CN104830824A - 一种d型水解酶的生产工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种D型水解酶的生产工艺，包括如下步骤：菌种培养--种子培养--发酵前准备--发酵--提取--纯化--成品。本发明通过菌种培养，发酵，纯化等得到的D型水解酶，纯度达到99%，生产成本低，工艺简单，反应条件温和，既简便又高效。

Description

一种D型水解酶的生产工艺
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种D型水解酶的生产工艺。
背景技术
D-色氨酸作为一种非蛋白光学活性氨基酸，具有特殊的生理学性质，在食品、饲料工业以及农业中均有一定的价值，可以作为非营养性甜味剂、饲料添加剂、植物生长剂。特别是在医药行业中，D-色氨酸是抗癌剂和免疫抑制剂的重要合成前体。
现有技术中，关于 D-色氨酸的制备方法主要有拆分法和生物法。其中，拆分法包括：1）膜拆分法，膜法拆分因具有快速方便、相对能量损失较低以及操作连续的优点，可以用来分离处理大量的消旋体；2）酶法拆分，有三种方法：a）酶促水解法，上海市生物化学研究所用高活力的固定化的酰化氨基酸水解酶拆分 DL-乙酰色氨酸；b）酶降解法，单孢菌属、肠杆菌属、变形杆菌属等类微生物产生的色氨酸酶能将DL-色氨酸消旋体中的L-色氨酸降解为吲哚、氨和丙酮酸；c）酰胺酶法，L-酰胺酶来源于红酵母细胞，它是L-型酰胺特异性水解酶，能选择性地将DL-色氨酸酰胺中的L-型降解为L-色氨酸。
生物法合成光学活性物质实质上就是利用微生物体内的酶，在新陈代谢过程中将合适的底物经过一系列反应转化成所需要的产物，故该法又称为酶法转化。生物法包括：
1）转氨酶法，枯草杆菌属等体内存在着 D- 氨基酸转移酶，它属枯草杆菌属、细菌等，与各种L-氨基酸氨基转移酶比较，D-氨基酸氨基转移酶最大的优点是对L-氨基酸完全没有作用；
2）海因酶法，海因酶（又称二氢嘧啶酶）是广泛存在于动植物组织中的一种水解酶，它不仅能水解打开二氢嘧啶环，并且还可以水解与二氢嘧啶结构类似的海因类化合物，中性的天然或非天然的氨基酸的海因都可作此酶的底物。
发明内容
发明目的：本发明提供一种D型水解酶的生产工艺，通过菌种培养，发酵，纯化等得到的D型水解酶，纯度达到99%，生产成本低，工艺简单，反应条件温和，既简便又高效。
技术方案：一种D型水解酶的生产工艺，包括如下步骤：菌种培养——种子培养——发酵前准备——发酵——提取——纯化——成品；
具体步骤如下：
（1）、菌种培养：菌种在实验室内进行斜面活化培养20-24h，培养温度为32℃；
（2）、种子培养：将活化的菌种接入种子培养基中，温度控制在32℃，通风比控制在1：1，流加碱水，控制PH在7.0-7.2，通过流加泡敌消泡，搅拌转速400r/min；
所述种子培养基的配比：葡萄糖40g/L，(NH4)2 4.0g/L，酵母浸膏粉6g/L，KH2PO4 1.0g/L，NgSO4 0.4g/L，MnSO4 0.01g/L，FeSO4 0.01g/L，玉米浆30ml，VB 300ug，VH 200ug，pH：7.0-7.2；
（3）、发酵前准备：发酵罐在温度123℃-125℃下空消30min-50min，然后注入纯净水，按种子培养基的配比配好培养基进行实消，温度123℃-125℃，时间为30min-50min；
（4）、发酵：将实消好的培养基降温至32℃-35℃，按10%-15%的比例接入种子发酵液，pH控制在7.0-7.2，通风比控制在1：1，搅拌转速40-60r/min，进行发酵20-24h；
（5）、提取：将发酵好的发酵液通过粗过滤、精过滤后，得到D型水解酶溶液粗酶液；
（6）、纯化：将粗酶液粉碎1h，配以3倍的乙醇得到沉淀物，离心去除上层液，得到湿品酶；
（7）、成品：将湿酶经过冷冻干燥得到成品D型水解酶，包装冷藏保存。
作为优化：所述步骤（1）中，菌种培养：菌种在实验室内进行斜面活化培养22h，培养温度为32℃。
作为优化：所述步骤（2）中，种子培养：将活化的菌种接入种子培养基中，温度控制在32℃，通风比控制在1：1，流加碱水，控制PH在7.1，通过流加泡敌消泡，搅拌转速400r/min。
作为优化：所述步骤（3）中，发酵前准备：发酵罐在温度124℃下空消40min，然后注入纯净水，按种子培养基的配比配好培养基进行实消，温度124℃，时间为40min。
作为优化：所述（4）中，发酵：将实消好的培养基降温至34℃，按13%的比例接入种子发酵液，pH控制在7.1，通风比控制在1：1，搅拌转速50r/min，进行发酵23h。
有益效果：本发明通过菌种培养，发酵，纯化等得到的D型水解酶，纯度达到99%，生产成本低，工艺简单，反应条件温和，既简便又高效。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述。
具体实施例一：
一种D型水解酶的生产工艺，包括如下步骤：菌种培养——种子培养——发酵前准备——发酵——提取——纯化——成品；
具体步骤如下：
（1）、菌种培养：菌种在实验室内进行斜面活化培养20h，培养温度为32℃；
（2）、种子培养：将活化的菌种接入种子培养基中，温度控制在32℃，通风比控制在1：1，流加碱水，控制PH在7.0，通过流加泡敌消泡，搅拌转速400r/min；
所述种子培养基的配比：葡萄糖40g/L，(NH4)2 4.0g/L，酵母浸膏粉6g/L，KH2PO4 1.0g/L，NgSO4 0.4g/L，MnSO4 0.01g/L，FeSO4 0.01g/L，玉米浆30ml，VB 300ug，VH 200ug，pH：7.0；
（3）、发酵前准备：发酵罐在温度123℃下空消30min，然后注入纯净水，按种子培养基的配比配好培养基进行实消，温度123℃，时间为30min；
（4）、发酵：将实消好的培养基降温至32℃，按10%的比例接入种子发酵液，pH控制在7.0，通风比控制在1：1，搅拌转速40r/min，进行发酵20h；
（5）、提取：将发酵好的发酵液通过粗过滤、精过滤后，得到D型水解酶溶液粗酶液；
（6）、纯化：将粗酶液粉碎1h，配以3倍的乙醇得到沉淀物，离心去除上层液，得到湿品酶；
（7）、成品：将湿酶经过冷冻干燥得到成品D型水解酶，包装冷藏保存。
具体实施例二：
一种D型水解酶的生产工艺，包括如下步骤：菌种培养——种子培养——发酵前准备——发酵——提取——纯化——成品；
具体步骤如下：
（1）、菌种培养：菌种在实验室内进行斜面活化培养24h，培养温度为32℃；
（2）、种子培养：将活化的菌种接入种子培养基中，温度控制在32℃，通风比控制在1：1，流加碱水，控制PH在7.2，通过流加泡敌消泡，搅拌转速400r/min；
所述种子培养基的配比：葡萄糖40g/L，(NH4)2 4.0g/L，酵母浸膏粉6g/L，KH2PO4 1.0g/L，NgSO4 0.4g/L，MnSO4 0.01g/L，FeSO4 0.01g/L，玉米浆30ml，VB 300ug，VH 200ug，pH：7.2；
（3）、发酵前准备：发酵罐在温度125℃下空消50min，然后注入纯净水，按种子培养基的配比配好培养基进行实消，温度125℃，时间为50min；
（4）、发酵：将实消好的培养基降温至35℃，按15%的比例接入种子发酵液，pH控制在7.2，通风比控制在1：1，搅拌转速60r/min，进行发酵24h；
（5）、提取：将发酵好的发酵液通过粗过滤、精过滤后，得到D型水解酶溶液粗酶液；
（6）、纯化：将粗酶液粉碎1h，配以3倍的乙醇得到沉淀物，离心去除上层液，得到湿品酶；
（7）、成品：将湿酶经过冷冻干燥得到成品D型水解酶，包装冷藏保存。
具体实施例三：
一种D型水解酶的生产工艺，包括如下步骤：菌种培养——种子培养——发酵前准备——发酵——提取——纯化——成品；
具体步骤如下：
（1）、菌种培养：菌种在实验室内进行斜面活化培养22h，培养温度为32℃；
（2）、种子培养：将活化的菌种接入种子培养基中，温度控制在32℃，通风比控制在1：1，流加碱水，控制PH在7.1，通过流加泡敌消泡，搅拌转速400r/min；
所述种子培养基的配比：葡萄糖40g/L，(NH4)2 4.0g/L，酵母浸膏粉6g/L，KH2PO4 1.0g/L，NgSO4 0.4g/L，MnSO4 0.01g/L，FeSO4 0.01g/L，玉米浆30ml，VB 300ug，VH 200ug，pH：7.0-7.2；
（3）、发酵前准备：发酵罐在温度124℃下空消40min，然后注入纯净水，按种子培养基的配比配好培养基进行实消，温度124℃，时间为40min；
（4）、发酵：将实消好的培养基降温至34℃，按13%的比例接入种子发酵液，pH控制在7.1，通风比控制在1：1，搅拌转速50r/min，进行发酵23h；
（5）、提取：将发酵好的发酵液通过粗过滤、精过滤后，得到D型水解酶溶液粗酶液；
（6）、纯化：将粗酶液粉碎1h，配以3倍的乙醇得到沉淀物，离心去除上层液，得到湿品酶；
（7）、成品：将湿酶经过冷冻干燥得到成品D型水解酶，包装冷藏保存。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种D型水解酶的生产工艺，其特征在于：包括如下步骤：菌种培养——种子培养——发酵前准备——发酵——提取——纯化——成品；
具体步骤如下：
（1）、菌种培养：菌种在实验室内进行斜面活化培养20-24h，培养温度为32℃；
（2）、种子培养：将活化的菌种接入种子培养基中，温度控制在32℃，通风比控制在1：1，流加碱水，控制PH在7.0-7.2，通过流加泡敌消泡，搅拌转速400r/min；
所述种子培养基的配比：葡萄糖40g/L，(NH4)2 4.0g/L，酵母浸膏粉6g/L，KH2PO4 1.0g/L，NgSO4 0.4g/L，MnSO4 0.01g/L，FeSO4 0.01g/L，玉米浆30ml，VB 300ug，VH 200ug，pH：7.0-7.2；
（3）、发酵前准备：发酵罐在温度123℃-125℃下空消30min-50min，然后注入纯净水，按种子培养基的配比配好培养基进行实消，温度123℃-125℃，时间为30min-50min；
（4）、发酵：将实消好的培养基降温至32℃-35℃，按10%-15%的比例接入种子发酵液，pH控制在7.0-7.2，通风比控制在1：1，搅拌转速40-60r/min，进行发酵20-24h；
（5）、提取：将发酵好的发酵液通过粗过滤、精过滤后，得到D型水解酶溶液粗酶液；
（6）、纯化：将粗酶液粉碎1h，配以3倍的乙醇得到沉淀物，离心去除上层液，得到湿品酶；
（7）、成品：将湿酶经过冷冻干燥得到成品D型水解酶，包装冷藏保存。
2.根据权利要求1所述的D型水解酶的生产工艺，其特征在于：所述步骤（1）中，菌种培养：菌种在实验室内进行斜面活化培养22h，培养温度为32℃。
3.根据权利要求1所述的D型水解酶的生产工艺，其特征在于：所述步骤（2）中，种子培养：将活化的菌种接入种子培养基中，温度控制在32℃，通风比控制在1：1，流加碱水，控制PH在7.1，通过流加泡敌消泡，搅拌转速400r/min。
4.根据权利要求1所述的D型水解酶的生产工艺，其特征在于：所述步骤（3）中，发酵前准备：发酵罐在温度124℃下空消40min，然后注入纯净水，按种子培养基的配比配好培养基进行实消，温度124℃，时间为40min。
5.根据权利要求1所述的D型水解酶的生产工艺，其特征在于：所述（4）中，发酵：将实消好的培养基降温至34℃，按13%的比例接入种子发酵液，pH控制在7.1，通风比控制在1：1，搅拌转速50r/min，进行发酵23h。
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