WO2021242032A1 - 신규 l-타이로신 배출 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-타이로신을 생산하는 방법 - Google Patents

신규 l-타이로신 배출 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-타이로신을 생산하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2021242032A1
WO2021242032A1 PCT/KR2021/006621 KR2021006621W WO2021242032A1 WO 2021242032 A1 WO2021242032 A1 WO 2021242032A1 KR 2021006621 W KR2021006621 W KR 2021006621W WO 2021242032 A1 WO2021242032 A1 WO 2021242032A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
tyrosine
seq
amino acid
protein
present application
Prior art date
Application number
PCT/KR2021/006621
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김현아
김희정
정무영
서창일
송규현
Original Assignee
씨제이제일제당 (주)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 씨제이제일제당 (주) filed Critical 씨제이제일제당 (주)
Priority to US17/999,788 priority Critical patent/US20230272441A1/en
Priority to CN202180047331.9A priority patent/CN116472352A/zh
Priority to EP21813776.8A priority patent/EP4144848A4/en
Priority to BR112022023964A priority patent/BR112022023964A2/pt
Priority to JP2022572662A priority patent/JP2023527830A/ja
Publication of WO2021242032A1 publication Critical patent/WO2021242032A1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
    • C12P13/225—Tyrosine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15—Corynebacterium

Definitions

  • the present application relates to a novel protein variant having L-tyrosine excretion activity, a microorganism for producing L-tyrosine including the protein variant, and a method for producing L-tyrosine using the microorganism.
  • L-Tyrosine is one of the amino acids and is used as an important material for pharmaceutical raw materials, food additives, animal feeds, and nutritional supplements.
  • various studies are being conducted for the development of high-efficiency production microorganisms and fermentation process technology.
  • the L-tyrosine production process of microorganisms is a polymerization reaction between E4P (Erythrose-4-Phosphate), an intermediate material of the pentose cycle, and PEP (Phosphoenolpyruvate), an intermediate material of glycolysis (3-Deoxy-D DAHP) -arobino-heptulosonate-7-phosphate). Thereafter, DAHP is finally converted to L-tyrosine through the L-tyrosine biosynthetic pathway through the aromatic common biosynthetic pathway through the chorismate to the prephenate.
  • E4P Erythrose-4-Phosphate
  • PEP Phosphoenolpyruvate
  • DAHP is finally converted to L-tyrosine through the L-tyrosine biosynthetic pathway through the aromatic common biosynthetic pathway through the chorismate to the prephenate.
  • the expression of a specific amino acid excretion gene has caused improvement in the productivity of the corresponding amino acid in microorganisms.
  • Enhancing the expression of the L-lysine export gene (lysE ) of microorganisms of the genus Corynebacterium improved the productivity of lysine (US 6858406 B1).
  • the enhancement of the rhtC gene in E. coli improved resistance to L-threonine, and at the same time, the productivity of L-homoserine, L-threonine, and L-leucine was improved (EP1013765A1).
  • the present application relates to a protein variant in which the 79th amino acid is substituted with another amino acid from the N-terminus in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52; a polynucleotide encoding it; And it provides a vector comprising the polynucleotide.
  • the present application relates to the protein variant; a polynucleotide encoding it; And it provides a microorganism for producing L-tyrosine, including one or more of the vector containing the polynucleotide.
  • the present application provides a method for producing L-tyrosine comprising culturing the microorganism.
  • the present application relates to the protein variant, the polynucleotide; It provides a composition for producing L-tyrosine comprising any one or more of the vector and the microorganism.
  • the microorganism expressing the protein variant of the present application can dramatically improve the production of L-tyrosine compared to the parent strain that does not express it, it can effectively produce L-tyrosine by using it.
  • One aspect of the present application provides a protein variant having L-tyrosine excretion activity, wherein one or more amino acids are substituted with other amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52.
  • the protein variant may be a protein variant having L-tyrosine excretion activity in which the 79th amino acid from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52 is substituted with another amino acid.
  • L-Tyrosine of the present application is one of 20 ⁇ -amino acids, and may be classified as a polar amino acid or an aromatic amino acid. Tyrosine is a commercially important amino acid used as a precursor for pharmaceuticals, flavonoids, and alkanoids.
  • a protein having L-tyrosine excretion activity may be a protein having an activity capable of specifically excreting L-tyrosine out of a cell.
  • the protein variant having L- tyrosine excretion activity of the present application may be derived from a protein having L-tryptophan excretion activity derived from Herbaspillium rhizosphaerae, but is not limited thereto.
  • Herbaspillium rhizosphaerae is a gram-negative bacterium belonging to the genus Herbaspillium, and in Korea, it is a strain isolated from Ulleungdo, etc., and can be isolated from the rhizosphere in the soil.
  • the Herbaspillium rhizosphaerae- derived protein having L-tryptophan excretion activity may be, for example, a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52, but the same as the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52 A sequence that has activity and can have L-tyrosine excretion ability by substituting another amino acid of the present application in which the sequence corresponding to position 79 of SEQ ID NO: 52 is not wild-type has an amino acid mutation of the residue corresponding to position 79 It is obvious that the target protein that occurs is included in the scope of the present application without limitation on its origin.
  • the protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52 may be used in combination with the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52 and the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52.
  • the protein having L-tyrosine excretion activity of the present application may be a variant of the protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52.
  • the protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52 is a protein having L-tryptophan excretion activity, and as of the present application, it is determined that the mutant in which the amino acid corresponding to the 79th position of the protein is mutated has L-tyrosine excretion activity. newly identified.
  • the protein comprising the amino acid of SEQ ID NO: 52 is a representative example among proteins capable of introducing the mutation of the present application, and a meaningless sequence added before and after the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52 or a naturally occurring mutation, or a mutation thereof It does not exclude a latent mutation, and belongs to a protein capable of introducing a mutation in the present application if it has the same or corresponding activity as the protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52.
  • the protein capable of introducing a mutation in the present application may be a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52 or an amino acid sequence having 80%, 90%, 95%, or 97% or more homology or identity thereto. have.
  • a protein having an amino acid sequence in which some sequence is deleted, modified, substituted or added is also included within the scope of the protein subject to mutation of the present application. is self-evident
  • a polypeptide consisting of the amino acid sequence of the corresponding SEQ ID NO: It is apparent that a protein having an amino acid sequence in which some sequences have been deleted, modified, substituted or added may also be used in the present application, provided that it has the same or corresponding activity to .
  • a 'protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52' may belong to a 'protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52' if it has the same or corresponding activity.
  • variant means that one or more amino acids differ from the recited sequence in conservative substitution and/or modification, but the function of the protein ( Functions) or properties (properties) are maintained.
  • a variant differs from an identified sequence by several amino acid substitutions, deletions or additions. Such variants can generally be identified by modifying one or more amino acids in the amino acid sequence of the protein and evaluating the properties of the modified protein. That is, the ability of the variant may be increased, unchanged, or decreased compared to the native protein.
  • some variants may include variants in which one or more portions, such as an N-terminal leader sequence or a transmembrane domain, have been removed.
  • variants may include variants in which a portion is removed from the N- and/or C-terminus of the mature protein.
  • variant refers to terms such as variant, modified, mutated protein, variant polypeptide, mutation, etc. (in English, modified, modified protein, modified polypeptide, mutant, mutein, divergent, variant, etc.) may be used. , as long as it is a term used in a mutated meaning, it is not limited thereto.
  • the mutant may have increased activity of the mutated protein compared to the natural wild-type or unmodified protein, but is not limited thereto.
  • conservative substitution refers to substituting one amino acid with another amino acid having similar structural and/or chemical properties. Such variants may have, for example, one or more conservative substitutions while still retaining one or more biological activities. Such amino acid substitutions may generally occur based on similarity in the polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and/or amphipathic nature of the residues.
  • amino acids with electrically charged amino acids positively charged (basic) amino acids are arginine, lysine, and histidine
  • negatively charged (acidic) amino acids are glutamic acid and aspartic acid.
  • Amino acids with uncharged side chains are classified as including glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, phenylalanine, tryptophan, proline, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, and glutamine. can do.
  • variants may contain deletions or additions of amino acids that have minimal effect on the properties and secondary structure of the polypeptide.
  • the polypeptide can be conjugated with a signal (or leader) sequence at the N-terminus of the protein that is involved in the transfer of the protein either co-translationally or post-translationally.
  • the polypeptide may also be conjugated with other sequences or linkers to enable identification, purification, or synthesis of the polypeptide.
  • 'substitution with another amino acid' is not limited as long as it is an amino acid different from the amino acid before the substitution. It can be expressed as "the 79th amino acid from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52 is substituted with another amino acid".
  • the amino acid is substituted with an amino acid different from the amino acid before the substitution, even if it is not separately indicated that it is substituted with another amino acid.
  • the protein variant of the present application may be a variant in which the 79th amino acid from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52 is substituted with another amino acid, but is not limited thereto.
  • the 79th amino acid from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52 is substituted with alanine, glycine, isoleucine, methionine, serine, proline, threonine, tyrosine, asparagine, arginine or tryptophan It may be a variant, but is not limited thereto.
  • the protein variant of the present application may be a variant in which the 79th amino acid from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52 is substituted with alanine, glycine, isoleucine, methionine, threonine, tyrosine, asparagine, arginine or tryptophan.
  • the protein variant of the present application may be a variant in which the 79th amino acid from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52 is substituted with alanine or glycine.
  • the protein variant of the present application has enhanced L-tyrosine excretion ability compared to the protein before mutation.
  • the protein variant in which amino acid 79 is substituted with another amino acid from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52 of the present application is the N or C terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52, or an intermediate amino acid deletion / addition / insertion Even if it is described at a position other than 79, it is obvious that the amino acid corresponding to position 79 from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52 includes protein variants in which another amino acid is substituted.
  • protein variant having L-tyrosine excretion activity in the present application a protein variant in which amino acid 79 from the N-terminus of SEQ ID NO: 52 is substituted with another amino acid has been described, but the protein variant having L-tyrosine excretion activity of the present application is It is not limited to the variant of SEQ ID NO: 52, and in any amino acid sequence having the same activity or L-tyrosine excretion activity as the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52, "at position 79 from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52 It is apparent that variants having L-tyrosine excretion activity by replacing "corresponding amino acids" with other amino acids are also included in the scope of the protein variants of the present application.
  • amino acid corresponding to position 79 from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52 in any amino acid sequence can be identified through various sequence alignment methods known in the art.
  • the protein variant in which amino acid 79 is substituted with another amino acid from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52 of the present application is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52 or 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, It may be a protein comprising an amino acid sequence having 97%, 98%, or 99% or more homology or identity and wherein the amino acid corresponding to position 79 from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52 is substituted with another amino acid.
  • the protein variant of the present application may include the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 77 to 85. Specifically, it may consist essentially of the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 77 to 85, and more specifically, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: It may consist of any one of the amino acid sequences of 77 to 85.
  • the protein variant of the present application may consist of any one amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 77 to 83, and in another embodiment, the protein variant of the present application is SEQ ID NO: 1 or It may consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
  • the protein variants of the present application are, It may include any one of the amino acid sequence.
  • the protein variant of the present application may include any one of SEQ ID NOs: 1, 2, and SEQ ID NOs: 77 to 83.
  • the protein variant of the present application may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2. However, it is not limited thereto.
  • the protein variant of the present application may consist essentially of the amino acid sequence of the above-mentioned SEQ ID NO: or may consist of the amino acid sequence of the above-mentioned SEQ ID NO:, but is not limited thereto.
  • the protein variant is SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, 79th amino acid in the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 77 to 85 is fixed, and at least 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, amino acid sequences having 98%, or 99% homology or identity.
  • proteins having an amino acid sequence in which some sequences are deleted, modified, substituted or added other than position 79 are also included in the scope of the present application. self-evident
  • Homology and identity refer to the degree to which two given amino acid sequences or base sequences are related and can be expressed as percentages.
  • Sequence homology or identity of a conserved polynucleotide or polypeptide is determined by standard alignment algorithms, with default gap penalties established by the program used may be used. Substantially, homologous or identical sequences are generally at least about 50%, 60%, 70%, 80% of the entire or full-length sequence under moderate or high stringent conditions. or more than 90% hybrid. Hybridization is also contemplated for polynucleotides containing degenerate codons instead of codons in the polynucleotides.
  • Homology or identity to said polypeptide or polynucleotide sequence can be determined, for example, by the algorithm BLAST according to the literature [Karlin and Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)] or FASTA by Pearson (see Methods Enzymol., 183, 63, 1990). Based on such an algorithm BLAST, a program called BLASTN or BLASTX has been developed (refer to http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
  • Another aspect of the present application provides a polynucleotide encoding the protein variant.
  • polynucleotide refers to a DNA or RNA strand of a certain length or longer as a polymer of nucleotides in which nucleotide monomers are linked in a long chain by covalent bonds, and more specifically, encoding the protein variant. It means a polynucleotide fragment that
  • polynucleotide encoding the protein variant of the present application may be included without limitation as long as it is a polynucleotide sequence encoding a protein variant having L-tyrosine excretion ability.
  • the gene encoding the amino acid sequence of the protein to be mutated may be a wex gene, may be derived from Hubaspilium risospere, and specifically may be a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52 However, it is not limited thereto.
  • the polynucleotide encoding the protein variant of the present application is located in the coding region within a range that does not change the amino acid sequence due to codon degeneracy or in consideration of codons preferred in an organism to express the protein variant.
  • Various modifications may be made. Specifically, any polynucleotide sequence encoding a protein variant in which amino acid 79 is substituted with another amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52 may be included without limitation.
  • the polynucleotide of the present application is a protein variant of the present application, specifically, a protein comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 77 to 85, or homology or identity thereto. It may be a polynucleotide sequence encoding a protein having, but is not limited thereto. The homology or identity is the same as described above.
  • amino acid 79 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52 is substituted with another amino acid
  • Any sequence encoding a variant protein may be included without limitation.
  • stringent conditions means conditions that allow specific hybridization between polynucleotides. These conditions are specifically described in the literature (eg, J. Sambrook et al., supra). For example, genes with high homology between genes having homology of 40% or more, specifically 90% or more, more specifically 95% or more, still more specifically 97% or more, and particularly specifically 99% or more homology.
  • Hybridization requires that two polynucleotides have complementary sequences, although mismatch between bases is possible depending on the stringency of hybridization.
  • complementary is used to describe the relationship between nucleotide bases capable of hybridizing to each other. For example, with respect to DNA, adenosine is complementary to thymine and cytosine is complementary to guanine. Accordingly, the present application may also encompass substantially similar polynucleotide sequences as well as isolated polynucleotide fragments complementary to the overall sequence.
  • polynucleotides having homology can be detected using hybridization conditions including a hybridization step at a Tm value of 55° C. and using the conditions described above.
  • the Tm value may be 60 °C, 63 °C, or 65 °C, but is not limited thereto, and may be appropriately adjusted by those skilled in the art depending on the purpose.
  • Another aspect of the present application provides a vector comprising a polynucleotide encoding the protein variant.
  • the term "vector” refers to a DNA preparation containing the nucleotide sequence of a polynucleotide encoding the target protein operably linked to a suitable regulatory sequence so that the target protein can be expressed in a suitable host.
  • the regulatory sequences may include a promoter capable of initiating transcription, an optional operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and a sequence regulating the termination of transcription and translation. After transformation into an appropriate host cell, the vector can replicate or function independently of the host genome, and can be integrated into the genome itself.
  • the vector used in the present application is not particularly limited, and any vector known in the art may be used.
  • Examples of commonly used vectors include natural or recombinant plasmids, cosmids, viruses and bacteriophages.
  • pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, and Charon21A may be used as a phage vector or a cosmid vector
  • pBR-based, pUC-based, pBluescriptII-based plasmid vectors may be used.
  • pGEM-based, pTZ-based, pCL-based and pET-based and the like can be used.
  • pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC vectors and the like can be used.
  • a polynucleotide encoding a target protein in a chromosome may be replaced with a mutated polynucleotide through a vector for intracellular chromosome insertion. Insertion of the polynucleotide into a chromosome may be performed by any method known in the art, for example, homologous recombination, but is not limited thereto. It may further include a selection marker (selection marker) for confirming whether the chromosome is inserted.
  • the selection marker is used to select cells transformed with the vector, that is, to confirm whether a target nucleic acid molecule is inserted, and to confer a selectable phenotype such as drug resistance, auxotrophicity, resistance to cytotoxic agents, or surface protein expression. markers may be used. In an environment treated with a selective agent, only the cells expressing the selectable marker survive or exhibit other expression traits, so that the transformed cells can be selected.
  • Another aspect of the present application is the protein variant; a polynucleotide encoding it; And it provides a microorganism for producing L-tyrosine, including any one or more of the vector containing the polynucleotide.
  • the microorganism producing the L-tyrosine compared to the microorganism comprising the wild-type SEQ ID NO: 52, the protein mutant; a polynucleotide encoding it; And it may be a microorganism having an increased L-tyrosine production ability by including any one or more of the vectors including the polynucleotide.
  • the microorganism comprising any one or more of the vectors containing the polynucleotide may be a microorganism to which L-tyrosine-producing ability is conferred, but is not limited thereto.
  • microorganism producing L-tyrosine or "microorganism having L-tyrosine producing ability” may be a microorganism in which tyrosine producing ability is conferred to a microorganism having a natural tyrosine producing ability or a parent strain without tyrosine producing ability. have.
  • the microorganism may be a microorganism capable of producing an excess of L-tyrosine from a carbon source in the medium compared to a wild-type or unmodified microorganism.
  • the microorganism producing the L-tyrosine may be a recombinant microorganism.
  • the type of the microorganism is not particularly limited as long as it can produce L-tyrosine, but enterobacter genus, Escherichia genus, Erwinia genus, Serratia genus, pro It may be a microorganism belonging to the genus Providencia, the genus Corynebacterium, and the genus Brevibacterium.
  • it may be a microorganism belonging to the genus Corynebacterium or the genus Escherichia. More specifically, it may be a microorganism of the genus Corynebacterium, for example, Corynebacterium glutamicum, but may be, but is not limited thereto.
  • Escherichia microorganisms may be Escherichia coli
  • Corynebacterium genus microorganisms may be Corynebacterium glutamicum
  • L- Microorganisms belonging to the genus Escherichia or Corynebacterium that can increase L-tyrosine production by introducing or enhancing a protein having tyrosine excretion activity may be included without limitation.
  • the microorganism producing L-tyrosine including the vector including the polynucleotide may be a microorganism expressing the protein variant of the present application.
  • the term "to be/are expressed” refers to a state in which a target protein is introduced into a microorganism or modified to be expressed in the microorganism.
  • the target protein is a protein present in a microorganism, it refers to a state in which the activity is enhanced compared to before intrinsic or modification.
  • the microorganism expressing the protein variant of the present application may be a microorganism modified to express the protein variant, therefore, another aspect of the present application provides a method for producing a microorganism expressing the protein variant of the present application.
  • the "protein of interest” may be a protein variant having the above-described L-tyrosine excretion activity.
  • introduction of protein means that the activity of a specific protein that the microorganism did not originally have or exhibited an improved activity compared to the intrinsic activity or activity before modification of the protein.
  • a polynucleotide encoding a specific protein may be introduced into a chromosome in a microorganism, or a vector including a polynucleotide encoding a specific protein may be introduced into the microorganism to exhibit its activity.
  • enhancement of activity means that the activity is improved compared to the intrinsic activity of a specific protein of the microorganism or the activity before modification.
  • “Intrinsic activity” refers to the activity of a specific protein originally possessed by the parent strain before transformation when the trait of a microorganism is changed due to genetic variation caused by natural or artificial factors.
  • the enhancement of the activity of the present application includes increasing the intracellular copy number of the gene encoding the protein variant, a method of introducing a mutation into the expression control sequence of the gene encoding the protein variant, and the protein having the L-tyrosine excretion activity
  • a method of replacing a gene expression control sequence encoding a variant with a sequence with strong activity a method of replacing a gene encoding a native protein having L-tyrosine excretion activity on a chromosome with a gene encoding the protein variant, the protein variant It may consist of any one or more methods selected from the group consisting of a method of additionally introducing a mutation into the gene encoding the protein to enhance the activity of the protein, and a method of introducing a protein mutant into a microorganism, but is not limited thereto.
  • the increase in the copy number of the gene is not particularly limited thereto, but may be performed in a form operably linked to a vector or inserted into a chromosome in a host cell.
  • a vector capable of replicating and functioning independently of a host to which a polynucleotide encoding the protein of the present application is operably linked may be introduced into a host cell.
  • a vector capable of inserting the polynucleotide into a chromosome in the host cell, to which the polynucleotide is operably linked may be introduced into the chromosome of the host cell. Insertion of the polynucleotide into a chromosome may be accomplished by any method known in the art, for example, by homologous recombination.
  • modifying the expression control sequence to increase the expression of the polynucleotide is not particularly limited thereto, to further enhance the activity of the expression control sequence, deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution of the nucleic acid sequence, or their It can be carried out by inducing a mutation in the sequence in combination, or by replacing it with a nucleic acid sequence having a stronger activity.
  • the expression control sequence is not particularly limited thereto, but may include a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, a sequence for regulating the termination of transcription and translation, and the like.
  • a strong promoter may be linked to the upper portion of the polynucleotide expression unit instead of the original promoter, but is not limited thereto.
  • Examples of known strong promoters include cj1 to cj7 promoter (Republic of Korea Patent No. 10-0620092 call), lac promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, lambda phage PR promoter, P L promoter, tet promoter, gapA promoter, SPL7 promoter, SPL13(sm3) promoter (Republic of Korea Patent No. 10-1783170), O2 promoter (Korean Patent No. 10-1632642), tkt promoter, and yccA promoter, but are not limited thereto.
  • the modification of the polynucleotide sequence on the chromosome is not particularly limited thereto, but a mutation in the expression control sequence by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution of a nucleic acid sequence or a combination thereof to further enhance the activity of the polynucleotide sequence. It can be carried out by inducing or replacing the polynucleotide sequence improved to have stronger activity.
  • Incorporation and enhancement of such protein activity is generally performed such that the activity or concentration of the corresponding protein is at least 1%, 10%, 25%, 50%, based on the activity or concentration of the protein in the wild-type or unmodified microbial strain; It may be increased by 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% or 500%, up to 1000% or 2000%, but is not limited thereto.
  • the term "unmodified strain” does not exclude strains containing mutations that may occur naturally in microorganisms, and is either the native strain itself, or before the trait is changed due to genetic mutation by natural or artificial factors. It may mean a strain.
  • the "unmodified strain” may be used interchangeably with “unmodified strain”, “pre-modified strain”, “pre-modified microorganism”, “unmodified microorganism”, “unmodified microorganism” or "reference microorganism”.
  • the unmodified microorganism may be a strain that does not include the protein variant having the L-tyrosine excretion activity of the present application.
  • the microorganism of the present application is a natural microorganism having tyrosine-producing ability itself, a microorganism having an improved tyrosine-producing ability by enhancing or inactivating the activity of a gene related to a tyrosine production mechanism, or introducing or enhancing the activity of a foreign gene to improve tyrosine It may be a microorganism having a production ability.
  • the parent strain of the microorganism producing L-tyrosine modified to express the protein variant having the L-tyrosine excretion activity is not particularly limited as long as it is a microorganism producing L-tyrosine.
  • the microorganisms producing L-tyrosine are of competition pathway genes, L-tyrosine operon directional pathway regulators, L-tyrosine entry genes, L-tyrosine entry and degradation genes, It may be a microorganism that attenuates or inactivates, and/or modulates the activity of the L-tyrosine operon.
  • the activity of an aromatic amino acid input protein may be attenuated or eliminated compared to its intrinsic activity (eg, attenuated/removed aroP activity), and a gene encoding a protein involved in feedback regulation (eg, tyrA) , aroG) can be introduced to release feedback.
  • a gene encoding a protein involved in feedback regulation eg, tyrA
  • aroG a protein involved in feedback regulation
  • the activity of the gene (eg, pheA) of the competitive pathway may be attenuated, eliminated, or altered (eg, L-tryptophan concentration-dependently altered) compared to the intrinsic activity.
  • Another aspect of the present application provides a method for producing L-tyrosine, comprising culturing a microorganism expressing a protein variant having L-tyrosine excretion activity of the present application in a medium.
  • the protein variant, the expression of the protein, and the microorganism are the same as described above.
  • the term “cultivation” means growing the microorganism in an appropriately controlled environmental condition.
  • the culture process of the present application may be made according to an appropriate medium and culture conditions known in the art. Such a culture process can be easily adjusted and used by those skilled in the art according to the selected strain. Specifically, the culture may be batch, continuous, and fed-batch, but is not limited thereto.
  • the term "medium” refers to a material mixed with nutrients required for culturing the microorganism as a main component, and supplies nutrients and growth factors, including water, which are essential for survival and growth.
  • any medium and other culture conditions used for culturing the microorganisms of the present application may be used without any particular limitation as long as they are conventional media used for culturing microorganisms. It can be cultured while controlling temperature, pH, etc. under aerobic conditions in a conventional medium containing compounds, amino acids and/or vitamins.
  • carbon source in the present application, carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose, maltose; sugar alcohols such as mannitol and sorbitol; organic acids such as pyruvic acid, lactic acid, citric acid and the like; Amino acids such as glutamic acid, methionine, lysine, and the like may be included.
  • natural organic nutrient sources such as starch hydrolyzate, molasses, blackstrap molasses, rice winter, cassava, sugar cane offal and corn steep liquor can be used, specifically glucose and sterilized pre-treated molasses (i.e., converted to reducing sugar). molasses) may be used, and other appropriate amounts of carbon sources may be variously used without limitation. These carbon sources may be used alone or in combination of two or more, but is not limited thereto.
  • nitrogen source examples include inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, anmonium carbonate, and ammonium nitrate; Amino acids such as glutamic acid, methionine, glutamine, and organic nitrogen sources such as peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract, malt extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, fish or degradation products thereof, defatted soybean cake or degradation products thereof, etc. can be used These nitrogen sources may be used alone or in combination of two or more, but is not limited thereto.
  • inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, anmonium carbonate, and ammonium nitrate
  • Amino acids such as glutamic acid, methionine, glutamine
  • organic nitrogen sources such as peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract
  • the phosphorus may include potassium monobasic phosphate, dipotassium phosphate, or a sodium-containing salt corresponding thereto.
  • potassium monobasic phosphate dipotassium phosphate
  • sodium-containing salt corresponding thereto.
  • sodium chloride, calcium chloride, iron chloride, magnesium sulfate, iron sulfate, manganese sulfate, calcium carbonate, etc. may be used, and in addition, amino acids, vitamins and/or suitable precursors may be included. These components or precursors may be added to the medium either batchwise or continuously. However, the present invention is not limited thereto.
  • a compound such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid, sulfuric acid, etc. may be added to the medium in an appropriate manner during culturing of the microorganism to adjust the pH of the medium.
  • an antifoaming agent such as fatty acid polyglycol ester may be used to suppress bubble formation.
  • oxygen or oxygen-containing gas may be injected into the medium, or nitrogen, hydrogen or carbon dioxide gas may be injected without injection of gas or without gas to maintain anaerobic and microaerobic conditions. it is not
  • the temperature of the medium may be 20 °C to 50 °C, specifically 30 °C to 37 °C, but is not limited thereto.
  • the incubation period may be continued until a desired production amount of a useful substance is obtained, and specifically, it may be 10 hours to 100 hours, but is not limited thereto.
  • the production method may further include recovering L-tyrosine from the culture medium or the microorganism.
  • the desired L-tyrosine can be recovered from the medium using a suitable method known in the art according to the culture method of the microorganism of the present application, for example, a batch, continuous or fed-batch culture method.
  • a suitable method known in the art for example, centrifugation, filtration, treatment with a crystallized protein precipitating agent (salting out method), extraction, ultrasonic disruption, ultrafiltration, dialysis, molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography It may be used in combination of various chromatography, HPLC, and methods thereof, such as, but is not limited to these examples.
  • the production method may include an additional purification process.
  • the recovered L-tyrosine may be purified using a suitable method known in the art.
  • Another aspect of the present application is the protein variant; a polynucleotide encoding it; a vector comprising the polynucleotide; And it provides a composition for producing L-tyrosine, comprising any one or more of microorganisms expressing the protein variant.
  • Another aspect of the present application is the protein variant; a polynucleotide encoding it; a vector comprising the polynucleotide; And any one or more of microorganisms expressing the protein variant, it provides a use for producing L-tyrosine.
  • Protein variants, polynucleotides encoding the same, vectors and microorganisms containing the same are as described above.
  • composition of the present application includes the protein variant; a polynucleotide encoding it; a vector comprising the polynucleotide;
  • an additional composition capable of producing L-tyrosine using a microorganism expressing the protein variant may be included without limitation.
  • it may further include any suitable excipients or components of a medium commonly used in compositions for microbial fermentation. However, it is not limited thereto.
  • the wild-type Corynebacterium glutamicum has the ability to produce L-tyrosine, but does not produce in excess enough to be discharged into the culture medium.
  • a strain having an increased L-tyrosine production capacity rather than a wild-type strain was used. Therefore, the genes necessary to produce L-tyrosine were strengthened in the Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 strain to prepare an L-tyrosine-producing strain.
  • E4P Erythrose-4-Phosphate
  • tkt an aromatic amino acid influx gene for introducing L-tyrosine into the cell
  • aroP downstream (Downstream) and upstream (Upsteam) regions were obtained into which the tkt gene was to be replaced.
  • the aroP downstream region using the primers of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, upstream using the primers of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6
  • a gene fragment of the (Upsteam) region was obtained through PCR.
  • Solg TM Pfu-X DNA polymerase was used as the polymerase, and PCR amplification conditions were repeated 30 times of denaturation at 95°C for 5 minutes, denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 60°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 60 seconds. , the polymerization was carried out at 72 °C for 5 minutes.
  • PCR was performed on the tkt gene fragment containing the tkt promoter using the primers of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 using the Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 chromosomal DNA as a template. was obtained through SolgTM Pfu-X DNA polymerase was used as the polymerase, and PCR amplification conditions were repeated 30 times of denaturation at 95°C for 5 minutes, denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 60°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 150 seconds. Polymerization was performed at 72° C. for 5 minutes.
  • the amplified aroP promoter upstream and downstream regions, the tkt gene fragment including the tkt promoter, and the vector pDZ for chromosomal transformation cut with SmaI restriction enzyme was prepared by Gibson assembly (DG Gibson et al. , NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix) to obtain a recombinant plasmid by cloning using the method, and named pDZ- ⁇ aroP::Pn-tkt. Cloning was performed by mixing the Gibson assembly reagent and each gene fragment with the calculated mole number and then storing at 50° C. for 1 hour.
  • the primer sequences used to construct each of the vectors are shown in Table 1 below.
  • the tyrA gene which is previously subject to feedback control by L-tyrosine, which Corynebacterium glutamicum has, is a mutant type that does not receive feedback control from E. coli, including the gapA promoter, which is a strong promoter. was replaced with tyrA.
  • E. coli-derived tyrA protein is known to release feedback when methionine 53 is mutated to isoleucine and alanine 354 to valine is mutated, and this form (SEQ ID NO: 11) was used ( Appl. Microbiol. Biotechnol. 75, 103-110 (2007)).
  • tyrA upstream (Upstream) and downstream (Downsteam) regions were first obtained for replacement of the tyrA gene. Specifically, using the Corynebacterium glutamicum ATCC13869 chromosomal DNA as a template, the tyrA upstream region using the primers of SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13, downstream using the primers of SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15 A gene fragment of the (Downsteam) region was obtained by performing PCR.
  • Solg TM Pfu-X DNA polymerase was used as the polymerase, and PCR amplification conditions were repeated 30 times of denaturation at 95°C for 5 minutes, denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 60°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 60 seconds. , the polymerization was carried out at 72 °C for 5 minutes.
  • the gapA promoter fragment was subjected to PCR using the primers of SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17 using Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 chromosomal DNA as a template.
  • the E. coli-derived mutant tyrA gene fragment was obtained through PCR using the primers of SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19 using E. coli-derived mutant tyrA synthetic DNA as a template.
  • Solg TM Pfu-X DNA polymerase was used as the polymerase, and PCR amplification conditions were repeated 30 times of denaturation at 95°C for 5 minutes, denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 60°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 60 seconds. , the polymerization was carried out at 72 °C for 5 minutes.
  • Recombinant plasmid was obtained by cloning the amplified tyrA upstream and downstream regions, the mutated tyrA gene fragment derived from Escherichia coli containing the gapA promoter, and the vector pDZ for chromosomal transformation cut with SmaI restriction enzyme using the Gibson assembly method. - ⁇ tyrA::PgapA-tyrAm was named. Cloning was performed by mixing the Gibson assembly reagent and each gene fragment with the calculated mole number and then storing at 50° C. for 1 hour.
  • the primer sequences used to construct each of the vectors are shown in Table 3 below.
  • the tyrA gene was deleted through a secondary crossover process, and the E. coli-derived mutant tyrA gene including the gapA promoter was inserted. strains were obtained.
  • the genetic manipulation was confirmed through PCR method and genome sequencing using primers of SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21 that can amplify the external regions of the upstream and downstream regions of the homologous recombination into which the gene is inserted, respectively, CM06-0002 named as
  • the aroG gene the first step of the aromatic common biosynthetic pathway, was reinforced by adding a strong promoter to the feedback deregulation mutant aroG derived from E. coli.
  • E. coli-derived aroG protein is known to release feedback when proline 150 is substituted with leucine, and this form (SEQ ID NO: 22) was used (Appl. Environ. Microbiol. 63, 761-) 762 (1997)).
  • the upstream (Upstream) and downstream (Downsteam) regions into which the aroG gene is to be additionally inserted were obtained.
  • a gene fragment of the downstream (Downsteam) region was obtained by performing PCR.
  • Solg TM Pfu-X DNA polymerase was used as the polymerase, and PCR amplification conditions were after denaturation at 95°C for 5 minutes, denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 60°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 60 seconds after repeating 30 times. , the polymerization was carried out at 72 °C for 5 minutes.
  • Recombinant plasmid was obtained by cloning the upstream and downstream regions into which the amplified mutant aroG was to be additionally inserted, and the vector pDZ for chromosomal transformation cut with SmaI restriction enzyme, using the Gibson assembly method, and it was named pDZ- ⁇ BBD29_14470. Cloning was performed by mixing the Gibson assembly reagent and each gene fragment with the calculated mole number and then storing at 50° C. for 1 hour.
  • PCR was performed on the gapA promoter fragment using the primers of SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28 using Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 chromosomal DNA as a template.
  • the mutant aroG gene fragment was obtained through PCR using the primers of SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30 using E. coli-derived feedback cancellation mutant aroG synthetic DNA as a template.
  • Solg TM Pfu-X DNA polymerase was used as the polymerase, and PCR amplification conditions were repeated 30 times of denaturation at 95°C for 5 minutes, denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 60°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 60 seconds. , the polymerization was carried out at 72 °C for 5 minutes.
  • a recombinant plasmid was obtained by cloning the mutant aroG gene fragment containing the amplified gapA promoter, and the vector pDZ- ⁇ BBD29_14470 for chromosome transformation cut with ScaI restriction enzyme, using the Gibson assembly method, pDZ- ⁇ BBD29_14470::PgapA- It was named aroGm. Cloning was performed by mixing the Gibson assembly reagent and each gene fragment with the calculated mole number and then storing at 50° C. for 1 hour.
  • the primer sequences used to construct each of the vectors are shown in Table 5 below.
  • CM06-0003 After transforming the prepared pDZ- ⁇ BBD29_14470::PgapA-aroGm vector into the CM06-0002 strain by electroporation, a secondary crossover process was performed to obtain a strain in which the feedback cancellation mutant aroG gene derived from Escherichia coli containing the gapA promoter was inserted. .
  • the genetic manipulation was confirmed through PCR method and genome sequencing using the primers of SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32, which can amplify the external regions of the upstream region and the downstream region of the homologous recombination into which the gene is inserted, respectively, CM06-0003 named as
  • L-tryptophan is precisely controlled so that it does not interfere with the growth of cells while maintaining a low concentration at all times during culture.
  • known literature it is known that the production of L-tryptophan is simultaneously regulated by an inhibitor and a promoter according to the L-tryptophan concentration (Appl Environ Microbiol 59 791, 1993).
  • L-tryptophan was applied to the L-phenylalanine-producing gene pheA so that the pheA gene was regulated according to the L-tryptophan concentration.
  • the region upstream of the region to be inserted, the promoter region of trpE and the region downstream of the region to be inserted were obtained.
  • the upstream region of the region to be inserted using the primers of SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 34 using Corynebacterium glutamicum ATCC13869 chromosomal DNA as a template, SEQ ID NO: 35 and SEQ ID NO: 36 primers
  • a gene fragment of a region downstream of the region to be inserted using the primers of SEQ ID NO: 37 and SEQ ID NO: 38 was obtained through PCR.
  • Solg TM Pfu-X DNA polymerase was used as the polymerase, and PCR amplification conditions were after denaturation at 95°C for 5 minutes, denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 60°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 30 seconds after repeating 30 times. , the polymerization was carried out at 72 °C for 5 minutes.
  • the amplified upstream and downstream regions of the region to be inserted, the trpE promoter region, and the vector pDZ for chromosomal transformation cut with SmaI restriction enzyme were obtained by cloning using the Gibson assembly method to obtain a recombinant plasmid, pDZ- ⁇ PpheA::PtrpE named as Cloning was performed by mixing the Gibson assembly reagent and each gene fragment with the calculated mole number and then storing at 50° C. for 1 hour.
  • the prepared pDZ- ⁇ PpheA::PtrpE vector was transformed into the CM06-0003 strain by electroporation, followed by a secondary crossover process to obtain a strain in which the pheA gene was regulated by the trpE promoter.
  • the genetic manipulation was confirmed by PCR and genome sequencing using the primers of SEQ ID NO: 39 and SEQ ID NO: 40, respectively, capable of amplifying the regions outside of the upstream region and the downstream region of the homologous recombination region into which the promoter was inserted.
  • the strain in which the trpE promoter was inserted before the pheA gene was named CM06-0005.
  • the primer sequences used to construct the vector are shown in Table 7 below.
  • the upstream (Upstream) and downstream (Downsteam) regions into which the Zymomonas mobilis-derived glf gene is inserted were obtained.
  • the ptsG upstream region using the primers of SEQ ID NO: 41 and SEQ ID NO: 42, downstream using the primers of SEQ ID NO: 43 and SEQ ID NO: 44 A gene fragment of the (Downsteam) region was obtained by performing PCR.
  • Solg TM Pfu-X DNA polymerase was used as the polymerase, and PCR amplification conditions were after denaturation at 95°C for 5 minutes, denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 60°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 60 seconds after repeating 30 times. , the polymerization was carried out at 72 °C for 5 minutes.
  • the cj7 promoter using the synthetic cj7 promoter DNA as a template and the primers of SEQ ID NO: 46 and SEQ ID NO: 47
  • the fragment was obtained through PCR, and the glf gene fragment was obtained through PCR using the primers of SEQ ID NO: 48 and SEQ ID NO: 49 using Zymomonas mobilis ATCC10988 chromosomal DNA as a template.
  • Solg TM Pfu-X DNA polymerase was used as the polymerase, and PCR amplification conditions were repeated 30 times of denaturation at 95°C for 5 minutes, denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 60°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 60 seconds. , the polymerization was carried out at 72 °C for 5 minutes.
  • the amplified ptsG upstream and downstream gene fragments, the glf gene fragment containing the cj7 promoter, and the vector pDZ for chromosome transformation cut with ScaI restriction enzyme were obtained by cloning using the Gibson assembly method to obtain a recombinant plasmid, pDZ- ⁇ ptsG ::pcj7-glf was named. Cloning was performed by mixing the Gibson assembly reagent and each gene fragment with the calculated mole number and then storing at 50° C. for 1 hour.
  • a secondary crossover process was performed to obtain a strain in which the glf gene derived from Zymomonas mobilis containing the cj7 promoter was inserted.
  • the genetic manipulation was confirmed through PCR and genome sequencing using primers of SEQ ID NO: 50 and SEQ ID NO: 51, which can amplify the external regions of the upstream and downstream regions of the homologous recombination into which the gene is inserted, respectively, and CM06-0010 named as
  • each strain was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 25 ml of the seed medium, and incubated at 30° C. for 20 hours with shaking at 200 rpm. Then, 1 ml of the seed culture solution was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 25 ml of the production medium and cultured with shaking at 30° C. for 24 hours at 200 rpm. After completion of the culture, the production of L-tyrosine, L-phenylalanine, and L-tryptophan was measured by HPLC.
  • Glucose 30 g (NH4)2SO4 15 g, MgSO4 7H2O 1.2 g, KH2PO4 1 g, yeast extract 5 g, biotin 900 ⁇ g, thiamine hydrochloride 4500 ⁇ g, calcium-pantothenic acid 4500 ⁇ g, CaCO3 30 g (based on 1 liter of distilled water).
  • L-tyrosine was not produced in the strain CM06-0001 in which an aromatic amino acid influx gene was deleted in the wild-type strain and the precursor E4P supply was enhanced, and L-tyrosine was also detected in CM06-0002 in which the tyrA feedback restriction was additionally released in this strain. It didn't happen.
  • L-tyrosine and L-phenylalanine were confirmed in the CM06-0003 strain, in which the common aromatic production pathway was strengthened by releasing the feedback restriction of aroG in addition to the CM06-0002 strain. Production of L-tyrosine and L-phenylalanine increased significantly compared to the previous strain, but L-tryptophan did not change significantly. In the case of the CM06-0005 strain, in which the L-phenylalanine pathway was controlled by the L-tryptophan concentration, L-tyrosine was produced in a yield of 5.37%. The L-tyrosine production of CM06-0005 was improved by 283% compared to the parent strain CM06-0003. From the above results, it can be seen that when pheA is adjusted according to the L-tryptophan concentration, L-tyrosine production is significantly increased.
  • CM06-0010 a non-PTS strain that can smoothly supply PEP, compared to CM06-0005, a PTS strain.
  • the CM06-0010 strain produced L-tyrosine with an improved 7.06% yield.
  • Example 1 Preparation of strains introduced with L-tryptophan excreting protein of L-tyrosine-producing strains
  • the tyrosine excretion ability was checked by introducing a new L-tryptophan excreting protein (WO2019164348A1) into the L-tyrosine-producing strain CM06-0010 strain prepared in Reference Example 1.
  • the novel L-tryptophan excretion protein is a membrane protein derived from Herbaspilium risospere and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 52.
  • the transformation vector used in patent WO2019164348A1 was pDZTn-PgapA-Hrh, and the same vector was transformed into the L-tyrosine-producing strain CM06-0010 strain by electroporation (Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52:541-545). After conversion, a strain in which one copy of the PgapA-Hrh gene was inserted between the transposon genes on the chromosome was obtained through a secondary crossover process.
  • the PgapA-Hrh gene-expressed protein was named Wex, and PCR method and genome using primers of SEQ ID NO: 53 and SEQ ID NO: 54 that can amplify the external regions of the upstream region and the downstream region of the homologous recombination into which the gene is inserted, respectively The genetic manipulation was confirmed through sequencing.
  • the strain thus obtained was named Corynebacterium glutamicum CM06-0111.
  • the strain was cultured using the method and medium composition described in Reference Example 2.
  • Example 3 Substitution of amino acid 79, leucine with other amino acids in the Wex sequence in the L-tyrosine-producing strain.
  • 79th leucine In order to provide substrate specificity for L-tyrosine of the Wex membrane protein, the 79th amino acid, leucine (hereinafter referred to as 79th leucine or 79th) was replaced with another amino acid to find a variant that excretes L-tyrosine.
  • site-directed mutagenesis was performed using the pDZTn-PgapA-Hrh used in Example 1 as a template. Site-Directed mutagenesis was performed in the following way.
  • pDZTn-PgapA-wex L79A pDZTn-PgapA-wex L79I
  • pDZTn-PgapA-wex L79G pDZTn-PgapA-wex L79M
  • pDZTn-PgapA-wex L79S pDZTn-PgapA-wex L79S
  • pDZTn-PgapA-wex L79T pDZTn-PgapA-wex L79Y
  • pDZTn-PgapA-wex L79N pDZTn-PgapA-wex L79W
  • pDZTn-PgapA-wex L79R vectors prepared in CM06-0111 above, respectively.
  • CM06-0112 (wex L79A), CM06-0114 (wex L79I), CM06-0115 (wex L79G), CM06-0117 (wex L79M), CM06-0118 (wex L79S), CM06- 0119 (wex L79P), CM06-0120 (wex L79T), CM06-0121 (wex L79Y), CM06-0124 (wex L79N), CM06-0128 (wex L79W), CM06-0129 (wex L79R) were named.
  • CM06-0112 (wex L79A), CM06-0114 (wex L79I), CM06-0115 (wex L79G), CM06-0117 (wex L79M), CM06-0118 (wex L79S), CM06-0119 (wex L79P), CM06- 0120 (wex L79T), CM06-0121 (wex L79Y), CM06-0124 (wex L79N), CM06-0128 (wex L79W), CM06-0129 (wex L79R)
  • the strain introduced with the wild-type Wex membrane protein had insignificant effects, whereas the CM06-0112 strain introduced with the Wex L79A mutation had an L-tyrosine concentration of 2.92 g/L in flask culture, which was about 2.5%p higher than that of the control CM06-0111. improvement could be seen.
  • the CM06-0115 strain introduced with the Wex L79G mutation was also improved by 2.4%p, confirming that the Wex L79A mutation and the L79G mutation specifically excrete L-tyrosine.
  • KCCM Korea Microorganism Conservation Center

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 출원은 L-타이로신 배출 활성을 갖는 단백질 변이체, 이를 발현하는 미생물 및 그 용도에 관한 것이다.

Description

신규 L-타이로신 배출 단백질 변이체 및 이를 이용한 L-타이로신을 생산하는 방법
본 출원은 L-타이로신 배출 활성을 갖는 신규한 단백질 변이체 및 상기 단백질 변이체를 포함하는 L-타이로신을 생산하는 미생물, 및 상기 미생물을 이용하여 L-타이로신을 생산하는 방법에 관한 것이다.
L-타이로신은 아미노산의 하나로써, 약품 원료와 식품 첨가제, 동물 사료, 영양제 등의 중요 소재로 사용된다. 상기 L-타이로신 및 기타 유용물질을 생산하기 위하여, 고효율 생산 미생물 및 발효공정기술 개발을 위한 다양한 연구들이 수행되고 있다.
미생물의 L-타이로신 생산 과정은 5탄당 회로의 중간 물질인 E4P(Erythrose-4-Phosphate)와 해당과정(glycolysis)의 중간 물질인 PEP(Phosphoenolpyruvate)가 중합 반응하여 만들어지는 DAHP(3-Deoxy-D-arobino-heptulosonate-7-phosphate)로부터 시작된다. 이후 DAHP는 방향족 공통 생합성 경로를 거쳐 코리스믹산(chorismate)에서 프레펜산(prephenate)을 거쳐 L-타이로신 생합성 경로를 통해 최종적으로 L-타이로신으로 전환된다.
한편, 특정 아미노산 배출 유전자의 발현은 미생물에서 해당 아미노산의 생산성 향상을 야기하여 왔다. 코리네박테리움 속 미생물의 L-라이신 배출유전자 (lysE)의 발현 강화는 라이신의 생산성을 향상시켰다 (US 6858406 B1). 또한 대장균에서 rhtC 유전자의 강화는 L-쓰레오닌 (L-threonine)에 대한 내성을 향상시켰으며, 동시에 L-호모세린, L-쓰레오닌, L-류신의 생산성이 향상되었다 (EP1013765A1). 대장균에서 기능이 공지되지 않은 유전자들, yahN 유전자, yeaS 유전자, yfiK 유전자 그리고 yggA 유전자를 강화시킴으로써 L-글루타민산, L-라이신, L-쓰레오닌, L-알라닌, L-히스티딘, L-프롤린, L-아르기닌, L-발린 및 L-이소류신의 생산성이 향상되었다는 특허(EP1016710B1)도 개시되어 있다.
현재 L-타이로신에 특이성을 보이는 배출 단백질은 보고된 바 없다. 방향족 아미노산의 배출 단백질로 대장균의 yddG 유전자가 알려져 있지만, L-타이로신이나 L-트립토판보다 L-페닐알라닌에 높은 특이성을 보인다 (FEMS Microbiol Lett 275 (2007) 312-318). 또한 L-아미노산 발효의 생산 균주로서 주로 이용되는 코리네박테리움 속 미생물에서는 L-타이로신 또는 방향족 아미노산 배출 유전자가 전혀 보고된 바 없다. (J Ind Microbiol Biotechnol. 2015 May;42(5):787-97)
본 출원은 서열번호 52의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 79번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 단백질 변이체; 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 출원은 상기 단백질 변이체; 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 하나 이상을 포함하여 L-타이로신을 생산하는 미생물을 제공한다.
본 출원은 상기 미생물을 배양하는 것을 포함하는 L-타이로신 생산 방법을 제공한다.
본 출원은 상기 단백질 변이체, 상기 폴리뉴클레오티드; 상기 벡터 및 상기 미생물 중 어느 하나 이상을 포함하는 L-타이로신 생산용 조성물을 제공한다.
본 출원의 단백질 변이체를 발현하는 미생물은 이를 발현하지 않는 모균주에 비하여 L-타이로신 생산량이 획기적으로 향상시킬 수 있으므로, 이를 이용하여 L-타이로신을 효과적으로 생산할 수 있다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.
또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 출원의 하나의 양태는 서열번호 52의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, L-타이로신 배출 활성을 갖는 단백질 변이체를 제공한다.
상기 단백질 변이체는 서열번호 52의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 79번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, L-타이로신 배출 활성을 갖는 단백질 변이체일 수 있다.
본 출원의 용어 "L-타이로신(L-Tyrosine)"은 20개 α-아미노산 중 하나로써, 극성 아미노산(polar amino acid) 또는 방향족 아미노산으로 분류될 수 있다. 타이로신은 의약품이나 플라보노이드, 알카노이드 등의 전구체로 사용되는 상업적으로 중요한 아미노산이다.
본 출원에서 "L-타이로신 배출 활성을 갖는 단백질"은 특이적으로 L-타이로신을 세포 밖으로 배출할 수 있는 활성을 가지는 단백질일 수 있다.
본 출원의 L-타이로신 배출 활성을 갖는 단백질 변이체는 허바스필리움 리조스페레 (Herbaspirillum rhizosphaerae) 유래의 L-트립토판 배출 활성을 갖는 단백질로부터 유래하는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
여기서, "허바스필리움 리조스페레 (Herbaspirillum rhizosphaerae)"란 허바스필리움 속에 속하는 그람 음성 박테리아로, 국내에서는 울릉도 등에서 분리된 균주로, 토양 내 근권 (rhizosphere)에서 분리될 수 있다.
상기 허바스필리움 리조스페레 (Herbaspirillum rhizosphaerae)유래의 L-트립토판 배출 활성을 갖는 단백질은 예를 들면, 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있으나, 상기 서열번호 52의 아미노산 서열과 동일한 활성을 갖고 있으며 서열번호 52의 79번째 위치에 상응하는 서열이 야생형이 아닌 본 출원의 다른 아미노산으로 치환되어 L-타이로신 배출능을 갖게될 수 있는 서열은 79번 위치에 상응하는 잔기의 아미노산 변이가 일어나는 대상 단백질로 그 유래에 제한 없이 본 출원의 범위에 포함됨은 자명하다. 상기 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 서열번호 52의 아미노산 서열을 가지는 단백질, 서열번호 52의 아미노산 서열로 구성되는 단백질과 혼용되어 사용될 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 L-타이로신 배출 활성을 갖는 단백질은 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 변이체일 수 있다.
상기 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 L-트립토판 배출 활성을 가지는 단백질로, 본 출원에 이르러 상기 단백질의 79번째 위치에 상응하는 아미노산을 변이시킨 변이체가 L-타이로신 배출 활성을 가진다는 것을 새롭게 규명하였다.
본 출원에서 서열번호 52의 아미노산을 포함하는 단백질은, 본 출원의 변이를 도입할 수 있는 단백질 중 대표적인 예로서, 서열번호 52의 아미노산 서열 앞뒤로의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 서로 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 본 출원에서 변이를 도입할 수 있는 단백질에 속한다.
예를 들어, 본 출원에서 변이를 도입할 수 있는 단백질은 서열번호 52의 아미노산 서열 또는 이와 80%, 90%, 95%, 또는 97% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 단백질일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 변이 대상이 되는 단백질의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
즉, 본 출원에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드', '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드'라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, '서열번호 52의 아미노산 서열로 이루어진 단백질'은, 이와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 '서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 단백질'에 속할 수 있음은 자명하다.
본 출원에서 용어, "변이체(variant)"는 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 변형(modification)에 있어서 상기 열거된 서열 (the recited sequence)과 상이하나, 상기 단백질의 기능(functions) 또는 특성(properties)이 유지되는 단백질을 지칭한다. 변이체는 수 개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가에 의해 식별되는 서열(identified sequence)와 상이하다. 이러한 변이체는 일반적으로 상기 단백질의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산을 변형하고, 상기 변형된 단백질의 특성을 평가하여 식별될 수 있다. 즉, 변이체의 능력은 본래 단백질(native protein)에 비하여 증가되거나, 변하지 않거나, 또는 감소될 수 있다. 또한, 일부 변이체는 N-말단 리더 서열 또는 막전이 도메인(transmembrane domain)과 같은 하나 이상의 부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 다른 변이체는 성숙 단백질 (mature protein) 의 N- 및/또는 C-말단으로부터 일부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 상기 용어 "변이체"는 변이형, 변형, 변이된 단백질, 변이형 폴리펩티드, 변이, 등의 용어(영문 표현으로는 modification, modified protein, modified polypeptide, mutant, mutein, divergent, variant 등)가 사용될 수 있으며, 변이된 의미로 사용되는 용어라면 이에 제한되지 않는다. 본 출원의 목적상, 상기 변이체는 천연의 야생형 또는 비변형 단백질 대비 변이된 단백질의 활성이 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 상기 변이체는 하나 이상의 생물학적 활성을 여전히 보유하면서, 예를 들어 하나 이상의 보존적 치환을 가질 수 있다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다.
예를 들면, 전하를 띠는 곁사슬(electrically charged amino acid)을 갖는 아미노산 중 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신, 및 히스티딘을, 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 글루탐산 및 아스파르트산을 포함하고; 전하를 띠지 않는 곁사슬(uncharged side chain)을 갖는 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 프롤린, 세린, 쓰레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴, 글루타민을 포함하는 것으로 분류할 수 있다.
또한, 변이체는 폴리펩티드의 특성과 2차 구조에 최소한의 영향을 갖는 아미노산들의 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 예를 들면 폴리펩티드는 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 이전(transfer)에 관여하는 단백질 N-말단의 시그널 (또는 리더)서열과 컨쥬게이트 할 수 있다. 또한 상기 폴리펩티드는 폴리펩티드를 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트 될 수 있다.
본 출원에서 제공하는 L-타이로신 배출 활성을 갖는 단백질 변이체는, 상기에서 설명한 단백질 중 특이적 위치 또는 이에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되어, 단백질의 L-타이로신 배출 활성이 변이 전 단백질 대비 100%를 초과되는 변이체를 의미할 수 있다.
본 출원에서, '다른 아미노산으로 치환'은 치환 전의 아미노산과 다른 아미노산이면 제한되지 않는다 즉, 서열번호 52의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 79번째 아미노산인 류신이 "류신 이외의 아미노산"으로 치환되는 것을 "서열번호 52의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 79번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되는" 것으로 표현할 수 있다. 한편, 본 출원에서 '특정 아미노산이 치환되었다'고 표현하는 경우, 다른 아미노산으로 치환되었다고 별도로 표기하지 않더라도 치환 전의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환되는 것임은 자명하다.
본 출원의 단백질 변이체는, 서열번호 52의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 79번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 변이체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 본 출원의 단백질 변이체는 서열번호 52의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 79번째 아미노산이 알라닌, 글리신, 이소류신, 메티오닌, 세린, 프롤린, 쓰레오닌, 타이로신, 아스파라긴, 아르기닌 또는 트립토판으로 치환된 변이체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 본 출원의 단백질 변이체는 서열번호 52의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 79번째 아미노산이 알라닌, 글리신, 이소류신, 메티오닌, 쓰레오닌, 타이로신, 아스파라긴, 아르기닌 또는 트립토판으로 치환된 변이체 일 수 있다. 구체적으로 본 출원의 단백질 변이체는 서열번호 52의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 79번째 아미노산이 알라닌 또는 글리신으로 치환된 변이체 일 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않는다.
이와 같은 본 출원의 단백질 변이체는 변이 전 단백질에 비해 강화된 L-타이로신 배출능을 갖는다.
본 출원의 서열번호 52의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 79번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 단백질 변이체는, 서열번호 52의 아미노산 서열의 N 또는 C 말단, 또는 중간의 아미노산 결실/부가/삽입 등에 의해 79번이 아닌 다른 위치로 기재되는 경우라고 하더라도, 서열번호 52의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 79번 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 단백질 변이체를 포함하는 것은 자명하다.
또한, 본 출원에서 L-타이로신 배출 활성을 갖는 단백질로서 서열번호 52의 N-말단으로부터 79번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 단백질 변이체를 기재하였으나, 본 출원의 L-타이로신 배출 활성을 갖는 단백질 변이체는 서열번호 52의 변이체에 제한되지 않고, 그 밖에 서열번호 52의 아미노산 서열과 동일한 활성 혹은 L-타이로신 배출 활성을 가지는 임의의 아미노산 서열에서 "서열번호 52의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 79번 위치에 상응하는 아미노산"이 다른 아미노산으로 치환되어 L-타이로신 배출 활성을 가지는 변이체 역시 본 출원의 단백질 변이체의 범위에 포함되는 것은 자명하다.
임의의 아미노산 서열 내에서 "서열번호 52의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 79번 위치에 상응하는 아미노산" 은, 당업계에 공지된 다양한 서열 얼라인먼트(alignment) 방법을 통해 확인할 수 있다.
본 출원의 서열번호 52의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 79번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 단백질 변이체는, 서열번호 52의 아미노산 서열 또는 이와 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고 서열번호 52의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 79번 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 단백질일 수 있다.
본 출원의 단백질 변이체는, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 77 내지 85 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 77 내지 85 중 어느 하나의 아미노산 서열로 필수적으로 구성되는(consisting essentially of) 것일 수 있고, 보다 구체적으로는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 77 내지 85 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 일 구현예로, 본 출원의 단백질 변이체는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 77 내지 83 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고, 다른 구현예로 본 출원의 단백질 변이체는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 단백질 변이체는, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 77, 서열번호 78, 서열번호 79, 서열번호 80, 서열번호 81, 서열번호 82, 서열번호 83, 서열번호 84 및 서열번호 85 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 본 출원의 단백질 변이체는, 서열번호 1, 2, 서열번호 77 내지 83 중 어느 하나의 서열을 포함하는 것일 수 있다. 본 출원의 단백질 변이체는, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않는다.
한편 본 출원의 단백질 변이체는 전술한 서열번호의 아미노산 서열로 필수적으로 구성되거나, 전술한 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 단백질 변이체는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 77 내지 85 중 어느 하나의 아미노산 서열에서 79번째 아미노산은 고정되고, 이와 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 변이체에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 79번 위치 이외에, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 범위에 포함됨은 자명하다.
상동성(homology) 및 동일성(identity)은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다.
용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된 (conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한 (identical) 서열은 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상으로 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.
상기 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 상동성 또는 동일성은 예를 들면, 문헌에 의한 알고리즘 BLAST[참조: Karlin 및 Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]나 Pearson에 의한 FASTA(참조: Methods Enzymol., 183, 63, 1990)을 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다(참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov). 또한, 임의의 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.
본 출원의 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, L-타이로신 배출능을 갖는 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한 없이 포함될 수 있다.
본 출원에서 변이 대상이 되는 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자는 wex 유전자일 수 있으며, 허바스필리움 리조스페레 유래일 수 있고, 구체적으로는 서열번호 52의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 단백질 변이체를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 서열번호 52의 아미노산 서열에서 79번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한 없이 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 본 출원의 단백질 변이체, 구체적으로는 상기 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 77 내지 85 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 이와 상동성 또는 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 상동성 또는 동일성에 대해서는 전술한 바와 같다.
또한, 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드 서열 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화하여 서열번호 52의 아미노산 서열의 79번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 단백질 변이체를 코딩하는 서열이라면 제한 없이 포함할 수 있다.
상기 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성이 높은 유전자끼리, 40% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1X SSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1X SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1X SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다. 그러나 이에 제한되는 것은 아니며, 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 폴리뉴클레오티드가 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 폴리뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 폴리뉴클레오티드 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63 ℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다 (Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조)..
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 출원에서 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 변이된 폴리뉴클레오티드로 교체시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는, 상기 단백질 변이체; 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하여, L-타이로신을 생산하는 미생물을 제공한다.
상기 L-타이로신을 생산하는 미생물은, 야생형의 서열번호 52을 포함하는 미생물에 비하여, 상기 단백질 변이체; 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하여 L-타이로신 생산능이 증대된 미생물일 수 있다.
상기 단백질 변이체; 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하는 미생물은, L-타이로신 생산능이 부여된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어 "L-타이로신을 생산하는 미생물" 또는 "L-타이로신 생산능을 가지는 미생물"은 자연적으로 타이로신 생산능을 가지고 있는 미생물 또는 타이로신 생산능이 없는 모균주에 타이로신 생산능이 부여된 미생물일 수 있다.
상기 미생물은 배지 중의 탄소원으로부터 L-타이로신을 야생형이나 비변형 미생물과 비교하여 과량으로 생산할 수 있는 미생물일 수 있다. 또한, 상기 L-타이로신을 생산하는 미생물은 재조합 미생물일 수 있다. 구체적으로 상기 미생물은 L-타이로신을 생산할 수 있다면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 엔테로박터(Enterbacter) 속, 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 일 수 있다. 보다 구체적으로는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 또는 에스케리키아(Escherichia) 속에 속하는 미생물일 수 있다. 보다 구체적으로는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물일 수 있고, 예를 들어 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
보다 더욱 구체적으로는 에스케리키아속(Escherichia) 미생물은 대장균(Escherichia coli)일 수 있으며, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)일 수 있으나, L-타이로신 배출 활성을 갖는 단백질이 도입 또는 강화되어 L-타이로신 생산량이 증가될 수 있는 에스케리키아 속 또는 코리네박테리움 속에 속하는 미생물은 제한 없이 포함될 수 있다.
본 출원의 단백질 변이체; 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하여 L-타이로신을 생산하는 미생물은, 본 출원의 단백질 변이체를 발현하는 미생물일 수 있다.
본 출원에서 용어, 단백질이 "발현되도록/되는"은 목적 단백질이 미생물 내에 도입되거나, 미생물내에서 발현되도록 변형된 상태를 의미한다. 상기 목적 단백질이 미생물 내 존재하는 단백질인 경우 내재적 또는 변형전에 비하여 그 활성이 강화된 상태를 의미한다.
본 출원의 단백질 변이체를 발현하는 미생물은 단백질 변이체를 발현하도록 변형된 미생물일 수 있고, 따라서 본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 단백질 변이체를 발현하는 미생물의 제조 방법을 제공한다.
본 출원의 목적상 "목적 단백질"은 전술한 L-타이로신 배출 활성을 갖는 단백질 변이체일 수 있다.
구체적으로, "단백질의 도입"은, 미생물이 본래 가지고 있지 않았던 특정 단백질의 활성을 나타나게 되는 것 또는 해당 단백질의 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 향상된 활성을 나타나게 되는 것을 의미한다. 예를 들어, 특정 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 미생물 내 염색체로 도입되거나, 특정 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 미생물 내로 도입되어 이의 활성이 나타나는 것일 수 있다. 또한, "활성의 강화"는 미생물이 가진 특정 단백질의 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 활성이 향상된 것을 의미한다. "내재적 활성"은 자연적, 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 미생물의 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주가 본래 가지고 있던 특정 단백질의 활성을 말한다.
구체적으로, 본 출원의 활성 강화는 상기 단백질 변이체를 코딩하는 유전자의 세포 내 카피수 증가, 상기 단백질 변이체를 암호화하는 유전자의 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법, 상기 L-타이로신 배출 활성을 갖는 단백질 변이체를 암호화하는 유전자 발현 조절 서열을 활성이 강력한 서열로 교체하는 방법, 염색체상의 L-타이로신 배출 활성을 갖는 자연형 단백질을 코딩하는 유전자를 상기 단백질 변이체를 암호화하는 유전자로 대체하는 방법, 상기 단백질 변이체의 활성이 강화되도록 상기 단백질을 암호화하는 유전자에 변이를 추가적으로 도입시키는 방법, 및 미생물에 단백질 변이체를 도입하는 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 이루어질 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기에서 유전자의 카피수 증가는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 벡터에 작동 가능하게 연결된 형태로 수행되거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 삽입됨으로써 수행될 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입되는 것일 수 있다. 또는, 상기 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포의 염색체 내에 도입되는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있다.
다음으로, 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현 조절서열을 변형하는 것은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현 조절서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현 조절서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드 발현 단위의 상부에는 본래의 프로모터 대신 강력한 프로모터가 연결될 수 있으며 이에 한정되는 것은 아니다. 공지된 강력한 프로모터의 예에는 cj1 내지 cj7 프로모터(대한민국 등록특허 제10-0620092호), lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터, tet 프로모터, gapA 프로모터, SPL7 프로모터, SPL13(sm3) 프로모터 (대한민국 등록특허 제 10-1783170호), O2 프로모터(대한민국 등록특허 제10-1632642), tkt 프로모터 및 yccA 프로모터 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
아울러, 염색체상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다.
이와 같은 단백질 활성의 도입 및 강화는, 상응하는 단백질의 활성 또는 농도가 야생형이나 비변형 미생물 균주에서의 단백질의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 일반적으로 최소 1%, 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% 또는 500%, 최대 1000% 또는 2000%까지 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "비변형 균주"는 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 천연형 균주 자체이거나, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화되기 전 균주를 의미할 수 있다. 상기 "비변형 균주"는 "비변이 균주", "변형 전 균주","변형 전 미생물","비변이 미생물", "비변형 미생물" 또는 "기준 미생물"과 혼용될 수 있다. 일 구현예로 상기 비변형 미생물은 본 출원의 L-타이로신 배출 활성을 갖는 단백질 변이체를 포함하지 않는 균주일 수 있다.
본 출원의 미생물은 타이로신 생산능을 가지는 천연형 미생물 자체, 타이로신 생산 기작과 관련된 유전자의 활성을 강화시키거나 불활성시켜 향상된 타이로신 생산능을 가지게 된 미생물, 또는 외부유전자의 활성을 도입 또는 강화시켜 향상된 타이로신 생산능을 가지게 된 미생물일 수 있다.
본 출원의 미생물에 L-타이로신 생산능을 부여하거나, 생산능을 증가시키기 위해, E4P(Erythrose-4-Phosphate)와 같은 전구체의 지속적인 공급, 에너지의 효율적 이용을 위한 변형, 생합성 경로에서의 곁가지 경로를 차단시켜 생합성을 증가시키는 방법 또는 ATP를 적게 사용하는 변형 등을 사용할 수 있다.
구체적으로 본 출원에서 상기 L-타이로신 배출 활성을 갖는 단백질 변이체 발현되도록 변형된 L-타이로신을 생산하는 미생물의 모균주는, L-타이로신을 생산하는 미생물이라면 특별히 제한되지 않는다. L-타이로신을 생산하는 미생물은 L-타이로신 생합성 경로를 강화하기 위하여, 경쟁경로의 유전자, L-타이로신 오페론의 방향성 경로의 조절자, L-타이로신 유입유전자, L-타이로신 유입 및 분해 유전자의 활성의 약화 또는 불활성화 시키거나, 및/또는 L-타이로신 오페론의 활성을 조절한 미생물일 수 있다.
미생물 변형의 예를 들면, 방향족 아미노산 유입 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 약화 또는 제거될 수 있고 (예를 들어, aroP 활성 약화/제거), 피드백 조절에 관련된 단백질을 코딩하는 유전자(예를 들면 tyrA, aroG)에 변이를 도입하여 피드백을 해제시킬 수 있다. 또한, 전구체 공급에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자(예를 들어, tkt 유전자)의 발현을 강화시킬 수 있다. 또한, 경쟁 경로의 유전자 (예를 들어 pheA) 의 활성을 내재적 활성에 비해 약화 또는 제거, 혹은 변경 (예를 들어, L-트립토판 농도 의존적으로 변경) 시킬 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 L-타이로신 배출 활성을 갖는 단백질 변이체를 발현하는 미생물을 배지에서 배양하는 것을 포함하는, L-타이로신의 생산 방법을 제공한다.
상기 단백질 변이체, 단백질의 발현, 및 미생물에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 출원에서 용어, "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "배지"는 상기 미생물을 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 출원의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 출원의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원에서, 미생물의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
배지의 온도는 20℃ 내지 50℃, 구체적으로는 30℃ 내지 37℃일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 배양 기간은 유용 물질의 원하는 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 10 시간 내지 100 시간일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 생산방법은, 상기 배양에 따른 배지 또는 상기 미생물로부터 L-타이로신을 회수하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
상기 타이로신을 회수하는 것은 본 출원의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지로부터 목적하는 L-타이로신을 회수할 수 있다. 예컨대 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 및 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
상기 생산방법은, 추가적인 정제 공정을 포함할 수 있다. 상기 정제공정은 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여, 회수된 L-타이로신을 정제할 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 단백질 변이체; 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 및 상기 단백질 변이체를 발현하는 미생물 중 어느 하나 이상을 포함하는, L-타이로신 생산용 조성물을 제공한다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 단백질 변이체; 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 및 상기 단백질 변이체를 발현하는 미생물 중 어느 하나 이상의, L-타이로신 생산 용도를 제공한다.
단백질 변이체, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 벡터 및 미생물에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원의 조성물은 상기 단백질 변이체; 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 또는 상기 단백질 변이체를 발현하는 미생물을 이용하여 L-타이로신을 생산할 수 있는 추가적인 구성을 제한없이 포함할 수 있다. 예를 들어, 미생물 발효용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제 또는 배지의 구성 성분을 추가로 포함할 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
본원 명세서에서 문맥상 달리 요구하지 않는 한, "포함한다", "포함하는", "함유하는", 등의 표현은 명시된 정수(integer) 또는 정수 그룹의 포함을 의미하지만, 다른 정수 또는 정수의 집합을 배제하는 것이 아니라고 이해되어야 한다.
이하 본 출원을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
참고예 1: L-타이로신 생산 균주 제작
야생형의 코리네박테리움 글루타미쿰은 L-타이로신을 생산하는 능력은 있으나, 배양액으로 배출할 만큼 과량 생산하지는 않는다. 본 출원의 목적에 따라 L-타이로신 생산능을 증가시키는 유전형질을 확인하기 위하여, 야생형 균주보다는 L-타이로신 생산능이 증가된 균주를 활용하였다. 따라서 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 균주에 L-타이로신을 생산하는데 필요한 유전자들을 강화하여 L-타이로신 생산 균주를 제작 하였다.
먼저, L-타이로신의 전구체로서 E4P(Erythrose-4-Phosphate)의 원활한 공급을 위해 tkt 유전자의 과발현을 진행하였다. 이와 동시에 L-타이로신을 세포 내부로 유입하는 방향족 아미노산 유입 유전자인 aroP의 결손을 진행하였다.
상기 유전자 조작을 위해 우선 tkt 유전자를 대체 삽입할 aroP 다운스트림 (Downstream) 과 업스트림 (Upsteam) 지역을 수득하였다. 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 3와 서열번호 4의 프라이머를 이용하여 aroP 다운스트림 (Downstream) 지역을, 서열번호 5와 서열번호 6의 프라이머를 이용하여 업스트림 (Upsteam) 지역의 유전자 단편을 PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
또한, tkt 프로모터를 포함한 tkt 유전자를 확보하기 위해서 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 7와 서열번호 8의 프라이머를 이용하여 tkt 프로모터를 포함하는 tkt 유전자 단편을 PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 150초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
증폭된 aroP 프로모터 업스트림과 다운스트림 지역, tkt 프로모터를 포함하는 tkt 유전자 단편, 그리고 SmaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pDZ(특허등록 제10-0924065호) 는 깁슨 어셈블리 (DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix) 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDZ-ΔaroP::Pn-tkt로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.
상기 각각의 벡터를 제작하기 위해 사용한 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
서열번호 서열(5'-3')
3 TCGAGCTCGGTACCCTGGGAACTTGTCGACGCTAT
4 TGTTCGGCAAGCATTGTGGTGTGGGCAATGATCAC
5 ATTAACGGTTAAAGTACTCATTGTGAGGTGGCGGG
6 CTCTAGAGGATCCCCGGAGCTGCTGTCCAACGTGG
7 CCACACCACAATGCTTGCCGAACATTTTTCTTTTC
8 CACAATGAGTACTTTAACCGTTAATGGAGTCCTTG
제작된 pDZ-ΔaroP::Pn-tkt 벡터를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 균주에 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 aroP 유전자를 결손하는 동시에 tkt 프로모터를 포함하는 tkt 유전자가 삽입된 균주를 얻었다. 해당 유전자가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 9과 서열번호 10의 프라이머를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였으며, CM06-0001로 명명하였다.
서열번호 서열(5'-3')
9 ACGCGCCAAGTCGGACG
10 CGCACGATGTTTACCTGCG
L-타이로신 경로를 강화하기 위해서, 기존에 코리네박테리움 글루타미쿰이 가지고 있는 L-타이로신에 의한 피드백 조절을 받는 tyrA 유전자를 강한 프로모터인 gapA 프로모터를 포함한 대장균 유래의 피드백 조절을 받지 않는 변이형 tyrA로 교체하였다. 대장균 유래 tyrA 단백질은 53번 메티오닌(Methionine)이 이소류신(Isoleucine)으로, 354번 알라닌(Alanine)이 발린(Valine)으로 변이되면 피드백이 해제되는 것으로 알려져 있고 이 형태 (서열번호 11)를 사용하였다 (Appl. Microbiol. Biotechnol. 75, 103-110 (2007)).
상기 유전자 조작을 위해 우선 tyrA 유전자를 교체 삽입할 tyrA 업스트림 (Upstream) 과 다운스트림 (Downsteam) 지역을 수득하였다. 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 12과 서열번호 13의 프라이머를 이용하여 tyrA 업스트림 (Upstream) 지역을, 서열번호 14와 서열번호 15의 프라이머를 이용하여 다운스트림 (Downsteam) 지역의 유전자 단편을 PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
또한, gapA 프로모터를 포함한 대장균 유래 변이 tyrA 유전자를 확보하기 위해서 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 16과 서열번호 17의 프라이머를 이용하여 gapA 프로모터 단편을 PCR 수행을 통해 수득하였고, 대장균 유래 변이 tyrA 합성 DNA를 주형으로 하여 서열번호 18와 서열번호 19의 프라이머를 이용하여 대장균 유래 변이 tyrA 유전자 단편을 PCR 수행을 통해 수득하였다.
중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
증폭된 tyrA 업스트림과 다운스트림 지역, gapA 프로모터를 포함하는 대장균 유래 변이 tyrA 유전자 단편, 그리고 SmaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pDZ 는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDZ-ΔtyrA::PgapA-tyrAm 으로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.
상기 각각의 벡터를 제작하기 위해 사용한 프라이머 서열은 하기 표 3에 나타낸 바와 같다.
서열번호 서열(5'-3')
12 TTCGAGCTCGGTACCCTATCAAAACCGAGTTCTTCC
13 GTCGTTTTTAGGCCTCCTGACAAGTGTGGCACATAC
14 TGACAATCGCCAGTAATTTTATCGGCTGATGATTCT
15 ACTCTAGAGGATCCCCAACGCGATTGCATTCGGCTC
16 GTGCCACACTTGTCAGGAGGCCTAAAAACGACCGAG
17 TCAATTCAGCAACCATGTTGTGTCTCCTCTAAAGAT
18 TTAGAGGAGACACAACATGGTTGCTGAATTGACCGC
19 TCATCAGCCGATAAAATTACTGGCGATTGTCATTCG
제작된 pDZ-ΔtyrA::PgapA-tyrAm 벡터를 CM06-0001 균주에 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 tyrA 유전자를 결손하는 동시에 gapA 프로모터를 포함하는 대장균 유래 변이 tyrA 유전자가 삽입된 균주를 얻었다. 해당 유전자가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 20과 서열번호 21의 프라이머를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였으며, CM06-0002 로 명명하였다.
서열번호 서열(5'-3')
20 GCCCACTAGTCGAATCCC
21 CTGTCCGCAACCTGTGCG
L-타이로신 생산을 늘리기 위해 방향족 공통 생합성 경로의 첫 단계인 aroG 유전자를 대장균 유래 피드백 조절 해제 변이형 aroG에 강한 프로모터를 추가하여 강화하였다. 대장균 유래 aroG 단백질은 150번 프롤린(Proline)이 루이신(Leucine)으로 치환될 경우 피드백이 해제되는 것으로 알려져 있으며, 이 형태 (서열번호 22)를 사용하였다 (Appl. Environ. Microbiol. 63, 761-762 (1997)).
이러한 유전자 조작을 위해 우선 aroG 유전자를 추가 삽입할 업스트림 (Upstream)과 다운스트림 (Downsteam) 지역을 수득하였다. 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 23와 서열번호 24의 프라이머를 이용하여 BBD29_14470유전자의 업스트림 (Upstream) 지역을, 서열번호 25와 서열번호 26의 프라이머를 이용하여 다운스트림 (Downsteam) 지역의 유전자 단편을 PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
증폭된 변이형 aroG를 추가 삽입할 업스트림과 다운스트림 지역, SmaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pDZ는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDZ-ΔBBD29_14470 로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.
또한, gapA 프로모터를 포함한 대장균 유래 변이형 aroG 유전자를 확보하기 위해서 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 27와 서열번호 28의 프라이머를 이용하여 gapA 프로모터 단편을 PCR 수행을 통해 수득하였고, 대장균 유래 피드백 해제 변이형 aroG 합성 DNA를 주형으로 하여 서열번호 29와 서열번호 30의 프라이머를 이용하여 변이형 aroG 유전자 단편을 PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
증폭된 gapA 프로모터를 포함하는 변이형 aroG 유전자 단편, 그리고 ScaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pDZ-ΔBBD29_14470 는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDZ-ΔBBD29_14470::PgapA-aroGm 으로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.
상기 각각의 벡터를 제작하기 위해 사용한 프라이머 서열은 하기 표 5에 나타낸 바와 같다.
서열번호 서열(5'-3')
23 TCGAGCTCGGTACCCCCCGGCGGTATCGAGGTAGT
24 GACAAGTTTAGTACTTTAATCACCCGCGGGGACCC
25 GGTGATTAAAGTACTAAACTTGTCCCGAGGGTGAG
26 CTCTAGAGGATCCCCTATCAGTCACTTCCCTGAGA
27 GCGGGTGATTAAAGTGAGGCCTAAAAACGACCGAG
28 GTTCTGATAATTCATGTTGTGTCTCCTCTAAAGAT
29 ATGAATTATCAGAACGACGA
30 CGGGACAAGTTTAGTTTACCCGCGACGCGCTTTTA
제작된 pDZ-ΔBBD29_14470::PgapA-aroGm 벡터를 CM06-0002 균주에 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 gapA 프로모터를 포함하는 대장균 유래 피드백 해제 변이형 aroG 유전자가 삽입된 균주를 얻었다. 해당 유전자가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 31과 서열번호 32의 프라이머를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였으며, CM06-0003로 명명하였다.
서열번호 서열(5'-3')
31 TTGATATGACCGCAGCCTGA
32 CTGCATTCTCATCGATCTTG
방향족 공통 생산 경로를 강화하였을 때, 늘어난 코리스메이트 pool에서 경쟁경로인 L-페닐알라닌을 생산을 최소화 할 때 가장 L-타이로신과 L-트립토판의 생산이 증가할 것으로 예상할 수 있다. 하지만 경쟁경로의 pheA 유전자를 결손하게 되면 L-페닐알라닌 생산이 불가능해지면서 L-페일알라닌에 대한 요구성이 부여되기 때문에 낮은 농도로 유지하면서 균체의 성장에 영향이 없도록 L-트립토판 조절 기작을 이용하기로 하였다.
L-트립토판은 배양시에 항시 낮은 농도로 유지되면서도 균체의 성장에는 지장이 없도록 정교하게 조절 받는 것으로 예측할 수 있다. 공지된 문헌에서도 L-트립토판의 생산은 L-트립토판 농도에 따른 억제자와 촉진자의 동시 조절을 받는 것으로 알려져 있다 (Appl Environ Microbiol 59 791, 1993).
따라서, L-트립토판의 조절 기작을 L-페닐알라닌 생산 유전자 pheA 에 적용하여 L-트립토판 농도에 따라 pheA 유전자가 조절을 받도록 하였다.
pheA의 유전자를 trpE의 프로모터에 조절 받도록 하기 위하여 삽입하려는 지역의 업스트림 (Upstream) 과 trpE의 프로모터 지역과 삽입하려는 지역의 다운스트림 (Downsteam) 지역을 수득하였다. 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 33과 서열번호 34의 프라이머를 이용하여 삽입하고자 하는 지역의 업스트림 (Upstream) 지역을, 서열번호 35와 서열번호 36의 프라이머를 이용하여 trpE의 프로모터 지역을, 서열번호 37과 서열번호 38의 프라이머를 이용하여 삽입하고자 하는 지역의 다운스트림 (Downsteam) 지역의 유전자 단편을 PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
증폭된 삽입하고자 하는 지역의 업스트림과 다운스트림 지역, trpE 프로모터 지역, SmaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pDZ는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDZ-ΔPpheA::PtrpE 로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.
제작된 pDZ-ΔPpheA::PtrpE 벡터를 CM06-0003 균주에 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 pheA의 유전자가 trpE 의 프로모터로 조절 받도록 만든 균주를 얻었다. 해당 프로모터가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 39와 서열번호 40의 프라이머를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였다. pheA의 유전자 앞에 trpE의 프로모터를 삽입한 균주는 CM06-0005으로 명명하였다.
상기 벡터를 제작하기 위해 사용한 프라이머 서열은 하기 표 7에 나타낸 바와 같다.
서열번호 서열(5'-3')
33 TTCGAGCTCGGTACCCGGAGGGGTTTCCACCTCG
34 TGGGAAGCTTGTCTCAATTATGTCTGTTGCTCAATTAGCG
35 CTAATTGAGCAACAGACATAATTGAGACAAGCTTCCCA
36 AATTGGTGCGTCGCTCATGGGGCACCTACCGAGGAA
37 TTCCTCGGTAGGTGCCCCATGAGCGACGCACCAATTGTTG
38 CGACTCTAGAGGATCCCCCCGAAGAGTTCGGCTGCG
39 CCAGCGATGATCGCGCCG
40 ATCGCCGTGGAGCCAGCC
L-타이로신의 생산은 PEP와 E4P를 전구 물질로 시작되기 때문에 non-PTS (Phosphotransferase system)를 사용 할 경우 PEP 공급을 보다 원할하게 하여 높은 생산을 기대할 수 있다 (Nature biotechnol 14 620, 1996). 따라서, 균주의 PTS 유전자인 ptsG를 제거하고 non-PTS 유전자인 Zymomonas mobilis ATCC 10988 유래의 glf를 도입하였다.
ptsG를 결손하며 glf를 삽입하기 위해 우선 Zymomonas mobilis 유래 glf 유전자를 삽입할 업스트림 (Upstream) 과 다운스트림 (Downsteam) 지역을 수득하였다. 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 41과 서열번호 42의 프라이머를 이용하여 ptsG 업스트림 (Upstream) 지역을, 서열번호 43와 서열번호 44의 프라이머를 이용하여 다운스트림 (Downsteam) 지역의 유전자 단편을 PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
또한, 기공지된 cj7 프로모터 (서열번호 45, 특허등록 제10-0620092호)를 포함한 glf 유전자를 확보하기 위해서 합성 cj7 프로모터 DNA를 주형으로 하여 서열번호 46와 서열번호 47의 프라이머를 이용하여 cj7 프로모터 단편을 PCR 수행을 통해 수득하였고, Zymomonas mobilis ATCC10988 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 48와 서열번호 49의 프라이머를 이용하여 glf 유전자 단편을 PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
증폭된 ptsG 업스트림과 다운스트림 유전자 단편, cj7 프로모터를 포함하는 glf 유전자 단편, 그리고 ScaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pDZ 는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDZ-ΔptsG::pcj7-glf 로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.
본 참고예에서 사용한 프라이머의 서열은 표 8에 나타낸 바와 같다.
서열번호 서열(5'->3')
41 TTCGAGCTCGGTACCCGAGGGCTCACTGACGTTGA
42 CGCTGGGATGTTTCTACCGGATTCGATTCCTCAG
43 CGCTCCCAGAAGTAGGCTCAAACCTTGCCCATAAC
44 CTCTAGAGGATCCCCCTCCCCCAAACCACGCTTTT
46 GGAATCGAATCCGGTAGAAACATCCCAGCGCTACT
47 TACTTTCAGAACTCATGAGTGTTTCCTTTCGTTGG
48 ACGAAAGGAAACACTCATGAGTTCTGAAAGTAGTC
49 GGGCAAGGTTTGAGCCTACTTCTGGGAGCGCCACA
제작된 pDZ-ΔptsG::pcj7-glf 벡터를 CM06-0005 균주에 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 cj7 프로모터를 포함하는 Zymomonas mobilis 유래 glf 유전자가 삽입된 균주를 얻었다. 해당 유전자가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 50과 서열번호 51의 프라이머를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였으며, CM06-0010로 명명하였다.
서열번호 서열(5'-3')
50 ACATTAAGTGGTAGGCGCTGA
51 CATAACAGGGCAGAACAAAC
참고예 2: L-타이로신 생산 균주의 생산능 평가
상기 참고예 1에서 제작한 균주의 L-타이로신 생산능을 확인하고자 아래와 같은 방법으로 배양하여 평가하였다. 종 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 24시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC에 의해 L-타이로신, L-페닐알라닌, L-트립토판의 생산량을 측정하였다.
< 종배지 (pH 7.0) >
포도당 20g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
< 생산배지 (pH 7.0) >
포도당 30g, (NH4)2SO4 15 g, MgSO4 7H2O 1.2 g, KH2PO4 1 g, 효모추출물 5 g, 바이오틴 900 ㎍, 티아민 염산염 4500 ㎍, 칼슘-판토텐산 4500 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준).
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 유래 L-타이로신 생산균주의 생산능 평가
균주 번호 형질 사용한
포도당
(g/L)		 L-타이로신
생산량
(g/L)		 L-페닐알라닌
생산량
(g/L)		 L-트립토판
생산량
(g/L)
ATCC 13869 야생형 30 0.00 0.00 0.00
CM06-0001 ATCC 13869ΔaroP::Pn-tkt 30 0.00 0.00 0.00
CM06-0002 CM06-0001ΔtyrA::PgapA-tyrAm 30 0.00 0.00 0.00
CM06-0003 CM06-0002Δ BBD29_14470::PgapA-aroGm 30 0.38 1.11 0.02
CM06-0005 CM06-0003 ΔPpheA::PtrpE 30 1.61 0.03 0.02
CM06-0010 CM06-0005 ΔptsG::pcj7-glf 30 2.12 0.03 0.02
야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869, CM06-0001, CM06-0002, CM06-0003, CM06-0005, CM06-0010에 대한 배양물 중의 L-타이로신, L-페닐알라닌, L-트립토판 생산에 대한 결과는 상기 표 10과 같다.
야생형 균주에 방향족 아미노산 유입 유전자를 결손하고, 전구체인 E4P 공급을 강화시킨 균주 CM06-0001에서는 L-타이로신이 생산되지 않았고, 이 균주에 추가적으로 tyrA 피드백 제한을 해제한 CM06-0002 에서도 L-타이로신이 검출되지 않았다.
CM06-0002 균주에 추가적으로 aroG의 피드백 제한을 해제하여 방향족 공통 생산 경로를 강화한 CM06-0003 균주에서는 L-타이로신, L-페닐알라닌의 생산을 확인하였다. L-타이로신, L-페닐알라닌은 이전 균주에 비해 큰 폭으로 생산이 증가하였으나, L-트립토판은 크게 변화가 없었다. L-페닐알라닌 경로를 L-트립토판 농도에 조절 받도록 한 CM06-0005 균주의 경우 5.37 % 수율로 L-타이로신을 생산하였다. CM06-0005의 L-타이로신 생산량은 모균주인 CM06-0003 대비 283% 향상되었다. 상기 결과로부터 pheA를 L-트립토판 농도에 따라 조절 받도록 할 경우 L-타이로신 생산이 대폭 증가함을 확인할 수 있다.
또한, 예상했던대로 PTS 균주인 CM06-0005에 비해서 PEP 공급을 원활히 할 수 있는 non-PTS 균주인 CM06-0010에서 L-타이로신 생산이 증가함을 확인하였다. CM06-0010 균주는 향상된 7.06 % 수율로 L-타이로신을 생산하였다.
실시예 1: L-타이로신 생산 균주의 L-트립토판 배출단백질 도입된 균주의 제작
상기 참고예 1에서 제작한 L-타이로신 생산균주 CM06-0010 균주에 L-트립토판 신규 배출단백질 (WO2019164348A1) 를 도입하여 타이로신 배출능을 확인해 보았다.
L-트립토판 신규 배출단백질은 허바스필리움 리조스페레 유래의 막 단백질로 서열번호 52로 기재되는 아미노산 서열을 가진다. 특허 WO2019164348A1 에서 사용된 형질전환용 벡터는 pDZTn-PgapA-Hrh로 동일한 벡터를 L-타이로신 생산균주 CM06-0010 균주에 전기천공법(Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545)으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 트랜스포존 유전자의 사이에 1 카피의 PgapA-Hrh 유전자가 삽입된 균주를 얻었다. 상기의 PgapA-Hrh 유전자 발현된 단백질은 Wex라 명명하였고 해당 유전자가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 53과 서열번호 54의 프라이머를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였다.
서열번호 서열(5'-3')
53 CGGATTATGCCAATGATGTG
54 CACGATCACCAACATTCAGG
이렇게 수득한 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 CM06-0111 로 명명하였다
실시예 2: L-트립토판 배출단백질 Wex가 도입된 L-타이로신 생산 균주의 생산능 평가
상기 실시예 1에서 제작한 균주의 L-타이로신 생산능을 확인하고자 참고예 2에서 서술한 방법 및 배지 조성을 이용하여 균주를 배양하였다.
PgapA-Hrh 형질이 도입된 균주의 생산 배지에서의 생산능 평가
균주 번호 형질 사용한
포도당
(g/L)		 L-타이로신
생산량
(g/L)		 L-타이로신
수율
(%)		 L-페닐알라닌
생산량
(g/L)		 L-트립토판
생산량
(g/L)
CM06-0010 CM06-0005 ΔptsG::pcj7-glf 30 2.2 7.3 0.05 0.02
CM06-0111 CM06-0010-PgapA_Hrh 30 2.1 7.1 0.06 0.02
L-타이로신 생산균주인 CM06-0010, CM06-0111에 대한 배양물 중의 L-타이로신, L-페닐알라닌, L-트립토판 생산에 대한 결과는 상기 표 12과 같다.
L-트립토판 배출자 Wex 막단백질 도입된 균주는 L-타이로신 배출능이 보이지 않았고 L-트립토판 역시 너무 소량이라 증가여부를 확인할 수 없었다. 이에 Wex 막단백질에 변이를 도입하여 L-타이로신에 대한 기질 특이성을 부여하고자 하였다.
실시예 3: L-타이로신 생산 균주내 Wex 서열의 79번 아미노산, 류신(Leucine)의 타 아미노산으로의 치환.
Wex 막단백질의 L-타이로신에 대한 기질 특이성을 부여하기 위해 79번째 아미노산인 류신(이하 79번 류신 또는 79번으로 기재)을 다른 아미노산으로 치환을 통해 L-타이로신 배출하는 변이형을 찾고자 하였다. 류신 이외 다른 아미노산으로 변이를 주기 위해서 상기 실시예 1에서 사용된 pDZTn-PgapA-Hrh를 주형으로 Site-Directed Mutagenesis 를 수행하였다. Site-Directed mutagenesis는 아래의 방법으로 수행되었다.
Site-Direction Mutagenesis PCR 조성
단위 (ul)
10X pfu-X Buffer 5
10mM dNTP Mix 1
pfu-X Polymerase 1
Mutagenic forward primer(5pmol) 2
Mutagenic reverse primer(5pmol) 2
pDZTn-PgapA-Hrh (template DNA, 200ng/ul) 1
dH2O 38
Total 50
Site-Direction Mutagenesis PCR cycle
Cycle Temperature Time
1 95 ℃ 1 min
18 95 ℃ 50 sec
60 ℃ 50 sec
68 ℃ 9 min
1 68 ℃ 7 min
Wex 아미노산 서열의 79번 아미노산 류신을 다른 아미노산인 알라닌(A) (서열번호 1), 글리신(G) (서열번호 2), 이소류신(I) (서열번호 77), 메티오닌(M) (서열번호 78), 쓰레오닌(T) (서열번호 79), 타이로신(Y) (서열번호 80), 아스파라긴(N) (서열번호 81), 아르기닌(R) (서열번호 82), 트립토판(W) (서열번호 83), 세린(S) (서열번호 84), 프롤린(P) (서열번호 85)으로 치환하기 위해서 [표 15] 에서 표기한 각각의 mutagenic primer 세트를 이용해서 [표 14]과 같은 PCR mixture를 만들고 [표 15]의 cycle로 PCR 을 수행하였다. PCR이 종료되고 DpnI 제한효소 1㎕를 첨가 후 37℃ 로 1시간 처리하였다. DpnI 처리된 DNA 3㎕ DH5a competent cell에 transformation하여 pDZTn-PgapA-wex 변이형 플라스미드를 확보하였고 시퀀싱을 통해서 [표 15]에 표기한 각각의 변이로 교체되었음을 확인하였다.
Wex 아미노산 서열의 79번 아미노산 변이형 플라스미드 제작을 위한 mutagenic primer 세트
변이형 Wex 플라스미드 서열번호 서열(5'-3')
pDZTn-PgapA-wex L79A 55 GTGTCCTACGAACTCTGCGCATCGCTCTCCATCGGTTATG
56 CATAACCGATGGAGAGCGATGCGCAGAGTTCGTAGGACAC
pDZTn-PgapA-wex L79I 57 GTGTCCTACGAACTCTGCATCTCGCTCTCCATCGGTTATG
58 CATAACCGATGGAGAGCGAGATGCAGAGTTCGTAGGACAC
pDZTn-PgapA-wex L79G 59 GTGTCCTACGAACTCTGCGGCTCGCTCTCCATCGGTT
60 CATAACCGATGGAGAGCGAGCCGCAGAGTTCGTAGG
pDZTn-PgapA-wex L79M 61 GTGTCCTACGAACTCTGCATGTCGCTCTCCATCGGTT
62 CATAACCGATGGAGAGCGACATGCAGAGTTCGTAGG
pDZTn-PgapA-wex L79T 63 GTGTCCTACGAACTCTGCACCTCGCTCTCCATCGGTT
64 CATAACCGATGGAGAGCGAGGTGCAGAGTTCGTAGG
pDZTn-PgapA-wex L79Y 65 GTGTCCTACGAACTCTGCTACTCGCTCTCCATCGGTT
66 CATAACCGATGGAGAGCGAGTAGCAGAGTTCGTAGG
pDZTn-PgapA-wex L79N 67 GTGTCCTACGAACTCTGCAACTCGCTCTCCATCGGTT
68 CATAACCGATGGAGAGCGAGTTGCAGAGTTCGTAGG
pDZTn-PgapA-wex L79W 69 GTGTCCTACGAACTCTGCTGGTCGCTCTCCATCGGTT
70 CATAACCGATGGAGAGCGACCAGCAGAGTTCGTAGG
pDZTn-PgapA-wex L79R 71 GTGTCCTACGAACTCTGCCGCTCGCTCTCCATCGGTT
72 CATAACCGATGGAGAGCGAGCGGCAGAGTTCGTAGG
pDZTn-PgapA-wex L79S 73 GTGTCCTACGAACTCTGCTCCTCGCTCTCCATCGGTT
74 CATAACCGATGGAGAGCGAGGAGCAGAGTTCGTAGG
pDZTn-PgapA-wex L79P 75 GTGTCCTACGAACTCTGCCCATCGCTCTCCATCGGTT
76 CATAACCGATGGAGAGCGATGGGCAGAGTTCGTAGG
상기 [표15]과 같이 제작된 pDZTn-PgapA-wex L79A, pDZTn-PgapA-wex L79I, pDZTn-PgapA-wex L79G, pDZTn-PgapA-wex L79M, pDZTn-PgapA-wex L79S, pDZTn-PgapA-wex L79P, pDZTn-PgapA-wex L79T, pDZTn-PgapA-wex L79Y, pDZTn-PgapA-wex L79N, pDZTn-PgapA-wex L79W, pDZTn-PgapA-wex L79R 벡터를 상기 실시예 2 에서 제작된 CM06-0111 에 각각 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 변이형 wex 유전자가 삽입된 19종의 균주를 얻었다. 해당 유전자가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 53과 서열번호 54의 프라이머를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였다.
이렇게 수득한 형질전환 균주를 각각 CM06-0112 (wex L79A), CM06-0114 (wex L79I), CM06-0115 (wex L79G), CM06-0117 (wex L79M), CM06-0118 (wex L79S), CM06-0119 (wex L79P), CM06-0120 (wex L79T), CM06-0121 (wex L79Y), CM06-0124 (wex L79N), CM06-0128 (wex L79W), CM06-0129 (wex L79R) 로 명명하였다.
CM06-0112 (wex L79A), CM06-0114 (wex L79I), CM06-0115 (wex L79G), CM06-0117 (wex L79M), CM06-0118 (wex L79S), CM06-0119 (wex L79P), CM06-0120 (wex L79T), CM06-0121 (wex L79Y), CM06-0124 (wex L79N), CM06-0128 (wex L79W), CM06-0129 (wex L79R) 균주의 타이로신 생산량을 확인하고자 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC를 이용해 L-타이로신의 생산량을 측정하였다.
Wex 아미노산 서열의 79번 아미노산이 변이형으로 교체된 L-타이로신 생산균주의 생산능 평가
균주 번호 형질 사용한
포도당 (g/L)		 L-타이로신
생산량 (g/L)		 L-타이로신
수율 (%)
CM06-0010 CM06-0005 ΔptsG::pcj7-glf 30 2.18 7.27
CM06-0111 CM06-0010-PgapA_Hrh (Wex) 30 2.16 7.20
CM06-0112 CM06-0010-PgapA_wex L79A 30 2.92 9.73
CM06-0114 CM06-0010-PgapA_wex L79I 30 2.23 7.43
CM06-0115 CM06-0010-PgapA_wex L79G 30 2.88 9.60
CM06-0117 CM06-0010-PgapA_wex L79M 30 2.32 7.73
CM06-0118 CM06-0010-PgapA_wex L79S 30 2.17 7.23
CM06-0119 CM06-0010-PgapA_wex L79P 30 2.17 7.23
CM06-0120 CM06-0010-PgapA_wex L79T 30 2.33 7.77
CM06-0121 CM06-0010-PgapA_wex L79Y 30 2.24 7.47
CM06-0124 CM06-0010-PgapA_wex L79N 30 2.29 7.63
CM06-0128 CM06-0010-PgapA_wex L79W 30 2.19 7.30
Wex 막단백질의 야생형을 도입한 균주는 효과가 미미한데 비해 Wex L79A 변이가 도입된 CM06-0112 균주는 플라스크 배양에서 L-타이로신 농도가 2.92g/L 로 대조군 CM06-0111 대비 수율이 약 2.5%p 향상하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, Wex L79G 변이가 도입된 CM06-0115 균주도 2.4%p 향상됨을 확인하여, Wex L79A변이와 L79G 변이는 L-타이로신을 특이적으로 배출함을 확인하였다.
상기 균주, CM06-0112는 2020년 4월 27일자로 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 국제기탁하여 KCCM12708P로 기탁번호를 부여받았다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure PCTKR2021006621-appb-I000001

Claims (7)

  1. 서열번호 52의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 79번째 아미노산이 알라닌 또는 글리신으로 치환된 단백질 변이체; 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 하나 이상을 포함하는, L-타이로신을 생산하는 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 미생물인, L-타이로신을 생산하는 미생물.
  3. 서열번호 52의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 79번째 아미노산이 알라닌 또는 글리신으로 치환된 단백질 변이체; 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 하나 이상을 포함하는, L-타이로신을 생산하는 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-타이로신 생산방법.
  4. 제3항에 있어서, 생산된 타이로신을 회수하는 단계를 포함하는, L-타이로신 생산방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 미생물인, L-타이로신 생산방법.
  6. 서열번호 52의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 79번째 아미노산이 알라닌 또는 글리신으로 치환된, L-타이로신 배출 활성을 갖는 단백질 변이체.
  7. 제6항의 L-타이로신 배출 활성을 갖는 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
PCT/KR2021/006621 2020-05-27 2021-05-27 신규 l-타이로신 배출 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-타이로신을 생산하는 방법 WO2021242032A1 (ko)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17/999,788 US20230272441A1 (en) 2020-05-27 2021-05-27 Novel l-tyrosine-exporting protein variant and method for producing l-tyrosine using the same
CN202180047331.9A CN116472352A (zh) 2020-05-27 2021-05-27 新的l-酪氨酸输出蛋白质变体及利用其的l-酪氨酸生产方法
EP21813776.8A EP4144848A4 (en) 2020-05-27 2021-05-27 NEW L-TYROSINE RELEASING PROTEIN VARIANT AND METHOD FOR PRODUCING L-TYROSINE THEREFROM
BR112022023964A BR112022023964A2 (pt) 2020-05-27 2021-05-27 Variante de proteína que exporta l-tirosina inovadora e método para produzir l-tirosina com uso da mesma
JP2022572662A JP2023527830A (ja) 2020-05-27 2021-05-27 新規ｌ－チロシン排出タンパク質変異体及びそれを用いてｌ－チロシンを生産する方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2020-0063778 2020-05-27
KR1020200063778A KR102647745B1 (ko) 2020-05-27 2020-05-27 신규 l-타이로신 배출 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-타이로신을 생산하는 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021242032A1 true WO2021242032A1 (ko) 2021-12-02

Family

ID=78744838

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2021/006621 WO2021242032A1 (ko) 2020-05-27 2021-05-27 신규 l-타이로신 배출 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-타이로신을 생산하는 방법

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20230272441A1 (ko)
EP (1) EP4144848A4 (ko)
JP (1) JP2023527830A (ko)
KR (1) KR102647745B1 (ko)
CN (1) CN116472352A (ko)
BR (1) BR112022023964A2 (ko)
WO (1) WO2021242032A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230136447A (ko) * 2022-03-18 2023-09-26 씨제이제일제당 (주) 거짓쌀도둑거저리 유래 아스파테이트 1-디카복실레이스의 변이체 및 이를 포함하는 미생물

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1013765A1 (en) 1998-12-23 2000-06-28 Ajinomoto Co., Ltd. Gene and method for producing L-amino acids
US6858406B1 (en) 1995-12-22 2005-02-22 Forschungszentrum Jülich GmbH Process for the microbial production of amino acids by boosted activity of export carriers
KR20050044860A (ko) * 2001-11-23 2005-05-13 아지노모토 가부시키가이샤 에스케리키아속 세균을 사용한 ｌ-아미노산의 제조방법
KR100620092B1 (ko) 2004-12-16 2006-09-08 씨제이 주식회사 코리네박테리움 속 세포로부터 유래된 신규한 프로모터서열, 그를 포함하는 발현 카세트 및 벡터, 상기 벡터를포함하는 숙주 세포 및 그를 이용하여 유전자를 발현하는방법
KR100791794B1 (ko) * 1999-02-20 2008-01-04 에보니크 데구사 게엠베하 코리네형 세균을 사용한 ｌ-아미노산의 발효적 생산 방법
KR100924065B1 (ko) 2006-09-15 2009-10-27 씨제이제일제당 (주) Ｌ－라이신 생산능이 향상된 코리네박테리아 및 그를 이용한 ｌ－라이신 생산 방법
EP1016710B1 (en) 1998-12-30 2010-03-17 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-amino acids
KR101632642B1 (ko) 2015-01-29 2016-06-22 씨제이제일제당 주식회사 신규한 프로모터 및 그의 용도
KR101783170B1 (ko) 2016-08-31 2017-09-29 씨제이제일제당 (주) 신규 프로모터 및 이의 용도
KR101968317B1 (ko) * 2018-02-23 2019-04-11 씨제이제일제당 주식회사 신규 l-트립토판 배출 단백질 및 이를 이용한 l-트립토판을 생산하는 방법

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102205717B1 (ko) * 2019-04-05 2021-01-22 씨제이제일제당 주식회사 신규 l-트립토판 배출 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-트립토판을 생산하는 방법

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6858406B1 (en) 1995-12-22 2005-02-22 Forschungszentrum Jülich GmbH Process for the microbial production of amino acids by boosted activity of export carriers
EP1013765A1 (en) 1998-12-23 2000-06-28 Ajinomoto Co., Ltd. Gene and method for producing L-amino acids
EP1016710B1 (en) 1998-12-30 2010-03-17 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-amino acids
KR100791794B1 (ko) * 1999-02-20 2008-01-04 에보니크 데구사 게엠베하 코리네형 세균을 사용한 ｌ-아미노산의 발효적 생산 방법
KR20050044860A (ko) * 2001-11-23 2005-05-13 아지노모토 가부시키가이샤 에스케리키아속 세균을 사용한 ｌ-아미노산의 제조방법
KR100620092B1 (ko) 2004-12-16 2006-09-08 씨제이 주식회사 코리네박테리움 속 세포로부터 유래된 신규한 프로모터서열, 그를 포함하는 발현 카세트 및 벡터, 상기 벡터를포함하는 숙주 세포 및 그를 이용하여 유전자를 발현하는방법
KR100924065B1 (ko) 2006-09-15 2009-10-27 씨제이제일제당 (주) Ｌ－라이신 생산능이 향상된 코리네박테리아 및 그를 이용한 ｌ－라이신 생산 방법
KR101632642B1 (ko) 2015-01-29 2016-06-22 씨제이제일제당 주식회사 신규한 프로모터 및 그의 용도
KR101783170B1 (ko) 2016-08-31 2017-09-29 씨제이제일제당 (주) 신규 프로모터 및 이의 용도
KR101968317B1 (ko) * 2018-02-23 2019-04-11 씨제이제일제당 주식회사 신규 l-트립토판 배출 단백질 및 이를 이용한 l-트립토판을 생산하는 방법
WO2019164348A1 (ko) 2018-02-23 2019-08-29 씨제이제일제당 (주) 신규 l-트립토판 배출 단백질 및 이를 이용한 l-트립토판을 생산하는 방법

Non-Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
APPL. ENVIRON. MICROBIOL., vol. 63, 1997, pages 761 - 762
APPL. MICROBIOL. BIOTECHNOL., vol. 52, 1999, pages 541 - 545
APPL. MICROBIOL. BIOTECHNOL., vol. 75, 2007, pages 103 - 110
DATABASE PROTEIN 6 April 2020 (2020-04-06), ANONYMOUS : "aromatic amino acid DMT transporter YddG [Herbaspirillum rhizosphaerae] ", XP055872186, retrieved from NCBI Database accession no. WP_050478745 *
DG GIBSON ET AL.: "NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix", NATURE METHODS, vol. 6, no. 5, May 2009 (2009-05-01)
F. M. AUSUBEL ET AL., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY
FEMS MICROBIOL LETT, vol. 275, 2007, pages 312 - 318
J IND MICROBIOL BIOTECHNOL, vol. 42, no. 5, May 2015 (2015-05-01), pages 787 - 97
J. SAMBROOK ET AL.: "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
KARLINALTSCHUL, PRO. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 90, 1993, pages 5873
NATURE BIOTECHNOL, vol. 14, 1996, pages 620
PEARSON, METHODS ENZYMOL., vol. 183, 1990, pages 63
See also references of EP4144848A4

Also Published As

Publication number Publication date
US20230272441A1 (en) 2023-08-31
BR112022023964A2 (pt) 2023-02-23
JP2023527830A (ja) 2023-06-30
KR102647745B1 (ko) 2024-03-14
EP4144848A1 (en) 2023-03-08
CN116472352A (zh) 2023-07-21
KR20210146670A (ko) 2021-12-06
EP4144848A4 (en) 2023-11-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2020130236A1 (ko) 변이형 호모세린 디하이드로게나제 및 이를 이용한 호모세린 또는 호모세린 유래 l-아미노산의 생산 방법
WO2019231159A1 (ko) 변이형 호모세린 디하이드로게나제 및 이를 이용한 호모세린 또는 호모세린 유래 l-아미노산의 생산 방법
WO2020218736A1 (ko) L-히스티딘 생산능이 강화된 미생물 및 이를 이용한 히스티딘 생산방법
WO2019190192A1 (ko) 신규한 프로모터 및 이를 이용한 l-아미노산 생산 방법
WO2019147059A1 (ko) L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산의 생산방법
WO2016148490A1 (ko) 피루브산 디하이드로게나아제 변이체, 이를 포함하는 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산 생산 방법
WO2020226341A1 (ko) L-아미노산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산을 생산하는 방법
WO2022055094A1 (ko) L-글루탐산 생산 재조합 미생물 및 이를 이용한 l-글루탐산의 제조방법
WO2021242032A1 (ko) 신규 l-타이로신 배출 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-타이로신을 생산하는 방법
WO2021177731A1 (ko) 글루타민 신테타아제 변이형 폴리펩티드 및 이를 이용한 l-글루타민 생산 방법
WO2020256415A1 (ko) L-타이로신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 l-타이로신 생산 방법
WO2022191630A1 (ko) 신규한 시트레이트 신타아제 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법
WO2022050671A1 (ko) L-발린 생산 미생물 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법
WO2022005022A1 (ko) L-이소류신 생산능이 강화된 미생물 및 이를 이용한 l-이소류신 생산방법
WO2022124708A1 (ko) 신규한 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제 변이체 및 이를 이용한 이소류신 생산 방법
WO2020218737A1 (ko) L-쓰레오닌 생산능이 강화된 미생물 및 이를 이용한 쓰레오닌 생산방법
WO2021153866A1 (ko) 시트레이트 신타아제의 활성이 약화된 신규한 변이형 폴리펩티드 및 이를 이용한 l-아미노산 생산 방법
WO2022163904A1 (ko) 신규한 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-라이신 생산 방법
WO2021261733A1 (ko) L-쓰레오닌 디하이드라타아제의 신규 변이체 및 이를 이용한 l-이소류신 생산 방법
WO2024035191A1 (ko) 케톨산 리덕토아이소머라제 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법
WO2023171997A1 (ko) 변이형 l-쓰레오닌 배출 단백질 및 이를 이용한 l-쓰레오닌 생산 방법
WO2023171996A1 (ko) 변이형 l-쓰레오닌 배출 단백질 및 이를 이용한 l-쓰레오닌 생산 방법
WO2023121055A1 (ko) L-이소루신 생산 미생물 및 이를 이용한 l-이소루신 생산 방법
WO2023177161A1 (ko) 카르바모일 인산 합성효소 라지 서브유닛 변이체 및 이를 이용한 l-오르니틴 생산 방법
WO2022191467A1 (ko) L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산의 생산방법

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21813776

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022572662

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021813776

Country of ref document: EP

Effective date: 20221201

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112022023964

Country of ref document: BR

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 202180047331.9

Country of ref document: CN

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112022023964

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20221124