CN116472352A - 新的l-酪氨酸输出蛋白质变体及利用其的l-酪氨酸生产方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及具有L‑酪氨酸输出活性的蛋白质变体、表达所述蛋白质变体的微生物及其用途。

Description

新的L-酪氨酸输出蛋白质变体及利用其的L-酪氨酸生产方法
【技术领域】
本申请涉及一种具有L-酪氨酸输出活性的新的蛋白质变体、一种包括该蛋白质变体在内的L-酪氨酸生产微生物，以及利用该微生物生产L-酪氨酸的方法。
【背景艺术】
L-酪氨酸是一种氨基酸，是用作医药原料、食品添加剂、动物饲料、营养补充剂等的重要原料。为了生产L-酪氨酸和其他有用的材料，正在进行各种研究，以开发具有高效生产和发酵过程技术的微生物。
微生物生产L-酪氨酸的过程始于3-脱氧-D-阿罗比糖庚醛酸-7-磷酸酯(DAHP)聚合反应产生的磷酸烯醇丙酮酸(PEP)，PEP是糖酵解的中间体，与红藓糖-4-磷酸(E4P)是磷酸戊糖途径的中间体。然后，DAHP通过共同芳族生物合成途径从绒毛膜生物合成到预芬酸盐，最后通过L-酪氨酸生物合成途径转化为L-酪氨酸。
同时，能够输出特定氨基酸的基因的表达有助于提高微生物中相应氨基酸的生产力。棒杆菌属(Corynebacterium)微生物中L-赖氨酸输出基因(lysE)的增强提高了赖氨酸的生产力(US 6858406 B1)。此外，大肠埃希氏菌(E.coli)中rhtC基因的增强提高了对L-苏氨酸的抵抗力，同时也提高了L-高丝氨酸，L-苏氨酸和L-亮氨酸的生产力(EP 1013765A1)。EP 1016710 B1揭示了通过增强功能尚未在大肠埃希氏菌(E.coli)中鉴定的yahN、yeaS、yfiK和yggA等基因来提高L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-缬氨酸和L-异亮氨酸的生产力。
【发明概述】
【技术问题】
然而，尚未有显示对L-酪氨酸特异性的输出蛋白的报道。虽然大肠埃希氏菌(E.coli)的yddG基因被称为芳族氨基酸的输出蛋白，但它对L-苯丙氨酸的特异性高于L-酪氨酸或L-色氨酸(FEMS Microbiol Lett 275(2007)312-318)。此外，在主要用作L-氨基酸生产的菌株的棒杆菌属(Corynebacterium)微生物中，没有报道L-酪氨酸或芳族氨基酸输出基因(J Ind Microbiol Biotechnol.2015May；42(5)：787-97)。
【技术方案】
本申请的目的之一是提供一种蛋白质变体，其中在SEQ ID NO：52的氨基酸序列中自N末端起79位的氨基酸被丙氨酸或甘氨酸取代；编码所述蛋白质变体的多核苷酸；和含有所述多核苷酸的载体。
本申请的另一个目的是提供一种用于生产L-酪氨酸的微生物，包括一种或多种所述蛋白质变体；编码所述蛋白质变体的多核苷酸；和含有所述多核苷酸的载体。
本申请的另一个目的是提供一种生产L-酪氨酸的方法，其包括：培养所述微生物。
本申请的又一个目的是提供一种用于生产L-酪氨酸的组合物，其包括任一种或多种所述蛋白质变体；多核苷酸；载体和微生物。
【有利效果】
与不表达该蛋白质变体的亲本菌株相比，本申请表达所述蛋白质变体的微生物可以显著改善L-酪氨酸的生产，并且因此能够有效地利用该蛋白质变体生产L-酪氨酸。
【优选实施方式的详细说明】
以下，对本申请进行详细说明。同时，本文公开的每个描述和实施例可以分别应用于其它描述和实施例。也就是说，本文公开的各种元件的所有组合都属于本申请的范围。此外，本申请的范围不受下面描述的具体描述的限制。
此外，本领域普通技术人员可以仅使用常规实验来识别或确认与本文描述的本发明的特定方面的许多等效物。此外，还打算在本申请中包括这些等同物。
此外，许多论文和专利文献已在整个本说明书中被引用和引用。本文引用的论文和专利文献的内容全文并入本文，本发明所属的技术领域水平和本发明的内容将更加清晰地描述。
本申请的一方面提供了一种具有L-酪氨酸输出活性的蛋白质变体，其中在SEQ IDNO：52的氨基酸序列中一个或多个氨基酸被另一种氨基酸取代。
所述蛋白质变体可以是具有L-酪氨酸输出活性的蛋白质变体，其中SEQ ID NO：52的氨基酸序列中自N末端起第79位的氨基酸被另一种氨基酸取代。
本文所用的术语“L-酪氨酸”是指20种α氨基酸之一，并被分类为极性氨基酸或芳族氨基酸。酪氨酸是一种商业上至关重要的氨基酸，用作药物、类黄酮、生物碱等的前体。
在本申请中，“具有L-酪氨酸输出活性的蛋白质”可以是具有能够特异性地将L-酪氨酸输出细胞的活性的蛋白质。
本申请的具有L-酪氨酸输出活性的蛋白质可以来源于根际草螺菌(Herbaspirillum rhizosphaerae)来源的具有L-酪氨酸输出能力的蛋白质，但不限于此。
特别地，所述“根际草螺菌(Herbaspiril lum rhizosphaerae)”是一种属于草螺菌属(Herbaspiril lum)的革兰氏阴性菌。在韩国，作为从郁陵岛分离的菌株，它可以从土壤中的根际中分离出来。
尽管来源于根际草螺菌(Herbaspiril lum rhizosphaerae)的具有L-酪氨酸输出活性的蛋白质可以是例如包括SEQ ID NO：52的氨基酸序列的蛋白质，但显而易见的是，任何具有与SEQ ID NO：52的氨基酸序列相同的活性，其中SEQ ID NO：52的序列的对应于第79位的位置被本申请的野生型序列以外的另一种氨基酸取代，从而具有输出L-酪氨酸的能力的序列也作为对应于第79位的残基发生氨基酸突变的对象蛋白，也不受限制地在本申请的范围内。包括SEQ ID NO：52的氨基酸序列的蛋白质可以与具有SEQ ID NO：52的氨基酸序列的蛋白质和由SEQ ID NO：52的氨基酸序列组成的蛋白质互换使用。
具体地，本申请的具有L-酪氨酸输出活性的蛋白质可以是包括SEQ ID NO：52的氨基酸序列的蛋白质的变体。
包括SEQ ID NO：52的氨基酸序列的蛋白质是具有L-色氨酸输出活性的蛋白质，并且在本申请中新鉴定出对应于第79位的氨基酸突变的变体具有L-酪氨酸输出活性。
在本申请中，包括SEQ ID NO：52的氨基酸序列的蛋白质是可以导入本申请的突变的蛋白质中的代表性例子，不排除在SEQ ID NO：52的氨基酸序列的上游或下游添加序列，这种突变可能自然发生，或是沉默突变，并且当蛋白质具有与包括SEQ IDNO：52的氨基酸序列的蛋白质相同或相应的活性时，该蛋白质属于本申请中可以导入突变的蛋白质。
例如，在本申请中可以导入突变的蛋白质可以是由SEQ ID NO：52的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：52的氨基酸序列具有80％、90％、95％、97％或更高的同源性的氨基酸序列组成的蛋白质。此外，很明显，任何具有部分序列缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列的蛋白质，只要该蛋白质具有上述同源性和同一性，并表现出与上述蛋白质相对应的效果，则也可以属于本申请的突变对象蛋白质的范围。
也就是说，在本申请中，尽管被描述为“具有特定SEQ ID NO的氨基酸序列的蛋白质或多肽”或“包括特定SEQ ID NO的氨基酸序列的蛋白质或多肽”，但显而易见的是，在部分氨基酸序列中具有缺失、修饰、取代或添加的任何蛋白质也可以用于本申请中，只要蛋白质具有相同或相应的活性，由氨基酸序列组成的氨基酸序列为相应的SEQ ID NO。例如，很明显，只要蛋白质具有相同或相应的活性，“由SEQ ID NO：52的氨基酸序列组成的蛋白质”可能属于“包括SEQ ID NO：52的氨基酸序列的蛋白质”。
本文所用的术语“变体”是指通过保守的替换和/或修饰使得蛋白质的功能和性质得以保留而具有与所述序列不同的一个或多个氨基酸的蛋白质。这些变体不同于通过替换、删除或添加几个氨基酸来识别的序列。这种变异通常可以通过修饰蛋白质的一个或多个上述氨基酸序列并评估修饰蛋白质的性质来鉴定。也就是说，相对于天然蛋白质，变体的能力可能会增强、改变或降低。此外，一些变体可能包括去除一个或多个部分(例如N末端引导序列或跨膜结构域)的变体。此外，一些变体可能包括从成熟蛋白的N端和/或C末端去除一个或多个部分的变体。术语“变体”可以与修饰、修饰蛋白、修饰多肽、突变、突变、突变、分歧、变异等术语互换使用，不受限制，只要这些术语用于表示突变。为了本申请的目的，所述变体可以是那些与天然野生型或非修饰型蛋白质相比，蛋白质的活性增强的变体，但不限于此。
本文所用的术语“保守取代”是指用具有相似结构和/或化学性质的另一氨基酸取代一种氨基酸。例如，该变体可能具有一个或多个保守的替代，同时仍保留一种或多种生物活性。这种氨基酸取代通常可以基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性性质的相似性而发生。
例如，在具有带电侧链的氨基酸中，带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；带负电荷(酸性)氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸；具有不带电荷侧链的氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。
此外，该变体还可以包括缺失或添加对多肽的性质和二级结构影响最小的氨基酸。例如，多肽可以与参与共翻译或翻译后蛋白质转移的N末端的信号(或前导)序列偶联。此外，多肽还可以与另一个序列或接头偶联以鉴定、纯化或合成多肽。
本申请提供的具有L-酪氨酸输出活性的蛋白质变体可以指这样的变体，其中，在上述蛋白质中，处于特定位置的氨基酸或其对应的氨基酸被另一种氨基酸取代，并且所得的L-酪氨酸蛋白的输出能力与突变前的蛋白质相比超过100％。
在本申请中，“用另一种氨基酸取代”不受限制，只要在取代之前用氨基酸以外的氨基酸取代即可。也就是说，SEQ ID NO：52的氨基酸序列的自N末端起第79位的氨基酸亮氨酸被“亮氨酸以外的氨基酸”取代的表达可以表示为“SEQ ID NO：52的氨基酸序列的自N末端起第79位的氨基酸被另一种氨基酸取代”。同时，在本申请中，当表达“特定氨基酸已被取代”时，很明显，该氨基酸被取代前的氨基酸所取代，即使没有明确说明该氨基酸已被不同的氨基酸取代。
本申请的蛋白质变体可以是其中SEQ ID NO：52的氨基酸序列的自N末端起第79位的氨基酸被另一种氨基酸取代的变体，但不限于此。
具体地，本申请的蛋白质变体可以是其中SEQ ID NO：52的氨基酸序列的自N末端起第79位的氨基酸被丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、脯氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、精氨酸或色氨酸取代，但不限于此。
具体地，本申请的蛋白质变体可以是其中SEQ ID NO：52的氨基酸序列的自N末端起第79位的氨基酸被丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、精氨酸或色氨酸取代，但不限于此。具体地，本申请的蛋白质变体可以是其中SEQ ID NO：52的氨基酸序列的自N末端起第79位的氨基酸被丙氨酸或甘氨酸取代的变体，但不限于此。
与突变前的蛋白质相比，本申请的这种蛋白质变体具有增强的L-酪氨酸输出能力。
很明显，本申请SEQ ID NO：52的氨基酸序列的自N末端起第79位的氨基酸被另一种氨基酸取代的蛋白质变体明显可以包括即使是SEQ ID NO：52的氨基酸序列的N或C末端，或者，因中间的氨基酸缺失/附加/插入等而记载为不是第79位的别的位置的情况，对应于SEQ ID NO：52的氨基酸序列的自N末端起第79位的位置的氨基酸被别的氨基酸的取代的蛋白质变体。
此外，尽管在本申请中，蛋白质变体，其中SEQ ID NO：52的氨基酸序列的自N末端起第79位的氨基酸被另一种氨基酸取代，已被描述为具有L-酪氨酸输出活性的蛋白质，但本申请中具有L-酪氨酸输出活性的蛋白质变体不限于SEQ ID NO：52的变体，并且很明显，在与SEQ ID NO：52的氨基酸序列具有相同的活性或L-酪氨酸排出活性的任意的氨基酸序列中“对应于SEQ ID NO：52的氨基酸序列的自N末端起第79位位置的氨基酸”被别的氨基酸取代而具有L-酪氨酸排出活性的变体也属于本申请的蛋白质变体的范围。
在任何氨基酸序列中都可以通过本领域已知的各种序列比对方法确认“对应于SEQ ID NO：52的氨基酸序列的自N末端起第79位的氨基酸”。
本申请的在SEQ ID NO：52的氨基酸序列的自N末端起第79位的氨基酸被另一种氨基酸取代的蛋白质变体可以是包括SEQ ID NO：52的氨基酸序列或与其具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高同源性或同一性的氨基酸序列的对应于SEQ IDNO：52的氨基酸序列的自N末端起第79位的氨基酸被另一种氨基酸取代的蛋白质。
本申请的蛋白质变体可以包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：77至85中的任意一个的氨基酸序列。具体而言，它可以是基本上由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQID NO：77至85中任何一个的氨基酸序列组成的，更具体地说，它可以由SEQ ID NO：1、SEQID NO：2和SEQ ID NO：77至85中的任何一个氨基酸序列组成。在一个实施方案中，本申请的蛋白质变体可以由SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：77至83的氨基酸序列中的任何一个组成，并且在另一个实施方案中，本申请的蛋白质变体可以由SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2的氨基酸序列组成，但不限于此。
本申请的蛋白质变体可以包括以下氨基酸序列中的任意一个：SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQID NO：82，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：83，SEQ IDNO：84和SEQ ID NO：85。本申请的蛋白质变体可以包括SEQ ID NO：1、2和SEQ IDNO：77至83的氨基酸序列中的任何一个。本申请的蛋白质变体可以包括SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列，但不限于此。
同时，本申请的蛋白质变体可以基本上由上述SEQ ID NO的氨基酸序列组成，或者可以由上述SEQ ID NO的氨基酸序列组成，但不限于此。
此外，蛋白质变体可以包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：77至85中的任意一个氨基酸序列中第79位的氨基酸是固定的、并且与其具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性或同一性的任何氨基酸序列，但不限于此。此外，很明显，只要是具有上述任何同源性或同一性并表现出与上述蛋白质变体相对应的效果的氨基酸序列，除了上述第79位之外具有缺失、修饰、取代或添加部分序列的氨基酸序列的蛋白质也可以包括在本申请的范围内。
本文所用的术语“同源性”或“同一性”是指两个给定氨基酸序列或核苷酸序列之间的相关性程度，并且可以表示为百分比。
术语同源性和同一性通常可以相互互换地使用。
保守多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性可以通过标准比对算法来确定，并且可以与由所使用的程序建立的默认空位罚分一起使用。基本上，同源或相同的序列可以在中度或高度严格的条件下杂交，使得序列的全长或全长的至少约50％，60％，70％，80％或90％或更多可以杂交。在杂交多核苷酸中，还考虑了含有简并密码子而不是密码子的多核苷酸。
多肽或多核苷酸序列的同源性或同一性可以通过例如由文献的BLAST算法(Karlin和Altschul，Pro.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873(1993))或由Pearson的FASTA(Methods Enzymol.，183，63，1990)确定。基于算法BLAST，已经开发了一个称为BLASTN或BLASTX的程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。此外，无论任何氨基酸或多核苷酸序列彼此之间是否具有同源性、相似性或同一性，都可以通过在定义的严格条件下比较Southen杂交实验中的序列来确认，并且定义的适当杂交条件在本领域技术范围内，并且可以通过本领域技术人员熟知的方法(例如，J.Sambrook et al.,Molecular Cloning,A LaboratoryManual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,NewYork,1989；F.M.Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley&Sons,Inc.,New York)确认。
本申请的另一方面提供了编码蛋白质变体的多核苷酸。
本文所用的“多核苷酸”，其是核苷酸单体通过共价键连接成长链状的核苷酸聚合物，是具有至少一定长度的DNA或RNA链。更具体地说，它可以指编码蛋白质变体的多核苷酸片段。
编码本申请的蛋白质变体的多核苷酸可以不受限制地包括在内，只要它是编码具有L-酪氨酸输出能力的蛋白质变体的多核苷酸序列。
在本申请中，编码用于突变的蛋白质的氨基酸序列的基因可以是wex基因，也可以来源于根际草螺菌(Herbaspiril lum rhizosphaerae)，具体地说，可以是编码SEQ ID NO：52的氨基酸序列的核苷酸序列，但不限于此。
此外，编码本申请的蛋白质变体的多核苷酸因密码子的简并性(degeneracy)或考虑在要表达所述蛋白质变体的生物中优选的密码子，而可在不改变多肽的氨基酸序列的范围内经历各种修饰。具体而言，只要是编码SEQ ID NO：52的氨基酸序列中的第79位的氨基酸被另一种氨基酸取代的蛋白质变体的多核苷酸序列，就可以不受限制地包括在内。
例如，本申请的多核苷酸可以是编码本申请的蛋白质变体(具体地说，包括SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：77至85的氨基酸序列中的任何一个的蛋白质，或者与其具有同源性或同一性的蛋白质)的多核苷酸序列，但不限于此。同源性和同一性如上所述。
此外，也可无限制地包括可由公知的基因序列制造的探针(例如，与所述多核苷酸序列全体或一部分的互补序列在严格的条件下杂交而编码SEQ ID NO：52的氨基酸序列的第79位氨基酸被别的氨基酸取代的蛋白质变体的序列)。
“严格条件”是指允许多核苷酸之间进行特异性杂交的条件。这些条件在文献中有具体描述(J.Sambrook等人，同上)。例如，严格条件可包括具有40％或更高、具体而言是90％或更高，特别是95％或更多，甚至更具体地说是97％或更多，更具体地说是99％或更多的同源性或同一性的基因相互杂交，并且具有低于上述同源性或同一性的同源性或同一性的基因不相互杂交的条件，或Southen杂交的洗涤条件，即在对应于60℃、1×SSC、0.1％SDS，特别是60℃、0.1×SSC、0.1％SDS，更具体地说是68℃、0.1×SSC、0.1％SDS的盐浓度和温度下洗涤一次、具体地洗涤2次或3次。然而，条件不限于此，并且可以由本领域技术人员根据目的适当地进行调整。
尽管取决于杂交的严格程度而碱基之间可具有错配，杂交要求两个多核苷酸含有互补序列。术语“互补”用于描述可以相互杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，关于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本申请可以包括与整个序列互补的分离的多核苷酸片段以及与其基本相似的多核苷酸序列。
具体地，具有同源性的多核苷酸可以使用包括在55℃的Tm值的杂交步骤的杂交条件进行检测。此外，Tm值可以是60℃、63℃或65℃，但不限于此，并且可以由本领域技术人员根据其目的适当地进行调整。
杂交多核苷酸的适当严格程度取决于多核苷酸的长度和互补程度，并且这些变量是本领域公知的(例如，Sambrook等人，同上，9.50-9.51，11.7-11.8)。
本申请的又一方面提供了含有编码蛋白质变体的多核苷酸的载体。
本文所用的术语“载体”是指含有编码靶蛋白的多核苷酸序列的DNA构建体，该多核苷酸可操作地连接到合适的表达调控序列，以便能够在合适的宿主细胞中表达靶蛋白。所述表达调控序列可包括：能够启动转录的启动子、用于调节转录的任何操纵序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列以及用于调节转录和翻译终止的序列。一旦转化合适的宿主细胞，载体可以独立于宿主基因组进行复制或发挥功能，或者可以整合到宿主基因组中。
本申请中使用的载体没有特别限制，可以使用本领域已知的任何载体。通常使用的载体的例子可以包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，作为噬菌体载体或粘粒载体，可以使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A和Charon21A等；作为质粒载体，可以使用基于pBR，pUC，pBluescriptII，pGEM，pTZ，pCL和pET等的质粒载体。具体地，可以使用pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118或pCC1BAC载体。
在一示例中，可以通过用于在细胞内染色体插入的载体，将编码染色体中靶蛋白的多核苷酸替换为变异的多核苷酸。将多核苷酸插入染色体可以通过本领域已知的任何方法进行，例如通过同源重组，但不限于此。载体还可以包括选择标记，以确认插入到染色体中。选择标记用于选择用载体转化的细胞，即用于确认靶核酸分子是否已插入，并且可以使用提供可选表型的标记，例如耐药性、营养性、对细胞毒性药物的抵抗力或表面蛋白的表达。只有表达选择标记的细胞才能在用选择性试剂处理的环境中存活或显示不同的表型，因此可以选择转化的细胞。
本申请的又一方面提供了用于生产L-酪氨酸的微生物，包括下列之任一种或多种：所述蛋白质变体；编码所述蛋白质变体的多核苷酸；和含有所述多核苷酸的载体。
用于生产L-酪氨酸的微生物可以是与包括野生型SEQ ID NO：52的微生物相比具有增强的L-酪氨酸生产能力的微生物，包括下列之任一种或多种：所述蛋白质变体；编码所述蛋白质变体的多核苷酸；和含有所述多核苷酸的载体。
所述微生物可以是具有L-酪氨酸生产能力的微生物，其包括下列之任一种或多种：所述蛋白质变体；编码所述蛋白质变体的多核苷酸；含有所述多核苷酸的载体，但不限于此。
本文所用的术语“用于生产L-酪氨酸的微生物”或“具有L-酪氨酸生产能力的微生物”可以是具有自然产生酪氨酸能力的微生物，或者向不具有酪氨酸生产能力的亲本菌株赋予酪氨酸生产能力的微生物。
微生物可以是与野生型或非修饰微生物相比，能够从碳源生产过量的L-酪氨酸的微生物。另外，用于生产L-酪氨酸的微生物可以是重组微生物。具体而言，该微生物只要能生产L-酪氨酸，其类型就没有特别限制，可以是肠杆菌属(Enterobacter)的微生物，埃希氏菌属(Escherichia)的微生物，欧文氏菌属(Erwinia)的微生物，沙雷氏菌属(Serratia)的微生物，普罗威登斯菌属(Providencia)的微生物，棒杆菌属(Corynebacterium)的微生物或短杆菌属(Brevibacterium)的微生物。更具体地说，微生物可以是棒杆菌属(Corynebacterium)的微生物或埃希氏菌属(Escherichia)的微生物。更具体地说，所述微生物可以是棒杆菌属(Corynebacterium)的微生物，例如谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)，但不限于此。
更具体地说，埃希氏菌属(Escherichia)的微生物可以是大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，并且棒杆菌属(Corynebacterium)的微生物可以是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，但是包括但不限于具有L-酪氨酸输出活性的蛋白质被导入或活性增强而L-酪氨酸生产量增加的任何埃希氏菌属(Escherichia)或棒杆菌属(Corynebacterium)的微生物。
通过包括本申请的蛋白质变体；编码所述蛋白质变体的多核苷酸；含有所述多核苷酸的载体，可以生产L-酪氨酸的微生物可以是表达本申请的蛋白质变体的微生物。
本文所用的术语“待表达/表达”的蛋白质是指将靶蛋白质导入微生物或将靶蛋白质修饰以在微生物中表达的状态。当靶蛋白是存在于微生物中的蛋白质时，该术语是指与其内源性蛋白质的活性或其修饰之前的活性相比，蛋白质的活性增强的状态。
表达本申请的蛋白质变体的微生物可以是已被修饰以表达所述蛋白质变体的微生物，因此，本申请的另一方面提供了生产表达本申请的蛋白质变体的微生物的方法。
根据本申请的目的，“靶蛋白”可以是具有上述L-酪氨酸输出活性的蛋白质变体。
具体地，术语“导入蛋白质”是指微生物表现出该微生物最初不具备的特定蛋白质的活性，或者该微生物表现出与其内源性活性或修饰前蛋白质的活性相比增强的活性。例如，这可能意味着编码特定蛋白质的多核苷酸被导入微生物的染色体中；或者将含有编码特定蛋白质的多核苷酸的载体导入微生物中，从而允许出现特定蛋白质的活性。此外，术语“活性增强”是指微生物拥有的特定蛋白质的活性与其内源性活性或其修饰前的活性相比增强。术语“内源性活性”是指在微生物的性状由于自然或人为因素引起的基因突变而改变的情况下，在修饰之前最初由亲本菌株具有的特定蛋白质的活性。
具体地，本申请的活性增强可以通过选自以下组的一种或多种用于增强活性的方法来实现：用于增加编码该蛋白质变体的基因的细胞内拷贝数的方法；将突变导入编码蛋白质变体的基因的表达控制序列的方法；用具有强活性的序列替换编码具有L-酪氨酸输出活性的蛋白质变体的基因的表达控制序列的方法；用编码蛋白质变体的基因替换编码染色体上具有L-酪氨酸输出活性的天然蛋白质的基因的方法；进一步将突变导入编码蛋白质的基因而使蛋白质变体的活性得到增强的方法；以及将蛋白质变体导入微生物的方法，但不限于此。
在上述中，增加基因拷贝数的方法可以以基因可操作地与载体连接的形式进行，或者通过将基因插入宿主细胞的染色体中，但该方法并不特别限于此。具体而言，可以通过将可操作地连接了编码本申请蛋白质的多核苷酸并且可与宿主细胞无关地复制和发挥作用的载体导入宿主细胞来增加基因的拷贝数。或者，可以通过向宿主细胞的染色体中导入可操作地连接了所述多核苷酸并且可将所述多核苷酸插入宿主细胞的染色体中的载体来增加基因的拷贝数。将多核苷酸插入染色体可以通过本领域已知的方法例如同源重组来实现。
然后，用于增加多核苷酸表达的表达控制序列的修饰无特别限制，可以通过缺失、插入、非保守或保守取代或其组合来诱导核酸序列中的突变来进行，从而进一步增强表达控制序列的活性；或者通过用活性更强的核酸序列替换表达控制序列来进行。所述表达控制序列可以包括：启动子、操纵序列、编码核糖体结合位点的序列、控制转录和翻译终止的序列等，但表达控制序列并不特别限于此。
可将强启动子(而不是原始启动子)连接到多核苷酸表达单元的上游区域，但不限于此。本领域已知的强启动子的实例可包括cj1至cj7启动子(韩国专利No.10-0620092)、lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体PR启动子、PL启动子、tet启动子、gapA启动子、SPL7启动子、SPL13(sm3)启动子(韩国专利No.10-1783170)，O2启动子(韩国专利No.10-1632642)，tkt启动子，yccA启动子等，但强启动子不限于此。
此外，染色体上多核苷酸序列的修饰无特别限制，可以通过缺失、插入、非保守或保守替换或其组合来诱导表达控制序列上的突变来进行，从而进一步增强多核苷酸序列的活性；或者通过用改进的多核苷酸序列替换多核苷酸序列来进行，以具有更强的活性。
如上所述的蛋白质活性的导入和增强通常可以基于蛋白质在野生型或非修饰微生物菌株中的活性或浓度，使相应蛋白质的活性或浓度增加至少1％、10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或500％，以及最多1,000％或2,000％，但不限于此。
如本文所用，术语“非修饰菌株”并不排除含有可能在微生物中自然发生的突变的菌株，并且可以指天然型菌株本身，或者由于自然或人为因素引起的遗传修饰而改变性状之前的菌株。“非修饰菌株”可与“非突变菌株”、“修饰前菌株”、“修饰前微生物”、“非突变微生物”、“非修饰微生物”或“参考微生物”互换使用。在一个实施方案中，未修饰的微生物可以是不包括具有本申请的L-酪氨酸输出活性的蛋白质变体的菌株。
本申请的微生物可以是：具有酪氨酸生产能力的天然微生物本身，参与酪氨酸生产机制的基因的活性被增强或灭活而具有改进的酪氨酸生产能力的微生物，或者导入或增强外源基因的活性而具有改进的酪氨酸生产能力的微生物。
为了赋予本申请的微生物L-酪氨酸的生产能力或增加生产能力，可以使用：前体(例如赤藓糖-4-磷酸(E4P))的连续供应，用于有效的能量利用的修饰，通过阻断L-酪氨酸生物合成途径中的旁路途径来增加L-酪氨酸生物合成的方法，或者较少量利用ATP的修饰等。
具体地，在本申请中，被修饰使得可以表达具有L-酪氨酸输出活性的蛋白质变体的生产L-酪氨酸的微生物的亲本菌株只要是生产L-酪氨酸的微生物，就没有特别限制。为了增强L-酪氨酸生物合成途径，生产L-酪氨酸的微生物可以是竞争途径中的基因活性、L-酪氨酸操纵子定向途径中的调节因子、输入L-酪氨酸的基因或导入和分解L-酪氨酸的基因被削弱或失活的微生物；和/或调节L-酪氨酸操纵子活性的微生物.
例如，对于微生物修饰，芳族氨基酸输入蛋白的活性可以与其内源性活性相比减弱或去除(例如，衰减/去除aroP活性)，并且可以通过将突变导入编码参与反馈调节的蛋白质的基因(例如，tyrA，aroG)来解除反馈。此外，编码参与前体供应的蛋白质的基因(例如tkt基因)的表达可以增强。此外，竞争途径中的基因(例如，pheA)的活性可以与其内源性活性相比减弱、去除或改变(例如，L-色氨酸浓度依赖性改变)，但不限于此。
甚至本申请的另一方面提供了生产L-酪氨酸的方法，其包括：在培养基中培养表达本申请的具有L-酪氨酸输出活性的蛋白质变体的微生物。
蛋白质变体、蛋白质表达和微生物均与上述相同。
如本文所用，术语“培养”是指使微生物在适当控制的环境条件下生长。本申请的培养过程可以在本领域已知的合适的培养基和培养条件下进行。这样的培养方法可以容易地根据所选择的菌株调整供本领域技术人员使用。具体地，培养可以是分批培养、连续培养和补料分批培养，但不限于此。
本文所用的术语“培养基”是指含有培养微生物所需的营养物质作为主要成分的材料的混合物，并且它提供营养物质和生长因子，以及对于生存和生长至关重要的水。具体地，本申请中用于培养微生物的培养基和其它培养条件可以是用于常规微生物培养的任何培养基，而没有任何特殊限制。然而，本申请的微生物可以在含有适当碳源、氮源、磷源、无机化合物、氨基酸和/或维生素的常规培养基中在需氧条件下，同时调节温度、pH等而进行培养。
在本申请中，碳源可包括碳水化合物，如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等；糖醇，如甘露糖醇、山梨糖醇等；有机酸，如丙酮酸、乳酸、柠檬酸等；氨基酸，如谷氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸等。此外，碳源可包括天然有机营养素，例如淀粉水解物，糖蜜，黑糖蜜，米糠，木薯，甘蔗糖蜜和玉米浸泡液等。具体地，可以使用碳水化合物如葡萄糖和灭菌的预处理糖蜜(即转化为还原糖的糖蜜)，此外，可以不受限制地使用适量的各种其它碳源。这些碳源可以单独使用，也可以以两种或多种的组合使用，但不限于此。
所述氮源可包括无机氮源，如氨、硫酸铵、氯化铵、乙酸铵、磷酸铵、碳酸铵、硝酸铵等；氨基酸，如谷氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺等；和有机氮源，如蛋白胨、NZ-胺、肉类提取物、酵母提取物、麦芽提取物、玉米浸泡液、酪蛋白水解物、鱼或其分解产物、脱脂豆饼或其分解产物等。这些氮源可以单独使用，也可以以两种或多种的组合使用，但不限于此。
磷源可以包括磷酸一钾、磷酸二钾或相应的含钠盐等。无机化合物的实例可包括氯化钠、氯化钙、氯化铁、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰、碳酸钙等。此外，可能包括氨基酸、维生素和/或适当的前体。这些构成成分或前体可以分批或连续的方式添加到培养基中，但不限于此。
在本申请中，培养基的pH值可以通过在微生物培养过程中通过以适当的方式向培养基中加入诸如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸、硫酸等的化合物来调节。此外，在培养过程中，可以添加消泡剂，例如脂肪酸聚乙二醇酯，以防止泡沫产生。此外，可以将氧气或含氧气体注入培养基中以维持培养基的有氧状态；可以注入氮气、氢气或二氧化碳气体或不注入气体以维持培养基的厌氧或微好氧状态，但不限于此。
培养基温度可以在20℃至50℃的范围内，具体地说为30℃至37℃，但不限于此。培养可以继续，直到获得所需生产量的有用物质，并且具体地，培养期可以是10小时至100小时，但不限于此。
所述制备方法还可以包括根据培养物从培养基或微生物中回收L-酪氨酸。
在回收L-酪氨酸时，可以使用本申请的微生物培养方法收集所需的L-酪氨酸，例如，使用本领域已知的根据分批培养、连续培养或分批补料培养方法的合适方法。例如，可以使用诸如离心、过滤、用蛋白质结晶沉淀剂处理(盐析法)、萃取、超声破碎、超滤、透析等方法，可以使用各种色谱如分子筛层析(凝胶过滤)、吸附色谱、离子交换色谱、亲和色谱等，可以使用HPLC或其组合，但不限于此。
制备方法可以包括额外的纯化过程，其可以使用本领域已知的适当方法进行，并且回收的L-酪氨酸可以纯化。
本申请的进一步方面提供了用于生产L-酪氨酸的组合物，包括下列之任一种或多种：所述蛋白质变体；编码所述蛋白质变体的多核苷酸；含有所述多核苷酸的载体；以及表达所述蛋白质变体的微生物。
本申请的又一方面提供了下列之任一种或多种在L-酪氨酸生产中的用途：所述蛋白质变体；编码所述蛋白质变体的多核苷酸；含有所述多核苷酸的载体；和表达所述蛋白质变体的微生物。
所述蛋白质变体、编码所述蛋白质变体的多核苷酸、含有所述多核苷酸的载体和微生物均与上述相同。
本申请的组合物可无限制地包括利用所述蛋白质变体；编码所述蛋白质变体的多核苷酸；含有所述多核苷酸的载体；以及表达所述蛋白质变体的微生物生产L-酪氨酸的附加构成。例如，还可以包括用于微生物发酵的组合物中常用的任何合适的赋形剂或组分，但不限于此。
在本说明书中，除非上下文另有要求，表达“包括”、“包括”、“包含”等均指包含指定的整数或整数组，但应当理解，不排除其它整数或整数集。
【实施方式】
下面通过实施例和实验例对本申请进行详细描述。然而，给出这些实施例和实验例仅用于说明目的，本申请的范围并不旨在限于这些实施例和实验例或由这些实施例和实验例所限制。
【参考例1：L-酪氨酸生产菌株的构建】
尽管野生型谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)具有生产L-酪氨酸的能力，但它不会过量生产L-酪氨酸而释放到培养基中。根据本公开的目的，为了鉴定增加L-酪氨酸生产能力的遗传性状，使用具有增加L-酪氨酸生产能力的菌株而不是野生型菌株。因此，通过基于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13869菌株增强生产L-酪氨酸所需的基因，构建了L-酪氨酸生产菌株。
首先，为了增强作为L-酪氨酸前体的4磷酸赤藓糖(E4P)的供应，对tkt基因进行过表达。同时，将作为L-酪氨酸导入细胞的芳族氨基酸输入基因的aroP删除。
对于遗传操作，首先获得通过替换插入tkt基因的aroP基因的下游和上游区域。具体而言，以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13869染色体DNA作为模板，使用SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的引物，通过PCR获得aroP基因下游区域的基因片段，使用SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的引物，获得aroP基因上游区域的基因片段。以SolgTM Pfu-XDNA聚合酶为聚合酶，在95℃变性5分钟，重复30次的95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃聚合60秒后，72℃聚合5分钟的条件下进行PCR扩增。
此外，为了获得包含tkt启动子的tkt基因，以谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13869染色体DNA作为模板，使用SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的引物，通过PCR获得包括tkt启动子在内的tkt基因片段。以SolgTM Pfu-X DNA聚合酶为聚合酶，在95℃变性5分钟，重复30次的95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃聚合150秒后，72℃聚合5分钟的条件下进行PCR扩增。
将扩增的aroP启动子上游和下游区域、包括tkt启动子在内的tkt基因片段和通过SmaI限制性内切酶切割的用于染色体转化的载体pDZ(韩国专利No.10-0924065)使用Gibson组装方法克隆(DG Gibson等人，NATURE METHODS，Vol.6No.5，2009年5月，NEBuilderHiFi DNA组装预混液)而获得重组质粒，将其命名为pDZ-ΔaroP::Pn-tkt。通过将Gibson组装试剂和每个基因片段以计算的摩尔数混合，然后在50℃下温育1小时来进行克隆。
用于构建每个载体的引物序列如下表1所示。
【表1】
SEQ ID NO： 序列(5'-3')
3 TCGAGCTCGG TACCCTGGGA ACTTGTCGAC GCTAT
4 TGTTCGGCAA GCATTGTGGT GTGGGCAATG ATCAC
5 ATTAACGGTT AAAGTACTCA TTGTGAGGTG GCGGG
6 CTCTAGAGGA TCCCCGGAGC TGCTGTCCAA CGTGG
7 CCACACCACA ATGCTTGCCG AACATTTTTC TTTTC
8 CACAATGAGT ACTTTAACCG TTAATGGAGT CCTTG
将构建的pDZ-ΔaroP::Pn-tkt载体通过电穿孔转化谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13869菌株，然后进行二次交叉，得到了缺失aroP基因的同时插入有包含tkt启动子的tkt基因的菌株。使用分别可以扩增插入相应基因的同源重组的上游区域和下游区域的外部区域的SEQ ID NO：9和SEQ IDNO：10的引物，通过基因组测序和PCR方法证实了相应的基因操作，将所得菌株命名为CM06-0001。
【表2】
SEQ ID NO： 序列(5'-3')
9 ACGCGCCAAG TCGGACG
10 CGCACGATGT TTACCTGCG
为了加强L-酪氨酸途径，将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)所拥有的接受L-酪氨酸反馈调控的tyrA基因替换为包括作为强启动子的gapA启动子的来自大肠埃希氏菌(E.coli)的不接收反馈调节的变体tyrA。已知在大肠埃希氏菌(E.coli)来源的tyrA蛋白中，当第53位的甲硫氨酸突变为异亮氨酸且第354位的丙氨酸突变为缬氨酸时，反馈被解除，并且使用这种形式(SEQ ID NO：11)(Appl.Microbiol.Biotechnol.75,103-110(2007))。
对于遗传操作，首先获得用于替换插入tyrA基因的tyrA基因的上游和下游区域。具体而言，以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13869染色体DNA作为模板，使用SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的引物，通过PCR获得tyrA基因上游区域的基因片段，使用SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15的引物，通过PCR获得tyrA基因下游区域的基因片段。以SolgTM Pfu-X DNA聚合酶为聚合酶，在95℃变性5分钟，重复30次的95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃聚合60秒后，72℃聚合5分钟的条件下进行PCR扩增。
此外，为了获得包含gapA启动子的大肠埃希氏菌(E.coli)来源的变体tyrA基因，以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13869染色体DNA作为模板，使用SEQID NO：16和SEQ ID NO：17的引物，通过PCR获得gapA启动子片段；并以大肠埃希氏菌(E.coli)来源的变体tyrA合成DNA作为模板，使用SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19的引物，通过PCR获得大肠埃希氏菌(E.coli)来源的变体tyrA基因片段。
采用SolgTM Pfu-X DNA聚合酶作为聚合酶，在95℃变性5分钟，重复30次的95℃变性30秒，在60℃退火30秒，在72℃聚合60秒后，在72℃聚合5分钟的条件下进行PCR扩增。
将扩增的tyrA基因上下游区域、包括gapA启动子在内的大肠埃希氏菌(E.coli)来源的变体tyrA基因片段、以及通过SmaI限制性内切酶切割的用于染色体转化的载体pDZ采用Gibson组装法克隆得到重组质粒，将其命名为pDZ-ΔtyrA::PgapA-tyrAm。通过将Gibson组装试剂和每个基因片段以计算的摩尔数混合后进行克隆，然后在50℃下温育1小时。
用于构建每个载体的引物序列示于下表3中。
【表3】
SEQ ID NO： 序列(5'-3')
12 TTCGAGCTCG GTACCCTATC AAAACCGAGT TCTTCC
13 GTCGTTTTTA GGCCTCCTGA CAAGTGTGGC ACATAC
14 TGACAATCGC CAGTAATTTT ATCGGCTGAT GATTCT
15 ACTCTAGAGG ATCCCCAACG CGATTGCATT CGGCTC
16 GTGCCACACT TGTCAGGAGG CCTAAAAACG ACCGAG
17 TCAATTCAGC AACCATGTTG TGTCTCCTCT AAAGAT
18 TTAGAGGAGA CACAACATGG TTGCTGAATT GACCGC
19 TCATCAGCCG ATAAAATTAC TGGCGATTGT CATTCG
将构建的pDZ-ΔtyrA::PgapA-tyrAm载体通过电穿孔转化CM06-0001菌株，然后进行二次交叉，得到了缺失tyrA基因的同时插入有包括gapA启动子在内的大肠埃希氏菌(E.coli)来源的变体tyrA基因的菌株。使用分别可以扩增插入相应基因的同源重组的上游区域和下游区域的外部区域的SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21的引物，通过基因组测序和PCR方法证实了相应的基因操作，将所得菌株命名为CM06-0002。
【表4】
SEQ ID NO： 序列(5'-3')
20 GCCCACTAGT CGAATCCC
21 CTGTCCGCAA CCTGTGCG
为了增加L-酪氨酸生产，通过向大肠埃希氏菌(E.coli)来源的反馈调节解除变体aroG添加强启动子来增强参与共同芳族生物合成途径第一步的aroG基因。众所周知，在大肠埃希氏菌(E.coli)来源的aroG蛋白中，当第150位的脯氨酸被亮氨酸取代时，反馈被解除，并且使用了这种形式(SEQ ID NO：22)(Appl.Environ.Microbiol.63,761-762(1997))。
对于遗传操作，获得要进一步插入的aroG基因的下游和上游区域。具体而言，以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13869染色体DNA作为模板，使用SEQ IDNO：23和SEQ ID NO：24的引物，通过PCR获得BBD29_14470基因上游区域的基因片段，并使用SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26的引物，通过PCR获得BBD29_14470的下游区域的基因片断。以SolgTM Pfu-X DNA聚合酶为聚合酶，在95℃变性5分钟，重复30次的95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃聚合60秒后，72℃聚合5分钟的条件下进行PCR扩增。
将扩增的上游和下游区域进一步插入变体aroG，并使用Gibson组装方法克隆由SmaI切割的用于染色体转化的载体pDZ，得到重组质粒，将其命名为pDZ-ΔBBD29_14470。通过将Gibson组装试剂和每个基因片段以计算的摩尔数混合后进行克隆，然后在50℃下温育1小时。
此外，为了获得包含gapA启动子的大肠埃希氏菌(E.coli)来源的变体aroG基因，以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13869染色体DNA作为模板，使用SEQID NO：27和SEQ ID NO：28的引物，通过PCR获得gapA启动子片段，并以大肠埃希氏菌(E.coli)来源的反馈解除变体aroG合成DNA作为模板，使用SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30的引物，通过PCR获得大肠埃希氏菌(E.coli)来源的变体aroG基因片段。以SolgTM Pfu-XDNA聚合酶为聚合酶，在95℃变性5分钟，重复30次的95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃聚合60秒后，72℃聚合5分钟的条件下进行PCR扩增。
将扩增的包括gapA启动子的变体aroG基因片段、通过ScaI限制性内切酶切割的用于染色体转化的载体pDZ-ΔBBD29_14470采用Gibson组装法克隆，得到重组质粒，将其命名为pDZ-ΔBBD29_14470::PgapA-aroGm。通过将Gibson组装试剂和每个基因片段以计算的摩尔数混合后进行克隆，然后在50℃下温育1小时。
用于构建每个载体的引物序列示于下表5中。
【表5】
SEQ ID NO： 序列(5'-3')
23 TCGAGCTCGG TACCCCCCGG CGGTATCGAG GTAGT
24 GACAAGTTTA GTACTTTAAT CACCCGCGGG GACCC
25 GGTGATTAAA GTACTAAACT TGTCCCGAGG GTGAG
26 CTCTAGAGGA TCCCCTATCA GTCACTTCCC TGAGA
27 GCGGGTGATT AAAGTGAGGC CTAAAAACGA CCGAG
28 GTTCTGATAA TTCATGTTGT GTCTCCTCTA AAGAT
29 ATGAATTATC AGAACGACGA
30 CGGGACAAGT TTAGTTTACC CGCGACGCGC TTTTA
将构建的pDZ-ΔBBD29_14470::PgapA-aroGm载体通过电穿孔转化CM06-0002菌株，然后进行二次交叉，得到插入有包括gapA启动子在内的大肠埃希氏菌(E.coli)来源的反馈解除变体aroG基因的菌株。使用分别可以扩增插入相应基因的同源重组的上游区域和下游区域的外部区域的SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32的引物，通过基因组测序和PCR方法证实了相应的基因操作，将所得菌株命名为CM06-0003。
【表6】
SEQ ID NO： 序列(5'-3')
31 TTGATATGAC CGCAGCCTGA
32 CTGCATTCTC ATCGATCTTG
当共同芳族生产途径得到加强时，可以预测，当在增加的绒毛膜池中作为竞争途径的L-苯丙氨酸生产最小化时，L-酪氨酸和L-色氨酸生产增加最多。但是，如果竞争途径中的pheA基因缺失，则L-苯丙氨酸生产变得不可能，需要L-苯丙氨酸，因此，使用L-色氨酸调节机制，以便在保持低浓度的同时不影响菌体的生长。
可以预测，L-色氨酸浓度被精确地调节，使得L-色氨酸在培养过程中始终保持在低浓度，而细胞的生长不受干扰。文献中也已知，L-色氨酸的生产随着L-色氨酸浓度而同时受抑制剂和促进剂的调节(Appl.Environ Microbiol 59 791，1993)。
因此，PheA(L-苯丙氨酸生产基因)受到L-色氨酸的调控机制，使得pheA基因可以根据L-色氨酸的浓度进行调控。
为了使pheA基因受trpE基因启动子的调控，获得了要插入该基因的上游区域、trpE启动子区域和要插入该基因的下游区域。具体而言，以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13869染色体DNA作为模板，使用SEQ ID NO：33和SEQID NO：34的引物，通过PCR获得要插入区域的上游区域中的基因片段；使用SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36的引物，通过PCR获得trpE启动子区域中的基因片段；并使用SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38的引物，通过PCR获得要插入区域的下游区域的基因片段。以SolgTM Pfu-XDNA聚合酶为聚合酶，在95℃变性5分钟，重复30次的95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃聚合30秒后，72℃聚合5分钟的条件下进行PCR扩增。
将扩增的要插入区域的上游和下游区域、trpE启动子区域和通过SmaI限制性内切酶切割的用于染色体转化的载体pDZ采用Gibson组装方法克隆，得到重组质粒，将其命名为pDZ-ΔPpheA::PtrpE。通过将Gibson组装试剂和每个基因片段以计算的摩尔数混合后进行克隆，然后在50℃下温育1小时。
将构建的pDZ-ΔPpheA::PtrpE载体通过电穿孔转化CM06-0003菌株，然后进行二次交叉，得到pheA基因受trpE启动子调控的菌株。使用分别可以扩增插入相应基因的同源重组的上游区域和下游区域的外部区域的SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40的引物，通过基因组测序和PCR方法证实了相应的遗传操作，并将在pheA基因上游插入trpE启动子的菌株命名为CM06-0005。
用于构建每个载体的引物序列如下表7所示。
【表7】
SEQ ID NO： 序列(5'-3')
33 TTCGAGCTCG GTACCCGGAG GGGTTTCCAC CTCG
34 TGGGAAGCTT GTCTCAATTA TGTCTGTTGC TCAATTAGCG
35 CTAATTGAGC AACAGACATA ATTGAGACAA GCTTCCCA
36 AATTGGTGCG TCGCTCATGG GGCACCTACC GAGGAA
37 TTCCTCGGTA GGTGCCCCAT GAGCGACGCA CCAATTGTTG
38 CGACTCTAGA GGATCCCCCC GAAGAGTTCG GCTGCG
39 CCAGCGATGA TCGCGCCG
40 ATCGCCGTGG AGCCAGCC
由于L-酪氨酸生产始于PEP和E4P作为前体，使用非磷酸转移酶系统(PTS)可以允许增强PEP的供应，因此可以预期L-酪氨酸的高产量(Nature biotechnol 14620，1996)。因此，去除了该菌株的PTS基因ptsG，并导入了运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)ATCC10988来源的glf(非PTS基因)。
为了删除ptsG并插入glf，获得了要插入运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)来源的glf的上游和下游区域。具体而言，以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13869染色体DNA作为模板，使用SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42的引物，通过PCR获得ptsG基因上游区域的基因片段，并使用SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44的引物，通过PCR获得ptsG基因下游区域的基因片段。以SolgTM Pfu-X DNA聚合酶为聚合酶，在95℃变性5分钟，重复30次的在95℃下变性30秒，在60℃退火30秒，在72℃聚合60秒后，在72℃聚合5分钟的条件下进行PCR扩增。
此外，为了获得包含公知的cj7启动子(SEQ ID NO：45，韩国专利No.10-0620092)的glf基因，以合成cj7启动子DNA作为模板，使用SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47的引物，通过PCR获得cj7启动子片段；并以运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)ATCC10988染色体DNA作为模板，使用SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：49的引物，通过PCR获得glf基因片段。以SolgTM Pfu-X DNA聚合酶为聚合酶，在95℃变性5分钟，重复30次的在95℃下变性30秒，在60℃退火30秒，在72℃聚合60秒后，在72℃聚合5分钟的条件下进行PCR扩增。
将扩增的ptsG基因上游和下游区域、包括cj7启动子在内的glf基因片段、以及通过ScaI限制性内切酶切割的用于染色体转化的载体pDZ采用Gibson组装法克隆，得到重组质粒，将其命名为pDZ-ΔptsG::pcj7-glf。通过将Gibson组装试剂和每个基因片段以计算的摩尔数混合后进行克隆，然后在50℃下温育1小时。
参考例中使用的引物序列示于下表8中。
【表8】
SEQ ID NO： 序列(5'-3')
41 TTCGAGCTCG GTACCCGAGG GCTCACTGAC GTTGA
42 CGCTGGGATG TTTCTACCGG ATTCGATTCC TCAG
43 CGCTCCCAGA AGTAGGCTCA AACCTTGCCC ATAAC
44 CTCTAGAGGA TCCCCCTCCC CCAAACCACG CTTTT
46 GGAATCGAAT CCGGTAGAAA CATCCCAGCG CTACT
47 TACTTTCAGA ACTCATGAGT GTTTCCTTTC GTTGG
48 ACGAAAGGAA ACACTCATGA GTTCTGAAAG TAGTC
49 GGGCAAGGTT TGAGCCTACT TCTGGGAGCG CCACA
将构建的pDZ-ΔptsG::pcj7-glf载体通过电穿孔转化CM06-0005菌株，然后进行二次交叉，得到插入有包括cj7启动子在内的运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)来源的glf基因的菌株。使用分别可以扩增插入相应基因的同源重组的上游区域和下游区域的外部区域的SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：51的引物，通过基因组测序和PCR方法证实了相应的基因操作，将所得菌株命名为CM06-0010。
【表9】
SEQ ID NO： 序列(5'-3')
50 ACATTAAGTG GTAGGCGCTG A
51 CATAACAGGG CAGAACAAAC
【参考例2：L-酪氨酸生产菌株的生产能力评价】
为了确认实施例1中构建的菌株的L-酪氨酸生产能力，将菌株按以下方式培养和评价。将每种菌株接种到含有25mL下述种子培养基的250mL角挡板烧瓶中，并在30℃下以200rpm振荡培养20小时。接下来，将1mL种子培养液接种到含有25mL下述生产培养基的250mL角挡板烧瓶中，并在30℃下以200rpm振荡培养24小时。培养后，用HPLC测定L-酪氨酸、L-苯丙氨酸和L-色氨酸的产量。
【种子培养基(pH 7.0)】
20g葡萄糖、10g蛋白胨、5g酵母提取物、1.5g尿素、4g KH2PO4、8g K2HPO4、0.5gMgSO4·7H2O、100μg生物素、1,000μg盐酸硫胺素、2,000μg泛酸钙和2,000μg烟酰胺(每升蒸馏水)
【生产培养基(pH 7.0)】
30g葡萄糖、15g(NH4)2SO4、1.2g MgSO4·7H2O、1g KH2PO4、5g酵母提取物、900μg生物素、4,500μg盐酸硫胺素、4,500μg泛酸钙和30g CaCO3(每升蒸馏水)。
【表10：谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13869来源的L-酪氨酸生产菌株的生产能力评价】
野生型谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13869、CM06-0001、CM06-0002、CM06-0003、CM06-0005和CM06-0010的培养物中L-酪氨酸、L-苯丙氨酸和L-色氨酸的生产的结果如表10所示。
在通过从野生型菌株中删除芳族氨基酸输入基因、强化了作为前体的E4P供应来制备的菌株CM06-0001中没有产生L-酪氨酸，并且在进一步解除了tyrA反馈抑制的CM06-0002中也没有检测到L-酪氨酸。
在通过在CM06-0002菌株中进一步解除aroG的反馈抑制而增强了共同芳族化合物生产途径的CM06-0003菌株中证实了L-酪氨酸和L-苯丙氨酸的生产。与以前的菌株相比，L-酪氨酸和L-苯丙氨酸的产量显著增加，但L-色氨酸的产量没有显著变化。此外，在使L-苯丙氨酸途径受L-色氨酸浓度调节的CM06-0005菌株的情况中，L-酪氨酸的产率为5.37％。与亲本菌株CM06-0003相比，CM06-0005的L-酪氨酸产量提高了283％。从以上结果可以证实，当pheA受L-色氨酸浓度调控时，L-酪氨酸产量显著增加。
此外，如预期的那样证实，与作为PTS菌株的CM06-0005相比，在促进了PEP供应的作为非PTS菌株的CM06-0010中L-酪氨酸的产量增加。CM06-0010菌株以7.06％的提高的产率生产L-酪氨酸。
【实施例1：导入L-色氨酸输出蛋白的L-酪氨酸生产菌株的构建】
通过将新的L-色氨酸输出蛋白(WO 2019164348 A1)导入到参考例1中制备的L-酪氨酸生产菌株CM06-0010中，证实了酪氨酸的输出能力。
新的L-色氨酸输出蛋白是来源于根际草螺菌(Herbaspirillum rhizosphaerae)的膜蛋白，其氨基酸序列由SEQ ID NO：52表示。国际专利WO2019164348A1中使用的转化用载体为pDZTn-PgapA-Hrh，通过电穿孔法(Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52:541-545)用该载体转化L-酪氨酸生产菌株CM06-0010，然后进行二次交叉，获得了在染色体上的转座子基因之间插入了一拷贝的PgapA-Hrh基因的菌株。将PgapA-Hrh基因表达的蛋白命名为Wex，使用分别可以扩增插入相应基因的同源重组的上游区域和下游区域的外部区域的SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54的引物，通过基因组测序和PCR方法确认了相应的基因操作。
【表11】
SEQ ID NO： 序列(5'-3')
53 CGGATTATGC CAATGATGTG
54 CACGATCACC AACATTCAGG
将这样获得的菌株命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CM06-0111。
【实施例2：用L-色氨酸输出蛋白Wex导入的L-酪氨酸生产菌株的生产能力评价】
为了确认实施例1中制备的菌株的L-酪氨酸生产能力，使用参考例2中描述的方法和培养基组成培养菌株。
【表12：导入PgapA-Hrh的菌株在生产培养基中的生产能力评估】
在L-酪氨酸生产菌株CM06-0010和CM06-0111的培养物中生产L-酪氨酸、L-苯丙氨酸和L-色氨酸的结果如上表12所示。
导入了作为L-色氨酸输出蛋白的Wex膜蛋白的菌株没有显示出L-酪氨酸的输出能力，由于L-色氨酸仍是少量，无法确认是否增加。因此，试图通过将突变导入Wex膜蛋白来赋予对于L-酪氨酸的底物特异性。
【实施例3：L-酪氨酸生产菌株的Wex序列中的第79位的氨基酸亮氨酸用其它氨基酸的取代】
为了提供对于Wex膜蛋白的L-酪氨酸的底物特异性，将亮氨酸，即第79位的氨基酸(以下简称为第79位的亮氨酸或第79位)用其它氨基酸取代以寻找输出L-酪氨酸的突变体。为了提供亮氨酸以外的氨基酸突变，使用实施例1中使用的pDZTn-PgapA-Hrh作为模板进行定点诱变。以下列方式进行定点诱变。
【表13：定点诱变PCR组成】
【表14：定点诱变PCR循环】
/>
为了将Wex氨基酸序列中的第79位的氨基酸亮氨酸用如下其它氨基酸取代：丙氨酸(A)(SEQ ID NO：1)，甘氨酸(G)(SEQ ID NO：2)，异亮氨酸(I)(SEQ ID NO：77)，甲硫氨酸(M)(SEQ ID NO：78)，苏氨酸(T)(SEQ ID NO：79)，酪氨酸(Y)(SEQ ID NO：80)、天冬酰胺(N)(SEQ ID NO：81)，精氨酸(R)(SEQ ID NO：82)，色氨酸(W)(SEQ ID NO：83)，丝氨酸(S)(SEQID NO：84)和脯氨酸(P)(SEQ ID NO：85)，使用表15中所示的每个诱变引物组制备表14所示的PCR混合物，并以表15所示的循环进行PCR。PCR完成后，加入1μL DpnI限制性内切酶，然后在37℃下处理1小时。然后，用3μL DpnI处理的DNA转化DH5a感受态细胞，获得pDZTn-PgapA-wex突变质粒，并通过测序确认如表15所示的每个突变。
【表15：用于构建Wex氨基酸序列的第79位的氨基酸突变质粒的诱变引物组】
用如表15所示制备的pDZTn-PgapA-wex L79A、pDZTn-PgapA-wex L79I、pDZTn-PgapA-wex L79G、pDZTn-PgapA-wex L79M、pDZTn-PgapA-wex L79S、pDZTn-PgapA-wexL79P、pDZTn-PgapA-wex L79T、pDZTTn-PgapA-wex L79Y、pDZTn-PgapA-wex L79N、pDZTn-PgapA-wex L79W和pDZTn-PgapA-wex L79R载体分别通过电穿孔转化实施例2中制备的CM06-0111，然后进行二次交叉，得到19株在染色体上插入突变的wex基因的菌株。使用可以分别扩增插入相应基因的同源重组的上游区域和下游区域的外部区域的SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54引物，通过基因组测序和PCR方法证实了相应的遗传操作。
将由此得到的转化菌株分别命名为CM06-0112(wex L79A)、CM06-0114(wexL79I)、CM06-0115(wex L79G)、CM06-0117(wex L79M)、CM06-0118(wex L79S)、CM06-0119(wex L79P)、CM06-0120(wex L79T)、CM06-0121(wex L79Y)、CM06-0124(wex L79N)、CM06-0128(wex L79W)和CM06-0129(wex L79R)。
为了确认CM06-0112(wex L79A)、CM06-0114(wex L79I)、CM06-0115(wex L79G)、CM06-0117(wex L79M)、CM06-0118(wex L79S)、CM06-0119(wex L79P)、CM06-0120(wexL79T)、CM06-0121(wex L79Y)、CM06-0124(wex L79N)、CM06-0128(wex L79W)和CM06-0129(wex L79R)菌株中酪氨酸的产量，以与实施例2中相同的方式培养菌株。培养完成后，用HPLC测定L-酪氨酸的产量。
【表16：Wex氨基酸序列的第79位的氨基酸被取代为突变体的L-酪氨酸生产菌株的生产能力评估】
导入野生型Wex膜蛋白的菌株效果不显著，与此相比，导入Wex L79A突变的CM06-0112菌株在烧瓶培养中L-酪氨酸浓度为2.92g/L，相对于对照CM06-0111，其产量提高了约2.5％p。此外，证实导入Wex L79G突变的CM06-0115菌株的产量也提高了2.4％p，证实了WexL79A突变和L79G突变特异性输出L-酪氨酸。
CM06-0112菌株于2020年4月27日根据《布达佩斯条约》以保藏号：KCCM12708P保藏在国际保藏机构韩国微生物保藏中心(KCCM)。
从前述内容可知，本申请所属领域的技术人员将能够理解，本申请可以不修改本申请的技术概念或本质特征而以其它特定形式体现。在这方面，本文公开的示例性实施例仅用于说明目的，不应被解释为限制本申请的范围。相反，本申请旨在不仅涵盖示例性实施例，而且涵盖各种替代、修改、等同物和其他实施例，这些实施例可包括在所附权利要求所定义的本申请的精神和范围内。
【国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约】
国际表格
国际保藏机构对原始保藏的收条
根据细则第7.1条发给
至：希杰(CJ)第一制糖株式会社
韩国，首尔市，中区，东湖路330，CJ第一制糖中心，(邮)100-400
/>
序列表
<110> CJ CheilJedang Corporation
<120> 新的L-酪氨酸输出蛋白质变体及利用其的L-酪氨酸生产方法
<130> OPA21208
<150> KR 10-2020-0063778
<151> 2020-05-27
<160> 85
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 307
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Wex L79A
<400> 1
Met Asn Ser Lys Lys Ala Thr Leu Ile Gly Leu Thr Ala Val Val Leu
1 5 10 15
Trp Ser Ser Ile Val Gly Leu Ile Arg Gly Val Ser Glu His Leu Gly
20 25 30
Ala Thr Gly Gly Ala Ala Met Met Tyr Ser Val Ala Ser Leu Phe Leu
35 40 45
Leu Leu Ser Val Gly Phe Pro Lys Leu Gly Ser Phe Pro Lys Lys Tyr
50 55 60
Leu Leu Trp Gly Ser Leu Leu Phe Val Ser Tyr Glu Leu Cys Ala Ser
65 70 75 80
Leu Ser Ile Gly Tyr Ala Asn Thr Gly Arg Gln Ala Ile Glu Val Ser
85 90 95
Met Val Asn Tyr Leu Trp Pro Ala Phe Thr Leu Ile Ala Ala Ile Ala
100 105 110
Phe Asn Arg Gln Arg Ala Asn Trp Met Val Val Pro Gly Phe Ile Leu
115 120 125
Ser Ile Ile Gly Ile Cys Trp Val Leu Gly Gly Asp Gln Gly Leu Asp
130 135 140
Leu Ala Gly Met Leu Gly Asn Val Gln Asp Asn Pro Leu Ser Tyr Gly
145 150 155 160
Leu Ala Phe Leu Gly Ala Val Ile Trp Ala Ala Tyr Cys Thr Val Thr
165 170 175
Ala Arg Leu Ala Lys Gly Lys Asn Gly Val Thr Leu Phe Phe Ile Leu
180 185 190
Val Ala Leu Thr Leu Trp Val Lys Phe Phe Phe Gly Asp His Arg Pro
195 200 205
Met Ser Phe Ser Leu Pro Ala Ile Val Tyr Leu Leu Leu Ala Ala Ala
210 215 220
Ala Met Gly Phe Gly Tyr Ala Ala Trp Asn Val Gly Ile Leu His Gly
225 230 235 240
Asn Val Thr Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Phe Ile Pro Val Phe Ser
245 250 255
Ala Ala Leu Ser Ala Met Val Leu His Ala Pro Leu Pro Arg Ser Phe
260 265 270
Trp Val Gly Ala Ser Leu Val Cys Ala Gly Ser Ile Leu Cys Trp Leu
275 280 285
Ala Thr Arg Ala Arg Arg Ala Ser Ala Ala Gln Glu Asp Ala Val Ala
290 295 300
Asp Cys Leu
305
<210> 2
<211> 307
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Wex L79G
<400> 2
Met Asn Ser Lys Lys Ala Thr Leu Ile Gly Leu Thr Ala Val Val Leu
1 5 10 15
Trp Ser Ser Ile Val Gly Leu Ile Arg Gly Val Ser Glu His Leu Gly
20 25 30
Ala Thr Gly Gly Ala Ala Met Met Tyr Ser Val Ala Ser Leu Phe Leu
35 40 45
Leu Leu Ser Val Gly Phe Pro Lys Leu Gly Ser Phe Pro Lys Lys Tyr
50 55 60
Leu Leu Trp Gly Ser Leu Leu Phe Val Ser Tyr Glu Leu Cys Gly Ser
65 70 75 80
Leu Ser Ile Gly Tyr Ala Asn Thr Gly Arg Gln Ala Ile Glu Val Ser
85 90 95
Met Val Asn Tyr Leu Trp Pro Ala Phe Thr Leu Ile Ala Ala Ile Ala
100 105 110
Phe Asn Arg Gln Arg Ala Asn Trp Met Val Val Pro Gly Phe Ile Leu
115 120 125
Ser Ile Ile Gly Ile Cys Trp Val Leu Gly Gly Asp Gln Gly Leu Asp
130 135 140
Leu Ala Gly Met Leu Gly Asn Val Gln Asp Asn Pro Leu Ser Tyr Gly
145 150 155 160
Leu Ala Phe Leu Gly Ala Val Ile Trp Ala Ala Tyr Cys Thr Val Thr
165 170 175
Ala Arg Leu Ala Lys Gly Lys Asn Gly Val Thr Leu Phe Phe Ile Leu
180 185 190
Val Ala Leu Thr Leu Trp Val Lys Phe Phe Phe Gly Asp His Arg Pro
195 200 205
Met Ser Phe Ser Leu Pro Ala Ile Val Tyr Leu Leu Leu Ala Ala Ala
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Ala Met Gly Phe Gly Tyr Ala Ala Trp Asn Val Gly Ile Leu His Gly
225 230 235 240
Asn Val Thr Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Phe Ile Pro Val Phe Ser
245 250 255
Ala Ala Leu Ser Ala Met Val Leu His Ala Pro Leu Pro Arg Ser Phe
260 265 270
Trp Val Gly Ala Ser Leu Val Cys Ala Gly Ser Ile Leu Cys Trp Leu
275 280 285
Ala Thr Arg Ala Arg Arg Ala Ser Ala Ala Gln Glu Asp Ala Val Ala
290 295 300
Asp Cys Leu
305
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
tcgagctcgg taccctggga acttgtcgac gctat 35
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
tgttcggcaa gcattgtggt gtgggcaatg atcac 35
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
attaacggtt aaagtactca ttgtgaggtg gcggg 35
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
ctctagagga tccccggagc tgctgtccaa cgtgg 35
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 7
ccacaccaca atgcttgccg aacatttttc ttttc 35
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 8
cacaatgagt actttaaccg ttaatggagt ccttg 35
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 9
acgcgccaag tcggacg 17
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 10
cgcacgatgt ttacctgcg 19
<210> 11
<211> 1122
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大肠埃希氏菌（E. coli） tyrA_M53I_A354V
<400> 11
atggttgctg aattgaccgc attacgcgat caaattgatg aagtcgataa agcgctgctg 60
aatttattag cgaagcgtct ggaactggtt gctgaagtgg gcgaggtgaa aagccgcttt 120
ggactgccta tttatgttcc ggagcgcgag gcatctattt tggcctcgcg tcgtgcagag 180
gcggaagctc tgggtgtacc gccagatctg attgaggatg ttttgcgtcg ggtgatgcgt 240
gaatcttact ccagtgaaaa cgacaaagga tttaaaacac tttgtccgtc actgcgtccg 300
gtggttatcg tcggcggtgg cggtcagatg ggacgcctgt tcgagaagat gctgaccctc 360
tcgggttatc aggtgcggat tctggagcaa catgactggg atcgagcggc tgatattgtt 420
gccgatgccg gaatggtgat tgttagtgtg ccaatccacg ttactgagca agttattggc 480
aaattaccgc ctttaccgaa agattgtatt ctggtcgatc tggcatcagt gaaaaatggg 540
ccattacagg ccatgctggt ggcgcatgat ggtccggtgc tggggctaca cccgatgttc 600
ggtccggaca gcggtagcct ggcaaagcaa gttgtggtct ggtgtgatgg acgtaaaccg 660
gaagcatacc aatggtttct ggagcaaatt caggtctggg gcgctcggct gcatcgtatt 720
agcgccgtcg agcacgatca gaatatggcg tttattcagg cactgcgcca ctttgctact 780
tttgcttacg ggctgcacct ggcagaagaa aatgttcagc ttgagcaact tctggcgctc 840
tcttcgccga tttaccgcct tgagctggcg atggtcgggc gactgtttgc tcaggatccg 900
cagctttatg ccgacatcat tatgtcgtca gagcgtaatc tggcgttaat caaacgttac 960
tataagcgtt tcggcgaggc gattgagttg ctggagcagg gcgataagca ggcgtttatt 1020
gacagtttcc gcaaggtgga gcactggttc ggcgattacg tgcagcgttt tcagagtgaa 1080
agccgcgtgt tattgcgtca ggcgaatgac aatcgccagt aa 1122
<210> 12
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 12
ttcgagctcg gtaccctatc aaaaccgagt tcttcc 36
<210> 13
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 13
gtcgttttta ggcctcctga caagtgtggc acatac 36
<210> 14
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 14
tgacaatcgc cagtaatttt atcggctgat gattct 36
<210> 15
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 15
actctagagg atccccaacg cgattgcatt cggctc 36
<210> 16
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 16
gtgccacact tgtcaggagg cctaaaaacg accgag 36
<210> 17
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 17
tcaattcagc aaccatgttg tgtctcctct aaagat 36
<210> 18
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
ttagaggaga cacaacatgg ttgctgaatt gaccgc 36
<210> 19
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 19
tcatcagccg ataaaattac tggcgattgt cattcg 36
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 20
gcccactagt cgaatccc 18
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 21
ctgtccgcaa cctgtgcg 18
<210> 22
<211> 1053
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大肠埃希氏菌（E. coli） aroG_P150L
<400> 22
atgaattatc agaacgacga tttacgcatc aaagaaatca aagagttact tcctcctgtc 60
gcattgctgg aaaaattccc cgctactgaa aatgccgcga atacggttgc ccatgcccga 120
aaagcgatcc ataagatcct gaaaggtaat gatgatcgcc tgttggttgt gattggccca 180
tgctcaattc atgatcctgt cgcggcaaaa gagtatgcca ctcgcttgct ggcgctgcgt 240
gaagagctga aagatgagct ggaaatcgta atgcgcgtct attttgaaaa gccgcgtacc 300
acggtgggct ggaaagggct gattaacgat ccgcatatgg ataatagctt ccagatcaac 360
gacggtctgc gtatagcccg taaattgctg cttgatatta acgacagcgg tctgccagcg 420
gcaggtgagt ttctcgatat gatcacccca caatatctcg ctgacctgat gagctggggc 480
gcaattggcg cacgtaccac cgaatcgcag gtgcaccgcg aactggcatc agggctttct 540
tgtccggtcg gcttcaaaaa tggcaccgac ggtacgatta aagtggctat cgatgccatt 600
aatgccgccg gtgcgccgca ctgcttcctg tccgtaacga aatgggggca ttcggcgatt 660
gtgaatacca gcggtaacgg cgattgccat atcattctgc gcggcggtaa agagcctaac 720
tacagcgcga agcacgttgc tgaagtgaaa gaagggctga acaaagcagg cctgccagca 780
caggtgatga tcgatttcag ccatgctaac tcgtccaaac aattcaaaaa gcagatggat 840
gtttgtgctg acgtttgcca gcagattgcc ggtggcgaaa aggccattat tggcgtgatg 900
gtggaaagcc atctggtgga aggcaatcag agcctcgaga gcggggagcc gctggcctac 960
ggtaagagca tcaccgatgc ctgcatcggc tgggaagata ccgatgctct gttacgtcaa 1020
ctggcgaatg cagtaaaagc gcgtcgcggg taa 1053
<210> 23
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 23
tcgagctcgg taccccccgg cggtatcgag gtagt 35
<210> 24
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 24
gacaagttta gtactttaat cacccgcggg gaccc 35
<210> 25
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 25
ggtgattaaa gtactaaact tgtcccgagg gtgag 35
<210> 26
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 26
ctctagagga tcccctatca gtcacttccc tgaga 35
<210> 27
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 27
gcgggtgatt aaagtgaggc ctaaaaacga ccgag 35
<210> 28
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 28
gttctgataa ttcatgttgt gtctcctcta aagat 35
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 29
atgaattatc agaacgacga 20
<210> 30
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 30
cgggacaagt ttagtttacc cgcgacgcgc tttta 35
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 31
ttgatatgac cgcagcctga 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 32
ctgcattctc atcgatcttg 20
<210> 33
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 33
ttcgagctcg gtacccggag gggtttccac ctcg 34
<210> 34
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 34
tgggaagctt gtctcaatta tgtctgttgc tcaattagcg 40
<210> 35
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 35
ctaattgagc aacagacata attgagacaa gcttccca 38
<210> 36
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 36
aattggtgcg tcgctcatgg ggcacctacc gaggaa 36
<210> 37
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 37
ttcctcggta ggtgccccat gagcgacgca ccaattgttg 40
<210> 38
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 38
cgactctaga ggatcccccc gaagagttcg gctgcg 36
<210> 39
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 39
ccagcgatga tcgcgccg 18
<210> 40
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 40
atcgccgtgg agccagcc 18
<210> 41
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 41
ttcgagctcg gtacccgagg gctcactgac gttga 35
<210> 42
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 42
cgctgggatg tttctaccgg attcgattcc tcag 34
<210> 43
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 43
cgctcccaga agtaggctca aaccttgccc ataac 35
<210> 44
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 44
ctctagagga tccccctccc ccaaaccacg ctttt 35
<210> 45
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CJ7 启动子
<400> 45
agaaacatcc cagcgctact aatagggagc gttgaccttc cttccacgga ccggtaatcg 60
gagtgcctaa aaccgcatgc ggcttaggct ccaagatagg ttctgcgcgg ccgggtaatg 120
catcttcttt agcaacaagt tgaggggtag gtgcaaataa gaacgacata gaaatcgtct 180
cctttctgtt tttaatcaac atacaccacc acctaaaaat tccccgacca gcaagttcac 240
agtattcggg cacaatatcg ttgccaaaat attgtttcgg aatatcatgg gatacgtacc 300
caacgaaagg aaacactc 318
<210> 46
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 46
ggaatcgaat ccggtagaaa catcccagcg ctact 35
<210> 47
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 47
tactttcaga actcatgagt gtttcctttc gttgg 35
<210> 48
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 48
acgaaaggaa acactcatga gttctgaaag tagtc 35
<210> 49
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 49
gggcaaggtt tgagcctact tctgggagcg ccaca 35
<210> 50
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 50
acattaagtg gtaggcgctg a 21
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 51
cataacaggg cagaacaaac 20
<210> 52
<211> 307
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> wex AA seq
<400> 52
Met Asn Ser Lys Lys Ala Thr Leu Ile Gly Leu Thr Ala Val Val Leu
1 5 10 15
Trp Ser Ser Ile Val Gly Leu Ile Arg Gly Val Ser Glu His Leu Gly
20 25 30
Ala Thr Gly Gly Ala Ala Met Met Tyr Ser Val Ala Ser Leu Phe Leu
35 40 45
Leu Leu Ser Val Gly Phe Pro Lys Leu Gly Ser Phe Pro Lys Lys Tyr
50 55 60
Leu Leu Trp Gly Ser Leu Leu Phe Val Ser Tyr Glu Leu Cys Leu Ser
65 70 75 80
Leu Ser Ile Gly Tyr Ala Asn Thr Gly Arg Gln Ala Ile Glu Val Ser
85 90 95
Met Val Asn Tyr Leu Trp Pro Ala Phe Thr Leu Ile Ala Ala Ile Ala
100 105 110
Phe Asn Arg Gln Arg Ala Asn Trp Met Val Val Pro Gly Phe Ile Leu
115 120 125
Ser Ile Ile Gly Ile Cys Trp Val Leu Gly Gly Asp Gln Gly Leu Asp
130 135 140
Leu Ala Gly Met Leu Gly Asn Val Gln Asp Asn Pro Leu Ser Tyr Gly
145 150 155 160
Leu Ala Phe Leu Gly Ala Val Ile Trp Ala Ala Tyr Cys Thr Val Thr
165 170 175
Ala Arg Leu Ala Lys Gly Lys Asn Gly Val Thr Leu Phe Phe Ile Leu
180 185 190
Val Ala Leu Thr Leu Trp Val Lys Phe Phe Phe Gly Asp His Arg Pro
195 200 205
Met Ser Phe Ser Leu Pro Ala Ile Val Tyr Leu Leu Leu Ala Ala Ala
210 215 220
Ala Met Gly Phe Gly Tyr Ala Ala Trp Asn Val Gly Ile Leu His Gly
225 230 235 240
Asn Val Thr Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Phe Ile Pro Val Phe Ser
245 250 255
Ala Ala Leu Ser Ala Met Val Leu His Ala Pro Leu Pro Arg Ser Phe
260 265 270
Trp Val Gly Ala Ser Leu Val Cys Ala Gly Ser Ile Leu Cys Trp Leu
275 280 285
Ala Thr Arg Ala Arg Arg Ala Ser Ala Ala Gln Glu Asp Ala Val Ala
290 295 300
Asp Cys Leu
305
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 53
cggattatgc caatgatgtg 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 54
cacgatcacc aacattcagg 20
<210> 55
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 55
gtgtcctacg aactctgcgc atcgctctcc atcggttatg 40
<210> 56
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 56
cataaccgat ggagagcgat gcgcagagtt cgtaggacac 40
<210> 57
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 57
gtgtcctacg aactctgcat ctcgctctcc atcggttatg 40
<210> 58
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 58
cataaccgat ggagagcgag atgcagagtt cgtaggacac 40
<210> 59
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 59
gtgtcctacg aactctgcgg ctcgctctcc atcggtt 37
<210> 60
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 60
cataaccgat ggagagcgag ccgcagagtt cgtagg 36
<210> 61
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 61
gtgtcctacg aactctgcat gtcgctctcc atcggtt 37
<210> 62
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 62
cataaccgat ggagagcgac atgcagagtt cgtagg 36
<210> 63
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 63
gtgtcctacg aactctgcac ctcgctctcc atcggtt 37
<210> 64
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 64
cataaccgat ggagagcgag gtgcagagtt cgtagg 36
<210> 65
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 65
gtgtcctacg aactctgcta ctcgctctcc atcggtt 37
<210> 66
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 66
cataaccgat ggagagcgag tagcagagtt cgtagg 36
<210> 67
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 67
gtgtcctacg aactctgcaa ctcgctctcc atcggtt 37
<210> 68
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 68
cataaccgat ggagagcgag ttgcagagtt cgtagg 36
<210> 69
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 69
gtgtcctacg aactctgctg gtcgctctcc atcggtt 37
<210> 70
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 70
cataaccgat ggagagcgac cagcagagtt cgtagg 36
<210> 71
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 71
gtgtcctacg aactctgccg ctcgctctcc atcggtt 37
<210> 72
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 72
cataaccgat ggagagcgag cggcagagtt cgtagg 36
<210> 73
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 73
gtgtcctacg aactctgctc ctcgctctcc atcggtt 37
<210> 74
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 74
cataaccgat ggagagcgag gagcagagtt cgtagg 36
<210> 75
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 75
gtgtcctacg aactctgccc atcgctctcc atcggtt 37
<210> 76
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 76
cataaccgat ggagagcgat gggcagagtt cgtagg 36
<210> 77
<211> 307
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> wex L79I
<400> 77
Met Asn Ser Lys Lys Ala Thr Leu Ile Gly Leu Thr Ala Val Val Leu
1 5 10 15
Trp Ser Ser Ile Val Gly Leu Ile Arg Gly Val Ser Glu His Leu Gly
20 25 30
Ala Thr Gly Gly Ala Ala Met Met Tyr Ser Val Ala Ser Leu Phe Leu
35 40 45
Leu Leu Ser Val Gly Phe Pro Lys Leu Gly Ser Phe Pro Lys Lys Tyr
50 55 60
Leu Leu Trp Gly Ser Leu Leu Phe Val Ser Tyr Glu Leu Cys Ile Ser
65 70 75 80
Leu Ser Ile Gly Tyr Ala Asn Thr Gly Arg Gln Ala Ile Glu Val Ser
85 90 95
Met Val Asn Tyr Leu Trp Pro Ala Phe Thr Leu Ile Ala Ala Ile Ala
100 105 110
Phe Asn Arg Gln Arg Ala Asn Trp Met Val Val Pro Gly Phe Ile Leu
115 120 125
Ser Ile Ile Gly Ile Cys Trp Val Leu Gly Gly Asp Gln Gly Leu Asp
130 135 140
Leu Ala Gly Met Leu Gly Asn Val Gln Asp Asn Pro Leu Ser Tyr Gly
145 150 155 160
Leu Ala Phe Leu Gly Ala Val Ile Trp Ala Ala Tyr Cys Thr Val Thr
165 170 175
Ala Arg Leu Ala Lys Gly Lys Asn Gly Val Thr Leu Phe Phe Ile Leu
180 185 190
Val Ala Leu Thr Leu Trp Val Lys Phe Phe Phe Gly Asp His Arg Pro
195 200 205
Met Ser Phe Ser Leu Pro Ala Ile Val Tyr Leu Leu Leu Ala Ala Ala
210 215 220
Ala Met Gly Phe Gly Tyr Ala Ala Trp Asn Val Gly Ile Leu His Gly
225 230 235 240
Asn Val Thr Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Phe Ile Pro Val Phe Ser
245 250 255
Ala Ala Leu Ser Ala Met Val Leu His Ala Pro Leu Pro Arg Ser Phe
260 265 270
Trp Val Gly Ala Ser Leu Val Cys Ala Gly Ser Ile Leu Cys Trp Leu
275 280 285
Ala Thr Arg Ala Arg Arg Ala Ser Ala Ala Gln Glu Asp Ala Val Ala
290 295 300
Asp Cys Leu
305
<210> 78
<211> 307
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> wex L79M
<400> 78
Met Asn Ser Lys Lys Ala Thr Leu Ile Gly Leu Thr Ala Val Val Leu
1 5 10 15
Trp Ser Ser Ile Val Gly Leu Ile Arg Gly Val Ser Glu His Leu Gly
20 25 30
Ala Thr Gly Gly Ala Ala Met Met Tyr Ser Val Ala Ser Leu Phe Leu
35 40 45
Leu Leu Ser Val Gly Phe Pro Lys Leu Gly Ser Phe Pro Lys Lys Tyr
50 55 60
Leu Leu Trp Gly Ser Leu Leu Phe Val Ser Tyr Glu Leu Cys Met Ser
65 70 75 80
Leu Ser Ile Gly Tyr Ala Asn Thr Gly Arg Gln Ala Ile Glu Val Ser
85 90 95
Met Val Asn Tyr Leu Trp Pro Ala Phe Thr Leu Ile Ala Ala Ile Ala
100 105 110
Phe Asn Arg Gln Arg Ala Asn Trp Met Val Val Pro Gly Phe Ile Leu
115 120 125
Ser Ile Ile Gly Ile Cys Trp Val Leu Gly Gly Asp Gln Gly Leu Asp
130 135 140
Leu Ala Gly Met Leu Gly Asn Val Gln Asp Asn Pro Leu Ser Tyr Gly
145 150 155 160
Leu Ala Phe Leu Gly Ala Val Ile Trp Ala Ala Tyr Cys Thr Val Thr
165 170 175
Ala Arg Leu Ala Lys Gly Lys Asn Gly Val Thr Leu Phe Phe Ile Leu
180 185 190
Val Ala Leu Thr Leu Trp Val Lys Phe Phe Phe Gly Asp His Arg Pro
195 200 205
Met Ser Phe Ser Leu Pro Ala Ile Val Tyr Leu Leu Leu Ala Ala Ala
210 215 220
Ala Met Gly Phe Gly Tyr Ala Ala Trp Asn Val Gly Ile Leu His Gly
225 230 235 240
Asn Val Thr Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Phe Ile Pro Val Phe Ser
245 250 255
Ala Ala Leu Ser Ala Met Val Leu His Ala Pro Leu Pro Arg Ser Phe
260 265 270
Trp Val Gly Ala Ser Leu Val Cys Ala Gly Ser Ile Leu Cys Trp Leu
275 280 285
Ala Thr Arg Ala Arg Arg Ala Ser Ala Ala Gln Glu Asp Ala Val Ala
290 295 300
Asp Cys Leu
305
<210> 79
<211> 307
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> wex L79T
<400> 79
Met Asn Ser Lys Lys Ala Thr Leu Ile Gly Leu Thr Ala Val Val Leu
1 5 10 15
Trp Ser Ser Ile Val Gly Leu Ile Arg Gly Val Ser Glu His Leu Gly
20 25 30
Ala Thr Gly Gly Ala Ala Met Met Tyr Ser Val Ala Ser Leu Phe Leu
35 40 45
Leu Leu Ser Val Gly Phe Pro Lys Leu Gly Ser Phe Pro Lys Lys Tyr
50 55 60
Leu Leu Trp Gly Ser Leu Leu Phe Val Ser Tyr Glu Leu Cys Thr Ser
65 70 75 80
Leu Ser Ile Gly Tyr Ala Asn Thr Gly Arg Gln Ala Ile Glu Val Ser
85 90 95
Met Val Asn Tyr Leu Trp Pro Ala Phe Thr Leu Ile Ala Ala Ile Ala
100 105 110
Phe Asn Arg Gln Arg Ala Asn Trp Met Val Val Pro Gly Phe Ile Leu
115 120 125
Ser Ile Ile Gly Ile Cys Trp Val Leu Gly Gly Asp Gln Gly Leu Asp
130 135 140
Leu Ala Gly Met Leu Gly Asn Val Gln Asp Asn Pro Leu Ser Tyr Gly
145 150 155 160
Leu Ala Phe Leu Gly Ala Val Ile Trp Ala Ala Tyr Cys Thr Val Thr
165 170 175
Ala Arg Leu Ala Lys Gly Lys Asn Gly Val Thr Leu Phe Phe Ile Leu
180 185 190
Val Ala Leu Thr Leu Trp Val Lys Phe Phe Phe Gly Asp His Arg Pro
195 200 205
Met Ser Phe Ser Leu Pro Ala Ile Val Tyr Leu Leu Leu Ala Ala Ala
210 215 220
Ala Met Gly Phe Gly Tyr Ala Ala Trp Asn Val Gly Ile Leu His Gly
225 230 235 240
Asn Val Thr Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Phe Ile Pro Val Phe Ser
245 250 255
Ala Ala Leu Ser Ala Met Val Leu His Ala Pro Leu Pro Arg Ser Phe
260 265 270
Trp Val Gly Ala Ser Leu Val Cys Ala Gly Ser Ile Leu Cys Trp Leu
275 280 285
Ala Thr Arg Ala Arg Arg Ala Ser Ala Ala Gln Glu Asp Ala Val Ala
290 295 300
Asp Cys Leu
305
<210> 80
<211> 307
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> wex L79Y
<400> 80
Met Asn Ser Lys Lys Ala Thr Leu Ile Gly Leu Thr Ala Val Val Leu
1 5 10 15
Trp Ser Ser Ile Val Gly Leu Ile Arg Gly Val Ser Glu His Leu Gly
20 25 30
Ala Thr Gly Gly Ala Ala Met Met Tyr Ser Val Ala Ser Leu Phe Leu
35 40 45
Leu Leu Ser Val Gly Phe Pro Lys Leu Gly Ser Phe Pro Lys Lys Tyr
50 55 60
Leu Leu Trp Gly Ser Leu Leu Phe Val Ser Tyr Glu Leu Cys Tyr Ser
65 70 75 80
Leu Ser Ile Gly Tyr Ala Asn Thr Gly Arg Gln Ala Ile Glu Val Ser
85 90 95
Met Val Asn Tyr Leu Trp Pro Ala Phe Thr Leu Ile Ala Ala Ile Ala
100 105 110
Phe Asn Arg Gln Arg Ala Asn Trp Met Val Val Pro Gly Phe Ile Leu
115 120 125
Ser Ile Ile Gly Ile Cys Trp Val Leu Gly Gly Asp Gln Gly Leu Asp
130 135 140
Leu Ala Gly Met Leu Gly Asn Val Gln Asp Asn Pro Leu Ser Tyr Gly
145 150 155 160
Leu Ala Phe Leu Gly Ala Val Ile Trp Ala Ala Tyr Cys Thr Val Thr
165 170 175
Ala Arg Leu Ala Lys Gly Lys Asn Gly Val Thr Leu Phe Phe Ile Leu
180 185 190
Val Ala Leu Thr Leu Trp Val Lys Phe Phe Phe Gly Asp His Arg Pro
195 200 205
Met Ser Phe Ser Leu Pro Ala Ile Val Tyr Leu Leu Leu Ala Ala Ala
210 215 220
Ala Met Gly Phe Gly Tyr Ala Ala Trp Asn Val Gly Ile Leu His Gly
225 230 235 240
Asn Val Thr Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Phe Ile Pro Val Phe Ser
245 250 255
Ala Ala Leu Ser Ala Met Val Leu His Ala Pro Leu Pro Arg Ser Phe
260 265 270
Trp Val Gly Ala Ser Leu Val Cys Ala Gly Ser Ile Leu Cys Trp Leu
275 280 285
Ala Thr Arg Ala Arg Arg Ala Ser Ala Ala Gln Glu Asp Ala Val Ala
290 295 300
Asp Cys Leu
305
<210> 81
<211> 307
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> wex L79N
<400> 81
Met Asn Ser Lys Lys Ala Thr Leu Ile Gly Leu Thr Ala Val Val Leu
1 5 10 15
Trp Ser Ser Ile Val Gly Leu Ile Arg Gly Val Ser Glu His Leu Gly
20 25 30
Ala Thr Gly Gly Ala Ala Met Met Tyr Ser Val Ala Ser Leu Phe Leu
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Ala Met Gly Phe Gly Tyr Ala Ala Trp Asn Val Gly Ile Leu His Gly
225 230 235 240
Asn Val Thr Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Phe Ile Pro Val Phe Ser
245 250 255
Ala Ala Leu Ser Ala Met Val Leu His Ala Pro Leu Pro Arg Ser Phe
260 265 270
Trp Val Gly Ala Ser Leu Val Cys Ala Gly Ser Ile Leu Cys Trp Leu
275 280 285
Ala Thr Arg Ala Arg Arg Ala Ser Ala Ala Gln Glu Asp Ala Val Ala
290 295 300
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305
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<211> 307
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<213> 人工序列
<220>
<223> wex L79R
<400> 82
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1 5 10 15
Trp Ser Ser Ile Val Gly Leu Ile Arg Gly Val Ser Glu His Leu Gly
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Ala Thr Gly Gly Ala Ala Met Met Tyr Ser Val Ala Ser Leu Phe Leu
35 40 45
Leu Leu Ser Val Gly Phe Pro Lys Leu Gly Ser Phe Pro Lys Lys Tyr
50 55 60
Leu Leu Trp Gly Ser Leu Leu Phe Val Ser Tyr Glu Leu Cys Arg Ser
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Phe Asn Arg Gln Arg Ala Asn Trp Met Val Val Pro Gly Phe Ile Leu
115 120 125
Ser Ile Ile Gly Ile Cys Trp Val Leu Gly Gly Asp Gln Gly Leu Asp
130 135 140
Leu Ala Gly Met Leu Gly Asn Val Gln Asp Asn Pro Leu Ser Tyr Gly
145 150 155 160
Leu Ala Phe Leu Gly Ala Val Ile Trp Ala Ala Tyr Cys Thr Val Thr
165 170 175
Ala Arg Leu Ala Lys Gly Lys Asn Gly Val Thr Leu Phe Phe Ile Leu
180 185 190
Val Ala Leu Thr Leu Trp Val Lys Phe Phe Phe Gly Asp His Arg Pro
195 200 205
Met Ser Phe Ser Leu Pro Ala Ile Val Tyr Leu Leu Leu Ala Ala Ala
210 215 220
Ala Met Gly Phe Gly Tyr Ala Ala Trp Asn Val Gly Ile Leu His Gly
225 230 235 240
Asn Val Thr Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Phe Ile Pro Val Phe Ser
245 250 255
Ala Ala Leu Ser Ala Met Val Leu His Ala Pro Leu Pro Arg Ser Phe
260 265 270
Trp Val Gly Ala Ser Leu Val Cys Ala Gly Ser Ile Leu Cys Trp Leu
275 280 285
Ala Thr Arg Ala Arg Arg Ala Ser Ala Ala Gln Glu Asp Ala Val Ala
290 295 300
Asp Cys Leu
305
<210> 83
<211> 307
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> wex L79W
<400> 83
Met Asn Ser Lys Lys Ala Thr Leu Ile Gly Leu Thr Ala Val Val Leu
1 5 10 15
Trp Ser Ser Ile Val Gly Leu Ile Arg Gly Val Ser Glu His Leu Gly
20 25 30
Ala Thr Gly Gly Ala Ala Met Met Tyr Ser Val Ala Ser Leu Phe Leu
35 40 45
Leu Leu Ser Val Gly Phe Pro Lys Leu Gly Ser Phe Pro Lys Lys Tyr
50 55 60
Leu Leu Trp Gly Ser Leu Leu Phe Val Ser Tyr Glu Leu Cys Trp Ser
65 70 75 80
Leu Ser Ile Gly Tyr Ala Asn Thr Gly Arg Gln Ala Ile Glu Val Ser
85 90 95
Met Val Asn Tyr Leu Trp Pro Ala Phe Thr Leu Ile Ala Ala Ile Ala
100 105 110
Phe Asn Arg Gln Arg Ala Asn Trp Met Val Val Pro Gly Phe Ile Leu
115 120 125
Ser Ile Ile Gly Ile Cys Trp Val Leu Gly Gly Asp Gln Gly Leu Asp
130 135 140
Leu Ala Gly Met Leu Gly Asn Val Gln Asp Asn Pro Leu Ser Tyr Gly
145 150 155 160
Leu Ala Phe Leu Gly Ala Val Ile Trp Ala Ala Tyr Cys Thr Val Thr
165 170 175
Ala Arg Leu Ala Lys Gly Lys Asn Gly Val Thr Leu Phe Phe Ile Leu
180 185 190
Val Ala Leu Thr Leu Trp Val Lys Phe Phe Phe Gly Asp His Arg Pro
195 200 205
Met Ser Phe Ser Leu Pro Ala Ile Val Tyr Leu Leu Leu Ala Ala Ala
210 215 220
Ala Met Gly Phe Gly Tyr Ala Ala Trp Asn Val Gly Ile Leu His Gly
225 230 235 240
Asn Val Thr Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Phe Ile Pro Val Phe Ser
245 250 255
Ala Ala Leu Ser Ala Met Val Leu His Ala Pro Leu Pro Arg Ser Phe
260 265 270
Trp Val Gly Ala Ser Leu Val Cys Ala Gly Ser Ile Leu Cys Trp Leu
275 280 285
Ala Thr Arg Ala Arg Arg Ala Ser Ala Ala Gln Glu Asp Ala Val Ala
290 295 300
Asp Cys Leu
305
<210> 84
<211> 307
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> wex L79S
<400> 84
Met Asn Ser Lys Lys Ala Thr Leu Ile Gly Leu Thr Ala Val Val Leu
1 5 10 15
Trp Ser Ser Ile Val Gly Leu Ile Arg Gly Val Ser Glu His Leu Gly
20 25 30
Ala Thr Gly Gly Ala Ala Met Met Tyr Ser Val Ala Ser Leu Phe Leu
35 40 45
Leu Leu Ser Val Gly Phe Pro Lys Leu Gly Ser Phe Pro Lys Lys Tyr
50 55 60
Leu Leu Trp Gly Ser Leu Leu Phe Val Ser Tyr Glu Leu Cys Ser Ser
65 70 75 80
Leu Ser Ile Gly Tyr Ala Asn Thr Gly Arg Gln Ala Ile Glu Val Ser
85 90 95
Met Val Asn Tyr Leu Trp Pro Ala Phe Thr Leu Ile Ala Ala Ile Ala
100 105 110
Phe Asn Arg Gln Arg Ala Asn Trp Met Val Val Pro Gly Phe Ile Leu
115 120 125
Ser Ile Ile Gly Ile Cys Trp Val Leu Gly Gly Asp Gln Gly Leu Asp
130 135 140
Leu Ala Gly Met Leu Gly Asn Val Gln Asp Asn Pro Leu Ser Tyr Gly
145 150 155 160
Leu Ala Phe Leu Gly Ala Val Ile Trp Ala Ala Tyr Cys Thr Val Thr
165 170 175
Ala Arg Leu Ala Lys Gly Lys Asn Gly Val Thr Leu Phe Phe Ile Leu
180 185 190
Val Ala Leu Thr Leu Trp Val Lys Phe Phe Phe Gly Asp His Arg Pro
195 200 205
Met Ser Phe Ser Leu Pro Ala Ile Val Tyr Leu Leu Leu Ala Ala Ala
210 215 220
Ala Met Gly Phe Gly Tyr Ala Ala Trp Asn Val Gly Ile Leu His Gly
225 230 235 240
Asn Val Thr Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Phe Ile Pro Val Phe Ser
245 250 255
Ala Ala Leu Ser Ala Met Val Leu His Ala Pro Leu Pro Arg Ser Phe
260 265 270
Trp Val Gly Ala Ser Leu Val Cys Ala Gly Ser Ile Leu Cys Trp Leu
275 280 285
Ala Thr Arg Ala Arg Arg Ala Ser Ala Ala Gln Glu Asp Ala Val Ala
290 295 300
Asp Cys Leu
305
<210> 85
<211> 307
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> wex L79P
<400> 85
Met Asn Ser Lys Lys Ala Thr Leu Ile Gly Leu Thr Ala Val Val Leu
1 5 10 15
Trp Ser Ser Ile Val Gly Leu Ile Arg Gly Val Ser Glu His Leu Gly
20 25 30
Ala Thr Gly Gly Ala Ala Met Met Tyr Ser Val Ala Ser Leu Phe Leu
35 40 45
Leu Leu Ser Val Gly Phe Pro Lys Leu Gly Ser Phe Pro Lys Lys Tyr
50 55 60
Leu Leu Trp Gly Ser Leu Leu Phe Val Ser Tyr Glu Leu Cys Pro Ser
65 70 75 80
Leu Ser Ile Gly Tyr Ala Asn Thr Gly Arg Gln Ala Ile Glu Val Ser
85 90 95
Met Val Asn Tyr Leu Trp Pro Ala Phe Thr Leu Ile Ala Ala Ile Ala
100 105 110
Phe Asn Arg Gln Arg Ala Asn Trp Met Val Val Pro Gly Phe Ile Leu
115 120 125
Ser Ile Ile Gly Ile Cys Trp Val Leu Gly Gly Asp Gln Gly Leu Asp
130 135 140
Leu Ala Gly Met Leu Gly Asn Val Gln Asp Asn Pro Leu Ser Tyr Gly
145 150 155 160
Leu Ala Phe Leu Gly Ala Val Ile Trp Ala Ala Tyr Cys Thr Val Thr
165 170 175
Ala Arg Leu Ala Lys Gly Lys Asn Gly Val Thr Leu Phe Phe Ile Leu
180 185 190
Val Ala Leu Thr Leu Trp Val Lys Phe Phe Phe Gly Asp His Arg Pro
195 200 205
Met Ser Phe Ser Leu Pro Ala Ile Val Tyr Leu Leu Leu Ala Ala Ala
210 215 220
Ala Met Gly Phe Gly Tyr Ala Ala Trp Asn Val Gly Ile Leu His Gly
225 230 235 240
Asn Val Thr Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Phe Ile Pro Val Phe Ser
245 250 255
Ala Ala Leu Ser Ala Met Val Leu His Ala Pro Leu Pro Arg Ser Phe
260 265 270
Trp Val Gly Ala Ser Leu Val Cys Ala Gly Ser Ile Leu Cys Trp Leu
275 280 285
Ala Thr Arg Ala Arg Arg Ala Ser Ala Ala Gln Glu Asp Ala Val Ala
290 295 300
Asp Cys Leu
305

Claims (7)

1.用于生产L-酪氨酸的微生物，其包含下列之一种或多种：
蛋白质变体，其中SEQ ID NO：52的氨基酸序列的自N末端起第79位的氨基酸被丙氨酸或甘氨酸取代；
编码所述蛋白质变体的多核苷酸；和
含有所述多核苷酸的载体。
2.根据权利要求1所述的微生物，其中所述微生物属于棒杆菌属(Corynebacteriumsp.)。
3.生产L-酪氨酸的方法，其包括：在培养基中培养用于生产L-酪氨酸的微生物，其中所述微生物包含下列之一种或多种：
蛋白质变体，其中SEQ ID NO：52的氨基酸序列的自N末端起第79位的氨基酸被丙氨酸或甘氨酸取代；
编码所述蛋白质变体的多核苷酸；和
含有所述多核苷酸的载体。
4.根据权利要求3所述的方法，其包括回收所生产的酪氨酸。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述微生物属于棒杆菌属(Corynebacteriumsp.)。
6.具有L-酪氨酸输出活性的蛋白质变体，其中SEQ ID NO：52的氨基酸序列的自N末端起第79位的氨基酸被丙氨酸或甘氨酸取代。
7.多核苷酸，其编码根据权利要求6所述的具有L-酪氨酸输出活性的蛋白质变体。
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DE19907347A1 (de) * 1999-02-20 2000-08-24 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien
DE60236684D1 (de) * 2001-11-23 2010-07-22 Ajinomoto Kk Verfahren zur l-aminosäureproduktion mit escherichia
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KR101968317B1 (ko) * 2018-02-23 2019-04-11 씨제이제일제당 주식회사 신규 l-트립토판 배출 단백질 및 이를 이용한 l-트립토판을 생산하는 방법
KR102205717B1 (ko) * 2019-04-05 2021-01-22 씨제이제일제당 주식회사 신규 l-트립토판 배출 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-트립토판을 생산하는 방법

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