cytosine permease)"는 세포 내로 사이토신을 수송하는 폴리펩티드이다. 구체적으로, 본 출원의 사이토신 퍼미에이즈는 사이토신 투과효소로 혼용하여 사용될 수 있다. 본 출원에서 상기 사이토신 퍼미에이즈는 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다. 구체적으로 codB에 의해 코딩되는 사이토신 퍼미에이즈 활성을 갖는 폴리펩티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "타우토머레이즈 pptA(tautomerase pptA)"는 페닐피루베이트, 2- 하이드록시-2,4-펜타디에노에이트 및 (p-하이드록시페닐)피루베이트의 에놀 이성질체를 기질로 하는 상호변이효소(이성화효소)이다. 구체적으로, 본 출원의 타우토머레이즈 pptA는 4-옥살로크로토네이트 타우토머레이즈(4-oxalocrotonate tautomerase) 또는 4-OT로 혼용하여 사용될 수 있다. 본 출원에서 상기 타우토머레이즈 pptA는 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다. 구체적으로 pptA에 의해 코딩되는 타우토머레이즈 pptA 활성을 갖는 폴리펩티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "단백질 HtrL(Protein HtrL)"는 지질다당류(lipopolysaccharide) 생합성에 관여하는 폴리펩티드이다. 구체적으로, 본 출원의 단백질 HtrL은 단백질 YibB, 또는 HtrL로 혼용하여 사용될 수 있다. 본 출원에서 상기 단백질 HtrL은 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다. 구체적으로 yibB에 의해 코딩되는 단백질 HtrL 활성을 갖는 폴리펩티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "H(+)/Cl(-) 익스체인지 트랜스포터(H(+)/Cl(-) exchange transporter)"는 양성자와 클로라이드(염소) 이온의 교환을 매개하는 폴리펩티드이다. 구체적으로, 본 출원의 H(+)/Cl(-) 익스체인지 트랜스포터는 전압-의존성 클로라이드 채널 ClcB(voltage-gated ClC-type chloride channel ClcB) 또는 ClcB로 혼용하여 사용될 수 있다. 본 출원에서 상기 H(+)/Cl(-) 익스체인지 트랜스포터는 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다. 구체적으로 clcB에 의해 코딩되는 H(+)/Cl(-) 익스체인지 트랜스포터 활성을 갖는 폴리펩티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "시아네이트 트랜스포터 패밀리 단백질"는 세포막에서 수송을 담당하는 폴리펩티드이다. 구체적으로, 본 출원의 시아네이트 트랜스포터 패밀리 단백질은 시아네이트 트랜스포터 단백질 CynX(Cyanate transport protein CynX)로 혼용하여 사용될 수 있다. 본 출원에서 상기 시아네이트 트랜스포터 패밀리 단백질은 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다. 구체적으로 cynX에 의해 코딩되는 시아네이트 트랜스포터 패밀리 단백질 활성을 갖는 폴리펩티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "아이소시트르산 디하이드로게네이즈 키나아제/포스파타제 효소"는 환경변화에 반응하여 각각 아이소시트르산 디하이드로게네이즈(ICDH)를 비활성화 시키거나 활성화시키는 독특한 이중 기능의 효소이다. 구체적으로, 본 출원의 아이소시트르산 디하이드로게네이즈 키나아제/포스파타제 효소는 AceK와 혼용하여 사용될 수 있다. 본 출원에서 상기 아이소시트르산 디하이드로게네이즈 키나아제/포스파타제 효소는 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다. 구체적으로 aceK에 의해 코딩되는 아이소시트르산 디하이드로게네이즈 키나아제/포스파타제 효소 활성을 갖는 폴리펩티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "수용성 피리딘 뉴클레오티드 트랜스수소효소"는 NADPH를 에너지 생성을 위해 호흡 체인(respiratory chain)에 들어갈 수 있는 NADH로 변환하는 반응을 촉매 하는 효소이다. 구체적으로, 본 출원의 수용성 피리딘 뉴클레오티드 트랜스수소효소는 SthA와 혼용하여 사용될 수 있다. 본 출원에서 상기 수용성 피리딘 뉴클레오티드 트랜스수소효소 단백질은 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다. 구체적으로 sthA에 의해 코딩되는 수용성 피리딘 뉴클레오티드 트랜스수소효소 활성을 갖는 폴리펩티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서, 용어 "상응하는(corresponding to)"은, 폴리펩티드에서 열거되는 위치의 아미노산 잔기이거나, 또는 폴리펩티드에서 열거되는 잔기와 유사하거나 동일하거나 상동한 아미노산 잔기를 지칭한다. 상응하는 위치의 아미노산을 확인하는 것은 특정 서열을 참조하는 서열의 특정 아미노산을 결정하는 것일 수 있다. 본 출원에 사용된 "상응 영역"은 일반적으로 관련 단백질 또는 참조 (reference) 단백질에서의 유사하거나 대응되는 위치를 지칭한다.
예를 들어, 임의의 아미노산 서열을 서열번호 3과 정렬(align)하고, 이를 토대로 상기 아미노산 서열의 각 아미노산 잔기는 서열번호 3의 아미노산 잔기와 상응하는 아미노산 잔기의 숫자 위치를 참조하여 넘버링 할 수 있다. 예를 들어, 본 출원에 기재된 것과 같은 서열 정렬 알고리즘은, 쿼리 시퀀스("참조 서열"이라고도 함)와 비교하여 아미노산의 위치, 또는 치환, 삽입 또는 결실 등의 변형이 발생하는 위치를 확인할 수 있다.
이러한 정렬에는 예를 들어 Needleman-Wunsch 알고리즘(Needleman 및 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), EMBOSS 패키지의 Needleman 프로그램 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000), Trends Genet. 16: 276-277) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 알려진 서열 정렬 프로그램, 쌍 서열(pairwise sequence) 비교 알고리즘 등을 적절히 사용할 수 있다.
본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.
본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1, 서열번호 5, 서열번호 9, 서열번호 13, 서열번호 17, 서열번호 21, 서열번호 25, 서열번호 29, 서열번호 33, 서열번호 37, 서열번호 41로 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 염기서열을 포함할 수 있다. 본 출원의 일 예로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2, 서열번호 6, 서열번호 10, 서열번호 14, 서열번호 18, 서열번호 22, 서열번호 26, 서열번호 30, 서열번호 34, 서열번호 38, 서열번호 42 중 어느 하나 이상의 서열을 가지거나 포함하거나, 이루어지거나, 필수적으로 구성될 수 있다.
본 출원의 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy) 또는 본 출원의 변이체를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 본 출원의 변이체의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2, 서열번호 6, 서열번호 10, 서열번호 14, 서열번호 18, 서열번호 22, 서열번호 26, 서열번호 30, 서열번호 34, 서열번호 38, 서열번호 42 중 어느 하나 이상의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 2, 서열번호 6, 서열번호 10, 서열번호 14, 서열번호 18, 서열번호 22, 서열번호 26, 서열번호 30, 서열번호 34, 서열번호 38, 서열번호 42 중 어느 하나 이상의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이때, 상기 상동성 또는 동일성을 갖는 서열에서, 서열번호 1의 100번째 위치에 상응하는 아미노산을 코딩하는 코돈은 아스파라긴을 코딩하는 코돈 중 하나; 서열번호 5의 786번째 위치에 상응하는 아미노산을 코딩하는 코돈은 아스파라긴을 코딩하는 코돈 중 하나; 서열번호 9의 137번째 위치에 상응하는 아미노산을 코딩하는 코돈은 아스파르트산을 코딩하는 코돈 중 하나; 서열번호 13의 149번째 위치에 상응하는 아미노산을 코딩하는 코돈은 루신을 코딩하는 코돈 중 하나; 서열번호 17의 401번째 위치에 상응하는 아미노산을 코딩하는 코돈은 트레오닌을 코딩하는 코돈 중 하나; 서열번호 21의 31번째 위치에 상응하는 아미노산을 코딩하는 코돈은 히스티딘을 코딩하는 코돈 중 하나; 서열번호 25의 156번째 위치에 상응하는 아미노산을 코딩하는 코돈은 이소루신을 코딩하는 코돈 중 하나; 서열번호 29의 133번째 위치에 상응하는 아미노산을 코딩하는 코돈은 페닐알라닌을 코딩하는 코돈 중 하나; 서열번호 33의 259번째 위치에 상응하는 아미노산을 코딩하는 코돈은 아스파라긴을 코딩하는 코돈 중 하나; 서열번호 37의 26번째 위치에 상응하는 아미노산을 코딩하는 코돈은 라이신을 코딩하는 코돈 중 하나 및 서열번호 41의 145번째 위치에 상응하는 아미노산을 코딩하는 코돈은 발린을 코딩하는 코돈 중 하나일 수 있다.
또한, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 서열로부터 제조될 수 있는 프로브, 예를 들면, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화할 수 있는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(J. Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 폴리뉴클레오티드끼리, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 구체적으로 60℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로 68℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데닌은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드와 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(예컨대, J. Sambrook et al., 상동).
본 출원에서 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리펩티드를 발현시킬 수 있도록 적합한 발현조절영역(또는 발현조절서열)에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 포함하는 DNA 제조물을 포함할 수 있다. 상기 발현조절영역은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 염색체 내로 삽입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 폴리펩티드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 혹은 미생물 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드가 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 목적 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로도 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 출원의 균주는 본 출원의 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상 또는 11 이상의 변이형 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상 또는 11 이상의 폴리뉴클레오티드, 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상 또는 11 이상의 벡터, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
본 출원에서 용어, "균주(또는, 미생물)"는 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 폴리펩티드, 단백질 또는 산물의 생산을 위하여 유전적 변형(modification)을 포함하는 미생물일 수 있다.
본 출원의 균주는 본 출원의 하나 이상의 변이체, 본 출원의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 및 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하는 균주; 본 출원의 하나 이상의 변이체 또는 본 출원의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 발현하도록 변형된 균주; 본 출원의 하나 이상의 변이체, 또는 본 출원의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 발현하는 균주(예컨대, 재조합 균주); 또는 본 출원의 하나 이상의 변이체 활성을 갖는 균주(예컨대, 재조합 균주)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 균주는 L-트립토판 생산능을 가진 균주일 수 있다.
본 출원의 균주는 자연적으로 데옥시구아노신트리포스페이트 트리포스포하이드로레이즈, 쿠퍼익스포팅 P-type 에이티피에이즈 A, 페로체라테이즈, 하이드로레이즈, 사이토신 퍼미에이즈, 타우토머레이즈 pptA, 단백질 HtrL, H(+)/Cl(-) 익스체인지 트랜스포터, 시아네이트 트랜스포터 패밀리 단백질, 아이소시트르산 디하이드로게네이즈 키나아제/포스파타제, 수용성 피리딘 뉴클레오티드 트랜스수소효소 또는 L-트립토판 생산능을 가지고 있는 미생물, 또는 데옥시구아노신트리포스페이트 트리포스포하이드로레이즈, 쿠퍼익스포팅 P-type 에이티피에이즈 A, 페로체라테이즈, 하이드로레이즈, 사이토신 퍼미에이즈, 타우토머레이즈 pptA, 단백질 HtrL, H(+)/Cl(-) 익스체인지 트랜스포터, 시아네이트 트랜스포터 패밀리 단백질, 아이소시트르산 디하이드로게네이즈 키나아제/포스파타제, 수용성 피리딘 뉴클레오티드 트랜스수소효소 또는 L-트립토판 생산능이 없는 모균주에 본 출원의 하나 이상의 변이체, 이를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드(또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터), 또는 이들의 조합이 도입되거나 및/또는 L-트립토판 생산능이 부여된 미생물일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 본 출원의 균주는 본 출원의 하나 이상의 변이체를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 하나 이상의 벡터로 형질전환되어, 본 출원의 하나 이상의 변이체를 발현하는 세포 또는 미생물로서, 본 출원의 목적상 본 출원의 균주는 본 출원의 하나 이상의 변이체를 포함하여 L-트립토판을 생산할 수 있는 미생물을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 균주는 천연의 야생형 미생물, 또는 L-트립토판을 생산하는 미생물에 본 출원의 하나 이상의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입됨으로써 L-트립토판 생산능이 증가된 재조합 균주일 수 있다. 상기 L-아미노산 생산능이 증가된 재조합 균주는, 천연의 야생형 미생물 또는 비변형 미생물(즉, 상기 변이체를 발현하지 않는 미생물)에 비하여 L-트립토판 생산능이 증가된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 예로, 본 출원의 L-트립토판 생산능이 증가된 균주는 서열번호 3, 서열번호 7, 서열번호 11, 서열번호 15, 서열번호 19, 서열번호 23, 서열번호 27, 서열번호 31, 서열번호 35, 서열번호 39, 서열번호 43의 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 에스케리치아 콜라이와 비교하여 L-트립토판 생산능이 증가된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 그 예로, 상기 L-트립토판 생산능의 증가 여부를 비교하는 대상 균주인, 비변형 미생물은 CJ600 균주(KCCM 10812P, KR10-0792095) 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 상기 생산능이 증가된 재조합 균주는 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물의 L-트립토판 생산능에 비하여 약 1% 이상약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 또는 약 20% 이상(상한값은 특별한 제한은 없으며, 예컨대, 약 200% 이하, 약 150% 이하, 약 100% 이하, 또는 약 50% 이하일 수 있음) 증가된 것일 수 있으나, 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물의 생산능에 비해 +값의 증가량을 갖는 한, 이에 제한되지 않는다. 다른 예에서, 상기 생산능이 증가된 재조합 균주는 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물에 비하여, L-트립토판 생산능이 약 1.01배 이상, 약 1.05배 이상, 약 1.1배 이상, 1.15배 이상, 또는 약 1.2 배 이상(상한값은 특별한 제한은 없으며, 예컨대, 약 20배 이하일 수 있음) 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 용어 "약(about)"은 ±0.5, ±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1 등을 모두 포함하는 범위로, 약 이란 용어 뒤에 나오는 수치와 동등하거나 유사한 범위의 수치를 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "비변형 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 야생형 균주 또는 천연형 균주 자체이거나, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화되기 전 균주를 의미할 수 있다. 예를 들어, 상기 비변형 미생물은 본 명세서에 기재된 하나 이상의 변이체가 도입되지 않거나 도입되기 전의 균주를 의미할 수 있다. 상기 "비변형 미생물"은 "변형 전 균주", "변형 전 미생물", "비변이 균주", "비변형 균주", "비변이 미생물" 또는 "기준 미생물"과 혼용될 수 있다.
본 출원의 또 다른 일 예로, 본 출원의 미생물은 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 일 수 있다.
본 출원에서 용어, 폴리펩티드활성의 "약화"는 내재적 활성에 비하여 활성이 감소되거나 또는 활성이 없는 것을 모두 포함하는 개념이다. 상기 약화는 불활성화(inactivation), 결핍(deficiency), 하향조절(down-regulation), 감소(decrease), 저하(reduce), 감쇠(attenuation) 등의 용어와 혼용될 수 있다.
상기 약화는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 변이 등으로 폴리펩티드 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 폴리펩티드의 활성에 비해 감소 또는 제거된 경우, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 유전자의 발현 저해 또는 폴리펩티드로의 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 폴리펩티드 활성 정도 및/또는 농도(발현량)가 천연형 균주에 비하여 낮은 경우, 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 전혀 이루어지지 않은 경우, 및/또는 폴리뉴클레오티드의 발현이 되더라도 폴리펩티드의 활성이 없는 경우 역시 포함할 수 있다. 상기 "내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주, 야생형 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성을 의미한다. 이는 "변형 전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 "불활성화, 결핍, 감소, 하향조절, 저하, 감쇠"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성에 비하여 낮아진 것을 의미한다.
이러한 폴리펩티드의 활성의 약화는, 당업계에 알려진 임의의 방법에 의하여 수행될 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니며, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다(예컨대, Nakashima N et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014;15(2):2773-2793, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).
구체적으로, 본 출원의 폴리펩티드활성의 약화는
1) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전체 또는 일부의 결손;
2) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현이 감소하도록 발현조절영역(또는 발현조절서열)의 변형;
3) 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 상기 폴리펩티드를 구성하는 아미노산 서열의 변형(예컨대, 아미노산 서열 상의 1 이상의 아미노산의 삭제/치환/부가);
4) 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 서열의 변형(예를 들어, 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 변형된 폴리펩티드를 코딩하도록 상기 폴리펩티드 유전자의 핵산염기 서열 상의 1 이상의 핵산염기의 삭제/치환/부가);
5) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열의 변형;
6) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입;
7) 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능한 2차 구조물을 형성시키기 위하여 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열의 부가;
8) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터의 부가(Reverse transcription engineering, RTE); 또는
9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.
예컨대,
상기 1) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자 일부 또는 전체의 결손은, 염색체 내 내재적 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 전체의 제거, 일부 뉴클레오티드가 결실된 폴리뉴클레오티드로의 교체 또는 마커 유전자로 교체일 수 있다.
또한, 상기 2) 발현조절영역(또는 발현조절서열)의 변형은, 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절영역(또는 발현조절서열) 상의 변이 발생, 또는 더욱 약한 활성을 갖는 서열로의 교체일 수 있다. 상기 발현조절영역에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 5) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열 변형은, 예를 들면, 내재적 개시코돈에 비해 폴리펩티드 발현율이 더 낮은 다른 개시코돈을 코딩하는 염기서열로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 3) 및 4)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은 폴리펩티드의 활성을 약화하도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 활성이 없도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열로의 교체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 서열 내 변이를 도입하여 종결 코돈을 형성시킴으로써, 유전자의 발현을 저해하거나 약화시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 6) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입은 예를 들어 문헌 [Weintraub, H. et al., Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986]을 참고할 수 있다.
상기 7) 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능한 2차 구조물을 형성시키기 위하여 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열의 부가는 mRNA 번역을 불가능하게 하거나 속도를 저하시키는 것일 수 있다.
상기 8) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터의 부가(Reverse transcription engineering, RTE)는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 전사체에 상보적인 안티센스 뉴클레오티드를 만들어 활성을 약화하는 것일 수 있다.
본 출원에서 용어, 폴리펩티드 활성의 "강화"는, 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되는 것을 의미한다. 상기 강화는 활성화(activation), 상향조절(up-regulation), 과발현(overexpression), 증가(increase) 등의 용어와 혼용될 수 있다. 여기서 활성화, 강화, 상향조절, 과발현, 증가는 본래 가지고 있지 않았던 활성을 나타내게 되는 것, 또는 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 향상된 활성을 나타내게 되는 것을 모두 포함할 수 있다. 상기 “내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성을 의미한다. 이는 "변형 전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 "강화", "상향조절", "과발현" 또는 "증가"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성 및/또는 농도(발현량)에 비하여 향상된 것을 의미한다.
상기 강화는 외래의 폴리펩티드를 도입하거나, 내재적인 폴리펩티드의 활성 강화 및/또는 농도(발현량)를 통해 달성할 수 있다. 상기 폴리펩티드의 활성의 강화 여부는 해당 폴리펩티드의 활성 정도, 발현량 또는 해당 폴리펩티드로부터 배출되는 산물의 양의 증가로부터 확인할 수 있다.
상기 폴리펩티드의 활성의 강화는 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하며, 목적 폴리펩티드의 활성을 변형전 미생물보다 강화시킬 수 있는 한, 제한되지 않는다. 구체적으로, 분자생물학의 일상적 방법인 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 유전자 공학 및/또는 단백질 공학을 이용한 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다(예컨대, Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).
구체적으로, 본 출원의 폴리펩티드활성의 강화는
1) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가;
2) 폴리펩티드를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역을 활성이 강력한 서열로 교체;
3) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열의 변형;
4) 폴리펩티드 활성이 강화되도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열의 변형;
5) 폴리펩티드 활성이 강화도록 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형(예를 들어, 폴리펩티드의 활성이 강화되도록 변형된 폴리펩티드를 코딩하도록 상기 폴리펩티드 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형);
6) 폴리펩티드의 활성을 나타내는 외래 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입;
7) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화;
8) 폴리펩티드의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식; 또는
9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로,
상기 1) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가는, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터의 숙주세포 내로의 도입에 의해 달성되는 것일 수 있다. 또는, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내의 염색체 내에 1 카피 또는 2 카피 이상 도입에 의해 달성되는 것일 수 있다. 상기 염색체 내에 도입은 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 벡터는 전술한 바와 같다.
상기 2) 폴리펩티드를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역(또는 발현조절서열)을 활성이 강력한 서열로 교체는, 예를 들면, 상기 발현조절영역의 활성을 더욱 강화하도록 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 강한 활성을 가지는 서열로의 교체일 수 있다. 상기 발현조절영역은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 그리고 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다. 일 예로, 본래의 프로모터를 강력한 프로모터로 교체시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
공지된 강력한 프로모터의 예에는 CJ1 내지 CJ7 프로모터(미국등록특허 US 7662943 B2), lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터, tet 프로모터, gapA 프로모터, SPL7 프로모터, SPL13(sm3) 프로모터(미국등록특허 US 10584338 B2), O2 프로모터(미국등록특허 US 10273491 B2), tkt 프로모터, yccA 프로모터 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 3) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열 변형은, 예를 들면, 내재적 개시코돈에 비해 폴리펩티드 발현율이 더 높은 다른 개시코돈을 코딩하는 염기 서열로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 4) 및 5)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 폴리펩티드의 활성을 강화하도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 활성이 증가하도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열로의 교체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 교체는 구체적으로 상동재조합에 의하여 폴리뉴클레오티드를 염색체내로 삽입함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때 사용되는 벡터는 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 전술한 바와 같다.
상기 6) 폴리펩티드의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입은, 상기 폴리펩티드와 동일/유사한 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 숙주세포 내 도입일 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리펩티드와 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한이 없다. 상기 도입에 이용되는 방법은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 폴리펩티드가 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.
상기 7) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화는, 내재 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 전사 또는 번역이 증가하도록 코돈 최적화한 것이거나, 또는 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화한 것일 수 있다.
상기 8) 폴리펩티드의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식하는 것은, 예를 들어 분석하고자 하는 폴리펩티드의 서열정보를 기지 단백질들의 서열정보가 저장된 데이터베이스와 비교함으로써 서열의 유사성 정도에 따라 주형 단백질 후보를 결정하고 이를 토대로 구조를 확인하여, 변형하거나 화학적으로 수식할 노출 부위를 선택하여 변형 또는 수식하는 것일 수 있다.
이와 같은 폴리펩티드 활성의 강화는, 상응하는 폴리펩티드의 활성 또는 농도 발현량이 야생형이나 변형 전 미생물 균주에서 발현된 폴리펩티드의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 증가되거나, 해당 폴리펩티드로부터 생산되는 산물의 양의 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 미생물에서 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체의 변형은 (a) 미생물 내 염색체 삽입용 벡터를 이용한 상동 재조합 또는 유전자가위(engineered nuclease, e.g., CRISPR-Cas9)을 이용한 유전체 교정 및/또는 (b) 자외선 및 방사선 등과 같은 빛 및/또는 화학물질 처리에 의해 유도될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 유전자 일부 또는 전체의 변형 방법에는 DNA 재조합 기술에 의한 방법이 포함될 수 있다. 예를 들면, 목적 유전자와 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터를 상기 미생물에 주입하여 상동 재조합(homologous recombination)이 일어나게 함으로써 유전자 일부 또는 전체의 결손이 이루어질 수 있다. 상기 주입되는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터는 우성 선별 마커를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 (i) 본 출원의 하나 이상의 변이체 (ii) 상기 변이체를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 (iii) 이들의 조합을 포함하는 에스케리치아 콜라이 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-아미노산 생산방법을 제공한다. 본 출원의 L-아미노산은 본 출원의 변이체 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드 또는 본 출원의 벡터를 포함하는 에스케리치아 콜라이 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
더불어, 본 출원의 L-아미노산은 L-트립토판일 수 있다.
본 출원에서, 용어 "배양"은 본 출원의 에스케리치아 콜라이 균주를 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및/또는 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "배지"는 본 출원의 에스케리치아 콜라이 균주를 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 출원의 에스케리치아 콜라이 균주의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 출원의 에스케리치아 콜라이 균주를 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
구체적으로, 에스케리치아 콜라이 균주에 대한 배양 배지는 문헌["Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에서 찾아 볼 수 있다.
본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 출원의 에스케리치아 콜라이 균주의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 배양에서 배양온도는 20 내지 45℃ 구체적으로는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 배양에 의하여 생산된 L-아미노산은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
본 출원의 L-아미노산 생산방법은, 본 출원의 에스케리치아 콜라이 균주를 준비하는 단계, 상기 균주를 배양하기 위한 배지를 준비하는 단계, 또는 이들의 조합(순서에 무관, in any order)을, 예를 들어, 상기 배양하는 단계 이전에, 추가로 포함할 수 있다.
본 출원의 L-아미노산 생산방법은, 상기 배양에 따른 배지(배양이 수행된 배지) 또는 본 출원의 에스케리치아 콜라이 균주로부터 L-아미노산을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 회수하는 단계는 상기 배양하는 단계 이후에 추가로 포함될 수 있다.
상기 회수는 본 출원의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 목적하는 L-아미노산을 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 또는 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 L-아미노산을 회수할 수 있다.
또한, 본 출원의 L-아미노산 생산방법은, 추가적으로 정제 단계를 포함할 수 있다. 상기 정제는 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여, 수행할 수 있다. 일 예에서, 본 출원의 L-아미노산 생산방법이 회수 단계와 정제 단계를 모두 포함하는 경우, 상기 회수 단계와 정제 단계는 순서에 상관없이 연속적 또는 비연속적으로 수행되거나, 동시에 또는 하나의 단계로 통합되어 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 방법에서, 변이체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 균주, L-트립토판 등은 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 하나 이상의 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 벡터 또는 본 출원의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 에스케리치아 콜라이 균주; 이를 배양한 배지; 또는 이들 중 2 이상의 조합을 포함하는 L-아미노산 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 조성물은 L-아미노산 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 부형제는, 예를 들어 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 조성물에서, 변이체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 균주, L-아미노산 등은 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 출원을 예시하기 위한 바람직한 실시양태에 불과한 것이며 따라서, 본 출원의 권리범위를 이에 한정하는 것으로 의도되지는 않는다. 한편, 본 명세서에 기재되지 않은 기술적인 사항들은 본 출원의 기술 분야 또는 유사 기술 분야에서 숙련된 통상의 기술자이면 충분히 이해하고 용이하게 실시할 수 있다.
실시예 1: 데옥시구아노신트리포스페이트 트리포스포하이드로레이즈 변이체를 발현하는 미생물의 L-트립토판 생산능 평가
실시예 1-1. 데옥시구아노신트리포스페이트 트리포스포하이드로레이즈 변이체 발현 균주 제작
dgt 변이체(D100N; 서열번호 1) 형질을 갖도록 하기 위해서 대장균 W3110 gDNA를 주형으로 하고 서열번호 45 및 46의 서열의 프라이머 쌍과 서열번호 47 및 48의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여　대장균 dgt D100N 변이체의 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 단편을 각각 PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 1분 어닐링, 72℃ 1분 중합을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 염색체상 상동재조합이 발생하기 위해서 상기의 각각 증폭된 dgt D100N 변이체의 업스트림 지역과 다운스트림 지역, 그리고 SmaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pSG76-C 플라즈미드(JOURNAL OF BACTERIOLOGY,July 1997, p. 4426-4428)는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며,　pSG76-C-dgt(D100N)로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다. CJ600 균주(KR10-0792095)에 상기의 pSG76-C-dgt(D100N) 플라스미드를 형질전환하여 LB-Cm(Yeast extract 10g/L, NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Chlororamphenicol 25ug/L) 고체 배지에서 배양한 후 chloramphenicol 내성을 가지는 콜로니을 선발하였다. 선별된 형질 전환체는 서열번호 49 및 50의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여 pSG76-C-dgt(D100N) 플라스미드가 염색체 내 dgt 유전자 부분에 삽입된 균주 임을 확인하였다. 1차로 확인된 dgt(D100N) 변이체가 삽입된 균주에 pST76-AsceP(Nucleic Acids Research, Volume 27, Issue 22, 1 November 1999, Pages 4409-4415)를 형질 전환하여 LB-Amp(Yeast extract 10g/L, NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Ampicillin 100ug/L) 고체 배지, 30℃에서 생장하는 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니들은 LB, LB-Amp, LB-Cm 고체 배지에 각각 picking하여 42℃에서 16시간 동안 배양하였다. LB 고체 배지에서는 생장하고 LB-Amp, LB-Cm 고체배지에서 생장하지 않는 콜로니들은 모두 pST76-AsceP 플라스미드가 curing 되었음을 확인하였다. 최종적으로 pST76-AsceP 플라스미드가 curing이 확인된 콜로니들은 각각 서열번호 49 및 50의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여 dgt 유전자를 증폭하였고, 시퀀싱을 통해 dgt(D100N)로 교체된 균주를 선별하였다. 이렇게 제작된 균주는 CJ600_dgt_D100N으로 명명하였다
실시예 1-2: 데옥시구아노신트리포스페이트 트리포스포하이드로레이즈 변이체를 발현하는 미생물의 L-트립토판 생산능 평가
상기 실시예 1-1에서 제작된 각 균주 및 대조군 모균주의 플라스크 발효역가 평가를 통해 L-트립토판 생산능을 분석하였다.
대조군 모균주 CJ600과 실시예 1-1에서 제작된 재조합 균주 CJ600_dgt_D100N의 콜로니를 백금이를 이용하여 LB 고체배지에서 밤새 배양하였다. 성장한 균주들을 생산배지 25ml을 함유하는 250ml 코너-바플 플라스크에 한 백금이씩 접종하고, 37℃에서 48시간 동안 200rpm 으로 진탕 배양하였다. 배양 종류 후 HPLC로 L-트립토판의 생산능을 측정하였다.
<생산배지 (pH 7.0)>
포도당 60 g, 효모 추출물(yeast extract) 2.5g, 암모늄 설페이트 [(NH4)2SO4.7H2O] 20g, 마그네슘 설페이트 (MgSO4) 1g, 포타슘 디히드로겐포스페이트 (KH2PO4) 2g, 구연산 나트륨 (Na-citrate) 5g, 소디움 클로라이드 (NaCl) 1g, 타이로신 (L-tyrosine) 0.1g, L-페닐알라닌 (L-phenylalanine) 0.15g, 칼슘 카르보네이트 (CaCO3) 40g (증류수 1리터 기준)
상기 실험은 3번 반복하였으며, 그 분석 결과의 평균값을 아래 표 1에 나타내었다.
L-트립토판 생산능 비교
균 주 L-트립토판 농도 (g/L)
CJ600 6.5
CJ600_dgt_D100N 7.2
표 1과 같이, CJ600_dgt_D100N 균주는 대조군에 비해 증가된 L-트립토판 생산능을 나타내었다.
상기 CJ600_dgt_D100N은 CA04-4588으로 명명하였으며, 부다페스트조약 하의 수탁기관인 한국미생물보존센터에 2020년 12월 2일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM12880P를 부여받았다.
실시예 2: 쿠퍼익스포팅 P-type 에이티피에이즈 A 변이체를 발현하는 미생물의 L-트립토판 생산능 평가
실시예 2-1. 쿠퍼익스포팅 P-type 에이티피에이즈 A 변이체 발현 균주 제작
copA 변이체(S786N; 서열번호 5) 형질을 갖도록 하기 위해서 대장균 W3110 gDNA를 주형으로 하고 서열번호 51 및 52의 서열의 프라이머 쌍과 서열번호 53 및 54의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여　대장균 copA S786N 변이체의 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 단편을 각각 PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 1분 어닐링, 72℃ 1분 중합을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 염색체상 상동재조합이 발생하기 위해서 상기의 각각 증폭된 copA S786N 변이체의 업스트림 지역과 다운스트림 지역, 그리고 SmaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pSG76-C 플라즈미드(JOURNAL OF BACTERIOLOGY,July 1997, p. 4426-4428)는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며,　pSG76-C-copA(S786N)로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다. CJ600 균주(KR10-0792095)에 상기의 pSG76-C-copA(S786N) 플라스미드를 형질전환하여 LB-Cm(Yeast extract 10g/L, NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Chlororamphenicol 25ug/L) 배지에서 배양한 후 chloramphenicol 내성을 가지는 콜로니을 선발하였다. 선별된 형질 전환체는 서열번호 55 및 56의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여 pSG76-C-copA(S786N) 플라스미드가 염색체 내 copA 유전자 부분에 삽입된 균주 임을 확인하였다. 1차로 확인된 copA(S786N) 변이체가 삽입된 균주에 pST76-AsceP(Nucleic Acids Research, Volume 27, Issue 22, 1 November 1999, Pages 4409-4415)를 형질 전환하여 LB-Amp(Yeast extract 10g/L, NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Ampicillin 100ug/L) 고체 배지, 30℃에서 생장하는 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니들은 LB, LB-Amp, LB-Cm 고체 배지에 각각 picking하여 42℃에서 16시간 동안 배양하였다. LB 고체 배지에서는 생장하고 LB-Amp, LB-Cm 고체배지에서 생장하지 않는 콜로니들은 모두 pST76-AsceP 플라스미드가 curing 되었음을 확인하였다. 최종적으로 pST76-AsceP 플라스미드가 curing이 확인된 콜로니들은 각각 서열번호 55 및 56의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여 copA 유전자를 증폭하였고, 시퀀싱을 통해 copA(S786N)로 교체된 균주를 선별하였다. 이렇게 제작된 균주는 CJ600_copA_S786N으로 명명하였다
실시예 2-2: 쿠퍼익스포팅 P-type 에이티피에이즈 A 변이체를 발현하는 미생물의 L-트립토판 생산능 평가
상기 실시예 2-1에서 제작된 각 균주 및 대조군 모균주의 플라스크 발효역가 평가를 통해 L-트립토판 생산능을 분석하였다.
대조군 모균주 CJ600과 실시예 2-1에서 제작된 재조합 균주 CJ600_copA_S786N의 콜로니를 백금이를 이용하여 LB 고체배지에서 밤새 배양하였다. 성장한 균주들을 생산배지 25ml을 함유하는 250ml 코너-바플 플라스크에 한 백금이씩 접종하고, 37℃에서 48시간 동안 200rpm 으로 진탕 배양하였다. 배양 종류 후 HPLC로 L-트립토판의 생산능을 측정하였다.
<생산배지 (pH 7.0)>
포도당 60 g, 효모 추출물(yeast extract) 2.5g, 암모늄 설페이트 [(NH4)2SO4.7H2O] 20g, 마그네슘 설페이트 (MgSO4) 1g, 포타슘 디히드로겐포스페이트 (KH2PO4) 2g, 구연산 나트륨 (Na-citrate) 5g, 소디움 클로라이드 (NaCl) 1g, 타이로신 (L-tyrosine) 0.1g, L-페닐알라닌 (L-phenylalanine) 0.15g, 칼슘 카르보네이트 (CaCO3) 40g (증류수 1리터 기준)
상기 실험은 3번 반복하였으며, 그 분석 결과의 평균값을 아래 표 2에 나타내었다.
L-트립토판 생산능 비교
균 주 L-트립토판 농도 (g/L)
CJ600 6.5
CJ600_copA_S786N 7.38
표 2과 같이, CJ600_copA_S786N 균주는 대조군에 비해 증가된 L-트립토판 생산능을 나타내었다.상기 CJ600_copA_S786N은 CA04-4591으로 명명하였으며, 부다페스트조약 하의 수탁기관인 한국미생물보존센터에 2020년 12월 2일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM12883P를 부여받았다.
실시예 3: 페로체라테이즈 변이체를 발현하는 미생물의 L-트립토판 생산능 평가
실시예 3-1. 페로체라테이즈 변이체 발현 균주 제작
hemH 변이체(G137D; 서열번호 9) 형질을 갖도록 하기 위해서 대장균 W3110 gDNA를 주형으로 하고 서열번호 57 및 58의 서열의 프라이머 쌍과 서열번호 59 및 60의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여　대장균 hemH G137D 변이체의 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 단편을 각각 PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 1분 어닐링, 72℃ 1분 중합을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 염색체상 상동재조합이 발생하기 위해서 상기의 각각 증폭된 hemH G137D 변이체의 업스트림 지역과 다운스트림 지역, 그리고 SmaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pSG76-C 플라즈미드(JOURNAL OF BACTERIOLOGY,July 1997, p. 4426-4428)는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며,　pSG76-C-hemH(G137D)로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다. CJ600 균주(KR10-0792095)에 상기의 pSG76-C-hemH(G137D) 플라스미드를 형질전환하여 LB-Cm(Yeast extract 10g/L, NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Chlororamphenicol 25ug/L) 배지에서 배양한 후 chloramphenicol 내성을 가지는 콜로니을 선발하였다. 선별된 형질 전환체는 서열번호 61 및 62의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여 pSG76-C-hemH(G137D) 플라스미드가 염색체 내 hemH 유전자 부분에 삽입된 균주 임을 확인하였다. 1차로 확인된 hemH(G137D) 변이체가 삽입된 균주에 pST76-AsceP(Nucleic Acids Research, Volume 27, Issue 22, 1 November 1999, Pages 4409-4415)를 형질 전환하여 LB-Amp(Yeast extract 10g/L, NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Ampicillin 100ug/L) 고체 배지, 30℃에서 생장하는 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니들은 LB, LB-Amp, LB-Cm 고체 배지에 각각 picking하여 42℃에서 16시간 동안 배양하였다. LB 고체 배지에서는 생장하고 LB-Amp, LB-Cm 고체배지에서 생장하지 않는 콜로니들은 모두 pST76-AsceP 플라스미드가 curing 되었음을 확인하였다. 최종적으로 pST76-AsceP 플라스미드가 curing이 확인된 콜로니들은 각각 서열번호 61 및 62의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여 hemH 유전자를 증폭하였고, 시퀀싱을 통해 hemH(G137D)로 교체된 균주를 선별하였다. 이렇게 제작된 균주는 CJ600_hemH_G137D으로 명명하였다
실시예 3-2: 페로체라테이즈 변이체를 발현하는 미생물의 L-트립토판 생산능 평가
상기 실시예 3-1에서 제작된 각 균주 및 대조군 모균주의 플라스크 발효역가 평가를 통해 L-트립토판 생산능을 분석하였다.
대조군 모균주 CJ600과 실시예 3-1에서 제작된 재조합 균주 CJ600_hemH_G137D의 콜로니를 백금이를 이용하여 LB 고체배지에서 밤새 배양하였다. 성장한 균주들을 생산배지 25ml을 함유하는 250ml 코너-바플 플라스크에 한 백금이씩 접종하고, 37℃에서 48시간 동안 200rpm 으로 진탕 배양하였다. 배양 종류 후 HPLC로 L-트립토판의 생산능을 측정하였다.
<생산배지 (pH 7.0)>
포도당 60 g, 효모 추출물(yeast extract) 2.5g, 암모늄 설페이트 [(NH4)2SO4.7H2O] 20g, 마그네슘 설페이트 (MgSO4) 1g, 포타슘 디히드로겐포스페이트 (KH2PO4) 2g, 구연산 나트륨 (Na-citrate) 5g, 소디움 클로라이드 (NaCl) 1g, 타이로신 (L-tyrosine) 0.1g, L-페닐알라닌 (L-phenylalanine) 0.15g, 칼슘 카르보네이트 (CaCO3) 40g (증류수 1리터 기준)
상기 실험은 3번 반복하였으며, 그 분석 결과의 평균값을 아래 표 3에 나타내었다.
L-트립토판 생산능 비교
균 주 L-트립토판 농도 (g/L)
CJ600 6.5
CJ600_hemH_G137D 7.22
표 3과 같이, CJ600_hemH_G137D 균주는 대조군에 비해 증가된 L-트립토판 생산능을 나타내었다.상기 CJ600_hemH_G137D는 CA04-4590으로 명명하였으며, 부다페스트조약 하의 수탁기관인 한국미생물보존센터에 2020년 12월 2일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM12882P를 부여받았다.
실시예 4: 하이드로레이즈 변이체를 발현하는 미생물의 L-트립토판 생산능 평가
실시예 4-1. 하이드로레이즈 변이체 발현 균주 제작
ynbC 변이체(P149L; 서열번호 13) 형질을 갖도록 하기 위해서 대장균 W3110 gDNA를 주형으로 하고 서열번호 63 및 64의 서열의 프라이머 쌍과 서열번호 65 및 66의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여　대장균 ynbC P149L 변이체의 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 단편을 각각 PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 1분 어닐링, 72℃ 1분 중합을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 염색체상 상동재조합이 발생하기 위해서 상기의 각각 증폭된 ynbC P149L 변이체의 업스트림 지역과 다운스트림 지역, 그리고 SmaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pSG76-C 플라즈미드(JOURNAL OF BACTERIOLOGY,July 1997, p. 4426-4428)는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며,　pSG76-C-ynbC(P149L)로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다. CJ600 균주(KR10-0792095)에 상기의 pSG76-C-ynbC(P149L) 플라스미드를 형질전환하여 LB-Cm(Yeast extract 10g/L, NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Chlororamphenicol 25ug/L) 배지에서 배양한 후 chloramphenicol 내성을 가지는 콜로니을 선발하였다. 선별된 형질 전환체는 서열번호 67 및 68의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여 pSG76-C-ynbC(P149L) 플라스미드가 염색체 내 ynbC 유전자 부분에 삽입된 균주 임을 확인하였다. 1차로 확인된 ynbC(P149L) 변이체가 삽입된 균주에 pST76-AsceP(Nucleic Acids Research, Volume 27, Issue 22, 1 November 1999, Pages 4409-4415)를 형질 전환하여 LB-Amp(Yeast extract 10g/L, NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Ampicillin 100ug/L) 고체 배지, 30℃에서 생장하는 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니들은 LB, LB-Amp, LB-Cm 고체 배지에 각각 picking하여 42℃에서 16시간 동안 배양하였다. LB 고체 배지에서는 생장하고 LB-Amp, LB-Cm 고체배지에서 생장하지 않는 콜로니들은 모두 pST76-AsceP 플라스미드가 curing 되었음을 확인하였다. 최종적으로 pST76-AsceP 플라스미드가 curing이 확인된 콜로니들은 각각 서열번호 67 및 68의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여 ynbC 유전자를 증폭하였고, 시퀀싱을 통해 ynbC(P149L)로 교체된 균주를 선별하였다. 이렇게 제작된 균주는 CJ600_ynbC_P149L으로 명명하였다
실시예 4-2: 하이드로레이즈 변이체를 발현하는 미생물의 L-트립토판 생산능 평가
상기 실시예 4-1에서 제작된 각 균주 및 대조군 모균주의 플라스크 발효역가 평가를 통해 L-트립토판 생산능을 분석하였다.
대조군 모균주 CJ600과 실시예 4-1에서 제작된 재조합 균주 CJ600_ynbC_P149L의 콜로니를 백금이를 이용하여 LB 고체배지에서 밤새 배양하였다. 성장한 균주들을 생산배지 25ml을 함유하는 250ml 코너-바플 플라스크에 한 백금이씩 접종하고, 37℃에서 48시간 동안 200rpm 으로 진탕 배양하였다. 배양 종류 후 HPLC로 L-트립토판의 생산능을 측정하였다.
<생산배지 (pH 7.0)>
포도당 60 g, 효모 추출물(yeast extract) 2.5g, 암모늄 설페이트 [(NH4)2SO4.7H2O] 20g, 마그네슘 설페이트 (MgSO4) 1g, 포타슘 디히드로겐포스페이트 (KH2PO4) 2g, 구연산 나트륨 (Na-citrate) 5g, 소디움 클로라이드 (NaCl) 1g, 타이로신 (L-tyrosine) 0.1g, L-페닐알라닌 (L-phenylalanine) 0.15g, 칼슘 카르보네이트 (CaCO3) 40g (증류수 1리터 기준)
상기 실험은 3번 반복하였으며, 그 분석 결과의 평균값을 아래 표 4에 나타내었다.
L-트립토판 생산능 비교
균 주 L-트립토판 농도 (g/L)
CJ600 6.5
CJ600_ynbC_P149L 7.6
표 4과 같이, CJ600_ynbC_P149L 균주는 대조군에 비해 증가된 L-트립토판 생산능을 나타내었다.상기 CJ600_ynbC_P149L은 CA04-4592로 명명하였으며, 부다페스트조약 하의 수탁기관인 한국미생물보존센터에 2020년 12월 2일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM12884P를 부여받았다.
실시예 5: 사이토신 퍼미에이즈 변이체를 발현하는 미생물의 L-트립토판 생산능 평가
실시예 5-1. 사이토신 퍼미에이즈 변이체 발현 균주 제작
codB 변이체(I401T; 서열번호 17) 형질을 갖도록 하기 위해서 대장균 W3110 gDNA를 주형으로 하고 서열번호 69 및 70의 서열의 프라이머 쌍과 서열번호 71 및 72의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여　대장균 codB I401T 변이체의 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 단편을 각각 PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 1분 어닐링, 72℃ 1분 중합을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 염색체상 상동재조합이 발생하기 위해서 상기의 각각 증폭된 codB I401T 변이체의 업스트림 지역과 다운스트림 지역, 그리고 SmaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pSG76-C 플라즈미드(JOURNAL OF BACTERIOLOGY,July 1997, p. 4426-4428)는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며,　pSG76-C-codB(I401T)로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다. CJ600 균주(KR10-0792095)에 상기의 pSG76-C-codB(I401T) 플라스미드를 형질전환하여 LB-Cm(Yeast extract 10g/L, NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Chlororamphenicol 25ug/L) 배지에서 배양한 후 chloramphenicol 내성을 가지는 콜로니을 선발하였다. 선별된 형질 전환체는 서열번호 73 및 74의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여 pSG76-C-codB(I401T) 플라스미드가 염색체 내 codB 유전자 부분에 삽입된 균주 임을 확인하였다. 1차로 확인된 codB(I401T) 변이체가 삽입된 균주에 pST76-AsceP(Nucleic Acids Research, Volume 27, Issue 22, 1 November 1999, Pages 4409-4415)를 형질 전환하여 LB-Amp(Yeast extract 10g/L, NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Ampicillin 100ug/L) 고체 배지, 30℃에서 생장하는 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니들은 LB, LB-Amp, LB-Cm 고체 배지에 각각 picking하여 42℃에서 16시간 동안 배양하였다. LB 고체 배지에서는 생장하고 LB-Amp, LB-Cm 고체배지에서 생장하지 않는 콜로니들은 모두 pST76-AsceP 플라스미드가 curing 되었음을 확인하였다. 최종적으로 pST76-AsceP 플라스미드가 curing이 확인된 콜로니들은 각각 서열번호 73 및 74의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여 codB 유전자를 증폭하였고, 시퀀싱을 통해 codB(I401T)로 교체된 균주를 선별하였다. 이렇게 제작된 균주는 CJ600_codB_I401T으로 명명하였다
실시예 5-2: 사이토신 퍼미에이즈 변이체를 발현하는 미생물의 L-트립토판 생산능 평가
상기 실시예 5-1에서 제작된 각 균주 및 대조군 모균주의 플라스크 발효역가 평가를 통해 L-트립토판 생산능을 분석하였다.
대조군 모균주 CJ600과 실시예 5-1에서 제작된 재조합 균주 CJ600_codB_I401T의 콜로니를 백금이를 이용하여 LB 고체배지에서 밤새 배양하였다. 성장한 균주들을 생산배지 25ml을 함유하는 250ml 코너-바플 플라스크에 한 백금이씩 접종하고, 37℃에서 48시간 동안 200rpm 으로 진탕 배양하였다. 배양 종류 후 HPLC로 L-트립토판의 생산능을 측정하였다.
<생산배지 (pH 7.0)>
포도당 60 g, 효모 추출물(yeast extract) 2.5g, 암모늄 설페이트 [(NH4)2SO4.7H2O] 20g, 마그네슘 설페이트 (MgSO4) 1g, 포타슘 디히드로겐포스페이트 (KH2PO4) 2g, 구연산 나트륨 (Na-citrate) 5g, 소디움 클로라이드 (NaCl) 1g, 타이로신 (L-tyrosine) 0.1g, L-페닐알라닌 (L-phenylalanine) 0.15g, 칼슘 카르보네이트 (CaCO3) 40g (증류수 1리터 기준)
상기 실험은 3번 반복하였으며, 그 분석 결과의 평균값을 아래 표 5에 나타내었다.
L-트립토판 생산능 비교
균 주 L-트립토판 농도 (g/L)
CJ600 6.5
CJ600_codB_I401T 7.9
표 5과 같이, CJ600_codB_I401T 균주는 대조군에 비해 증가된 L-트립토판 생산능을 나타내었다.상기 CJ600_codB_I401T는 CA04-4589로 명명하였으며, 부다페스트조약 하의 수탁기관인 한국미생물보존센터에 2020년 12월 2일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM12881P를 부여받았다.
실시예 6: 타우토머레이즈 pptA 변이체를 발현하는 미생물의 L-트립토판 생산능 평가
실시예 6-1. 타우토머레이즈 pptA 변이체 발현 균주 제작
pptA 변이체(R31H; 서열번호 21) 형질을 갖도록 하기 위해서 대장균 W3110 gDNA를 주형으로 하고 서열번호 75 및 76의 서열의 프라이머 쌍과 서열번호 77 및 78의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여　대장균 pptA R31H 변이체의 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 단편을 각각 PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 1분 어닐링, 72℃ 1분 중합을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 염색체상 상동재조합이 발생하기 위해서 상기의 각각 증폭된 pptA R31H 변이체의 업스트림 지역과 다운스트림 지역, 그리고 SmaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pSG76-C 플라즈미드(JOURNAL OF BACTERIOLOGY,July 1997, p. 4426-4428)는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며,　pSG76-C-pptA(R31H)로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다. CJ600 균주(KR10-0792095)에 상기의 pSG76-C-pptA(R31H) 플라스미드를 형질전환하여 LB-Cm(Yeast extract 10g/L, NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Chlororamphenicol 25ug/L) 배지에서 배양한 후 chloramphenicol 내성을 가지는 콜로니을 선발하였다. 선별된 형질 전환체는 서열번호 79 및 80의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여 pSG76-C-pptA(R31H) 플라스미드가 염색체 내 pptA 유전자 부분에 삽입된 균주 임을 확인하였다. 1차로 확인된 pptA(R31H) 변이체가 삽입된 균주에 pST76-AsceP(Nucleic Acids Research, Volume 27, Issue 22, 1 November 1999, Pages 4409-4415)를 형질 전환하여 LB-Amp(Yeast extract 10g/L, NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Ampicillin 100ug/L) 고체 배지, 30℃에서 생장하는 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니들은 LB, LB-Amp, LB-Cm 고체 배지에 각각 picking하여 42℃에서 16시간 동안 배양하였다. LB 고체 배지에서는 생장하고 LB-Amp, LB-Cm 고체배지에서 생장하지 않는 콜로니들은 모두 pST76-AsceP 플라스미드가 curing 되었음을 확인하였다. 최종적으로 pST76-AsceP 플라스미드가 curing이 확인된 콜로니들은 각각 서열번호 79 및 80의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여 pptA 유전자를 증폭하였고, 시퀀싱을 통해 pptA(R31H)로 교체된 균주를 선별하였다. 이렇게 제작된 균주는 CJ600_pptA_R31H로 명명하였다
실시예 6-2: 타우토머레이즈 pptA 변이체를 발현하는 미생물의 L-트립토판 생산능 평가
상기 실시예 6-1에서 제작된 각 균주 및 대조군 모균주의 플라스크 발효역가 평가를 통해 L-트립토판 생산능을 분석하였다.
대조군 모균주 CJ600과 실시예 6-1에서 제작된 재조합 균주 CJ600_pptA_R31H의 콜로니를 백금이를 이용하여 LB 고체배지에서 밤새 배양하였다. 성장한 균주들을 생산배지 25ml을 함유하는 250ml 코너-바플 플라스크에 한 백금이씩 접종하고, 37℃에서 48시간 동안 200rpm 으로 진탕 배양하였다. 배양 종류 후 HPLC로 L-트립토판의 생산능을 측정하였다.
<생산배지 (pH 7.0)>
포도당 60 g, 효모 추출물(yeast extract) 2.5g, 암모늄 설페이트 [(NH4)2SO4.7H2O] 20g, 마그네슘 설페이트 (MgSO4) 1g, 포타슘 디히드로겐포스페이트 (KH2PO4) 2g, 구연산 나트륨 (Na-citrate) 5g, 소디움 클로라이드 (NaCl) 1g, 타이로신 (L-tyrosine) 0.1g, L-페닐알라닌 (L-phenylalanine) 0.15g, 칼슘 카르보네이트 (CaCO3) 40g (증류수 1리터 기준)
상기 실험은 3번 반복하였으며, 그 분석 결과의 평균값을 아래 표6에 나타내었다.
L-트립토판 생산능 비교
균 주 L-트립토판 농도 (g/L)
CJ600 6.5
CJ600_pptA_R31H 7.8
표 6과 같이, CJ600_pptA_R31H 균주는 대조군에 비해 증가된 L-트립토판 생산능을 나타내었다.상기 CJ600_pptA_R31H는 CA04-4593으로 명명하였으며, 부다페스트조약 하의 수탁기관인 한국미생물보존센터에 2020년 12월 2일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM12885P를 부여받았다.
실시예 7: 단백질 HtrL 변이체를 발현하는 미생물의 L-트립토판 생산능 평가
실시예 7-1. 단백질 HtrL 변이체 발현 균주 제작
yibB 변이체(T156I; 서열번호 25) 형질을 갖도록 하기 위해서 대장균 W3110 gDNA를 주형으로 하고 서열번호 81 및 82의 서열의 프라이머 쌍과 서열번호 83 및 84의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여　대장균 yibB T156I 변이체의 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 단편을 각각 PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 1분 어닐링, 72℃ 1분 중합을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 염색체상 상동재조합이 발생하기 위해서 상기의 각각 증폭된 yibB T156I 변이체의 업스트림 지역과 다운스트림 지역, 그리고 SmaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pSG76-C 플라즈미드(JOURNAL OF BACTERIOLOGY,July 1997, p. 4426-4428)는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며,　pSG76-C-yibB(T156I)로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다. CJ600 균주(KR10-0792095)에 상기의 pSG76-C-yibB(T156I) 플라스미드를 형질전환하여 LB-Cm(Yeast extract 10g/L, NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Chlororamphenicol 25ug/L) 배지에서 배양한 후 chloramphenicol 내성을 가지는 콜로니을 선발하였다. 선별된 형질 전환체는 서열번호 85 및 86의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여 pSG76-C-yibB(T156I) 플라스미드가 염색체 내 yibB 유전자 부분에 삽입된 균주 임을 확인하였다. 1차로 확인된 yibB(T156I) 변이체가 삽입된 균주에 pST76-AsceP(Nucleic Acids Research, Volume 27, Issue 22, 1 November 1999, Pages 4409-4415)를 형질 전환하여 LB-Amp(Yeast extract 10g/L, NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Ampicillin 100ug/L) 고체 배지, 30℃에서 생장하는 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니들은 LB, LB-Amp, LB-Cm 고체 배지에 각각 picking하여 42℃에서 16시간 동안 배양하였다. LB 고체 배지에서는 생장하고 LB-Amp, LB-Cm 고체배지에서 생장하지 않는 콜로니들은 모두 pST76-AsceP 플라스미드가 curing 되었음을 확인하였다. 최종적으로 pST76-AsceP 플라스미드가 curing이 확인된 콜로니들은 각각 서열번호 85 및 86의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여 yibB 유전자를 증폭하였고, 시퀀싱을 통해 yibB(T156I)로 교체된 균주를 선별하였다. 이렇게 제작된 균주는 CJ600_yibB_T156I로 명명하였다
실시예 7-2: 단백질 HtrL 변이체를 발현하는 미생물의 L-트립토판 생산능 평가
상기 실시예 7-1에서 제작된 각 균주 및 대조군 모균주의 플라스크 발효역가 평가를 통해 L-트립토판 생산능을 분석하였다.
대조군 모균주 CJ600과 실시예 7-1에서 제작된 재조합 균주 CJ600_yibB_T156I의 콜로니를 백금이를 이용하여 LB 고체배지에서 밤새 배양하였다. 성장한 균주들을 생산배지 25ml을 함유하는 250ml 코너-바플 플라스크에 한 백금이씩 접종하고, 37℃에서 48시간 동안 200rpm 으로 진탕 배양하였다. 배양 종류 후 HPLC로 L-트립토판의 생산능을 측정하였다.
<생산배지 (pH 7.0)>
포도당 60 g, 효모 추출물(yeast extract) 2.5g, 암모늄 설페이트 [(NH4)2SO4.7H2O] 20g, 마그네슘 설페이트 (MgSO4) 1g, 포타슘 디히드로겐포스페이트 (KH2PO4) 2g, 구연산 나트륨 (Na-citrate) 5g, 소디움 클로라이드 (NaCl) 1g, 타이로신 (L-tyrosine) 0.1g, L-페닐알라닌 (L-phenylalanine) 0.15g, 칼슘 카르보네이트 (CaCO3) 40g (증류수 1리터 기준)
상기 실험은 3번 반복하였으며, 그 분석 결과의 평균값을 아래 표 7에 나타내었다.
L-트립토판 생산능 비교
균 주 L-트립토판 농도 (g/L)
CJ600 6.5
CJ600_yibB_T156I 8.12
표 7과 같이, CJ600_yibB_T156I 균주는 대조군에 비해 증가된 L-트립토판 생산능을 나타내었다.상기 CJ600_yibB_T156I은 CA04-4597으로 명명하였으며, 부다페스트조약 하의 수탁기관인 한국미생물보존센터에 2020년 12월 2일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM12887P를 부여받았다.
실시예 8: H(+)/Cl(-) 익스체인지 트랜스포터 변이체를 발현하는 미생물의 L-트립토판 생산능 평가
실시예 8-1. H(+)/Cl(-) 익스체인지 트랜스포터 변이체 발현 균주 제작
clcB 변이체(C133F; 서열번호 29) 형질을 갖도록 하기 위해서 대장균 W3110 gDNA를 주형으로 하고 서열번호 87 및 88의 서열의 프라이머 쌍과 서열번호 89 및 90의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여　대장균 clcB C133F 변이체의 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 단편을 각각 PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 1분 어닐링, 72℃ 1분 중합을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 염색체상 상동재조합이 발생하기 위해서 상기의 각각 증폭된 clcB C133F 변이체의 업스트림 지역과 다운스트림 지역, 그리고 SmaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pSG76-C 플라즈미드(JOURNAL OF BACTERIOLOGY,July 1997, p. 4426-4428)는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며,　pSG76-C-clcB(C133F)로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다. CJ600 균주(KR10-0792095)에 상기의 pSG76-C-clcB(C133F) 플라스미드를 형질전환하여 LB-Cm(Yeast extract 10g/L, NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Chlororamphenicol 25ug/L) 배지에서 배양한 후 chloramphenicol 내성을 가지는 콜로니을 선발하였다. 선별된 형질 전환체는 서열번호 91 및 92의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여 pSG76-C-clcB(C133F) 플라스미드가 염색체 내 clcB 유전자 부분에 삽입된 균주 임을 확인하였다. 1차로 확인된 clcB(C133F) 변이체가 삽입된 균주에 pST76-AsceP(Nucleic Acids Research, Volume 27, Issue 22, 1 November 1999, Pages 4409-4415)를 형질 전환하여 LB-Amp(Yeast extract 10g/L, NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Ampicillin 100ug/L) 고체 배지, 30℃에서 생장하는 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니들은 LB, LB-Amp, LB-Cm 고체 배지에 각각 picking하여 42℃에서 16시간 동안 배양하였다. LB 고체 배지에서는 생장하고 LB-Amp, LB-Cm 고체배지에서 생장하지 않는 콜로니들은 모두 pST76-AsceP 플라스미드가 curing 되었음을 확인하였다. 최종적으로 pST76-AsceP 플라스미드가 curing이 확인된 콜로니들은 각각 서열번호 91 및 92의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여 clcB 유전자를 증폭하였고, 시퀀싱을 통해 clcB(C133F)로 교체된 균주를 선별하였다. 이렇게 제작된 균주는 CJ600_clcB_C133F로 명명하였다
실시예 8-2: H(+)/Cl(-) 익스체인지 트랜스포터 변이체를 발현하는 미생물의 L-트립토판 생산능 평가
상기 실시예 8-1에서 제작된 각 균주 및 대조군 모균주의 플라스크 발효역가 평가를 통해 L-트립토판 생산능을 분석하였다.
대조군 모균주 CJ600과 실시예 8-1에서 제작된 재조합 균주 CJ600_clcB_C133F의 콜로니를 백금이를 이용하여 LB 고체배지에서 밤새 배양하였다. 성장한 균주들을 생산배지 25ml을 함유하는 250ml 코너-바플 플라스크에 한 백금이씩 접종하고, 37℃에서 48시간 동안 200rpm 으로 진탕 배양하였다. 배양 종류 후 HPLC로 L-트립토판의 생산능을 측정하였다.
<생산배지 (pH 7.0)>
포도당 60 g, 효모 추출물(yeast extract) 2.5g, 암모늄 설페이트 [(NH4)2SO4.7H2O] 20g, 마그네슘 설페이트 (MgSO4) 1g, 포타슘 디히드로겐포스페이트 (KH2PO4) 2g, 구연산 나트륨 (Na-citrate) 5g, 소디움 클로라이드 (NaCl) 1g, 타이로신 (L-tyrosine) 0.1g, L-페닐알라닌 (L-phenylalanine) 0.15g, 칼슘 카르보네이트 (CaCO3) 40g (증류수 1리터 기준)
상기 실험은 3번 반복하였으며, 그 분석 결과의 평균값을 아래 표 8에 나타내었다.
L-트립토판 생산능 비교
균 주 L-트립토판 농도 (g/L)
CJ600 6.5
CJ600_clcB_C133F 7.85
표 8과 같이, CJ600_clcB_C133F 균주는 대조군에 비해 증가된 L-트립토판 생산능을 나타내었다.상기 CJ600_clcB_C133F은 CA04-4594로 명명하였으며, 부다페스트조약 하의 수탁기관인 한국미생물보존센터에 2020년 12월 2일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM12886P를 부여받았다.
실시예 9: 시아네이트 트랜스포터 패밀리 단백질 변이체를 발현하는 미생물의 L-트립토판 생산능 평가
실시예 9-1. 시아네이트 트랜스포터 패밀리 단백질 변이체 발현 균주 제작
cynX 변이체(D259N; 서열번호 33) 형질을 갖도록 하기 위해서 대장균 W3110 gDNA를 주형으로 하고 서열번호 93 및 94의 서열의 프라이머 쌍과 서열번호 95 및 96의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여　대장균 cynX D259N 변이체의 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 단편을 각각 PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 1분 어닐링, 72℃ 1분 중합을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 염색체상 상동재조합이 발생하기 위해서 상기의 각각 증폭된 cynX D259N 변이체의 업스트림 지역과 다운스트림 지역, 그리고 SmaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pSG76-C 플라즈미드(JOURNAL OF BACTERIOLOGY,July 1997, p. 4426-4428)는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며,　pSG76-C-cynX(D259N)로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다. CJ600 균주(KR10-0792095)에 상기의 pSG76-C-cynX(D259N) 플라스미드를 형질전환하여 LB-Cm(Yeast extract 10g/L, NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Chlororamphenicol 25ug/L) 배지에서 배양한 후 chloramphenicol 내성을 가지는 콜로니을 선발하였다. 선별된 형질 전환체는 서열번호 97 및 98의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여 pSG76-C-cynX(D259N) 플라스미드가 염색체 내 cynX 유전자 부분에 삽입된 균주 임을 확인하였다. 1차로 확인된 cynX(D259N) 변이체가 삽입된 균주에 pST76-AsceP(Nucleic Acids Research, Volume 27, Issue 22, 1 November 1999, Pages 4409-4415)를 형질 전환하여 LB-Amp(Yeast extract 10g/L, NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Ampicillin 100ug/L) 고체 배지, 30℃에서 생장하는 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니들은 LB, LB-Amp, LB-Cm 고체 배지에 각각 picking하여 42℃에서 16시간 동안 배양하였다. LB 고체 배지에서는 생장하고 LB-Amp, LB-Cm 고체배지에서 생장하지 않는 콜로니들은 모두 pST76-AsceP 플라스미드가 curing 되었음을 확인하였다. 최종적으로 pST76-AsceP 플라스미드가 curing이 확인된 콜로니들은 각각 서열번호 97 및 98의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여 cynX 유전자를 증폭하였고, 시퀀싱을 통해 cynX(D259N)로 교체된 균주를 선별하였다. 이렇게 제작된 균주는 CJ600_cynX_D259N로 명명하였다
실시예 9-2: 시아네이트 트랜스포터 패밀리 단백질 변이체를 발현하는 미생물의 L-트립토판 생산능 평가
상기 실시예 1에서 제작된 각 균주 및 대조군 모균주의 플라스크 발효역가 평가를 통해 L-트립토판 생산능을 분석하였다.
대조군 모균주 CJ600과 실시예 1에서 제작된 재조합 균주 CJ600_cynX_D259N의 콜로니를 백금이를 이용하여 LB 고체배지에서 밤새 배양하였다. 성장한 균주들을 생산배지 25ml을 함유하는 250ml 코너-바플 플라스크에 한 백금이씩 접종하고, 37℃에서 48시간 동안 200rpm 으로 진탕 배양하였다. 배양 종류 후 HPLC로 L-트립토판의 생산능을 측정하였다.
<생산배지 (pH 7.0)>
포도당 60 g, 효모 추출물(yeast extract) 2.5g, 암모늄 설페이트 [(NH4)2SO4.7H2O] 20g, 마그네슘 설페이트 (MgSO4) 1g, 포타슘 디히드로겐포스페이트 (KH2PO4) 2g, 구연산 나트륨 (Na-citrate) 5g, 소디움 클로라이드 (NaCl) 1g, 타이로신 (L-tyrosine) 0.1g, L-페닐알라닌 (L-phenylalanine) 0.15g, 칼슘 카르보네이트 (CaCO3) 40g (증류수 1리터 기준)
상기 실험은 3번 반복하였으며, 그 분석 결과의 평균값을 아래 표 9에 나타내었다.
L-트립토판 생산능 비교
균 주 L-트립토판 농도 (g/L)
CJ600 6.5
CJ600_cynX_D259N 8.1
표 9과 같이, CJ600_cynX_D259N 균주는 대조군에 비해 증가된 L-트립토판 생산능을 나타내었다.상기 CJ600_cynX_D259N은 CA04-4595으로 명명하였으며, 부다페스트조약 하의 수탁기관인 한국미생물보존센터에 2020년 12월 22일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM12914P를 부여받았다.
실시예 10 아이소시트르산 디하이드로게네이즈 키나아제/포스파타제 변이체를 발현하는 미생물의 L-트립토판 생산능 평가
실시예 10-1. 아이소시트르산 디하이드로게네이즈 키나아제/포스파타제 효소 변이체 발현 균주 제작
aceK 변이체(E26K; 서열번호 37) 형질을 갖도록 하기 위해서 대장균 W3110 gDNA를 주형으로 하고 서열번호 99 및 100의 서열의 프라이머 쌍과 서열번호 101 및 102의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여　대장균 aceK E26K 변이체의 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 단편을 각각 PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 1분 어닐링, 72℃ 1분 중합을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 염색체상 상동재조합이 발생하기 위해서 상기의 각각 증폭된 aceK E26K 변이체의 업스트림 지역과 다운스트림 지역, 그리고 SmaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pSG76-C 플라즈미드(JOURNAL OF BACTERIOLOGY,July 1997, p. 4426-4428)는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며,　pSG76-C-aceK(E26K) 로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다. CJ600 균주(KR10-0792095)에 상기의 pSG76-C-aceK(E26K) 플라스미드를 형질전환하여 LB-Cm(Yeast extract 10g/L, NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Chlororamphenicol 25ug/L) 배지에서 배양한 후 chloramphenicol 내성을 가지는 콜로니을 선발하였다. 선별된 형질 전환체는 서열번호 103 및 104의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여 pSG76-C-aceK(E26K) 플라스미드가 염색체 내 aceK 유전자 부분에 삽입된 균주 임을 확인하였다. 1차로 확인된 aceK(E26K) 변이체가 삽입된 균주에 pST76-AsceP(Nucleic Acids Research, Volume 27, Issue 22, 1 November 1999, Pages 4409-4415)를 형질 전환하여 LB-Amp(Yeast extract 10g/L, NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Ampicillin 100ug/L) 고체 배지, 30℃에서 생장하는 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니들은 LB, LB-Amp, LB-Cm 고체 배지에 각각 picking하여 42℃에서 16시간 동안 배양하였다. LB 고체 배지에서는 생장하고 LB-Amp, LB-Cm 고체배지에서 생장하지 않는 콜로니들은 모두 pST76-AsceP 플라스미드가 curing 되었음을 확인하였다. 최종적으로 pST76-AsceP 플라스미드가 curing이 확인된 콜로니들은 각각 서열번호 103 및 104의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여 aceK 유전자를 증폭하였고, 시퀀싱을 통해 aceK(E26K)로 교체된 균주를 선별하였다. 이렇게 제작된 균주는 CJ600_aceK_E26K로 명명하였다.
실시예 2: 아이소시트르산 디하이드로게네이즈 키나아제/포스파타제 변이체를 발현하는 미생물의 L-트립토판 생산능 평가
상기 실시예 1에서 제작된 각 균주 및 대조군 모균주의 플라스크 발효역가 평가를 통해 L-트립토판 생산능을 분석하였다.
대조군 모균주 CJ600과 실시예 1에서 제작된 재조합 균주 CJ600_aceK_E26K의 콜로니를 백금이를 이용하여 LB 고체배지에서 밤새 배양하였다. 성장한 균주들을 생산배지 25ml을 함유하는 250ml 코너-바플 플라스크에 한 백금이씩 접종하고, 37℃에서 48시간 동안 200rpm 으로 진탕 배양하였다. 배양 종류 후 HPLC로 L-트립토판의 생산능을 측정하였다.
<생산배지 (pH 7.0)>
포도당 60 g, 효모 추출물(yeast extract) 2.5g, 암모늄 설페이트 [(NH4)2SO4.7H2O] 20g, 마그네슘 설페이트 (MgSO4) 1g, 포타슘 디히드로겐포스페이트 (KH2PO4) 2g, 구연산 나트륨 (Na-citrate) 5g, 소디움 클로라이드 (NaCl) 1g, 타이로신 (L-tyrosine) 0.1g, L-페닐알라닌 (L-phenylalanine) 0.15g, 칼슘 카르보네이트 (CaCO3) 40g (증류수 1리터 기준)
상기 실험은 3번 반복하였으며, 그 분석 결과의 평균값을 아래 표 10에 나타내었다.
L-트립토판 생산능 비교
균 주 L-트립토판 농도 (g/L)
CJ600 6.02
CJ600_aceK_E26K 7.78
표 10과 같이, CJ600_aceK_E26K 균주는 대조군에 비해 증가된 L-트립토판 생산능을 나타내었다.
실시예 11: 수용성 피리딘 뉴클레오티드 트랜스수소효소 변이체를 발현하는 미생물의 L-트립토판 생산능 평가
실시예 11-1. 수용성 피리딘 뉴클레오티드 트랜스수소효소 변이체 발현 균주 제작
sthA 변이체(A145V; 서열번호 41) 형질을 갖도록 하기 위해서 대장균 W3110 gDNA를 주형으로 하고 서열번호 105 및 106의 서열의 프라이머 쌍과 서열번호 107 및 108의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여　대장균 sthA A145V 변이체의 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 단편을 각각 PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 1분 어닐링, 72℃ 1분 중합을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 염색체상 상동재조합이 발생하기 위해서 상기의 각각 증폭된 sthA A145V 변이체의 업스트림 지역과 다운스트림 지역, 그리고 SmaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pSG76-C 플라즈미드(JOURNAL OF BACTERIOLOGY,July 1997, p. 4426-4428)는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며,　pSG76-C-sthA(A145V) 로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다. CJ600 균주(KR10-0792095)에 상기의 pSG76-C-sthA(A145V) 플라스미드를 형질전환하여 LB-Cm(Yeast extract 10g/L, NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Chlororamphenicol 25ug/L) 배지에서 배양한 후 chloramphenicol 내성을 가지는 콜로니을 선발하였다. 선별된 형질 전환체는 서열번호 109 및 110의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여 pSG76-C-sthA(A145V) 플라스미드가 염색체 내 sthA 유전자 부분에 삽입된 균주 임을 확인하였다. 1차로 확인된 sthA(A145V) 변이체가 삽입된 균주에 pST76-AsceP(Nucleic Acids Research, Volume 27, Issue 22, 1 November 1999, Pages 4409-4415)를 형질 전환하여 LB-Amp(Yeast extract 10g/L, NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Ampicillin 100ug/L) 고체 배지, 30℃에서 생장하는 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니들은 LB, LB-Amp, LB-Cm 고체 배지에 각각 picking하여 42℃에서 16시간 동안 배양하였다. LB 고체 배지에서는 생장하고 LB-Amp, LB-Cm 고체배지에서 생장하지 않는 콜로니들은 모두 pST76-AsceP 플라스미드가 curing 되었음을 확인하였다. 최종적으로 pST76-AsceP 플라스미드가 curing이 확인된 콜로니들은 각각 서열번호 109 및 110의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여 sthA 유전자를 증폭하였고, 시퀀싱을 통해 sthA(A145V)로 교체된 균주를 선별하였다. 이렇게 제작된 균주는 CJ600_sthA_A145V로 명명하였다.
실시예 11-2: 수용성 피리딘 뉴클레오티드 트랜스수소효소 변이체를 발현하는 미생물의 L-트립토판 생산능 평가
상기 실시예 11-1에서 제작된 각 균주 및 대조군 모균주의 플라스크 발효역가 평가를 통해 L-트립토판 생산능을 분석하였다.
대조군 모균주 CJ600과 실시예 11-1에서 제작된 재조합 균주 CJ600_sthA_A145V의 콜로니를 백금이를 이용하여 LB 고체배지에서 밤새 배양하였다. 성장한 균주들을 생산배지 25ml을 함유하는 250ml 코너-바플 플라스크에 한 백금이씩 접종하고, 37℃에서 48시간 동안 200rpm 으로 진탕 배양하였다. 배양 종류 후 HPLC로 L-트립토판의 생산능을 측정하였다.
<생산배지 (pH 7.0)>
포도당 60 g, 효모 추출물(yeast extract) 2.5g, 암모늄 설페이트 [(NH4)2SO4.7H2O] 20g, 마그네슘 설페이트 (MgSO4) 1g, 포타슘 디히드로겐포스페이트 (KH2PO4) 2g, 구연산 나트륨 (Na-citrate) 5g, 소디움 클로라이드 (NaCl) 1g, 타이로신 (L-tyrosine) 0.1g, L-페닐알라닌 (L-phenylalanine) 0.15g, 칼슘 카르보네이트 (CaCO3) 40g (증류수 1리터 기준)
상기 실험은 3번 반복하였으며, 그 분석 결과의 평균값을 아래 표 11에 나타내었다.
L-트립토판 생산능 비교
균 주 L-트립토판 농도 (g/L)
CJ600 6.11
CJ600_sthA_A145V 7.75
표 11과 같이, CJ600_sthA_A145V 균주는 대조군에 비해 증가된 L-트립토판 생산능을 나타내었다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure PCTKR2021005387-appb-I000001
Figure PCTKR2021005387-appb-I000002
Figure PCTKR2021005387-appb-I000003
Figure PCTKR2021005387-appb-I000004
Figure PCTKR2021005387-appb-I000005
Figure PCTKR2021005387-appb-I000006
Figure PCTKR2021005387-appb-I000007
Figure PCTKR2021005387-appb-I000008
Figure PCTKR2021005387-appb-I000009

Claims (3)

  1. (i) 하기 (a) 내지 (k)로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 변이체, (ii) 상기 변이체를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 (iii) 이들의 조합을 포함하는, 에스케리치아 콜라이 균주:
    (a) 서열번호 3의 100번째 위치에 상응하는 아미노산인 아스파르트산이 아스파라긴으로 치환된, 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 데옥시구아노신트리포스페이트 트리포스포하이드로레이즈 변이체;
    (b) 서열번호 7의 786번째 위치에 상응하는 아미노산인 세린이 아스파라긴으로 치환된, 서열번호 5로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 쿠퍼익스포팅 P-type 에이티피에이즈 A 변이체;
    (c) 서열번호 11의 137번째 위치에 상응하는 아미노산인 글리신이 아스파르트산으로 치환된, 서열번호 9로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 페로체라테이즈 변이체;
    (d) 서열번호 15의 149번째 위치에 상응하는 아미노산인 프롤린이 루신으로 치환된, 서열번호 13으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 하이드로레이즈 변이체;
    (e) 서열번호 19의 401번째 위치에 상응하는 아미노산인 이소루신이 트레오닌으로 치환된, 서열번호 17로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 사이토신 퍼미에이즈 변이체;
    (f) 서열번호 23의 31번째 위치에 상응하는 아미노산인 아르기닌이 히스티딘으로 치환된, 서열번호 21로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 타우토머레이즈 pptA 변이체;
    (g) 서열번호 27의 156번째 위치에 상응하는 아미노산인 트레오닌이 이소루신으로 치환된, 서열번호 25로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질 HtrL 변이체;
    (h) 서열번호 31의 133번째 위치에 상응하는 아미노산인 시스테인이 페닐알라닌으로 치환된, 서열번호 29로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 H(+)/Cl(-) 익스체인지 트랜스포터 변이체;
    (i) 서열번호 35의 259번째 위치에 상응하는 아미노산인 아스파르트산이 아스파라긴으로 치환된, 서열번호 33으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 시아네이트 트랜스포터 패밀리 단백질 변이체;
    (j) 서열번호 39의 26번째 위치에 상응하는 아미노산인 글루탐산이 라이신으로 치환된, 서열번호 37로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 아이소시트르산 디하이드로게네이즈 키나아제/포스파타제 변이체 및
    (k) 서열번호 43의 145번째 위치에 상응하는 아미노산인 알라닌이 발린 으로 치환되고, 서열번호 41로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 수용성 피리딘 뉴클레오티드 트랜스수소효소 변이체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 균주는 (i) 상기 (a) 내지 (k)로 구성되는 군에서 선택되는 둘 이상의 변이체, (ii) 상기 변이체를 코딩하는 둘 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 (iii) 이들의 조합을 포함하는, 균주.
  3. 제1항 또는 제2항의 에스케리치아 콜라이 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-트립토판 생산 방법.
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