이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 출원의 하나의 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열의 381번째에 상응하는 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, L-쓰레오닌 디하이드라타아제(L-threonine dehydratase)의 변이체를 제공하는 것이다.
구체적으로, 상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 381번째에 상응하는 위치의 아미노산이 알라닌, 세린, 프롤린, 글루타민, 발린, 이소류신, 글리신 및 메티오닌으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환된 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.
또한, 본 출원의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 381번째에 상응하는 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것 외에, 서열번호 1의 아미노산 서열의 383번째에 상응하는 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 추가로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 다른 아미노산은 구체적으로 비극성 아미노산일 수 있고, 보다 구체적으로 알라닌일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "L-이소류신"은 필수아미노산의 하나로 구조적으로 L-발린, L-류신과 함께 분지쇄 아미노산에 해당하는 화학식 HO2CCH(NH2)CH(CH3)CH2CH3인 L-아미노산을 의미한다.
본 출원에서 용어, "L-쓰레오닌 디하이드라타아제(L-threonine dehydratase, TD)"는 L-이소류신 생합성 경로에 관여하는 효소로, L-이소류신 생합성 단계 중 아스파르트산(Aspartate; Aspartic acid) 유래 아미노산인 L-쓰레오닌으로부터 2-케토부티르산(2-ketobutyrate)을 생성하는 효소를 의미한다. L-이소류신은 상기 2-케토부티르산과 해당 과정(Glycolysis)에서 생성되는 피루브산(pyruvate)을 전구체로 사용하여 생산된다.
상기 L-쓰레오닌 디하이드라타아제는 예를 들면, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 단백질, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 단백질과 혼용하여 사용될 수 있다.
구체적으로, 상기 서열번호 1은 ilvA 유전자에 의해 코딩되는 L-쓰레오닌 디하이드라타아제의 아미노산 서열일 수 있다. 상기 서열번호 1의 아미노산은 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다. 일 예로, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며 상기 아미노산과 동일한 활성을 갖는 서열은 제한없이 포함될 수 있다. 또한, 본 출원에서의 L-쓰레오닌 디하이드라타아제는 비록 서열번호 1의 아미노산을 포함하는 단백질이라고 정의하였으나, 서열번호 1의 아미노산 서열 앞뒤로의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 또는 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 서로 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 본 출원의 L-쓰레오닌 디하이드라타아제에 해당됨은 당업자에게 자명하다. 구체적인 예를 들어, 본 출원의 L-쓰레오닌 디하이드라타아제는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 단백질일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 변이 대상이 되는 단백질의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
즉, 본 출원에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드', '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드'라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드와 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, '서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드'는, 이와 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 '서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드'에 속할 수 있음은 자명하다.
본 출원에서 용어, "변이체(variant)"는 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 변형(modification)되어 상기 변이체의 변이 전 아미노산 서열과 상이하나 기능(functions) 또는 특성(properties)이 유지되는 폴리펩티드를 지칭한다. 이러한 변이체는 일반적으로 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산을 변형하고, 상기 변형된 폴리펩티드의 특성을 평가하여 동정(identify)될 수 있다. 즉, 변이체의 능력은 변이 전 폴리펩티드에 비하여 증가되거나, 변하지 않거나, 또는 감소될 수 있다. 또한, 일부 변이체는 N-말단 리더 서열 또는 막전이 도메인(transmembrane domain)과 같은 하나 이상의 부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 다른 변이체는 성숙 단백질(mature protein)의 N- 및/또는 C-말단으로부터 일부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 상기 용어 "변이체"는 변이형, 변형, 변이형 폴리펩티드, 변이된 단백질, 변이 및 변이체 등의 용어(영문 표현으로는 modification, modified polypeptide, modified protein, mutant, mutein, divergent 등)가 혼용되어 사용될 수 있으며, 변이된 의미로 사용되는 용어라면 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 목적상, 상기 변이체는 천연의 야생형 또는 비변형 단백질 대비 변이된 단백질의 활성이 증가되어 L-이소류신 생산이 증대된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 통상적으로, 보존적 치환은 단백질 또는 폴리펩티드의 활성에 거의 영향을 미치지 않거나 또는 영향을 미치지 않을 수 있다.
또한, 변이체는 폴리펩티드의 특성과 2차 구조에 최소한의 영향을 갖는 아미노산들의 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 예를 들면 폴리펩티드는 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 이전(transfer)에 관여하는 단백질 N-말단의 시그널(또는 리더) 서열과 컨쥬게이트 할 수 있다. 또한 상기 폴리펩티드는 폴리펩티드를 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트 될 수 있다.
상기 '다른 아미노산으로 치환'은 치환 전의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환되는 것이면 제한되지 않는다. 즉, 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 381번째 아미노산인 쓰레오닌이 쓰레오닌 이외의 다른 아미노산 잔기로 치환된 것이라면 제한되지 않으며, 구체적으로 알지닌, 리신, 히스티딘, 글루탐산, 아르파르트산, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 프롤린, 세린, 쓰레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민 중 어느 하나의 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 381번째에 상응하는 위치의 아미노산인 쓰레오닌은 알라닌, 세린, 프롤린, 글루타민, 발린, 이소류신, 글리신 및 메티오닌으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 치환된 아미노산 잔기에는 천연 아미노산뿐만 아니라 비천연 아미노산 역시 포함될 수 있다. 상기 비천연 아미노산은 예를 들어, D-아미노산, 호모(Homo)-아미노산, 베타-호모(Beta-homo)-아미노산, N-메틸 아미노산, 알파-메틸 아미노산, 비통상 아미노산 (예컨대, 시트룰린 또는 나프틸알라닌 등) 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 한편, 본 출원에서 '특정 아미노산이 치환되었다'고 표현하는 경우, 다른 아미노산으로 치환되었다고 별도로 표기하지 않더라도 치환 전의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환되는 것임은 자명하다.
또한, 상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 381번째에 상응하는 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되는 것 외에 추가로 383번째에 상응하는 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 383번째에 상응하는 위치의 아미노산은 비극성 아미노산으로 치환된 것일 수 있으며, 상기 비극성 아미노산은 알라닌일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
즉, 상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 i) 381번째에 상응하는 위치의 아미노산이 알라닌, 세린, 프롤린, 글루타민, 발린, 이소류신, 글리신 및 메티오닌으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환되고, 및/또는 ii) 383번째에 상응하는 위치의 아미노산이 알라닌으로 치환된 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.
상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열과 80% 이상, 100% 미만의 서열 상동성을 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 본 출원의 상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 가지는 것일 수 있으며 또한, 이러한 상동성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면 381 및/또는 383번째 위치의 아미노산 서열 이외의 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 변이체에 포함됨은 자명하다.
본 출원에서 용어 "상응하는(corresponding to)"은, 폴리펩티드에서 열거되는 위치의 아미노산 잔기이거나, 또는 폴리펩티드에서 열거되는 잔기와 유사하거나 동일하거나 상동한 아미노산 잔기를 지칭한다. 상응하는 위치의 아미노산을 확인하는 것은 특정 서열을 참조하는 서열의 특정 아미노산을 결정하는 것일 수 있다. 본 출원에 사용된 "상응 영역"은 일반적으로 관련 단백질 또는 참조 (reference) 단백질에서의 유사하거나 대응되는 위치를 지칭한다.
예를 들어, 임의의 아미노산 서열을 서열번호 1과 정렬(align)하고, 이를 토대로 상기 아미노산 서열의 각 아미노산 잔기는 서열번호 1의 아미노산 잔기와 상응하는 아미노산 잔기의 숫자 위치를 참조하여 넘버링 할 수 있다. 예를 들어, 본 출원에 기재된 것과 같은 서열 정렬 알고리즘은, 쿼리 시퀀스("참조 서열"이라고도 함)와 비교하여 아미노산의 위치, 또는 치환, 삽입 또는 결실 등의 변형이 발생하는 위치를 확인할 수 있다.
이러한 정렬에는 예를 들어 Needleman-Wunsch 알고리즘 (Needleman 및 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), EMBOSS 패키지의 Needleman 프로그램 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000), Trends Genet. 16: 276-277) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 알려진 서열 정렬 프로그램, 쌍 서열(pairwise sequence) 비교 알고리즘 등을 적절히 사용할 수 있다.
본 출원에서 제공하는 L-쓰레오닌 디하이드라타아제의 변이체는, 상기에서 설명한 L-쓰레오닌 디하이드라타아제에서 특이적 위치의 아미노산이 치환되어, L-이소류신의 전구체 생산이 증가됨으로써, 이에 따라 L-이소류신의 생산능이 변이 전 단백질 대비 증가될 수 있다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 381번째에 상응하는 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, L-쓰레오닌 디하이드라타아제의 변이체는 서열번호 3 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고, 구체적으로는 서열번호 3 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열로 필수적으로 구성되는(consisting essentially of) 것일 수 있고, 보다 구체적으로는 서열번호 3 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 서열번호 3 내지 10의 아미노산 서열은 각각 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 381번째에 상응하는 위치의 아미노산이 알라닌, 세린, 프롤린, 글루타민, 발린, 이소류신, 글리신 또는 메티오닌으로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 변이체는 서열번호 3 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열의, 381번째에 상응하는 위치의 아미노산은 고정되고, 이와 80% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 본 출원의 변이체는 서열번호 3 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면 381번째 아미노산 위치 이외에, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명할 수 있다.
더하여, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 381번째에 상응하는 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 L-쓰레오닌 디하이드라타아제의 변이체는 추가로 서열번호 1의 아미노산 서열의 383번째에 상응하는 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 i) 381번째에 상응하는 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되고, 및/또는 ii) 383번째에 상응하는 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, L-쓰레오닌 디하이드라타아제의 변이체는 서열번호 23 내지 30 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있거나; 서열번호 23 내지 30 중 어느 하나의 아미노산 서열로 필수적으로 구성되는 것일 수 있거나; 또는 서열번호 23 내지 30 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 서열번호 23 내지 30의 아미노산 서열은 각각 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 i) 381번째에 상응하는 위치의 아미노산이 각각 알라닌, 세린, 프롤린, 글루타민, 발린, 이소류신, 글리신 또는 메티오닌으로 치환되고, 및/또는 ii) 383번째에 상응하는 위치의 아미노산이 알라닌으로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 a) i) 381번째에 상응하는 위치의 아미노산이 알라닌으로 치환되고, 및/또는 ii) 383번째에 상응하는 위치의 아미노산이 알라닌으로 치환; b) i) 381번째에 상응하는 상응하는 위치의 아미노산이 세린으로 치환되고, 및/또는 ii) 383번째 에 상응하는 위치의 아미노산이 알라닌으로 치환; c) i) 381번째에 상응하는 위치의 아미노산이 프롤린으로 치환되고, 및/또는 ii) 383번째에 상응하는 위치의 아미노산이 알라닌으로 치환; d) i) 381번째에 상응하는 위치의 아미노산이 글루타민으로 치환되고, 및/또는 ii) 383번째에 상응하는 위치의 아미노산이 알라닌으로 치환; e) i) 381번째에 상응하는 위치의 아미노산이 발린으로 치환되고, 및/또는 ii) 383번째에 상응하는 위치의 아미노산이 알라닌으로 치환; f) i) 381번째에 상응하는 위치의 아미노산이 이소류신으로 치환되고, 및/또는 ii) 383번째에 상응하는 위치의 아미노산이 알라닌으로 치환; g) i) 381번째에 상응하는 위치의 아미노산이 글리신으로 치환되고, 및/또는 ii) 383번째에 상응하는 위치의 아미노산이 알라닌으로 치환; 또는 h) i) 381번째에 상응하는 위치의 아미노산이 메티오닌으로 치환되고, 및/또는 ii) 383번째에 상응하는 위치의 아미노산이 알라닌으로 치환;된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 변이체는 서열번호 23 내지 30 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열에서, 381번째 및/또는 383번째에 상응하는 위치의 아미노산 중 선택된 어느 하나 이상의 아미노산은 고정되고, 이와 80% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 본 출원의 변이체는 서열번호 23 내지 30 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면 381번째 및/또는 383번째에 상응하는 위치의 아미노산 이외에, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 출원에서 용어, '상동성 (homology)' 또는 '동일성 (identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열 상호간 유사한 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 일부분과 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 일반 코돈 또는 코돈 축퇴성을 고려한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드와의 하이브리드화 역시 포함됨이 자명하다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의할 수 있다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 L-쓰레오닌 디하이드라타아제의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열, L-쓰레오닌 디하이드라타아제 및 이의 변이체에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥을 의미한다. 본 출원에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 본 출원의 L-쓰레오닌 디하이드라타아제의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는, 본 출원의 L-쓰레오닌 디하이드라타아제의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 본 출원에서 L-쓰레오닌 디하이드라타아제의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자는 ilvA 유전자이며, 상기 유전자는 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 본 출원의 L-쓰레오닌 디하이드라타아제의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 381번째에 상응하는 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 L-쓰레오닌 디하이드라타아제의 변이체를 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 폴리펩티드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열의 381번째에 상응하는 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 L-쓰레오닌 디하이드라타아제의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한 없이 포함할 수 있다.
또한, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 서열로부터 제조될 수 있는 프로브, 예를 들면, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화할 수 있는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(J. Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 폴리뉴클레오티드끼리, 70% 이상, 75% 이상, 6% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1ХSSC, 0.1% SDS, 구체적으로 60℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로 68℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데닌은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드와 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(예컨대, J. Sambrook et al., 상동).
또한, 본 출원의 L-쓰레오닌 디하이드라타아제의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 i) 381번째에 상응하는 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되고, 및/또는 ii) 383번째에 상응하는 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 L-쓰레오닌 디하이드라타아제의 변이체를 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열의 381번째 및/또는 383번째에 상응하는 위치의 아미노산 중 선택된 어느 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 L-쓰레오닌 디하이드라타아제의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한 없이 포함할 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 L-쓰레오닌 디하이드라타아제의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열, L-쓰레오닌 디하이드라타아제, 이의 변이체 및 폴리뉴클레오티드에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원에서 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리펩티드를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 염색체 내로 삽입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 폴리펩티드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 L-쓰레오닌 디하이드라타아제의 변이체; 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 중 어느 하나 이상을 포함하여, L-이소류신을 생산하는 미생물을 제공한다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열, L-쓰레오닌 디하이드라타아제, 이의 변이체, 폴리뉴클레오티드 및 벡터에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원에서 용어 "L-이소류신을 생산하는 미생물"이란, 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 단백질 또는 산물의 생산을 위하여 유전적 변형(modification)을 포함하는 미생물일 수 있다.
본 출원의 L-이소류신을 생산하는 미생물은 상기 폴리펩티드; 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하여, 목적 단백질 또는 상기 목적 단백질의 생산에 관여하는 목적 산물의 생산능을 갖는 미생물일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 미생물은, 자연적으로 목적 단백질 또는 목적 산물 생산능을 가지고 있는 미생물, 또는 목적 단백질 또는 목적 산물 생산능이 없는 모균주에 목적 단백질 또는 목적산물 생산능이 부여된 미생물 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 출원의 목적상, 상기 목적 단백질은 L-쓰레오닌 디하이드라타아제의 변이체일 수 있고, 상기 목적 산물은 L-이소류신일 수 있다.
상기 L-이소류신을 생산하는 미생물은 본 출원의 폴리펩티드, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 통해 유전적으로 변형된 미생물; 상기 폴리펩티드, 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현하도록 변형된 미생물; 상기 폴리펩티드, 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 재조합 미생물; 또는 상기 폴리펩티드 활성을 갖는 재조합 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 출원의 목적상, 상기 L-이소류신을 생산하는 미생물은 자연적으로 약한 L-이소류신 생산능을 가지고 있는 미생물에 L-쓰레오닌 디하이드라타아제의 변이체가 도입되어 L-이소류신 생산능이 증가된 미생물을 의미할 수 있다. 구체적으로, 상기 미생물은 서열번호 1의 아미노산 서열의 381번째에 상응하는 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, L-쓰레오닌 디하이드라타아제의 변이체를 발현하는 미생물로서, 상기 L-쓰레오닌 디하이드라타아제의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 381번째에 상응하는 위치의 아미노산이 알라닌, 세린, 프롤린, 글루타민, 발린, 이소류신, 글리신 및 메티오닌으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산으로 치환된 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.
또한, 상기 L-이소류신을 생산하는 미생물의 경우, 야생형 또는 비변형 미생물에 비하여 L-쓰레오닌 디하이드라타아제의 활성이 증가함에 따라, L-이소류신의 전구체인 2-케토부티르산의 생산능이 증가함으로써, L-이소류신의 생산능이 증가하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이는 야생형 또는 비변형 미생물이 L-이소류신을 생산하지 못하거나, L-이소류신을 생산하더라도 극미량을 생산할 수 있는 것에 반해, 본 출원의 L-쓰레오닌 디하이드라타아제의 변이체를 도입함으로써 미생물의 L-이소류신의 전구체 생산량을 증가시켜, L-이소류신 생산량을 증가시킬 수 있다는 것에 의의가 있을 수 있다.
본 출원에서 용어 "비변형 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 야생형 균주 또는 천연형 균주 자체이거나, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화되기 전 균주를 의미할 수 있다. 상기 "비변형 미생물"은 "변형 전 균주", "변형 전 미생물", "비변이 균주", "비변형 균주", "비변이 미생물" 또는 "기준 미생물"과 혼용될 수 있다.
더하여, 본 출원의 L-이소류신을 생산하는 미생물은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 381번째에 상응하는 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, L-쓰레오닌 디하이드라타아제의 변이체뿐만 아니라, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 추가로 서열번호 1의 아미노산 서열의 383번째에 상응하는 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 L-쓰레오닌 디하이드라타아제의 변이체를 발현하는 것일 수 있다. 본 출원의 L-이소류신을 생산하는 미생물은 구체적으로, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 i) 381번째에 상응하는 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되고, 및/또는 ii) 383번째에 상응하는 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, L-쓰레오닌 디하이드라타아제의 변이체를 발현하는 것일 수 있고, 보다 구체적으로, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 i) 381번째에 상응하는 위치의 아미노산이 알라닌, 세린, 프롤린, 글루타민, 발린, 이소류신, 글리신 및 메티오닌으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산으로 치환되고, 및/또는 ii) 383번째에 상응하는 위치의 아미노산이 알라닌으로 치환된, L-쓰레오닌 디하이드라타아제의 변이체를 발현하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, 단백질이 "발현되도록/되는"은 목적 단백질이 미생물 내에 도입되거나, 미생물 내에서 발현되도록 변형된 상태를 의미한다. 상기 목적 단백질이 미생물 내 존재하는 단백질인 경우 내재적 또는 변형 전에 비하여 그 활성이 강화된 상태를 의미한다. 본 출원의 목적상, 상기 "목적 단백질"은 전술한 L-쓰레오닌 디하이드라타아제의 변이체일 수 있다. 구체적으로, "단백질의 도입"은, 미생물이 본래 가지고 있지 않았던 특정 단백질의 활성을 나타나게 되는 것 또는 해당 단백질의 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 향상된 활성을 나타나게 되는 것을 의미한다. 예를 들어, 특정 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 미생물 내 염색체로 도입되거나, 특정 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 미생물 내로 도입되어 이의 활성이 나타나는 것일 수 있다.
본 출원에서 용어, 폴리펩티드 활성의 "강화"는, 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되는 것을 의미한다. 상기 강화는 활성화(activation), 상향조절(up-regulation), 과발현(overexpression), 증가(increase) 등의 용어와 혼용될 수 있다. 여기서 활성화, 강화, 상향조절, 과발현, 증가는 본래 가지고 있지 않았던 활성을 나타내게 되는 것, 또는 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 향상된 활성을 나타내게 되는 것을 모두 포함할 수 있다. 상기 “내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성을 의미한다. 이는 "변형 전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 "강화", "상향조절", "과발현" 또는 "증가"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성 및/또는 농도(발현량)에 비하여 향상된 것을 의미한다.
상기 강화는 외래의 폴리펩티드를 도입하거나, 내재적인 폴리펩티드의 활성 강화 및/또는 농도(발현량)를 통해 달성할 수 있다. 상기 폴리펩티드의 활성의 강화 여부는 해당 폴리펩티드의 활성 정도, 발현량 또는 해당 폴리펩티드로부터 배출되는 산물의 양의 증가로부터 확인할 수 있다.
상기 폴리펩티드의 활성의 강화는 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하며, 목적 폴리펩티드의 활성을 변형전 미생물보다 강화시킬 수 있는 한, 제한되지 않는다. 구체적으로, 분자생물학의 일상적 방법인 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 유전자 공학 및/또는 단백질 공학을 이용한 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다(예컨대, Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).
구체적으로, 본 출원의 폴리펩티드 활성의 강화는
1) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가;
2) 폴리펩티드를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역을 활성이 강력한 서열로 교체;
3) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열의 변형;
4) 폴리펩티드 활성이 강화되도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열의 변형;
5) 폴리펩티드 활성이 강화도록 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 (예를 들어, 폴리펩티드의 활성이 강화되도록 변형된 폴리펩티드를 코딩하도록 상기 폴리펩티드 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형);
6) 폴리펩티드의 활성을 나타내는 외래 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입;
7) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화;
8) 폴리펩티드의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식; 또는
9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로,
상기 1) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가는, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터의 숙주세포 내로의 도입에 의해 달성되는 것일 수 있다. 또는, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내의 염색체 내에 1 카피 또는 2 카피 이상 도입에 의해 달성되는 것일 수 있다. 상기 염색체 내에 도입은 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 벡터는 전술한 바와 같다.
상기 2) 폴리펩티드를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역(또는 발현조절서열)을 활성이 강력한 서열로 교체는, 예를 들면, 상기 발현조절영역의 활성을 더욱 강화하도록 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 강한 활성을 가지는 서열로의 교체일 수 있다. 상기 발현조절영역은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 그리고 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다. 일 예로, 본래의 프로모터를 강력한 프로모터로 교체시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
공지된 강력한 프로모터의 예에는 CJ1 내지 CJ7 프로모터(미국등록특허 US 7662943 B2), lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터, tet 프로모터, gapA 프로모터, SPL7 프로모터, SPL13(sm3) 프로모터(미국등록특허 US 10584338 B2), O2 프로모터(미국등록특허 US 10273491 B2), tkt 프로모터, yccA 프로모터 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 3) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열 변형은, 예를 들면, 내재적 개시코돈에 비해 폴리펩티드 발현율이 더 높은 다른 개시코돈을 코딩하는 염기 서열로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 4) 및 5)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 폴리펩티드의 활성을 강화하도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 활성이 증가하도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열로의 교체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 교체는 구체적으로 상동재조합에 의하여 폴리뉴클레오티드를 염색체내로 삽입함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때 사용되는 벡터는 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커 (selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 전술한 바와 같다.
상기 6) 폴리펩티드의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입은, 상기 폴리펩티드와 동일/유사한 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 숙주세포 내 도입일 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리펩티드와 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한이 없다. 상기 도입에 이용되는 방법은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 폴리펩티드가 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.
상기 7) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화는, 내재 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 전사 또는 번역이 증가하도록 코돈 최적화한 것이거나, 또는 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화한 것일 수 있다.
상기 8) 폴리펩티드의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식하는 것은, 예를 들어 분석하고자 하는 폴리펩티드의 서열정보를 기지 단백질들의 서열정보가 저장된 데이터베이스와 비교함으로써 서열의 유사성 정도에 따라 주형 단백질 후보를 결정하고 이를 토대로 구조를 확인하여, 변형하거나 화학적으로 수식할 노출 부위를 선택하여 변형 또는 수식하는 것일 수 있다.
이와 같은 폴리펩티드 활성의 강화는, 상응하는 폴리펩티드의 활성 또는 농도 발현량이 야생형이나 변형 전 미생물 균주에서 발현된 폴리펩티드의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 증가되거나, 해당 폴리펩티드로부터 생산되는 산물의 양의 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 미생물에서 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체의 변형은 (a) 미생물 내 염색체 삽입용 벡터를 이용한 상동 재조합 또는 유전자가위 (engineered nuclease, e.g., CRISPR-Cas9)을 이용한 유전체 교정 및/또는 (b) 자외선 및 방사선 등과 같은 빛 및/또는 화학물질 처리에 의해 유도될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 유전자 일부 또는 전체의 변형 방법에는 DNA 재조합 기술에 의한 방법이 포함될 수 있다. 예를 들면, 목적 유전자와 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터를 상기 미생물에 주입하여 상동 재조합(homologous recombination)이 일어나게 함으로써 유전자 일부 또는 전체의 결손이 이루어질 수 있다. 상기 주입되는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터는 우성 선별 마커를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이와 같은 폴리펩티드 또는 단백질 활성의 강화는, 상응하는 폴리펩티드 또는 단백질의 활성 또는 농도가 야생형이나 변형 전 미생물 균주에서 발현된 폴리펩티드 또는 단백질의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 증가되거나, 해당 폴리펩티드 또는 단백질로부터 생산되는 산물의 양의 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 상기 L-쓰레오닌 디하이드라타아제의 변이체를 포함하는 미생물은 재조합 미생물일 수 있고, 상기 재조합은 형질전환과 같은 유전적 변형에 의해 이루어질 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 미생물은 상기 L-쓰레오닌 디하이드라타아제의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환되어 제조된 재조합 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로도 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 출원의 벡터를 형질전환 시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌 글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 L-이소류신을 생산하는 미생물은 L-이소류신을 생산할 수 있다면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들면, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 에스케리키아(Escherichia) 속, 엔테로박터(Enterbacter) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 일 수 있고, 구체적으로, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물일 수 있다.
본 출원의 "코리네박테리움 속 미생물"은 모든 코리네박테리움 속 미생물을 포함할 수 있다. 구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데세르티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 스테셔니스(Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 싱굴라레(Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 폴루티솔리(Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스(Corynebacterium imitans), 코리네박테리움 테스투디노리스(Corynebacterium testudinoris) 또는 코리네박테리움 플라베스센스(Corynebacterium flavescens)일 수 있고, 더욱 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다.
본 출원에서 상기 미생물의 모균주는 L-이소류신의 생산량을 증가시키기 위해 추가적으로 L-이소류신의 생합성 경로를 강화시킨 미생물일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 미생물은 상기 L-이소류신의 생합성 경로를 강화시키기 위해, 예를 들면, 이소류신의 전구체인 쓰레오닌의 피드백 저해 해소를 위해 호모세린 디하이드로게나제를 코딩하는 hom 유전자에 유전적 변이(R407H)(미국공개공보 US 2020-0340022 A1)를 추가로 도입하거나, 아스파르토키나아제를 코딩하는 lysC 유전자에 유전적 변이(L377K)(미국등록공보 US 10662450 B2)를 추가로 도입한 미생물일 수 있다. 그러나, 상기에 제한되지 않고 당업계에 공지된 유전자 발현 조절 방법으로 L-이소류신의 생산량을 증가시킬 수 있다.
본 출원에서, 용어 "강화/증가"는 내재적 활성에 비하여 활성이 증가되는 것을 모두 포함하는 개념이다.
이러한 유전자 활성의 강화 또는 증가는, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다. 상기 방법의 예로, 유전자의 세포 내 카피수 증가; 유전자의 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법; 유전자 발현 조절 서열을 활성이 강력한 서열로 교체하는 방법; 유전자의 활성이 강화되도록 해당 유전자에 변이를 추가적으로 도입시키는 방법; 및 미생물에 외래 유전자를 도입하는 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 이루어질 수 있으며, 이들의 조합으로도 달성할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
L-이소류신의 생산량을 증가시키기 위한 또 하나의 예로, 본 출원에서 상기 미생물의 모균주는 L-이소류신의 생산량을 증가시키기 위해 추가적으로 L-이소류신의 생합성 경로를 약화시키는 유전자를 불활성화시킨 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, 폴리펩티드의 "약화"는 내재적 활성에 비하여 활성이 감소되거나 또는 활성이 없는 것을 모두 포함하는 개념이다. 상기 약화는 불활성화(inactivation), 결핍(deficiency), 하향조절(down-regulation), 감소(decrease), 저하(reduce), 감쇠(attenuation) 등의 용어와 혼용될 수 있다.
상기 약화는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 변이 등으로 폴리펩티드 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 폴리펩티드의 활성에 비해 감소 또는 제거된 경우, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 유전자의 발현 저해 또는 폴리펩티드로의 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 폴리펩티드 활성 정도 및/또는 농도(발현량)가 천연형 균주에 비하여 낮은 경우, 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 전혀 이루어지지 않은 경우, 및/또는 폴리뉴클레오티드의 발현이 되더라도 폴리펩티드의 활성이 없는 경우 역시 포함할 수 있다. 상기 "내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주, 야생형 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성을 의미한다. 이는 "변형 전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 "불활성화, 결핍, 감소, 하향조절, 저하, 감쇠"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성에 비하여 낮아진 것을 의미한다.
이러한 폴리펩티드의 활성의 약화는, 당업계에 알려진 임의의 방법에 의하여 수행될 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니며, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다(예컨대, Nakashima N et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014;15(2):2773-2793, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).
구체적으로, 본 출원의 폴리펩티드 활성의 약화는
1) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전체 또는 일부의 결손;
2) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현이 감소하도록 발현조절영역(또는 발현조절서열)의 변형;
3) 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 상기 폴리펩티드를 구성하는 아미노산 서열의 변형(예컨대, 아미노산 서열 상의 1 이상의 아미노산의 삭제/치환/부가);
4) 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 서열의 변형 (예를 들어, 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 변형된 폴리펩티드를 코딩하도록 상기 폴리펩티드 유전자의 핵산염기 서열 상의 1 이상의 핵산염기의 삭제/치환/부가);
5) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열의 변형;
6) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입;
7) 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능한 2차 구조물을 형성시키기 위하여 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열의 부가;
8) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터의 부가(Reverse transcription engineering, RTE); 또는
9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.
예컨대,
상기 1) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자 일부 또는 전체의 결손은, 염색체 내 내재적 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 전체의 제거, 일부 뉴클레오티드가 결실된 폴리뉴클레오티드로의 교체 또는 마커 유전자로 교체일 수 있다.
또한, 상기 2) 발현조절영역(또는 발현조절서열)의 변형은, 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절영역(또는 발현조절서열) 상의 변이 발생, 또는 더욱 약한 활성을 갖는 서열로의 교체일 수 있다. 상기 발현조절영역에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 5) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열 변형은, 예를 들면, 내재적 개시코돈에 비해 폴리펩티드 발현율이 더 낮은 다른 개시코돈을 코딩하는 염기서열로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 3) 및 4)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은 폴리펩티드의 활성을 약화하도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 활성이 없도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열로의 교체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 서열 내 변이를 도입하여 종결 코돈을 형성시킴으로써, 유전자의 발현을 저해하거나 약화시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 6) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입은 예를 들어 문헌 [Weintraub, H. et al., Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986]을 참고할 수 있다.
상기 7) 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능한 2차 구조물을 형성시키기 위하여 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열의 부가는 mRNA 번역을 불가능하게 하거나 속도를 저하시키는 것일 수 있다.
상기 8) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터의 부가(Reverse transcription engineering, RTE)는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 전사체에 상보적인 안티센스 뉴클레오티드를 만들어 활성을 약화하는 것일 수 있다.
본 출원에 있어서, 상기 미생물의 모균주는 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032, 상기 ATCC1303에 이소류신의 전구체인 쓰레오닌의 피드백 저해 해소를 위해 호모세린 디하이드로게나제를 코딩하는 hom(R407H)(미국공개공보 US 2020-0340022 A1)를 추가로 도입한 미생물, 상기 ATCC130에 아스파르토키나아제를 코딩하는 lysC(L377K)(미국등록공보 US 10662450 B2)를 추가로 도입한 미생물, NTG(N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine) 처리된 L-이소류신 생산 균주인 KCJI-38(KCCM11248P, 대한민국 등록특허 제10-1335789호) 또는 상기 ATCC 13032에 hom(R407H) 및 ilvA(F383A)를 동시에 도입한 ATCC 13032 hom(R407H) /pECCG117-ilvA(F383A) 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 L-쓰레오닌 디하이드라타아제의 변이체; 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 중 어느 하나 이상을 포함하는 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-이소류신 생산 방법을 제공한다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열, L-쓰레오닌 디하이드라타아제, 이의 변이체, 폴리뉴클레오티드, 벡터 및 미생물에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 미생물은 코리네박테리움 속일 수 있고, 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원에서 용어, "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및 유가식일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "배지"는 상기 미생물을 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 출원의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 출원의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
구체적으로, 코리네박테리움 속 균주에 대한 배양 배지는 문헌["Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에서 찾아 볼 수 있다.
본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 미생물의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
배지의 온도는 20℃내지 50℃, 구체적으로는 30℃ 내지 37℃ 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 배양 기간은 유용 물질의 원하는 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 10 시간 내지 100 시간일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 배양에 의하여 생산된 L-이소류신은 배지 중으로 배출되거나 미처 배출되지 못하고 세포 내에 잔류할 수 있다.
본 출원의 L-이소류신 생산 방법은 상기 배양에 따른 배지 또는 상기 미생물로부터 L-이소류신을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 L-이소류신을 회수하는 방법은 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 L-이소류신을 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파괘, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 및 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 L-이소류신을 회수할 수 있다.
상기 생산 방법은 추가적인 정제 공정을 포함할 수 있다. 상기 정제 공정은 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 회수된 L-이소류신을 정제할 수 있다. 따라서, 상기의 회수되는 L-이소류신은 정제된 형태, 혹은 목적 산물을 함유한 미생물 발효액일 수 있다(Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A. J. Nair., 2008).
본 출원의 다른 하나의 양태는본 출원의 L-쓰레오닌 디하이드라타아제의 변이체; 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 중 어느 하나 이상을 포함하는, L-이소류신을 생산하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는, L-이소류신 생산용 조성물을 제공한다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열, L-쓰레오닌 디하이드라타아제, 이의 변이체, 폴리뉴클레오티드, 벡터 및 미생물에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 미생물은 코리네박테리움 속일 수 있고, 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 L-이소류신 생산용 조성물은 본 출원의 L-쓰레오닌 디하이드라타아제의 변이체에 의해 L-이소류신을 생산할 수 있는 조성물을 의미할 수 있다. 상기 조성물은 상기 L-쓰레오닌 디하이드라타아제의 변이체 또는 상기 L-쓰레오닌 디하이드라타아제의 변이체를 작동시킬 수 있는 구성을 제한없이 포함할 수 있다. 상기 L-쓰레오닌 디하이드라타아제의 변이체는 도입된 숙주 세포에서 작동가능하게 연결된 유전자를 발현시킬 수 있도록 벡터 내에 포함된 형태일 수 있다.
상기 조성물은 동결보호제 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 동결보호제 또는 부형제는 비자연적으로 발생한(non-naturally occurring) 물질 또는 자연적으로 발생한 물질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또 하나의 구체 예로, 상기 동결보호제 또는 부형제는 상기 미생물이 자연적으로 접촉하지 않는 물질, 또는 상기 미생물과 자연적으로 동시에 포함되지 않는 물질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니며, 본 출원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.
실시예 1: L-쓰레오닌 디하이드라타아제 활성을 갖는 ilvA 변이체(F383A) 플라스미드 제작
L-이소류신의 생산능이 향상된 미생물 변이주를 얻기 위해 하기와 같은 방법을 사용하여 미생물의 변이를 유도하였다.
L-쓰레오닌 디하이드라타아제(L-Threonine dehydratase, TD)를 코딩하는 유전자인 ilvA(서열번호 2)를 증폭하기 위하여, 기보고된 F383A 변이가 도입된 ilvA 서열(World J Microbiol Biotechnol (2015) 31:1369-1377)에 근거하여 프로모터 부위(개시코돈 상단 약 300bp)로부터 터미네이터 부위(종결코돈 하단 약 100bp)까지 증폭하기 위한 프라이머(서열번호 11 및 서열번호 12)의 양 말단에 BamHI 제한 효소 부위를 삽입하였다. 또한, ilvA에 F383A 변이를 도입하기 위한 프라이머(서열번호 13 및 서열번호 14)를 사용하였다. 여기에서 사용된 프라이머 서열은 하기 표 1과 같다.
서열번호 |
명칭 |
서열 |
11 |
primer1 |
ggatccGACTGAGCCTGGGCAACTGG |
12 |
primer2 |
ggatccCCGTCACCGACACCTCCACA |
13 |
primer3 |
ACATCACGCTGgcaGAGTACCTCAA |
14 |
primer4 |
TTGAGGTACTCtgcCAGCGTGATGT |
야생형 코리네박테리움 글루타미쿰(wild type Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 11 및 서열번호 14, 서열번호 12 및 서열번호 13의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 90초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
그 결과, ilvA 유전자의 변이를 중심으로 5' 상단 부위의 1460 bp의 DNA 단편과 3' 하단 부위의 276 bp DNA 단편을 수득하였다.
증폭된 두 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 서열번호 11 및 서열번호 12의 프라이머로 PCR을 수행하였다.
그 결과, 383번째 페닐알라닌이 알라닌으로 치환된 ilvA 변이(서열번호 7)를 포함하는 1531 bp의 DNA 단편이 증폭되었다. pECCG117(대한민국 등록특허 제10-0057684호) 벡터와 ilvA DNA 단편을 제한 효소 BamHI으로 처리하고, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였고 이를 pECCG117-ilvA(F383A)라 명명하였다.
실시예 2: L-쓰레오닌 디하이드라타아제 활성을 갖는 ilvA 변이체 플라스미드 제작
L-쓰레오닌 디하이드라타아제를 코딩하는 유전자의 변이체를 얻기 위해 무작위 돌연변이 키트(random mutagenesis kit, Agilent Technologies, 미국)를 이용하여 ilvA 변이체 유전자 플라스미드를 제조하였다. 실시예 1의 ilvA(F383A) 염색체를 주형으로 하여 서열번호 11 및 서열번호 12의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 90초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 10분간 중합반응을 수행하였다.
그 결과, 383번째 페닐알라닌이 알라닌으로 치환된 변이 외에 추가적인 무작위 변이를 가진 L-쓰레오닌 디하이드라타아제를 암호화할 수 있는 ilvA 변이체인 1531 bp의 DNA 단편이 증폭되었다. pECCG117 벡터와 ilvA 변이체 DNA 단편을 제한 효소 BamHI으로 처리하고, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 클로닝함으로써 플라스미드군을 획득하였다.
실시예 3: L-이소류신 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 균주 제작 및 평가
야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032를 이용하여 L-이소류신 생산 균주를 제작하였다. 구체적으로, L-이소류신 생합성 경로에서 이소류신의 전구체인 쓰레오닌의 피드백 저해 해소를 위해 호모세린 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자인 hom의 407번째 아미노산인 알지닌(Arginine)을 히스티딘(Histidine)으로 치환하였다(미국공개공보 US 2020-0340022 A1, 서열번호 17)
더 구체적으로, hom(R407H) 변이가 도입된 균주들을 제작하기 위해 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 18 및 서열번호 19 혹은 서열번호 20 및 서열번호 21의 프라이머를 이용하여 PCR을 각각 수행하였다. 여기에서 사용된 프라이머 서열은 하기 표 2와 같다.
서열번호 |
명칭 |
서열 |
18 |
primer5 |
TCGAGCTCGGTACCCCGCTTTTGCACTCATCGAGC |
19 |
primer6 |
CACGATCAGATGTGCATCATCAT |
20 |
primer7 |
ATGATGATGCACATCTGATCGTG |
21 |
primer8 |
CTCTAGAGGATCCCCGAGCATCTTCCAAAACCTTG |
PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 1분을 28회 반복하였다.
그 결과, hom 유전자의 변이를 중심으로 5' 상단 부위의 1000 bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 1000 bp의 DNA 단편을 각각 수득하였다.
증폭된 두 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 서열번호 18 및 서열번호 21의 프라이머로 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 2분 중합을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
그 결과, 407번째 알지닌이 히스티딘으로 치환된 호모세린 디하이드로게나제 변이체를 코딩하는 hom 유전자의 변이를 포함하는 2 kb의 DNA 단편이 증폭되었다. 증폭 산물을 PCR 정제 키트(PCR Purification kit, QUIAGEN)를 사용하여 정제하여 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다. 정제한 증폭 산물을 제한효소 smaI으로 처리한 후, 65℃에서 20분간 열처리한 pDZ 벡터(미국등록공보 US 9109242 B2)와 상기 증폭 산물인 삽입 DNA 단편의 몰농도(M) 비율이 1:2가 되도록 하고, 인퓨전 클로닝 키트(Infusion Cloning Kit, TaKaRa)를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 hom(R407H) 변이를 염색체상에 도입하기 위한 벡터 pDZ-R407H를 제작하였다.
제작된 벡터를 전기천공법으로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 hom(R407H) 변이를 포함하는 균주를 얻었으며, 이를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 hom(R407H)로 명명하였다.
실시예 4: ilvA 변이체 도입 L-이소류신 생산 균주의 L-이소류신 생산능 평가
상기 실시예 2에서 얻어진 변이체의 L-이소류신 생산성을 확인하기 위해 하기와 같은 방법으로 균주를 제작하였다. 구체적으로, 실시예 3에서 제작한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 hom(R407H) 균주에 실시예 1에서 제작한 플라스미드를 도입하였고, 제작한 플라스미드를 도입한 균주는 ATCC 13032 hom(R407H)/pECCG117-ilvA(F383A)로 명명하였다. 또한 실시예 2에서 얻어진 변이체 플라스미드군을 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 hom(R407H) 균주에 도입하였고, 최소배지에 도말하여 사멸율을 구해본 결과 사멸율은 70 %였으며 생존한 세포들을 종배지에 접종 배양, 최종적으로 ATCC 13032 hom(R407H)/pECCG117-ilvA(F383A) 대조군보다 우수한 이소류신 생산능을 나타내는 변이주를 선별하여 코리네박테리움 글루타미쿰 CJILE-301(Corynebacterium glutamicum, CJILE-301)로 명명하였다.
상기 균주를 이소류신 생산배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바풀 플라스크에 접종한 후, 32℃에서 60시간동안 200 rpm으로 진탕 배양하여 L-이소류신을 제조하였다. 본 실시예에서 사용한 생산배지의 조성은 하기와 같다.
<종배지>
포도당 5%, 박토펩톤 1%, 소듐클로라이드 0.25%, 효모추출물 1%, 요소 0.4%, pH 7.2
<최소배지>
포도당 1.0%, 황산암모늄 0.4%, 황산마그네슘 0.04%, 인산제1칼륨 0.1%, 요소 0.1%, 티아민 0.001%, 비오틴 200 ㎍/L, 한천 2%, pH 7.2
<생산배지>
포도당 10%, 효모추출물 0.2%, 황산암모늄 1.6%, 제1인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘7수염 0.1%, 황산철7수염 10mg/L, 황산망간1수염 10 mg/L, 비오틴 200 ㎍/L, pH 7.2
배양종료 후, 액체고속크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 배양액 중의 L-이소류신과 L-쓰레오닌 농도를 측정하고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
균주명 |
L-이소류신 농도 (g/L) |
L-쓰레오닌 농도 (g/L) |
ATCC 13032 hom(R407H) /pECCG117-ilvA(F383A) (모균주) |
2.5 |
1.5 |
CJILE-301 (변이주) |
4.3 |
0.0 |
상기 표 3에 나타난 바와 같이, 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 hom(R407H)/pECCG117-ilvA(F383A)은 2.5 g/L의 농도로 L-이소류신을 생산하였으나, 본 출원에 따른 변이주 코리네박테리움 글루타미쿰 CJILE-301은 4.3 g/L의 농도로 L-이소류신을 생산하여, 모균주에 비해 약 172% L-이소류신 생산성이 증가한 것을 확인하였다. 또한 잔여 L-쓰레오닌 농도가 1.5 g/L에서 0.0 g/L로 감소하여 쓰레오닌에 대한 ilvA의 활성이 증가된 것으로 확인되었다.
상기의 결과를 바탕으로 CJILE-301균주로부터 플라스미드를 분리하여 ilvA 유전자를 시퀀싱 한 결과, ilvA 유전자의 1141번째 염기서열이 A에서 G로 치환되어 ilvA 단백질의 383번째 F가 A로 치환된 변이 외에 추가로 381번째 T가 A로 치환된 변이 단백질을 암호화할 수 있음을 확인하였으며, 이는 서열번호 22로 나타내었다.
상기의 결과는 무작위 돌연변이법을 통해 얻어진 실시예 2의 ilvA 변이체(T381A)를 도입한 균주가 결과적으로 L-이소류신을 고효율 및 고수율로 생산할 수 있음을 의미한다.
실시예 5: L-쓰레오닌 디하이드라타아제 활성을 갖는 ilvA(T381A) 및 ilvA(T381A, F383A) 변이체 도입 균주 제작
상기 실시예 4에서 확인된 ilvA 변이체(T381A, F383A)를 야생형 균주로 도입하기 위하여 서열번호 31 및 서열번호 32의 프라이머를 제작하였다.
ilvA 변이체(T381A, F383A)가 도입된 균주를 제작하기 위해 실시예 4의 CJILE-301 균주로부터 추출한 플라스미드 DNA를 주형으로 서열번호 31 및 서열번호 32의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 여기에서 사용된 프라이머 서열은 하기 표 4와 같다.
서열번호 |
명칭 |
서열 |
31 |
primer9 |
TCGAGCTCGGTACCCATGAGTGAAACATACGTGTC |
32 |
primer10 |
CTCTAGAGGATCCCCCGTCACCGACACCTCCACA |
PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 95℃ 30초; 어닐링 55℃ 30초; 및 중합반응 72℃, 2분을 28회 반복하였다.
그 결과, 1311bp인 ilvA 유전자의 약 100bp 터미네이터 부위를 포함한 1411bp의 유전자 단편을 각각 수득하였다.
증폭 산물을 PCR 정제 키트를 사용하여 정제하고, 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다. 정제한 증폭 산물을 제한효소 smaI으로 처리한 후, 65℃에서 20분간 열처리한 pDZ벡터와 상기 증폭 산물인 삽입 DNA 단편의 몰농도(M) 비율이 1:2가 되도록 하고 인퓨전 클로닝 키트를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 T381A, F383A 변이를 염색체상에 도입하기 위한 벡터 pDZ-T381A_F383A를 제작하였다.
제작된 벡터를 전기천공법에 의해 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 hom(R407H)에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 ilvA(T381A, F383A) 변이를 포함하는 균주를 얻었으며, 이를 CA10-3101으로 명명하였다.
상기 균주 CA10-3101은 2020년 5월 27일자로 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 국제기탁하여 KCCM12739P로 기탁번호를 부여받았다.
또한 ilvA(T381A) 단독 변이형의 이소류신 생산능 및 쓰레오닌 분해 효과를 확인하기 위해 서열번호 47 및 서열번호 48의 프라이머를 제작하였다.
ilvA 변이체(T381A)가 도입된 균주를 제작하기 위해 Cgl13032 게놈 DNA를 주형으로 서열번호 31 및 서열번호 48, 그리고 서열번호 32 및 서열번호 47의 프라이머를 사용하여 PCR을 각각 수행하였다. 여기에서 사용된 프라이머 서열은 하기 표 5와 같다.
서열번호 |
명칭 |
서열 |
47 |
primer47 |
CCGGATGATGACATCgctCTGTTTGAGTACCTC |
48 |
primer48 |
TCAAACAGagcGATGTCATCATCCGG |
PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 95℃ 30초; 어닐링 55℃ 30초; 및 중합반응 72℃ 2분을 28회 반복하였다.
그 결과, 1166 bp와 ilvA 유전자의 약 100bp 터미네이터 부위를 포함한 301 bp의 유전자 단편을 각각 수득하였다.
증폭된 두 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 서열번호 31 및 서열번호 32의 프라이머로 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95℃에서 10분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 56℃ 30초 어닐링, 72℃ 2분 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 10분간 중합반응을 수행하였다.
그 결과, 1311bp의 ilvA 유전자와 약 100bp 터미네이터 부위를 포함한 1411bp의 유전자 단편을 수득하였다.
증폭 산물을 PCR 정제 키트를 사용하여 정제하고, 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다. 정제한 증폭 산물을 제한효소 smaI으로 처리한 후, 65℃에서 20분간 열처리한 pDZ 벡터와 상기 증폭 산물인 삽입 DNA 단편의 몰농도(M) 비율이 1:2가 되도록 하고 인퓨전 클로닝 키트를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 T381A 변이를 염색체상에 도입하기 위한 벡터 pDZ-T381A를 제작하였다.
제작된 벡터를 전기천공법에 의해 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 hom(R407H)에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 ilvA(T381A) 변이를 포함하는 균주를 얻었으며, 이를 ATCC13032 hom(R407H) ilvA(T381A)으로 명명하였다.
상기 균주를 이소류신 생산배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바풀 플라스크에 접종한 후, 32℃에서 60시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하여 L-이소류신을 제조하였다. 본 실시예에서 사용한 생산배지의 조성은 하기와 같다.
<생산배지>
포도당 10%, 효모추출물 0.2%, 황산암모늄 1.6%, 제1인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘7수염 0.1%, 황산철7수염 10mg/L, 황산망간1수염 10 mg/L, 비오틴 200 ㎍/L, pH 7.2
배양종료 후, 고성능액체크로마토그래피(high-performance liquid chromatography, HPLC)를 이용하여 배양액 중의 L-이소류신과 L-쓰레오닌 농도를 측정하고, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
균주명 |
L-이소류신 (g/L) |
L-쓰레오닌(g/L) |
ATCC 13032 hom(R407H) |
0.0 |
3.8 |
ATCC 13032 hom(R407H) ilvA(WT) |
0.0 |
3.7 |
ATCC 13032 hom(R407H) ilvA(T381A) |
0.5 |
3.3 |
CA10-3101(ATCC 13032 hom(R407H) ilvA(T381A, F383A)) |
3.3 |
0.0 |
상기 표 6에 나타난 바와 같이, 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 hom(R407H)은 L-이소류신을 생산하지 못하였으나 ATCC 13032 hom(R407H) ilvA(T381A) 단독 변이주는 L-쓰레오닌이 줄면서 0.5 g/L의 농도로 L-이소류신을 생산하여, 모균주에 비해 L-이소류신 생산성이 증가한 것을 확인하였다. 또한 F383A 변이를 추가로 포함하는 ATCC 13032 hom(R407H) ilvA(T381A, F383A) 변이주는 3.9 g/L의 농도로 L-이소류신을 생산하여, 모균주에 비해 L-이소류신 생산성이 현저하게 증가한 것을 확인하였다.
실시예 6: L-쓰레오닌 디하이드라타아제 활성을 갖는 ilvA 변이체 벡터 제작
상기 실시예 4을 통해 밝혀낸 L-이소류신 생산능이 높은 ilvA 변이 위치에 다른 아미노산이 치환된 변이형을 제작하여 그 효과를 확인하였다. 구체적으로, 실시예 3에서 제작된 플라스미드를 주형으로 사용하여 ilvA의 381번째 아미노산 위치에 다른 아미노산이 치환된 7종의 변이체를 제작하였다. 각각의 변이체, 치환된 아미노산 및 각 변이체 제작에 사용된 프라이머 서열은 하기 표 7에 나타내었다.
유전자 |
치환 아미노산 |
프라이머 서열번호 |
ilvA |
T381S |
서열번호 3, 33 / 서열번호 34, 4 |
T381P |
서열번호 3, 35 / 서열번호 36, 4 |
T381Q |
서열번호 3, 37 / 서열번호 38, 4 |
T381V |
서열번호 3, 39 / 서열번호 40, 4 |
T381I |
서열번호 3, 41 / 서열번호 42, 4 |
T381G |
서열번호 3, 43 / 서열번호 44, 4 |
T381M |
서열번호 3, 45 / 서열번호 46, 4 |
상기 표 7에서 사용된 프라이머 서열은 하기 표 8과 같다.
서열번호 |
명칭 |
서열 |
33 |
primer15 |
AGGTACTCtgcCAGggaGATGTCAT |
34 |
primer16 |
ATGACATCtccCTGgcaGAGTACCT |
35 |
primer21 |
AGGTACTCtgcCAGtggGATGTCAT |
36 |
primer22 |
ATGACATCccaCTGgcaGAGTACCT |
37 |
primer27 |
AGGTACTCtgcCAGctgGATGTCAT |
38 |
primer28 |
ATGACATCcagCTGgcaGAGTACCT |
39 |
primer33 |
AGGTACTCtgcCAGaacGATGTCAT |
40 |
primer34 |
ATGACATCgttCTGgcaGAGTACCT |
41 |
primer35 |
AGGTACTCtgcCAGgatGATGTCAT |
42 |
primer36 |
ATGACATCatcCTGgcaGAGTACCT |
43 |
primer41 |
AGGTACTCtgcCAGgccGATGTCAT |
44 |
primer42 |
ATGACATCggcCTGgcaGAGTACCT |
45 |
primer45 |
AGGTACTCtgcCAGcatGATGTCAT |
46 |
primer46 |
ATGACATCatgCTGgcaGAGTACCT |
상기 표 7 및 표 8에서 제시한 각각의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제(SolGent co., Ltd.)를 사용하였으며, PCR 조건은 95℃에서 10분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 56℃ 30초 어닐링, 72℃ 90초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
그 결과, ilvA 유전자의 변이를 중심으로 5' 상단 부위의 1457 bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 279 bp의 DNA 단편을 수득하였다.
증폭된 두 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 서열번호 11 및 서열번호 12의 프라이머로 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95℃에서 10분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 56℃ 30초 어닐링, 72℃ 2분 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 10분간 중합반응을 수행하였다.
그 결과, 381번째 쓰레오닌이 표 3의 각 아미노산으로 치환된 쓰레오닌 디하이드라타아제 변이체를 암호화하는 ilvA 유전자의 변이를 포함하는 1736 bp의 DNA 단편이 증폭되었다. pECCG117 벡터와 PCR을 통해 수득한 1736 bp의 ilvA DNA 단편을 제한 효소 BamHI으로 처리하고, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였다. 이로써 381번째 쓰레오닌이 표 3에 나타낸 아미노산으로 치환된 7종의 ilvA 변이체 벡터가 제작되었고, 이들은 하기 표 9와 같이 명명하였다.
유전자 |
치환 아미노산 |
ilvA 변이체 벡터 명칭 |
ilvA |
T381S |
pECCG117-ilvA(T381S, F383A) |
T381P |
pECCG117-ilvA(T381P, F383A) |
T381Q |
pECCG117-ilvA(T381Q, F383A) |
T381V |
pECCG117-ilvA(T381V, F383A) |
T381I |
pECCG117-ilvA(T381I, F383A) |
T381G |
pECCG117-ilvA(T381G, F383A) |
T381M |
pECCG117-ilvA(T381M, F383A) |
실시예 7: L-쓰레오닌 디하이드라타아제 활성을 갖는 ilvA 변이체 도입 균주의 L-이소류신 생산능 평가
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 유래의 아스파토키나아제를 코딩하는 lysC 유전자에 lysC 유전자의 발현 강화와 L-리신(L-Lysine) 및 L-쓰레오닌(L-Threonine)에 대한 피드백 저해 해제를 위한 변이(L377K)(미국등록공보 US 10662450 B2)를 도입하고, 상기 변이형 lysC 유전자를 포함하는 벡터를 제작하기 위하여, 변이 위치를 중심으로 5' 상단 부위를 증폭하기 위한 프라이머 한 쌍(서열번호 50 및 서열번호 51)과 3' 하단 부위를 증폭하기 위한 프라이머 한쌍(서열번호 52 및 서열번호 53)을 고안하였다. 서열번호 50 및 53의 프라이머는 각 말단에 Xba I, SalI 제한 효소 부위를 삽입하였고, 서열번호 51 및 52의 프라이머는 서로 교차되도록 고안하였으며 이 부위에 뉴클레오티드 치환 변이가 위치하도록 하였다. 프라이머 서열은 하기 표 10과 같았다.
서열번호 |
명칭 |
서열 |
서열번호 50 |
lysC_L377K_5 F |
tcctctagaGCTGCGCAGTGTTGAATACG |
서열번호 51 |
lysC_L377K_5 R |
AGGTGGAAATCTTTTCGATGTTC |
서열번호 52 |
lysC_L377K_3 F |
GAACATCGAAAAGATTTCCACCT |
서열번호 53 |
lysC_L377K_3 R |
gactctagaGTTCACCTCAGAGACGATTA |
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 50 및 서열번호 51, 서열번호 52 및 서열번호 53의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초 어닐링, 72℃에서 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다.
그 결과, lysC 유전자의 변이를 중심으로 5' 상단 부위의 512 bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 522 bp의 DNA 단편을 수득하였다.
증폭된 두 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 서열번호 50 및 서열번호 53의 프라이머로 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초 어닐링, 72℃에서 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다.
그 결과, 377번째 루이신이 라이신으로 치환된 아스파토키나아제 변이체를 코딩하는 변이 lysC(L377K) 유전자(서열번호 49)를 포함하는 1011 bp의 DNA 단편이 증폭되었다.
상기 PCR을 통하여 획득한 lysC(L377K) PCR 단편 말단에 포함된 제한효소 XbaI, SalI을 처리하고, 제한효소 XbaI, SalI가 처리된 pDZ(KR 2008-0025355) 벡터에 접합(ligation)하여 클로닝함으로써 최종적으로 lysC(L377K) 치환 카세트가 클로닝된 pDZ-lysC(L377K) 재조합 벡터를 제작하였다.
제작된 pDZ-lysC(L377K) 벡터를 실시예 3의 ATCC13032 hom(R407H) 균주에 전기펄스법으로 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 lysC 유전자에 변이가 도입된 코리네박테리움 ATCC 13032 hom(R407H) lysC(L377K)을 수득하였다. 상기 변이가 도입된 유전자는 서열번호 50과 53의 프라이머를 이용한 PCR 수행 후 시퀀싱을 통해 야생형 lysC 유전자의 서열과 비교하여 최종 확인하였다.
실시예 6에서 제작된 ilvA 변이체 벡터 7종과 실시예 4의 CJILE-301 균주로부터 추출한 pECCG117-ilvA(T381A, F383A)를 상기 제작된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 hom(R407H) lysC(L377K) 균주에 전기펄스법으로 도입한 후 카나마이신(kanamycin) 25 mg/L를 함유한 선별배지에 도말하여 각각의 형질전환주를 획득하였다. 그 후, 실시예 4와 동일한 방법으로 배양액 중의 L-이소류신과 L-쓰레오닌 농도를 측정하고, 그 결과를 하기 표 11에 나타내었다.
균주명 |
L-이소류신 (g/L) |
L-쓰레오닌(g/L) |
ATCC 13032 hom(R407H) lysC(L377K) |
0.0 |
3.5 |
ATCC 13032 hom(R407H) lysC(L377K)/pECCG117-ilvA(F383A) |
2.3 |
1.5 |
ATCC 13032 hom(R407H) lysC(L377K)/pECCG117-ilvA(T381A, F383A) |
4.3 |
0.0 |
ATCC 13032 hom(R407H) lysC(L377K)/pECCG117-ilvA(T381S, F383A) |
2.7 |
1.1 |
ATCC 13032 hom(R407H) lysC(L377K)/pECCG117-ilvA(T381P, F383A) |
2.9 |
1.4 |
ATCC 13032 hom(R407H) lysC(L377K)/pECCG117-ilvA(T381Q, F383A) |
2.6 |
1.3 |
ATCC 13032 hom(R407H) lysC(L377K)/pECCG117-ilvA(T381V, F383A) |
3.0 |
0.7 |
ATCC 13032 hom(R407H) lysC(L377K)/pECCG117-ilvA(T381I, F383A) |
3.8 |
0.2 |
ATCC 13032 hom(R407H) lysC(L377K)/pECCG117-ilvA(T381G, F383A) |
3.2 |
0.5 |
ATCC 13032 hom(R407H) lysC(L377K)/pECCG117-ilvA(T381M, F383A) |
2.5 |
1.2 |
상기 표 11에 나타난 바와 같이, ilvA의 T381A, T381S, T381P, T381Q, T381V, T381I, T381G, T381M 변이체가 야생형보다 쓰레오닌 분해율이 높고 L-이소류신 생산능이 증가한 것을 확인하였다.
실시예 8: L-이소류신 생산 균주에서의 쓰레오닌 디하이드라타아제 활성을 갖는 변이형 ilvA의 L-이소류신 생산능 평가
실시예 7에서 L-이소류신 생산능 증가가 가장 우수한 것으로 나타난 ilvA(T381A, F383A) 변이를 NTG(N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine) 처리된 L-이소류신 생산 균주인 KCJI-38(KCCM11248P, 대한민국 등록특허 제10-1335789호) 균주에 전기펄스법으로 도입한 후 카나마이신 25mg/L를 함유한 선별배지에 도말하여 각각의 형질전환주를 획득하였다. 그 후, 실시예 4와 동일한 방법으로 배양액 중의 L-이소류신과 L-쓰레오닌 농도를 측정하고, 그 결과를 하기 표 12에 나타내었다.
균주명 |
L-이소류신 (g/L) |
L-쓰레오닌(g/L) |
KCCM11248P |
1.5 |
0.5 |
KCCM11248P/pECCG117-ilvA(F383A) |
2.8 |
0.6 |
KCCM11248P/pECCG117-ilvA(T381A, F383A) |
4.0 |
0.0 |
상기 표 12에 나타난 바와 같이, ilvA(F381T, F383A) 변이를 도입한 KCCM11248P/pECCG117-ilvA(T381A, F383A) 균주는 KCCM11248P 또는 KCCM11248P/pECCG117-ilvA(F383A) 균주에 비해 L-이소류신 생산이 현저히 증가하고, L-쓰레오닌 분해율이 높은 것을 확인하였다.
이상의 결과들은 본 출원의 ilvA 변이체가 L-이소류신의 생산을 증가시킬 수 있음을 시사하는 것이다. 또한, ilvA 유전자의 381번 위치의 변이는 L-쓰레오닌이 분해되기 위해 결합되는 것을 도와주는 변이임을 확인함에 따라, 상기 변이는 L-이소류신의 생산을 증가시키는 역할을 하는 것으로 확인되었다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.