BR112021000765B1 - Variante de proteína de exportação de l-triptofano e seu uso, polinucleotídeo que codifica a dita variante, vetor, microrganismo que produz l-triptofano e método para produzir l- triptofano - Google Patents

Abstract

VARIANTE DE PROTEÍNA DE EXPORTAÇÃO DE L-TRIPTOFANO E SEU USO, POLINUCLEOTÍDEO QUE CODIFICA A DITA VARIANTE, VETOR, MICRORGANISMO QUE PRODUZ LTRIPTOFANO E MÉTODO PARA PRODUZIR L- TRIPTOFANO. A presente revelação se refere a uma variante de proteína que tem uma atividade de exportação de triptofano, um microrganismo que produz L-triptofano que expressa a variante de proteína e um método para produzir L-triptofano com uso do microrganismo.

Description

[CAMPO DA TÉCNICA]

[001] A presente revelação refere-se a uma variante de proteína inovadora que tem uma atividade de exportação de triptofano, um microrganismo que produz L- triptofano que expressa a variante de proteína e um método para produzir L-triptofano com uso do microrganismo.

[ANTECEDENTES DA TÉCNICA]

[002] Triptofano, que é um aminoácido essencial, foi amplamente usado como uma matéria-prima para fornecer aditivos, medicamentos (por exemplo, soluções de infusão), materiais de comida saudável etc. No presente, um método de fermentação direta com uso de um microrganismo é principalmente usado para a produção de L- triptofano.

[003] Anteriormente, cepas seletivas que exibem resistência a análogos através de mutação química ou física foram principalmente usadas como o microrganismo usado para a produção de L-triptofano. No entanto, conforme o rápido desenvolvimento de tecnologia de recombinação genética e os mecanismos regulatórios de nível molecular foram identificados na década de 1990, cepas recombinantes são principalmente usadas utilizando-se técnicas de engenharia genética.

[004] Entretanto, a expressão de um gene de exportação de um aminoácido particular contribuiu para um aumento na produtividade do aminoácido correspondente em microrganismos. A melhora da expressão do gene de exportação de L-lisina (lysE) em um microrganismo do gênero Corynebacterium aprimorou a produtividade de lisina (WO 9723597A2). Adicionalmente, a melhora do gene rhtC em E. coli aprimorou a resistência a L-treonina e, simultaneamente, também aprimorou a produtividade de L-homoserina, L-treonina e L-leucina (EP1013765A1). Adicionalmente, a Patente número EP1016710B1 revela que a produtividade de L- ácido glutâmico, L-lisina, L-treonina, L-alanina, L-fenilalanina, L-prolina, L-arginina, L- valina, e L-isoleucina aprimorou pela melhora de genes yahN, yeaS, yfiK e yggA genes, cujas funções em E. coli ainda não foram identificadas.

[005] No entanto, a exportação de proteínas que mostram especificidade para L- triptofano não foi reportada até a presente data. Embora o gene yddG de E. coli seja mostrado, mostra maior especificidade para L-fenilalanina que para L-triptofano (FEMS Microbiol Lett 275 (2007), 312 a 318). Adicionalmente, em um microrganismo do gênero Corynebacterium que é principalmente usado como uma cepa produtora para fermentação de L-aminoácido, genes que exportam L-triptofano ou um aminoácido aromático nunca foram reportados (J Ind Microbiol Biotechnol. Maio de 2015; 42(5): 787 a 797).

[REVELAÇÃO] [PROBLEMA DA TÉCNICA]

[006] Os inventores da presente revelação tiveram sucesso em expressar uma proteína inovadora de exportação de triptofano que tem especificidade para L- triptofano em um microrganismo que produz L-triptofano e, como resultado, foi constatado que a quantidade de produção de L-triptofano foi significativamente aprimorada. Além disso, através da introdução de mutações para aprimora ainda a capacidade de exportar uma proteína de membrana correspondente, foi confirmado que a quantidade de produção de L-triptofano foi significativamente aprimorada. Assim, a presente revelação foi concluída.

[SOLUÇÃO TÉCNICA]

[007] Um objeto da presente revelação é fornecer uma variante de proteína que tenha uma atividade de exportação de L-triptofano, em que pelo menos um aminoácido selecionado a partir dos aminoácidos corresponde a aqueles nas posições 79 a 83 em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 é substituído com um aminoácido hidrofóbico ou alifático.

[008] Outro objeto da presente revelação deve fornecer um polinucleotídeo que codifica a variante, e um vetor que inclui o polinucleotídeo.

[009] Ainda outro objeto da presente revelação deve fornecer um microrganismo que produz L-triptofano, que expressa a variante de proteína.

[010] Ainda outro objeto da presente revelação deve fornecer um método para produzir L-triptofano, que inclui cultivar o microrganismo em um meio.

[011] Ainda outro objeto da presente revelação deve fornecer um uso da variante de proteína para melhorar a produção de L-triptofano.

[EFEITOS VANTAJOSOS DA INVENÇÃO]

[012] Os inventores da presente revelação constataram um gene inovador de exportação que tem especificidade para L-triptofano e tentou expressar o gene em um microrganismo que produz L-triptofano. Como resultado, confirmaram que o microrganismo pode significantemente melhorar a quantidade de produção de L- triptofano comparada a sua cepa parental, em que o gene não é expresso e também foi constatado uma variante de proteína codificada pelo gene, o que permite que o microrganismo melhore mais significativamente a quantidade de produção de L- triptofano, confirmando, assim, que o L-triptofano pode ser produzido de modo eficaz através do mesmo.

[BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS]

[013] A Figura 1 mostra as concentrações intracelulares de triptofano em CA04- 8352 e CA04-8405, que são cepas modificadas de Corynebacterium glutamicum, de acordo com o consumo de glicose.

[DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO]

[014] Doravante, a presente invenção será descrita em mais detalhes. Enquanto isso, cada descrição e modalidade reveladas na presente revelação podem ser aplicadas no presente documento para descrever cada uma das diferentes descrições e modalidades. Ou seja, todas as combinações dos vários componentes revelados na presente revelação estão inclusas no escopo da presente revelação. Adicionalmente, o escopo da presente revelação não deve ser limitado pela descrição detalhada fornecida abaixo.

[015] Um aspecto da presente revelação fornece uma variante de proteína que tem uma capacidade de exportação de L-triptofano, em que a variante de proteína inclui pelo menos uma mutação em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

[016] A mutação pode incluir aqueles em que pelo menos um aminoácido selecionado a partir do 79° aminoácido ao 83° aminoácido do N-terminal da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 é substituído com um aminoácido diferente.

[017] A variante de proteína pode ser uma variante de proteína que tem uma atividade de exportação de L-triptofano, em que pelo menos um aminoácido selecionado a partir dos aminoácidos nas posições 79 a 83 em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 é substituído com um aminoácido diferente. Especificamente, a variante de proteína pode ser uma variante de proteína que tem uma atividade de exportação de L-triptofano, em que pelo menos um aminoácido selecionado a partir dos aminoácidos nas posições 79 a 83 em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 é substituído com um aminoácido hidrofóbico ou aminoácido alifático.

[018] Conforme usado no presente documento, o termo “L-triptofano”, que é um dentre os a-aminoácidos, se refere a um aminoácido essencial que não é sintetizado in vivo e é um L-aminoácido aromático que tem uma fórmula química de C11H12N2O2.

[019] Na presente revelação, “proteína que tem uma capacidade de exportação de L-triptofano” ou “proteína que tem uma atividade de exportação de L-triptofano” se refere a uma proteína de membrana que tem uma atividade de especificamente de exportação de L-triptofano fora de uma célula.

[020] A proteína que tem uma atividade de exportação de L-triptofano pode ser uma proteína derivada Herbaspirillum rhizosphaerae que tem uma atividade de exportação de L-triptofano. A proteína derivada Herbaspirillum rhizosphaerae que tem uma atividade de exportação de L-triptofano pode ser, por exemplo, uma proteína que inclui uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. A proteína que inclui uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 pode ser usada de forma intercambiável com uma proteína que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 e uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

[021] Em particular, “Herbaspirillum rhizosphaerae” é uma bactéria gram- negativa que pertence ao gênero Herbaspirillum. Na Coreia do Sul, Herbaspirillum rhizosphaerae, como uma cepa isolada da Ilha Ulleungdo etc., pode ser isolada a partir da rizosfera no solo.

[022] Adicionalmente, embora a proteína da presente revelação, que tem uma atividade de exportação de L-triptofano, foi definida como uma proteína que inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, não excluí uma adição de uma sequência sem sentido a montante ou a jusante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, uma mutação que pode ocorrer naturalmente, ou mutação silenciosa da mesma, e é evidente para os versados na técnica que qualquer proteína, que tem uma atividade idêntica ou correspondente à proteína, incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, pertence à proteína da presente revelação, que tem uma atividade de exportação de L-triptofano. Especificamente, por exemplo, a proteína da presente revelação, que tem uma atividade de exportação de L-triptofano, pode ser uma proteína que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, ou uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos que tem uma homologia ou identidade para a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 de 80%, 90%, 95%, 97% ou superior. Adicionalmente, é evidente que qualquer proteína que tem uma sequência de aminoácidos com deleção, modificação, substituição ou adição em parte da sequência também pode pertencer ao escopo das proteínas da presente revelação deve ser mutada, contando que a proteína tenha uma sequência de aminoácidos com qualquer uma dentre as homologias e identidades acima e exiba um efeito que corresponde à proteína acima.

[023] Ou seja, na presente revelação, mesmo em uma caso em que seja descrito como “proteína ou polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos de uma SEQ ID NO” particular ou “proteína ou polipeptídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos de uma SEQ ID NO” particular, é evidente que qualquer proteína que tem uma sequência de aminoácidos com deleção, modificação, substituição ou adição em parte da sequência também pode ser usado na presente revelação, desde que a proteína tenha atividade idêntica ou correspondente aquela do polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO correspondente. Por exemplo, é evidente que o “polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1” também pode pertencer ao “polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1”, contanto que o polipeptídeo tenha uma atividade idêntica ou que corresponda ao mesmo.

[024] A variante de proteína que tem uma capacidade de exportação de L- triptofano fornecida na presente revelação pode se referir a uma variante na qual, entre as proteínas com a capacidade de exportação de proteína L-triptofano descrita acima, um aminoácido em uma posição específica do mesmo é substituído e a capacidade de exportação de L-triptofano resultante excede 100% em comparação com a da proteína antes da mutação.

[025] Conforme usado no presente documento, o termo "variante" se refere a uma proteína, na qual pelo menos um aminoácido na substituição e/ou modificação conservativa é diferente daquele da sequência recitada, mas as funções ou propriedades da proteína são mantidas. Uma variante difere da sequência identificada por várias substituições, deleções ou adições de aminoácidos. Tal variante pode ser identificada modificando-se um ou mais aminoácidos na sequência de aminoácidos da proteína acima e avaliando-se as propriedades da proteína modificada acima. Ou seja, a capacidade de uma variante pode ser aumentada, inalterada ou reduzida em comparação com a de sua proteína nativa. Adicionalmente, algumas variantes podem incluir aquelas em que uma ou mais partes (por exemplo, uma sequência líder de terminal N ou um domínio transmembranar) são removidas. Outras variantes podem incluir variantes nas quais parte do terminal N e/ou terminal C de uma proteína madura é removida. O termo "variante" também pode ser usado indistintamente com "modificação", "proteína modificada", "polipeptídeo modificado", "mutante", "muteína", "divergente", "variante" etc., mas o termo a ser usado não se limita a isso e qualquer termo pode ser usado, desde que seja usado no sentido de estar mutado. Para o propósito da presente revelação, a variante pode se referir àqueles em que a atividade de uma proteína mutada é aumentada em comparação com aquela de proteínas naturais de tipo selvagem ou não modificadas, mas a variante não está limitada as mesmas.

[026] Conforme usado no presente documento, o termo "substituição conservativa" se refere à substituição de um aminoácido por um aminoácido diferente que tem propriedades estruturais e/ou químicas semelhantes. A variante pode ter, por exemplo, uma ou mais substituições conservativas, embora ainda retenha uma ou mais atividades biológicas. Essas substituições de aminoácidos podem geralmente ocorrer com base na semelhança na polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou natureza anfipática de resíduos. Por exemplo, entre os aminoácidos carregados eletricamente, os aminoácidos carregados positivamente (básicos) incluem arginina, lisina e histidina; aminoácidos carregados negativamente (ácidos) incluem ácido glutâmico e ácido aspártico. Entre os aminoácidos não carregados, os aminoácidos não polares incluem glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptofano e prolina; aminoácidos polares ou hidrofílicos incluem serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina; e os aminoácidos aromáticos incluem fenilalanina, triptofano e tirosina.

[027] Além disso, a variante pode incluir a deleção ou adição de aminoácidos que têm uma influência mínima nas propriedades e uma estrutura secundária de um polipeptídio. Por exemplo, um polipeptídio pode ser conjugado com uma sequência de sinal (ou líder) no terminal N de uma proteína, que direciona de forma translacional ou pós-translacional a transferência da proteína. Além disso, o polipeptídio também pode ser conjugado com outra sequência ou um ligante para identificação, purificação ou síntese do polipeptídio.

[028] A "substituição por um aminoácido diferente" não é limitada, desde que o aminoácido substituído seja diferente daquele antes da substituição. Ou seja, a "substituição por um aminoácido diferente" não é limitada, desde que o 79° aminoácido do terminal N de uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (isto é, leucina) é substituído por um aminoácido diferente de leucina; o 80° aminoácido do terminal N de uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (isto é, serina) é substituído por um aminoácido diferente de serina; o 81° aminoácido do terminal N de uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (isto é, leucina) é substituído por um aminoácido diferente de leucina; o 82° aminoácido do terminal N de uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (isto é, serina) é substituído por um aminoácido diferente de serina; o 83° aminoácido do terminal N de uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (isto é, isoleucina) é substituído por um aminoácido diferente de isoleucina. Enquanto isso, quando é expresso como "um aminoácido particular é substituído" na presente revelação, é óbvio que o aminoácido é substituído por um aminoácido diferente do aminoácido antes da substituição, mesmo que não seja especificamente declarado que o aminoácido foi substituído por um aminoácido diferente.

[029] Alternativamente, a variante de proteína pode ser uma variante, na qual pelo menos um aminoácido entre os aminoácidos nas posições 79 a 83 em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 é substituído por um aminoácido diferente do aminoácido antes da substituição, excluindo aminoácidos ácidos e aminoácidos básicos. Alternativamente, a variante da proteína pode ser uma variante com um aminoácido não carregado, em que o aminoácido substituído é diferente do aminoácido antes da substituição, mas a variante da proteína não está limitada ao mesmo.

[030] Alternativamente, a variante de proteína pode ser uma variante, na qual pelo menos um aminoácido entre os aminoácidos nas posições 79 a 83 em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 é substituído por um aminoácido entre um aminoácido hidrofóbico e um aminoácido alifático que é diferente do aminoácido antes da substituição. Especificamente, a variante da proteína pode ser uma variante, na qual pelo menos um aminoácido entre os aminoácidos nas posições 79 a 83 em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 é substituído por qualquer um dos aminoácidos entre um aminoácido hidrofóbico (não polar) e um aminoácido alifático. O aminoácido alifático pode ser, por exemplo, um aminoácido selecionado do grupo que consiste em glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina, mas o aminoácido alifático não está limitado aos mesmos. O aminoácido hidrofóbico (não polar) pode ser, por exemplo, um aminoácido selecionado do grupo que consiste em glicina, metionina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, tirosina e triptofano, mas o aminoácido hidrofóbico (não polar) o ácido não está limitado aos mesmos.

[031] Alternativamente, a variante de proteína pode ser uma variante, na qual pelo menos um aminoácido entre os aminoácidos nas posições 79 a 83 em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 é substituído por um aminoácido diferente do aminoácido antes da substituição, entre os aminoácidos de tamanho pequeno, mas a variante de proteína não está limitada ao mesmo.

[032] Conforme usado no presente documento, o termo "aminoácidos de pequeno porte" inclui aminoácidos com um tamanho relativamente pequeno entre os 20 aminoácidos (isto é, glicina, alanina, serina, treonina, cisteína, valina, leucina, isoleucina, prolina e asparagina) e, especificamente, pode se referir a glicina, alanina, serina, treonina, cisteína, valina, leucina, isoleucina e prolina, mas os aminoácidos de pequeno porte não estão limitados aos mesmos; e mais especificamente, os aminoácidos de pequeno tamanho podem se referir a glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina e treonina, mas os aminoácidos de pequeno tamanho não estão limitados aos mesmos.

[033] Alternativamente, a variante de proteína pode ser uma variante, na qual pelo menos um aminoácido entre os aminoácidos nas posições 79 a 83 em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 é substituído por um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, valina, leucina e isoleucina, mas a variante de proteína não está limitada aos mesmos.

[034] Especificamente, a substituição por um aminoácido diferente na variante da proteína pode ser uma ou mais substituições selecionadas a partir das substituições, que consiste em: uma substituição na qual o 79° aminoácido na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (isto é, leucina) é substituído por alanina, valina ou isoleucina; uma substituição na qual o 80° aminoácido na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (isto é, serina) é substituído por alanina, valina ou isoleucina; uma substituição na qual o 81° aminoácido na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (isto é, leucina) é substituído por alanina, valina ou isoleucina; uma substituição na qual o 82° aminoácido na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (isto é, serina) é substituído por alanina, valina, leucina ou isoleucina; e uma substituição na qual o 83° aminoácido na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (isto é, isoleucina) é substituído por alanina, valina ou leucina, mas a substituição não está limitada aos mesmos.

[035] As variantes de proteína da presente revelação, como tal, têm uma capacidade aumentada de exportação de L-triptofano em comparação com a proteína antes da mutação.

[036] É óbvio que as variantes de proteínas da presente revelação, nas quais pelo menos um aminoácido entre os aminoácidos nas posições 79 a 83 do terminal N de SEQ ID NO: 1 é substituído por um aminoácido diferente, inclui variantes de proteína em que os aminoácidos nas posições correspondentes às posições de 79 a 83 são substituídos por um aminoácido diferente.

[037] Um versado na técnica será capaz de identificar se um aminoácido em qualquer posição em qualquer sequência é ou não um aminoácido que corresponde aos aminoácidos nas posições 79 a 83 da SEQ ID NO: 1, comparando-se qualquer sequência com a SEQ ID NO: 1 da presente revelação aplicando-se um método de confirmação de alinhamento, homologia ou identidade de sequência conhecido na técnica.

[038] Portanto, embora não seja descrito no presente documento de outra forma, é óbvio que a descrição relativa aos "aminoácidos nas posições 79 a 83 da SEQ ID NO: 1” também pode ser aplicado à descrição dos“aminoácidos que correspondem aos aminoácidos nas posições 79 a 83 da SEQ ID NO: 1” em qualquer sequência, por exemplo, uma sequência que tem a identidade com a SEQ ID NO: 1 de 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% ou superior.

[039] Por exemplo, a variante de proteína da presente revelação pode ser uma variante de proteína em que um aminoácido correspondente aos aminoácidos nas posições 79 a 83 é substituído por um aminoácido diferente e tem a identidade com a SEQ ID NO: 1 de 70%, 80%, 90% ou 95%, mas a variante de proteína da presente revelação não está limitada aos mesmos.

[040] A variante de proteína, na qual um ou mais aminoácidos entre os aminoácidos nas posições 79 a 83 em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 são substituídos por um aminoácido diferente, pode ser uma variante de proteína que inclui qualquer sequência de aminoácidos entre as SEQ ID NOS: 131 a 147; especificamente, pode ser uma variante de proteína que consiste essencialmente em qualquer sequência de aminoácidos entre as SEQ ID NOS: 131 a 147; e mais especificamente, pode ser uma variante de proteína que consiste em qualquer sequência de aminoácidos entre as SEQ ID NOS: 131 a 147, mas a variante de proteína da presente revelação não está limitada aos mesmos.

[041] Adicionalmente, a variante de proteína pode incluir qualquer sequência de aminoácidos entre as SEQ ID NOS: 131 a 147; ou uma sequência de aminoácidos, na qual pelo menos um aminoácido selecionado a partir dos aminoácidos nas posições 79 a 83 em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 é fixo e que tem uma homologia ou identidade com a SEQ ID NO: 1 de 80% ou superior, mas a variante da proteína não está limitada ao mesmo. Especificamente, o polipeptídeo mutante da presente revelação pode incluir um polipeptídeo que tem uma homologia ou identidade com qualquer sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 131 a 147 de pelo menos 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%. Adicionalmente, é evidente que qualquer proteína, que tem uma sequência de aminoácidos com deleção, modificação, substituição ou adição em parte da sequência diferente das posições de aminoácidos de 79 a 83, também pode ser incluída no escopo da presente revelação, desde que a proteína tenha qualquer uma das homologias ou identidades acima e exiba um efeito correspondente à proteína acima.

[042] Conforme usado no presente documento, o termo "homologia" ou "identidade" se refere a um grau de relevância entre duas sequências de aminoácidos ou sequências de nucleotídeos dadas e pode ser expresso como uma porcentagem. Esses termos “homologia” e “identidade” podem muitas vezes ser usados de forma intercambiável.

[043] A homologia de sequência ou identidade de polinucleotídeos ou polipeptídeos conservados pode ser determinada por algoritmo de alinhamento padrão e penalidades de lacuna padrão estabelecidas por um programa em uso podem ser usadas em conjunto. Na verdade, sequências homólogas ou idênticas podem hibridizar entre si ao longo de pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% de toda a sequência ou de todo o comprimento sob condições moderadas ou altamente restringentes. Na hibridização, polinucleotídeos incluindo um códon degenerado em vez de um códon também são considerados.

[044] A possibilidade de quaisquer duas sequências de polinucleotídeo ou polipeptídeo terem uma homologia, similaridade ou identidade, pode ser determinado usando algoritmos de computador conhecidos na técnica, por exemplo, programa "FASTA" com uso de parâmetros padrão introduzidos por Pearson et al. (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85: 2.444]. Alternativamente, algoritmo Needleman-Wunsch (1970, J. Mol. Biol. 48: 443 a 453) realizado em um programa Needleman do pacote The European Molecular Biology Open Software Suite do EMBOSS (Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276 a 277) (versão 5.0.0 ou uma versão posterior) pode ser usado para determinar o mesmo (incluindo o pacote de programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL., J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego, 1994, e [CARILLO ETA /.] (1988) SIAM J Applied Math 48: 1.073). Por exemplo, a homologia, similaridade ou identidade pode ser determinada usando BLAST do banco de dados do National Center for Biotechnology Information ou ClustalW.

[045] A homologia, semelhança ou identidade entre polinucleotídeos ou polipeptídeos, por exemplo, pode ser determinada comparando-se a informação de sequência dada com uso de um programa de computador GAP, como um programa introduzido por Needleman et al. (J Mol Biol. 48: 443 (1970)) conforme revelado por Smith e Waterman (Adv. Appl. Math (1981) 2: 482). Em resumo, o programa GAP define homologia, semelhança ou identidade como o número de símbolos alinhados semelhantes (isto é, nucleotídeos ou aminoácidos) dividido pelo número total de símbolos em uma das duas sequências mais curta. Os parâmetros padrão para o programa GAP podem incluir: (1) uma matriz de comparação binária (incluindo um valor 1 para identidade e um valor 0 para não identidade) e a matriz de comparação ponderada de Gribskov, et al., (Nucl. Acids Res. 14: 6.745 (1986)) conforme descrito por Schwartz e Dayhoff, eds. (Atlas Of Protein Sequence And Structure, Fundação Nacional de Pesquisa Biomédica, páginas 353 a 358 (1979) ou matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS de NCBI NUC4.4)); (2) uma penalidade de 3,0 para cada intervalo e uma penalidade adicional de 0,10 para cada símbolo em cada intervalo (ou uma penalidade de intervalo aberto de 10 e uma penalidade de extensão do intervalo de 0,5); e (3) nenhuma penalidade por intervalos finais.

[046] Adicionalmente, a possibilidade de quaisquer duas sequências de polinucleotídeo ou polipeptídeo terem uma homologia, similaridade ou identidade pode ser confirmado comparando-se essas sequências por experimentos de hibridização Southern a serem realizados sob condições estritas definidas, e as condições de hibridização apropriadas a serem definidas podem ser determinadas dentro escopo da técnica e por um método bem conhecido dos versados na técnica (por exemplo, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, Nova York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York).

[047] Conforme usado no presente documento, o termo "a ser expresso/que expressa" em relação a uma proteína se refere a um estado em que uma proteína alvo é introduzida em um microrganismo ou uma proteína alvo é modificada para ser expressa em um microrganismo. Quando a proteína alvo é uma proteína presente em um microrganismo, o termo se refere a um estado em que a atividade da proteína é aumentada em comparação com a atividade de sua proteína endógena ou antes de sua modificação. Para o propósito da presente revelação, "proteína alvo" pode ser uma variante da proteína com uma capacidade de exportação de L-triptofano descrita acima.

[048] Especificamente, o termo "introdução de uma proteína" significa que um microrganismo exibe uma atividade de uma proteína particular que não foi originalmente possuída na mesma, ou o microrganismo exibe uma atividade aumentada em comparação com sua atividade endógena ou a atividade da proteína antes da modificação. Por exemplo, o termo "introdução de uma proteína" pode significar que um polinucleotídeo que codifica uma proteína particular é introduzido no cromossomo de um microrganismo; ou um vetor que inclui um polinucleotídeo que codifica uma proteína particular é introduzido em um microrganismo e, assim, permite que a atividade da proteína particular seja exibida. Adicionalmente, o termo "aumento da atividade" significa que a atividade de uma determinada proteína é aumentada em comparação com sua atividade endógena ou a atividade antes de sua modificação. O termo "atividade endógena" se refere à atividade de uma proteína particular originalmente possuída por uma cepa parental antes da modificação, em um caso em que a característica do microrganismo é alterada devido à mutação genética causada por um fator natural ou artificial.

[049] Especificamente, na presente revelação, a melhora de uma atividade pode ser alcançado por um ou mais métodos selecionados a partir do grupo que consiste em: um método para aumentar o número de cópias intracelulares de um gene que codifica a variante de proteína; um método para introduzir uma mutação na sequência de controle de expressão de um gene que codifica a variante de proteína; um método para substituir a sequência de controle de expressão de um gene que codifica a variante de proteína que tem uma atividade de exportação de L-triptofano por uma sequência com uma atividade forte; um método para substituir um gene que codifica uma proteína nativa com uma atividade de exportação de L-triptofano no cromossomo por um gene que codifica a variante de proteína; um método para introduzir ainda uma mutação em um gene que codifica a proteína que tem uma atividade de exportação de L-triptofano de modo que a atividade da variante da proteína seja aumentada; e um método para introduzir uma variante de proteína em um microrganismo, mas o método para aumentar uma atividade não está limitado aos mesmos.

[050] No acima, o método para aumentar o número de cópias de um gene pode ser realizado em uma forma em que o gene está operacionalmente ligado a um vetor ou pela inserção do gene no cromossomo de uma célula hospedeira, mas o método não é particularmente limitado a isso. Especificamente, o número de cópias de um gene pode ser aumentado pela introdução de um vetor em uma célula hospedeira, em que o vetor, ao qual um polinucleotídeo que codifica a proteína da presente revelação está operacionalmente ligado e que pode se replicar e funcionar independentemente da célula hospedeira, é introduzido na célula hospedeira. Alternativamente, o número de cópias de um gene pode ser aumentado pela introdução do vetor, ao qual um polinucleotídeo está operacionalmente ligado e que pode inserir o polinucleotídeo no cromossomo de uma célula hospedeira, no cromossomo da célula hospedeira. A inserção de um polinucleotídeo no cromossomo pode ser conseguida por um método conhecido na técnica (por exemplo, recombinação homóloga).

[051] Em seguida, a modificação da sequência de controle de expressão para aumentar a expressão de um polinucleotídeo pode ser realizada por indução de uma mutação na sequência de um ácido nucleico por deleção, inserção, substituição não conservativa ou conservativa, ou uma combinação dos mesmos de modo a ainda aumentar a atividade da sequência de controle de expressão; ou substituindo-se a sequência de controle de expressão por uma sequência de ácido nucleico com uma atividade mais forte, mas o método de modificação da sequência de controle de expressão não está particularmente limitado a isso. A sequência de controle de expressão pode incluir um promotor, uma sequência de operador, uma sequência que codifica um sítio de ligação ao ribossomo, sequências que controlam a terminação da transcrição e tradução etc., mas a sequência de controle de expressão não é particularmente limitada aos mesmos.

[052] Um promotor forte pode ser ligado a uma região a montante da unidade de expressão do polinucleotídeo em vez do promotor original, mas não está limitado a isso. Exemplos do promotor forte conhecido na técnica podem incluir promotores cj1 a cj7 (Patente número KR 10-0620092), um promotor lac, um promotor trp, um promotor trc, um promotor tac, um promotor PR de fago lambda, um promotor PL, um promotor tet, um promotor gapA, um promotor SPL7, promotor SPL13 (sm3) (Patente KR No. 10-1783170), um promotor O2 (Patente KR No. 10-1632642), um promotor tkt, um promotor yccA etc., mas o promotor forte não se limita aos mesmos.

[053] Além disso, a modificação de uma sequência polinucleotídica no cromossomo pode ser realizada induzindo-se uma mutação na sequência de controle de expressão por deleção, inserção, substituição não conservativa ou conservativa, ou uma combinação das mesmas, de modo a aumentar ainda mais a atividade da sequência polinucleotídica; ou substituindo-se a sequência polinucleotídica por uma sequência polinucleotídica melhorada para ter uma atividade mais forte, mas o método de modificação da sequência polinucleotídica não está particularmente limitado a isso.

[054] A introdução e o aumento de uma atividade de proteína como descrito acima podem geralmente aumentar a atividade ou concentração da proteína correspondente em pelo menos 1%, pelo menos 10%, pelo menos 25%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 100%, pelo menos 150%, pelo menos 200%, pelo menos 300%, pelo menos 400%, ou pelo menos 500% e no máximo 1.000% ou 2.000%, com base na atividade ou concentração da proteína em uma cepa de microrganismo de tipo selvagem ou não modificado, mas a faixa de aumento não está limitada aos mesmos.

[055] Outro aspecto da presente revelação fornece um polinucleotídeo que codifica a variante de proteína acima.

[056] Conforme usado no presente documento, o termo “polinucleotídeo” se refere a uma cadeia de DNA ou RNA com mais de um certo comprimento como um polímero nucleotídico, que é uma cadeia longa de monômeros nucleotídicos ligados por uma ligação covalente e, mais especificamente, se refere a um fragmento polinucleotídico que codifica a variante de proteína.

[057] O polinucleotídeo que codifica a variante de proteína da presente revelação pode incluir qualquer sequência de polinucleotídeo sem limitação, desde que a sequência de polinucleotídeo codifique uma variante de proteína com uma capacidade de exportação de L-triptofano.

[058] Na presente revelação, o gene que codifica a sequência de aminoácidos da proteína com uma capacidade de exportação de L-triptofano pode ser um gene wex, pode ser derivado de Herbaspirillum rhizosphaerae, especificamente, pode ser uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, e mais especificamente, pode ser uma sequência de nucleotídeos incluindo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2, mas o gene não está limitado aos mesmos.

[059] Considerando a degenerescência do códon e os códons preferidos em um bio-organismo em que o polipeptídeo deve ser expresso, várias modificações podem ser realizadas na região de codificação do polinucleotídeo que codifica a variante de proteína da presente revelação dentro do escopo que não alteram a sequência de aminoácidos do polipeptídeo. Especificamente, qualquer sequência polinucleotídica que codifica uma variante de proteína, na qual pelo menos um aminoácido selecionado a partir dos aminoácidos nas posições 79 a 83 em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 é substituído com um aminoácido diferente, pode ser incluído sem limitação. Por exemplo, o polinucleotídeo da presente revelação pode ser a variante da proteína da presente revelação e, especificamente, uma sequência polinucleotídica que codifica uma proteína, que inclui uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 131 a 147, ou um polipeptídeo que tem uma homologia ou identidade com a proteína, mas o polinucleotídeo da presente revelação não está limitado aos mesmos e, mais especificamente, pode ser um que inclui qualquer sequência polinucleotídica entre as sequências polinucleotídicas de SEQ ID NOS: 80, 81, 82, 89, 90, 91, 92, 101, 102, 103, 110, 111, 112, 113, 122, 123 e 124, mas o polinucleotídeo da presente revelação não está limitado aos mesmos. A homologia e identidade são as mesmas descritas acima.

[060] Adicionalmente, qualquer sequência que codifica uma variante de proteína, na qual pelo menos um aminoácido selecionado a partir dos aminoácidos nas posições 79 a 83 em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 é substituído por um aminoácido diferente, por hibridização com qualquer sonda que pode ser preparada a partir de sequências de genes conhecidas (por exemplo, sequências complementares para toda ou parte da sequência de polinucleotídeo acima) sob condições estringentes, podem ser incluídas sem limitação.

[061] O termo "condições rigorosas" se refere a condições que permitem a hibridização específica entre polinucleotídeos. Tais condições são especificamente descritas nas referências (por exemplo, J Sambrook et al., supra). Por exemplo, as condições podem incluir a realização de hibridização entre genes com alta homologia, homologia de 40% ou mais, especificamente 90% ou mais, mais especificamente 95% ou mais, ainda mais especificamente 97% ou mais, e mais especificamente 99% ou superior, embora não execute hibridização entre genes com uma homologia inferior às homologias descritas acima; ou realizar condições de lavagem convencionais para hibridização Southern, isto é, lavar uma vez, especificamente, duas ou três vezes a uma concentração de sal e temperatura correspondente a 60 °C, 1 x SSC e SDS a 0,1%, especificamente 60 °C, 0,1 x SSC, e 0,1% SDS, e mais especificamente 68 °C, 0,1 x SSC e 0,1% SDS. No entanto, as condições de hibridização não estão limitadas às mesmas, mas podem ser apropriadamente ajustadas por aqueles versados na técnica de acordo com o propósito.

[062] A hibridação requer que dois polinucleotídeos incluam sequências complementares, embora incompatibilidades entre as bases sejam possíveis dependendo do rigor da hibridização. O termo "complementar" é usado para descrever a relação entre bases de nucleotídeos mutuamente hibridizáveis. Por exemplo, com relação ao DNA, a adenosina é complementar à timina, e a citosina é complementar à guanina. Consequentemente, a presente revelação também pode incluir fragmentos polinucleotídicos isolados complementares à sequência inteira, bem como sequências polinucleotídicas substancialmente semelhantes.

[063] Especificamente, os polinucleotídeos com homologia podem ser detectados a um valor Tm de 55 °C com uso de condições de hibridização que incluem uma etapa de hibridização e com uso das condições descritas acima. Adicionalmente, o valor de Tm pode ser 60 °C, 63 °C ou 65 °C, mas a temperatura não é limitada aos mesmos e pode ser adequadamente ajustada por aqueles versados na técnica de acordo com o propósito.

[064] O rigor adequado para a hibridação dos polinucleotídeos depende do comprimento e do grau de complementaridade dos polinucleotídeos, e as variáveis são bem conhecidas na técnica (consulte Sambrook et al., supra, 9,50 a 9,51 e 11,7 a 11,8).

[065] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um vetor que inclui um polinucleotídeo que codifica a variante de proteína.

[066] Conforme usado no presente documento, o termo “vetor” se refere a uma construção de DNA que inclui uma sequência de nucleotídeos de um polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo, que está operacionalmente ligada a uma sequência de controle adequada para que a proteína alvo possa ser expressa em um hospedeiro adequado. A sequência de controle inclui um promotor capaz de iniciar a transcrição, qualquer sequência de operador para controlar a transcrição, uma sequência que codifica um sítio de ligação ao ribossomo de mRNA apropriado e uma sequência para controlar a terminação da transcrição e tradução. O vetor, depois de ser transformado em uma célula hospedeira adequada, pode ser replicada ou funcionar independentemente do genoma hospedeiro, ou pode ser integrado ao próprio genoma hospedeiro.

[067] O vetor usado na presente revelação não é particularmente limitado, mas qualquer vetor conhecido na técnica pode ser usado. Exemplos de vetores convencionalmente usados podem incluir um plasmídeo natural ou recombinante, cosmídeo, vírus e bacteriófago. Por exemplo, pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A etc. podem ser usados como um vetor de fago ou vetor de cosmídeo; e aqueles com base em pBR, pUC, pBluescriptII, pGEM, pTZ, pCL, pET etc. podem ser usados como um vetor de plasmídeo. Especificamente, podem ser usados vetores, como pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC etc..

[068] Por exemplo, o polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo no cromossomo pode ser substituído por um polinucleotídeo mutado através de um vetor para inserção cromossômica intracelular. A inserção de um polinucleotídeo no cromossomo pode ser realizada usando qualquer método conhecido na técnica (por exemplo, recombinação homóloga), mas o método não está limitado a isso. O vetor pode ainda incluir um marcador de seleção para confirmar sua inserção bem-sucedida no cromossomo. Um marcador de seleção é usado para a seleção de células transformadas com o vetor, isto é, para confirmar se a molécula de ácido nucleico alvo foi inserida com sucesso, e marcadores que conferem fenótipos selecionáveis (por exemplo, resistência a drogas, auxotrofia, resistência a agentes citotóxicos, expressão de proteínas de superfície etc.). Nas circunstâncias em que os agentes seletivos são tratados, apenas as células capazes de expressar os marcadores de seleção podem sobreviver ou expressar outras características fenotípicas, permitindo assim fácil seleção das células transformadas.

[069] Ainda outro objeto da presente revelação é fornecer um microrganismo que produz de L-triptofano, que expressa a variante de proteína com uma atividade de exportação de L-triptofano.

[070] Conforme usado no presente documento, o termo "microrganismo que produz L-triptofano" se refere a um microrganismo que pode produzir L-triptofano a partir de fontes de carbono em um meio em uma quantidade em excesso em comparação com um microrganismo de tipo selvagem ou não modificado. Adicionalmente, o microrganismo que produz L-triptofano pode ser um microrganismo recombinante. Especificamente, o microrganismo pode ser um microrganismo do gênero Enterobacter, um microrganismo do gênero Escherichia, um microrganismo do gênero Erwinia, um microrganismo do gênero Serratia, um microrganismo do gênero Providencia, um microrganismo do gênero Corynebacterium, ou um microrganismo do gênero Brevibacterium, mas o tipo de microrganismo não é particularmente limitado, desde que o microrganismo possa produzir L-triptofano. Mais especificamente, o microrganismo pode ser um microrganismo do gênero Corynebacterium ou um microrganismo do gênero Escherichia.

[071] Ainda mais especificamente, o microrganismo do gênero Escherichia pode ser Escherichia coli e o microrganismo do gênero Corynebacterium pode ser Corynebacterium glutamicum, mas qualquer microrganismo do gênero Escherichia ou do gênero Corynebacterium, em que uma proteína com atividade de exportação de L- triptofano é introduzido ou a atividade é aumentada e, assim, a quantidade de produção de L-triptofano pode ser aumentada, pode ser incluída sem limitação.

[072] Nos microrganismos descritos acima, a quantidade de produção de L- triptofano pode ser aumentada usando um método para aumentar a biossíntese de L- triptofano, aumentando a expressão de um gene tktA ou bloqueando vias ramificadas na via de biossíntese de L-triptofano para fornecimento contínuo de precursores (por exemplo, eritrose-4-fosfato; E4P) e utilização eficiente de energia, ou usando um método de utilização de uma quantidade menor de ATP etc.

[073] Especificamente, na presente revelação, a cepa parental do microrganismo que produz de L-triptofano, que expressa a proteína ou variante de proteína que tem uma atividade de exportação de L-triptofano ou que é modificada de modo que a proteína ou variante de proteína que tem um L-triptofano - a atividade de exportação pode ser expressa, não é particularmente limitada, desde que a cepa parental seja um microrganismo que produz de L-triptofano. O microrganismo que produz de L- triptofano pode ser um microrganismo no qual a atividade de um gene em uma via competitiva, um regulador em uma via direcional de um operão L-triptofano, um gene para importar L-triptofano ou um gene para importar e em decomposição o L-triptofano é enfraquecido ou inativado, de modo a aumentar a via de biossíntese do L-triptofano; e/ou pode ser um microrganismo no qual a atividade de um operão L-triptofano é superexpressa. Especificamente, a atividade de trpR (isto é, um gene para regular um grupo de enzimas da síntese de triptofano, que inibe a expressão de genes de biossíntese de L-triptofano (trpEDCBA)) ou a atividade de Mtr (isto é, uma proteína de membrana que importa L- extracelular triptofano em uma célula) pode ser enfraquecido ou removido em comparação com sua atividade endógena.

[074] Para atingir o objetivo acima, ainda outro aspecto da presente revelação fornece um método para a produção de triptofano, que inclui a cultura de um microrganismo que produz de L-triptofano que expressa a variante de proteína em um meio.

[075] O L-triptofano, a proteína que possui uma atividade de exportação de L- triptofano e inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, a expressão da proteína e do microrganismo são as mesmas descritas acima.

[076] Conforme usado no presente documento, o termo "cultura" significa que o microrganismo é cultivado sob condições ambientais devidamente controladas. O processo de cultura da presente revelação pode ser realizado em um meio de cultura adequado e em condições de cultura conhecidas na técnica. Tal processo de cultura pode ser facilmente ajustado para uso por aqueles versadosna técnica de acordo com a cepa a ser selecionada. Especificamente, o processo de cultura pode ser realizado em cultura em lote, cultura contínua e cultura em lote alimentada conhecidas na técnica, mas o processo de cultura não está limitado as mesmas.

[077] Conforme usado no presente documento, o termo "meio" se refere a uma mistura de materiais que contém materiais nutrientes necessários para a cultura do microrganismo como ingrediente principal e fornece materiais nutrientes, fatores de crescimento, etc. junto com material que é essencial para a sobrevivência e crescimento. Especificamente, como o meio e outras condições de cultura usadas para cultivar o microrganismo da presente revelação, qualquer meio usado para cultura convencional de microrganismos pode ser usado sem limitação particular. No entanto, o microrganismo da presente revelação pode ser cultivado sob condições aeróbicas em um meio convencional que contém uma fonte de carbono apropriada, fonte de nitrogênio, fonte de fósforo, composto inorgânico, aminoácido e/ou vitamina etc. enquanto se ajusta a temperatura, pH etc.

[078] Na presente revelação, a fonte de carbono pode incluir carboidratos (por exemplo, glicose, frutose, sacarose, maltose etc.; álcoois de açúcar (por exemplo, manitol, sorbitol etc.); ácidos orgânicos (por exemplo, ácido pirúvico, ácido láctico, ácido cítrico etc.; aminoácidos (por exemplo, ácido glutâmico, metionina, lisina etc.) etc. Adicionalmente, a fonte de carbono pode incluir nutrientes orgânicos naturais (por exemplo, hidrolisado de amido, melaço, melaço de blackstrap, farelo de arroz, mandioca, melaço de cana de açúcar, licor de milho etc.). Especificamente, carboidratos como glicose e melaço pré-tratado esterilizado (isto é, melaço convertido em açúcar redutor) podem ser usados e, além disso, várias outras fontes de carbono em uma quantidade apropriada podem ser usadas sem limitação. Essas fontes de carbono podem ser usadas sozinhas ou em uma combinação de dois ou mais tipos, mas as fontes de carbono não estão limitadas as mesmas.

[079] Exemplos da fonte de nitrogênio podem incluir fontes de nitrogênio inorgânico (por exemplo, amônia, sulfato de amônio, cloreto de amônio, acetato de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio, nitrato de amônio etc.); aminoácidos (por exemplo, ácido glutâmico, metionina, glutamina etc.); e fontes de nitrogênio orgânico (por exemplo, peptona, amina N-Z, um extrato de carne, um extrato de levedura, um extrato de malte, licor de milho, um hidrolisado de caseína, peixe ou um produto de decomposição do mesmo, torta de soja desengordurada ou um produto de decomposição do mesmo etc.). Essas fontes de nitrogênio podem ser usadas sozinhas ou em uma combinação de dois ou mais tipos, mas as fontes de nitrogênio não se limitam as mesmas.

[080] Exemplos da fonte de fósforo podem incluir fosfato di-hidrogênio de potássio, hidrogenofosfato dipotássico, sais que contêm sódio correspondentes etc. Exemplos do composto inorgânico podem incluir cloreto de sódio, cloreto de cálcio, cloreto de ferro, sulfato de magnésio, sulfato de ferro, sulfato de manganês, carbonato de cálcio etc. Além disso, podem ser incluídos aminoácidos, vitaminas e/ou precursores apropriados. Esses ingredientes constituintes ou precursores podem ser adicionados a um meio em cultura descontínua ou cultura contínua, mas não estão limitados aos mesmos.

[081] Na presente revelação, o pH de um meio pode ser ajustado durante a cultura de um microrganismo adicionando-se um composto (por exemplo, hidróxido de amônio, hidróxido de potássio, amônia, ácido fosfórico, ácido sulfúrico etc.) ao meio de maneira apropriada. Adicionalmente, durante a cultura, um agente antiespuma (por exemplo, éster de poliglicol de ácido graxo) pode ser adicionado para prevenir a geração de espuma. Adicionalmente, oxigênio ou gás contendo oxigênio podem ser injetados no meio para manter um estado aeróbico do meio; ou nitrogênio, hidrogênio ou gás de dióxido de carbono podem ser injetados no meio sem injeção de gás, para manter um estado anaeróbio ou microaeróbico do meio, mas o gás não está limitado ao mesmo.

[082] A temperatura de meio pode estar em uma faixa de 20 °C a 50 °C e, especificamente, em uma faixa de 30 °C a 37 °C, mas a temperatura do meio não está limitada a mesma. A cultura pode ser continuada até que os materiais úteis sejam obtidos nas quantidades desejadas, e especificamente por 10 horas a 100 horas, mas o período de cultura não é limitado a isso.

[083] O método de produção pode incluir a recuperação de L-triptofano do meio de cultura ou do microrganismo.

[084] Na etapa de recuperação do triptofano, o L-triptofano desejado pode ser recuperado do meio com uso do método da presente revelação para cultivar um microrganismo, por exemplo, com uso de um método adequado conhecido na técnica de acordo com um processo de cultura em lote, cultura contínua processo, ou processo de cultura em lote alimentada. Por exemplo, métodos como centrifugação, filtração, tratamento com um precipitante de cristalização de proteína (método de relargagem), extração, ruptura ultrassônica, ultrafiltração, diálise, vários tipos de cromatografias (por exemplo, cromatografia de peneira molecular (filtração em gel), cromatografia de adsorção, cromatografia de troca iônica, cromatografia de afinidade etc.) e HPLC podem ser usados sozinhos ou em combinação, mas os métodos não estão limitados aos mesmos.

[085] O método de produção pode incluir um processo de purificação. No processo de purificação, o L-triptofano recuperado pode ser purificado com uso de um método de purificação apropriado conhecido na técnica.

[086] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um método para aumentar a capacidade de exportação de L-triptofano de um microrganismo, que inclui a modificação do microrganismo de modo que uma variante de proteína que tem uma atividade de exportação de L-triptofano, em que pelo menos um aminoácido selecionado dos aminoácidos nas posições 79 a 83 em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 é substituído por um aminoácido diferente, pode ser expresso no microrganismo.

[087] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um uso da variante de proteína para aumentar a capacidade de exportação de L-triptofano.

[088] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um uso da variante de proteína para aumentar a capacidade de produção de L-triptofano.

[089] Uma vez que a variante de proteína da presente revelação pode aumentar a capacidade de exportação de L-triptofano de um microrganismo, pode ser usada para aumentar a produção de L-triptofano. A variante da proteína e outros aminoácidos são os mesmos descritos acima.

[DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO]

[090] Doravante, a presente revelação é descrita em detalhes através de modalidades exemplificativas. No entanto, essas modalidades exemplificativas são fornecidas apenas para fins de ilustração e não se destinam a limitar o escopo da presente revelação.

EXEMPLO 1: TRIAGEM E SELEÇÃO DE GENE DE EXPORTAÇÃO

[091] Como resultado de uma triagem PSI-BLAST com base em bancos de dados NCBI e KEGG com a sequência de aminoácidos de YdeD (isto é, uma família EamA derivada de E. coli) como uma sequência de consulta, 30 genes candidatos, que são considerados como proteínas de membrana capazes de exportação de triptofano, e os bio-organismos que possuem esses genes foram selecionados. Entre os mesmos, cinco tipos de bio-organismos foram selecionados em consideração aos níveis de biossegurança, que são aplicáveisà produção de cepas e disponibilidade conforme mostrado na Tabela 1 abaixo. [TABELA 1] MICRORGANISMOS QUE DEVEM POSSUIR PROTEÍNA DE MEMBRANA CAPAZ DE EXPOR !TAR AMINOÁCIDí DS AROMÁTICOS

EXEMPLO 2: PREPARAÇÃO DE MICRORGANISMO DO GÊNERO CORYNEBACTERIUM EM QUE O GENE DERIVADO DE HERBASPIRILLUM RHIZOSPHAERAE É INTRODUZIDO

[092] O gene que codifica a proteína de membrana derivada de Herbaspirillum rhizosphaerae selecionado no Exemplo 1 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. As informações sobre o gene que codifica a proteína de membrana e as sequências de nucleotídeos adjacentes (Registro No. NZ_LFLU01000012.1) foram obtidas do NIH GenBank.

[093] Iniciadores para inserir um gene derivado de Herbaspirillum rhizosphaerae no DNA genômico de Corynebacterium glutamicum foram sintetizados com base nas informações obtidas das sequências de nucleotídeos. Para amplificar o gene derivado de Herbaspirillum rhizosphaerae, a PCR foi realizada com uso do DNA cromossômico de uma cepa de Herbaspirillum rhizosphaerae como modelo junto com os iniciadores de SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4. Utilizou-se a polimerase de DNA SolgTM Pfu-X como polimerase e a PCR foi realizada da seguinte forma: desnaturação a 95 °C durante 2 minutos; 27 ciclos de desnaturação a 95 °C durante 20 segundos, hibridação a 62 °C durante 40 segundos e polimerização a 72 °C durante 1 minuto; e polimerização a 72 °C durante 5 minutos.

[094] Como resultado, um fragmento de gene de 956 pb que inclui o gene 924 pb (SEQ ID NO: 2) foi obtida.

[095] SEQ ID NO: 3 (wex - 1) TAGAGGAGACACAACATGAATAGCAAGAAGGCCAC

[096] SEQ ID NO: 4 (wex - 2) ggctcttcctgtttAGTCTACAAACAGTCCGCCAC

[097] Para obter o promotor gapA derivado de Corynebacterium glutamicum, a PCR foi realizada com uso do DNA genômico de Corynebacterium glutamicum como modelo juntamente com os iniciadores de SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6. Utilizou-se a polimerase de DNA SolgTM Pfu-X (SolGent Co., Ltd.) como polimerase e a PCR foi realizada da seguinte forma: desnaturação a 95 °C durante 2 minutos; 27 ciclos de desnaturação a 95 °C durante 20 segundos, hibridação a 62 °C durante 40 segundos e polimerização a 72 °C durante 30 segundos; e polimerização a 72 °C durante 5 minutos.

[098] SEQ ID NO: 5 (PgapA - 1) cccttccggtttAGTTTGAAGCCAGTGTGAGTTGC

[099] SEQ ID NO: 6 (PgapA(-wex) - 2) CTTCTTGCTATTCATGTTGTGTCTCCTCTAAAGATTGTA

[0100] A região do promotor gapA amplificado, os fragmentos do gene derivados de Herbaspirillum rhizosphaerae e o vetor pDZTn (Patente número KR 10-1126041), que foi clivado com a enzima de restrição ScaI, foram clonados pelo método de montagem Gibson (DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL. Número 6, 5 DE MAIO DE 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix), e assim um plasmídeo recombinante foi obtido. O plasmídeo recombinante foi denominado pDZTn-PgapA- Hrh. A clonagem foi realizada misturando-se o reagente de montagem de Gibson e cada um dos fragmentos do gene em um número calculado de moles seguido de incubação a 50 °C por uma hora.

[0101] O vetor pDZTn-PgapA-Hrh preparado foi transformado em uma cepa de Corynebacterium glutamicum ATCC13869 de tipo selvagem por eletroporação (Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52: 541 a 545) e, em seguida, submetido a um cruzamento secundário para obter uma cepa na qual uma cópia do gene PgapA-Hrh é inserida entre genes de transposon no cromossomo. A manipulação genética correspondente foi confirmada por meio de sequenciamento de genoma e um método de PCR com uso dos iniciadores de SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, cada um dos quais pode, respectivamente, amplificar a região externa da região a montante e a região a jusante para recombinação homóloga em que o gene correspondente é inserido.

[0102] SEQ ID NO: 7 (Confirm_PgapA-wex - 1) CGGATTATGCCAATGATGTG

[0103] SEQ ID NO: 8 (Confirm_PgapA-wex - 2) CACGATCACCAACATTCAGG

[0104] A cepa assim obtida foi denominada Corynebacterium glutamicum ATCC13869::PgapA-Hrh.

EXEMPLO 3: PREPARAÇÃO DE MICRORGANISMO DO GÊNERO CORYNEBACTERIUM EM QUE O GENE DERIVADO DE PSEUDOMONAS STUTZERI É INTRODUZIDO

[0105] O gene que codifica a proteína de membrana derivada de Pseudomonas stutzeri selecionada no Exemplo 1 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. As informações sobre o gene correspondente e as sequências de nucleotídeos adjacentes do mesmo (Número de registro NC_018177.1) foram obtidas no NIH GenBank.

[0106] Iniciadores para inserir um gene derivado de Pseudomonas stutzeri no DNA genômico de Corynebacterium glutamicum foram sintetizados com base nas informações obtidas das sequências de nucleotídeos. Para amplificar o gene derivado de Pseudomonas stutzeri, a PCR foi realizada da mesma maneira que no Exemplo 2 com uso do DNA cromossômico de uma cepa de Pseudomonas stutzeri como um modelo junto com os iniciadores de SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12.

[0107] Como resultado, um fragmento de gene de 977 pb que inclui o gene de exportação de 945 pb (SEQ ID NO: 10) foi obtido.

[0108] SEQ ID NO: 11 (Pst-1) TAGAGGAGACACAACATGAAAAACCAGCGTAAAGC

[0109] SEQ ID NO: 12 (Pst-2) ggctcttcctgtttAGTTTATCCGTTTCGACGCGG

[0110] Para o uso do promotor gapA derivado de Corynebacterium glutamicum, a PCR foi realizada da mesma maneira que no Exemplo 2 com uso do DNA genômico de Corynebacterium glutamicum ATCC13869 como um modelo junto com os iniciadores de SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 13.

[0111] SEQ ID NO: 13 (PgapA(-Pst)-2) ACGCTGGTTTTTCATGTTGTGTCTCCTCTAAAGATTGTA

[0112] A região amplificada do promotor gapA, os fragmentos do gene derivados de Pseudomonas stutzeri e o vetor pDZTn, que foi clivado com a enzima de restrição ScaI, foram clonados pelo método de montagem Gibson e, assim, um plasmídeo recombinante foi obtido. O plasmídeo recombinante foi denominado pDZTn-PgapA- Pst. A clonagem foi realizada misturando-se o reagente de montagem de Gibson e cada um dos fragmentos do gene em um número calculado de moles seguido de incubação a 50 °C por uma hora.

[0113] O vetor pDZTn-PgapA-Pst preparado foi transformado em uma cepa de Corynebacterium glutamicum ATCC13869 de tipo selvagem por eletroporação (Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52: 541 a 545) e, em seguida, submetido a um cruzamento secundário para obter uma cepa na qual uma cópia do gene PgapA-Pst é inserida entre genes de transposon no cromossomo. A manipulação genética correspondente foi confirmada por meio de sequenciamento de genoma e um método de PCR com uso dos iniciadores de SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, cada um dos quais pode, respectivamente, amplificar a região externa da região a montante e a região a jusante para recombinação homóloga em que o gene correspondente é inserido.

[0114] A cepa assim obtida foi denominada Corynebacterium glutamicum ATCC13869::PgapA-Pst.

EXEMPLO 4: PREPARAÇÃO DE MICRORGANISMO DO GÊNERO CORYNEBACTERIUM EM QUE O GENE DERIVADO DE ALCALIGENES FAECALIS É INTRODUZIDO

[0115] O gene que codifica a proteína de membrana derivada de Alcaligenes faecalis selecionada no Exemplo 1 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. As informações sobre o gene correspondente e as sequências de nucleotídeos adjacentes do mesmo (Número de registro NZ_CP013119.1) foram obtidas no NIH GenBank.

[0116] Iniciadores para inserir um gene derivado de Alcaligenes faecalis no DNA genômico de Corynebacterium glutamicum foram sintetizados com base nas informações obtidas das sequências de nucleotídeos. Para amplificar o gene derivado de Alcaligenes faecalis, a PCR foi realizada da mesma maneira que no Exemplo 2, com uso do DNA cromossômico de uma cepa de Alcaligenes faecalis como um modelo juntamente com os iniciadores de SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 17.

[0117] Como resultado, um fragmento de gene de 943 pb que inclui o gene de exportação de 912 pb (SEQ ID NO: 15) foi obtida.

[0118] SEQ ID NO: 16 (Afa-1) TAGAGGAGACACAACATGAAGCAATCTGATAAGGC

[0119] SEQ ID NO: 17 (Afa-2) gctcttcctgtttAGTTCAGGCAGCGCTTTTTAGT

[0120] Para obter o promotor gapA derivado de Corynebacterium glutamicum, a PCR foi realizada da mesma maneira que no Exemplo 2, com uso do DNA genômico de Corynebacterium glutamicum como um modelo juntamente com os iniciadores de SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 18.

[0121] SEQ ID NO: 18 (PgapA(-Afa)-2) ATCAGATTGCTTCATGTTGTGTCTCCTCTAAAGATTGTA

[0122] A região amplificada do promotor gapA, fragmentos de genes derivados de Alcaligenes faecalis e o vetor pDZTn, que foi clivado com a enzima de restrição ScaI, foram clonados pelo método de montagem Gibson e, assim, um plasmídeo recombinante foi obtido. O plasmídeo recombinante foi denominado pDZTn-PgapA- Afa. A clonagem foi realizada misturando-se o reagente de montagem de Gibson e cada um dos fragmentos do gene em um número calculado de moles seguido de incubação a 50 °C por uma hora.

[0123] O vetor pDZTn-PgapA-Afa preparado foi transformado em uma cepa Corynebacterium glutamicum ATCC13869 de tipo selvagem por eletroporação e, em seguida, submetido a um cruzamento secundário para obter uma cepa na qual uma cópia do gene PgapA-Afa é inserida entre os genes do transposon no cromossomo. A manipulação genética correspondente foi confirmada por meio de sequenciamento de genoma e um método de PCR com uso dos iniciadores de SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, cada um dos quais pode, respectivamente, amplificar a região externa da região a montante e a região a jusante para recombinação homóloga em que o gene correspondente é inserido.

[0124] A cepa assim obtida foi denominada Corynebacterium glutamicum ATCC13869::PgapA-Afa.

EXEMPLO 5: PREPARAÇÃO DE MICRORGANISMO DO GÊNERO CORYNEBACTERIUM EM QUE O GENE DERIVADO DE CUPRIAVIDUS NECATOR É INTRODUZIDO

[0125] O gene que codifica a proteína de membrana derivada de Cupriavidus necator selecionado no Exemplo 1 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19. As informações sobre o gene correspondente e as sequências de nucleotídeos adjacentes do mesmo (Número de registro AM260480.1) foram obtidas no NIH GenBank.

[0126] Iniciadores para inserir um gene derivado de Cupriavidus necator no DNA genômico de Corynebacterium glutamicum foram sintetizados com base nas informações obtidas das sequências de nucleotídeos. Para amplificar o gene derivado de Cupriavidus necator, a PCR foi realizada da mesma maneira que no Exemplo 2, com uso do DNA cromossômico de uma cepa de Cupriavidus necator como um modelo juntamente com os iniciadores de SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 22.

[0127] Como resultado, um fragmento de gene de 977 bp que inclui o gene de exportação de 945 bp derivado de Cupriavidus necator (SEQ ID NO: 20) foi obtida.

[0128] SEQ ID NO: 21 (Cne-1) TAGAGGAGACACAACATGCAAAGCAAGAGCAAAGC

[0129] SEQ ID NO: 22 (Cne-2) ggctcttcctgtttAGTTCACGGTTCCTGGACACG

[0130] Para obter o promotor gapA derivado de Corynebacterium glutamicum, a PCR foi realizada da mesma maneira que no Exemplo 2, com uso do DNA genômico de Corynebacterium glutamicum como um modelo juntamente com os iniciadores de SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 23.

[0131] SEQ ID NO: 23 (PgapA(-Cne)-2) GCTCTTGCTTTGCATGTTGTGTCTCCTCTAAAGATTGTA

[0132] A região amplificada do promotor gapA, fragmentos de genes derivados de Cupriavidus necator e o vetor pDZTn, que foi clivado com a enzima de restrição ScaI, foram clonados pelo método de montagem Gibson e, assim, um plasmídeo recombinante foi obtido. O plasmídeo recombinante foi denominado pDZTn-PgapA- Cne. A clonagem foi realizada misturando-se o reagente de montagem de Gibson e cada um dos fragmentos do gene em um número calculado de moles seguido de incubação a 50 °C por uma hora.

[0133] O vetor pDZTn-PgapA-Cne preparado foi transformado em uma cepa Corynebacterium glutamicum ATCC13869 de tipo selvagem por eletroporação e, em seguida, submetido a um cruzamento secundário para obter uma cepa na qual uma cópia do gene PgapA-Cne é inserida entre os genes do transposon no cromossomo. A manipulação genética correspondente foi confirmada por meio de sequenciamento de genoma e um método de PCR com uso dos iniciadores de SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, cada um dos quais pode, respectivamente, amplificar a região externa da região a montante e a região a jusante para recombinação homóloga em que o gene correspondente é inserido.

[0134] A cepa assim obtida foi denominada Corynebacterium glutamicum ATCC13869::PgapA-Cne.

EXEMPLO 6: PREPARAÇÃO DE MICRORGANISMO DO GÊNERO CORYNEBACTERIUM EM QUE GENE DERIVADO DE ESCHERICHIA COLI STR. SUBSTRATO K-12 MG1655 É INTRODUZIDO

[0135] O gene que codifica a proteína de membrana derivada de Escherichia coli str. substrato K-12 MG1655 selecionado no Exemplo 1 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24. As informações sobre o gene correspondente e as sequências de nucleotídeos adjacentes do mesmo (Número de registro NC_000913.3) foram obtidas no NIH GenBank.

[0136] Iniciadores para inserir um gene derivado de Escherichia colino DNA genômico de Corynebacterium glutamicum foram sintetizados com base nas informações obtidas das sequências de nucleotídeos. Para amplificar o gene derivado de Escherichia coli, a PCR foi realizada da mesma maneira que no Exemplo 2, com uso do DNA cromossômico de uma cepa de Escherichia coli como um modelo juntamente com os iniciadores de SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 27.

[0137] Como resultado, um fragmento de gene de 913 pb que inclui o gene de exportação de 882 pb (SEQ ID NO: 25) foi obtida.

[0138] SEQ ID NO: 26 (Eco-1) TAGAGGAGACACAACATGACACGACAAAAAGCAAC

[0139] SEQ ID NO: 27 (Eco-2) gctcttcctgtttAGTTTAACCACGACGTGTCGCC

[0140] Para obter o promotor gapA derivado de Corynebacterium glutamicum, a PCR foi realizada da mesma maneira que no Exemplo 2, com uso do DNA genômico de Corynebacterium glutamicum como um modelo juntamente com os iniciadores de SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 28.

[0141] SEQ ID NO: 28 (PgapA(-Eco)-2) TTTTTGTCGTGTCATGTTGTGTCTCCTCTAAAGATTG

[0142] A região amplificada do promotor gapA, fragmentos de genes derivados de Escherichia coli e o vetor pDZTn, que foi clivado com a enzima de restrição ScaI, foram clonados pelo método de montagem Gibson e, assim, um plasmídeo recombinante foi obtido. O plasmídeo recombinante foi denominado pDZTn-PgapA- Eco. A clonagem foi realizada misturando-se o reagente de montagem de Gibson e cada um dos fragmentos do gene em um número calculado de moles seguido de incubação a 50 °C por uma hora.

[0143] O vetor pDZTn-PgapA-Eco preparado foi transformado em uma cepa Corynebacterium glutamicum ATCC13869 de tipo selvagem por eletroporação e, em seguida, submetido a um cruzamento secundário para obter uma cepa na qual uma cópia do gene PgapA-Eco é inserida entre os genes do transposon no cromossomo. A manipulação genética correspondente foi confirmada por meio de sequenciamento de genoma e um método de PCR com uso dos iniciadores de SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, cada um dos quais pode, respectivamente, amplificar a região externa da região a montante e a região a jusante para recombinação homóloga em que o gene correspondente é inserido.

[0144] A cepa assim obtida foi denominada Corynebacterium glutamicum ATCC13869::PgapA-Eco.

EXEMPLO 7: MEDIÇÃO DE MICS EM CEPAS DE MICRORGANISMOS DO GÊNERO CORYNEBACTERIUM, EM QUE GENES DERIVADOS DE VÁRIOS MICRORGANISMOS SÃO INTRODUZIDOS

[0145] Para confirmar a presença de atividade de exportação de triptofano nos cinco tipos de cepas de Corynebacterium glutamicum preparadas nos Exemplos 2 a 6 (isto é, ATCC13869::PgapA-Hrh, ATCC13869::PgapA-Pst, ATCC13869::PgapA- Afa, ATCC13869::PgapA-Cne e ATCC13869::PgapA-Eco), o experimento de concentração inibitória mínima (MIC) foi realizado com uso de um análogo de triptofano e um análogo de fenilalanina (isto é, outro aminoácido aromático). As 5 cepas diferentes de Corynebacterium glutamicum, cada uma introduzida com um gene que codifica uma proteína de membrana, foram cultivadas em meio líquido mínimo a 30 °C por 24 horas, diluídas para uma concentração de 3 x 103 células e 3 x io4 células, respectivamente, e então cultivadas em sítio em um meio sólido mínimo em que um análogo de triptofano ou um análogo de fenilalanina foi adicionado.

[0146] Para o experimento de concentração inibitória mínima (MIC), p-fluoro-DL- fenilalanina (2,5 mg/ml) ou 5-fluoro-DL-triptofano (0,25 μg/ml) foi adicionado ao meio sólido mínimo, e o crescimento celular foi observada após 60 horas (Tabela 2).

[0147] Todas as introduções dos cinco tipos de genes selecionados permitiram o crescimento celular sob uma condição em que o análogo da fenilalanina foi adicionado a uma concentração de 2,5 mg/ml. Dentre eles, a introdução de genes derivados de Herbaspirillum rhizosphaerae, Alcaligenes faecalis e Escherichia coli apresentou o maior crescimento celular. A introdução do gene derivado de Pseudomonas stutzeri mostrou crescimento celular ligeiramente reduzido em comparação com os três tipos de cepas acima, e a introdução do gene derivado de Cupriavidus necator apresentou o menor crescimento celular. Sob a mesma condição, a cepa ATCC13869 de tipo selvagem não cresceu. Adicionalmente, na condição em que um análogo de triptofano foi adicionado na concentração de 0,25 μg/ml, apenas a introdução do gene derivado de Herbaspirillum rhizosphaerae possibilitou o crescimento celular.

[0148] A partir dos resultados acima, observou-se que todas as introduções dos cinco tipos de genes selecionados apresentaram resistência à fenilalanina e ao análogo da fenilalanina, embora houvesse diferenças de atividade entre as introduções. Em contraste, no que diz respeito ao triptofano e ao análogo do triptofano, apenas a introdução do gene derivado de Herbaspirillum rhizosphaera apresentou resistência específica e excelente aos mesmos. Com base nesses resultados, pode- se interpretar que apenas a proteína de membrana codificada pelo gene derivado de Herbaspirillum rhizosphaera pode atuar como proteína exportadora de triptofano. MEIO MÍNIMO (pH 7,2)

[0149] Glicose 10 g, KH2PO4 1 g, K2HPO4 2 g, MgSO4 • 7H2O 0,4 g, Ureia 2 g, (NH4)2SO4 5 g, NaCl 0,5 g, Nicotinamida 5 μg, Pantotenato de cálcio 0,1 μg, Biotina 0,2 μg, Tiamina HCl 3 μg, Solução de oligoelementos de 1 ml (com base em 1 l de água destilada) SOLUÇÃO DE ELEMENTOS TRAÇO

[0150] Na2B4O7 10H2O 0,09 g, (NH4)6Mo?O27 4H2O 0,04 g, ZnSO4 • 7H2O 0,01 g, CuSO4 5H2O 0,27 g, MnCl2 • 4H2O 0,01 g, FeCla • 6H2O 1 g, CaCl2 0,01 g (com base em 1 l de água destilada) [TABELA 2] CRESCIMENTO DE CEPAS DE CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM, NAS QUAIS GENES DERIVADOS DE VÁRIOS MICRORGANISMOS SÃO INTRODUZIDOS, EM MEIO MÍNIMO QUE CONTÉM UM ANÁLOGO DE FENILALANINA OU ANÁLOGO DE TRIPTOFANO

EXEMPLO 8: PREPARAÇÃO DO VETOR DE EXPRESSÃO PARA ESCHERICHIA COLI EM QUE GENES DERIVADOS DE VÁRIOS MICRORGANISMOS SÃO INTRODUZIDOS

[0151] Para confirmar a resistência dos genes derivados de vários microrganismos selecionados no Exemplo 1 ao triptofano ou um análogo deste em Escherichia coli, cada um dos genes foi clonado em pCL1920 (isto é, um vetor de expressão de E. coli) e expresso pelo promotor yccA de E. coli W3110.

[0152] Para obter um fragmento do gene derivado de Herbaspirillum rhizosphaerae, a PCR foi realizada com uso do DNA cromossômico de uma cepa de Herbaspirillum rhizosphaerae como modelo junto com os iniciadores de SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 30. Utilizou-se a polimerase de DNA SolgTM Pfu-X (SolGent Co., Ltd.) como polimerase e a PCR foi realizada da seguinte forma: desnaturação a 95 °C durante 2 minutos; 27 ciclos de desnaturação a 95 °C durante 20 segundos, hibridação a 62 °C durante 40 segundos e polimerização a 72 °C durante 1 minuto; e polimerização a 72 °C durante 5 minutos.

[0153] SEQ ID NO: 29 (Hrh-3) ATAGAGAGTGACTCAATGAATAGCAAGAAGGCCAC

[0154] SEQ ID NO: 30 (Hrh-4) TCGAGCTCGGTACCCCTACAAACAGTCCGCCAC

[0155] Para obter o promotor yccA derivado de E. coli W3110, a PCR foi realizada com uso do DNA genômico de E. coli W3110 como um modelo junto com os iniciadores de SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 32. Utilizou-se a polimerase de DNA SolgTM Pfu-X (SolGent Co., Ltd.) como polimerase e a PCR foi realizada da seguinte forma: desnaturação a 95 °C durante 2 minutos; 27 ciclos de desnaturação a 95 °C durante 20 segundos, hibridação a 62 °C durante 40 segundos e polimerização a 72 °C durante 10 segundos; e polimerização a 72 °C durante 5 minutos.

[0156] SEQ ID NO: 31 (PyccA - 1) CTCTAGAGGATCCCCTTCCAGATCAAATGCGTAA

[0157] SEQ ID NO: 32 (PyccA(-Hrh)-2) CTTCTTGCTATTCATTGAGTCACTCTCTATGACAG

[0158] A região do promotor yccA amplificado, fragmentos de genes derivados de Herbaspirillum rhizosphaerae e o vetor pCL1920 (pSC101 ori, Spr), que foi clivado com a enzima de restrição SmaI, foram clonados pelo método de montagem Gibson e, assim, um plasmídeo recombinante foi obtido. O plasmídeo recombinante foi denominado pCL1920-PyccA-Hrh. A clonagem foi realizada misturando-se o reagente de montagem de Gibson e cada um dos fragmentos do gene em um número calculado de moles seguido de incubação a 50 °C por uma hora. O pCL1920-PyccA-Hrh obtido foi introduzido em E. coli W3110 de tipo selvagem e, portanto, W3110 / pCL1920- PyccA-Hrh (isto é, um transformante em que o gene é expresso) foi preparado.

[0159] Para obter um fragmento do gene derivado de Pseudomonas stutzeri, a PCR foi realizada com uso do DNA cromossômico da cepa de Pseudomonas stutzeri como molde junto com os iniciadores de SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 34. Adicionalmente, a PCR foi realizada da mesma maneira que na obtenção do fragmento do gene da cepa Herbaspirillum rhizosphaerae descrita acima, exceto que o iniciador da SEQ ID NO: 35, que foi usado para obter o promotor yccA derivado de E. coli W3110 para uso.

[0160] SEQ ID NO: 33 (Pst-3) ATAGAGAGTGACTCAATGAAAAACCAGCGTAAAGC

[0161] SEQ ID NO: 34 (Pst-4) TCGAGCTCGGTACCCTTATCCGTTTCGACGCGG

[0162] SEQ ID NO: 35 (PyccA(-Pst)-2) ACGCTGGTTTTTCATTGAGTCACTCTCTATGACAG

[0163] Como tal, o plasmídeo recombinante foi obtido e denominado como pCL1920-PyccA-Pst. O vetor de expressão pCL1920-PyccA-Pst foi transformado em E. coli W3110 de tipo selvagem e, portanto, W3110 / pCL1920-PyccA-Pst (isto é, um transformante em que o gene é expresso) foi preparado.

[0164] O processo de preparação de um transformante, em que o gene derivado de uma cepa Alcaligenes faecalis é expresso, foi o mesmo descrito acima, exceto que o PCR foi realizado com uso do DNA cromossômico de uma cepa Alcaligenes faecalis como um modelo junto com os iniciadores de SEQ ID NO: 36 e SEQ ID NO: 37, e o iniciador de SEQ ID NO: 38 para obter o promotor yccA foram usados.

[0165] SEQ ID NO: 36 (Afa-3) ATAGAGAGTGACTCAATGAAGCAATCTGATAAGGC

[0166] SEQ ID NO: 37 (Afa-4) TCGAGCTCGGTACCCTCAGGCAGCGCTTTTTAGT

[0167] SEQ ID NO: 38 (PyccA(-Afa)-2) ATCAGATTGCTTCATTGAGTCACTCTCTATGACAG

[0168] Como tal, um plasmídeo recombinante no qual o gene derivado de Alcaligenes faecalis é clonado foi obtido e denominado como pCL1920-PyccA-Afa. O vetor de expressão pCL1920-PyccA-Afa foi transformado em E. coli de tipo selvagem W3110 e, assim, W3110/pCL1920-PyccA-Afa (isto é, um transformante) foi preparado.

[0169] Para obter um fragmento do gene derivado da cepa Cupriavidus necator, a PCR foi realizada com uso do DNA cromossômico da cepa Cupriavidus necator como modelo juntamente com os iniciadores de SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 40. Adicionalmente, a PCR foi realizada da mesma maneira que na obtenção do fragmento do gene da cepa Herbaspirillum rhizosphaerae descrita acima, exceto que o iniciador da SEQ ID NO: 41, que foi usado para obter o promotor yccA derivado de E. coli W3110 para uso.

[0170] SEQ ID NO: 39 (Cne-3) ATAGAGAGTGACTCAATGCAAAGCAAGAGCAAAGC

[0171] SEQ ID NO: 40 (Cne-4) TCGAGCTCGGTACCCTCACGGTTCCTGGACACG

[0172] SEQ ID NO: 41 (PyccA(-Cne)-2) GCTCTTGCTTTGCATTGAGTCACTCTCTATGACAG

[0173] Como tal, um plasmídeo recombinante foi obtido e denominado como pCL1920-PyccA-Cne. O vetor de expressão pCL1920-PyccA-Cne foi transformado em E. coli W3110 de tipo selvagem e, portanto, W3110 / pCL1920-PyccA-Cne (isto é, um transformante em que o gene é expresso) foi preparado.

[0174] Para a obtenção de um fragmento do gene derivado da cepa de Escherichia coli, foi realizada PCR utilizando o DNA cromossômico da linhagem de Escherichia coli str. substrato K-12 Cepa MG1655 como um modelo juntamente com os iniciadores de SEQ ID NO: 42 e SEQ ID NO: 43. Adicionalmente, a PCR foi realizada da mesma maneira que na obtenção do fragmento do gene da cepa Herbaspirillum rhizosphaerae descrita acima, exceto que o iniciador da SEQ ID NO: 44, que foi usado para obter o promotor yccA derivado de E. coli W3110 para uso.

[0175] SEQ ID NO: 42 (Eco-3) ATAGAGAGTGACTCAATGACACGACAAAAAGCAAC

[0176] SEQ ID NO: 43 (Eco-4) TCGAGCTCGGTACCCTTAACCACGACGTGTCGCC

[0177] SEQ ID NO: 44 (PyccA(-Eco)-2) TTTTTGTCGTGTCATTGAGTCACTCTCTATGACAG

[0178] Como tal, um plasmídeo recombinante foi obtido e denominado como pCL1920-PyccA-Eco. O vetor de expressão pCL1920-PyccA-Eco foi introduzido em E. coli W3110 de tipo selvagem e, assim, W3110/pCL1920-PyccA-Cne (isto é, um transformante em que o gene é expresso) foi preparado.

EXEMPLO 9: MEDIÇÃO DE MIC DE E. COLI EM QUE GENES PARA PROTEÍNAS DE MEMBRANA DERIVADOS DE VÁRIOS MICRORGANISMOS SÃO SUPEREXPRESSOS

[0179] Para confirmar a resistência de cepas de E. coli em que os cinco tipos de genes preparados no Exemplo 8 são superexpressos (isto é, W3110/pCL1920-PyccA- Hrh, W3110/pCL1920-PyccA-Pst, W3110/pCL1920-PyccA-Afa, W3110/pCL1920- PyccA-Cne e W3110/pCL1920-PyccA-Eco), o experimento de concentração inibitória mínima (MIC) foi realizado com uso de um análogo de triptofano e um análogo de fenilalanina. As cepas de E. coli em que os cinco tipos de genes são superexpressos foram cultivadas em meio líquido mínimo M9 contendo espectinomicina (50 μg/ml) a 37 °C por 15 horas, diluída em concentrações de 104 células e 105 células, respectivamente, e então sítio de cultura em meio sólido mínimo de glicose M9 contendo espectinomicina (50 μg/ml), em que um análogo de triptofano ou análogo de fenilalanina foi adicionado. Para o experimento de concentração inibitória mínima (MIC), p-fluoro-DL-fenilalanina (2 mg/ml) ou 5-fluoro-DL-triptofano (0,7 μg/ml) foi adicionado ao meio sólido mínimo M9, e o crescimento celular foi observada após 48 horas (Tabela 3).

[0180] Como nas cepas de Corynebacterium glutamicum, as cepas de E. coli apresentaram excelente crescimento sob a condição em que um análogo de fenilalanina foi adicionado quando os genes derivados de E. coli foram superexpressos, e a superexpressão do gene derivado de Alcaligenes faecalis também apresentou crescimento significativo. No entanto, a superexpressão dos genes derivados de Herbaspirillum rhizosphaerae, Pseudomonas stutzeri e Cupriavidus necator não conseguiu mostrar um crescimento comparável como em W3110/pCL1920 (isto é, o grupo de controle). Em contraste, a superexpressão de todos os cinco tipos de genes selecionados permitiu que todas as células crescessem sob a condição em que o análogo de triptofano foi adicionado. entre os mesmos, a superexpressão do gene derivado de Herbaspirillum rhizosphaerae permitiu o maior crescimento, e a superexpressão dos genes exportadores derivados de Alcaligenes faecalis e. coli possibilitou o segundo maior crescimento. A superexpressão dos genes exportadores derivados de Pseudomonas stutzeri e Cupriavidus necator apresentou crescimento desprezível.

[0181] Os resultados do experimento MIC sobre os cinco tipos de genes na cepa de E. coli foram semelhantes aos observados em Corynebacterium glutamicum. O gene derivado de Herbaspirillum rhizosphaerae apresentou resistência específica e excelente ao triptofano e seu análogo nas cepas de Corynebacterium glutamicum e E. coli, e o gene de exportação derivado de E. coli apresentou maior resistência à exportação para fenilalanina e seu análogo do que ao triptofano. A partir desses resultados, foi determinado que o gene derivado de Herbaspirillum rhizosphaerae mostra uma capacidade de exportação específica e excelente de triptofano em ambas as cepas de Corynebacterium glutamicum e E. coli. [TABELA 3] CRESCIMENTO DE CEPAS DE E. COLI, EM QUE CADA GENE É SUPEREXPRESSO EM UM MEIO MÍNIMO CONTENDO UM ANÁLOGO DE

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 1: PREPARAÇÃO DE MICRORGANISMO QUE PRODUZ DE L-TRIPTOFANO DO GÊNERO CORYNEBACTERIUM

[0182] As cepas produtoras de L-triptofano foram desenvolvidas a partir de Corynebacterium glutamicum ATCC13869 de tipo selvagem. Uma vez que o Corynebacterium glutamicum de tipo selvagem não pode produzir L-triptofano ou pode produzir apenas uma quantidade muito pequena, mesmo quando possível, foi feita uma tentativa de usar a cepa em que a via de biossíntese essencial para a produção de L-triptofano é aprimorada como o cepa parental. Especificamente, a expressão do operão de genes biossintéticos de L-triptofano foi aumentada pelo aumento do promotor. Além disso, para liberar a inibição de retroalimentação da proteína TrpE, o 38° aminoácido de TrpE (isto é, serina) foi substituído por arginina (Journal of Bacteriology, novembro de 1987, p. 5.330 a 5.332).

[0183] Para a manipulação genética acima, primeiro, a região a montante do promotor trpE e a região a jusante da 38a mutação de aminoácido de TrpE foram obtidas para recombinação homóloga no cromossomo. Especificamente, o fragmento genético da região a montante do promotor trpE foi obtido pela realização de PCR com uso do DNA cromossômico de Corynebacterium glutamicum como um modelo junto com os iniciadores de SEQ ID NO: 45 e SEQ ID NO: 46, enquanto o fragmento genético da região a jusante da 38a mutação de aminoácido de TrpE foi obtido por meio da realização de PCR com uso do DNA cromossômico de Corynebacterium glutamicum como um modelo junto com os iniciadores de SEQ ID NO: 47 e SEQ ID NO: 48.

[0184] SEQ ID NO: 45 (Pspl7-trpE(S38R)_L-1) TCGAGCTCGGTACCCAAACAACTGCGACGTGTGTC

[0185] SEQ ID NO: 46 (Pspl7-trpE(S38R)_L-2) CATGAAGCGCCGGTACCTTAATCATTTTTGGGTTC

[0186] SEQ ID NO: 47 (Pspl7-trpE(S38R)_R-1) GCCCTGTTGGAACGCGCTGATATCACCACCAAGAA

[0187] SEQ ID NO: 48 (Pspl7-trpE(S38R)_R-2) CTCTAGAGGATCCCCAGATGTCACCGTTGTAAATG

[0188] Utilizou-se a polimerase de DNA SolgTM Pfu-X (SolGent Co., Ltd.) como polimerase e a PCR foi realizada da seguinte forma: desnaturação a 95 °C durante 5 minutos; 30 ciclos de desnaturação a 95 °C durante 30 segundos, hibridação a 60 °C durante 30 segundos e polimerização a 72 °C durante 60 segundos; e polimerização a 72 °C durante 5 minutos.

[0189] A PCR foi realizada com uso do promotor sintetizado SPL7 (SEQ ID NO: 49) como um modelo juntamente com os iniciadores de SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 51.

[0190] SEQ ID NO: 50 (Pspl7 - 1) CCCAAAAATGATTAAGGTACCGGCGCTTCATGTCA

[0191] SEQ ID NO: 51 (Pspl7 - 2) GGGATTCGTGCTCATGATATCTGTTTTGATCTCCTCC

[0192] Utilizou-se a polimerase de DNA SolgTM Pfu-X (SolGent Co., Ltd.) como polimerase e a PCR foi realizada da seguinte forma: desnaturação a 95 °C durante 5 minutos; 30 ciclos de desnaturação a 95 °C durante 30 segundos, hibridação a 60 °C durante 30 segundos e polimerização a 72 °C durante 30 segundos; e polimerização a 72 °C durante 5 minutos.

[0193] Para obter um fragmento a montante de TrpE derivado de Corynebacterium glutamicum, incluindo a sequência de aminoácidos do 1° aminoácido ao 38° aminoácido mutado, a PCR foi realizada com uso do DNA genômico de Corynebacterium glutamicum como um modelo junto com os iniciadores de SEQ ID NO: 52 e SEQ ID NO: 53.

[0194] SEQ ID NO: 52 (trpE (S38R) - 1) ATCAAAACAGATATCATGAGCACGAATCCCCATGT

[0195] SEQ ID NO: 53 (trpE (S38R) - 2) GTGGTGATATCAGCGCGTTCCAACAGGGCTGCATC

[0196] Utilizou-se a polimerase de DNA SolgTM Pfu-X (SolGent Co., Ltd.) como polimerase e a PCR foi realizada da seguinte forma: desnaturação a 95 °C durante 5 minutos; 30 ciclos de desnaturação a 95 °C durante 30 segundos, hibridação a 60 °C durante 30 segundos e polimerização a 72 °C durante 30 segundos; e polimerização a 72 °C durante 5 minutos.

[0197] Um plasmídeo recombinante foi obtido por clonagem da região a montante amplificada do promotor trpE e a região a jusante do 38° aminoácido mutado de TrpE, o promotor SPL7 e o fragmento a montante de TrpE e o vetor pDZ que foi clivado com a enzima de restrição SmaI com uso do método de montagem Gibson. O plasmídeo recombinante foi denominado pDZ-PSPL7-trpE (S38R). A clonagem foi realizada misturando-se o reagente de montagem de Gibson e cada um dos fragmentos do gene em um número calculado de moles seguido de incubação a 50 °C por uma hora.

[0198] O vetor pDZ-PSPL7-trpE (S38R) preparado foi transformado na cepa Corynebacterium glutamicum ATCC13869 por eletroporação e, em seguida, submetido a um cruzamento secundário. Em seguida, foi obtida uma cepa, na qual um promotor do trpE é substituído pelo promotor SPL7 (isto é, um promotor mais forte) e o 38° aminoácido de TrpE (isto é, serina) é substituído por arginina no cromossomo. A manipulação genética correspondente foi confirmada por meio de sequenciamento de genoma e um método de PCR com uso dos iniciadores de SEQ ID NO: 54 e SEQ ID NO: 55, que pode amplificar a região a montante e a jusante para recombinação homóloga em que o gene é inserido, e a cepa resultante foi nomeada como CA04- 8325.

[0199] SEQ ID NO: 54 (Confirm_Pspl7-trpE(S38R) - 1) GAAGAAGAGGCTGCAGATG

[0200] SEQ ID NO: 55 (Confirm_Pspl7-trpE(S38R) - 2) GATCAGCGCCATCATGTT

[0201] A produção de triptofano ocorre a partir da via metabólica dos aminoácidos aromáticos, e essa via metabólica começa a partir da reação de condensação entre o fosfoenolpiruvato e a eritrose 4-fosfato. Consequentemente, um suprimento uniforme desses dois precursores é essencial para a produção de triptofano, e a superexpressão do gene tkt foi realizada para o suprimento suave de eritrose 4- fosfato, que é conhecido por ser relativamente deficiente.

[0202] Para a manipulação genética acima, a PCR foi realizada com uso do DNA cromossômico de Corynebacterium glutamicum como um modelo junto com os iniciadores de SEQ ID NO: 56 e SEQ ID NO: 57 para obter a região a montante para a inserção adicional do gene tkt, e junto com os iniciadores de SEQ ID NO: 58 e SEQ ID NO: 59 para obter a região a jusante para a inserção adicional do gene tkt.

[0203] SEQ ID NO: 56 (Pn-tkt_L - 1 ) TCGAGCTCGGTACCCAAACTTTGAGTGGGTGCGTG

[0204] SEQ ID NO: 57 (Pn-tkt_L - 2 ) TCGAGCTACGAGGGCGGTTCCCAGCCCTTCATTAG

[0205] SEQ ID NO: 58 (Pn-tkt_R - 1) ATTAACGGTTAATTGATTCTGGACGTCATGACTAC

[0206] SEQ ID NO: 59 (Pn-tkt_R - 2) CTCTAGAGGATCCCCGCCTCGATGATGCAGTCGTC

[0207] Utilizou-se a polimerase de DNA SolgTM Pfu-X como polimerase e a PCR foi realizada da seguinte forma: desnaturação a 95 °C durante 2 minutos; 27 ciclos de desnaturação a 95 °C durante 20 segundos, hibridação a 62 °C durante 40 segundos e polimerização a 72 °C durante 30 segundos; e polimerização a 72 °C durante 5 minutos.

[0208] Para obter o gene tkt e seu promotor, a PCR foi realizada com uso do DNA cromossômico de Corynebacterium glutamicum ATCC13869 de tipo selvagem como um modelo junto com os iniciadores de SEQ ID NO: 60 e SEQ ID NO: 61, e assim o gene tkt incluindo seu promotor foi obtido.

[0209] SEQ ID NO: 60 (Pn-tkt - 1) GAAGGGCTGGGAACCGCCCTCGTAGCTCGAGAGTT

[0210] SEQ ID NO: 61 (Pn-tkt - 2) CATGACGTCCAGAATCAATTAACCGTTAATGGAGTCC

[0211] Utilizou-se a polimerase de DNA SolgTM Pfu-X como polimerase e a PCR foi realizada da seguinte forma: desnaturação a 95 °C durante 2 minutos; 27 ciclos de desnaturação a 95 °C durante 20 segundos, hibridação a 62 °C durante 40 segundos e polimerização a 72 °C durante 1 minuto e 20 segundos; e polimerização a 72 °C durante 5 minutos.

[0212] Um plasmídeo recombinante foi obtido por clonagem da região a montante amplificada para a inserção adicional do gene tkt e região a jusante para a inserção adicional do gene tkt, o gene tkt incluindo o promotor tkt e o vetor pDZ para a transformação cromossômica, que é clivado por Enzima de restrição SmaI com uso do método de montagem Gibson, e o plasmídeo recombinante resultante foi denominado como pDZ-Pn-tkt. A clonagem foi realizada misturando-se o reagente de montagem de Gibson e cada um dos fragmentos do gene em um número calculado de moles seguido de incubação a 50 °C por uma hora.

[0213] O vetor pDZ-Pn-tkt preparado foi transformado na cepa CA04-8325 por eletroporação e depois submetido a um cruzamento secundário para obter uma cepa na qual o gene tkt incluindo o promotor tkt é inserido no cromossomo. A manipulação genética correspondente foi confirmada por meio de sequenciamento de genoma e um método de PCR com uso dos iniciadores de SEQ ID NO: 62 e SEQ ID NO: 63, dos quais pode, respectivamente, amplificar a região externa da região a montante e a região a jusante para recombinação homóloga em que o gene correspondente é inserido. A cepa resultante foi denominada CA04-8352. A cepa CA04-8352 foi depositada internacionalmente no Centro de Cultura Coreana de Microrganismos (KCCM), um depositário internacional, em 2 de fevereiro de 2018, de acordo com as disposições do Tratado de Budapeste e recebeu o número de adesão KCCM12218.

[0214] SEQ ID NO: 62 (Confirm_Pn-tkt - 1) ACCCAGAACCCCAAATTTTC

[0215] SEQ ID NO: 63 (Confirm_Pn-tkt - 2) TTGAGTTCGACAACTTTGG EXEMPLO 10: PRODUÇÃO DE TRIPTOFANO POR MICRORGANISMO DO GÊNERO CORYNEBACTERIUM EM QUE OS GENES DERIVADOS DE HERBASPIRILLUM RHIZOSPHAERAE E. COLI SÃO INTRODUZIDOS

[0216] O gene derivado de Herbaspirillum rhizosphaerae, que apresentou excelente atividade na concentração inibitória mínima do análogo de triptofano no Exemplo 7, foi introduzido em CA04-8352, que é uma cepa produtora de triptofano preparada no Exemplo de Referência 1. Para este propósito, o vetor pDZTn-PgapA- Hrh para a introdução do gene derivado de Herbaspirillum rhizosphaerae preparado no Exemplo 2 foi transformado em CA04-8352 (isto é, uma cepa produtora de triptofano) por eletroporação e submetido ao processo como no Exemplo 2, e assim foi obtida uma cepa na qual uma cópia do gene derivado de Herbaspirillum rhizosphaerae é inserida entre os genes do transposon. A cepa resultante foi denominada CA04-8405.

[0217] Adicionalmente, o gene derivado de E. coli foi introduzido no CA04-8352 (isto é, uma cepa produtora de triptofano) como o grupo de controle. O vetor pDZTn- PgapA-Eco para a introdução do gene derivado de E. coli preparado no Exemplo 6 foi transformado em CA04-8352 (isto é, uma cepa produtora de triptofano) por eletroporação e submetido ao processo como no Exemplo 6, e assim, foi obtida uma cepa na qual uma cópia do gene derivado de E. coli é inserida entre os genes do transposon. A cepa resultante foi denominada CA04-8406.

[0218] As cepas CA04-8405 e CA04-8406 obtidas pelos processos descritos acima foram cultivadas pelo seguinte método de modo a confirmar a quantidade de produção de triptofano em relação à cepa CA04-8352, que foi preparada no Exemplo de Referência 1 como o grupo de controle. Cada cepa foi inoculada em um frasco defletor de canto de 250 ml que contém meio de semente (25 ml) e cultivada com agitação a 30 °C a 200 rpm por 20 horas. Em seguida, cada solução de cultura de sementes (1 ml) foi inoculada em um frasco defletor de canto de 250 ml que contém meio de produção (25 ml) e cultivada com agitação a 30 °C a 200 rpm por 24 horas. Após a conclusão da cultura, a quantidade de produção de L-triptofano foi medida por HPLC. MEIO DE SEMEADURA (pH 7,0)

[0219] Glicose 20 g, peptona 10 g, extrato de levedura 5 g, ureia 1,5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 • 7H2O 0,5 g, biotina 100 μg, tiamina HCl 1.000 μg, pantotenato de cálcio 2.000 μg, nicotinamida 2.000 μg (com base em 1 l de água destilada) MEIO DE PRODUÇÃO (pH 7,0)

[0220] Glicose 30 g, (NH4)2SO4 15 g, MgSO4 • 7H2O 1,2 g, KH2PO4 1 g, Extrato de levedura 5 g, Biotina 900 μg, Tiamina HCl 4.500 μg, Pantotenato de cálcio 4.500 μg, CaCO3 30 g (com base em 1 l de destilado água). [TABELA 4] CONFIRMAÇÃO DA QUANTIDADE DE PRODUÇÃO DE L- TRIPTOFANO POR CA04-8352 (UMA CEPA DE CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM QUE PRODUZ L-TRIPTOFANO), CA04-8405 (UMA CEPA EM QUE UM GENE DERIVADO DE HERBASPIRILLUM RHIZOSPHAERAE É INSERIDO), E CA04-8406 (A CEPA EM Q UE UM GENE DERIVADO DE E. CO L7 É INSERIDO)

[0221] Os resultados da produção de L-triptofano pelas cepas CA04-8352, CA04- 8405 e CA04-8406 no meio são mostrados na Tabela 4 acima. A cepa CA04-8405 na qual o gene derivado de Herbaspirillum rhizosphaerae é introduzido produziu L- triptofano em uma concentração final de 1,52 g/l no cultivo em frasco, e esta é uma melhoria de cerca de 5 vezes em comparação com a cepa CA04-8352 (isto é, o grupo de controle). Isso indica que o gene derivado de Herbaspirillum rhizosphaerae pode melhorar significativamente a produção de L-triptofano em uma cepa de Corynebacterium glutamicum. Em contraste, a cepa CA04-8406 na qual um gene derivado de E. coli foi introduzido produziu L-triptofano a uma concentração de 0,23 g/l, que é quase o mesmo que a quantidade de produção de L-triptofano pelo CA04- 8352 cepa (isto é, a cepa parental da cepa CA04-8406). Conforme confirmado na experiência de concentração inibitória mínima (MIC) do análogo de triptofano e do análogo de fenilalanina nos Exemplos 7 e 9, o gene derivado de E. coli é considerado um gene de exportação que mostra maior especificidade para fenilalanina do que para triptofano. A cepa CA04-8405 foi depositada internacionalmente no Centro de Cultura Coreana de Microrganismos (KCCM), um depositário internacional, em segunda-feira, 21 de agosto de 2017, de acordo com as disposições do Tratado de Budapeste e recebeu o número de adesão KCCM12099P (CA04-8405).

EXEMPLO 11: ANÁLISE DE METABÓLITOS DE TRIPTOFANO INTRACELULAR EM CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM, EM QUE UM GENE DERIVADO DE HERBASPIRILLUM RHIZOSPHAERAE É INTRODUZIDO

[0222] Para confirmar explicitamente se a concentração de triptofano intracelular diminui conforme a capacidade de exportação de triptofano da cepa CA04-8405 (isto é, uma cepa produtora de triptofano) melhora, a concentração de triptofano intracelular foi medida na cepa CA04-8405 e na cepa CA04-8352 (isto é, a cepa parental da cepa CA04-8405) por um método de extração usando um solvente orgânico.

[0223] O método para analisar os metabólitos intracelulares foi realizado de acordo com o método descrito na referência (Nakamura J et al., Appl. Environ. Microbiol. 73(14): 4.491 a 4.498, 2007).

[0224] Primeiro, no que diz respeito às cepas mutadas de Corynebacterium glutamicum de CA04-8352 e CA04-8405, cada cepa foi inoculada em um frasco defletor de canto de 250 ml que contém meio de semente (25 ml) e cultivada com agitação a 30 °C a 200 rpm durante 20 horas. Em seguida, cada solução de cultura de sementes (1 ml) foi inoculada em um frasco defletor de canto de 250 ml que contém meio de produção (25 ml) e cultivada com agitação a 30 °C a 200 rpm. A concentração intracelular de triptofano foi analisada três vezes de acordo com o consumo de glicose. As células cultivadas em cada etapa foram separadas da solução de cultura por filtração rápida a vácuo (Durapore HV, 0,45 m; Millipore, Billerica, MA). O filtro ao qual as células foram adsorvidas foi lavado duas vezes com água destilada (10 ml) e embebido em metanol contendo 5 μM de ácido morfolina etanossulfônico e 5 μM de metionina sulfona por 10 minutos. Clorofórmio (1,6 ml) e água destilada (0,64 μl) foram adicionados ao extrato celular (1,6 ml) obtido acima e bem misturados, e apenas a fase aquosa foi aplicada à coluna de rotação para remover impurezas de proteína. O extrato filtrado foi analisado usando a espectrometria de massa de eletroforese capilar e os resultados são mostrados na Figura 1.

[0225] Conforme mostrado na Figura 1, foi confirmado que a cepa CA04-8405 apresentou uma diminuição da concentração de triptofano intracelular para um nível de 33% a 41%, em comparação com sua cepa parental, CA04-8352. Esses resultados indicam que como o triptofano produzido dentro das células de uma cepa de Corynebacterium glutamicum foi suavemente exportado extracelularmente devido à expressão do gene derivado de Herbaspirillum rhizosphaerae, a concentração de triptofano intracelular da cepa CA04-8405 diminuiu. A partir desses resultados, foi confirmado que o gene derivado de Herbaspirillum rhizosphaerae é um gene que codifica uma proteína de membrana com uma capacidade de exportação específica para triptofano.

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 2: PREPARAÇÃO DE MICRORGANISMO QUE PRODUZ L-TRIPTOFANO DO GÊNERO ESCHERICHIA

[0226] O microrganismo que produz de L-triptofano do gênero Escherichia foi desenvolvido a partir da E. coli W3110 de tipo selvagem. Para confirmar se a quantidade de produção de triptofano aumenta significativamente quando a proteína com atividade de exportação de L-triptofano é modificada para ser expressa, a cepa preparada para produzir L-triptofano foi usada como cepa parental. Especificamente, a expressão dos genes da biossíntese de L-triptofano (trpEDCBA), que estão envolvidos na produção de L-triptofano a partir do corismato, é inibida por TrpR. Consequentemente, o gene trpR que codifica TrpR foi removido. Adicionalmente, para liberar a inibição de retroalimentação do polipeptídeo TrpE de acordo com o melhoramento da produção de L-triptofano, o 21° aminoácido do terminal N de TrpE (isto é, prolina) foi substituído por serina (J. Biochem. Mol. Biol. 32, 20 a 24 (1999)).

[0227] A proteína de membrana Mtr tem o papel de introduzir L-triptofano extracelular em uma célula, e a proteína TnaA tem o papel de decompor o L-triptofano intracelular e as moléculas de água em indol, piruvato e amônia (NH3). Consequentemente, os genes mtr e tnaA que inibem a produção de L-triptofano e a decompõem foram removidos.

[0228] Para a remoção desses genes, o método de recombinação À-red (Inativação em uma etapa de genes cromossômicos em Escherichia coli K-12 usando produtos de PCR, Datsenko KA, Wanner BL., Proc Natl Acad Sci EUA. 6 de junho de 2000; 97(12): 6.640 a 6.645) foi usado. Para a remoção do gene mtr, a PCR foi realizada com uso do vetor pKD4 como um modelo junto com os iniciadores de SEQ ID NO: 64 e SEQ ID NO: 65. Como resultado, foi obtido um fragmento do gene de 1.580 pb, no qual um cassete FRT-canamicina-FRT está ligado a um par de nucleotídeos homólogos de 50 pb flanqueando o gene mtr, em que ocorre recombinação homóloga cromossômica entre os mesmos. O marcador antibiótico canamicina do vetor pKD4 foi utilizado para a confirmação da remoção de um gene alvo e inserção de um gene antibiótico, e a região FRT tem a função de remover o marcador antibiótico após a remoção do gene alvo.

[0229] Utilizou-se a polimerase de DNA SolgTM Pfu-X como polimerase e a PCR foi realizada da seguinte forma: desnaturação a 95 °C durante 2 minutos; 27 ciclos de desnaturação a 95 °C durante 20 segundos, hibridação a 62 °C durante 40 segundos e polimerização a 72 °C durante 1 minuto; e polimerização a 72 °C durante 5 minutos.

[0230] SEQ ID NO: 64 (cassete Δmtr - 1) TGCAATGCATAACAACGCAGTCGCACTATTTTTCACTGGAGAGAAGC CCTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC

[0231] SEQ ID NO: 65 (cassete Δmtr - 2) TGCAATGCATAACAACGCAGTCGCACTATTTTTCACTGGAGAGAAGC CCTGTCCATATGAATATCCTCCT

[0232] O vetor pKD46 que expressa a recombinase vermelha lambda (genes gam, bet, e exo) foi transformado na cepa W3110 de E. coli por eletroporação e a cepa foi espalhada em meio sólido LB contendo canamicina (50 mg/l). A cepa de E. coli W3110 na qual a transformação do vetor pKD46 foi confirmada induziu a expressão de uma enzima recombinante pela adição de L-arabinose 10 mM quando a OD600 atingiu cerca de 0,1. Quando a OD600 atingiu cerca de 0,6, a cepa foi preparada em uma célula competente, e o fragmento do gene linear obtido no processo acima, no qual um cassete FRT-canamicina-FRT é ligado a um par de nucleotídeos homólogos de 50 bp flanqueando o gene mtr, foi transformado por eletroporação. Para as colônias cultivadas em meio sólido LB contendo canamicina (25 mg/l), a PCR de colônia foi realizada com uso dos iniciadores de SEQ ID NO: 66 e SEQ ID NO: 67, e as colônias em que o fragmento do gene de 782 pb é preparado foram selecionadas.

[0233] SEQ ID NO: 66 (Confirm_Cassette - 1) GGGCAGGATCTCCTGTCATC

[0234] SEQ ID NO: 67 (Confirm_Δmtr - 2) AAATGTCGGATAAGGCACCG

[0235] A cepa em que o gene mtr foi removido devido à ocorrência de recombinação homóloga foi preparada em uma célula competente de modo a remover o marcador antibiótico canamicina e então transformada com o vetor pCP20 por eletroporação. O vetor pCP20 expressa a proteína FLP e, assim, reconhece os locais FRT que flanqueiam o antibiótico canamicina e se liga ao mesmo no cromossomo, removendo assim o marcador de antibiótico entre os locais FRT. A cepa transformada com vetor pCP20 cultivada em meio sólido LB que contém ampicilina (100 mg/l) e cloranfenicol (25 mg/l) foi cultivada em meio líquido LB a 30 °C por uma hora, posteriormente cultivada a 42 °C por 15 horas e espalhada em meio LB sólido. As colônias crescidas foram cultivadas em meio sólido LB que contém ampicilina (100 mg/l) e cloranfenicol (25 mg/l); Meio LB sólido que contém canamicina (12,5 mg/l); e meio sólido LB sem antibiótico. Apenas as colônias que cresceram em meio sólido LB sem antibiótico foram selecionadas. A remoção do gene mtr foi finalmente confirmada por sequenciamento degenoma e a cepa foi denominada CA04-9300.

[0236] A manipulação genética foi realizada pelo método descrito acima de modo a remover o gene tnaA. A PCR foi realizada com uso do vetor pKD4 como um modelo juntamente com os iniciadores de SEQ ID NO: 68 e SEQ ID NO: 69 e, portanto, um fragmento do gene de 1.580 pb, no qual um cassete FRT-canamicina-FRT está ligado a um par de nucleotídeos homólogos de 50 pb flanqueando o gene tnaA, em que a recombinação homóloga cromossômica ocorre entre os mesmos. Utilizou-se a polimerase de DNA SolgTM Pfu-X como polimerase e a PCR foi realizada da seguinte forma: desnaturação a 95 °C durante 2 minutos; 27 ciclos de desnaturação a 95 °C durante 20 segundos, hibridação a 62 °C durante 40 segundos e polimerização a 72 °C durante 1 minuto; e polimerização a 72 °C durante 5 minutos.

[0237] SEQ ID NO: 68 (cassete ΔtnaA - 1) TGTAATATTCACAGGGATCACTGTAATTAAAATAAATGAAGGATTATGT AGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC

[0238] SEQ ID NO: 69 (cassete ΔtnaA - 2) TGTAGGGTAAGAGAGTGGCTAACATCCTTATAGCCACTCTGTAGTATT AAGTCCATATGAATATCCTCCT

[0239] A transformação do vetor pKD46 foi confirmada. O CA04-9300, no qual as recombinases foram expressas pela adição de L-arabinose 10 mM foi transformado por eletroporação com o fragmento do gene linear obtido no processo acima, no qual um cassete FRT-canamicina-FRT está ligado a um par de Nucleotídeos homólogos de 50 bp flanqueando o gene tnaA. Para as colônias cultivadas em meio sólido LB contendo canamicina (25 mg/l), a PCR de colônia foi realizada com uso dos iniciadores de SEQ ID NO: 66 e SEQ ID NO: 70, e as colônias em que o fragmento do gene de 787 pb é preparado foram selecionadas.

[0240] SEQ ID NO: 70 (Confirm_ΔtnaA - 2) ACATCCTTATAGCCACTCTG

[0241] A cepa na qual o gene tnaA foi removido devido à recombinação homóloga foi preparada em uma célula competente de modo a remover o marcador do antibiótico canamicina e, em seguida, transformada com o vetor pCP20, e uma cepa em que o marcador do antibiótico canamicina foi removido pela expressão do A proteína FLP foi preparada. A remoção do gene tnaA foi finalmente confirmada por sequenciamento degenoma e a cepa foi denominada CA04-9301.

[0242] Para remover o gene trpR, a PCR foi realizada com uso do vetor pKD4 como um modelo junto com os iniciadores de SEQ ID NO: 71 e SEQ ID NO: 72 e, assim, o fragmento do gene (1.580 pb), no qual um cassete FRT-canamicina-FRT está ligado a um par de nucleotídeos homólogos de 50 pb flanqueando o gene trpR, em que a recombinação homóloga cromossômica ocorre entre os mesmos, foi obtido. Utilizou-se a polimerase de DNA SolgTM Pfu-X como polimerase e a PCR foi realizada da seguinte forma: desnaturação a 95 °C durante 2 minutos; 27 ciclos de desnaturação a 95 °C durante 20 segundos, hibridação a 62 °C durante 40 segundos e polimerização a 72 °C durante 1 minuto; e polimerização a 72 °C durante 5 minutos.

[0243] SEQ ID NO: 71 (cassete ΔtrpR - 1) TACAACCGGGGGAGGCATTTTGCTTCCCCCGCTAACAATGGCGACAT ATTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC

[0244] SEQ ID NO: 72 (cassete ΔtrpR - 2) GCATTCGGTGCACGATGCCTGATGCGCCACGTCTTATCAGGCCTACA AAAGTCCATATGAATATCCTCCT

[0245] A transformação do vetor pKD46 foi confirmada. O CA04-9301, no qual as recombinases foram expressas pela adição de L-arabinose 10 mM foi transformado por eletroporação com o fragmento do gene linear obtido no processo acima, no qual um cassete FRT-canamicina-FRT está ligado a um par de Nucleotídeos homólogos de 50 bp flanqueando o gene trpR. Para as colônias cultivadas em meio sólido LB contendo canamicina (25 mg/l), a PCR de colônia foi realizada com uso dos iniciadores de SEQ ID NO: 66 e SEQ ID NO: 73, e as colônias em que o fragmento do gene de 838 pb é preparado foram selecionadas.

[0246] SEQ ID NO: 73 (Confirm_ΔtrpR - 2) AGGACGGATAAGGCGTTCAC

[0247] A cepa na qual o gene trpR foi removido devido à recombinação homóloga foi preparada em uma célula competente de modo a remover o marcador do antibiótico canamicina e, em seguida, transformada com o vetor pCP20, e uma cepa em que o marcador do antibiótico canamicina foi removido pela expressão do A proteína FLP foi preparada. A remoção do gene trpR foi finalmente confirmada por sequenciamento degenoma e a cepa foi denominada CA04-9307.

[0248] Para fornecer à cepa CA04-9307 um traço trpE resistente a retroalimentação, a PCR foi realizada com uso do gDNA de E. coli W3110 como um modelo junto com os iniciadores de SEQ ID NO: 74 e SEQ ID NO: 75 (ambos os quais incluem um sítio de restrição EcoRI) e, portanto, foi obtido um fragmento do gene trpE de 1.575 pb que contém um sítio de restrição EcoRI. Utilizou-se a polimerase de DNA SolgTM Pfu-X como polimerase e a PCR foi realizada da seguinte forma: desnaturação a 95 °C durante 2 minutos; 27 ciclos de desnaturação a 95 °C durante 20 segundos, hibridação a 62 °C durante 1 minuto e polimerização a 72 °C durante 1 minuto; e polimerização a 72 °C durante 5 minutos.

[0249] SEQ ID NO: 74 (trpE - 1) GAATTCATGCAAACACAAAAACCGAC

[0250] SEQ ID NO: 75 (trpE - 2) GAATTCTCAGAAAGTCTCCTGTGCA

[0251] A clonagem foi realizada após tratamento do fragmento do gene trpE obtido pelo método acima e o plasmídeo pSG76-C (Journal of Bacteriology, July 1997, p. 4.426 a 4.428) com a enzima de restrição EcoRI, respectivamente. O plasmídeo clonado foi transformado em E. coli DH5α por eletroporação, e as cepas transformadas de E. coli DH5α foram selecionadas em placas LB que contêm cloranfenicol (25 μg/ml) e, assim, o plasmídeo pSG76-C-trpE foi obtido.

[0252] Um pSG76-C-trpE (P21S) foi preparado com uso do plasmídeo pSG76-C- trpE obtido acima juntamente com os iniciadores de SEQ ID NO: 76 e SEQ ID NO: 77 por mutagênese dirigida ao sítio (Stratagene, EUA).

[0253] SEQ ID NO: 76 (trpE(P21S) - 1) CGCTTATCGCGACAATTCCACCGCGCTTTTTCACCAG

[0254] SEQ ID NO: 77 (trpE(P21S) - 2) CTGGTGAAAAAGCGCGGTGGAATTGTCGCGATAAGCG

[0255] O plasmídeo pSG76-C-trpE (P21S) foi transformado na cepa CA04-9307, cultivado em meio LB-Cm (extrato de levedura 10 g/l, NaCl 5 g/l, triptona 10 g/l, e cloranfenicol 25 μg/l), e as colônias com resistência ao cloranfenicol foram selecionadas. Os transformantes selecionados são cepas nas quais o plasmídeo pSG76-C-trpE (P21S) é inserido na região trpE do genoma pela primeira inserção. A cepa na qual o gene trpE(P21S) obtido é inserido foi transformada com o plasmídeo pAScep (Journal of Bacteriology, Julho de 1997, p. 4.426 a 4.428), que expressa a enzima de restrição I-SceI que cliva as regiões I-SceI presentes em o plasmídeo pSG76-C, e a cepa que cresceu no LB-Ap (extrato de levedura 10 g/l, NaCl 5 g/l, triptona 10 g/l e ampicilina 100 μg/l) foi selecionada. O gene trpE na cepa selecionada foi amplificado com uso dos iniciadores de SEQ ID NO: 74 e SEQ ID NO: 75, e foi confirmado que o gene trpE amplificado foi substituído pelo gene trpE(P21S) por sequenciamento. A cepa assim preparada foi nomeada como CA04-4303.

EXEMPLO 12: PRODUÇÃO DE L-TRIPTOFANO POR MICRORGANISMO DO GÊNERO ESCHERICHIA NO QUAL UM GENE DERIVADO DE HERBASPIRILLUM RHIZOSPHAERAE É INTRODUZIDO

[0256] O pCL1920-PyccA-Hrh preparado no Exemplo 8 foi introduzido na cepa CA04-4303 preparada no Exemplo de Referência 2, e assim foi preparada uma cepa CA04-4306 na qual um gene derivado de Herbaspirillum rhizosphaerae é superexpresso. Adicionalmente, o vetor pCL1920, como grupo de controle, foi transformado na cepa CA04-4303. Para confirmar a quantidade de produção de L- triptofano nas duas cepas (isto é, CA04-4303/pCL1920 e CA04-4306), essas cepas foram cultivadas em meio líquido LB que contém espectinomicina (50 mg/l) por 12 horas. Em seguida, essas cepas foram inoculadas em um frasco defletor de canto de 250 ml que contém 25 ml de meio de produção de modo que o valor OD600 inicial se tornasse 0,01 e, em seguida, cultivadas com agitação a 37 °C a 200 rpm por 48 horas. Após a conclusão da cultura, a quantidade de produção de L-triptofano foi medida por HPLC.

[0257] Os resultados com respeito à produção de L-triptofano nas cepas CA04- 4303/pCL1920 e CA04-4306 no meio são mostrados na Tabela 5 abaixo. A cepa CA04-4306, na qual um gene derivado de Herbaspirillum rhizosphaerae foi introduzido e superexpresso, apresentou concentração final de L-triptofano de 2,1 g/l no cultivo em frasco, cerca de 50% maior do que no grupo controle. Isso indica que o gene derivado de Herbaspirillum rhizosphaerae também exporta L-triptofano em E. coli e, portanto, melhora significativamente sua produção de L-triptofano. MEIO DE PRODUÇÃO (pH 7,0)

[0258] Glicose 70 g, (NH4)2SO4 20 g, MgSO4 • 7H2O 1 g, KH2PO4 2 g Extrato de levedura 2,5 g, Na-citrato 5 g, NaCl 1 g, CaCO3 40 g (com base em 1 l de água destilada) [TABELA 5] CONFIRMAÇÃO DA QUANTIDADE DE PRODUÇÃO DE L- TRIPTOFANO NA CEPA PRODUTORA DE L-TRIPTOFANO DERIVADA DE E. COLI (CA04-4303) E A CEPA PRODUTORA DE L-TRIPTOFANO EM QUE O GENE DE EXPORTAÇÃO DERIVADO DE HERBASPIRILLUM RHIZOSPHAERAE ESTÁ SUPEREXPRESSO (CA 04-4306)

[0259] Consequentemente, como pode ser visto nos resultados dos Exemplos 7 e 9, o gene derivado de Herbaspirillum rhizosphaerae mostrou alta especificidade e excelente resistência ao L-triptofano e seu análogo. Como pode ser visto nos resultados dos Exemplos 10 e 12, o gene derivado de Herbaspirillum rhizosphaerae melhorou a produção de L-triptofano em ambas as cepas de Corynebacterium glutamicum e E. coli. Adicionalmente, foi observado no Exemplo 11 que o gene derivado de Herbaspirillum rhizosphaerae exportou substancialmente triptofano extracelularmente. Como resultado, o gene derivado de Herbaspirillum rhizosphaerae foi denominado wex (exportador de triptofano (W)).

EXEMPLO 13: MELHORAMENTO DA CAPACIDADE DE EXPORTAÇÃO DE WEX USANDO MUTAGÊNESE ALEATÓRIA

[0260] Nesse exemplo, a PCR propensa a erros foi realizada para aplicar mutagênese aleatória ao gene wex de tipo selvagem e, no momento da realização da PCR propensa a erros, foi usado o Diversify PCR Random Mutagenesis Kit (Clontech, EUA).

[0261] Para obter uma variante do gene wex em que a mutagênese aleatória é introduzida, a PCR propensa a erros foi realizada com uso do pCL1920-PyccA-wex preparado no Exemplo 8 como um modelo junto com a SEQ ID NO: 78 e SEQ ID NO: 79.

[0262] Para seleção de condições de taxa de mutação, a PCR propensa a erros foi realizada com duas composições de acordo com a concentração de MnSO4 como segue.

[0263] SEQ ID NO: 78 (wex - 1) ACTCTAGAGGATCCCCTTCCAGATCAAATGCGTAA

[0264] SEQ ID NO: 79 (wex - 2) ATTCGAGCTCGGTACCCCTACAAACAGTCCGCCAC [TABELA 6] COMPOSIÇÃO PARA PCR SUJEITO A ERROS (UNIDADE: μL)

[TABELA 7] DICLO DE PCR SUJEITO A ERROS

[0265] Uma biblioteca de plasmídeo mutante recombinante foi obtida pelo método de montagem Gibson (DG Gibson et al., Nature Methods, VOL. Número 6 5 DE MAIO 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix) com uso dos produtos da PCR propensa a erros (que foi realizada nas condições da Tabela 6 e Tabela 7) e o pCL1920 (que foi clivado com uma enzima de restrição SmaI). A biblioteca mutante obtida pelo método acima, pCL1920-PyccA-Hrh e pCL1920 foram transformados em células Escherichia coli W3110, cultivadas em um meio de placa LB que contém espectinomicina (50 μg/l) e 50 colônias foram selecionadas da biblioteca mutante. O sequenciamento foi realizado para determinar sua taxa de mutação e presença/ausência de mutação em várias posições. Como resultado do sequenciamento, a taxa de mutação da condição do Caso # 1 foi de 1,3 kb-1 e a da condição do Caso # 2 foi de 2,5 kb-1. Ambos os Casos # 1 e # 2 foram determinados para atingir a taxa de mutação adequada para a obtenção de uma biblioteca de mutantes, e um processo de triagem de mutações eficazes foi realizado com uso da biblioteca preparada nas condições acima.

[0266] 300 μl de meio mínimo M9 que contém 50 μg/ml de 5'-fluoro triptofano (isto é, um análogo de L-triptofano) foi aliquotado em cada poço de uma placa de 96 poços profundos, seguido pela inoculação de cada colônia do mutante previamente transformado bibliotecas (isto é, bibliotecas mutantes W3110/pCL1920-PyccA-Hrh, W3110/pCL1920 e W3110/pCL1920-PyccA-wex). A cultura foi realizada a 1.200 rpm/37 °C, e a DO foi medida em um comprimento de onda de 600 nm após 16 horas de cultura. O crescimento da maioria das bibliotecas mutantes quase não foi observado em placas de poços profundos como é o caso das cepas de controle (W3110/pCL1920 e W3110/pCL1920-PyccA-Hrh). Entre os mesmos, 51 colônias com crescimento melhorado foram selecionadas, e os plasmídeos mutantes pCL1920- PyccA-wex foram respectivamente extraídos das colônias e retransformados em cepas de E. coli W3110 para avaliar a reprodutibilidade. Foram observados 10 tipos de cepas que mostraram melhora específica de crescimento no meio mínimo M9, no qual 5'-fluoro triptofano estava comumente contido em uma concentração de 50 μg/ml, e suas DOs foram registradas. [TABELA 8] UMA BIBLIOTECA WEX EM QUE O CRESCIMENTO É MELHORADO EM MEIO MÍNIMO QUE CONTÉM ANÁLOGO DE L-TRIPTOFANO

[0267] Depois de extrair o plasmídeo mutante pCL1920-PyccA-wex das 10 cepas mutantes selecionadas, o sequenciamento foi realizado para confirmar suas mutações e, como resultado, foi confirmado que as mutações ocorreram nas sequências de codificação (CDS), que não estão no regiões promotoras. Adicionalmente, foi confirmado que os locais de mutação em 8 das 10 cepas mutantes foram concentrados em uma região do 79° aminoácido (isto é, leucina) para o 83° aminoácido (isto é, isoleucina) da sequência de aminoácidos do Wex proteína de membrana, e que a maioria das mutações foi sua substituição por um aminoácido hidrofóbico, um aminoácido alifático ou um L-aminoácido relativamente pequeno. Portanto, foi determinado que as posições de 79 a 83 da sequência de aminoácidos da proteína de membrana Wex poderiam ser uma região central para a introdução de uma mutação para melhorar a capacidade de exportação de L-triptofano. A este respeito, foi feita uma tentativa de melhorar a sua atividade substituindo-se o aminoácido (ou aminoácidos) na sequência correspondente por vários aminoácido hidrofóbico (ou aminoácidos hidrofóbicos), aminoácido alifático(ou aminoácidos alifáticos) ou por L- aminoácido (ou L-aminoácidos) relativamente pequeno.

EXEMPLO 14: SUBSTITUIÇÃO DO 79° AMINOÁCIDO DA SEQUÊNCIA DE WEX (LEUCINA) POR AMINOÁCIDO HIDROFÓBICO EM MICRORGANISMO DO GÊNERO CORYNEBACTERIUM

[0268] Foi feita uma tentativa de confirmar a eficácia melhorada da exportação de L-triptofano por meio da substituição do 79° aminoácido, leucina (doravante, denominada leucina na posição 79 ou na 79a posição), na sequência de aminoácidos do Wex proteína de membrana com um aminoácido hidrofóbico diferente. A mutagênese dirigida ao sítio foi realizada com uso do pDZTn-PgapA-Hrh preparado no Exemplo 2 como um modelo de modo a gerar mutações em três tipos diferentes de aminoácidos diferentes da leucina. A mutagênese dirigida ao sítio foi realizada pelo seguinte método. [TABELA 9] COMPOSIÇÃO DE PCR DE MUTAGÊNESE DIRIGIDA AO SÍTIO

[TABELA 1 0] CICLO DE PCR DE MUTAGÊNESE DIRIGIDA AO SÍTIO

[0269] Para a substituição do aminoácido na posição 79 (isto é, leucina) da sequência de aminoácidos Wex com cada um dos diferentes aminoácidos hidrofóbicos (isto é, alanina (A) (SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 131), valina (V) (SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 132) e isoleucina (I) (SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 133)), uma mistura de PCR foi preparada como mostrado na Tabela 9 usando cada conjunto de iniciadores mutagênicos indicado na Tabela 11, e a PCR foi realizada seguindo o método mostrado na Tabela 10. Após a conclusão da PCR, 1 μl de uma enzima de restrição Dpn I foi adicionado e a mistura foi tratada a 37 °C durante uma hora. 3 μl do DNA tratado com DpnI foram transformados em células competentes DH5a para obter plasmídeos pDZTn-PgapA-wex mutantes, e cada uma das mutações indicadas na Tabela 11 foi confirmada por sequenciação. [TABELA 11] CONJUNTOS DE INICIADORES MUTAGÊNICOS PARA A PREPARAÇÃO DE PLASMÍDEOS MUTANTES, NOS QUAIS O AMINOÁCIDO NA POSIÇÃO 79 DA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DE WEX ESTÁ, RESPECTIVAMENTE, MUTADO, PARA INTRODUÇÃO EM UM MICRORGANISMO DO GÊNERO CORYNEBACTERIUM

[0270] Os vetores pDZTn-PgapA-wex L79A, pDZTn-PgapA-wex L79V e pDZTn- PgapA-wex L79I preparados como mostrado na Tabela 11 foram cada um transformados por eletroporação na cepa CA04-8352, que foi preparada no Exemplo de Referência 1, e em seguida, submetido a um cruzamento secundário para obter três tipos de cepas, nas quais um gene wex mutante é inserido no cromossomo, respectivamente. A manipulação genética correspondente foi confirmada por meio de sequenciamento de genoma e um método de PCR com uso dos iniciadores de SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, cada um dos quais pode, respectivamente, amplificar a região externa da região a montante e a região a jusante para recombinação homóloga em que o gene correspondente é inserido.

[0271] As cepas mutantes obtidas foram nomeadas como CA04-8352 (wex L79A), CA04-8352 (wex L79V) e CA04-8352 (wex L79I), respectivamente.

[0272] Para confirmar a quantidade de produção de triptofano nas cepas CA04- 8352, CA04-8405, CA04-8352 (wex L79A), CA04-8352 (wex L79V) e CA04-8352 (wex L79I), essas cepas foram cultivadas pelas mesmas método como no Exemplo 10. Após a conclusão da cultura, a quantidade de produção de L-triptofano em cada cepa foi medida por HPLC. [TABELA 12] CONFIRMAÇÃO DA QUANTIDADE DE PRODUÇÃO DE L- TRIPTOFANO NA CEPA PRODUTORA DE L-TRIPTOFANO DERIVADA DE CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM (CA04-8352), CEPA (CA04-8405) NA QUAL UM GENE EXPORTADOR DE L-TRIPTOFANO (WEX) É INSERIDO, E CEPAS MUTANTES (CA04-8352 (WEX L79A), CA04-8352 (WEX L79V) E CA04-8352 (WEX L79I)), EM QUE O AMINOÁCIDO NA POSIÇÃO 79 DA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS WEX ESTÁ RESPECTIVAMENTE MUTADO

[0273] Conforme mostrado nos resultados da Tabela 12, todos os três tipos de mutantes, nos quais a leucina na posição 79 da sequência de aminoácidos de Wex é respectivamente substituída por um aminoácido hidrofóbico diferente, mostraram uma melhoria no rendimento de fermentação em 1,59% p para 2,95% p, em comparação com a cepa CA04-8405, à qual o Wex de tipo selvagem é introduzido. Em particular, a cepa wex L79A mutante mostrou a maior melhoria no rendimento da fermentação de L-triptofano, e esses resultados indicam que a substituição da leucina na posição 79 da sequência de aminoácidos Wex por um aminoácido hidrofóbico diferente pode aumentar significativamente a atividade de Capacidade de exportação de L-triptofano do Wex. EXEMPLO 15: SUBSTITUIÇÃO DO 80° AMINOÁCIDO DA SEQUÊNCIA DE WEX (SERINA) POR AMINOÁCIDO HIDROFÓBICO EM MICRORGANISMO DO GÊNERO CORYNEBACTERIUM

[0274] Foi feita uma tentativa de confirmar a eficácia melhorada da exportação de L-triptofano através da substituição do 80° aminoácido, serina (doravante, denominado a serina na posição 80), na sequência de aminoácidos da proteína de membrana Wex por um hidrofóbico aminoácido. A mutagênese dirigida ao sítio foi realizada com uso do pDZTn-PgapA-wex como um modelo pelo mesmo método do Exemplo 14 de modo a gerar mutações em quatro tipos diferentes de aminoácidos hidrofóbicos.

[0275] Além disso, a serina na posição 80 da sequência de aminoácidos de Wex foi substituída por cada um dos diferentes aminoácidos hidrofóbicos (isto é, alanina (A) (SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 134), valina (V) (SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 135), leucina (l) (SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 136) e isoleucina (I) (SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 137)) com uso do mesmo método como no exemplo 14. Os conjuntos de iniciadores mutagênicos e as formas de mutação usadas para obter os plasmídeos mutantes pDZTn-PgapA-wex são os mesmos que os mostrados na Tabela 13 abaixo. [TABELA 13] CONJUNTOS DE INICIADORES MUTAGÊNICOS PARA A PREPARAÇÃO DE PLASMÍDEOS MUTANTES, NOS QUAIS O AMINOÁCIDO NA POSIÇÃO 80 DA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DE WEX ESTÁ, RESPECTIVAMENTE, MUTADO, PARA INTRODUÇÃO EM UM MICRORGANISMO DO GÊNERO CORYNEBACTERIUM

[0276] Os vetores pDZTn-PgapA-wex S80A, pDZTn-PgapA-wex S80V, pDZTn- PgapA-wex S80L e pDZTn-PgapA-wex S80I, que foram preparados como mostrado na Tabela 13, foram transformados por eletroporação no CA04-8352 e, em seguida, submetido a um cruzamento secundário para obter quatro tipos de cepas, nas quais um gene wex mutante é inserido no cromossomo, respectivamente. A manipulação genética correspondente foi confirmada por meio de sequenciamento de genoma e um método de PCR com uso dos iniciadores de SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, cada um dos quais pode, respectivamente, amplificar a região externa da região a montante e a região a jusante para recombinação homóloga em que o gene correspondente é inserido.

[0277] As cepas mutantes obtidas foram nomeadas como CA04-8352 (wex S80A), CA04-8352 (wex S80V), CA04-8352 (wex S80L) e CA04-8352 (wex S80I), respectivamente.

[0278] Para confirmar a quantidade de produção de triptofano nas cepas CA04- 8352, CA04-8405, CA04-8352 (wex S80A), CA04-8352 (wex S80V), CA04-8352 (wex S80L) e CA04-8352 (wex S80I), essas cepas foram cultivadas pelo mesmo método que no Exemplo 10. Após a conclusão da cultura, a quantidade de produção de L- triptofano em cada cepa foi medida por HPLC. [TABELA 14] CONFIRMAÇÃO DA QUANTIDADE DE PRODUÇÃO DE L- TRIPTOFANO NA CEPA PRODUTORA DE L-TRIPTOFANO DERIVADA DE CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM (CA04-8352), CEPA (CA04-8405) NA QUAL UM GENE DE EXPORTAÇÃO DE L-TRIPTOFANO (WEX) É INSERIDO, E CEPAS MUTANTES (CA04-8352 (WEX S80A), CA04-8352 (WEX S80V), CA04-8352 (WEX S80L) E CA04-8352 (WEX S80I)), EM QUE O AMINOÁCIDO NA POSIÇÃO 80 DO AMINO WEX SEQUÊNCIA DE ÁCIDO É RESPECTIVAMENTE MUTADA

[0279] Conforme mostrado nos resultados da Tabela 14, todos os quatro tipos de mutantes, nos quais o aminoácido na posição 80 da sequência de aminoácidos Wex é respectivamente substituído por um aminoácido hidrofóbico diferente, mostraram uma melhoria no rendimento de fermentação em 1,99% p a 2,62% p, em comparação com a cepa CA04-8405, à qual o Wex de tipo selvagem é introduzido. Em particular, a cepa wex S80V mutante mostrou a maior melhoria no rendimento da fermentação de L-triptofano, e esses resultados indicam que a substituição da serina na posição 80 da sequência de aminoácidos Wex por um aminoácido hidrofóbico diferente pode aumentar significativamente a atividade de Capacidade de exportação de L-triptofano do Wex. EXEMPLO 16: SUBSTITUIÇÃO DO 81° AMINOÁCIDO DA SEQUÊNCIA DE WEX (LEUCINA) POR AMINOÁCIDO HIDROFÓBICO EM MICRORGANISMO DO GÊNERO CORYNEBACTERIUM

[0280] Foi feita uma tentativa de confirmar a eficácia melhorada da exportação de L-triptofano através da substituição do 81° aminoácido, leucina (doravante, denominada a leucina na posição 81), na sequência de aminoácidos da proteína de membrana Wex por um diferente aminoácido hidrofóbico. A mutagênese dirigida ao sítio foi realizada com uso do pDZTn-PgapA-wex como um modelo pelo mesmo método do Exemplo 14 de modo a gerar mutações em três tipos diferentes de aminoácidos hidrofóbicos diferentes da leucina.

[0281] Além disso, a leucina na posição 81 da sequência de aminoácidos Wex foi substituída por cada um dos diferentes aminoácidos hidrofóbicos (isto é, alanina (A) (SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 138), valina (V) (SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 139) e isoleucina (I) (SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 140)) com uso do mesmo método como no exemplo 14. Os conjuntos de iniciadores mutagênicos e as formas de mutação usadas para obter os plasmídeos mutantes pDZTn-PgapA-wex são os mesmos que os mostrados na Tabela 15 abaixo. [TABELA 15] CONJUNTOS DE INICIADORES MUTAGÊNICOS PARA A PREPARAÇÃO DE PLASMÍDEOS MUTANTES, NOS QUAIS O AMINOÁCIDO NA POSIÇÃO 81 DA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DE WEX ESTÁ, RESPECTIVAMENTE, MUTADO, PARA INTRODUÇÃO EM MICRORGANISMO DO GÊNERO CORYNEBACTERIUM

[0282] Os vetores pDZTn-PgapA-wex L81A, pDZTn-PgapA-wex L81V e pDZTn- PgapA-wex L81I preparados como mostrado na Tabela 15 foram cada um transformados por eletroporação na cepa CA04-8352 e, então, submetidos a um cruzamento secundário para obter três tipos de cepas, nas quais um gene wex mutante é inserido no cromossomo, respectivamente. A manipulação genética correspondente foi confirmada por meio de sequenciamento de genoma e um método de PCR com uso dos iniciadores de SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, cada um dos quais pode, respectivamente, amplificar a região externa da região a montante e a região a jusante para recombinação homóloga em que o gene correspondente é inserido.

[0283] As cepas mutantes obtidas foram nomeadas como CA04-8352 (wex L81A), CA04-8352 (wex L81V) e CA04-8352 (wex L81I), respectivamente.

[0284] Para confirmar a quantidade de produção de triptofano em CA04-8352, CA04-8405, CA04-8352 (wex L81A), CA04-8352 (wex L81V) e CA04-8352 (wex L81I), essas cepas foram cultivadas pelo mesmo método que no Exemplo 10. Após a conclusão da cultura, a quantidade de produção de L-triptofano em cada cepa foi medida por HPLC. [TABELA 16] CONFIRMAÇÃO DA QUANTIDADE DE PRODUÇÃO DE L- TRIPTOFANO NA CEPA PRODUTORA DE L-TRIPTOFANO DERIVADA DE CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM (CA04-8352), CEPA (CA04-8405) NA QUAL UM GENE DE EXPORTAÇÃO DE L-TRIPTOFANO (WEX) É INSERIDO, E CEPAS MUTANTES (CA04-8352 (WEX L81A), CA04-8352 (WEX L81V) E CA04-8352 (WEX L81I)), EM QUE O AMINOÁCIDO NA POSIÇÃO 81 DA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS WEX ESTÁ RESPECTIVAMENTE MUTADO

[0285] Conforme mostrado nos resultados da Tabela 16, todos os três tipos de mutantes, nos quais o aminoácido na posição 81 da sequência de aminoácidos Wex é respectivamente substituído por um aminoácido hidrofóbico diferente, mostraram uma melhoria no rendimento de fermentação em 2,03% p a 2,87% p, em comparação com a cepa CA04-8405, à qual o Wex de tipo selvagem é introduzido. Em particular, a cepa wex L81A mutante mostrou a maior melhoria no rendimento da fermentação de L-triptofano, e esses resultados indicam que a substituição da leucina na posição 81 da sequência de aminoácidos Wex por um aminoácido hidrofóbico diferente pode aumentar significativamente a atividade de Capacidade de exportação de L-triptofano do Wex. EXEMPLO 17: SUBSTITUIÇÃO DO 82° AMINOÁCIDO DA SEQUÊNCIA DE WEX (SERINA) POR AMINOÁCIDO HIDROFÓBICO EM MICRORGANISMO DO GÊNERO CORYNEBACTERIUM

[0286] Foi feita uma tentativa de confirmar a eficácia melhorada da exportação de L-triptofano através da substituição do 82° aminoácido, serina (doravante, a serina na posição 82), na sequência de aminoácidos da proteína de membrana Wex por um hidrofóbico aminoácido. A mutagênese dirigida ao sítio foi realizada com uso do pDZTn-PgapA-wex como um modelo pelo mesmo método do Exemplo 14 de modo a gerar mutações em quatro tipos diferentes de aminoácidos hidrofóbicos.

[0287] Além disso, a serina na posição 82 da sequência de aminoácidos de Wex foi substituída por cada um dos diferentes aminoácidos hidrofóbicos (isto é, alanina (A) (SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 141), valina (V) (SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 142), leucina (l) (SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 143) e isoleucina (I) (SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 144)) com uso do mesmo método como no exemplo 14. Os conjuntos de iniciadores mutagênicos e as formas de mutação usadas para obter os plasmídeos mutantes pDZTn-PgapA-wex são os mesmos que os mostrados na Tabela 17 abaixo. [TABELA 17] CONJUNTOS DE INICIADORES MUTAGÊNICOS PARA A PREPARAÇÃO DE PLASMÍDEOS MUTANTES, NOS QUAIS O AMINOÁCIDO NA POSIÇÃO 82 DA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DE WEX ESTÁ, RESPECTIVAMENTE, MUTADO, PARA INTRODUÇÃO EM UM MICRORGANISMO DO GÊNERO CORYNEBACTERIUM

[0288] Os vetores pDZTn-PgapA-wex S82A, pDZTn-PgapA-wex S82V, pDZTn- PgapA-wex S82L e pDZTn-PgapA-wex S82I preparados como mostrado na Tabela 17 foram cada um transformado por eletroporação na cepa CA04-8352, e então submetido a um cruzamento secundário para obter quatro tipos de cepas, nas quais um gene wex mutante é inserido no cromossomo, respectivamente. A manipulação genética correspondente foi confirmada por meio de sequenciamento de genoma e um método de PCR com uso dos iniciadores de SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, cada um dos quais pode, respectivamente, amplificar a região externa da região a montante e a região a jusante para recombinação homóloga em que o gene correspondente é inserido.

[0289] As cepas mutantes obtidas foram nomeadas como CA04-8352 (wex S82A), CA04-8352 (wex S82V), CA04-8352 (wex S82L) e CA04-8352 (wex S82I), respectivamente.

[0290] Para confirmar a quantidade de produção de triptofano nas cepas CA04- 8352, CA04-8405, CA04-8352 (wex S82A), CA04-8352 (wex S82V), CA04-8352 (wex S82L) e CA04-8352 (wex S82I), essas cepas foram cultivadas pelo mesmo método que no Exemplo 10. Após a conclusão da cultura, a quantidade de produção de L- triptofano em cada cepa foi medida por HPLC. [TABELA 18] CONFIRMAÇÃO DA QUANTIDADE DE PRODUÇÃO DE L- TRIPTOFANO NA CEPA PRODUTORA DE L-TRIPTOFANO DERIVADA DE CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM (CA04-8352), CEPA (CA04-8405) NA QUAL UM GENE DE EXPORTAÇÃO DE L-TRIPTOFANO (WEX) É INSERIDO, E CEPAS MUTANTES (CA04-8352 (WEX S82A), CA04-8352 (WEX S82V), CA04-8352 (WEX S82L) E CA04-8352 (WEX S82I)), EM QUE O AMINOÁCIDO NA POSIÇÃO 82 DO AMINO WEX SEQUÊNCIA DE ÁCIDO É RESPECTIVAMENTE MUTADA

[0291] Conforme mostrado nos resultados da Tabela 18, todos os quatro tipos de mutantes, nos quais o aminoácido na posição 82 da sequência de aminoácidos Wex é respectivamente substituído por um aminoácido hidrofóbico diferente, mostraram uma melhoria no rendimento de fermentação em 1,40% p a 2,76% p, em comparação com a cepa CA04-8405, à qual o Wex de tipo selvagem é introduzido. Em particular, a cepa wex S82A mutante mostrou a maior melhoria no rendimento da fermentação de L-triptofano, e esses resultados indicam que a substituição da serina na posição 82 da sequência de aminoácidos Wex por um aminoácido hidrofóbico diferente pode aumentar significativamente a atividade de Capacidade de exportação de L-triptofano do Wex. EXEMPLO 18: SUBSTITUIÇÃO DO 83° AMINOÁCIDO DA SEQUÊNCIA DE WEX (ISOLEUCINA) POR AMINOÁCIDO HIDROFÓBICO EM MICRORGANISMO DO GÊNERO CORYNEBACTERIUM

[0292] Foi feita uma tentativa de confirmar a eficácia melhorada da exportação de L-triptofano através da substituição do 83° aminoácido, isoleucina (doravante, denominada a isoleucina na posição 83), na sequência de aminoácidos da proteína de membrana Wex por um diferente aminoácido hidrofóbico. A mutagênese dirigida ao sítio foi realizada com uso do pDZTn-PgapA-wex como um modelo pelo mesmo método do Exemplo 14 de modo a gerar mutações em três tipos diferentes de aminoácidos hidrofóbicos diferentes da isoleucina.

[0293] Além disso, a isoleucina na posição 83 da sequência de aminoácidos Wex foi substituída por cada um dos diferentes aminoácidos hidrofóbicos (isto é, alanina (A) (SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 145), valina (V) (SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 146) e leucina (l) (SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 147)) com uso do mesmo método como no exemplo 14. Os conjuntos de iniciadores mutagênicos e as formas de mutação usadas para obter os plasmídeos mutantes pDZTn-PgapA-wex são os mesmos que os mostrados na Tabela 19 abaixo. [TABELA 19] CONJUNTOS DE INICIADORES MUTAGÊNICOS PARA A PREPARAÇÃO DE PLASMÍDEOS MUTANTES, NOS QUAIS O AMINOÁCIDO NA POSIÇÃO 83 DA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DE WEX ESTÁ, RESPECTIVAMENTE, MUTADO, PARA INTRODUÇÃO EM UM MICRORGANISMO DO GÊNERO CORYNEBACTERIUM

[0294] Os vetores pDZTn-PgapA-wex I83A, pDZTn-PgapA-wex I83V e pDZTn- PgapA-wex I83L preparados como mostrado na Tabela 19 foram cada um transformados por eletroporação na cepa CA04-8352 e, então, submetidos a um cruzamento secundário para obter três tipos de cepas, nas quais um gene wex mutante é inserido no cromossomo, respectivamente. A manipulação genética correspondente foi confirmada por meio de sequenciamento de genoma e um método de PCR com uso dos iniciadores de SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, cada um dos quais pode, respectivamente, amplificar a região externa da região a montante e a região a jusante para recombinação homóloga em que o gene correspondente é inserido.

[0295] As cepas mutantes obtidas foram nomeadas como CA04-8352 (wex I83A), CA04-8352 (wex I83V) e CA04-8352 (wex I83L), respectivamente.

[0296] Para confirmar a quantidade de produção de triptofano nas cepas CA04- 8352, CA04-8405, CA04-8352 (wex I83A), CA04-8352 (wex I83V) e CA04-8352 (wex I83L), essas cepas foram cultivadas pelas mesmas método como no Exemplo 10. Após a conclusão da cultura, a quantidade de produção de L-triptofano em cada cepa foi medida por HPLC. [TABELA 20] CONFIRMAÇÃO DA QUANTIDADE DE PRODUÇÃO DE L- TRIPTOFANO NA CEPA PRODUTORA DE L-TRIPTOFANO DERIVADA DE CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM (CA04-8352), CEPA (CA04-8405) NA QUAL UM GENE DE EXPORTAÇÃO DE L-TRIPTOFANO (WEX) É INSERIDO, E CEPAS MUTANTES (CA04-8352 (WEX I83A), CA04-8352 (WEX I83V) E CA04-8352 (WEX I83L)), EM QUE O AMINOÁCIDO NA POSIÇÃO 83 DA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS WEX ESTÁ RESPECTIVAMENTE MUTADO

[0297] Conforme mostrado nos resultados da Tabela 20, todos os três tipos de mutantes, nos quais o aminoácido na posição 83 da sequência de aminoácidos Wex é respectivamente substituído por um aminoácido hidrofóbico diferente, mostraram uma melhoria no rendimento de fermentação em 1,73% p a 2,36% p, em comparação com a cepa CA04-8405, à qual o Wex de tipo selvagem é introduzido. Em particular, a cepa wex I83L mutante mostrou a maior melhoria no rendimento da fermentação de L-triptofano, e esses resultados indicam que a substituição da isoleucina na posição 83 da sequência de aminoácidos Wex por um aminoácido hidrofóbico diferente pode aumentar significativamente a atividade de Capacidade de exportação de L-triptofano do Wex. Através dos resultados mostrados nos Exemplos 2-6 acima, foi confirmado que a substituição dos aminoácidos nas posições de 79 a 83 na sequência de aminoácidos da proteína de membrana Wex por um aminoácido hidrofóbico diferente pode aumentar significativamente a atividade de capacidade de exportação de L- triptofano em uma cepa de Corynebacterium glutamicum.

[0298] As cepas CA04-8352 (wex L79I), CA04-8352 (wex S80V), CA04-8352 (wex L81V), CA04-8352 (wex S82V) e CA04-8352 (wex I83L), nas quais o wex mutante do a presente revelação é apresentada, foram nomeados como CM05-9022, CM05-9023, CM05-9024, CM05-9025 e CM05-9026, respectivamente. Essas cepas foram depositadas internacionalmente no Centro de Cultura Coreana de Microrganismos (KCCM), um depositário internacional, em 29 de março de 2019, de acordo com as disposições do Tratado de Budapeste e com os números de adesão atribuídos KCCM12475P, KCCM12476P, KCCM12477P, KCCM12478P e KCCM12479P, respectivamente. EXEMPLO 19: SUBSTITUIÇÃO DO AMINOÁCIDO NA POSIÇÃO 79 DA SEQUÊNCIA DE WEX (LEUCINA) POR AMINOÁCIDO HIDROFÓBICO EM MICRORGANISMO DO GÊNERO ESCHERICHIA

[0299] O efeito de melhorar a atividade da capacidade de exportação de L- triptofano de acordo com a introdução da mutação Wex em um microrganismo do gênero Corynebacterium mostrado nos Exemplos 14 a 18 acima foi confirmado novamente em um microrganismo do gênero Escherichia.

[0300] Como no microrganismo do gênero Corynebacterium, foi feita uma tentativa em um microrganismo do gênero Escherichia para confirmar a eficácia aprimorada da exportação de L-triptofano por meio da substituição do aminoácido na posição 79 (isto é, leucina) na sequência de aminoácidos da proteína de membrana Wex com um aminoácido hidrofóbico diferente. A mutagênese dirigida ao sítio foi realizada com uso do pCL1920-PyccA-Hrh preparado no Exemplo 8 como um modelo de modo a gerar mutações em três tipos diferentes de aminoácidos hidrofóbicos diferentes da leucina. A mutagênese dirigida ao sítio foi realizada pelo seguinte método. [TABELA 21] COMPOSIÇÃO DE PCR DE MUTAGÊNESE DIRIGIDA AO SÍTIO

[TABELA 22] CICLO DE PCR DE MUTAGÊNESE DIRIGIDA AO SÍTIO

[0301] Para a substituição do aminoácido na posição 79 da sequência de aminoácidos Wex (isto é, leucina) com cada um dos diferentes aminoácidos hidrofóbicos (isto é, alanina (A) (SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 131), valina (V) (SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 132) e isoleucina (I) (SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 133)), uma mistura de PCR foi preparada como mostrado na Tabela 21 usando cada conjunto de iniciadores mutagênicos indicado na Tabela 23, e a PCR foi realizada seguindo o método mostrado na Tabela 22. Após a conclusão da PCR, 1 μl de uma enzima de restrição Dpn I foi adicionado e a mistura foi tratada a 37 °C durante uma hora. 3 μl do DNA tratado com DpnI foram transformados em células competentes DH5a para obter plasmídeos pCL1920-PgapA-wex mutantes, e cada uma das mutações indicadas na Tabela 23 foi confirmada por sequenciação. [TABELA 23] CONJUNTOS DE INICIADORES MUTAGÊNICOS PARA A PREPARAÇÃO DE PLASMÍDEOS MUTANTES, NOS QUAIS O AMINOÁCIDO NA POSIÇÃO 79 DA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DE WEX ESTÁ, RESPECTIVAMENTE, MUTADO, PARA EXPRESSÃO EM UM MICRORGANISMO DO GÊNERO ESCHERI CHIA

[0302] Os vetores pCL1920-PyccA-wex L79A, pCL1920-PyccA-wex L79V e pCL1920-PyccA-wex L79I preparados como mostrado na Tabela 23 foram transformados por eletroporação na cepa CA04-4303 e, assim, três tipos de cepas em que cada dos genes wex mutantes que diferem uns dos outros no aminoácido na posição 79 é introduzido. As cepas mutantes obtidas foram nomeadas como CA04- 4303 (wex L79A), CA04-4303 (wex L79V) e CA04-4303 (wex L79I), respectivamente.

[0303] Para confirmar a quantidade de produção de triptofano nas cepas CA04- 4303 (wex L79A), CA04-4303 (wex L79V) e CA04-4303 (wex L79I), com uso das cepas CA04-4303 (pCL1920) e CA04-4306 preparadas em Exemplo 12 como os grupos de controle, essas cepas foram cultivadas pelo mesmo método no Exemplo 12. Após a conclusão da cultura, a quantidade de produção de L-triptofano em cada cepa foi medida por HPLC. [TABELA 24] CONFIRMAÇÃO DA QUANTIDADE DE PRODUÇÃO DE L- TRIPTOFANO NA CEPA PRODUTORA DE L-TRIPTOFANO DERIVADA DE E. COLI (CA04-4303 (PCL1920)), CEPA (CA04-4306) EM QUE UM GENE EXPORTADOR DE L-TRIPTOFANO (WEX) É EXPRESSO E AS CEPAS MUTANTES (CA04-4303 (WEX L79A), CA04-4303 (WEX L79V) E CA04-4303 (WEX L79I)), EM QUE O AMINOÁCIDO NA POSIÇÃO 79 DA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS WEX É RESPECTIVAMENTE MUTADO

[0304] Conforme mostrado nos resultados da Tabela 24, todos os três tipos de mutantes, nos quais o aminoácido na posição 79 da sequência de aminoácidos Wex é respectivamente substituído por um aminoácido hidrofóbico diferente, mostraram uma melhoria no rendimento de fermentação em 0,6% p a 1,5% p, em comparação com a cepa CA04-4306, à qual o Wex de tipo selvagem é introduzido. Em particular, como na cepa de proteção de L-triptofano de Corynebacterium glutamicum, a cepa de E. coli com uma mutação wex L79A também mostrou a maior melhoramento no rendimento da fermentação de L-triptofano, e esses resultados indicam que a substituição da leucina na posição 79 da sequência de aminoácidos Wex com um aminoácido hidrofóbico diferente pode aumentar significativamente a atividade da capacidade de exportação de L-triptofano do Wex em um microrganismo do gênero Escherichia, bem como em um microrganismo do gênero Corynebacterium. EXEMPLO 20: SUBSTITUIÇÃO DO AMINOÁCIDO NA POSIÇÃO 80 DA SEQUÊNCIA DE WEX (SERINA) POR AMINOÁCIDO HIDROFÓBICO EM MICRORGANISMO DO GÊNERO ESCHERICHIA

[0305] Foi feita uma tentativa de confirmar a maior eficácia da exportação de L- triptofano por meio da substituição da serina na posição 80 na sequência de aminoácidos da proteína de membrana de Wex por um aminoácido hidrofóbico diferente em um microrganismo do gênero Escherichia. A mutagênese dirigida ao sítio foi realizada com uso do pCL1920-PyccA-wex como um modelo pelo mesmo método do Exemplo 19 de modo a gerar mutações em quatro tipos diferentes de aminoácidos hidrofóbicos.

[0306] Além disso, a serina na posição 80 da sequência de aminoácidos de Wex foi substituída por cada um dos diferentes aminoácidos hidrofóbicos (isto é, alanina (A) (SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 134), valina (V) (SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 135), leucina (l) (SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 136) e isoleucina (I) (SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 137)) com uso do mesmo método como no exemplo 19. Os conjuntos de iniciadores mutagênicos e as formas de mutação usadas para obter os plasmídeos mutantes pCL1920-PyccA-wex são os mesmos que os mostrados na Tabela 25 abaixo. [TABELA 25] CONJUNTOS DE INICIADORES MUTAGÊNICOS PARA A PREPARAÇÃO DE PLASMÍDEOS MUTANTES, NOS QUAIS O AMINOÁCIDO NA POSIÇÃO 80 DA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DE WEX ESTÁ, RESPECTIVAMENTE, MUTADO, PARA EXPRESSÃO EM UM MICRORGANISMO DO GÊNERO ESCHERICHIA

[0307] Os vetores pCL1920-PyccA-wex S80A, pCL1920-PyccA-wex S80V, pCL1920-PyccA-wex S80L e pCL1920-PyccA-wex S80I preparados conforme mostrado na Tabela 25 foram cada um transformado por eletroporação na cepa CA04- 4303 e, assim, foram obtidos quatro tipos de cepas em que cada um dos genes wex mutantes que diferem um do outro no aminoácido na posição 80 é introduzido. As cepas mutantes obtidas foram nomeadas como CA04-4303 (wex S80A), CA04-4303 (wex S80V), CA04-4303 (wex S80L) e CA04-4303 (wex S80I), respectivamente.

[0308] Para confirmar a quantidade de produção de triptofano no CA04-4303 (pCL1920), CA04-4306, CA04-4303 (wex S80A), CA04-4303 (wex S80V), CA04-4303 (wex S80L) e CA04-4303 (wex S80I), essas cepas foram cultivadas pelo mesmo método no Exemplo 12. Após a conclusão da cultura, a quantidade de produção de L- triptofano em cada cepa foi medida por HPLC. [TABELA 26] CONFIRMAÇÃO DA QUANTIDADE DE PRODUÇÃO DE L- TRIPTOFANO NA CEPA PRODUTORA DE L-TRIPTOFANO DERIVADA DE E. COLI (CA04-4303 (PCL1920)), CEPA (CA04-4306) EM QUE UM GENE DE EXPORTAÇÃO DE L-TRIPTOFANO (WEX) É EXPRESSO E AS CEPAS MUTANTES (CA04-4303 (WEX S80A), CA04-4303 (WEX S80V), CA04-4303 (WEX S80L) E CA04-4303 (WEX S80I)), EM QUE O AMINOÁCIDO NA POSIÇÃO 80 DA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS WEX É RESPECTIVAMENTE MUTADO

[0309] Conforme mostrado nos resultados da Tabela 26, todos os quatro tipos de mutantes, nos quais o aminoácido na posição 80 da sequência de aminoácidos Wex é respectivamente substituído por um aminoácido hidrofóbico diferente, mostraram uma melhoria no rendimento de fermentação em 0,3% p a 1,2% p, em comparação com a cepa CA04-4306, à qual o Wex de tipo selvagem é introduzido. Em particular, como na cepa de proteção de L-triptofano de Corynebacterium glutamicum, a cepa de E. coli com uma mutação wex S80V também mostrou a maior melhoramento no rendimento da fermentação de L-triptofano, e esses resultados indicam que a substituição da serina na posição 80 da sequência de aminoácidos Wex com um aminoácido hidrofóbico diferente pode aumentar significativamente a atividade da capacidade de exportação de L-triptofano do Wex em um microrganismo do gênero Escherichia, bem como em um microrganismo do gênero Corynebacterium. Exemplo 21: Substituição do aminoácido na posição 81 da sequência de Wex (leucina) por aminoácido hidrofóbico em microrganismo do gênero Escherichia

[0310] Foi feita uma tentativa de confirmar a maior eficácia da exportação de L- triptofano por meio da substituição da leucina na posição 81 na sequência de aminoácidos da proteína de membrana de Wex por um aminoácido hidrofóbico diferente em um microrganismo do gênero Escherichia. A mutagênese dirigida ao sítio foi realizada com uso do pCL1920-PyccA-wex como um modelo pelo mesmo método do Exemplo 19 de modo a gerar mutações em três tipos diferentes de aminoácidos hidrofóbicos diferentes da leucina.

[0311] Além disso, a leucina na posição 81 da sequência de aminoácidos Wex foi substituída por cada um dos diferentes aminoácidos hidrofóbicos (isto é, alanina (A) (SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 138), valina (V) (SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 139) e isoleucina (I) (SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 140)) com uso do mesmo método como no exemplo 19. Os conjuntos de iniciadores mutagênicos e as formas de mutação usadas para obter os plasmídeos mutantes pCL1920-PyccA-wex são os mesmos que os mostrados na Tabela 27 abaixo. [TABELA 27] CONJUNTOS DE INICIADORES MUTAGÊNICOS PARA A PREPARAÇÃO DE PLASMÍDEOS MUTANTES, NOS QUAIS O AMINOÁCIDO NA POSIÇÃO 81 DA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DE WEX ESTÁ, RESPECTIVAMENTE, MUTADO, PARA EXPRESSÃO EM MICRORGANISMO DO GÊNERO ESCHERICHIA

[0312] Os vetores pCL1920-PyccA-wex L81A, pCL1920-PyccA-wex L81V e pCL1920-PyccA-wex L81I preparados como mostrado na Tabela 27 foram transformados por eletroporação na cepa CA04-4303 e, assim, três tipos de cepas em que cada dos genes wex mutantes que diferem uns dos outros no aminoácido na posição 81 é introduzido. As cepas mutantes obtidas foram nomeadas como CA04- 4303 (wex L81A), CA04-4303 (wex L81V) e CA04-4303 (wex L81I), respectivamente.

[0313] Para confirmar a quantidade de produção de triptofano nas cepas CA04- 4303(pCL1920), CA04-4306, CA04-4303(wex L81A), CA04-4303(wex L81V) e CA04- 4303(wex L81I), essas cepas foram cultivadas pelo mesmo método que no Exemplo 12. Após a conclusão da cultura, a quantidade de produção de L-triptofano em cada cepa foi medida por HPLC. [TABELA 28] CONFIRMAÇÃO DA QUANTIDADE DE PRODUÇÃO DE L- TRIPTOFANO NA CEPA PRODUTORA DE L-TRIPTOFANO DERIVADA DE E. COLI (CA04-4303 (PCL1920)), CEPA (CA04-4306) EM QUE UM GENE EXPORTADOR DE L-TRIPTOFANO (WEX) É EXPRESSO E AS CEPAS MUTANTES (CA04-4303 (WEX L81A), CA04-4303 (WEX L81V) E CA04-4303 (WEX L81I)), EM QUE O AMINOÁCIDO NA POSIÇÃO 81 DA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS WEX É RESPECTIVAMENTE MUTADO

[0314] Conforme mostrado nos resultados da Tabela 28, todos os três tipos de mutantes, nos quais o aminoácido na posição 81 da sequência de aminoácidos Wex é respectivamente substituído por um aminoácido hidrofóbico diferente, mostraram uma melhoria no rendimento de fermentação em 1,0% p a 1,8% p, em comparação com a cepa CA04-4306, à qual o Wex de tipo selvagem é introduzido. Em particular, como na cepa de proteção de L-triptofano de Corynebacterium glutamicum, a cepa de E. coli com uma mutação wex L81A também mostrou a maior melhoramento no rendimento da fermentação de L-triptofano, e esses resultados indicam que a substituição da leucina na posição 81 da sequência de aminoácidos Wex com um aminoácido hidrofóbico diferente pode aumentar significativamente a atividade da capacidade de exportação de L-triptofano do Wex em um microrganismo do gênero Escherichia, bem como em um microrganismo do gênero Corynebacterium. EXEMPLO 22: SUBSTITUIÇÃO DO AMINOÁCIDO NA POSIÇÃO 82 DA SEQUÊNCIA DE WEX (SERINA) POR AMINOÁCIDO HIDROFÓBICO EM MICRORGANISMO DO GÊNERO ESCHERICHIA

[0315] Foi feita uma tentativa de confirmar a maior eficácia da exportação de L- triptofano por meio da substituição do aminoácido na posição 82 (isto é, serina) na sequência de aminoácidos da proteína de membrana de Wex por um aminoácido hidrofóbico diferente em um microrganismo do gênero Escherichia. A mutagênese dirigida ao sítio foi realizada com uso do pCL1920-PyccA-wex como um modelo pelo mesmo método do Exemplo 19 de modo a gerar mutações em quatro tipos diferentes de aminoácidos hidrofóbicos.

[0316] Além disso, a serina na posição 82 da sequência de aminoácidos de Wex foi substituída por cada um dos diferentes aminoácidos hidrofóbicos (isto é, alanina (A) (SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 141), valina (V) (SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 142), leucina (l) (SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 143) e isoleucina (I) (SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 144)) com uso do mesmo método como no exemplo 19. Os conjuntos de iniciadores mutagênicos e as formas de mutação usadas para obter os plasmídeos mutantes pCL1920-PyccA-wex são os mesmos que os mostrados na Tabela 29 abaixo. [TABELA 29] CONJUNTOS DE INICIADORES MUTAGÊNICOS PARA A PREPARAÇÃO DE PLASMÍDEOS MUTANTES, NOS QUAIS O AMINOÁCIDO NA POSIÇÃO 82 DA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DE WEX ESTÁ, RESPECTIVAMENTE, MUTADO, PARA EXPRESSÃO EM MICRORGANISMO DO GÊNERO ESCHERICHIA

[0317] Os vetores pCL1920-PyccA-wex S82A, pCL1920-PyccA-wex S82V, pCL1920-PyccA-wex S82L e pCL1920-PyccA-wex S82I preparados conforme mostrado na Tabela 29 foram cada um transformado por eletroporação na cepa CA04- 4303 e, assim, foram obtidos quatro tipos de cepas em que cada um dos genes wex mutantes que diferem um do outro no aminoácido na posição 82 é introduzido. As cepas mutantes obtidas foram nomeadas como CA04-4303 (wex S82A), CA04-4303 (wex S82V), CA04-4303 (wex S82L) e CA04-4303 (wex S82I), respectivamente.

[0318] Para confirmar a quantidade de produção de triptofano no CA04-4303 (pCL1920), CA04-4306, CA04-4303 (wex S82A), CA04-4303 (wex S82V), CA04-4303 (wex S82L) e CA04-4303 (wex S82I), essas cepas foram cultivadas pelo mesmo método no Exemplo 12. Após a conclusão da cultura, a quantidade de produção de L- triptofano em cada cepa foi medida por HPLC. [TABELA 30] CONFIRMAÇÃO DA QUANTIDADE DE PRODUÇÃO DE L- TRIPTOFANO NA CEPA PRODUTORA DE L-TRIPTOFANO DERIVADA DE E. COLI (CA04-4303 (PCL1920)), CEPA (CA04-4306) EM QUE UM GENE DE EXPORTAÇÃO DE L-TRIPTOFANO (WEX) É EXPRESSO E AS CEPAS MUTANTES (CA04-4303 (WEX S82A), CA04-4303 (WEX S82V), CA04-4303 (WEX S82L) E CA04-4303 (WEX S82I)), EM QUE O AMINOÁCIDO NA POSIÇÃO 82 DA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS WEX É RESPECTIVAMENTE MUTADO

[0319] Conforme mostrado nos resultados da Tabela 30, todos os quatro tipos de mutantes, nos quais o aminoácido na posição 82 da sequência de aminoácidos Wex é respectivamente substituído por um aminoácido hidrofóbico diferente, mostraram uma melhoria no rendimento de fermentação em 0,2% p a 1,4% p, em comparação com a cepa CA04-4306, à qual o Wex de tipo selvagem é introduzido. Ao contrário da cepa de proteção de L-triptofano de Corynebacterium glutamicum, a cepa de E. coli com uma mutação wex S82V mostrou a maior melhoramento no rendimento da fermentação de L-triptofano, e esses resultados indicam que a substituição da serina na posição 82 da sequência de aminoácidos Wex com um aminoácido hidrofóbico diferente pode aumentar significativamente a atividade da capacidade de exportação de L-triptofano do Wex em um microrganismo do gênero Escherichia, bem como em um microrganismo do gênero Corynebacterium. EXEMPLO 23: SUBSTITUIÇÃO DO AMINOÁCIDO NA POSIÇÃO 83 DA SEQUÊNCIA DE WEX (ISOLEUCINA) POR AMINOÁCIDO HIDROFÓBICO EM MICRORGANISMO DO GÊNERO ESCHERICHIA

[0320] Foi feita uma tentativa de confirmar a maior eficácia da exportação de L- triptofano por meio da substituição do aminoácido na posição 83 (isto é, isoleucina) na sequência de aminoácidos da proteína de membrana de Wex por um aminoácido hidrofóbico diferente em um microrganismo do gênero Escherichia. A mutagênese dirigida ao sítio foi realizada com uso do pCL1920-PyccA-wex como um modelo pelo mesmo método do Exemplo 19 de modo a gerar mutações em três tipos de aminoácidos hidrofóbicos diferentes da isleucina.

[0321] Além disso, o aminoácido na posição 83 (isto é, isoleucina) da sequência de aminoácidos Wex foi substituída por cada um dos diferentes aminoácidos hidrofóbicos (isto é, alanina (A) (SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 145), valina (V) (SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 146) e leucina (l) (SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 147)) com uso do mesmo método como no exemplo 19. Os conjuntos de iniciadores mutagênicos e as formas de mutação usadas para obter os plasmídeos mutantes pCL1920-PyccA- wex são os mesmos que os mostrados na Tabela 31 abaixo. [TABELA 31] CONJUNTOS DE INICIADORES MUTAGÊNICOS PARA A PREPARAÇÃO DE PLASMÍDEOS MUTANTES, NOS QUAIS O AMINOÁCIDO NA POSIÇÃO 83 DA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DE WEX ESTÁ, RESPECTIVAMENTE, MUTADO, PARA EXPRESSÃO EM UM MICRORGANISMO DO GÊNERO ESCHERICHIA

[0322] Os vetores pCL1920-PyccA-wex I83A, pCL1920-PyccA-wex I83V e pCL1920-PyccA-wex I83L preparados como mostrado na Tabela 31 foram transformados por eletroporação na cepa CA04-4303 e, assim, três tipos de cepas em que cada dos genes wex mutantes que diferem uns dos outros no aminoácido na posição 83 é introduzido. As cepas mutantes obtidas foram nomeadas como CA04- 4303 (wex I83A), CA04-4303 (wex I83V) e CA04-4303 (wex I83L), respectivamente.

[0323] Para confirmar a quantidade de produção de triptofano nas cepas CA04- 4303(pCL1920), CA04-4306, CA04-4303(wex I83A), CA04-4303(wex I83V) e CA04- 4303(wex I83L), essas cepas foram cultivadas pelo mesmo método que no Exemplo 12. Após a conclusão da cultura, a quantidade de produção de L-triptofano em cada cepa foi medida por HPLC. [TABELA 32] CONFIRMAÇÃO DA QUANTIDADE DE PRODUÇÃO DE L- TRIPTOFANO NA CEPA PRODUTORA DE L-TRIPTOFANO DERIVADA DE E. COLI (CA04-4303 (PCL1920)), CEPA (CA04-4306) EM QUE UM GENE EXPORTADOR DE L-TRIPTOFANO (WEX) É EXPRESSO E AS CEPAS MUTANTES (CA04-4303 (WEX I83A), CA04-4303 (WEX I83V) E CA04-4303 (WEX I83L)), EM QUE O AMINOÁCIDO NA POSIÇÃO 83 DA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS WEX É RESPECTIVAMENTE MUTADO

[0324] Conforme mostrado nos resultados da Tabela 32, todos os três tipos de cepas mutantes, em que o aminoácido na posição 83 da sequência de aminoácidos Wex é respectivamente substituído por um aminoácido hidrofóbico diferente, mostraram um melhoramento no rendimento de fermentação em 0,2% p a 0,7% p, em comparação com a cepa CA04-4306, à qual o Wex de tipo selvagem é introduzido. Em particular, como na cepa de proteção de L-triptofano de Corynebacterium glutamicum, a cepa de E. coli com uma mutação wex I83L também mostrou a maior melhoramento no rendimento da fermentação de L-triptofano, e esses resultados indicam que a substituição da isoleucina na posição 83 da sequência de aminoácidos Wex com um aminoácido hidrofóbico diferente pode aumentar significativamente a atividade da capacidade de exportação de L-triptofano do Wex em um microrganismo do gênero Escherichia, bem como em um microrganismo do gênero Corynebacterium.

[0325] A partir do que foi mencionado anteriormente, aqueles que são versados na técnica a quem a presente revelação se refere terá a capacidade de entender que a presente revelação pode ser incorporada em outras formas específicas sem modificar os conceitos técnicos ou características essenciais da presente revelação. Nesse aspecto, as modalidades exemplificativas reveladas no presente documento são apenas para propósitos ilustrativos e não devem ser interpretadas como limitantes do escopo da presente revelação. O escopo da presente revelação deve ser interpretado como incluindo o significado e escopo das seguintes reivindicações e todas as formas alteradas ou modificadas derivadas dos conceitos equivalentes das mesmas, em vez da descrição detalhada acima.

Claims (10)

1. Variante de proteína caracterizada por ter uma atividade de exportação de L-triptofano, em que um aminoácido selecionado a partir dos aminoácidos nas posições 79 a 83 em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 é substituído por um aminoácido diferente do aminoácido antes da substituição, e em que o aminoácido diferente é selecionado do grupo que consiste em glicina, metionina, alanina, valina, leucina e isoleucina.

2. Variante de proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o aminoácido diferente ser selecionado do grupo que consiste em metionina, alanina, valina, leucina e isoleucina.

3. Variante de proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o aminoácido diferente ser selecionado do grupo que consiste em glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina.

4. Variante de proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o aminoácido diferente ser selecionado do grupo que consiste em alanina, valina, leucina e isoleucina.

5. Variante de proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a variante de proteína compreender qualquer uma das sequências de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOS: 131 a 147.

6. Polinucleotídeo que codifica a variante de proteína, conforme definido na reivindicação 1, caracterizado por um códon selecionado dos nucleotídeos nas posições 235 a 249 em uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 ou sua sequência degenerada ser substituído por um códon que codifica um aminoácido diferente do aminoácido antes da substituição, e em que o aminoácido diferente é selecionado do grupo que consiste em glicina, metionina, alanina, valina, leucina e isoleucina.

7. Vetor recombinante caracterizado por compreender o polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 6.

8. Microrganismo que produz L-triptofano caracterizado por expressar a variante de proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5.

9. Microrganismo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o microrganismo pertencer ao gênero Corynebacterium ou ao gênero Escherichia.

10. Método para produzir L-triptofano caracterizado por compreender cultivar o microrganismo, de acordo com a reivindicação 8, em um meio e recuperar o L-triptofano do meio cultivado ou microrganismo cultivado.

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