WO2020204427A1 - 신규 l-트립토판 배출 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-트립토판을 생산하는 방법 - Google Patents

신규 l-트립토판 배출 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-트립토판을 생산하는 방법 Download PDF

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WO2020204427A1
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tryptophan
amino acid
seq
gene
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정무영
김현아
서창일
이임상
김지원
김태연
손성광
정기용
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씨제이제일제당 (주)
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
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    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Definitions

  • the present application relates to a variant of a novel protein having tryptophan-releasing activity, a microorganism expressing the protein variant, and a microorganism producing L-tryptophan, and a method of producing L-tryptophan using the microorganism.
  • Tryptophan is one of the essential amino acids and has been widely used as a raw material for pharmaceuticals and health foods such as feed additives or infusions.
  • direct fermentation using microorganisms is mainly used for L-tryptophan production.
  • Microorganisms used for the production of L-tryptophan were initially mainly selected strains that showed resistance to analogs through chemical or physical mutations, but in the 1990s, as genetic recombination technology was rapidly developed and regulatory mechanisms at the molecular level were identified, genetic manipulation techniques Recombinant strains using is mainly used.
  • the expression of a specific amino acid excreting gene has caused the productivity of the corresponding amino acid to be improved in microorganisms.
  • Enhancement of the expression of the L-lysine excreting gene (lysE) in microorganisms of the genus Corynebacterium improved the productivity of lysine (WO 9723597A2).
  • enhancement of the rhtC gene in Escherichia coli improved resistance to L-threonine and at the same time improved the productivity of L-homoserine, L-threonine, and L-leucine (EP1013765A1).
  • One object of the present application is to investigate the L-tryptophan excretion activity in which any one or more amino acids of the amino acids corresponding to 79 to 83 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 are substituted with hydrophobic or aliphatic amino acids. It is to provide a protein variant having.
  • Another object of the present application is a polynucleotide encoding the variant; And it is to provide a vector containing the same.
  • One object of the present application is to provide a microorganism that expresses the protein variant and produces L-tryptophan.
  • Another object of the present application is to provide a method for producing L-tryptophan comprising culturing the microorganism in a medium.
  • Another object of the present application is to provide a use of the protein variant to increase L-tryptophan production.
  • Figure 1 is a check of the intracellular tryptophan concentration of the coryneglutamicum bacterium mutant strains CA04-8352 and CA04-8405 according to the amount of sugar consumption.
  • One aspect of the present application provides a protein variant having L-tryptophan excretion ability, including one or more mutations in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the mutation may include substitution of any one or more amino acids selected from the 79 th to 83 th amino acids from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 with another amino acid.
  • the protein variant may be a protein variant having L-tryptophan excretion activity in which any one or more of amino acids 79 to 83 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with another amino acid. Specifically, it may be a protein variant having L-tryptophan excreting activity in which any one or more of amino acids 79 to 83 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with a hydrophobic amino acid or an aliphatic amino acid.
  • L-tryptophan refers to an aromatic L-amino acid having a chemical formula of C 11 H 12 N 2 O 2 and is an essential amino acid that is not synthesized in the body as one of ⁇ -amino acids.
  • protein having L-tryptophan excretion ability and “protein having L-tryptophan excretion activity” refer to membrane proteins having an activity capable of specifically excreting L-tryptophan out of cells.
  • the protein having L-tryptophan excreting activity may be a protein having L-tryptophan excreting activity derived from Herbaspirillum rhizosphaerae .
  • the protein having L-tryptophan excretion activity derived from Herbaspirillum rhizosphaerae may be, for example, a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may be used interchangeably with a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Herbaspirillum rhizosphaerae is a Gram-negative bacterium belonging to the genus Herbaspirillum , a strain isolated from Ulleungdo in Korea, and can be isolated from the rhizosphere in soil.
  • the protein having L-tryptophan excretion activity in the present application is defined as a protein containing the amino acid of SEQ ID NO: 1, insignificant sequence addition before and after the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a mutation that may occur naturally, or its It is obvious to those skilled in the art that if it does not exclude silent mutations, and has the same or corresponding activity as a protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, it corresponds to a protein having L-tryptophan excretion activity of the present application. Do.
  • the protein having L-tryptophan excretion activity herein is a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having 80%, 90%, 95%, or 97% homology or identity thereto. I can.
  • a protein having an amino acid sequence in which some sequence is deleted, modified, substituted or added is also included within the range of the protein subject to mutation of the present application. Is self-explanatory.
  • the amino acid at a specific position among the proteins having the L-tryptophan protein excretion ability described above is substituted, so that the L-tryptophan excretion ability exceeds 100% compared to the pre-mutation protein. It can mean a variant that becomes.
  • variants are different from the recited sequence in which one or more amino acids are conservative substitution and/or modification, but the function of the protein ( functions) or properties are maintained. Variants differ from the identified sequence by several amino acid substitutions, deletions or additions. Such variants can generally be identified by modifying one or more amino acids of the amino acid sequence of the protein and evaluating the properties of the modified protein. That is, the ability of the variant may be increased, unchanged, or decreased compared to the native protein. In addition, some variants may include variants in which one or more portions, such as an N-terminal leader sequence or a transmembrane domain, have been removed.
  • variants may include variants with a portion removed from the N- and/or C-terminus of a mature protein.
  • variant may include terms such as variant, modified, mutated protein, variant polypeptide, mutant, etc. (modification, modified protein, modified polypeptide, mutant, mutein, divergent, variant, etc. in English) may be used. , If it is a term used in a mutated meaning, it is not limited thereto.
  • the mutant may be one having an increased activity of a mutated protein compared to a natural wild-type or unmodified protein, but is not limited thereto.
  • the term "conservative substitution” means replacing one amino acid with another amino acid having similar structural and/or chemical properties. Such variants may have, for example, one or more conservative substitutions while still retaining one or more biological activities. Such amino acid substitutions can generally occur based on similarity in the polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and/or amphipathic nature of the residues. For example, among amino acids having an electrically charged amino acid, positively charged (basic) amino acids are arginine, lysine, and histidine, and negatively charged (acidic) amino acids are glutamic acid and arpartic acid.
  • nonpolar amino acids include glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, phenylalanine, tryptophan, proline, and polar or hydrophilic ( hydrophilic) amino acids include serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, glutamine, and aromatic amino acids include phenylalanine, tryptophan and tyrosine.
  • variants may include deletions or additions of amino acids that have minimal effect on the properties and secondary structure of the polypeptide.
  • the polypeptide can be conjugated with a signal (or leader) sequence at the N-terminus of the protein involved in the transfer of the protein co-translationally or post-translationally.
  • the polypeptide may be conjugated with other sequences or linkers to identify, purify, or synthesize the polypeptide.
  • The'substitution with another amino acid' is not limited as long as it is an amino acid different from the amino acid before substitution. That is, leucine, which is the 79th amino acid from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, is an amino acid residue other than leucine, or serine, which is the 80th amino acid, is an amino acid residue other than serine, or leucine, which is the 81st amino acid, is leucine. It is not limited as long as the amino acid residue other than the amino acid residue, or the 82nd amino acid serine is substituted with an amino acid residue other than serine, or the 83rd amino acid isoleucine is substituted with an amino acid residue other than isoleucine. On the other hand, in the present application, when expressing'a specific amino acid has been substituted', it is obvious that it is substituted with an amino acid different from the amino acid before the substitution, even if it is not separately indicated that it is substituted with another amino acid.
  • the protein variant may be one in which any one or more of amino acids 79 to 83 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with an amino acid other than the amino acid before substitution, other than the acidic amino acid and the basic amino acid.
  • the protein variant may be a variant having an uncharged amino acid, substituted with an amino acid different from the amino acid before substitution, but is not limited thereto.
  • the protein variant may be a variant in which any one or more of amino acids 79 to 83 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with an amino acid different from the amino acid before substitution among a hydrophobic amino acid or an aliphatic amino acid.
  • the protein variant may be a variant in which any one or more of amino acids 79 to 83 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with one of a hydrophobic (nonpolar) amino acid or an aliphatic amino acid.
  • the aliphatic amino acid may be, for example, an amino acid selected from the group consisting of glycine, alanine, valine, leucine, and isoleucine, but is not limited thereto.
  • the hydrophobic (non-polar) amino acid may be, for example, an amino acid selected from the group consisting of glycine, methionine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, tyrosine, and tryptophan, but is not limited thereto.
  • the protein variant may be a variant in which any one or more of amino acids 79 to 83 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with an amino acid different from the amino acid before substitution among amino acids having a small size, but is not limited thereto. Does not.
  • small amino acid includes glycine, alanine, serine, threonine, cysteine, valine, leucine, isoleucine, proline, and asparagine, which are relatively small amino acids among 20 amino acids.
  • Glycine, alanine, serine, threonine, cysteine, valine, leucine, isoleucine and proline may mean, but are not limited thereto, and more specifically, glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, and threonine. However, it is not limited thereto.
  • the protein variant may be a variant in which any one or more of amino acids 79 to 83 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with an amino acid selected from the group consisting of alanine, valine, leucine, and isoleucine, but is not limited thereto. Does not.
  • the substitution of another amino acid in the protein variant may include alanine, valine, or isoleucine from leucine, which is the 79th amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; Serine, the 80th amino acid, is alanine, valine, leucine, or isoleucine; 81st amino acid leucine to alanine, valine, or isoleucine; 82nd amino acid serine is alanine, valine, leucine, or isoleucine;
  • the 83rd amino acid isoleucine may be one or more substitutions selected from substitution with alanine, valine, or leucine, but is not limited thereto.
  • the protein variant of the present application as described above has an enhanced L-tryptophan excretion ability compared to the pre-mutation protein.
  • amino acids 79 to 83 from the N-terminus of SEQ ID NO: 1 of the present application is substituted with another amino acid, the amino acid at the position corresponding to the 79 to 83 is substituted with another amino acid It is obvious to include the modified protein variants.
  • amino acids 79 to 83 of SEQ ID NO: 1 refers to any sequence, for example, 50%, 60%, 70%, 80% of SEQ ID NO: 1, Or, in a sequence having 90% or more identity, it is apparent that this can also be applied to "an amino acid at a position corresponding to amino acids 79 to 83 of SEQ ID NO: 1".
  • the amino acid at the position corresponding to 79 to 83 is substituted with another amino acid
  • a protein variant having 70%, 80%, 90%, or 95% or more identity with SEQ ID NO: 1 May be, but is not limited thereto.
  • the protein variant in which any one or more of amino acids 79 to 83 is substituted with another amino acid may include an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 131 to 147, and specifically, the sequence It may consist essentially of the amino acid sequence of any one of numbers 131 to 147, and more specifically, may consist of the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 131 to 147, but is not limited thereto.
  • the protein variant has at least one amino acid selected from amino acids 79 to 83 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 131 to 147 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is fixed, and 80% or more homology or identity thereto. It may include an amino acid sequence, but is not limited thereto.
  • the variant polypeptide of the present application is at least 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99 amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 131 to 147 and SEQ ID NOs: 131 to 147 Polypeptides with% homology or identity may be included.
  • proteins having an amino acid sequence in which some sequences are deleted, modified, substituted or added are also the scope of the present application. It is obvious to be included within.
  • the term'homology' or'identity' means the degree to which two given amino acid sequences or base sequences are related, and may be expressed as a percentage.
  • the terms homology and identity can often be used interchangeably.
  • sequence homology or identity of a conserved polynucleotide or polypeptide is determined by standard alignment algorithms, and a default gap penalty established by the program used can be used together.
  • Substantially, homologous or identical sequences are generally in moderate or high stringent conditions along at least about 50%, 60%, 70%, 80% or 90% of the sequence or full-length. (stringent conditions) can be hybridized. Hybridization is also contemplated for polynucleotides containing degenerate codons instead of codons in the polynucleotide.
  • the homology, similarity or identity of a polynucleotide or polypeptide can be found in, for example, Smith and Waterman, Adv. Appl. As known in Math (1981) 2:482, for example, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48: 443 can be determined by comparing sequence information using a GAP computer program.
  • the GAP program defines the total number of symbols in the shorter of two sequences, divided by the number of similarly aligned symbols (ie, nucleotides or amino acids).
  • the default parameters for the GAP program are (1) binary comparison matrix (contains values of 1 for identity and 0 for non-identity) and Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation , pp. As disclosed by 353-358 (1979), Gribskov et al (1986) Nucl. Acids Res. 14: weighted comparison matrix of 6745 (or EDNAFULL (EMBOSS version of NCBI NUC4.4) substitution matrix); (2) a penalty of 3.0 for each gap and an additional 0.10 penalty for each symbol in each gap (or a gap opening penalty of 10, a gap extension penalty of 0.5); And (3) no penalty for end gaps.
  • the term "to be expressed /" refers to a state in which a target protein is introduced into a microorganism or modified to be expressed in a microorganism.
  • the target protein is a protein present in a microorganism, it means a state in which its activity is enhanced compared to intrinsic or before modification.
  • the "target protein” may be a variant of the protein having the aforementioned L-tryptophan excretion ability.
  • introduction of a protein means that the microorganism exhibits an activity of a specific protein that the microorganism did not originally have, or exhibits an improved activity compared to the intrinsic activity of the protein or the activity before modification.
  • a polynucleotide encoding a specific protein may be introduced into a chromosome in a microorganism, or a vector including a polynucleotide encoding a specific protein may be introduced into a microorganism to exhibit its activity.
  • enhancing the activity means that the activity is improved compared to the intrinsic activity of a specific protein possessed by the microorganism or the activity before modification.
  • “Intrinsic activity” refers to the activity of a specific protein originally possessed by the parent strain before the change in the trait of a microorganism when the trait of a microorganism changes due to genetic variation caused by natural or artificial factors.
  • the enhancement of the activity of the present application is an increase in the intracellular copy number of the gene encoding the protein variant, a method of introducing a mutation into the expression control sequence of the gene encoding the protein variant, the protein having L-tryptophan excretion activity
  • a method of replacing a gene expression control sequence encoding a variant with a sequence having strong activity a method of replacing a gene encoding a natural protein having L-tryptophan excretion activity on a chromosome with a gene encoding the protein variant, the protein variant
  • a mutation may be additionally introduced into a gene encoding a protein, and a protein variant may be introduced into a microorganism. Not limited.
  • the increase in the copy number of the gene is not particularly limited thereto, but may be performed in a form operably linked to a vector, or may be performed by being inserted into a chromosome in a host cell.
  • a vector capable of replicating and functioning irrespective of the host, in which the polynucleotide encoding the protein of the present application is operably linked may be introduced into a host cell.
  • a vector capable of inserting the polynucleotide into a chromosome in a host cell to which the polynucleotide is operably linked may be introduced into a chromosome of a host cell. Insertion of the polynucleotide into the chromosome can be accomplished by any method known in the art, for example, by homologous recombination.
  • modifying the expression control sequence to increase the expression of the polynucleotide is not particularly limited thereto, but deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution of the nucleic acid sequence to further enhance the activity of the expression control sequence, or It can be carried out by inducing a mutation in the sequence in combination, or by replacing it with a nucleic acid sequence having a stronger activity.
  • the expression control sequence is not particularly limited thereto, but may include a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, a sequence controlling termination of transcription and translation, and the like.
  • a strong promoter may be linked to the top of the polynucleotide expression unit instead of the original promoter, but is not limited thereto.
  • Examples of known strong promoters include cj1 to cj7 promoters (Korean Patent Registration No. 10-0620092), lac promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, lambda phage PR promoter, P L promoter, tet promoter, gapA promoter, SPL7 Promoter, SPL13 (sm3) promoter (Korean Patent No. 10-1783170), O2 promoter (Korean Patent No. 10-1632642), tkt promoter and yccA promoter, but are not limited thereto.
  • modification of the polynucleotide sequence on the chromosome is not particularly limited thereto, but mutations in the expression control sequence by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution of the nucleic acid sequence, or a combination thereof to further enhance the activity of the polynucleotide sequence It may be performed by inducing or by replacing with a polynucleotide sequence modified to have stronger activity.
  • the introduction and enhancement of such protein activity is generally at least 1%, 10%, 25%, 50%, based on the activity or concentration of the protein in the wild-type or unmodified microbial strain. It may be increased to 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% or 500%, up to 1000% or 2000%, but is not limited thereto.
  • Another aspect of the present application provides a polynucleotide encoding the protein variant.
  • polynucleotide is a polymer of nucleotides in which nucleotide units are connected in a long chain by covalent bonds, and is a DNA or RNA strand having a certain length or more, and more specifically, coding for the protein variant. It means a polynucleotide fragment.
  • polynucleotide encoding the protein variant of the present application may be included without limitation as long as it is a polynucleotide sequence encoding a protein variant having L-tryptophan excretion capability.
  • the gene encoding the amino acid sequence of the protein having L-tryptophan excretion ability may be the wex gene, may be derived from Herbaspirium rizospere, specifically encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. It may be a nucleotide sequence, and more specifically, may be a sequence including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
  • the polynucleotide encoding the protein variant of the present application is a coding region within a range that does not change the amino acid sequence of the polypeptide due to the degeneracy of the codon or in consideration of the preferred codon in the organism to express the polypeptide.
  • Various variations can be made. Specifically, any polynucleotide sequence encoding a protein variant in which one or more of amino acids 79 to 83 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with another amino acid may be included without limitation.
  • the polynucleotide of the present application is a protein variant of the present application, specifically, a polynucleotide sequence encoding a protein comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 131 to 147 or a polypeptide having homology or identity thereto. May be, but is not limited thereto, and more specifically described in SEQ ID NOs: 80, 81, 82, 89, 90, 91, 92, 101, 102, 103, 110, 111, 112, 113, 122, 123 and 124 It may include, but is not limited to, any one of the polynucleotide sequences.
  • the homology or identity is as described above.
  • a probe that can be prepared from a known gene sequence hybridizes under stringent conditions with a complementary sequence to all or part of the polynucleotide sequence to any of amino acids 79 to 83 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • Any sequence encoding a protein variant in which one or more amino acids are substituted with other amino acids may be included without limitation.
  • stringent conditions refer to conditions that allow specific hybridization between polynucleotides. These conditions are specifically described in the literature (eg, J. Sambrook et al., homolog). For example, among genes with high homology, genes having a homology of 40% or more, specifically 90% or more, more specifically 95% or more, more specifically 97% or more, and particularly 99% or more Under conditions that hybridize to each other, and do not hybridize to genes with lower homology, or to wash conditions for general Southern hybridization, 60°C, 1X SSC, 0.1% SDS, specifically 60°C, 0.1X SSC, 0.1% SDS, more specifically 68 DEG C, 0.1X SSC, at a salt concentration and temperature corresponding to 0.1% SDS, one time, specifically two to three times washing conditions can be enumerated. However, it is not limited thereto, and may be appropriately adjusted by a person skilled in the art according to the purpose.
  • Hybridization requires that two polynucleotides have a complementary sequence, although a mismatch between bases is possible depending on the stringency of the hybridization.
  • the term "complementary" is used to describe the relationship between nucleotide bases capable of hybridizing to each other. For example, with respect to DNA, adenosine is complementary to thymine and cytosine is complementary to guanine.
  • the present application may also include substantially similar polynucleotide sequences as well as isolated polynucleotide fragments that are complementary to the entire sequence.
  • polynucleotides having homology can be detected using hybridization conditions including a hybridization step at a Tm value of 55° C. and using the above-described conditions.
  • the Tm value may be 60°C, 63°C, or 65°C, but is not limited thereto and may be appropriately adjusted by a person skilled in the art according to the purpose.
  • the appropriate stringency to hybridize a polynucleotide depends on the length of the polynucleotide and the degree of complementarity, and the parameters are well known in the art (see Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8).
  • Another aspect of the present application provides a vector comprising a polynucleotide encoding the protein variant.
  • vector refers to a DNA preparation containing the nucleotide sequence of a polynucleotide encoding the protein of interest operably linked to a suitable regulatory sequence so that the protein of interest can be expressed in a suitable host.
  • the regulatory sequence may include a promoter capable of initiating transcription, any operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and a sequence controlling termination of transcription and translation.
  • Vectors can be transformed into a suitable host cell and then replicated or function independently of the host genome, and can be integrated into the genome itself.
  • the vector used in the present application is not particularly limited, and any vector known in the art may be used.
  • Examples of commonly used vectors include natural or recombinant plasmids, cosmids, viruses and bacteriophages.
  • pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, and Charon21A can be used as a phage vector or a cosmid vector, and as a plasmid vector, pBR system, pUC system, pBluescriptII system , pGEM system, pTZ system, pCL system, pET system, etc. can be used.
  • pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC vectors, and the like can be used.
  • a polynucleotide encoding a target protein in a chromosome may be replaced with a mutated polynucleotide through a vector for intracellular chromosome insertion. Insertion of the polynucleotide into the chromosome may be performed by any method known in the art, for example, homologous recombination, but is not limited thereto.
  • a selection marker for confirming whether the chromosome is inserted may be additionally included. Selectable markers are used to select cells transformed with a vector, that is, to confirm the insertion of a nucleic acid molecule of interest, and give a selectable phenotype such as drug resistance, nutrient demand, resistance to cytotoxic agents, or expression of surface proteins. Markers can be used. In an environment treated with a selective agent, only cells expressing the selection marker survive or exhibit other phenotypic traits, and thus transformed cells can be selected.
  • Another object of the present application is to provide a microorganism that produces L-tryptophan, which expresses the protein variant having the L-tryptophan release activity.
  • a microorganism producing L-tryptophan refers to a microorganism capable of producing an excess of L-tryptophan from a carbon source in a medium compared to a wild-type or unmodified microorganism.
  • the microorganism producing the L-tryptophan may be a recombinant microorganism.
  • L-tryptophan its type is not particularly limited, but Enterbacter, Escherichia, Erwinia, Serratia, and Providencia ( Providencia), Corynebacterium (Corynebacterium) and Brevibacterium (Brevibacterium) may be a microorganism belonging to the genus. More specifically, it may be a microorganism belonging to the genus Corynebacterium or the genus Escherichia.
  • the microorganism of the genus Escherichia may be Escherichia coli
  • the microorganism of the genus Corynebacterium may be Corynebacterium glutamicum
  • L- Microorganisms belonging to the genus Escherichia or the genus Corynebacterium, which can increase the amount of L-tryptophan production by introducing or enhancing a protein having tryptophan-releasing activity may be included without limitation.
  • the expression of the tktA gene is enhanced for continuous supply of precursors such as E4P (erythorse-4-phosphate) and efficient use of energy, or by blocking the side branch pathway in the biosynthetic pathway.
  • precursors such as E4P (erythorse-4-phosphate)
  • efficient use of energy or by blocking the side branch pathway in the biosynthetic pathway.
  • a method of increasing biosynthesis or a method of using less ATP can be used.
  • the parent strain of the microorganism producing the protein having L-tryptophan-releasing activity or the L-tryptophan-producing protein variant expressing/modified to express the protein variant is a microorganism producing L-tryptophan. It doesn't work.
  • the L-tryptophan-producing microorganism is a competition pathway gene, a regulator of the directional pathway of the L-tryptophan operon, the L-tryptophan influx gene, the L-tryptophan influx and degradation genes.
  • the activity of the regulatory gene (trpR) of the tryptophan synthase group that inhibits the expression of ( trpEDCBA ) of L-tryptophan biosynthetic genes, or the Mtr membrane protein that introduces L-tryptophan from outside the cell into the cell is weakened compared to the intrinsic activity. Or can be removed.
  • Another aspect of the present application for achieving the above object relates to a method for producing tryptophan, which includes culturing a microorganism that produces L-tryptophan, which expresses the protein variant, in a medium.
  • the L-tryptophan, a protein having L-tryptophan-releasing activity including the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, expression of the protein, and microorganisms are as described above.
  • the term "culture” refers to growing the microorganism under appropriately controlled environmental conditions.
  • the cultivation process of the present application may be performed according to a suitable medium and culture conditions known in the art. This culture process can be easily adjusted and used by those skilled in the art according to the selected strain.
  • the culture may be a batch type, continuous type, and fed-batch type, but is not limited thereto.
  • the term "medium” refers to a material obtained by mixing nutrients required for culturing the microorganism as a main component, and supplies nutrients and growth factors, including water, which is essential for survival and development.
  • any medium and other culture conditions used for cultivation of microorganisms of the present application may be used without particular limitation as long as it is a medium used for cultivation of ordinary microorganisms.
  • the microorganisms of the present application are suitable In a conventional medium containing compounds, amino acids and/or vitamins, etc., it can be cultured while controlling temperature, pH, etc. under aerobic conditions.
  • the carbon source includes carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose, and maltose; Sugar alcohols such as mannitol and sorbitol, organic acids such as pyruvic acid, lactic acid and citric acid; Amino acids such as glutamic acid, methionine, and lysine may be included.
  • natural organic nutrients such as starch hydrolyzate, molasses, black strap molasses, rice winter, cassava, sugarcane residue and corn steep liquor can be used, specifically glucose and sterilized pretreated molasses (i.e., converted to reducing sugar)
  • Carbohydrates such as molasses
  • other appropriate amounts of carbon sources may be used in various ways without limitation. These carbon sources may be used alone or in combination of two or more, but are not limited thereto.
  • nitrogen source examples include inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, ammonium carbonate, and ammonium nitrate; Amino acids such as glutamic acid, methionine, glutamine, etc., organic nitrogen sources such as peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract, malt extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, fish or its degradation products, skim soybean cake or its degradation products, etc. Can be used. These nitrogen sources may be used alone or in combination of two or more, but are not limited thereto.
  • inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, ammonium carbonate, and ammonium nitrate
  • Amino acids such as glutamic acid, methionine, glutamine, etc.
  • organic nitrogen sources such as peptone, NZ-amine,
  • the personnel may include first potassium phosphate, second potassium phosphate, or a sodium-containing salt corresponding thereto.
  • the inorganic compound sodium chloride, calcium chloride, iron chloride, magnesium sulfate, iron sulfate, manganese sulfate, calcium carbonate, and the like may be used, and amino acids, vitamins, and/or suitable precursors may be included. These constituents or precursors may be added to the medium batchwise or continuously. However, it is not limited thereto.
  • the pH of the medium may be adjusted.
  • an antifoaming agent such as fatty acid polyglycol ester can be used to suppress the generation of air bubbles.
  • oxygen or oxygen-containing gas may be injected into the medium, or nitrogen, hydrogen, or carbon dioxide gas may be injected without the injection of gas to maintain the anaerobic and microaerobic state. It is not.
  • the temperature of the medium may be 20°C to 50°C, specifically 30°C to 37°C, but is not limited thereto.
  • the cultivation period may be continued until the desired production amount of the useful substance is obtained, and specifically, may be 10 to 100 hours, but is not limited thereto.
  • the production method may include recovering L-tryptophan from the culture medium or the microorganism.
  • Recovering the tryptophan may be performed using a suitable method known in the art according to the method of culturing the microorganism of the present application, for example, a batch, continuous, or fed-batch culture method, to recover the desired L-tryptophan from the medium.
  • a suitable method known in the art for example, centrifugation, filtration, treatment with a crystallized protein precipitant (salt-in method), extraction, ultrasonic disruption, ultrafiltration, dialysis, molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography
  • Various chromatography such as, HPLC, and methods thereof may be used in combination, but are not limited to these examples.
  • the production method may include a purification process.
  • the purification process can purify the recovered L-tryptophan using a suitable method known in the art.
  • Another aspect of the present application is to modify the microorganism to express a protein variant having L-tryptophan excreting activity in which any one or more of amino acids 79 to 83 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with another amino acid. It provides a method for increasing L-tryptophan excretion capacity, including.
  • Another aspect of the present application provides a use of the protein variant to increase L-tryptophan excretion ability.
  • Another aspect of the present application provides the use of the protein variant to increase L-tryptophan production.
  • the protein variant of the present application can increase the ability of microorganisms to excrete L-tryptophan, and thus can be used for increasing L-tryptophan production.
  • the protein variant and other amino acids are as described above.
  • the amino acid sequence of YdeD is used as the query sequence, and as a result of PSI-BLAST search based on the NCBI and Kegg database, 30 candidate genes considered as membrane proteins capable of releasing tryptophan and organisms having them are selected. I did. Among them, five organisms were selected as shown in Table 1 below in consideration of the biosafety level applicable to the production strain and the possibility of securing them.
  • Example 2 Herbaspirium rezospere ( Herbaspirillum rhizosphaerae ) Production of microorganisms in Corynebacterium into which the derived gene was introduced
  • the gene encoding the membrane protein derived from Herbaspirium rizospere selected in Example 1 has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Information on the gene encoding the membrane protein and the surrounding nucleotide sequence was obtained from the National Institutes of Health GenBank.
  • a primer for inserting a gene derived from Herbaspirium rizospere into the Corynebacterium glutamicum genomic DNA was synthesized.
  • PCR was performed using the primers of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 using the chromosomal DNA of the Herbaspirium rizospere strain as a template.
  • SolgTM Pfu-X DNA polymerase was used, and PCR amplification conditions were subjected to denaturation at 95°C for 2 minutes, denaturation at 95°C for 20 seconds, annealing at 62°C for 40 seconds, and polymerization for 1 minute at 72°C. Polymerization was carried out at 72° C. for 5 minutes.
  • PCR was performed using the primers of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 using the Corynebacterium glutamicum genomic DNA as a template.
  • SolgTM Pfu-X DNA polymerase SolGent co.
  • PCR amplification conditions were denatured at 95°C for 2 minutes, then denatured at 95°C for 20 seconds, annealing at 62°C for 40 seconds, and polymerization at 72°C for 30 seconds. After repeating twice, polymerization was performed at 72° C. for 5 minutes.
  • the amplified gapA promoter region, a gene fragment derived from Herbaspirium rizospere, and the vector pDZTn for chromosome transformation cut with ScaI restriction enzyme was used to obtain a recombinant plasmid by cloning, and was named pDZTn-PgapA-Hrh. Cloning was performed by mixing the Gibson assembly reagent and each gene fragment in the calculated mole number and then storing at 50° C. for 1 hour.
  • a strain was obtained in which 1 copy of the PgapA-Hrh gene was inserted between the transposon genes on the chromosome.
  • the genetic manipulation was confirmed by PCR method and genome sequencing using primers of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, which can amplify the regions outside the homologous recombination upstream region and downstream region into which the corresponding gene is inserted, respectively.
  • the strain thus obtained was named Corynebacterium glutamicum ATCC13869::PgapA-Hrh.
  • Example 3 Sudomonas Stupjeri ( Pseudomonas stutzeri ) Production of microorganisms in Corynebacterium into which the derived gene was introduced
  • the gene encoding the membrane protein derived from Sudomonas sturgery selected in Example 1 has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9. Information about the gene and surrounding nucleotide sequences (registration number NC_018177.1) was obtained from the National Institutes of Health GenBank.
  • a primer for inserting a gene derived from Sudomonas stag Jeri into Corynebacterium glutamicum genomic DNA was synthesized.
  • PCR was performed in the same manner as in Example 2 using the chromosomal DNA of the Sudomonas stag Jeri strain as a template and using the primers of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12.
  • the amplified gapA promoter region, a gene fragment derived from Sudomonas stag Jeri, and the vector pDZTn for chromosome transformation digested with ScaI restriction enzyme were cloned using the Gibson assembly method to obtain a recombinant plasmid and named pDZTn-PgapA-Pst. . Cloning was performed by mixing the Gibson assembly reagent and each gene fragment in the calculated mole number and then storing at 50° C. for 1 hour.
  • the prepared pDZTn-PgapA-Pst vector was transformed into a wild-type Corynebacterium glutamicum ATCC13869 strain by electroporation, followed by a second crossover process, and then one copy of the PgapA-Pst gene was inserted between the transposon genes on the chromosome.
  • the strain was obtained.
  • the genetic manipulation was confirmed by PCR method and genome sequencing using primers of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, which can amplify the regions outside the homologous recombination upstream region and downstream region into which the corresponding gene is inserted, respectively.
  • the strain thus obtained was named Corynebacterium glutamicum ATCC13869::PgapA-Pst.
  • Example 4 Alkaline Jinse Pecalis ( Alcaligenes faecalis ) Production of microorganisms in Corynebacterium into which the derived gene was introduced
  • the gene encoding the membrane protein derived from Alkaligins pecalis selected in Example 1 has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14. Information on the gene and surrounding nucleotide sequences (registration number NZ_CP013119.1) was obtained from the National Institutes of Health GenBank.
  • a primer for inserting a gene derived from Alkaligenes pecalis into the Corynebacterium glutamicum genomic DNA was synthesized.
  • PCR was performed in the same manner as in Example 2 using the chromosomal DNA of the Alkaligenes pecalis strain as a template and using the primers of SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17.
  • PCR was performed in the same manner as in Example 2 using the primers of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 18 using the Corynebacterium glutamicum genomic DNA as a template. Performed.
  • the amplified gapA promoter region, a gene fragment derived from Alkaline Jins pecalis, and the vector pDZTn for chromosome transformation digested with ScaI restriction enzyme were cloned using the Gibson assembly method to obtain a recombinant plasmid, and named pDZTn-PgapA-Afa. . Cloning was performed by mixing the Gibson assembly reagent and each gene fragment in the calculated mole number and then storing at 50° C. for 1 hour.
  • the prepared pDZTn-PgapA-Afa vector was transformed into a wild-type Corynebacterium glutamicum ATCC13869 strain by electroporation, and then one copy of the PgapA-Afa gene was inserted between the transposon genes on the chromosome through a second crossover process. Strain was obtained. The genetic manipulation was confirmed by PCR method and genome sequencing using primers of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, which can amplify the regions outside the homologous recombination upstream region and downstream region into which the corresponding gene is inserted, respectively.
  • the strain thus obtained was named Corynebacterium glutamicum ATCC13869::PgapA-Afa.
  • Example 5 Cupriabidus Necator ( Cupriavidus necator ) Production of microorganisms in Corynebacterium into which the derived gene was introduced
  • the gene encoding the membrane protein derived from Cupriabidus necator selected in Example 1 has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19.
  • Information on the gene and surrounding nucleotide sequences was obtained from the National Institutes of Health GenBank.
  • a primer for inserting a gene derived from Cupriabidus necator into Corynebacterium glutamicum genomic DNA was synthesized.
  • PCR was performed in the same manner as in Example 2 using primers of SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 using the chromosomal DNA of the Cupriabidus necator strain as a template.
  • PCR was performed in the same manner as in Example 2 using the primers of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 23 using the Corynebacterium glutamicum genomic DNA as a template. Performed.
  • Recombinant plasmid was obtained by cloning the amplified gapA promoter region, the gene fragment derived from Cupriabidus nekator, and the vector for chromosome transformation cut with ScaI restriction enzyme, pDZTn, using the Gibson assembly method, and named pDZTn-PgapA-Cne. I did. Cloning was performed by mixing the Gibson assembly reagent and each gene fragment in the calculated mole number and then storing at 50° C. for 1 hour.
  • the prepared pDZTn-PgapA-Cne vector was transformed into a wild-type Corynebacterium glutamicum ATCC13869 strain by electroporation, and then one copy of the PgapA-Cne gene was inserted between the transposon genes on the chromosome through a second crossover process. Strain was obtained. The genetic manipulation was confirmed by PCR method and genome sequencing using primers of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, which can amplify the regions outside the homologous recombination upstream region and downstream region into which the corresponding gene is inserted, respectively.
  • the strain thus obtained was named Corynebacterium glutamicum ATCC13869::PgapA-Cne.
  • Example 6 Escherichia coli ( Escherichia coli str. K-12 substr.MG1655 ) Production of microorganisms in Corynebacterium into which the derived gene was introduced
  • the gene encoding the membrane protein derived from E. coli selected in Example 1 has an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24.
  • Information on the gene and surrounding nucleotide sequences was obtained from the National Institutes of Health GenBank.
  • a primer for inserting the E. coli-derived gene into the Corynebacterium glutamicum genomic DNA was synthesized.
  • PCR was performed in the same manner as in Example 2 using the chromosomal DNA of the E. coli strain as a template and primers of SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 27.
  • PCR was performed in the same manner as in Example 2 using the primers of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 28 using the Corynebacterium glutamicum genomic DNA as a template. Performed.
  • the amplified gapA promoter region, E. coli-derived gene fragment, and the vector pDZTn for chromosomal transformation digested with ScaI restriction enzyme were cloned using the Gibson assembly method to obtain a recombinant plasmid, and named pDZTn-PgapA-Eco. Cloning was performed by mixing the Gibson assembly reagent and each gene fragment in the calculated mole number and then storing at 50° C. for 1 hour.
  • the prepared pDZTn-PgapA-Eco vector was transformed into a wild-type Corynebacterium glutamicum ATCC13869 strain by electroporation, and then one copy of the PgapA-Eco gene was inserted between the transposon genes on the chromosome through a second crossover process. Strain was obtained. The genetic manipulation was confirmed by PCR method and genome sequencing using primers of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, which can amplify the regions outside the homologous recombination upstream region and downstream region into which the corresponding gene is inserted, respectively.
  • the strain thus obtained was named Corynebacterium glutamicum ATCC13869::PgapA-Eco.
  • Example 7 MIC measurement of microorganism strains in Corynebacterium genus into which genes derived from various microorganisms were introduced
  • ATCC13869::PgapA-Hrh Five types of Corynebacterium glutamicum strains ATCC13869::PgapA-Hrh, ATCC13869::PgapA-Pst, ATCC13869::PgapA-Afa, ATCC13869::PgapA-Cne, ATCC13869 prepared in Examples 2 to 6: : A minimum inhibitory concentration (MIC) experiment was performed using a tryptophan analog and an analog of phenylalanine, another aromatic amino acid, to confirm whether PgapA-Eco retained the tryptophan excreting activity.
  • MIC minimum inhibitory concentration
  • the introduction of the selected five genes allowed growth in all conditions in which the phenylalanine analog at a concentration of 2.5 mg/ml was added.
  • the introduction of genes derived from Herbaspirium rizospere, Alkaline Jins pecalis, and E. coli showed the best growth potential.
  • the introduction of a gene derived from Sudomonas Stupjeri showed somewhat reduced growth compared to the previous three strains, and the introduction of a gene derived from Cupriabidus necator showed the lowest growth.
  • the wild strain ATCC13869 did not grow.
  • the only introduction of a gene derived from Herbaspirium rizospere allowed growth.
  • Glucose 10g KH 2 PO 4 1 g, K 2 HPO 4 2 g, MgSO 4 7H 2 O 0.4 g, urea 2 g, (NH 4 ) 2 SO 4 5 g, NaCl 0.5 g, nicotinamide 5 ⁇ g, calcium- Pantothenic acid 0.1 ⁇ g, biotin 0.2 ⁇ g, thiamine HCl 3 ⁇ g, trace elements solution 1ml (based on 1 liter of distilled water)
  • Example 8 Preparation of expression vector for E. coli into which genes derived from various microorganisms were introduced
  • each gene was cloned into pCL1920, an E. coli expression vector, and expressed with the yccA promoter of E. coli strain W3110.
  • PCR was performed using SEQ ID NO:29 and SEQ ID NO:30 using the chromosomal DNA of the Herbaspirium rizospere strain as a template.
  • the polymerase Solg TM Pfu-X DNA polymerase (SolGent co.) was used, and PCR amplification conditions were denatured at 95°C for 2 minutes, then denatured at 95°C for 20 seconds, annealing at 62°C for 40 seconds, and polymerization at 72°C for 1 minute. After repeating 27 times, polymerization was performed at 72° C. for 5 minutes.
  • PCR was performed using E. coli W3110 genomic DNA as a template using SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32.
  • the polymerase Solg TM Pfu-X DNA polymerase (SolGent co.) was used, and PCR amplification conditions were denatured at 95°C for 2 minutes, then denatured at 95°C for 20 seconds, annealing at 62°C for 40 seconds, and polymerization at 72°C for 10 seconds. After repeating 27 times, polymerization was performed at 72° C. for 5 minutes.
  • the amplified yccA promoter region, a gene fragment derived from Herbaspirium rizospere, and pCL1920 vector (pSC101 ori, Sp r ) digested with SmaI restriction enzyme were cloned using the Gibson assembly method to obtain a recombinant plasmid, pCL1920- It was named PyccA-Hrh. Cloning was performed by mixing the Gibson assembly reagent and each gene fragment in the calculated mole number and then storing at 50° C. for 1 hour. The obtained pCL1920-PyccA-Hrh was introduced into wild-type E. coli W3110 to prepare W3110/pCL1920-PyccA-Hrh, a transformant expressing the gene.
  • PCR was performed using SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 34 using the chromosomal DNA of Sudomonas stuungjeri strain as a template.
  • SEQ ID No. 35 used to secure the yccA promoter derived from E. coli W3110 to be used, all the methods were the same as those used for securing the gene fragment of the Herbaspirium rizospere strain.
  • pCL1920-PyccA-Pst a recombinant plasmid was obtained, named pCL1920-PyccA-Pst, and the expression vector pCL1920-PyccA-Pst was introduced into the wild-type E. coli W3110 to prepare a transformant W3110/pCL1920-PyccA-Pst expressing the gene.
  • the process of producing the transformant expressing the gene derived from the Alkalazines pecalis strain is the same as the above procedure, and the chromosomal DNA of the Alkaline genera pecalis strain for securing the fragment is used as a template, with SEQ ID NO: 36 and SEQ ID NO: 37. Only the use of primer SEQ ID NO: 38 to secure the yccA promoter was different.
  • pCL1920-PyccA-Afa a recombinant plasmid in which the gene derived from Alkaligenes pecalis was cloned was obtained and named pCL1920-PyccA-Afa, and the transformant W3110/pCL1920-PyccA-Afa, a transformant in which the expression vector pCL1920-PyccA-Afa was introduced into the wild-type E. coli W3110, was obtained.
  • pCL1920-PyccA-Afa a recombinant plasmid in which the gene derived from Alkaligenes pecalis was cloned was obtained and named pCL1920-PyccA-Afa
  • the transformant W3110/pCL1920-PyccA-Afa a transformant in which the expression vector pCL1920-PyccA-Afa was introduced into the wild-type E. coli W3110
  • PCR was performed using SEQ ID NO: 39 and SEQ ID NO: 40 using the chromosomal DNA of the Cupriabidus necator strain as a template.
  • SEQ ID No. 41 used to secure the yccA promoter derived from E. coli W3110 to be used, all the methods of performing were the same as those used for securing the gene fragment of the Herbaspirium rezospere strain.
  • pCL1920-PyccA-Cne a recombinant plasmid was obtained and named pCL1920-PyccA-Cne, and the expression vector pCL1920-PyccA-Cne was introduced into wild-type E. coli W3110 to prepare W3110/pCL1920-PyccA-Cne, a transformant expressing the gene.
  • Escherichia coli str Using the chromosomal DNA of the K-12 substr.MG1655 strain as a template, PCR was performed using SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 43. In addition, except for using the primer SEQ ID No. 44 used to secure the yccA promoter derived from E. coli W3110 to be used, all the methods were the same as those used for securing the gene fragment of the Herbaspirium rizospere strain.
  • pCL1920-PyccA-Eco a recombinant plasmid was obtained, named pCL1920-PyccA-Eco, and the expression vector pCL1920-PyccA-Eco was introduced into the wild-type E. coli W3110 to produce W3110/pCL1920-PyccA-Eco, a transformant expressing the gene.
  • Example 9 MIC measurement of E. coli overexpressing membrane protein genes derived from various microorganisms
  • a minimum inhibitory concentration (MIC) experiment using tryptophan and a phenylalanine analogue (analogue) was performed.
  • coli strains overexpressing five kinds of genes were incubated for 15 hours at 37°C in M9 minimal liquid medium supplemented with 50 ug/ml spectinomycin, and then diluted with 10 4 and 10 5 cells to tryptophan. Spotting incubation in M9 glucose minimal solid medium (50 ug/ml spectinomycin added) to which the analog or phenylalanine analog was added. 2 mg/ml of para-fluoro-DL-phenylalanine or 0.7 ug/ml of 5-fluoro-DL-trytophan was added to the M9 minimum for the minimum low concentration experiment. It was added to the solid medium, and the growth of cells was observed after 48 hours (Table 3).
  • the E. coli strain showed superior growth when the E. coli-derived gene was overexpressed, as in the Coryneglutamicum strain, and the overexpression of the Alkaligenes pecalis-derived gene also enabled significant growth.
  • genes derived from Herbaspirium rizospere, Sudomonas Stupzeri, and Cupriabidus necator were overexpressed, they could not grow together with the control group W3110/pCL1920.
  • overexpression of the five selected genes allowed growth in all conditions to which tryptophan analogs were added.
  • the overexpression of the five genes selected from the E. coli strains showed a similar pattern to the MIC test results of the Corynebacterium glutamicum strain.
  • Genes derived from Herbaspirium rizospere are specific and superior to tryptophan or tryptophan analogues in both Coryneglutamicum strains and E. coli, and the E. coli-derived excretion gene has a higher excretion in phenylalanine and its analogs than in tryptophan. Showed tolerance. From this, it was determined that the gene derived from Herbaspirium rizospere was specific for tryptophan in both the Coryneglutamicum strain and E. coli and showed superior excretion ability.
  • the L-tryptophan producing strain was developed from the wild species Corynebacterium glutamicum ATCC13869.
  • the wild-type Corynebacterium glutamicum does not produce L-tryptophan or produces only a very small amount of L-tryptophan even if it is produced, so the strain that strengthened the biosynthetic pathway essential for production was intended to be used as the parent strain.
  • the expression of the operon of the L-tryptophan biosynthesis gene was enhanced through promoter enhancement.
  • serine, amino acid 38 of trpE was substituted with arginine in order to resolve the feedback inhibition of the TrpE protein (JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Nov. 1987, p. 5330-5332).
  • trpE promoter upstream where homologous recombination occurs and a trpE 38 mutation downstream region were obtained.
  • the trpE promoter upstream region using the primers of SEQ ID NO: 45 and SEQ ID NO: 46, trpE using the primers of SEQ ID NO: 47 and SEQ ID NO: 48 A gene fragment of the 38th mutation downstream (Downsteam) region was obtained through PCR.
  • Solg TM Pfu-X DNA polymerase As the polymerase, Solg TM Pfu-X DNA polymerase was used, and PCR amplification conditions were after denaturation at 95°C for 5 minutes, denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 60°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 60 seconds. , Polymerization was performed at 72° C. for 5 minutes.
  • PCR was performed using the synthesized promoter SPL7 (SEQ ID NO: 49) as a template and primers of SEQ ID NO: 50 and SEQ ID NO: 51.
  • Solg TM Pfu-X DNA polymerase SolGent co.
  • PCR amplification conditions were denatured at 95°C for 5 minutes, then denatured at 95°C for 30 seconds, annealing at 60°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 30 seconds. After repeating 30 times, polymerization was performed at 72° C. for 5 minutes.
  • the Corynebacterium glutamicum genomic DNA as a template of SEQ ID NO: 52 and SEQ ID NO: 53 PCR was performed using primers.
  • SolgTM Pfu-X DNA polymerase was used, and PCR amplification conditions were subjected to denaturation at 95°C for 5 minutes, denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 60°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 30 seconds. Polymerization was carried out at 72° C. for 5 minutes.
  • Recombinant plasmids were obtained by cloning the amplified trpE promoter upstream and the trpE 38 mutation downstream region, the SPL7 promoter and the front fragment of trpE, and the vector pDZ for chromosome transformation digested with SmaI restriction enzyme using the Gibson assembly method. , named pDZ-PSPL7-trpE (S38R). Cloning was performed by mixing the Gibson assembly reagent and each gene fragment in the calculated mole number and then storing at 50° C. for 1 hour.
  • the prepared pDZ-PSPL7-trpE (S38R) vector was transformed into a wild-type Corynebacterium glutamicum ATCC13869 strain by electroporation, and then the promoter of trpE on the chromosome was converted to the stronger promoter SPL7 promoter through a secondary crossover process. Then, a strain in which amino acid 38 of TrpE was replaced from serine to arginine was obtained.
  • the genetic manipulation was confirmed through PCR method and genome sequencing using SEQ ID NO: 54 and SEQ ID NO: 55 that can amplify the homologous recombination upstream region and downstream region into which the gene was inserted, and this was named CA04-8325.
  • tryptophan originates from the aromatic amino acid metabolic cycle, which begins with the condensation reaction of phosphoenolpyruvate and erythrose 4-phosphate. Therefore, smooth supply of the two precursors is essential for improving tryptophan production, and overexpression of the tkt gene was carried out for smooth supply of erythrose 4-phosphate, which is known to be relatively insufficient.
  • Solg TM Pfu-X DNA polymerase As the polymerase, Solg TM Pfu-X DNA polymerase was used, and PCR amplification conditions were after denaturation at 95°C for 2 minutes, denaturation at 95°C for 20 seconds, annealing at 62°C for 40 seconds, and polymerization at 72°C for 30 seconds. , Polymerization was performed at 72° C. for 5 minutes.
  • Solg TM Pfu-X DNA polymerase As the polymerase, Solg TM Pfu-X DNA polymerase was used, and PCR amplification conditions were subjected to denaturation at 95°C for 2 minutes, denaturation at 95°C for 20 seconds, annealing at 62°C for 40 seconds, and polymerization at 72°C for 1 minute and 20 seconds. After that, polymerization was performed at 72°C for 5 minutes.
  • the upstream and downstream regions to additionally insert the amplified tkt gene, the tkt gene containing the tkt promoter, and the vector pDZ for chromosome transformation cut with SmaI restriction enzyme were cloned using the Gibson assembly method.
  • a recombinant plasmid was obtained and named pDZ-Pn-tkt. Cloning was performed by mixing the Gibson assembly reagent and each gene fragment in the calculated mole number and then storing at 50° C. for 1 hour.
  • the prepared pDZ-Pn-tkt vector was transformed into CA04-8325 strain by electroporation, followed by a second crossover process to obtain a strain in which the tkt gene including the tkt promoter was inserted on the chromosome.
  • the genetic manipulation was confirmed through PCR and genome sequencing using primers SEQ ID NO: 62 and SEQ ID NO: 63 that can amplify the regions outside the homologous recombination upstream region and downstream region into which the gene is inserted, respectively, and CA04-8352 It was named as.
  • the strain CA04-8352 was internationally deposited with the Korea Microbial Conservation Center (KCCM), an international depository organization under the Budapest Treaty, on February 2, 2018, and was given a deposit number as KCCM12218P.
  • KCCM Korea Microbial Conservation Center
  • Example 10 Production of tryptophan by microorganisms of the genus Corynebacterium into which genes derived from Herbaspirium rizospere and E. coli were introduced
  • Example 7 a gene derived from Herbaspirium rizospere, which showed excellent activity at a minimum low concentration of tryptophan analogue (analogue), was introduced into CA04-8352, a tryptophan-producing strain prepared in Reference Example 1.
  • the vector pDZTn-PgapA-Hrh for gene introduction derived from Herbaspirium rizospere prepared in Example 2 was transformed into a tryptophan-producing strain CA04-8352 by electroporation, and the same as in Example 2 Through the process, a strain in which a gene derived from Herbaspirium rizospere was inserted between the transposon genes was obtained. This was named CA04-8405.
  • E. coli-derived genes were introduced into tryptophan-producing strain CA04-8352 as a control.
  • the E. coli-derived gene introduction vector pDZTn-PgapA-Eco prepared in Example 6 was transformed into a tryptophan-producing strain CA04-8352 by electroporation, and through the same process as in Example 6, between the transposon genes.
  • One copy of the E. coli-derived release gene was inserted to obtain a strain. This was named CA04-8406.
  • CA04-8405 and CA04-8406 produced through the above process were cultured in the following manner to confirm the tryptophan production amount as a control for CA04-8352 produced in Reference Example 1.
  • Each strain was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 25 ml of the seed medium, and cultured with shaking at 30° C. for 20 hours and 200 rpm.
  • 1 ml of the seed culture was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 25 ml of the production medium, and cultured with shaking at 30° C. for 24 hours and 200 rpm.
  • the production amount of L-tryptophan was measured by HPLC.
  • Glucose 30g (NH 4 ) 2 SO 4 15 g, MgSO 4 7H 2 O 1.2 g, KH 2 PO 4 1 g, yeast extract 5 g, biotin 900 ⁇ g, thiamine hydrochloride 4500 ⁇ g, calcium-pantothenic acid 4500 ⁇ g, CaCO 3 30 g (based on 1 liter of distilled water).
  • Corynebacterium glutamicum L-tryptophan producing strain (CA04-8352), Herbaspirium rizospere-derived gene-inserted production strain (CA04-8405), E. coli-derived gene-inserted production strain (CA04-8406) ) L-tryptophan production OD562 Tryptophan production (g/L) Tryptophan yield (g/g glc, %) CA04-8352 56.5 0.25 0.83 CA04-8405 52.3 1.52 5.07 CA04-8406 56.1 0.24 0.80
  • results for L-tryptophan production in the medium for CA04-8352, CA04-8405, and CA04-8406 are shown in Table 4 above.
  • the CA04-8405 strain into which the gene derived from Herbaspirium rizospere was introduced produced a final 1.52 g/L of L-tryptophan in flask culture, which is about 5 times higher than that of the control CA04-8352 strain. This means that the gene derived from Herbaspirium rizospere significantly enhances L-tryptophan production in the Corynebacterium glutamicum strain.
  • the tryptophan production of the CA04-8406 strain into which the E is the tryptophan production of the CA04-8406 strain into which the E.
  • KCCM12099P As of August 21, it was deposited with the Korea Microbiological Conservation Center (KCCM), an international depository under the Budapest Treaty, and was given a deposit number as KCCM12099P (CA04-8405).
  • KCCM Korea Microbiological Conservation Center
  • Example 11 Analysis of intracellular tryptophan metabolites in Corynebacterium glutamicum into which a gene derived from Herbaspirium rizospere was introduced
  • Intracellular metabolite analysis method was performed according to the method described in Nakamura J et al., Appl. Environ. Microbiol. 73(14): 4491-4498, 2007.
  • Corynebacterium glutamicum mutant strains CA04-8352 and CA04-8405 were inoculated into 250 ml corner-baffle flasks containing 25 ml of species medium, and cultured with shaking at 30° C. for 20 hours and 200 rpm. I did. Then, 1 ml of the seed culture solution was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 25 ml of the production medium and cultured with shaking at 30°C at 200 rpm.
  • the intracellular tryptophan concentration was confirmed in a total of 3 steps depending on the amount of sugar consumed, and the cultured cells in each step were separated from the culture medium through rapid vacuum filtration (Durapore HV, 0.45 m; Millipore, Billerica, MA). .
  • the filter to which the cells were adsorbed was washed twice with 10 ml of purified water, and then immersed in methanol containing 5 uM morpholine ethanesulfonic acid and 5 uM methionine sulfone for 10 minutes.
  • the concentration of tryptophan in the cell was reduced to a level of 33 to 41% in CA04-8405 compared to the parent strain CA04-8352. It is judged that the intracellular tryptophan concentration of the CA04-8405 strain decreased as the tryptophan generated in the cells of the Corynebacterium glutamicum strain was smoothly excreted to the outside by the expression of the gene derived from Herbaspirium rizospere. . From this, it can be confirmed that the gene derived from Herbaspirium rizospere is a gene encoding a membrane protein having a specific excretion ability for tryptophan.
  • the strain producing L-tryptophan of the genus Escherichia was developed from the wild-type E. coli W3110.
  • a strain designed to produce L-tryptophan was used as a parent strain.
  • the expression of L-tryptophan biosynthesis genes ( trpEDCBA ) involved in L-tryptophan production from Chorismate is suppressed by TrpR. Accordingly, the trpR gene encoding it was removed.
  • proline amino acid 21 from the N-terminus of TrpE
  • serine amino acid 21 from the N-terminus of TrpE
  • Mtr membrane protein plays a role in introducing L-tryptophan from outside the cell into the cell, and TnaA protein breaks down L-tryptophan and water molecules in the cell into indole, pyruvate, and ammonia (NH 3 ). Do it. Therefore, mtr and tnaA genes that inhibit and degrade L-tryptophan production were removed.
  • lambda red recombination ( ⁇ -red recombination, One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Datsenko KA, Wanner BL., Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Jun6;97(12) ):6640-5) method was used.
  • the pKD4 vector is used as a template and the FRT-kanamycin-FRT cassette and the homologous 50 bp base pairs on both sides of the mtr gene where homologous recombination occurs on the chromosome are combined using primers of SEQ ID NO: 64 and SEQ ID NO: 65
  • the resulting gene fragment (1580 bp) was obtained through PCR.
  • the kanamycin antibiotic marker of the pKD4 vector was used to remove the target gene and confirm the insertion of the antibiotic gene, and the FRT region serves to remove the antibiotic marker after the target gene is removed.
  • Solg TM Pfu-X DNA polymerase As the polymerase, Solg TM Pfu-X DNA polymerase was used, and PCR amplification conditions were after denaturation at 95°C for 2 minutes, denaturation at 95°C for 20 seconds, annealing at 62°C for 40 seconds, and polymerization at 72°C for 1 minute after 27 times. , Polymerization was performed at 72° C. for 5 minutes.
  • the pKD46 vector expressing lambda red recombinase (gam, bet, exo) was transformed into E. coli W3110 strain by electroporation and plated on LB solid medium containing 50 mg/L of kanamycin.
  • the FRT-kanamycin-FRT cassette obtained in the above process and the linear gene fragment in which the homologous 50 bp base pairs on both sides of the mtr gene were bound were transformed through electroporation.
  • Colonies grown in LB solid medium containing 25 mg/L kanamycin were subjected to colony PCR using SEQ ID NO: 66 and SEQ ID NO: 67, and colonies from which 782 bp gene fragments are produced were selected.
  • the strain from which the mtr gene was removed due to homologous recombination was prepared as a conformant cell for removal of the kanamycin antibiotic marker, and then transformed with pCP20 vector by electroporation.
  • the pCP20 vector expresses the FLP protein to recognize the FRT region on both sides of the kanamycin antibiotic and binds onto the chromosome, thereby removing the antibiotic marker between the FRT regions.
  • the pCP20 vector transformed strain grown in LB solid medium containing 100 mg/L of Ampicillin and 25 mg/L of Chloramphenicol was incubated for 1 hour in LB medium at 30° C. and then added at 42° C. for 15 hours. Cultured and plated on LB solid medium.
  • the grown colonies are LB solid medium containing 100 mg/L of Ampicillin and 25 mg/L of chloramphenicol, LB solid medium containing 12.5 mg/L of kanamycin, and LB solid without antibiotics. Cultured in the medium, colonies grown only in LB solid medium without antibiotics were selected. The mtr gene removal was finally confirmed through genomic sequencing, and this was named CA04-9300.
  • Solg TM Pfu-X DNA polymerase As the polymerase, Solg TM Pfu-X DNA polymerase was used, and PCR amplification conditions were after denaturation at 95°C for 2 minutes, denaturation at 95°C for 20 seconds, annealing at 62°C for 40 seconds, and polymerization at 72°C for 1 minute after 27 times. , Polymerization was performed at 72° C. for 5 minutes.
  • Transformation of the pKD46 vector was confirmed, and the CA04-9300 strain, in which the recombinant enzymes were expressed through the addition of 10 mM L-arabinose, was electroporated to obtain the FRT-kanamycin-FRT cassette and the tnaA gene
  • the linear gene fragment to which the homologous 50 bp base pair was bound was transformed.
  • Colonies grown in LB solid medium containing 25 mg/L kanamycin were subjected to colony PCR using SEQ ID NO: 66 and SEQ ID NO: 70, and colonies from which 787 bp gene fragments are produced were selected.
  • the strain from which the tnaA gene was removed due to homologous recombination was prepared as a conformant cell for removal of the kanamycin antibiotic marker, and then the pCP20 vector was transformed, and a strain from which the kanamycin antagonist marker was removed was produced by expression of the FLP protein.
  • the tnaA gene removal was finally confirmed through genomic sequencing, and this was named CA04-9301.
  • the pKD4 vector is used as a template, and the FRT-kanamycin-FRT cassette and the homologous 50 bp base pairs on both sides of the trpR gene where homologous recombination occurs on the chromosome are combined using the primers of SEQ ID NO: 71 and SEQ ID NO: 72.
  • the resulting gene fragment (1580 bp) was obtained through PCR.
  • Transformation of the pKD46 vector was confirmed, and the CA04-9301 strain, in which the recombinant enzymes were expressed through the addition of 10 mM L-arabinose, was electroporated to obtain the FRT-kanamycin-FRT cassette and both sides of the trpR gene.
  • the linear gene fragment to which the homologous 50 bp base pair was bound was transformed.
  • Colonies grown in LB solid medium containing 25 mg/L kanamycin were subjected to colony PCR using primers of SEQ ID NO: 66 and SEQ ID NO: 73, and colonies from which 838 bp gene fragments are produced were selected.
  • the strain from which the trpR gene was removed due to homologous recombination was prepared as a conformant cell for removal of the kanamycin antibiotic marker, and then the pCP20 vector was transformed, and a strain from which the kanamycin antagonist marker was removed was produced by expression of the FLP protein. The removal of the trpR gene was finally confirmed through genomic sequencing, which was named CA04-9307.
  • trpE gene fragment containing the EcoRI sequence 1575 bp Obtained through PCR.
  • the polymerase Solg TM Pfu-X DNA polymerase was used, and PCR amplification conditions were after denaturation at 95°C for 2 minutes, denaturation at 95°C for 20 seconds, annealing at 62°C for 1 minute, polymerization at 72°C for 1 minute, and repeating 27 times. , Polymerization was performed at 72° C. for 5 minutes.
  • the trpE gene and pSG76-C plasmid obtained by the above method were respectively treated with EcoRI restriction enzymes and cloned.
  • the cloned plasmid was transformed into E. coli DH5 ⁇ by electroporation, and the transformed E. coli DH5 ⁇ was selected from an LB plate containing 25 ⁇ g/ml of chlororamphenocol to obtain pSG76-C-trpE plasmid.
  • pSG76-C-trpE (P21S) was prepared using the primers of SEQ ID NO: 76 and SEQ ID NO: 77 by a site directed mutagenesis (Stratagene, USA) method.
  • CA04-9307 strain was transformed with the pSG76-C-trpE (P21S) plasmid and cultured in LB-Cm (Yeast extract 10g/L, NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Chlororamphenicol 25ug/L) medium. Colonies with chloramphenicol resistance were selected.
  • the selected transformant is a strain in which the pSG76-C-trpE (P21S) plasmid is first inserted into the trpE portion of the genome. PAScep(JOURNAL OF BACTERIOLOGY, July 1997, p.
  • Example 12 Production of L-tryptophan by microorganisms of the genus Escherichia into which a gene derived from Herbaspirium rizospere was introduced
  • the pCL1920-PyccA-Hrh prepared in Example 8 was introduced into CA04-4303 prepared in Reference Example 2 to prepare CA04-4306, a transformant in which a gene derived from Herbaspirium rizospere was overexpressed.
  • the pCL1920 vector was transformed into CA04-4303.
  • the two strains CA04-4303/pCL1920 and CA04-4306 were cultured in LB liquid medium containing 50 mg/L spectinomycin for 12 hours to confirm the production of L-tryptophan.
  • Glucose 70g (NH 4 ) 2 SO 4 20 g, MgSO 4 7H 2 O 1 g, KH 2 PO 4 2 g, yeast extract 2.5 g, Na-citrate 5 g, NaCl 1 g, CaCO 3 40 g (distilled water 1 Liters).
  • the gene derived from Herbaspirium rizospere showed superior resistance while being specific to L-tryptophan and its analog, and in the results of Examples 10 and 12, Herba The gene derived from Philium rizospere improved L-tryptophan production in both the Corynebacterium glutamicum strain and the E. coli strain.
  • the gene derived from Herbaspirium rizospere substantially excreted tryptophan to the outside of the cell. Accordingly, the gene derived from Herbaspirium rizospere was named as Tryptophan ( W ) ex porter, wex).
  • error-prone PCR was performed to apply a random mutagenesis to the wild-type wex gene, and diversify PCR random mutagenesis kit (US CLONTECH) was used when performing error-prone PCR.
  • error-producing PCR was performed using the pCL1920-PyccA-wex prepared in Example 8 as a template using SEQ ID NOs: 78 and 79.
  • error-prone PCR was performed with two compositions according to the concentration of MnSO 4 as follows.
  • Gibson assembly (DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, with pCL1920 digested with error-prone PCR products and SmaI restriction enzymes performed under the conditions of [Table 6] and [Table 7].
  • NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix was used to obtain a recombinant mutant plasmid library.
  • the mutant library obtained by the above method, pCL1920-PyccA-Hrh and pCL1920 were transformed into Escherichia coli W3110 cells, and cultured in LB plate medium containing 50 ⁇ g/L spectinomycin. Sequencing was performed to select the colonies of 50 mutation libraries to determine the mutation rate and the presence or absence of mutations at various locations.
  • positions 79 to 83 of the Wex membrane protein amino acid sequence were the key regions for introducing mutations to improve L-tryptophan excretion, and the amino acids in the sequence were various hydrophobic amino acids and aliphatic amino acids. Alternatively, it was attempted to improve its activity by replacing it with a relatively small L-amino acid.
  • Example 14 Substitution of amino acid No. 79 of the Wex sequence and a hydrophobic amino acid of Leucine in a microorganism of the genus Corynebacterium.
  • leucine which is the 79th amino acid sequence of the Wex membrane protein, with another hydrophobic amino acid.
  • Site-Directed Mutagenesis was performed using pDZTn-PgapA-Hrh prepared in Example 2 as a template in order to make mutations to three other amino acids other than leucine. Site-Directed mutagenesis was performed in the following way.
  • the pDZTn-PgapA-wex L79A, pDZTn-PgapA-wex L79V, pDZTn-PgapA-wex L79I vectors prepared as in [Table 11] were transformed to CA04-8352 prepared in Reference Example 1 by electroporation, respectively.
  • Three strains were obtained in which the mutant wex gene was inserted on the chromosome through a second crossover process.
  • the genetic manipulation was confirmed by PCR method and genome sequencing using primers of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, which can amplify the regions outside the homologous recombination upstream region and downstream region into which the corresponding gene is inserted, respectively.
  • the transformed strains thus obtained were named CA04-8352 (wex L79A), CA04-8352 (wex L79V), and CA04-8352 (wex L79I), respectively.
  • CA04-8352, CA04-8405, CA04-8352 (wex L79A), CA04-8352 (wex L79V), CA04-8352 (wex L79I) strains were cultured in the same manner as in Example 10 to confirm tryptophan production. After completion of the culture, the production amount of L-tryptophan was measured using HPLC.
  • Example 15 Substitution of the 80th amino acid of the Wex sequence, serine, with a hydrophobic amino acid in the microorganism of the genus Corynebacterium.
  • serine 80 of the Wex amino acid sequence was used as a hydrophobic amino acid, alanine (A) (SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 134), valine (V) (SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 135), leucine (L) (SEQ ID NO: 91, sequence Number 136), isoleucine (I) (SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 137) was carried out in the same manner as in Example 14, the mutagenic primer set used to secure the pDZTn-PgapA-wex variant plasmid and The variant form is the same as in [Table 13].
  • Base sequence pDZTn-PgapA-wex S80A 93 GTCCTACGAACTCTGCCTG GCA CTCTCCATCGGTTATGCC 94
  • pDZTn-PgapA-wex S80L 97 GTCCTACGAACTCTGCCTG CTG CTCTCCATCGGTTATGCC 98
  • the pDZTn-PgapA-wex S80A, pDZTn-PgapA-wex S80V, pDZTn-PgapA-wex S80L, pDZTn-PgapA-wex S80I vectors prepared as in [Table 13] were transformed into CA04-8352 by electroporation, respectively. , Four strains were obtained in which the mutant wex gene was inserted on the chromosome through a second crossover process.
  • the genetic manipulation was confirmed by PCR method and genome sequencing using primers of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, which can amplify the regions outside the homologous recombination upstream region and downstream region into which the corresponding gene is inserted, respectively.
  • the transformed strains thus obtained were named CA04-8352 (wex S80A), CA04-8352 (wex S80V), CA04-8352 (wex S80L), and CA04-8352 (wex S80I), respectively.
  • CA04-8352, CA04-8405, CA04-8352 (wex S80A), CA04-8352 (wex S80V), CA04-8352 (wex S80L), CA04-8352 (wex S80I) strains were used in Example 10 to confirm tryptophan production. It was cultured in the same way. After completion of the culture, the production amount of L-tryptophan was measured by HPLC.
  • Example 16 Substitution of amino acid 81 of the Wex sequence and a hydrophobic amino acid of Leucine in a microorganism of the genus Corynebacterium.
  • leucine 81 the 81st amino acid of the amino acid sequence of the Wex membrane protein (hereinafter referred to as leucine 81) with another hydrophobic amino acid.
  • Site-Directed Mutagenesis was performed using pDZTn-PgapA-wex as a template in the same manner as in Example 14 in order to mutate into three other hydrophobic amino acids other than leucine.
  • leucine 81 of the Wex amino acid sequence was used as a hydrophobic amino acid, alanine (A) (SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 138), valine (V) (SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 139), isoleucine (I) (SEQ ID NO: 103, sequence 140) was performed in the same manner as in Example 14, and the mutagenic primer set and mutant form used to secure the pDZTn-PgapA-wex mutant plasmid are the same as in [Table 15].
  • A alanine
  • V valine
  • I isoleucine
  • Base sequence pDZTn-PgapA-wex L81A CCTACGAACTCTGCCTGTCG GCA TCCATCGGTTATGCCAATAC 105 GTATTGGCATAACCGATGGA TGC CGACAGGCAGAGTTCGTAGG pDZTn-PgapA-wex L81V
  • CCTACGAACTCTGCCTGTCG GTG TCCATCGGTTATGCCAATAC 107 GTATTGGCATAACCGATGGA CAC CGACAGGCAGAGTTCGTAGG pDZTn-PgapA-wex L81I CCTACGAACTCTGCCTGTCG ATC TCCATCGGTTATGCCAATAC 109 GTATTGGCATAACCGATGGA G,
  • the pDZTn-PgapA-wex L81A, pDZTn-PgapA-wex L81V, and pDZTn-PgapA-wex L81I vectors prepared as in [Table 15] were transformed into CA04-8352 by electroporation, respectively, and then subjected to a second crossover process. Three strains were obtained in which the variant wex gene was inserted on the chromosome. The genetic manipulation was confirmed by PCR method and genome sequencing using primers of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, which can amplify the regions outside the homologous recombination upstream region and downstream region into which the corresponding gene is inserted, respectively.
  • the transformed strains thus obtained were named CA04-8352 (wex L81A), CA04-8352 (wex L81V), and CA04-8352 (wex L81I), respectively.
  • CA04-8352, CA04-8405, CA04-8352 (wex L81A), CA04-8352 (wex L81V), CA04-8352 (wex L81I) strains were cultured in the same manner as in Example 10 to confirm tryptophan production. After completion of the culture, the production amount of L-tryptophan was measured by HPLC.
  • Example 17 Substitution of the 82nd amino acid of the Wex sequence, Serine with a hydrophobic amino acid in a microorganism of the genus Corynebacterium.
  • Serine 82 which is the 82nd amino acid in the amino acid sequence of the Wex membrane protein, with a hydrophobic amino acid.
  • Site-Directed Mutagenesis was performed using pDZTn-PgapA-wex as a template in the same manner as in Example 14 in order to mutate into four different hydrophobic amino acids.
  • serine 82 of the Wex amino acid sequence is hydrophobic amino acids alanine (A) (SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 141), valine (V) (SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 142), leucine (L) (SEQ ID NO: 112, sequence Number 143), isoleucine (I) (SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 144) was carried out in the same manner as in Example 14, the mutagenic primer set used to secure the pDZTn-PgapA-wex variant plasmid and The variant form is the same as [Table 17].
  • Base sequence pDZTn-PgapA-wex S82A 114 CGAACTCTGCCTGTCGCTC GCA ATCGGTTATGCCAATACAG 115 CTGTATTGGCATAACCGAT TGC GAGCGACAGGCAGAGTTCG pDZTn-PgapA-wex S82V 116 CGAACTCTGCCTGTCGCTC GTG ATCGGTTATGCCAATACAG 117 CTGTATTGGCATAACCGAT CAC GAGCGACAGGCAGAGTTCG pDZTn-PgapA-wex S82L 118 CGAACTCTGCCTGTCGCTC CTG ATCGGTTATGCCAATACAG 119 CTGTATTGGCATAACCGAT CAG GAGCGACAGGCAGAGTTCG p
  • the pDZTn-PgapA-wex S82A, pDZTn-PgapA-wex S82V, pDZTn-PgapA-wex S82L, pDZTn-PgapA-wex S82I vectors prepared as in [Table 17] were transformed into CA04-8352 by electroporation, respectively. , Four strains were obtained in which the mutant wex gene was inserted on the chromosome through a second crossover process.
  • the genetic manipulation was confirmed by PCR method and genome sequencing using primers of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, which can amplify the regions outside the homologous recombination upstream region and downstream region into which the corresponding gene is inserted, respectively.
  • the transformed strains thus obtained were named CA04-8352 (wex S82A), CA04-8352 (wex S82V), CA04-8352 (wex S82L), CA04-8352 (wex S82I), respectively.
  • CA04-8352, CA04-8405, CA04-8352 (wex S82A), CA04-8352 (wex S82V), CA04-8352 (wex S82L), CA04-8352 (wex S82I) strains were used in Example 10 to confirm tryptophan production. It was cultured in the same way. After completion of the culture, the production amount of L-tryptophan was measured by HPLC.
  • Corynebacterium glutamicum L-tryptophan-producing strain (CA04-8352) and L-tryptophan-releasing gene (Wex) inserted strain (CA04-8405), and amino acid variant 82 of the Wex amino acid sequence (CA04-8352 ( Wex S82A), CA04-8352 (wex S82V), CA04-8352 (wex S82L), CA04-8352 (wex S82I)) of L-tryptophan production.
  • Example 18 Substitution of amino acid 83 of the Wex sequence and isoleucine with a hydrophobic amino acid in a microorganism of the genus Corynebacterium.
  • isoleucine which is the 83rd amino acid of the Wex membrane protein, with another hydrophobic amino acid.
  • Site-Directed Mutagenesis was performed using pDZTn-PgapA-wex as a template in the same manner as in Example 14 in order to mutate to three other hydrophobic amino acids other than isoleucine.
  • isoleucine at No. 83 of the Wex amino acid sequence is used as a hydrophobic amino acid
  • alanine (A) (SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 145), valine (V) (SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 146), leucine (L) (SEQ ID NO: 124, sequence Number 147) was carried out in the same manner as in Example 14, and the mutagenic primer set and variant form used to secure the pDZTn-PgapA-wex mutant plasmid are the same as in [Table 19].
  • a mutagenic primer set for the production of amino acid variant 83 plasmid of Wex amino acid sequence for introduction of microorganisms in Corynebacterium genus Variant Wex Plasmid SEQ ID ## Base sequence pDZTn-PgapA-wex I83A 125 GAACTCTGCCTGTCGCTCTCC GCA GGTTATGCCAATACAGGCAGG 126 CCTGCCTGTATTGGCATAACC TGC GGAGAGCGACAGGCAGAGTTC pDZTn-PgapA-wex I83V 127 GAACTCTGCCTGTCGCTCTCC GTG GGTTATGCCAATACAGGCAGG 128 CCTGCCTGTATTGGCATAACC CAC GGAGAGCGACAGGCAGAGTTC pDZTn-PgapA-wex I83L 129 GAACTCTGCCTGTCGCTCTCC CTG GGTTATGCCAATACAGGCAGG 130 CCTGCCTGTATTGGCATAACC CAG GGAGAG
  • the pDZTn-PgapA-wex I83A, pDZTn-PgapA-wex I83V, and pDZTn-PgapA-wex I83L vectors prepared as in [Table 19] were transformed into CA04-8352 by electroporation, respectively, and then subjected to a second crossover process. Three strains were obtained in which the variant wex gene was inserted on the chromosome. The genetic manipulation was confirmed by PCR method and genome sequencing using primers of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, which can amplify the regions outside the homologous recombination upstream region and downstream region into which the corresponding gene is inserted, respectively.
  • the transformed strains thus obtained were named CA04-8352 (wex I83A), CA04-8352 (wex I83V), and CA04-8352 (wex I83L), respectively.
  • CA04-8352, CA04-8405, CA04-8352 (wex I83A), CA04-8352 (wex I83V), CA04-8352 (wex I83L) strains were cultured in the same manner as in Example 10 to confirm the tryptophan production. After completion of the culture, the production amount of L-tryptophan was measured by HPLC.
  • the strain CA04-8352 (wex L79I), CA04-8352 (wex S80V), CA04-8352 (wex L81V), CA04-8352 (wex S82V), CA04-8352 (wex I83L) of the present application was introduced They were named CM05-9022, CM05-9023, CM05-9024, CM05-9025, CM05-9026, respectively, and as of March 29, 2019, KCCM12475P was internationally deposited with the Korea Microbial Conservation Center (KCCM), an international depository organization under the Budapest Treaty. , KCCM12476P, KCCM12477P, KCCM12478P, KCCM12479P.
  • KCCM Korea Microbial Conservation Center
  • Example 19 Substitution of amino acid No. 79 of the Wex sequence and a hydrophobic amino acid of Leucine in a microorganism of the genus Escherichia.
  • Leucine No. 79 of the Wex amino acid sequence is another hydrophobic amino acid, alanine (A) (SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 131), valine (V) (SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 132), isoleucine (I) (SEQ ID NO: 82, sequence In order to substitute number 133), a PCR mixture as shown in [Table 21] was prepared using each mutagenic primer set indicated in [Table 23], and PCR was performed in the cycle of [Table 22]. After PCR was completed, 1 ⁇ l of DpnI restriction enzyme was added, followed by treatment at 37°C for 1 hour.
  • A alanine
  • V valine
  • I isoleucine
  • DpnI-treated DNA 3 ⁇ l DH5a competent cells were transformed to obtain pCL1920-PgapA-wex mutant plasmids, and it was confirmed that they were replaced with each of the mutations indicated in [Table 23] through sequencing.
  • a mutagenic primer set for the preparation of amino acid variant 79 of the Wex amino acid sequence for expression in Escherichia microorganisms Variant Wex Plasmid SEQ ID ## Base sequence pCL1920-PyccA-wex L79A 83 GTGTCCTACGAACTCTGC GCA TCGCTCTCCATCGGTTATG 84 CATAACCGATGGAGAGCGA TGC GCAGAGTTCGTAGGACAC pCL1920-PyccA-wex L79V 85 GTGTCCTACGAACTCTGC GTG TCGCTCTCCATCGGTTATG 86 CATAACCGATGGAGAGCGA CAC GCAGAGTTCGTAGGACAC pCL1920-PyccA-wex L79I 87 GTGTCCTACGAACTCTGC ATC TCGCTCCATCGGTTATG 88 CATAACCGATGGAGCGA GAT GCAGAGTTCGTAGGACAC
  • the pCL1920-PyccA-wex L79A, pCL1920-PyccA-wex L79V, and pCL1920-PyccA-wex L79I vectors prepared as shown in [Table 23] were transformed into CA04-4303 by electroporation, respectively, and different amino acids wex 79 Three strains into which the mutant gene was each introduced were obtained.
  • the transformed strains thus obtained were named CA04-4303 (wex L79A), CA04-4303 (wex L79V), and CA04-4303 (wex L79I), respectively.
  • L-tryptophan of CA04-4303 (wex L79A), CA04-4303 (wex L79V), CA04-4303 (wex L79I) strains using CA04-4303 (pCL1920) and CA04-4306 prepared in Example 12 as controls
  • E. coli L-tryptophan-producing strain (CA04-4303 (pCL1920)) and L-tryptophan-releasing gene (Wex)-expressing strain (CA04-4306), amino acid mutation 79 of the Wex amino acid sequence (CA04-4303 (wex L79A)) , CA04-4303 (wex L79V), CA04-4303 (wex L79I)) L-tryptophan production check Strain name Tryptophan production (g/L) Tryptophan yield (g/g glc, %) Improved yield compared to wild type Wex ( ⁇ ,%p) CA04-4303 (pCL1920) 1.4 2.0 - CA04-4306 2.1 3.0 - CA04-4303 (wex L79A) 3.2 4.5 1.5 CA04-4303 (wex L79V) 2.5 3.6 0.6 CA04-4303 (wex L79I) 2.7 3.9 0.9
  • Substitution of is meant to significantly improve the activity of Wex's L-tryptophan excretion capacity not only in the microorganisms of the genus Corynebacterium, but also in the microorganisms of the genus Escherichia.
  • Example 20 Substitution of amino acid No. 80 of the Wex sequence and a hydrophobic amino acid of serine in a microorganism of the genus Escherichia.
  • serine 80 of the Wex amino acid sequence was used as a hydrophobic amino acid, alanine (A) (SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 134), valine (V) (SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 135), leucine (L) (SEQ ID NO: 91, sequence Number 136), isoleucine (I) (SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 137) was carried out in the same manner as in Example 19, the mutagenic primer set used to secure the pCL1920-PyccA-wex variant plasmid and The variant form is the same as in [Table 25].
  • a mutagenic primer set for the production of amino acid variant 80 of the Wex amino acid sequence for expression in Escherichia microorganisms Variant Wex Plasmid SEQ ID ## Base sequence pCL1920-PyccA-wex S80A 93 GTCCTACGAACTCTGCCTG GCA CTCTCCATCGGTTATGCC 94 GGCATAACCGATGGAGAG TGC CAGGCAGAGTTCGTAGGAC pCL1920-PyccA-wex S80V 95 GTCCTACGAACTCTGCCTG GTG CTCCATCGGTTATGCC 96 GGCATAACCGATGGAGAG CAC CAGGCAGAGTTCGTAGGAC pCL1920-PyccA-wex S80L 97 GTCCTACGAACTCTGCCTG CTG CTCTCCATCGGTTATGCC 98 GGCATAACCGATGGAG CAG CAGGCAGAGTTCGTAGGAC pCL1920-PyccA-wex S80I 99 GTCCTAC
  • the pCL1920-PyccA-wex S80A, pCL1920-PyccA-wex S80V, pCL1920-PyccA-wex S80L, pCL1920-PyccA-wex S80I vectors prepared as in [Table 25] were transformed into CA04-4303 by electroporation, respectively. , Four different strains were obtained in which different wex 80 amino acid variant genes were introduced, respectively. The transformed strains thus obtained were named CA04-4303 (wex S80A), CA04-4303 (wex S80V), CA04-4303 (wex S80L), and CA04-4303 (wex S80I), respectively.
  • E. coli L-tryptophan-producing strain (CA04-4303 (pCL1920)) and L-tryptophan-releasing gene (Wex)-expressing strain (CA04-4306), and amino acid mutation strain 80 of the Wex amino acid sequence (CA04-4303 (wex S80A)) , CA04-4303 (wex S80V), CA04-4303 (wex S80L), CA04-4303 (wex S80I)) L-tryptophan production check Strain name Tryptophan production (g/L) Tryptophan yield (g/g glc, %) Improved yield compared to wild type Wex ( ⁇ ,%p) CA04-4303 (pCL1920) 1.4 2.0 - CA04-4306 2.1 3.0 - CA04-4303 (wex S80A) 2.7 3.9 0.9 CA04-4303 (wex S80V) 2.9 4.2 1.2 CA04-4303 (wex S80L) 2.6 3.7 0.7 CA04-4303 (wex S80I) 2.3
  • Example 21 Substitution of amino acid 81 of the Wex sequence and a hydrophobic amino acid of Leucine in a microorganism of the genus Escherichia.
  • leucine 81 of the Wex amino acid sequence was used as a hydrophobic amino acid, alanine (A) (SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 138), valine (V) (SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 139), isoleucine (I) (SEQ ID NO: 103, sequence No. 140) was carried out in the same manner as in Example 19, and the mutagenic primer set and variant form used to secure the pCL1920-PyccA-wex mutant plasmid are the same as in [Table 27].
  • a set of mutagenic primers for the production of amino acid variant 81 of the Wex amino acid sequence for expression in Escherichia microorganisms Variant Wex Plasmid SEQ ID ## Base sequence pCL1920-PyccA-wex L81A 104 CCTACGAACTCTGCCTGTCG GCA TCCATCGGTTATGCCAATAC 105 GTATTGGCATAACCGATGGA TGC CGACAGGCAGAGTTCGTAGG pCL1920-PyccA-wex L81V 106 CCTACGAACTCTGCCTGTCG GTG TCCATCGGTTATGCCAATAC 107 GTATTGGCATAACCGATGGA CAC CGACAGGCAGAGTTCGTAGG pCL1920-PyccA-wex L81I 108 CCTACGAACTCTGCCTGTCG ATC TCCATCGGTTATGCCAATAC 109 GTATTGGCATAACCGATGGA GAT CGACAGGCAGAGTTCGTAGG
  • the pCL1920-PyccA-wex L81A, pCL1920-PyccA-wex L81V, and pCL1920-PyccA-wex L81I vectors prepared as shown in [Table 27] were transformed into CA04-4303 by electroporation, respectively, and different amino acids wex 81 Three strains into which the mutant gene was each introduced were obtained. The transformed strains thus obtained were named CA04-4303 (wex L81A), CA04-4303 (wex L81V), and CA04-4303 (wex L81I), respectively.
  • CA04-4303 (pCL1920), CA04-4306, CA04-4303 (wex L81A), CA04-4303 (wex L81V), CA04-4303 (wex L81I) to determine the L-tryptophan production of strains in the same manner as in Example 12 Cultured. After completion of the culture, the production amount of L-tryptophan was measured by HPLC.
  • E. coli L-tryptophan-producing strain (CA04-4303 (pCL1920)) and L-tryptophan-releasing gene (Wex)-expressing strain (CA04-4306), and amino acid mutation 81 of the Wex amino acid sequence (CA04-4303 (wex L81A)) , CA04-4303 (wex L81V), CA04-4303 (wex L81I)) L-tryptophan production check Strain name Tryptophan production (g/L) Tryptophan yield (g/g glc, %) Improved yield compared to wild type Wex ( ⁇ ,%p) CA04-4303 (pCL1920) 1.4 2.0 - CA04-4306 2.1 3.0 - CA04-4303 (wex L81A) 3.4 4.8 1.8 CA04-4303 (wex L81V) 2.9 4.1 1.1 CA04-4303 (wex L81I) 2.8 4.0 1.0
  • Substitution of is meant to significantly improve the activity of Wex's L-tryptophan excretion capacity not only in the microorganisms of the genus Corynebacterium, but also in the microorganisms of the genus Escherichia.
  • Example 22 Substitution of amino acid 82 and serine to hydrophobic amino acid of Wex sequence in microorganisms of the genus Escherichia.
  • serine 82 of the Wex amino acid sequence is hydrophobic amino acids alanine (A) (SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 141), valine (V) (SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 142), leucine (L) (SEQ ID NO: 112, sequence Number 143) and isoleucine (I) (SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 144) was carried out in the same manner as in Example 19, and the mutagenic primer set used to secure the pCL1920-PyccA-wex variant plasmid and The variant form is the same as in [Table 29].
  • a mutagenic primer set for the production of amino acid variant 82 of the Wex amino acid sequence for expression in Escherichia microorganisms Variant Wex Plasmid SEQ ID ##
  • Base sequence pCL1920-PyccA-wex S82A 114 CGAACTCTGCCTGTCGCTC GCA ATCGGTTATGCCAATACAG 115 CTGTATTGGCATAACCGAT TGC GAGCGACAGGCAGAGTTCG pCL1920-PyccA-wex S82V 116 CGAACTCTGCCTGTCGCTC GTG ATCGGTTATGCCAATACAG 117 CTGTATTGGCATAACCGAT CAC GAGCGACAGGCAGAGTTCG pCL1920-PyccA-wex S82L 118 CGAACTCTGCCTGTCGCTC CTG ATCGGTTATGCCAATACAG 119 CTGTATTGGCATAACCGAT CAG GAGCGACAGGCAGAGTTCG pCL1920-PyccA-wex
  • the pCL1920-PyccA-wex S82A, pCL1920-PyccA-wex S82V, pCL1920-PyccA-wex S82L, pCL1920-PyccA-wex S82I vectors prepared as in [Table 29] were transformed into CA04-4303 by electroporation, respectively.
  • Four different strains were obtained in which different wex 82 amino acid variant genes were introduced, respectively.
  • the transformed strains thus obtained were named CA04-4303 (wex S82A), CA04-4303 (wex S82V), CA04-4303 (wex S82L), and CA04-4303 (wex S82I), respectively.
  • E. coli L-tryptophan-producing strain (CA04-4303 (pCL1920)) and L-tryptophan-releasing gene (Wex)-expressing strain (CA04-4306), amino acid mutant strain of the Wex amino acid sequence at amino acid 82 (CA04-4303 (wex S82A)) , Confirmation of L-tryptophan production of CA04-4303(wex S82V), CA04-4303(wex S82L), CA04-4303(wex S82I)) Strain name Tryptophan production (g/L) Tryptophan yield (g/g glc, %) Improved yield compared to wild type Wex ( ⁇ ,%p) CA04-4303 (pCL1920) 1.4 2.0 - CA04-4306 2.1 3.0 - CA04-4303 (wex S82A) 2.9 4.2 1.2 CA04-4303 (wex S82V) 3.1 4.4 1.4 CA04-4303 (wex S82L) 2.4 3.4 0.4 CA04-4303 (w
  • Example 23 Substitution of amino acid 83 of the Wex sequence, isoleucine with a hydrophobic amino acid in a microorganism of the genus Escherichia.
  • isoleucine at No. 83 of the Wex amino acid sequence is used as a hydrophobic amino acid
  • alanine (A) (SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 145), valine (V) (SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 146), leucine (L) (SEQ ID NO: 124, sequence Number 147) was carried out in the same manner as in Example 19, and the mutagenic primer set and variant form used to secure the pCL1920-PyccA-wex mutant plasmid are the same as in [Table 31].
  • a mutagenic primer set for the production of amino acid variant 83 plasmid of the Wex amino acid sequence for expression in Escherichia microorganisms Variant Wex Plasmid SEQ ID ## Base sequence pCL1920-PyccA-wex I83A 125 GAACTCTGCCTGTCGCTCTCC GCA GGTTATGCCAATACAGGCAGG 126 CCTGCCTGTATTGGCATAACC TGC GGAGAGCGACAGGCAGAGTTC pCL1920-PyccA-wex I83V 127 GAACTCTGCCTGTCGCTCTCC GTG GGTTATGCCAATACAGGCAGG 128 CCTGCCTGTATTGGCATAACC CAC GGAGAGCGACAGGCAGAGTTC pCL1920-PyccA-wex I83L 129 GAACTCTGCCTGTCGCTCTCC CTG GGTTATGCCAATACAGGCAGG 130 CCTGCCTGTATTGGCATAACC CAG GGAGAGCGACAGGCAGAGTTC
  • the pCL1920-PyccA-wex I83A, pCL1920-PyccA-wex I83V, and pCL1920-PyccA-wex I83L vectors prepared as shown in [Table 31] were transformed into CA04-4303 by electroporation, respectively, and different amino acids wex 83 Three strains into which the mutant gene was each introduced were obtained. The transformed strains thus obtained were named CA04-4303 (wex I83A), CA04-4303 (wex I83V), and CA04-4303 (wex I83L), respectively.
  • CA04-4303 (pCL1920), CA04-4306, CA04-4303 (wex I83A), CA04-4303 (wex I83V), CA04-4303 (wex I83L) to determine the L-tryptophan production of strains in the same manner as in Example 12 Cultured. After completion of the culture, the production amount of L-tryptophan was measured by HPLC.
  • E. coli L-tryptophan-producing strain (CA04-4303 (pCL1920)) and L-tryptophan-releasing gene (Wex)-expressing strain (CA04-4306), and the 83rd amino acid mutation strain of the Wex amino acid sequence (CA04-4303 (wex I83A)) , CA04-4303 (wex I83V), CA04-4303 (wex I83L)) L-tryptophan production check Strain name Tryptophan production (g/L) Tryptophan yield (g/g glc, %) Improved yield compared to wild type Wex ( ⁇ ,%p) CA04-4303 (pCL1920) 1.4 2.0 - CA04-4306 2.1 3.0 - CA04-4303 (wex I83A) 2.2 3.2 0.2 CA04-4303 (wex I83V) 2.3 3.3 0.3 CA04-4303 (wex I83L) 2.6 3.7 0.7

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Abstract

본 출원은 트립토판 배출 활성을 갖는 단백질 변이체, 상기 단백질 변이체를 발현하는 L-트립토판을 생산하는 미생물, 및 상기 미생물을 이용하여 L-트립토판을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

신규 L-트립토판 배출 단백질 변이체 및 이를 이용한 L-트립토판을 생산하는 방법
본 출원은 트립토판 배출 활성을 갖는 신규 단백질의 변이체 및 상기 단백질 변이체를 발현하는, L-트립토판을 생산하는 미생물, 및 상기 미생물을 이용하여 L-트립토판을 생산하는 방법에 관한 것이다.
트립토판은 필수 아미노산의 하나로 사료 첨가제 등, 또는 수액제 등의 의약품 원료 및 건강식품소재 등으로 널리 사용되어 왔다. 현재에는 미생물을 이용한 직접 발효법이 L-트립토판 생산에 주로 이용되고 있다.
L-트립토판 생산에 사용되는 미생물들은 초기에 화학적 또는 물리적 돌연변이를 통한 유사체 내성을 나타내는 선별 균주들이 주로 사용되어 왔으나, 1990년대 유전자 재조합 기술의 급격한 발전과 분자수준의 조절 기작들이 규명됨에 따라 유전자 조작 기법을 이용한 재조합 균주들이 주로 사용되고 있다.
한편, 특정 아미노산 배출 유전자의 발현은 미생물에서 해당 아미노산의 생산성 향상을 야기하여 왔다. 코리네박테리움 속 미생물의 L-라이신 배출유전자 (lysE)의 발현 강화는 라이신의 생산성을 향상시켰다 (WO 9723597A2). 또한 대장균에서 rhtC 유전자의 강화는 L-쓰레오닌 (L-threonine)에 대한 내성을 향상시켰으며, 동시에 L-호모세린, L-쓰레오닌, L-류신의 생산성이 향상되었다 (EP1013765A1). 대장균에서 기능이 공지되지 않은 유전자들, yahN 유전자, yeaS 유전자, yfiK 유전자 그리고 yggA 유전자를 강화시킴으로써 L-글루타민산, L-라이신, L-트레오닌, L-알라닌, L-히스티딘, L-프롤린, L-아르기닌, L-발린 및 L-이소류신의 생산성이 향상되었다는 특허(EP1016710B1)도 개시되어 있다.
하지만 현재 L-트립토판에 특이성을 보이는 배출 단백질은 보고된 바 없다. 대장균의 yddG 유전자가 알려져 있지만, L-트립토판보다 L-페닐알라닌에 높은 특이성을 보인다 (FEMS Microbiol Lett 275 (2007) 312-318). 또한 L-아미노산 발효의 생산 균주로서 주로 이용되는 코리네박테리움 속 미생물에서는 L-트립토판 또는 방향족 아미노산 배출 유전자가 전혀 보고된 바 없다. (J Ind Microbiol Biotechnol. 2015 May; 42(5):787-97)
본 출원에서는 L-트립토판에 특이성을 가지는 신규 트립토판 배출 단백질을 L-트립토판을 생산하는 미생물에서 발현시킨 결과, L-트립토판 생산량이 획기적으로 향상됨을 확인하였고, 해당 막단백질의 추가적 배출능 향상을 위한 변이 도입을 통해 L-트립토판 생산량이 획기적으로 향상됨을 확인함으로써 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 하나의 목적은, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 79번 내지 83번에 상응하는 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 소수성(hydrophobic) 또는 지방족(Aliphatic) 아미노산으로 치환된, L-트립토판 배출 활성을 갖는 단백질 변이체를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 이를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 출원의 하나의 목적은, 상기 단백질 변이체를 발현하는, L-트립토판을 생산하는 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은 상기 미생물을 배지에서 배양하는 것을 포함하는, L-트립토판 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은 상기 단백질 변이체의 L-트립토판 생산 증가 용도를 제공하는 것이다.
본 출원에서는 L-트립토판에 특이성을 가지는 신규 배출 유전자를 발굴하여, 이를 L-트립토판을 생산하는 미생물에 발현시킨 결과, 상기 유전자가 발현되지 않은 모균주에 비하여 L-트립토판 생산량이 획기적으로 향상됨을 확인하였으며, 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 변이체를 발굴하여 L-트립토판 생산량이 더욱 향상되는 것을 확인하였으므로, 이를 통해 L-트립토판을 효과적으로 생산할 수 있다.
도 1은 당소모량에 따른 코리네글루타미쿰 박테리움 변이주 CA04-8352와 CA04-8405의 세포 내 트립토판 농도를 확인한 것이다.
이하에서는 본 출원을 더욱 상세히 설명한다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 출원의 하나의 양태는, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 하나 이상의 변이를 포함하는, L-트립토판 배출능을 갖는 단백질 변이체를 제공한다.
상기 변이는 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 79번째 내지 83번째 아미노산 중에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것을 포함할 수 있다.
상기 단백질 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 79번 내지 83번 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, L-트립토판 배출 활성을 갖는 단백질 변이체일 수 있다. 구체적으로는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 79번 내지 83번 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 소수성 아미노산 또는 지방족 아미노산으로 치환된, L-트립토판 배출 활성을 갖는 단백질 변이체일 수 있다.
본 출원에서 용어, "L-트립토판(L-tryptophan)"은 α-아미노산의 하나로, 체내에서 합성되지 않는 필수 아미노산이며 화학식이 C11H12N2O2인 방향족 L-아미노산을 말한다.
본 출원에서 "L-트립토판 배출능을 갖는 단백질", "L-트립토판 배출 활성을 갖는 단백질"은 특이적으로 L-트립토판을 세포 밖으로 배출할 수 있는 활성을 가지는 막 단백질을 의미한다.
상기 L-트립토판 배출 활성을 갖는 단백질은 허바스필리움 리조스페레 (Herbaspirillum rhizosphaerae)유래의 L-트립토판 배출 활성을 갖는 단백질일 수 있다. 상기 허바스필리움 리조스페레 (Herbaspirillum rhizosphaerae)유래의 L-트립토판 배출 활성을 갖는 단백질은 예를 들면, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 단백질, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 단백질과 혼용되어 사용될 수 있다.
여기서, "허바스필리움 리조스페레 (Herbaspirillum rhizosphaerae)"란 허바스필리움 속에 속하는 그람 음성 박테리아로, 국내에서는 울릉도 등에서 분리된 균주로, 토양 내 근권 (rhizosphere)에서 분리될 수 있다.
또한, 본 출원에서의 L-트립토판 배출 활성을 갖는 단백질은 비록 서열번호 1의 아미노산을 포함하는 단백질이라고 정의하였지만, 서열번호 1의 아미노산 서열 앞뒤로의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 서로 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 본원의 L-트립토판 배출 활성을 갖는 단백질에 해당됨은 당업자에게 자명하다. 구체적인 예를 들어, 본원의 L-트립토판 배출 활성을 갖는 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 80%, 90%, 95%, 또는 97% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 단백질일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 변이 대상이 되는 단백질의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
즉, 본 출원에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드', '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 폴리펩티드'라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, '서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드'는, 이와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 '서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드'에 속할 수 있음은 자명하다.
본 출원에서 제공하는 L-트립토판 배출능을 갖는 단백질 변이체는, 상기에서 설명한 L-트립토판 단백질 배출능을 갖는 단백질 중 특이적 위치의 아미노산이 치환되어, L-트립토판 배출능이 변이 전 단백질 대비 100% 초과되는 변이체를 의미할 수 있다.
본 출원에서 용어, "변이체(variant)"는 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 변형(modification)에 있어서 상기 열거된 서열 (the recited sequence)과 상이하나, 상기 단백질의 기능(functions) 또는 특성(properties)이 유지되는 단백질을 지칭한다. 변이체는 수 개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가에 의해 식별되는 서열(identified sequence)와 상이하다. 이러한 변이체는 일반적으로 상기 단백질의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산을 변형하고, 상기 변형된 단백질의 특성을 평가하여 식별될 수 있다. 즉, 변이체의 능력은 본래 단백질(native protein)에 비하여 증가되거나, 변하지 않거나, 또는 감소될 수 있다. 또한, 일부 변이체는 N-말단 리더 서열 또는 막전이 도메인(transmembrane domain)과 같은 하나 이상의 부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 다른 변이체는 성숙 단백질 (mature protein) 의 N- 및/또는 C-말단으로부터 일부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 상기 용어 "변이체"는 변이형, 변형, 변이된 단백질, 변이형 폴리펩티드, 변이, 등의 용어(영문 표현으로는 modification, modified protein, modified polypeptide, mutant, mutein, divergent, variant 등)가 사용될 수 있으며, 변이된 의미로 사용되는 용어라면 이에 제한되지 않는다. 본 출원의 목적상, 상기 변이체는 천연의 야생형 또는 비변형 단백질 대비 변이된 단백질의 활성이 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 상기 변이체는 하나 이상의 생물학적 활성을 여전히 보유하면서, 예를 들어 하나 이상의 보존적 치환을 가질 수 있다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 예를 들면, 전하를 띠는 곁사슬(electrically charged amino acid)을 갖는 아미노산 중 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 알지닌, 리신, 및 히스티딘을, 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 글루탐산 및 아르파르트산을 포함하고; 전하를 띠지 않는 곁사슬(uncharged amino acid)을 갖는 아미노산 중 비극성 아미노산(nonpolar amino acid)은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 프롤린을 포함하고, 극성(polar) 또는 친수성(hydrophilic) 아미노산은 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 글루타민을 포함하고, 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신을 포함한다.
또한, 변이체는 폴리펩티드의 특성과 2차 구조에 최소한의 영향을 갖는 아미노산들의 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 예를 들면 폴리펩티드는 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 이전(transfer)에 관여하는 단백질 N-말단의 시그널 (또는 리더)서열과 컨쥬게이트 할 수 있다. 또한 상기 폴리펩티드는 폴리펩티드를 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트 될 수 있다.
상기 '다른 아미노산으로 치환'은 치환 전의 아미노산과 다른 아미노산이면 제한되지 않는다. 즉, 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 79번째 아미노산인 류신이 류신 이외의 다른 아미노산 잔기로, 또는 80번째 아미노산인 세린이 세린 이외의 다른 아미노산 잔기로, 또는 81번째 아미노산인 류신이 류신 이외의 다른 아미노산 잔기로, 또는 82번째 아미노산인 세린이 세린 이외의 다른 아미노산 잔기로, 또는 83번째 아미노산인 이소류신이 이소류신 이외의 다른 아미노산 잔기로 치환된 것이라면 제한되지 않는다. 한편, 본 출원에서 '특정 아미노산이 치환되었다'고 표현하는 경우, 다른 아미노산으로 치환되었다고 별도로 표기하지 않더라도 치환 전의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환되는 것임은 자명하다.
또는 상기 단백질 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 79번 내지 83번 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 산성 아미노산 및 염기성 아미노산 이외의, 치환 전 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 또는 상기 단백질 변이체는 전하를 띠지 않는 곁사슬(uncharged amino acid)을 갖는, 치환 전 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된, 변이체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또는 상기 단백질 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 79번 내지 83번 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 소수성(hydrophobic) 아미노산 또는 지방족(Aliphatic) 아미노산 중 치환 전 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된 변이체일 수 있다. 구체적으로는 상기 단백질 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 79번 내지 83번 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 소수성(비극성) 아미노산 또는 지방족 아미노산 중 하나의 아미노산으로 치환된 변이체일 수 있다. 상기 지방족 아미노산은 예를 들어, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 소수성(비극성) 아미노산은 예를 들어, 글리신, 메티오닌, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또는, 상기 단백질 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 79번 내지 83번 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 크기(size)가 작은 아미노산 중 치환 전 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된 변이체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어 "크기가 작은 아미노산"은 20종 아미노산 중 상대적으로 크기가 작은 아미노산인 글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 및 아스파라긴을 포함하는 것으로, 구체적으로는 글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 발린, 류신, 이소류신 및 프롤린을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 보다 구체적으로는 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 세린, 및 트레오닌을 의미하는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또는, 상기 단백질 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 79번 내지 83번 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 알라닌, 발린, 류신, 이소류신으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산으로 치환된 변이체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로는 상기 단백질 변이체에서 다른 아미노산으로의 치환은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 79번째 아미노산인 류신이 알라닌, 발린, 또는 이소류신으로; 80번째 아미노산인 세린이 알라닌, 발린, 류신, 또는 이소류신으로; 81번째 아미노산인 류신이 알라닌, 발린, 또는 이소류신으로; 82번째 아미노산인 세린이 알라닌, 발린, 류신, 또는 이소류신으로; 83번째 아미노산인 이소류신이 알라닌, 발린, 또는 류신으로 치환 중에서 선택되는 하나 이상의 치환일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다,
이와 같은 본 출원의 단백질 변이체는 변이 전 단백질에 비해 강화된 L-트립토판 배출능을 갖는다.
본 출원의 서열번호 1의 N-말단으로부터 79번 내지 83번 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 단백질 변이체는, 상기 79번 내지 83번에 상응하는 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 단백질 변이체를 포함하는 것은 자명하다.
당업자라면 당업계에 알려진 서열 얼라인먼트, 상동성 또는 동일성을 확인하는 방법을 적용하여 임의의 서열과 본 출원의 서열번호 1을 비교함으로써 임의의 서열에서 어느 위치의 아미노산이 서열번호 1의 79번 내지 83번에 상응하는 아미노산인지 파악할 수 있다.
따라서, 본원에서 별도로 기술하지 않더라도, "서열번호 1의 79번 내지 83번 아미노산"에 관해 설명된 내용은 임의의 서열, 예를 들어 서열번호 1과 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 이상의 동일성을 갖는 서열에서, "서열번호 1의 79번 내지 83번 아미노산에 상응하는 위치의 아미노산"에 대해서도 적용 될 수 있음은 자명하다.
예를 들어, 본 출원의 단백질 변이체는 상기 79번 내지 83번에 상응하는 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되고, 서열번호 1과 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상 동일성을 갖는 단백질 변이체 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 79번 내지 83번 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 단백질 변이체는 서열번호 131 내지 147 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고, 구체적으로는 서열번호 131 내지 147 중 어느 하나의 아미노산 서열로 필수적으로 구성되는(consisting essentially of) 것일 수 있고, 보다 구체적으로는 서열번호 131 내지 147 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 단백질 변이체는 서열번호 131 내지 147 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 79번 내지 83번 아미노산 중 선택된 하나 이상의 아미노산은 고정되고, 이와 80% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 본 출원의 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 131 내지 147 및 상기 서열번호 131 내지 147 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면 79번 내지 83번 아미노산 위치 이외에, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 출원에서 용어 '상동성(homology)' 또는 '동일성(identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된 (conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한 (identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 따라 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다. (GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol.48 : 443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.
또한, 임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.
본 출원에서 용어, 단백질이 "발현되도록/되는"은 목적 단백질이 미생물 내에 도입되거나, 미생물내에서 발현되도록 변형된 상태를 의미한다. 상기 목적 단백질이 미생물내 존재하는 단백질인 경우 내재적 또는 변형전에 비하여 그 활성이 강화된 상태를 의미한다. 본 출원의 목적상 "목적 단백질"은 전술한 L-트립토판 배출능을 갖는 단백질의 변이체일 수 있다.
구체적으로, "단백질의 도입"은, 미생물이 본래 가지고 있지 않았던 특정 단백질의 활성을 나타나게 되는 것 또는 해당 단백질의 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 향상된 활성을 나타나게 되는 것을 의미한다. 예를 들어, 특정 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 미생물 내 염색체로 도입되거나, 특정 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 미생물 내로 도입되어 이의 활성이 나타나는 것일 수 있다. 또한, "활성의 강화"는 미생물이 가진 특정 단백질의 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 활성이 향상된 것을 의미한다. "내재적 활성"은 자연적, 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 미생물의 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주가 본래 가지고 있던 특정 단백질의 활성을 말한다.
구체적으로, 본 출원의 활성 강화는 상기 단백질 변이체를 코딩하는 유전자의 세포 내 카피수 증가, 상기 단백질 변이체를 암호화하는 유전자의 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법, 상기 L-트립토판 배출 활성을 갖는 단백질 변이체를 암호화하는 유전자 발현 조절 서열을 활성이 강력한 서열로 교체하는 방법, 염색체상의 L-트립토판 배출 활성을 갖는 자연형 단백질을 코딩하는 유전자를 상기 단백질 변이체를 암호화하는 유전자로 대체하는 방법, 상기 단백질 변이체의 활성이 강화되도록 상기 L-트립토판 배출 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자에 변이를 추가적으로 도입시키는 방법, 및 미생물에 단백질 변이체를 도입하는 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 이루어질 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기에서 유전자의 카피수 증가는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 벡터에 작동 가능하게 연결된 형태로 수행되거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 삽입됨으로써 수행될 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입되는 것일 수 있다. 또는, 상기 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포의 염색체 내에 도입되는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있다.
다음으로, 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현 조절서열을 변형하는 것은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현 조절서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현 조절서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드 발현 단위의 상부에는 본래의 프로모터 대신 강력한 프로모터가 연결될 수 있으며 이에 한정되는 것은 아니다. 공지된 강력한 프로모터의 예에는 cj1 내지 cj7 프로모터(대한민국 등록특허 제10-0620092호), lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터, tet 프로모터, gapA 프로모터, SPL7 프로모터, SPL13(sm3) 프로모터 (대한민국 등록특허 제 10-1783170호), O2 프로모터(대한민국 등록특허 제10-1632642), tkt 프로모터 및 yccA 프로모터 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
아울러, 염색체상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다.
이와 같은 단백질 활성의 도입 및 강화는, 상응하는 단백질의 활성 또는 농도가 야생형이나 비변형 미생물 균주에서의 단백질의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 일반적으로 최소 1%, 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% 또는 500%, 최대 1000% 또는 2000%까지 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.
본 출원의 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, L-트립토판 배출능을 갖는 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한 없이 포함될 수 있다.
본 출원에서 상기 L-트립토판 배출능을 갖는 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자는 wex 유전자일 수 있으며, 허바스필리움 리조스페레 유래일 수 있고, 구체적으로는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있으며, 보다 구체적으로는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 폴리펩티드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 79번 내지 83번 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한 없이 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 본 출원의 단백질 변이체, 구체적으로는 상기 서열번호 131 내지 147 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 이와 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 보다 구체적으로는 서열번호 80, 81, 82, 89, 90, 91, 92, 101, 102, 103, 110, 111, 112, 113, 122, 123 및 124로 기재된 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 상동성 또는 동일성에 대해서는 전술한 바와 같다.
또한, 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드 서열 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화하여 서열번호 1의 아미노산 서열의 79번 내지 83번 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 단백질 변이체를 코딩하는 서열이라면 제한 없이 포함할 수 있다.
상기 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성이 높은 유전자끼리, 40% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1X SSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1X SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1X SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다. 그러나 이에 제한되는 것은 아니며, 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 폴리뉴클레오티드가 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 폴리뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 폴리뉴클레오티드 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다 (Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조)..
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 출원에서 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 변이된 폴리뉴클레오티드로 교체시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 목적은, 상기 L-트립토판 배출 활성을 갖는 단백질 변이체를 발현하는, L-트립토판을 생산하는 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원에서 용어, "L-트립토판을 생산하는 미생물"은 배지 중의 탄소원으로부터 L-트립토판을 야생형이나 비변형 미생물과 비교하여 과량으로 생산할 수 있는 미생물을 말한다. 또한, 상기 L-트립토판을 생산하는 미생물은 재조합 미생물일 수 있다. 구체적으로 L-트립토판을 생산할 수 있다면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 엔테로박터(Enterbacter) 속, 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 일 수 있다. 보다 구체적으로는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 또는 에스케리키아(Escherichia) 속에 속하는 미생물일 수 있다.
보다 더욱 구체적으로는 에스케리키아속(Escherichia) 미생물은 대장균(Escherichia coli)일 수 있으며, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)일 수 있으나, L-트립토판 배출 활성을 갖는 단백질이 도입 또는 강화되어 L-트립토판 생산량이 증가될 수 있는 에스케리키아 속 또는 코리네박테리움 속에 속하는 미생물은 제한 없이 포함될 수 있다.
상기 미생물에서 L-트립토판의 생산량을 증가시키기 위해 E4P (erythorse-4-phosphate)와 같은 전구체의 지속적인 공급과 에너지의 효율적 이용을 위해 tktA 유전자의 발현을 강화시키거나 생합성 경로에서의 곁가지 경로를 차단시켜 생합성을 증가시키는 방법 또는 ATP를 적게 사용하는 방법 등을 사용할 수 있다.
구체적으로 본 출원에서 상기 L-트립토판 배출 활성을 갖는 단백질 또는 상기 단백질 변이체를 발현하는/단백질 변이체가 발현되도록 변형된 L-트립토판을 생산하는 미생물의 모균주는 L-트립토판을 생산하는 미생물이라면 특별히 제한되지 않는다. L-트립토판을 생산하는 미생물은, L-트립토판 생합성 경로를 강화하기 위하여, 경쟁경로의 유전자, L-트립토판 오페론의 방향성 경로의 조절자, L-트립토판 유입유전자, L-트립토판 유입 및 분해 유전자의 활성의 약화 또는 불활성화 시키거나, 및/또는 L-트립토판 오페론의 활성을 과발현시킨 미생물일 수 있다. 구체적으로, L-트립토판 생합성 유전자들의 (trpEDCBA) 발현을 억제하는 트립토판 합성 효소군의 조절유전자(trpR), 또는 세포 외부의 L-트립토판을 세포 내로 유입하는 Mtr 막단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 약화 또는 제거될 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 단백질 변이체를 발현하는, L-트립토판을 생산하는 미생물을 배지에서 배양하는 것을 포함하는, 트립토판의 생산 방법에 대한 것이다.
상기 L-트립토판, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 L-트립토판 배출 활성을 갖는 단백질, 단백질의 발현, 및 미생물에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 출원에서 용어, "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "배지"는 상기 미생물을 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 출원의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 출원의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원에서, 미생물의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
배지의 온도는 20℃내지 50℃, 구체적으로는 30℃ 내지 37℃일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 배양 기간은 유용 물질의 원하는 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 10 시간 내지 100 시간일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 생산방법은, 상기 배양에 따른 배지 또는 상기 미생물로부터 L-트립토판을 회수하는 것을 포함할 수 있다.
상기 트립토판을 회수하는 것은 본 출원의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지로부터 목적하는 L-트립토판을 회수할 수 있다. 예컨대 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 및 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
상기 생산방법은, 정제 공정을 포함할 수 있다. 상기 정제공정은 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여, 회수된 L-트립토판을 정제할 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 79번 내지 83번 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, L-트립토판 배출 활성을 갖는 단백질 변이체가 발현되도록 미생물을 변형하는 것을 포함하는, L-트립토판 배출능을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 단백질 변이체의 L-트립토판 배출능 증가 용도를 제공한다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 단백질 변이체의 L-트립토판 생산 증가 용도를 제공한다.
본 출원의 단백질 변이체는 미생물의 L-트립토판 배출능을 증가시킬 수 있어, L-트립토판 생산 증가 용도로 사용될 수 있다.상기 단백질 변이체, 다른 아미노산에 관해서는 전술한 바와 같다.
이하 본 출원을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 배출 유전자 탐색 및 선별
대장균 유래 EamA family 인 YdeD 의 아미노산 서열을 query 서열로 하고, NCBI와 Kegg database를 기반으로 PSI-BLAST 탐색 결과 트립토판을 배출할 수 있는 막단백질로 고려되는 30종의 후보 유전자들과 그것을 보유한 생물들을 선정하였다. 그 중 생산 균주에 적용 가능한 생물 안전도 (Biosafety level)와 확보 가능성을 고려하여 아래 표 1 과 같이 5종의 생물을 선정하였다.
방향족 아미노산 배출 막단백질을 보유 하고 있는 것으로 예상되는 미생물
순서 균 주 단백질 등록 번호 게놈 등록 번호 생물 안전도
1 Herbaspirillum rhizosphaerae(KCTC12558) WP_050478745.1 NZ_LFLU01000012.1 1
2 Pseudomonas stutzeri(KCTC22466) WP_037022429.1 NC_018177.1 1
3 Alcaligenes faecalis(KCTC2678) WP_045930186.1 NZ_CP013119.1 1
4 Cupriavidus necator(KCTC22469) WP_011616478.1 AM260480.1 1
5 Escherichia coli str. K-12 substr.MG1655 WP_000198205.1 NC_000913.3 1
실시예 2 : 허바스필리움 리조스페레 ( Herbaspirillum rhizosphaerae ) 유래 유전자가 도입된 코리네박테리움 속 미생물 제작
상기 실시예 1에서 선정한 허바스필리움 리조스페레 유래의 막 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가진다. 미국 국립보건원 진뱅크 (NIH GenBank)로부터 막단백질을 코딩하는 유전자 및 주변 염기서열에 대한 정보(등록번호 NZ_LFLU01000012.1)를 획득하였다.
확보된 염기서열에 근거하여 허바스필리움 리조스페레 유래 유전자를 코리네박테리움 글루타미쿰 게놈 DNA에 삽입하기 위한 프라이머를 합성하였다. 허바스필리움 리조스페레 유래 유전자를 증폭시키기 위해 허바스필리움 리조스페레 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 3와 서열번호 4의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR증폭 조건은 95℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 20초 변성, 62℃ 40초 어닐링, 72℃ 1분 중합을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
그 결과 924bp의 유전자(서열번호 2)를 포함한 956bp의 유전자 단편을 수득하였다.
서열번호 3 (wex - 1)
TAGAGGAGACACAACATGAATAGCAAGAAGGCCAC
서열번호 4 (wex - 2)
ggctcttcctgtttAGTCTACAAACAGTCCGCCAC
코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 gapA 프로모터를 확보하기 위하여, 코리네박테리움 글루타미쿰 게놈 DNA를 주형으로 하여 서열번호 5와 서열번호 6의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제 (SolGent co.)를 사용하였으며, PCR증폭 조건은 95℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 20초 변성, 62℃ 40초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
서열번호 5 (PgapA - 1)
cccttccggtttAGTTTGAAGCCAGTGTGAGTTGC
서열번호 6 (PgapA(-wex) - 2)
CTTCTTGCTATTCATGTTGTGTCTCCTCTAAAGATTGTA
증폭된 gapA 프로모터 부위와 허바스필리움 리조스페레 유래 유전자 단편, 그리고 ScaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pDZTn (한국 등록특허 제10-1126041호)는 깁슨 어셈블리 (DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix) 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDZTn-PgapA-Hrh로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.
제작된 pDZTn-PgapA-Hrh 벡터를 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 균주에 전기천공법(Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545)으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 트랜스포존 유전자의 사이에 1 카피의 PgapA-Hrh 유전자가 삽입된 균주를 얻었다. 해당 유전자가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 7과 서열번호 8의 프라이머를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였다.
서열번호 7 (Confirm_PgapA-wex - 1)
CGGATTATGCCAATGATGTG
서열번호 8 (Confirm_PgapA-wex - 2)
CACGATCACCAACATTCAGG
이렇게 수득한 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869::PgapA-Hrh 로 명명하였다.
실시예 3 : 수도모나스 스툿제리 ( Pseudomonas stutzeri ) 유래 유전자가 도입된 코리네박테리움 속 미생물 제작
상기 실시예 1에서 선정한 수도모나스 스툿제리 유래의 막 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 9로 기재되는 아미노산 서열을 가진다. 미국 국립보건원 진뱅크 (NIH GenBank)로부터 해당 유전자 및 주변 염기서열에 대한 정보(등록번호 NC_018177.1)를 획득하였다.
확보된 염기서열에 근거하여 수도모나스 스툿제리 유래 유전자를 코리네박테리움 글루타미쿰 게놈 DNA에 삽입하기 위한 프라이머를 합성하였다. 수도모나스 스툿제리 유래 유전자를 증폭시키기 위해 수도모나스 스툿제리 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 11와 서열번호 12의 프라이머를 이용하여 실시예 2와 동일한 방식으로 PCR을 수행하였다.
그 결과 945bp의 배출유전자(서열번호 10)를 포함한 977bp의 유전자 단편을 수득하였다.
서열번호 11 (Pst-1)
TAGAGGAGACACAACATGAAAAACCAGCGTAAAGC
서열번호 12 (Pst-2)
ggctcttcctgtttAGTTTATCCGTTTCGACGCGG
코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 gapA 프로모터를 사용하기 위하여, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 게놈 DNA를 주형으로 하여 서열번호 5와 서열번호 13의 프라이머를 이용하여 실시예 2에서와 동일한 방식으로 PCR을 수행하였다.
서열번호 13 (PgapA(-Pst)-2)
ACGCTGGTTTTTCATGTTGTGTCTCCTCTAAAGATTGTA
증폭된 gapA 프로모터 부위와 수도모나스 스툿제리 유래 유전자 단편, 그리고 ScaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pDZTn는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDZTn-PgapA-Pst로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.
제작된 pDZTn-PgapA-Pst 벡터를 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 균주에 전기천공법으로 형질 전환 후 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 트랜스포존 유전자의 사이에 1 카피의 PgapA-Pst 유전자가 삽입된 균주를 얻었다. 해당 유전자가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 7과 서열번호 8의 프라이머를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였다.
이렇게 수득된 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869::PgapA-Pst 로 명명하였다.
실시예 4 : 알칼리진스 페칼리스 ( Alcaligenes faecalis ) 유래 유전자가 도입된 코리네박테리움 속 미생물 제작
상기 실시예 1에서 선정한 알칼리진스 페칼리스 유래의 막 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 14으로 기재되는 아미노산 서열을 가진다. 미국 국립보건원 진뱅크 (NIH GenBank)로부터 해당 유전자 및 주변 염기서열에 대한 정보(등록번호 NZ_CP013119.1)를 획득하였다.
확보된 염기서열에 근거하여 알칼리진스 페칼리스 유래 유전자를 코리네박테리움 글루타미쿰 게놈 DNA에 삽입하기 위한 프라이머를 합성하였다. 알칼리진스 페칼리스 유래 유전자를 증폭시키기 위해 알칼리진스 페칼리스 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 16와 서열번호 17의 프라이머를 이용하여 실시예 2와 동일한 방식으로 PCR을 수행하였다.
그 결과 912bp의 배출유전자(서열번호 15)를 포함한 943bp의 유전자 단편을 수득하였다.
서열번호 16 (Afa-1)
TAGAGGAGACACAACATGAAGCAATCTGATAAGGC
서열번호 17 (Afa-2)
gctcttcctgtttAGTTCAGGCAGCGCTTTTTAGT
코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 gapA 프로모터를 확보하기 위하여, 코리네박테리움 글루타미쿰 게놈 DNA를 주형으로 하여 서열번호 5와 서열번호 18의 프라이머를 이용하여 실시예 2와 동일한 방식으로 PCR을 수행하였다.
서열번호 18 (PgapA(-Afa)-2)
ATCAGATTGCTTCATGTTGTGTCTCCTCTAAAGATTGTA
증폭된 gapA 프로모터 부위와 알칼리진스 페칼리스 유래 유전자 단편, 그리고 ScaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pDZTn는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDZTn-PgapA-Afa로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.
제작된 pDZTn-PgapA-Afa 벡터를 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 균주에 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 트랜스포존 유전자의 사이에 1 카피의 PgapA-Afa 유전자가 삽입된 균주를 얻었다. 해당 유전자가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 7과 서열번호 8의 프라이머를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였다.
이렇게 수득한 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869::PgapA-Afa 로 명명하였다.
실시예 5 : 쿠프리아비더스 네카토르 ( Cupriavidus necator ) 유래 유전자가 도입된 코리네박테리움 속 미생물 제작
상기 실시예 1에서 선정한 쿠프리아비더스 네카토르 유래의 막 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 19로 기재되는 아미노산 서열을 가진다. 미국 국립보건원 진뱅크 (NIH GenBank)로부터 해당 유전자 및 주변 염기서열에 대한 정보(등록번호 AM260480.1)를 획득하였다.
확보된 염기서열에 근거하여 쿠프리아비더스 네카토르 유래 유전자를 코리네박테리움 글루타미쿰 게놈 DNA에 삽입하기 위한 프라이머를 합성하였다. 쿠프리아비더스 네카토르 유래 유전자를 증폭시키기 위해 쿠프리아비더스 네카토르 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 21과 서열번호 22의 프라이머를 이용하여 실시예 2와 동일한 방식으로 PCR을 수행하였다.
그 결과 945bp의 쿠프리아비더스 네카토르 유래 유전자(서열번호 20)를 포함한 977bp의 유전자 단편을 수득하였다.
서열번호 21 (Cne-1)
TAGAGGAGACACAACATGCAAAGCAAGAGCAAAGC
서열번호 22 (Cne-2)
ggctcttcctgtttAGTTCACGGTTCCTGGACACG
코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 gapA 프로모터를 확보하기 위하여, 코리네박테리움 글루타미쿰 게놈 DNA를 주형으로 하여 서열번호 5와 서열번호 23의 프라이머를 이용하여 실시예 2와 동일한 방식으로 PCR을 수행하였다.
서열번호 23 (PgapA(-Cne)-2)
GCTCTTGCTTTGCATGTTGTGTCTCCTCTAAAGATTGTA
증폭된 gapA 프로모터 부위와 쿠프리아비더스 네카토르 유래 유전자 단편, 그리고 ScaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pDZTn는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDZTn-PgapA-Cne로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.
제작된 pDZTn-PgapA-Cne 벡터를 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 균주에 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 트랜스포존 유전자의 사이에 1 카피의 PgapA-Cne 유전자가 삽입된 균주를 얻었다. 해당 유전자가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 7과 서열번호 8의 프라이머를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였다.
이렇게 수득된 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869::PgapA-Cne 로 명명하였다.
실시예 6 : 대장균 ( Escherichia coli str. K-12 substr.MG1655 ) 유래 유전자가 도입된 코리네박테리움 속 미생물 제작
상기 실시예 1에서 선정한 대장균 유래의 막 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 24로 기재되는 아미노산 서열을 가진다. 미국 국립보건원 진뱅크 (NIH GenBank)로부터 상기 유전자 및 주변 염기서열에 대한 정보(등록번호 NC_000913.3)를 획득하였다.
확보된 염기서열에 근거하여 대장균 유래 유전자를 코리네박테리움 글루타미쿰 게놈 DNA에 삽입하기 위한 프라이머를 합성하였다. 대장균 유래 유전자를 증폭시키기 위해 대장균 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 26와 서열번호 27의 프라이머를 이용하여 실시예 2와 동일한 방식으로 PCR을 수행하였다.
그 결과 882 bp의 배출유전자(서열번호 25)를 포함한 913 bp의 유전자 단편을 수득하였다.
서열번호 26 (Eco-1)
TAGAGGAGACACAACATGACACGACAAAAAGCAAC
서열번호 27 (Eco-2)
gctcttcctgtttAGTTTAACCACGACGTGTCGCC
코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 gapA 프로모터를 확보하기 위하여, 코리네박테리움 글루타미쿰 게놈 DNA를 주형으로 하여 서열번호 5와 서열번호 28의 프라이머를 이용하여 실시예 2와 동일한 방식으로 PCR을 수행하였다.
서열번호 28 (PgapA(-Eco)-2)
TTTTTGTCGTGTCATGTTGTGTCTCCTCTAAAGATTG
증폭된 gapA 프로모터 부위와 대장균 유래 유전자 단편, 그리고 ScaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pDZTn는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDZTn-PgapA-Eco 로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.
제작된 pDZTn-PgapA-Eco 벡터를 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 균주에 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 트랜스포존 유전자의 사이에 1 카피의 PgapA-Eco 유전자가 삽입된 균주를 얻었다. 해당 유전자가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 7과 서열번호 8의 프라이머를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였다.
이렇게 수득된 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869::PgapA-Eco 로 명명하였다.
실시예 7 : 다양한 미생물 유래 유전자가 도입된 코리네박테리움 속 미생물 균주들의 MIC 측정
상기 실시예 2 ~ 6 에서 제작된 5종의 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 ATCC13869::PgapA-Hrh, ATCC13869::PgapA-Pst, ATCC13869::PgapA-Afa, ATCC13869::PgapA-Cne, ATCC13869::PgapA-Eco 의 트립토판 배출능 활성의 보유여부 확인을 위해 트립토판 유사체(analogue)와 또 다른 방향족 아미노산인 페닐알라닌의 유사체를 이용한 최소저지농도 (minimum inhibitory concentration, MIC) 실험을 수행하였다. 5종의 막 단백질을 코딩하는 유전자가 도입된 균주들을 최소 액체 배지에 30℃에서 24시간 동안 배양한 후, 3 X 103과 3 X 104 개의 세포로 희석하여 트립토판 유사체 또는 페닐알라닌 유사체가 첨가된 최소 고체 배지에서 스포팅 (spotting) 배양하였다.
최소저지농도 실험을 위해 2.5 mg/ml의 파라-플로로 페닐알라닌 (ρ'-fluoro-DL- phenylalanine) 또는 0.25 ug/ml 의 5'-플로로 트립토판 (5-fluoro-DL-trytophan)을 최소 고체 배지에 첨가하였고, 60시간 후 세포의 성장을 관찰하였다 (표 2).
선별된 5종의 유전자의 도입은 2.5 mg/ml 농도의 페닐알라닌 유사체가 첨가된 조건에서 모두 성장을 가능하게 했다. 그 중 허바스필리움 리조스페레, 알칼리진스 페칼리스, 대장균 유래 유전자의 도입이 가장 좋은 성장성을 보였다. 수도모나스 스툿제리 유래 유전자의 도입은 앞선 3종의 균주들에 비해 다소 감소된 성장성을 보였으며, 쿠프리아비더스 네카토르 유래 유전자의 도입이 가장 낮은 성장을 보였다. 같은 조건에서 야생주 ATCC13869 는 성장하지 못하였다. 또한 0.25 ug/ml농도의 트립토판 유사체가 첨가된 조건에서는 유일하게 허바스필리움 리조스페레 유래 유전자의 도입이 성장을 가능하게 했다.
상기 결과로부터 선별된 5종의 유전자의 도입은 활성의 차이는 있지만 모두 페닐알라닌 및 이의 유사체에는 내성을 보이는 반면, 트립토판 및 트립토판 유사체에는 유일하게 허바스필리움 리조스페레 유래 유전자가 특이적이면서도 월등한 내성을 보이는 것으로 판단된다. 이로부터 허바스필리움 리조스페레 유래 유전자로 코딩되는 막 단백질만이 트립토판에 대한 배출 단백질로 작용할 수 있는 것으로 해석된다.
최소배지 (pH 7.2)
포도당 10g, KH2PO4 1 g, K2HPO4 2 g, MgSO4 7H2O 0.4 g, 요소 2 g, (NH4)2SO4 5 g, NaCl 0.5 g, 니코틴아미드 5 ㎍, 칼슘-판토텐산 0.1 ㎍, 바이오틴 0.2 ㎍, 티아민 HCl 3 ㎍, Trace elements solution 1ml (증류수 1 리터 기준)
Trace elements solution
Na2B4O7 10H2O 0.09 g, (NH4)6Mo7O27 4H2O 0.04 g, ZnSO4 7H2O 0.01 g, CuSO4 5H2O 0.27 g, MnCl2 4H2O 0.01 g, FeCl3 6H2O 1 g, CaCl2 0.01 g (증류수 1 리터 기준)
페닐알라닌 또는 트립토판 유사체가 포함된 최소배지에서 다양한 미생물 유래 유전자가 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주들의 성장
균 주 성 장
파라-플로로 페닐알라닌(2.5 mg/ml) 5'-플로로 트립토판(0.25 ug/ml)
ATCC13869 - -
ATCC13869 :: PgapA-Hrh ++ +++
ATCC13869 :: PgapA-Pst ++ -
ATCC13869 :: PgapA-Afa +++ -
ATCC13869 :: PgapA-Cne + -
ATCC13869 :: PgapA-Eco +++ -
실시예 8 : 다양한 미생물 유래 유전자가 도입된 대장균용 발현 벡터 제작
대장균 균주에서도 상기 실시예 1에서 선별된 다양한 미생물 유래 유전자들의 트립토판 또는 이의 아날로그 내성 확인을 위해, 각각의 유전자는 대장균 발현 벡터인 pCL1920 에 클로닝 되었으며, 대장균 균주 W3110 의 yccA 프로모터로 발현되었다.
허바스필리움 리조스페레 유래의 유전자 단편을 확보하기 위하여 허바스필리움 리조스페레 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 29와 서열번호 30를 이용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 Solg TM Pfu-X DNA 폴리머라제 (SolGent co.)를 사용하였으며, PCR증폭 조건은 95 ℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 20초 변성, 62℃ 40초 어닐링, 72℃ 1분 중합을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
서열번호 29 (Hrh-3)
ATAGAGAGTGACTCAATGAATAGCAAGAAGGCCAC
서열번호 30 (Hrh-4)
TCGAGCTCGGTACCCCTACAAACAGTCCGCCAC
대장균 W3110 유래의 yccA 프로모터를 확보하기 위하여, 대장균 W3110 게놈 DNA를 주형으로 하여 서열번호 31와 서열번호 32을 이용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 Solg TM Pfu-X DNA 폴리머라제 (SolGent co.)를 사용하였으며, PCR증폭 조건은 95 ℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 20초 변성, 62℃ 40초 어닐링, 72℃ 10초 중합을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
서열번호 31 (PyccA - 1)
CTCTAGAGGATCCCCTTCCAGATCAAATGCGTAA
서열번호 32 (PyccA(-Hrh)-2)
CTTCTTGCTATTCATTGAGTCACTCTCTATGACAG
증폭된 yccA 프로모터 부위와 허바스필리움 리조스페레 유래 유전자 단편, 그리고 SmaI 제한효소로 절단된 pCL1920 vector(pSC101 ori, Spr)는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pCL1920-PyccA-Hrh로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존됨으로써 수행되었다. 수득한 pCL1920-PyccA-Hrh를 야생형 대장균 W3110에 도입하여 상기 유전자가 발현되는 형질전환체인 W3110/ pCL1920-PyccA-Hrh를 제작하였다.
수도모나스 스툿제리 균주 유래 유전자 단편을 확보하기 위하여 수도모나스 스툿제리 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 33과 서열번호 34를 이용하여 PCR을 수행하였다. 또한, 사용하는 대장균 W3110 유래의 yccA 프로모터를 확보하기 위해 사용한 프라이머 서열번호 35을 이용한 것 이외에 모든 수행방법은 상기 허바스필리움 리조스페레 균주의 유전자 단편 확보에서 사용한 것과 동일하였다.
서열번호 33 (Pst-3)
ATAGAGAGTGACTCAATGAAAAACCAGCGTAAAGC
서열번호 34 (Pst-4)
TCGAGCTCGGTACCCTTATCCGTTTCGACGCGG
서열번호 35 (PyccA(-Pst)-2)
ACGCTGGTTTTTCATTGAGTCACTCTCTATGACAG
이렇게 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pCL1920-PyccA-Pst로 명명하였고, 상기 발현벡터 pCL1920-PyccA-Pst를 야생형 대장균 W3110에 도입하여 상기 유전자가 발현되는 형질전환체인 W3110/ pCL1920-PyccA-Pst를 제작하였다.
알칼리진스 페칼리스 균주 유래 유전자가 발현되는 형질전환체를 제작하는 과정은 상기의 과정과 동일하며, 단편을 확보하기 위한 알칼리진스 페칼리스 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 36와 서열번호 37와 yccA 프로모터를 확보하기 위한 프라이머 서열번호 38의 사용만 상이하였다.
서열번호 36 (Afa-3)
ATAGAGAGTGACTCAATGAAGCAATCTGATAAGGC
서열번호 37 (Afa-4)
TCGAGCTCGGTACCCTCAGGCAGCGCTTTTTAGT
서열번호 38 (PyccA(-Afa)-2)
ATCAGATTGCTTCATTGAGTCACTCTCTATGACAG
이렇게 알칼리진스 페칼리스 유래 유전자가 클로닝된 재조합 플라스미드를 획득하여 pCL1920-PyccA-Afa로 명명하였고, 상기 발현벡터 pCL1920-PyccA-Afa를 야생형 대장균 W3110에 도입한 형질전환체인 W3110/ pCL1920-PyccA-Afa 를 제작하였다.
쿠프리아비더스 네카토르 균주 유래 유전자 단편을 확보하기 위하여 쿠프리아비더스 네카토르 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 39와 서열번호 40을 이용하여 PCR을 수행하였다. 또한, 사용하는 대장균 W3110 유래의 yccA 프로모터를 확보하기 위해 사용한 프라이머 서열번호 41을 이용한 것 이외에 모든 수행방법은 상기 허바스필리움 리조스페레 균주의 유전자 단편 확보에서 사용한 것과 동일하였다.
서열번호 39 (Cne-3)
ATAGAGAGTGACTCAATGCAAAGCAAGAGCAAAGC
서열번호 40 (Cne-4)
TCGAGCTCGGTACCCTCACGGTTCCTGGACACG
서열번호 41 (PyccA(-Cne)-2)
GCTCTTGCTTTGCATTGAGTCACTCTCTATGACAG
이렇게 재조합 플라스미드를 획득하여 pCL1920-PyccA-Cne 로 명명하였고, 상기 발현벡터 pCL1920-PyccA-Cne 를 야생형 대장균 W3110에 도입하여 상기 유전자가 발현되는 형질전환체인 W3110/ pCL1920-PyccA-Cne를 제작하였다.
대장균 균주의 유전자 단편을 확보하기 위하여 Escherichia coli str. K-12 substr.MG1655 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 42와 서열번호 43를 이용하여 PCR을 수행하였다. 또한, 사용하는 대장균 W3110 유래의 yccA 프로모터를 확보하기 위해 사용한 프라이머 서열번호 44을 이용한 것 이외에 모든 수행방법은 상기 허바스필리움 리조스페레 균주의 유전자 단편 확보에서 사용한 것과 동일하였다.
서열번호 42 (Eco-3)
ATAGAGAGTGACTCAATGACACGACAAAAAGCAAC
서열번호 43 (Eco-4)
TCGAGCTCGGTACCCTTAACCACGACGTGTCGCC
서열번호 44 (PyccA(-Eco)-2)
TTTTTGTCGTGTCATTGAGTCACTCTCTATGACAG
이렇게 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pCL1920-PyccA-Eco 로 명명하였고, 상기 발현벡터 pCL1920-PyccA-Eco 를 야생형 대장균 W3110에 도입하여 상기 유전자가 발현되는 형질전환체인 W3110/ pCL1920-PyccA-Eco 를 제작하였다.
실시예 9 : 다양한 미생물 유래의 막 단백질 유전자가 과발현된 대장균의 MIC 측정
상기 실시예 8 에서 제작된 5종의 유전자가 과발현된 대장균 균주 W3110/ pCL1920-PyccA-Hrh, W3110/ pCL1920-PyccA-Pst, W3110/ pCL1920-PyccA-Afa, W3110/ pCL1920-PyccA-Cne, W3110/ pCL1920-PyccA-Eco 의 내성 확인을 위해 트립토판과 페닐알라닌 유사체 (analogue)를 이용한 최소저지농도 (minimum inhibitory concentration, MIC) 실험이 수행되었다. 5종의 유전자가 과발현된 대장균 균주들은 50 ug/ml 의 스펙티노마이신 (spectinomycin) 이 첨가된 M9 최소 액체 배지에 37℃에서 15시간 동안 배양된 후, 104과 105 개의 세포로 희석되어 트립토판 유사체 또는 페닐알라닌 유사체가 첨가된 M9 포도당 최소 고체 배지 (50 ug/ml 의 스펙티노마이신 첨가)에서 스포팅 (spotting) 배양되었다. 최소저지농도 실험을 위해 2 mg/ml의 파라-플로로 페닐알라닌 (p'-fluoro-DL-phenylalanine) 또는 0.7 ug/ml의 5'-플로로 트립토판 (5-fluoro-DL-trytophan)을 M9 최소 고체 배지에 첨가하였고, 48시간 후 세포의 성장을 관찰하였다 (표 3).
페닐알라닌 유사체가 첨가된 조건에서 대장균 균주는 코리네글루타미쿰 균주에서와 같이 대장균 유래 유전자가 과발현되었을 때 월등한 성장성을 보이며, 알칼리진스 페칼리스 유래 유전자의 과발현 역시 상당한 성장을 가능하게 하였다. 하지만 허바스필리움 리조스페레, 수도모나스 스툿제리, 쿠프리아비더스 네카토르 유래 유전자가 과발현되었을 때는 대조군인 W3110/ pCL1920 과 함께 성장하지 못했다. 반면, 선별된 5종의 유전자의 과발현은 트립토판 유사체가 첨가된 조건에서 모두 성장을 가능하게 했다. 그 중, 허바스필리움 리조스페레 유래 유전자의 과발현이 가장 뛰어난 성장을 가능하게 했으며, 알칼리진스 페칼리스와 대장균 유래 배출 유전자의 과발현이 다음가는 성장성을 보였다. 수도모나스 스툿제리와 쿠프리아비더스 네카토르 유래 배출 유전자의 과발현은 미미한 성장성을 보였다.
대장균 균주에서 선별된 5종의 유전자 과발현은 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 MIC 실험 결과와 비슷한 양상을 보였다. 허바스필리움 리조스페레 유래 유전자는 코리네글루타미쿰 균주와 대장균 모두에서 트립토판 또는 트립토판 유사체에 특이적이면서도 월등한 내성을 보이며, 대장균 유래 배출 유전자는 트립토판에 비해 페닐알라닌 및 이의 유사체에 보다 높은 배출 내성을 보였다. 이로부터 허바스필리움 리조스페레 유래 유전자가 코리네글루타미쿰 균주와 대장균 모두에서 트립토판에 대하여 특이적이면서도 월등한 배출능을 보이는 것으로 판단되었다.
페닐알라닌 또는 트립토판 유사체가 포함된 최소배지에서 각각 유전자가 과발현된 대장균 균주들의 성장
균 주 성 장
파라-플로로 페닐알라닌(2.5 mg/ml) 5'-플로로 트립토판(0.7 ug/ml)
W3110/pCL1920 - -
W3110/pCL1920-PyccA-Hrh - ++++
W3110/pCL1920-PyccA-Pst - +
W3110/pCL1920-PyccA-Afa ++ ++
W3110/pCL1920-PyccA-Cne - +
W3110/pCL1920-PyccA-Eco +++ ++
참고예 1 : L-트립토판을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 제작
L-트립토판 생산 균주는 야생종 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 로부터 개발하였다. 야생형의 코리네박테리움 글루타미쿰은 L-트립토판을 생산하지 못하거나 생산하더라도 극미량의 L-트립토판을 생산할 뿐이므로, 생산에 필수적인 생합성 경로를 강화한 균주를 모균주로 사용하고자 하였다. 구체적으로, L-트립토판 생합성 유전자의 오페론 (operon)을 프로모터 강화를 통해 발현을 향상시켰다. 또한 TrpE 단백질의 피드백 제한 (feedback inhibition) 해소를 위해 trpE의 38번 아미노산인 세린 (Serine)은 알지닌 (Arginine)으로 치환하였다(JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Nov. 1987, p. 5330-5332).
이러한 유전자 조작을 위해 우선 염색체상 상동재조합 (Homologous recombination)이 발생하는 trpE 프로모터 업스트림 (Upstream) 과 trpE 38번 변이 다운스트림 (Downsteam) 지역을 수득하였다. 구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 45와 서열번호 46의 프라이머를 이용하여 trpE 프로모터 업스트림 (Upstream) 지역을, 서열번호 47와 서열번호 48의 프라이머를 이용하여 trpE 38번 변이 다운스트림 (Downsteam) 지역의 유전자 단편을 PCR을 수행을 통해 수득하였다.
서열번호 45 (Pspl7-trpE(S38R)_L-1)
TCGAGCTCGGTACCCAAACAACTGCGACGTGTGTC
서열번호 46 (Pspl7-trpE(S38R)_L-2)
CATGAAGCGCCGGTACCTTAATCATTTTTGGGTTC
서열번호 47 (Pspl7-trpE(S38R)_R-1)
GCCCTGTTGGAACGCGCTGATATCACCACCAAGAA
서열번호 48 (Pspl7-trpE(S38R)_R-2)
CTCTAGAGGATCCCCAGATGTCACCGTTGTAAATG
중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
합성 제작한 프로모터 SPL7(서열번호 49)을 주형으로 서열번호 50과 서열번호 51 의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 50 (Pspl7 - 1)
CCCAAAAATGATTAAGGTACCGGCGCTTCATGTCA
서열번호 51 (Pspl7 - 2)
GGGATTCGTGCTCATGATATCTGTTTTGATCTCCTCC
중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제 (SolGent co.)를 사용하였으며, PCR증폭 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 trpE 1번 아미노산 내지 38번 변이 아미노산을 포함하는 앞 부분 단편을 확보하기 위하여, 코리네박테리움 글루타미쿰 게놈 DNA를 주형으로 하여 서열번호 52와 서열번호 53의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 52 (trpE (S38R) - 1)
ATCAAAACAGATATCATGAGCACGAATCCCCATGT
서열번호 53 (trpE (S38R) - 2)
GTGGTGATATCAGCGCGTTCCAACAGGGCTGCATC
중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR증폭 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
증폭된 trpE 프로모터 업스트림과 trpE 38번 변이 다운스트림 지역, SPL7 프로모터와 trpE의 앞 부분 단편, 그리고 SmaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pDZ는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDZ-PSPL7-trpE (S38R)로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.
제작된 pDZ-PSPL7-trpE (S38R) 벡터를 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 균주에 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 trpE의 프로모터를 보다 강한 프로모터인 SPL7 프로모터로 교체하고, TrpE의 38번 아미노산이 세린에서 알지닌으로 교체된 균주를 얻었다. 유전자가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역을 증폭할 수 있는 서열번호 54과 서열번호 55를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였으며, 이를 CA04-8325 로 명명하였다.
서열번호 54 (Confirm_Pspl7-trpE(S38R) - 1)
GAAGAAGAGGCTGCAGATG
서열번호 55 (Confirm_Pspl7-trpE(S38R) - 2)
GATCAGCGCCATCATGTT
트립토판 생산은 방향족 아미노산 대사회로로부터 기인하며, 이 대사회로는 포스포엔올피루베이트 (Phosphoenolpyruvate)와 에리스로즈 4-포스페이트 (Erythrose 4-phosphate)의 축합반응으로 시작된다. 따라서 두 가지 전구체의 원활한 공급은 트립토판 생산 향상에 필수적이며 상대적으로 부족하다고 알려진 에리스로즈 4-포스페이트의 원활한 공급을 위해 tkt 유전자의 과발현을 진행하였다.
이러한 유전자 조작을 위해 코리네박테리움 글루타미쿰 염색체 DNA를 주형으로 하여 프라이머 서열번호 56과 서열번호 57을 이용하여 tkt 유전자를 추가 삽입할 업스트림 (Upstream) 지역을, 서열번호 58과 서열번호 59를 이용하여 tkt 유전자를 추가 삽입할 다운스트림 (Downsteam) 지역의 유전자 단편을 PCR을 수행을 통해 수득하였다.
서열번호 56 (Pn-tkt_L - 1 )
TCGAGCTCGGTACCCAAACTTTGAGTGGGTGCGTG
서열번호 57 (Pn-tkt_L - 2 )
TCGAGCTACGAGGGCGGTTCCCAGCCCTTCATTAG
서열번호 58 (Pn-tkt_R - 1)
ATTAACGGTTAATTGATTCTGGACGTCATGACTAC
서열번호 59 (Pn-tkt_R - 2)
CTCTAGAGGATCCCCGCCTCGATGATGCAGTCGTC
중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95 ℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 20초 변성, 62℃ 40초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
tkt 유전자와 프로모터를 확보하기 위하여, 야생종의 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 60과 서열번호 61을 이용하여 tkt 프로모터를 포함하는 tkt 유전자 단편을 PCR을 수행을 통해 수득하였다.
서열번호 60 (Pn-tkt - 1)
GAAGGGCTGGGAACCGCCCTCGTAGCTCGAGAGTT
서열번호 61 (Pn-tkt - 2)
CATGACGTCCAGAATCAATTAACCGTTAATGGAGTCC
중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR증폭 조건은 95 ℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 20초 변성, 62℃ 40초 어닐링, 72℃ 1분 20초 중합을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
증폭된 tkt 유전자를 추가 삽입할 업스트림과 tkt 유전자를 추가 삽입할 다운스트림 지역, tkt 프로모터를 포함하는 tkt 유전자, 그리고 SmaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pDZ는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDZ-Pn-tkt 로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.
제작된 pDZ-Pn-tkt 벡터를 CA04-8325 균주에 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에 tkt 프로모터를 포함하는 tkt 유전자가 삽입된 균주를 얻었다. 해당 유전자가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 프라이머 서열번호 62과 서열번호 63을 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였으며, 이를 CA04-8352 로 명명하였다. 상기 균주 CA04-8352는 2018년 2월 2일자로 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 국제기탁하여 KCCM12218P로 기탁번호를 부여 받았다.
서열번호 62 (Confirm_Pn-tkt - 1)
ACCCAGAACCCCAAATTTTC
서열번호 63 (Confirm_Pn-tkt - 2)
TTGAGTTCGACAACTTTGG
실시예 10 : 허바스필리움 리조스페레와 대장균 유래 유전자가 도입된 코리네박테리움속 미생물의 트립토판 생산
상기 실시예 7 에서 트립토판 유사체(analogue) 최소저지농도에서 뛰어난 활성을 보인 허바스필리움 리조스페레 유래 유전자는 참고예 1에서 제작된 트립토판 생산 균주인 CA04-8352 에 도입되었다. 이를 위해 상기 실시예 2 에서 제작된 허바스필리움 리조스페레 유래 유전자 도입용 벡터 pDZTn-PgapA-Hrh를 트립토판 생산 균주인 CA04-8352 균주에 전기천공법으로 형질전환 하였고, 상기 실시예 2 와 같은 과정을 거쳐 트랜스포존 유전자의 사이에 1 카피의 허바스필리움 리조스페레 유래 유전자가 삽입된 균주를 얻었다. 이를 CA04-8405라 명명하였다.
또한 대장균 유래 유전자는 대조군으로써 트립토판 생산 균주 CA04-8352에 도입되었다. 상기 실시예 6 에서 제작된 대장균 유래 유전자 도입용 벡터 pDZTn-PgapA-Eco 를 트립토판 생산 균주인 CA04-8352 균주에 전기천공법으로 형질전환 하였고, 상기 실시예 6과 같은 과정을 거쳐 트랜스포존 유전자의 사이에 1 카피의 대장균 유래 배출 유전자가 삽입된 균주를 얻었다. 이를 CA04-8406라 명명하였다.
상기 과정을 통해 제작된 CA04-8405 와 CA04-8406은 참고예 1에서 제작된 CA04-8352를 대조군으로써 트립토판 생산량을 확인하고자 아래와 같은 방법으로 배양하였다. 종 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30 ℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종 배양액을 접종하고 30 ℃에서 24시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC에 의해 L-트립토판의 생산량을 측정하였다.
종배지 (pH 7.0)
포도당 20g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
생산배지 (pH 7.0)
포도당 30g, (NH4)2SO4 15 g, MgSO4 7H2O 1.2 g, KH2PO4 1 g, 효모추출물 5 g, 바이오틴 900 ㎍, 티아민 염산염 4500 ㎍, 칼슘-판토텐산 4500 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준).
코리네박테리움 글루타미쿰 L-트립토판 생산균주(CA04-8352)와 허바스필리움 리조스페레 유래 유전자가 삽입된 생산균주(CA04-8405), 대장균 유래 유전자가 삽입된 생산균주(CA04-8406) 의 L-트립토판 생산량 확인
　 OD562 트립토판 생산량 (g/L) 트립토판 수율 (g/g glc, %)
CA04-8352 56.5 0.25 0.83
CA04-8405 52.3 1.52 5.07
CA04-8406 56.1 0.24 0.80
CA04-8352, CA04-8405, CA04-8406에 대한 배지 중의 L-트립토판 생산에 대한 결과는 상기 표 4와 같다. 허바스필리움 리조스페레 유래 유전자가 도입된 CA04-8405 균주는 플라스크 배양에서 최종 1.52 g/L 의 L-트립토판을 생산하였고, 이는 대조군인 CA04-8352 균주에 비해 약 5배 향상된 수치이다. 이는 허바스필리움 리조스페레 유래 유전자가 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에서 L-트립토판 생산을 상당히 향상시킴을 의미한다. 반면 대장균 유래 유전자가 도입된 CA04-8406 균주의 트립토판 생산량은 0.23 g/L로 모균주인 CA04-8352 균주의 트립토판 생산량과 거의 동일했다. 상기 실시예 7과 9에서 확인한 트립토판과 페닐알라닌의 유사체(analogue) 최소저지농도 실험에서 확인된 것과 같이 대장균 유래 유전자는 트립토판보다 페닐알라닌에 특이성을 보이는 배출 유전자라 판단된다.상기 균주, CA04-8405는 2017년 8월 21일자로 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 국제기탁하여 KCCM12099P(CA04-8405)로 기탁번호를 부여받았다.
실시예 11 : 허바스필리움 리조스페레 유래 유전자가 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰에서의 세포내 트립토판 대사체 분석
허바스필리움 리조스페레 유래 유전자가 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 트립토판 생산 균주 CA04-8405 에서 트립토판 배출능이 향상됨에 따라 세포 내 트립토판 농도가 감소하였는지를 명확하게 확인하기 위해, CA04-8405와 모균주 CA04-8352 를 대상으로 유기용매를 이용한 추출방법으로 세포 내 트립토판 농도를 측정하였다.
세포 내 대사물질(intracellular metabolite) 분석방법은 문헌(Nakamura J et al., Appl. Environ. Microbiol. 73(14): 4491-4498, 2007)에 기재된 방법에 따라 수행하였다.
먼저, 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 CA04-8352와 CA04-8405는 종 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 200 rpm 으로 진탕 배양하였다. 세포내 트립토판 농도는 당소모량에 따라 총 3단계에서 확인되었으며, 각 단계의 배양세포들은 급속 진공 여과(rapid vacuum filtration, Durapore HV, 0.45 m; Millipore, Billerica, MA)를 통해 배양액으로부터 세포를 분리하였다. 세포가 흡착된 필터를 10 ml의 정제수로 2회 세척한 후, 5 uM 모르폴린 에탄설폰산(morpholine ethanesulfonic acid) 및 5 uM 메티오닌 설폰(methionine sulfone)을 함유한 메탄올에 10분간 담가두었다. 이로부터 얻은 1.6 ml의 세포 추출물에 1.6 ml의 클로로포름과 0.64 ul의 정제수를 잘 혼합한 후, 수층(aqueous phase)만을 스핀 칼럼(spin column)에 적용하여 단백질 오염물을 제거하였다. 여과된 추출액을 모세관 전기영동 질량분석기(capillary electrophoresis mass spectrometry)를 사용하여 분석하고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1 에서와 같이, CA04-8405는 모균주 CA04-8352 와 비교해 세포 내 트립토판의 농도가 33 ~41 % 수준으로 감소된 것을 확인하였다. 이는 허바스필리움 리조스페레 유래 유전자의 발현으로 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 세포 내에서 생성된 트립토판이 세포 외로 원활히 배출됨에 따라 CA04-8405 균주의 세포 내 트립토판 농도가 감소된 것으로 판단된다. 이로부터 허바스필리움 리조스페레 유래 유전자는 트립토판에 특이적인 배출능을 가지는 막 단백질을 코딩하는 유전자임을 확인할 수 있다.
참고예 2 : L-트립토판을 생산하는 에스케리키아 속 미생물 제작
에스케리키아속 L-트립토판 생산 균주는 야생형의 대장균 W3110 으로부터 개발되었다. L-트립토판 배출 활성을 갖는 단백질이 발현되도록 변형됨에 따라 L-트립토판의 생산량이 획기적으로 증가하는지 확인하기 위하여, L-트립토판을 생산하도록 제작된 균주를 모균주로 이용하였다. 구체적으로, 코리스메이트 (Chorismate)로부터 L-트립토판 생산에 관여하는 L-트립토판 생합성 유전자들의 (trpEDCBA) 발현은 TrpR에 의해 억제된다. 이에 따라 이를 암호화하는 trpR 유전자를 제거하였다. 또한 L-트립토판 생산 향상에 따른 TrpE 폴리펩티드의 피드백 제한 (feedback inhibition) 해소를 위해 TrpE 의 N-말단으로부터 21번 아미노산인 프롤린(Proline)을 세린(Serine)으로 치환하였다 (J. Biochem. Mol. Biol. 32, 20-24 (1999)).
Mtr 막단백질은 세포 외부의 L-트립토판을 세포 내로 유입하는데 역할을 하며, TnaA 단백질은 세포 내의 L-트립토판과 물분자를 인돌 (Indole), 피루브산 (pyruvate), 암모니아 (NH3) 로 분해하는 역할을 한다. 따라서 L-트립토판 생산을 저해하고 분해하는 mtr 와 tnaA 유전자를 제거하였다.
이러한 유전자 제거를 위해 람다 레드 재조합 (λ-red recombination, One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K- 12 using PCR products, Datsenko KA, Wanner BL., Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Jun6;97(12):6640-5) 방법을 이용하였다. mtr 유전자 제거를 위해 pKD4 벡터를 주형으로 하고 서열번호 64과 서열번호 65의 프라이머를 이용하여 FRT-kanamycin-FRT cassette와 염색체상 상동재조합이 발생하는 mtr 유전자 양 옆의 상동한 50 bp의 염기쌍이 결합된 유전자 단편을 (1580 bp) PCR 수행을 통해 수득하였다. pKD4 벡터의 카나마이신 항생제 마커는 타켓 유전자의 제거 및 항생제 유전자 삽입 확인을 위해 사용하였고, FRT 지역은 목표 유전자가 제거된 후 항생제 마커를 제거해 주는 역할을 한다.
중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95 ℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 20초 변성, 62℃ 40초 어닐링, 72℃ 1분 중합을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
서열번호 64 (Δmtr cassette - 1)
TGCAATGCATAACAACGCAGTCGCACTATTTTTCACTGGAGAGAAGCCCTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
서열번호 65 (Δmtr cassette - 2)
TGCAATGCATAACAACGCAGTCGCACTATTTTTCACTGGAGAGAAGCCCTGTCCATATGAATATCCTCCT
람다 레드 리콤비네이즈 (gam, bet, exo)를 발현하는 pKD46 벡터를 대장균 W3110 균주에 전기천공법으로 형질전환 하였고, 50 mg/L 의 카나마이신이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. pKD46 벡터의 형질전환이 확인된 대장균 W3110 균주는 30℃ 에서 OD600이 약 0.1 이 되었을 때 10mM의 L-아라비노즈 (L-arabinose) 첨가를 통해 재조합 효소 발현을 유도하였으며, OD600이 약 0.6 이 되었을 때 컴피턴트 세포로 준비된 후 상기 과정에서 수득된 FRT-kanamycin-FRT cassette 과 mtr 유전자 양 옆의 상동한 50 bp의 염기쌍이 결합된 선형 유전자 단편을 전기 천공법을 통해 형질전환하였다. 25 mg/L의 카나마이신이 포함된 LB 고체배지에서 자란 콜로니는 서열번호 66와 서열번호 67을 이용하여 콜로니 PCR을 진행하였고, 782 bp 의 유전자 단편이 제작되는 콜로니를 선택하였다.
서열번호 66 (Confirm_Cassette - 1)
GGGCAGGATCTCCTGTCATC
서열번호 67 (Confirm_Δmtr - 2)
AAATGTCGGATAAGGCACCG
상동재조합이 발생하여 mtr 유전자가 제거된 균주는 카나마이신 항생제 마커 제거를 위해 컨피턴트 세포로 준비된 후 pCP20 벡터로 전기천공법으로 형질전환하였다. pCP20 벡터는 FLP 단백질을 발현하여 카나마이신 항생제 양 옆 FRT 지역을 인식하고 염색체 상 결합됨으로써, FRT 지역 사이의 항생제 마커를 제거한다. 100 mg/L의 엠피실린 (Ampicillin)과 25 mg/L의 클로람페니콜 (Chloramphenicol)이 포함된 LB 고체배지에서 성장한 pCP20 벡터 형질전환 균주를 30 ℃ LB 액체배지에서 1시간 배양 후 42℃ 에서 15시간 추가 배양하였고 LB 고체배지에 도말하였다. 자란 콜로니는 100 mg/L의 엠피실린 (Ampicillin)과 25 mg/L의 클로람페니콜 (Chloramphenicol)이 포함된 LB 고체배지, 12.5 mg/L의 카나마이신이 포함된 LB 고체배지, 항생제가 포함되지 않은 LB 고체배지에 배양하였으며, 항생제가 포함되지 않은 LB 고체배지에서만 자란 콜로니를 선택하였다. 게놈 시퀀싱을 통해 mtr 유전자 제거를 최종 확인하였으며, 이를 CA04-9300으로 명명하였다.
tnaA 유전자 제거를 위해 상기와 같은 방법으로 유전자 조작을 수행하였다. pKD4 벡터를 주형으로 하고 서열번호 68과 서열번호 69를 이용하여 FRT-kanamycin-FRT cassette 과 염색체상 상동재조합이 발생하는 tnaA 유전자 양 옆의 상동한 50 bp의 염기쌍이 결합된 유전자 단편을 (1580 bp) PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR증폭 조건은 95 ℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 20초 변성, 62℃ 40초 어닐링, 72℃ 1분 중합을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
서열번호 68 (ΔtnaA cassette - 1)
TGTAATATTCACAGGGATCACTGTAATTAAAATAAATGAAGGATTATGTAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
서열번호 69 (ΔtnaA cassette - 2)
TGTAGGGTAAGAGAGTGGCTAACATCCTTATAGCCACTCTGTAGTATTAAGTCCATATGAATATCCTCCT
pKD46 벡터의 형질전환을 확인하였고, 10mM의 L-아라비노즈 첨가를 통해 재조합 효소들이 발현된 CA04-9300 균주는 전기천공법을 통해 상기 과정에서 수득된 FRT-kanamycin-FRT cassette와 tnaA 유전자 양 옆의 상동한 50 bp의 염기쌍이 결합된 선형 유전자 단편을 형질전환하였다. 25 mg/L의 카나마이신이 포함된 LB 고체배지에서 자란 콜로니는 서열번호 66과 서열번호 70을 이용하여 콜로니 PCR을 진행하였고, 787 bp 의 유전자 단편이 제작되는 콜로니를 선택하였다.
서열번호 70 (Confirm_ΔtnaA - 2)
ACATCCTTATAGCCACTCTG
상동재조합이 발생하여 tnaA 유전자가 제거된 균주는 카나마이신 항생제 마커 제거를 위해 컨피턴트 세포로 준비된 후 pCP20 벡터를 형질전환 하였고, FLP 단백질 발현으로 카나마이신 항상제 마커가 제거된 균주를 제작하였다. 게놈 시퀀싱을 통해 tnaA 유전자 제거를 최종 확인하였으며, 이를 CA04-9301으로 명명하였다.
trpR 유전자 제거를 위해 pKD4 벡터를 주형으로 하고 서열번호 71과 서열번호 72의 프라이머를 이용하여 FRT-kanamycin-FRT cassette와 염색체상 상동재조합이 발생하는 trpR 유전자 양 옆의 상동한 50 bp의 염기쌍이 결합된 유전자 단편을 (1580 bp) PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR증폭 조건은 95 ℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 20초 변성, 62℃ 40초 어닐링, 72℃ 1분 중합을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
서열번호 71 (ΔtrpR cassette - 1)
TACAACCGGGGGAGGCATTTTGCTTCCCCCGCTAACAATGGCGACATATTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
서열번호 72 (ΔtrpR cassette - 2)
GCATTCGGTGCACGATGCCTGATGCGCCACGTCTTATCAGGCCTACAAAAGTCCATATGAATATCCTCCT
pKD46 벡터의 형질전환을 확인하였고, 10mM의 L-아라비노즈 첨가를 통해 재조합 효소들이 발현된 CA04-9301 균주는 전기천공법을 통해 상기 과정에서 수득된 FRT-kanamycin-FRT cassette와 trpR 유전자 양 옆의 상동한 50 bp의 염기쌍이 결합된 선형 유전자 단편을 형질전환하였다. 25 mg/L의 카나마이신이 포함된 LB 고체배지에서 자란 콜로니는 서열번호 66과 서열번호 73의 프라이머를 이용하여 콜로니 PCR을 진행하였고, 838 bp 의 유전자 단편이 제작되는 콜로니를 선택하였다.
서열번호 73 (Confirm_ΔtrpR - 2)
AGGACGGATAAGGCGTTCAC
상동재조합이 발생하여 trpR 유전자가 제거된 균주는 카나마이신 항생제 마커 제거를 위해 컨피턴트 세포로 준비된 후 pCP20 벡터를 형질전환 하였고, FLP 단백질 발현으로 카나마이신 항상제 마커가 제거된 균주를 제작하였다. 게놈 시퀀싱을 통해 trpR 유전자 제거를 최종 확인하였으며, 이를 CA04-9307로 명명하였다.
상기 CA04-9307 균주에서 feedback resistant trpE 형질을 갖도록 하기 위해서 대장균 W3110 gDNA를 주형으로 하고 제한효소 EcoRI이 포함된 서열번호 74, 서열번호 75를 이용하여 EcoRI 서열이 포함된 trpE 유전자 단편을 (1575 bp) PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95 ℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 20초 변성, 62℃ 1분 어닐링, 72℃ 1분 중합을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
서열번호 74 (trpE - 1)
GAATTCATGCAAACACAAAAACCGAC
서열번호 75 (trpE - 2)
GAATTCTCAGAAAGTCTCCTGTGCA
상기의 방법으로 획득된 trpE 유전자 및 pSG76-C 플라스미드(JOURNAL OF BACTERIOLOGY,July 1997, p. 4426-4428)에 각각 EcoRI 제한효소를 처리하여 클로닝하였다. 클로닝된 플라스미드를 대장균 DH5α에 전기천공법으로 형질전환 하였고, 클로람페니콜(chlororamphenocol) 25㎍/ml를 포함하는 LB 플레이트에서 형질전환된 대장균 DH5α를 선별하여 pSG76-C-trpE 플라스미드를 획득하였다.
상기에서 획득된 pSG76-C-trpE 플라스미드를 이용하여 site directed mutagenesis(Stratagene, 미국) 방법으로 서열번호 76, 서열번호 77 프라이머를 이용하여 pSG76-C-trpE(P21S)를 제작하였다.
서열번호 76 (trpE(P21S) - 1)
CGCTTATCGCGACAATTCCACCGCGCTTTTTCACCAG
서열번호 77 (trpE(P21S) - 2)
CTGGTGAAAAAGCGCGGTGGAATTGTCGCGATAAGCG
CA04-9307 균주에 상기의 pSG76-C-trpE(P21S) 플라스미드를 형질전환하여 LB-Cm(Yeast extract 10g/L, NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Chlororamphenicol 25ug/L) 배지에서 배양한 후 chloramphenicol 내성을 가지는 콜로니을 선발하였다. 선별된 형질전환체는 pSG76-C-trpE(P21S) 플라스미드가 유전체내의 trpE 부분에 1차로 삽입된 균주이다. 확보된 trpE(P21S) 유전자가 삽입된 균주에 pSG76-C 플라스미드 내에 존재하는 I-SceI 부분을 절단하는 제한 효소 I-SceI를 발현하는 플라스미드인 pAScep(JOURNAL OF BACTERIOLOGY,July 1997, p. 4426-4428)를 형질전환하여 LB-Ap(Yeast extract 10g/L, NaCl 5g/L, Tryptone 10g/L, Ampicilline 100ug/L)에서 생장하는 균주를 선별하였다. 선별된 균주에서 서열번호 74, 서열번호 75 프라이머를 이용하여 trpE 유전자를 증폭하였고, 증폭된 유전자는 시퀀싱을 통해 trpE(P21S)로 교체되었음을 확인하였다. 이렇게 제작된 균주는 CA04-4303으로 명명하였다.
실시예 12 : 허바스필리움 리조스페레 유래 유전자가 도입된 에스케리키아속 미생물의 L-트립토판 생산
상기 실시예 8 에서 제작된 pCL1920-PyccA-Hrh를 참조예 2에서 제작된 CA04-4303에 도입하여 허바스필리움 리조스페레 유래 유전자가 과발현되는 형질전환체인 CA04-4306을 제작하였다. 또한 대조군으로써 pCL1920 벡터를 CA04-4303에 형질전환하였다. 상기 두 균주 CA04-4303/ pCL1920과 CA04-4306의 L-트립토판 생산량을 확인하고자 50 mg/L의 스펙티노마이신 (Spectinomycin) 이 포함된 LB 액체배지에 12시간 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 초기 OD600 값이 0.01 이 되게 접종하고 37℃에서 48시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC에 의해 L-트립토판의 생산량을 측정하였다.
CA04-4303/ pCL1920과 CA04-4306에 대한 배지 중의 L-트립토판 생산에 대한 결과는 아래 표 5와 같다. 허바스필리움 리조스페레 유래 유전자가 도입되어 과발현된 CA04-4306은 플라스크 배양에서 최종 2.1 g/L 의 L-트립토판을 생산하였고, 이는 대조군에 비해 약 50% 향상된 수치이다. 이는 허바스필리움 리조스페레 유래 배출 유전자가 대장균 균주에서도 L-트립토판을 배출시켜 생산을 상당히 향상시킴을 의미한다.
생산배지 (pH 7.0)
포도당 70g, (NH4)2SO4 20 g, MgSO4 7H2O 1 g, KH2PO4 2 g, 효모추출물 2.5 g, Na-citrate 5 g, NaCl 1 g, CaCO3 40 g (증류수 1리터 기준).
대장균 유래 L-트립토판 생산균주(CA04-4303)와 허바스필리움 리조스페레 유래 배출 유전자가 과발현된 생산균주(CA04-4306)의 L-트립토판 생산량 확인.
　 OD600 트립토판 생산량 (g/L) 트립토판 수율 (g/g glc, %)
CA04-4303 / pCL1920 43.7 1.4 2.0
CA04-4306 42 2.1 3.0
따라서, 실시예 7과 9의 결과에서 알 수 있듯이 허바스필리움 리조스페레 유래 유전자는 L-트립토판 및 이의 아날로그에 특이적이면서도 월등한 내성을 보였으며, 실시예 10과 12의 결과에서 허바스필리움 리조스페레 유래 유전자는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주와 대장균 균주 모두에서 L-트립토판 생산을 향상시켰다. 또한, 실시예 11에서는 허바스필리움 리조스페레 유래 유전자가 실질적으로 세포 외부로 트립토판을 배출하는 것을 보였다. 이에 따라 허바스필리움 리조스페레 유래 유전자를 트립토판 배출자 (Tryptophan (W) exporter, wex)로 명명하였다.
실시예 13 : Random mutagenesis를 이용한 Wex 배출능 개량
본 실시예는 야생형 wex 유전자에 임의돌연변이 유발시스템(random mutagenesis) 적용을 위하여 에러유발 PCR(error-prone PCR)을 수행하였으며, 에러유발 PCR 수행 시 diversify PCR random mutagenesis kit(미국 CLONTECH)를 사용하였다. 임의돌연변이가 도입된 wex 변이체를 확보하기 위하여, 상기 실시예 8에서 제작된 pCL1920-PyccA-wex 를 주형으로 하여 서열번호 78와 79를 이용하여 에러유발 PCR을 수행하였다. 변이 발생 비율(mutation rate) 조건 선정을 위해 아래와 같이 MnSO4 농도에 따른 두가지 조성으로 에러유발 PCR을 수행하였다.
서열번호 78 (wex - 1)
ACTCTAGAGGATCCCCTTCCAGATCAAATGCGTAA
서열번호 79 (wex - 2)
ATTCGAGCTCGGTACCCCTACAAACAGTCCGCCAC
에러유발 PCR(error-prone PCR) 조성 (단위 ul)
Case # 1 2
10X Titanium taq Buffer 5 5
MnSO4(8mM) 1 2
dGTP (2mM) 1 1
50 X diversify dNTP Mix 1 1
Titanium Taq Polymerase 1 1
Primer mix 2 2
Template DNA (1ng/ul) 1 1
PCR grade water 38 37
Total volume 50 50
에러유발 PCR cycle
Cycle Temperature Time
1 94 ℃ 30 sec
25 94 ℃ 30 sec
68 ℃ 1 min
1 68 ℃ 1 min
상기 [표 6]과 [표 7]의 조건으로 수행한 에러유발 PCR 산물과 SmaI 제한효소로 절단된 pCL1920으로 깁슨 어셈블리(DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix) 방법을 이용하여 재조합 변이 플라스미드 라이브러리를 획득하였다. 상기의 방법으로 획득한 변이 라이브러리(mutant library), pCL1920-PyccA-Hrh와 pCL1920를 대장균(Escherichia coli) W3110 세포에 형질전환시키고, 50μg/L의 스펙티노마이신이 포함된 LB 평판배지에서 배양한 후 변이 라이브러리 50개의 콜로니를 선별하여 변이 발생 비율(mutation rate) 및 다양한 위치에 변이 발생유무를 판단하기 위해 시퀀싱(sequencing)을 진행하였다. 시퀀싱 결과 case#1 조건의 변이 발생 비율은 1.3 kb-1, case#2 조건에서는 2.5 kb-1 이였다. Case #1, 2 모두 돌연변이체 라이브러리(mutant library) 확보에 적합한 변이 발생 비율을 충족시킨다고 판단하여 위의 조건에서 제작된 라이브러리를 이용하여 유효변이 선별 작업을 수행하였다.
L-트립토판(L-Tryptophan) 유사체인 5'-플로로 트립토판이 50ug/mL 포함된 M9, 최소배지(minimal media)를 96 딥-웰 플레이트(deep-well plate)에 300ul씩 분주 후 앞서 형질전환 한 W3110/pCL1920-PyccA-Hrh, W3110/pCL1920, W3110/pCL1920-PyccA-wex 변이 라이브러리 콜로니들을 접종하였다. 배양은 1200rpm/37℃ 조건에서 수행되었으며, 16시간 배양 후 600nm파장으로 OD를 측정하였다. 대부분 변이 라이브러리들은 딥웰 플레이트에서 컨트롤 균주(W3110/pCL1920, W3110/pCL1920-PyccA-Hrh)와 같이 거의 성장이 관찰되지 않았다. 그 중 생육이 향상된 51종의 콜로니들을 선별하여 pCL1920-PyccA-wex 변이형 플라스미드(plasmid)를 각각 추출 후 대장균 W3110 균주에 재 형질전환하여 재현성 평가를 진행하였으며, 공통적으로 5'-플로로 트립토판이 50ug/mL 포함된 M9, 최소배지에서 특이적으로 성장이 향상된 10종의 균주를 관찰하여 OD를 기록하였다.
L-트립토판 유사체가 포함된 최소배지에서 성장이 향상된 wex 라이브러리.
Optical density (OD600)
W3110/pCL1920 0.189
W3110/pCL1920-PyccA-Hrh 0.393
W3110/pCL1920-PyccA-wex 변이 라이브러리 (1-3 8G) 0.791
W3110/pCL1920-PyccA-wex 변이 라이브러리 (1-4 6D) 1.026
W3110/pCL1920-PyccA-wex 변이 라이브러리 (2-1 10C) 0.748
W3110/pCL1920-PyccA-wex 변이 라이브러리 (2-12 8C) 0.773
W3110/pCL1920-PyccA-wex 변이 라이브러리 (2-15 6B) 0.825
W3110/pCL1920-PyccA-wex 변이 라이브러리 (2-18 3F) 0.921
W3110/pCL1920-PyccA-wex 변이 라이브러리 (3-3 6D) 0.831
W3110/pCL1920-PyccA-wex 변이 라이브러리 (3-6 11F) 0.749
W3110/pCL1920-PyccA-wex 변이 라이브러리 (5-5 10B) 0.766
W3110/pCL1920-PyccA-wex 변이 라이브러리 (5-18 6B) 0.783
선별된 10종 변이주에서 pCL1920-PyccA-wex 변이형 플라스미드(plasmid)를 추출 후 변이 확인을 위해서 sequencing을 수행하였고, 그 결과 변이는 프로모터(Promoter) 지역이 아닌 코딩서열(CDS)에서 발생하였음을 확인하였다. 또한 변이주 10종 중 8종에서 발생한 변이 위치는 Wex 막단백질의 아미노산 서열의 79번째 류신(Leucine)에서부터 83번째 이소류신(Isoleucine)까지 집중되어 있는 것을 확인하였으며, 대부분의 변이는 소수성 (Hydrophobic) 아미노산, 지방족(Aliphatic) 아미노산 또는 상대적으로 크기가 작은 L-아미노산으로 치환되어 있음을 확인하였다. 따라서 Wex 막단백질 아미노산 서열의 79번부터 83번까지의 위치가 L-트립토판 배출능 향상을 위한 변이 도입의 핵심 지역이라 판단되었으며, 해당 서열의 아미노산을 다양한 소수성 (Hydrophobic) 아미노산, 지방족(Aliphatic) 아미노산 또는 상대적으로 크기가 작은 L-아미노산으로 치환하여 그 활성을 향상시키고자 하였다.
실시예 14: 코리네박테리움속 미생물에서 Wex 서열의 79번 아미노산, 류신(Leucine)의 소수성 아미노산으로의 치환.
Wex 막단백질의 아미노산 서열의 79번째 아미노산인 류신(이하 79번 류신 또는 79번으로 기재)을 다른 소수성 아미노산으로 치환을 통해 L-트립토판 배출 개선 유효성에 대해서 검증하고자 하였다. 류신 이외 3종의 다른 아미노산으로 변이를 주기 위해서 상기 실시예 2에서 제작된 pDZTn-PgapA-Hrh를 주형으로 Site-Directed Mutagenesis 를 수행하였다. Site-Directed mutagenesis는 아래의 방법으로 수행되었다.
Site-Direction Mutagenesis PCR 조성
단위 (ul)
10X pfu-X Buffer 5
10mM dNTP Mix 1
pfu-X Polymerase 1
Mutagenic forward primer(5pmol) 2
Mutagenic reverse primer(5pmol) 2
pDZTn-PgapA-Hrh (template DNA, 200ng/ul) 1
dH2O 38
Total 50
Site-Direction Mutagenesis PCR cycle
Cycle Temperature Time
1 95 ℃ 1 min
18 95 ℃ 50 sec
60 ℃ 50 sec
68 ℃ 9 min
1 68 ℃ 7 min
Wex 아미노산 서열의 79번 아미노산 류신을 다른 소수성 아미노산인 알라닌(A) (서열번호 80, 서열번호 131), 발린(V) (서열번호 81, 서열번호 132), 이소류신(I) (서열번호 82, 서열번호 133)으로 치환하기 위해서 [표11] 에서 표기한 각각의 mutagenic primer 세트를 이용해서 [표 9]과 같은 PCR mixture를 만들고 [표 10]의 cycle로 PCR 을 수행하였다. PCR이 종료되고 DpnI 제한효소 1㎕를 첨가 후 37℃ 로 1시간 처리하였다. DpnI 처리된 DNA 3㎕ DH5a competent cell에 transformation하여 pDZTn-PgapA-wex 변이형 플라스미드를 확보하였고 시퀀싱을 통해서 [표11]에 표기한 각각의 변이로 교체되었음을 확인하였다.
코리네박테리움 속 미생물 도입을 위한 Wex 아미노산 서열의 79번 아미노산 변이형 플라스미드 제작을 위한 mutagenic primer 세트
변이형 Wex 플라스미드 서열번호 # 염기서열
pDZTn-PgapA-wex L79A 83 GTGTCCTACGAACTCTGCGCATCGCTCTCCATCGGTTATG
84 CATAACCGATGGAGAGCGATGCGCAGAGTTCGTAGGACAC
pDZTn-PgapA-wex L79V 85 GTGTCCTACGAACTCTGCGTGTCGCTCTCCATCGGTTATG
86 CATAACCGATGGAGAGCGACACGCAGAGTTCGTAGGACAC
pDZTn-PgapA-wex L79I 87 GTGTCCTACGAACTCTGCATCTCGCTCTCCATCGGTTATG
88 CATAACCGATGGAGAGCGAGATGCAGAGTTCGTAGGACAC
상기 [표11]과 같이 제작된 pDZTn-PgapA-wex L79A, pDZTn-PgapA-wex L79V, pDZTn-PgapA-wex L79I 벡터를 상기 참고예 1 에서 제작된 CA04-8352 에 각각 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 변이형 wex 유전자가 삽입된 3종의 균주를 얻었다. 해당 유전자가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 7과 서열번호 8의 프라이머를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였다.
이렇게 수득한 형질전환 균주를 각각 CA04-8352 (wex L79A), CA04-8352(wex L79V), CA04-8352(wex L79I)로 명명하였다.
CA04-8352, CA04-8405, CA04-8352(wex L79A), CA04-8352(wex L79V), CA04-8352(wex L79I) 균주는 트립토판 생산량을 확인하고자 상기 실시예 10과 동일한 방법으로 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC를 이용해 L-트립토판의 생산량을 측정하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 L-트립토판 생산균주(CA04-8352)와 L-트립토판 배출유전자(Wex)가 삽입된 균주(CA04-8405), Wex 아미노산 서열의 79번째 아미노산 변이 균주(CA04-8352(wex L79A), CA04-8352(wex L79V), CA04-8352(wex L79I)) 의 L-트립토판 생산량 확인
균주명 트립토판 생산량(g/L) 트립토판 수율(g/g glc, %) 야생형 Wex대비수율 향상(Δ, %p)
CA04-8352 0.25 0.83 -
CA04-8405 1.52 5.07 -
CA04-8352(wex L79A) 2.41 8.02 2.95
CA04-8352(wex L79V) 2.02 6.73 1.66
CA04-8352(wex L79I) 2.00 6.66 1.59
[표 12] 의 결과와 같이 야생형 Wex 를 삽입한 CA04-8405 대비 Wex 아미노산 서열의 79번째 류신을 다른 소수성 아미노산으로 치환한 3종 변이 모두 1.59%p ~ 2.95%p 발효 수율 향상을 보였다. 특히 wex L79A 변이주에서 가장 큰 L-트립토판 발효 수율의 향상을 보였으며, 이러한 결과는 Wex 아미노산 서열의 79번 류신의 다른 소수성 아미노산으로의 치환은 Wex 의 L-트립토판 배출능의 활성을 상당히 향상시킴을 의미한다.
실시예 15: 코리네박테리움속 미생물에서 Wex 서열의 80번째 아미노산, 세린(Serine)의 소수성 아미노산으로의 치환.
Wex 막단백질의 아미노산 서열의 80번째 아미노산인 세린(이하 80번 세린으로 기재)을 소수성 아미노산으로 치환을 통해 L-트립토판 배출 개선 유효성에 대해서 검증하고자 하였다. 서로 다른 4종의 소수성 아미노산으로 변이를 주기 위해서 실시예 14와 동일한 방법으로 pDZTn-PgapA-wex를 주형으로 하여 Site-Directed Mutagenesis 를 수행하였다.
또한 Wex 아미노산 서열의 80번 세린을 소수성 아미노산인 알라닌(A) (서열번호 89, 서열번호 134), 발린(V) (서열번호 90, 서열번호 135), 류신(L) (서열번호 91, 서열번호 136), 이소류신(I) (서열번호 92, 서열번호 137)으로 치환하기 위해서 상기 실시예 14와 동일한 방법이 수행되었으며, pDZTn-PgapA-wex 변이형 플라스미드를 확보하기 위해 사용된 mutagenic primer 세트와 변이 형태는 [표13]과 동일하다.
코리네박테리움 속 미생물 도입을 위한 Wex 아미노산 서열의 80번째 아미노산 변이형 플라스미드 제작을 위한 mutagenic primer 세트
변이형 Wex 플라스미드 서열번호 # 염기서열
pDZTn-PgapA-wex S80A 93 GTCCTACGAACTCTGCCTGGCACTCTCCATCGGTTATGCC
94 GGCATAACCGATGGAGAGTGCCAGGCAGAGTTCGTAGGAC
pDZTn-PgapA-wex S80V 95 GTCCTACGAACTCTGCCTGGTGCTCTCCATCGGTTATGCC
96 GGCATAACCGATGGAGAGCACCAGGCAGAGTTCGTAGGAC
pDZTn-PgapA-wex S80L 97 GTCCTACGAACTCTGCCTGCTGCTCTCCATCGGTTATGCC
98 GGCATAACCGATGGAGAGCAGCAGGCAGAGTTCGTAGGAC
pDZTn-PgapA-wex S80I 99 GTCCTACGAACTCTGCCTGATCCTCTCCATCGGTTATGCC
100 GGCATAACCGATGGAGAGGATCAGGCAGAGTTCGTAGGAC
상기 [표13]과 같이 제작된 pDZTn-PgapA-wex S80A, pDZTn-PgapA-wex S80V, pDZTn-PgapA-wex S80L, pDZTn-PgapA-wex S80I 벡터를 CA04-8352에 각각 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 변이형 wex 유전자 삽입된 4종의 균주를 얻었다. 해당 유전자가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 7과 서열번호 8의 프라이머를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였다.
이렇게 수득한 형질전환 균주를 각각 CA04-8352(wex S80A), CA04-8352(wex S80V), CA04-8352(wex S80L), CA04-8352(wex S80I)로 명명하였다.
CA04-8352, CA04-8405, CA04-8352(wex S80A), CA04-8352(wex S80V), CA04-8352(wex S80L), CA04-8352(wex S80I) 균주는 트립토판 생산량을 확인하고자 실시예 10과 동일한 방법으로 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC에 의해 L-트립토판의 생산량을 측정하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 L-트립토판 생산균주(CA04-8352)와 L-트립토판 배출유전자(Wex)가 삽입된 균주(CA04-8405), Wex 아미노산 서열의 80번째 아미노산 변이 균주(CA04-8352(wex S80A), CA04-8352(wex S80V), CA04-8352(wex S80L), CA04-8352(wex S80I)) 의 L-트립토판 생산량 확인
균주명 트립토판 생산량(g/L) 트립토판 수율(g/g glc, %) 야생형 Wex대비수율 향상(Δ,%p)
CA04-8352 0.25 0.83 -
CA04-8405 1.52 5.07 -
CA04-8352(wex S80A) 2.21 7.36 2.29
CA04-8352(wex S80V) 2.31 7.69 2.62
CA04-8352(wex S80L) 2.28 7.61 2.54
CA04-8352(wex S80I) 2.12 7.06 1.99
[표 14] 의 결과와 같이 야생형 Wex 를 삽입한 CA04-8405 대비 Wex 아미노산 서열의 80번 아미노산을 서로 다른 소수성 아미노산으로 치환한 4종 변이 모두 1.99%p~2.62%p 발효 수율 향상을 보였다. 특히 wex S80V 변이주에서 가장 큰 L-트립토판 발효 수율의 향상을 보였으며, 이러한 결과 역시 Wex 아미노산 서열의 80번 세린의 다른 소수성 아미노산으로의 치환은 Wex 의 L-트립토판 배출능의 활성을 상당히 향상시킴을 의미한다.
실시예 16: 코리네박테리움속 미생물에서 Wex 서열의 81번 아미노산, 류신(Leucine)의 소수성 아미노산으로의 치환.
Wex 막단백질의 아미노산 서열의 81번째 아미노산인 류신(이하 81번 류신으로 기재)을 다른 소수성 아미노산으로 치환을 통해 L-트립토판 배출 개선 유효성에 대해서 검증하고자 하였다. 류신 이외 3종의 다른 소수성 아미노산으로 변이를 주기 위해서 실시예 14와 동일한 방법으로 pDZTn-PgapA-wex를 주형으로 하여 Site-Directed Mutagenesis 를 수행하였다.
또한 Wex 아미노산 서열의 81번 류신을 소수성 아미노산인 알라닌(A) (서열번호 101, 서열번호 138), 발린(V) (서열번호 102, 서열번호 139), 이소류신(I) (서열번호 103, 서열번호 140)으로 치환하기 위해서 상기 실시예 14와 동일한 방법이 수행되었으며, pDZTn-PgapA-wex 변이형 플라스미드를 확보하기 위해 사용된 mutagenic primer 세트와 변이 형태는 [표15]와 동일하다.
코리네박테리움 속 미생물 도입을 위한 Wex 아미노산 서열의 81번째 아미노산의 변이형 플라스미드 제작을 위한 mutagenic primer 세트
변이형 Wex 플라스미드 서열번호 # 염기서열
pDZTn-PgapA-wex L81A 104 CCTACGAACTCTGCCTGTCGGCATCCATCGGTTATGCCAATAC
105 GTATTGGCATAACCGATGGATGCCGACAGGCAGAGTTCGTAGG
pDZTn-PgapA-wex L81V 106 CCTACGAACTCTGCCTGTCGGTGTCCATCGGTTATGCCAATAC
107 GTATTGGCATAACCGATGGACACCGACAGGCAGAGTTCGTAGG
pDZTn-PgapA-wex L81I 108 CCTACGAACTCTGCCTGTCGATCTCCATCGGTTATGCCAATAC
109 GTATTGGCATAACCGATGGAGATCGACAGGCAGAGTTCGTAGG
상기 [표15]와 같이 제작된 pDZTn-PgapA-wex L81A, pDZTn-PgapA-wex L81V, pDZTn-PgapA-wex L81I 벡터를 CA04-8352에 각각 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 변이형 wex 유전자 삽입된 3종의 균주를 얻었다. 해당 유전자가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 7과 서열번호 8의 프라이머를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였다.
이렇게 수득한 형질전환 균주를 각각 CA04-8352(wex L81A), CA04-8352(wex L81V), CA04-8352(wex L81I)로 명명하였다.
CA04-8352, CA04-8405, CA04-8352(wex L81A), CA04-8352(wex L81V), CA04-8352(wex L81I) 균주는 트립토판 생산량을 확인하고자 실시예 10와 동일한 방법으로 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC에 의해 L-트립토판의 생산량을 측정하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 L-트립토판 생산균주(CA04-8352)와 L-트립토판 배출유전자(Wex)가 삽입된 균주(CA04-8405), Wex 아미노산 서열의 81번 아미노산 변이 균주(CA04-8352(wex L81A), CA04-8352(wex L81V), CA04-8352(wex L81I)) 의 L-트립토판 생산량 확인
균주명 트립토판 생산량(g/L) 트립토판 수율(g/g glc, %) 야생형 Wex대비수율 향상 (Δ,%p)
CA04-8352 0.25 0.83 -
CA04-8405 1.52 5.07 -
CA04-8352(wex L81A) 2.38 7.94 2.87
CA04-8352(wex L81V) 2.13 7.10 2.03
CA04-8352(wex L81I) 2.21 7.36 2.29
표 16] 의 결과와 같이 야생형 Wex 를 삽입한 CA04-8405 대비 Wex 아미노산 서열의 81번 아미노산을 서로 다른 소수성 아미노산으로 치환한 3종 변이 모두 2.03%p~2.87%p 발효 수율 향상을 보였다. 특히 wex L81A 변이주에서 가장 큰 L-트립토판 발효 수율의 향상을 보였으며, 이러한 결과 역시 Wex 아미노산 서열의 81번 류신의 다른 소수성 아미노산으로의 치환은 Wex 의 L-트립토판 배출능의 활성을 상당히 향상시킴을 의미한다.
실시예 17: 코리네박테리움속 미생물에서 Wex 서열의 82번째 아미노산, 세린(Serine)의 소수성 아미노산으로의 치환.
Wex 막단백질의 아미노산 서열의 82번째 아미노산인 세린(이하 82번 세린으로 기재)을 소수성 아미노산으로 치환을 통해 L-트립토판 배출 개선 유효성에 대해서 검증하고자 하였다. 서로 다른 4종의 소수성 아미노산으로 변이를 주기 위해서 실시예 14와 동일한 방법으로 pDZTn-PgapA-wex를 주형으로 하여 Site-Directed Mutagenesis 를 수행하였다.
또한 Wex 아미노산 서열의 82번 세린을 소수성 아미노산인 알라닌(A) (서열번호 110, 서열번호 141), 발린(V) (서열번호 111, 서열번호 142), 류신(L) (서열번호 112, 서열번호 143), 이소류신(I) (서열번호 113, 서열번호 144)으로 치환하기 위해서 상기 실시예 14와 동일한 방법이 수행되었으며, pDZTn-PgapA-wex 변이형 플라스미드를 확보하기 위해 사용된 mutagenic primer 세트와 변이 형태는 [표17]과 동일하다.
코리네박테리움 속 미생물 도입을 위한 Wex 아미노산 서열의 82번 아미노산 변이형 플라스미드 제작을 위한 mutagenic primer 세트
변이형 Wex 플라스미드 서열번호 # 염기서열
pDZTn-PgapA-wex S82A 114 CGAACTCTGCCTGTCGCTCGCAATCGGTTATGCCAATACAG
115 CTGTATTGGCATAACCGATTGCGAGCGACAGGCAGAGTTCG
pDZTn-PgapA-wex S82V 116 CGAACTCTGCCTGTCGCTCGTGATCGGTTATGCCAATACAG
117 CTGTATTGGCATAACCGATCACGAGCGACAGGCAGAGTTCG
pDZTn-PgapA-wex S82L 118 CGAACTCTGCCTGTCGCTCCTGATCGGTTATGCCAATACAG
119 CTGTATTGGCATAACCGATCAGGAGCGACAGGCAGAGTTCG
pDZTn-PgapA-wex S82I 120 CGAACTCTGCCTGTCGCTCATCATCGGTTATGCCAATACAG
121 CTGTATTGGCATAACCGATGATGAGCGACAGGCAGAGTTCG
상기 [표17]과 같이 제작된 pDZTn-PgapA-wex S82A, pDZTn-PgapA-wex S82V, pDZTn-PgapA-wex S82L, pDZTn-PgapA-wex S82I 벡터를 CA04-8352에 각각 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 변이형 wex 유전자 삽입된 4종의 균주를 얻었다. 해당 유전자가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 7과 서열번호 8의 프라이머를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였다.
이렇게 수득한 형질전환 균주를 각각 CA04-8352(wex S82A), CA04-8352(wex S82V), CA04-8352(wex S82L), CA04-8352(wex S82I)로 명명하였다.
CA04-8352, CA04-8405, CA04-8352(wex S82A), CA04-8352(wex S82V), CA04-8352(wex S82L), CA04-8352(wex S82I) 균주는 트립토판 생산량을 확인하고자 실시예 10과 동일한 방법으로 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC에 의해 L-트립토판의 생산량을 측정하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 L-트립토판 생산균주(CA04-8352)와 L-트립토판 배출유전자(Wex)가 삽입된 균주(CA04-8405), Wex 아미노산 서열의 82번 아미노산 변이 균주(CA04-8352(wex S82A), CA04-8352(wex S82V), CA04-8352(wex S82L), CA04-8352(wex S82I)) 의 L-트립토판 생산량 확인.
균주명 트립토판 생산량(g/L) 트립토판 수율(g/g glc, %) 야생형 Wex대비수율 향상(Δ,%p)
CA04-8352 0.25 0.83 -
CA04-8405 1.52 5.07 -
CA04-8352(wex S82A) 2.35 7.83 2.76
CA04-8352(wex S82V) 2.18 7.28 2.21
CA04-8352(wex S82L) 1.94 6.47 1.40
CA04-8352(wex S82I) 2.00 6.66 1.59
[표 18] 의 결과와 같이 야생형 Wex 를 삽입한 CA04-8405 대비 Wex 아미노산 서열의 82번 아미노산을 서로 다른 소수성 아미노산으로 치환한 4종 변이 모두 1.40%p~2.76%p 발효 수율 향상을 보였다. 특히 wex S82A 변이주에서 가장 큰 L-트립토판 발효 수율의 향상을 보였으며, 이러한 결과 역시 Wex 아미노산 서열의 82번 세린의 다른 소수성 아미노산으로의 치환은 Wex 의 L-트립토판 배출능의 활성을 상당히 향상시킴을 의미한다.
실시예 18: 코리네박테리움속 미생물에서 Wex 서열의 83번 아미노산, 이소류신(Isoleucine)의 소수성 아미노산으로의 치환.
Wex 막단백질의 아미노산 서열의 83번째 아미노산인 이소류신(이하 83번 이소류신으로 기재)을 다른 소수성 아미노산으로 치환을 통해 L-트립토판 배출 개선 유효성에 대해서 검증하고자 하였다. 이소류신 이외 3종의 다른 소수성 아미노산으로 변이를 주기 위해서 실시예 14와 동일한 방법으로 pDZTn-PgapA-wex를 주형으로 하여 Site-Directed Mutagenesis 를 수행하였다.
또한 Wex 아미노산 서열의 83번 이소류신을 소수성 아미노산인 알라닌(A) (서열번호 122, 서열번호 145), 발린(V) (서열번호 123, 서열번호 146), 류신(L) (서열번호 124, 서열번호 147)으로 치환하기 위해서 상기 실시예 14와 동일한 방법이 수행되었으며, pDZTn-PgapA-wex 변이형 플라스미드를 확보하기 위해 사용된 mutagenic primer 세트와 변이 형태는 [표19]와 동일하다.
코리네박테리움 속 미생물 도입을 위한 Wex 아미노산 서열의 83번 아미노산 변이형 플라스미드 제작을 위한 mutagenic primer 세트
변이형 Wex 플라스미드 서열번호 # 염기서열
pDZTn-PgapA-wex I83A 125 GAACTCTGCCTGTCGCTCTCCGCAGGTTATGCCAATACAGGCAGG
126 CCTGCCTGTATTGGCATAACCTGCGGAGAGCGACAGGCAGAGTTC
pDZTn-PgapA-wex I83V 127 GAACTCTGCCTGTCGCTCTCCGTGGGTTATGCCAATACAGGCAGG
128 CCTGCCTGTATTGGCATAACCCACGGAGAGCGACAGGCAGAGTTC
pDZTn-PgapA-wex I83L 129 GAACTCTGCCTGTCGCTCTCCCTGGGTTATGCCAATACAGGCAGG
130 CCTGCCTGTATTGGCATAACCCAGGGAGAGCGACAGGCAGAGTTC
상기 [표19]와 같이 제작된 pDZTn-PgapA-wex I83A, pDZTn-PgapA-wex I83V, pDZTn-PgapA-wex I83L 벡터를 CA04-8352에 각각 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 변이형 wex 유전자 삽입된 3종의 균주를 얻었다. 해당 유전자가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 7과 서열번호 8의 프라이머를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였다.
이렇게 수득한 형질전환 균주를 각각 CA04-8352(wex I83A), CA04-8352(wex I83V), CA04-8352(wex I83L)로 명명하였다.
CA04-8352, CA04-8405, CA04-8352(wex I83A), CA04-8352(wex I83V), CA04-8352(wex I83L) 균주는 트립토판 생산량을 확인하고자 실시예 10과 동일한 방법으로 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC에 의해 L-트립토판의 생산량을 측정하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 L-트립토판 생산균주(CA04-8352)와 L-트립토판 배출유전자(Wex)가 삽입된 균주(CA04-8405), Wex 아미노산 서열의 83번 아미노산 변이 균주(CA04-8352(wex I83A), CA04-8352(wex I83V), CA04-8352(wex I83L)) 의 L-트립토판 생산량 확인
균주명 트립토판 생산량(g/L) 트립토판 수율(g/g glc, %) 야생형 Wex대비수율 향상(Δ,%p)
CA04-8352 0.25 0.83 -
CA04-8405 1.52 5.07 -
CA04-8352(wex I83A) 2.04 6.80 1.73
CA04-8352(wex I83V) 2.22 7.39 2.32
CA04-8352(wex I83L) 2.23 7.43 2.36
[표 20] 의 결과와 같이 야생형 Wex 를 삽입한 CA04-8405 대비 Wex 아미노산 서열의 83번 아미노산을 서로 다른 소수성 아미노산으로 치환한 3종 변이 모두 1.73%p~2.36%p 발효 수율 향상을 보였다. 특히 wex I83L 변이주에서 가장 큰 L-트립토판 발효 수율의 향상을 보였으며, 이러한 결과 역시 Wex 아미노산 서열의 83번 이소류신의 다른 소수성 아미노산으로의 치환은 Wex 의 L-트립토판 배출능의 활성을 상당히 향상시킴을 의미한다. 상기 실시예 2~6에서 보인 결과들을 통해 Wex 막단백질 아미노산 서열의 79번부터 83번까지의 소수성 아미노산으로의 치환은 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에서 L-트립토판 배출능의 활성을 크게 향상시킴을 보여준다.
본 출원의 변이형 wex가 도입된 균주 CA04-8352(wex L79I), CA04-8352(wex S80V), CA04-8352(wex L81V), CA04-8352(wex S82V), CA04-8352(wex I83L)는 각각 CM05-9022, CM05-9023, CM05-9024, CM05-9025, CM05-9026으로 명명되었으며, 2019년 3월 29일자로, 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 국제기탁하여 KCCM12475P, KCCM12476P, KCCM12477P, KCCM12478P, KCCM12479P로 기탁번호를 부여 받았다.
실시예 19: 에스케리키아 속 미생물에서 Wex 서열의 79번 아미노산, 류신(Leucine)의 소수성 아미노산으로의 치환.
상기 실시예 14~18에서 보인 코리네박테리움속 미생물에서 Wex 변이 도입에 따른 L-트립토판 배출능 활성 향상에 대한 효과는 에스케리키아 속 미생물에서 다시 확인되었다.
코리네박테리움속 미생물에서와 같이 에스케리키아 속 미생물에서 Wex 막단백질의 아미노산 서열의 79번 아미노산인 류신을 다른 소수성 아미노산으로 치환을 통해 L-트립토판 배출 개선 유효성에 대해서 검증하고자 하였다. 류신 이외 3종의 다른 소수성 아미노산으로 변이를 주기 위해서 상기 실시예 8에서 제작된 pCL1920-PyccA-Hrh를 주형으로 Site-Directed Mutagenesis 를 수행하였다. Site-Directed mutagenesis는 아래의 방법으로 수행되었다.
Site-Direction Mutagenesis PCR 조성
단위 (ul)
10X pfu-X Buffer 5
10mM dNTP Mix 1
pfu-X Polymerase 1
Mutagenic forward primer(5pmol) 2
Mutagenic reverse primer(5pmol) 2
pCL1920-PyccA-wex (template DNA, 200ng/ul) 1
dH2O 38
Total 50
Site-Direction Mutagenesis PCR cycle
Cycle Temperature Time
1 95 ℃ 1 min
18 95 ℃ 50 sec
60 ℃ 50 sec
68 ℃ 6 min
1 68 ℃ 7 min
Wex 아미노산 서열의 79번 류신을 다른 소수성 아미노산인 알라닌(A) (서열번호 80, 서열번호 131), 발린(V) (서열번호 81, 서열번호 132), 이소류신(I) (서열번호 82, 서열번호 133)으로 치환하기 위해서 [표23] 에서 표기한 각각의 mutagenic primer 세트를 이용해서 [표 21]과 같은 PCR mixture를 만들고 [표 22]의 cycle로 PCR 을 수행하였다. PCR이 종료되고 DpnI 제한효소 1㎕를 첨가 후 37℃ 로 1시간 처리하였다. DpnI 처리된 DNA 3㎕ DH5a competent cell에 transformation하여 pCL1920-PgapA-wex 변이형 플라스미드를 확보하였고 시퀀싱을 통해서 [표23]에 표기한 각각의 변이로 교체되었음을 확인하였다.
에스케리키아 속 미생물에서 발현을 위한 Wex 아미노산 서열의 79번 아미노산 변이형 플라스미드 제작을 위한 mutagenic primer 세트
변이형 Wex 플라스미드 서열번호 # 염기서열
pCL1920-PyccA-wex L79A 83 GTGTCCTACGAACTCTGCGCATCGCTCTCCATCGGTTATG
84 CATAACCGATGGAGAGCGATGCGCAGAGTTCGTAGGACAC
pCL1920-PyccA-wex L79V 85 GTGTCCTACGAACTCTGCGTGTCGCTCTCCATCGGTTATG
86 CATAACCGATGGAGAGCGACACGCAGAGTTCGTAGGACAC
pCL1920-PyccA-wex L79I 87 GTGTCCTACGAACTCTGCATCTCGCTCTCCATCGGTTATG
88 CATAACCGATGGAGAGCGAGATGCAGAGTTCGTAGGACAC
상기 [표23]과 같이 제작된 pCL1920-PyccA-wex L79A, pCL1920-PyccA-wex L79V, pCL1920-PyccA-wex L79I 벡터를 CA04-4303에 각각 전기천공법으로 형질 전환하여, 서로 다른 wex 79번 아미노산 변이형 유전자가 각각 도입된 3종의 균주를 얻었다. 이렇게 수득한 형질전환 균주를 각각 CA04-4303(wex L79A), CA04-4303(wex L79V), CA04-4303(wex L79I)로 명명하였다.
상기 실시예 12에서 제작된 CA04-4303(pCL1920)와 CA04-4306을 대조군으로 사용하여 CA04-4303(wex L79A), CA04-4303(wex L79V), CA04-4303(wex L79I) 균주의 L-트립토판 생산량을 확인하고자 상기 실시예 12와 동일한 방법으로 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC에 의해 L-트립토판의 생산량을 측정하였다.
대장균 L-트립토판 생산균주(CA04-4303(pCL1920))와 L-트립토판 배출유전자(Wex)가 발현된 균주(CA04-4306), Wex 아미노산 서열의 79번 아미노산 변이 균주(CA04-4303(wex L79A), CA04-4303(wex L79V), CA04-4303(wex L79I)) 의 L-트립토판 생산량 확인
균주명 트립토판 생산량(g/L) 트립토판 수율(g/g glc, %) 야생형 Wex대비수율 향상(Δ,%p)
CA04-4303(pCL1920) 1.4 2.0 -
CA04-4306 2.1 3.0 -
CA04-4303(wex L79A) 3.2 4.5 1.5
CA04-4303(wex L79V) 2.5 3.6 0.6
CA04-4303(wex L79I) 2.7 3.9 0.9
[표 24] 의 결과와 같이 야생형 Wex 를 삽입한 CA04-4306 대비 Wex 아미노산 서열의 79번 아미노산을 다른 소수성 아미노산으로 치환한 3종 변이 모두 0.6%p~1.5%p 발효 수율 향상을 보였다. 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 L-트립토판 생산주에서와 같이 대장균에서도 wex L79A 변이주에서 가장 큰 L-트립토판 발효 수율의 향상을 보였으며, 이러한 결과는 Wex 아미노산 서열의 79번 류신의 다른 소수성 아미노산으로의 치환은 코리네박테리움속 미생물에서 뿐만아니라 에스케리키아 속 미생물에서도 Wex 의 L-트립토판 배출능의 활성을 상당히 향상시킴을 의미한다.
실시예 20: 에스케리키아 속 미생물에서 Wex 서열의 80번 아미노산, 세린(Serine)의 소수성 아미노산으로의 치환.
에스케리키아 속 미생물에서 Wex 막단백질의 아미노산 서열의 80번 세린을 다른 소수성 아미노산으로 치환을 통해 L-트립토판 배출 개선 유효성에 대해서 검증하고자 하였다. 서로 다른 4종의 다른 소수성 아미노산으로 변이를 주기 위해서 실시예 19와 동일한 방법으로 pCL1920-PyccA-wex를 주형으로 하여 Site-Directed Mutagenesis 를 수행하였다.
또한 Wex 아미노산 서열의 80번 세린을 소수성 아미노산인 알라닌(A) (서열번호 89, 서열번호 134), 발린(V) (서열번호 90, 서열번호 135), 류신(L) (서열번호 91, 서열번호 136), 이소류신(I) (서열번호 92, 서열번호 137)으로 치환하기 위해서 상기 실시예 19와 동일한 방법이 수행되었으며, pCL1920-PyccA-wex 변이형 플라스미드를 확보하기 위해 사용된 mutagenic primer 세트와 변이 형태는 [표 25]과 동일하다.
에스케리키아 속 미생물에서 발현을 위한 Wex 아미노산 서열의 80번 아미노산 변이형 플라스미드 제작을 위한 mutagenic primer 세트
변이형 Wex 플라스미드 서열번호 # 염기서열
pCL1920-PyccA-wex S80A 93 GTCCTACGAACTCTGCCTGGCACTCTCCATCGGTTATGCC
94 GGCATAACCGATGGAGAGTGCCAGGCAGAGTTCGTAGGAC
pCL1920-PyccA-wex S80V 95 GTCCTACGAACTCTGCCTGGTGCTCTCCATCGGTTATGCC
96 GGCATAACCGATGGAGAGCACCAGGCAGAGTTCGTAGGAC
pCL1920-PyccA-wex S80L 97 GTCCTACGAACTCTGCCTGCTGCTCTCCATCGGTTATGCC
98 GGCATAACCGATGGAGAGCAGCAGGCAGAGTTCGTAGGAC
pCL1920-PyccA-wex S80I 99 GTCCTACGAACTCTGCCTGATCCTCTCCATCGGTTATGCC
100 GGCATAACCGATGGAGAGGATCAGGCAGAGTTCGTAGGAC
상기 [표 25]와 같이 제작된 pCL1920-PyccA-wex S80A, pCL1920-PyccA-wex S80V, pCL1920-PyccA-wex S80L, pCL1920-PyccA-wex S80I벡터를 CA04-4303에 각각 전기천공법으로 형질 전환하여, 서로 다른 wex 80번 아미노산 변이형 유전자가 각각 도입된 4종의 균주를 얻었다. 이렇게 수득한 형질전환 균주를 각각 CA04-4303(wex S80A), CA04-4303(wex S80V), CA04-4303(wex S80L), CA04-4303(wex S80I)로 명명하였다.
CA04-4303(pCL1920), CA04-4306, CA04-4303(wex S80A), CA04-4303(wex S80V), CA04-4303(wex S80L), CA04-4303(wex S80I) 균주의 L-트립토판 생산량을 확인하고자 실시예 12와 동일한 방법으로 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC에 의해 L-트립토판의 생산량을 측정하였다.
대장균 L-트립토판 생산균주(CA04-4303(pCL1920))와 L-트립토판 배출유전자(Wex)가 발현된 균주(CA04-4306), Wex 아미노산 서열의 80번 아미노산 변이 균주(CA04-4303(wex S80A), CA04-4303(wex S80V), CA04-4303(wex S80L), CA04-4303(wex S80I))의 L-트립토판 생산량 확인
균주명 트립토판 생산량(g/L) 트립토판 수율(g/g glc, %) 야생형 Wex대비수율 향상(Δ,%p)
CA04-4303(pCL1920) 1.4 2.0 -
CA04-4306 2.1 3.0 -
CA04-4303(wex S80A) 2.7 3.9 0.9
CA04-4303(wex S80V) 2.9 4.2 1.2
CA04-4303(wex S80L) 2.6 3.7 0.7
CA04-4303(wex S80I) 2.3 3.3 0.3
[표 26] 의 결과와 같이 야생형 Wex 를 삽입한 CA04-4306 대비 Wex 아미노산 서열의 80번 아미노산을 다른 소수성 아미노산으로 치환한 4종 변이 모두 0.3%p~1.2%p 발효 수율 향상을 보였다. 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 L-트립토판 생산주에서와 같이 대장균에서도 wex S80V 변이주에서 가장 큰 L-트립토판 발효 수율의 향상을 보였으며, 이러한 결과는 Wex 아미노산 서열의 80번 세린의 다른 소수성 아미노산으로의 치환은 코리네박테리움속 미생물에서 뿐만아니라 에스케리키아 속 미생물에서도 Wex 의 L-트립토판 배출능의 활성을 상당히 향상시킴을 의미한다.
실시예 21: 에스케리키아 속 미생물에서 Wex 서열의 81번 아미노산, 류신(Leucine)의 소수성 아미노산으로의 치환.
에스케리키아 속 미생물에서 Wex 막단백질의 아미노산 서열의 81번 류신을 다른 소수성 아미노산으로 치환을 통해 L-트립토판 배출 개선 유효성에 대해서 검증하고자 하였다. 류신 이외 3종의 다른 소수성 아미노산으로 변이를 주기 위해서 실시예 19과 동일한 방법으로 pCL1920-PyccA-wex를 주형으로 하여 Site-Directed Mutagenesis 를 수행하였다.
또한 Wex 아미노산 서열의 81번 류신을 소수성 아미노산인 알라닌(A) (서열번호 101, 서열번호 138), 발린(V) (서열번호 102, 서열번호 139), 이소류신(I) (서열번호 103, 서열번호 140)으로 치환하기 위해서 상기 실시예 19와 동일한 방법이 수행되었으며, pCL1920-PyccA-wex 변이형 플라스미드를 확보하기 위해 사용된 mutagenic primer 세트와 변이 형태는 [표 27]과 동일하다.
에스케리키아 속 미생물에서 발현을 위한 Wex 아미노산 서열의 81번 아미노산 변이형 플라스미드 제작을 위한 mutagenic primer 세트
변이형 Wex 플라스미드 서열번호 # 염기서열
pCL1920-PyccA-wex L81A 104 CCTACGAACTCTGCCTGTCGGCATCCATCGGTTATGCCAATAC
105 GTATTGGCATAACCGATGGATGCCGACAGGCAGAGTTCGTAGG
pCL1920-PyccA-wex L81V 106 CCTACGAACTCTGCCTGTCGGTGTCCATCGGTTATGCCAATAC
107 GTATTGGCATAACCGATGGACACCGACAGGCAGAGTTCGTAGG
pCL1920-PyccA-wex L81I 108 CCTACGAACTCTGCCTGTCGATCTCCATCGGTTATGCCAATAC
109 GTATTGGCATAACCGATGGAGATCGACAGGCAGAGTTCGTAGG
상기 [표 27]과 같이 제작된 pCL1920-PyccA-wex L81A, pCL1920-PyccA-wex L81V, pCL1920-PyccA-wex L81I벡터를 CA04-4303에 각각 전기천공법으로 형질 전환하여, 서로 다른 wex 81번 아미노산 변이형 유전자가 각각 도입된 3종의 균주를 얻었다. 이렇게 수득한 형질전환 균주를 각각 CA04-4303(wex L81A), CA04-4303(wex L81V), CA04-4303(wex L81I) 로 명명하였다.
CA04-4303(pCL1920), CA04-4306, CA04-4303(wex L81A), CA04-4303(wex L81V), CA04-4303(wex L81I) 균주의 L-트립토판 생산량을 확인하고자 실시예 12와 동일한 방법으로 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC에 의해 L-트립토판의 생산량을 측정하였다.
대장균 L-트립토판 생산균주(CA04-4303(pCL1920))와 L-트립토판 배출유전자(Wex)가 발현된 균주(CA04-4306), Wex 아미노산 서열의 81번 아미노산 변이 균주(CA04-4303(wex L81A), CA04-4303(wex L81V), CA04-4303(wex L81I))의 L-트립토판 생산량 확인
균주명 트립토판 생산량(g/L) 트립토판 수율(g/g glc, %) 야생형 Wex대비수율 향상(Δ,%p)
CA04-4303(pCL1920) 1.4 2.0 -
CA04-4306 2.1 3.0 -
CA04-4303(wex L81A) 3.4 4.8 1.8
CA04-4303(wex L81V) 2.9 4.1 1.1
CA04-4303(wex L81I) 2.8 4.0 1.0
[표 28]의 결과와 같이 야생형 Wex 를 삽입한 CA04-4306 대비 Wex 아미노산 서열의 81번 아미노산을 다른 소수성 아미노산으로 치환한 3종 변이 모두 1.0%p~1.8%p 발효 수율 향상을 보였다. 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 L-트립토판 생산주에서와 같이 대장균에서도 wex L81A 변이주에서 가장 큰 L-트립토판 발효 수율의 향상을 보였으며, 이러한 결과는 Wex 아미노산 서열의 81번 류신의 다른 소수성 아미노산으로의 치환은 코리네박테리움속 미생물에서 뿐만아니라 에스케리키아 속 미생물에서도 Wex 의 L-트립토판 배출능의 활성을 상당히 향상시킴을 의미한다.
실시예 22: 에스케리키아 속 미생물에서 Wex 서열의 82번 아미노산, 세린(Serine)의 소수성 아미노산으로의 치환.
에스케리키아 속 미생물에서 Wex 막단백질의 아미노산 서열의 82번 아미노산인 세린을 다른 소수성 아미노산으로 치환을 통해 L-트립토판 배출 개선 유효성에 대해서 검증하고자 하였다. 서로 다른 4종의 다른 소수성 아미노산으로 변이를 주기 위해서 실시예 19와 동일한 방법으로 pCL1920-PyccA-wex를 주형으로 하여 Site-Directed Mutagenesis 를 수행하였다.
또한 Wex 아미노산 서열의 82번 세린을 소수성 아미노산인 알라닌(A) (서열번호 110, 서열번호 141), 발린(V) (서열번호 111, 서열번호 142), 류신(L) (서열번호 112, 서열번호 143), 이소류신(I) (서열번호 113, 서열번호 144)으로 치환하기 위해서 상기 실시예 19와 동일한 방법이 수행되었으며, pCL1920-PyccA-wex 변이형 플라스미드를 확보하기 위해 사용된 mutagenic primer 세트와 변이 형태는 [표 29]와 동일하다.
에스케리키아 속 미생물에서 발현을 위한 Wex 아미노산 서열의 82번 아미노산 변이형 플라스미드 제작을 위한 mutagenic primer 세트
변이형 Wex 플라스미드 서열번호 # 염기서열
pCL1920-PyccA-wex S82A 114 CGAACTCTGCCTGTCGCTCGCAATCGGTTATGCCAATACAG
115 CTGTATTGGCATAACCGATTGCGAGCGACAGGCAGAGTTCG
pCL1920-PyccA-wex S82V 116 CGAACTCTGCCTGTCGCTCGTGATCGGTTATGCCAATACAG
117 CTGTATTGGCATAACCGATCACGAGCGACAGGCAGAGTTCG
pCL1920-PyccA-wex S82L 118 CGAACTCTGCCTGTCGCTCCTGATCGGTTATGCCAATACAG
119 CTGTATTGGCATAACCGATCAGGAGCGACAGGCAGAGTTCG
pCL1920-PyccA-wex S82I 120 CGAACTCTGCCTGTCGCTCATCATCGGTTATGCCAATACAG
121 CTGTATTGGCATAACCGATGATGAGCGACAGGCAGAGTTCG
상기 [표 29]와 같이 제작된 pCL1920-PyccA-wex S82A, pCL1920-PyccA-wex S82V, pCL1920-PyccA-wex S82L, pCL1920-PyccA-wex S82I벡터를 CA04-4303에 각각 전기천공법으로 형질 전환하여, 서로 다른 wex 82번 아미노산 변이형 유전자가 각각 도입된 4종의 균주를 얻었다. 이렇게 수득한 형질전환 균주를 각각 CA04-4303(wex S82A), CA04-4303(wex S82V), CA04-4303(wex S82L), CA04-4303(wex S82I)로 명명하였다.
CA04-4303(pCL1920), CA04-4306, CA04-4303(wex S82A), CA04-4303(wex S82V), CA04-4303(wex S82L), CA04-4303(wex S82I) 균주의 L-트립토판 생산량을 확인하고자 실시예 12와 동일한 방법으로 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC에 의해 L-트립토판의 생산량을 측정하였다.
대장균 L-트립토판 생산균주(CA04-4303(pCL1920))와 L-트립토판 배출유전자(Wex)가 발현된 균주(CA04-4306), Wex 아미노산 서열의 82번 아미노산 변이 균주(CA04-4303(wex S82A), CA04-4303(wex S82V), CA04-4303(wex S82L), CA04-4303(wex S82I))의 L-트립토판 생산량 확인
균주명 트립토판 생산량(g/L) 트립토판 수율(g/g glc, %) 야생형 Wex대비수율 향상(Δ,%p)
CA04-4303(pCL1920) 1.4 2.0 -
CA04-4306 2.1 3.0 -
CA04-4303(wex S82A) 2.9 4.2 1.2
CA04-4303(wex S82V) 3.1 4.4 1.4
CA04-4303(wex S82L) 2.4 3.4 0.4
CA04-4303(wex S82I) 2.2 3.2 0.2
[표 30] 의 결과와 같이 야생형 Wex 를 삽입한 CA04-4306 대비 Wex 아미노산 서열의 82번 아미노산을 다른 소수성 아미노산으로 치환한 4종 변이 모두 0.2%p~1.4%p 발효 수율 향상을 보였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 L-트립토판 생산주에서와는 달리 대장균에서는 wex S82V 변이주에서 가장 큰 L-트립토판 발효 수율의 향상을 보였다. 이러한 결과는 Wex 아미노산 서열의 82번 세린의 다른 소수성 아미노산으로의 치환은 코리네박테리움속 미생물에서 뿐만아니라 에스케리키아 속 미생물에서도 Wex 의 L-트립토판 배출능의 활성을 상당히 향상시킴을 의미한다.
실시예 23: 에스케리키아 속 미생물에서 Wex 서열의 83번 아미노산, 이소류신(Isoleucine)의 소수성 아미노산으로의 치환.
에스케리키아 속 미생물에서 Wex 막단백질의 아미노산 서열의 83번 아미노산인 이소류신을 다른 소수성 아미노산으로 치환을 통해 L-트립토판 배출 개선 유효성에 대해서 검증하고자 하였다. 이소류신 이외 3종의 다른 소수성 아미노산으로 변이를 주기 위해서 실시예 19와 동일한 방법으로 pCL1920-PyccA-wex를 주형으로 하여 Site-Directed Mutagenesis 를 수행하였다.
또한 Wex 아미노산 서열의 83번 이소류신을 소수성 아미노산인 알라닌(A) (서열번호 122, 서열번호 145), 발린(V) (서열번호 123, 서열번호 146), 류신(L) (서열번호 124, 서열번호 147)으로 치환하기 위해서 상기 실시예 19와 동일한 방법이 수행되었으며, pCL1920-PyccA-wex 변이형 플라스미드를 확보하기 위해 사용된 mutagenic primer 세트와 변이 형태는 [표 31]과 동일하다.
에스케리키아 속 미생물에서 발현을 위한 Wex 아미노산 서열의 83번 아미노산 변이형 플라스미드 제작을 위한 mutagenic primer 세트
변이형 Wex 플라스미드 서열번호 # 염기서열
pCL1920-PyccA-wex I83A 125 GAACTCTGCCTGTCGCTCTCCGCAGGTTATGCCAATACAGGCAGG
126 CCTGCCTGTATTGGCATAACCTGCGGAGAGCGACAGGCAGAGTTC
pCL1920-PyccA-wex I83V 127 GAACTCTGCCTGTCGCTCTCCGTGGGTTATGCCAATACAGGCAGG
128 CCTGCCTGTATTGGCATAACCCACGGAGAGCGACAGGCAGAGTTC
pCL1920-PyccA-wex I83L 129 GAACTCTGCCTGTCGCTCTCCCTGGGTTATGCCAATACAGGCAGG
130 CCTGCCTGTATTGGCATAACCCAGGGAGAGCGACAGGCAGAGTTC
상기 [표 31]과 같이 제작된 pCL1920-PyccA-wex I83A, pCL1920-PyccA-wex I83V, pCL1920-PyccA-wex I83L벡터를 CA04-4303에 각각 전기천공법으로 형질 전환하여, 서로 다른 wex 83번 아미노산 변이형 유전자가 각각 도입된 3종의 균주를 얻었다. 이렇게 수득한 형질전환 균주를 각각 CA04-4303(wex I83A), CA04-4303(wex I83V), CA04-4303(wex I83L) 로 명명하였다.
CA04-4303(pCL1920), CA04-4306, CA04-4303(wex I83A), CA04-4303(wex I83V), CA04-4303(wex I83L) 균주의 L-트립토판 생산량을 확인하고자 실시예 12와 동일한 방법으로 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC에 의해 L-트립토판의 생산량을 측정하였다.
대장균 L-트립토판 생산균주(CA04-4303(pCL1920))와 L-트립토판 배출유전자(Wex)가 발현된 균주(CA04-4306), Wex 아미노산 서열의 83번 아미노산 변이 균주(CA04-4303(wex I83A), CA04-4303(wex I83V), CA04-4303(wex I83L))의 L-트립토판 생산량 확인
균주명 트립토판 생산량(g/L) 트립토판 수율(g/g glc, %) 야생형 Wex대비수율 향상(Δ,%p)
CA04-4303(pCL1920) 1.4 2.0 -
CA04-4306 2.1 3.0 -
CA04-4303(wex I83A) 2.2 3.2 0.2
CA04-4303(wex I83V) 2.3 3.3 0.3
CA04-4303(wex I83L) 2.6 3.7 0.7
[표 32] 의 결과와 같이 야생형 Wex 를 삽입한 CA04-4306 대비 Wex 아미노산 서열의 83번 아미노산을 다른 소수성 아미노산으로 치환한 3종 변이 모두 0.2%p~0.7%p 발효 수율 향상을 보였다. 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 L-트립토판 생산주에서와 같이 대장균에서도 wex I83L 변이주에서 가장 큰 L-트립토판 발효 수율의 향상을 보였으며, 이러한 결과는 Wex 아미노산 서열의 83번 류신의 다른 소수성 아미노산으로의 치환은 코리네박테리움속 미생물에서 뿐만아니라 에스케리키아 속 미생물에서도 Wex 의 L-트립토판 배출능의 활성을 상당히 향상시킴을 의미한다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure PCTKR2020003855-appb-I000001
Figure PCTKR2020003855-appb-I000002
Figure PCTKR2020003855-appb-I000003
Figure PCTKR2020003855-appb-I000004
Figure PCTKR2020003855-appb-I000005
Figure PCTKR2020003855-appb-I000006
Figure PCTKR2020003855-appb-I000007

Claims (11)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 79번 내지 83번 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 소수성(hydrophobic) 또는 지방족(Aliphatic) 아미노산으로 치환된, L-트립토판 배출 활성을 갖는 단백질 변이체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 소수성 아미노산은 글리신, 메티오닌, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산인, 단백질 변이체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 지방족 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산인, 단백질 변이체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 소수성(hydrophobic) 또는 지방족(Aliphatic) 아미노산은 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산인, 단백질 변이체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 단백질 변이체는 서열번호 131 내지 147 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 단백질 변이체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  7. 제6항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 단백질 변이체를 발현하는, L-트립토판을 생산하는 미생물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 또는 에스케리키아 속(Escherichia sp.) 미생물인, L-트립토판을 생산하는 미생물.
  10. 제8항의 미생물을 배지에서 배양하는 것; 및 상기 배양된 배지 또는 미생물로부터 L-트립토판을 회수하는 것을 포함하는, L-트립토판 생산방법.
  11. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 79번 내지 83번 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 단백질 변이체의, L-트립토판 생산 증가 용도.
PCT/KR2020/003855 2019-04-05 2020-03-20 신규 l-트립토판 배출 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-트립토판을 생산하는 방법 WO2020204427A1 (ko)

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