DE69225740T2

DE69225740T2 - Herstellung von L-Fucose-Dehydrogenase

Info

Publication number: DE69225740T2
Application number: DE69225740T
Authority: DE
Inventors: Ikunoshin Uji-Shi Kyoto-Fu Kato; Hirokazu Shiga-Ken Kotani; Masanori Tsuzuki-Gun Kyoto-Fu Mitta; Takeshi Hirosaki-Shi Aomori-Ken Sakai
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1991-03-29
Filing date: 1992-03-13
Publication date: 1999-02-11
Anticipated expiration: 2012-03-14
Also published as: US5217880A; DE69225740D1; EP0506262A1; JP3107847B2; EP0506262B1; JPH0538285A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine DNA, die genetische Informationen zur Herstellung von L-Fucosedehydrogenase trägt, neue Mikroorganismen (insbesondere neue Stämme von Escherichia coli), die ein Plasmid enthalten, in das die DNA integriert wurde und ein Verfahren zur Herstellung von L- Fucosedehydrogenase durch Verwendung des neuen Mikroorganismus.
L-Fucose findet man an den nichtreduzierenden Enden verschiedener Zuckerketten im Körper, wo sie die Antigenizität der Zuckerkette beeinflußt und an der Übertragung von Informationen teilnimmt. Sie wurde auch in Gerüstzuckern des Magenschleims und der Därme und im Fucoidan von Meeresalgen gefunden.
Eine Vielzahl von Komplexen mit L-Fucose ist in hohen Konzentrationen im Serum von Patienten mit bösartigen Erkrankungen enthalten (Cancer Research, 37, Seiten 4101-4103, 1977), und der Grad der im Urin frei vorliegenden L-Fucose ist bei Patienten mit Zirrhose oder bösartigen Erkrankungen hoch (Clinical Chemistry, 36, Seiten 474-476, 1990). Durch Messung von L-Fucose in einer Vielzahl von Proben, wie Urin, Serum und Schleim, ist es möglich, Informationen über die Änderung im Metabolismus von L-Fucose im Körper und bei bestimmten Erkrankungen zu erhalten. L-Fucose kann biochemisch durch HPLC und enzymatische Verfahren bestimmt werden. Das schnellste und einfachste Verfahren ist ein enzymatisches Verfahren unter Verwendung von L-Fucosedehydrogenase.
L-Fucosedehydrogenase wurde von Pseudomonas (Journal of Biological Chemistry, 240, Seiten 4493-4497, 1965), Schweineleber (Journal of Biological Chemistry, 244, Seiten 4785-4792, 1969), Pseudomonas (Agricultural and Biological Chemistry, 39, Seiten 2227-2234, 1975), Schafsleber (Archives of Biochemistry and Biophysics, 139, Seiten 83-86, 1970), Kaninchenleber (Journal of Biochemistry, 86, Seiten 1559-1565, 1979), Pullularia (Canadian Journal of Microbiology, 30, Seiten 753-757, 19841, Corynebacterium (US-A-4 927 753) und wiederum Pseudomonas (Agricultural and Biological Chemistry, 53, Seiten 1493-1501, 1989) erhalten. L-Fucosedehydrogenase ist ein sehr brauchbares Enzym, das in breitem Maße zur Bestimmung von L-Fucose verwendet wird (Agricultural and Biological Chemistry, 39, Seiten 2227-2234, 1975, und Journal of Biochemistry, 86, Seiten 1559-1565, 19791.
Verfahren zur Reinigung von L-Fucosedehydrogenase aus der Leber von Säugern sind nicht sehr praktikabel, aufgrund der geringen Mengen und geringen Ausbeuten, die erhalten werden. Verfahren, bei denen Mikroorganismen zur Herstellung von L-Fucosedehydrogenase gezüchtet werden, erfordern die Induktion der enzymatischen Produktion von kostspieligen Zuckern, wie L-Fucose und D-Arabinose. Somit ist ein kostengünstigeres Verfahren zur Herstellung von L-Fucosedehydrogenase erwünscht.
L-Fucosedehydrogenase ist weit verbreitet, wobei man es in Hepatozyten, Bakterien, Actinomyceten und Basidiomyceten findet und es gibt, wie vorstehend erwähnt, eine Vielzahl von veröffentlichten Verfahren für ihre enzymatische Reinigung. Die Struktur des Gens, das für L-Fucosedehydrogenase codiert, ist jedoch unbekannt, wie auch die Aminosäuresequenz dieses Enzyms, so daß es keine bekannten Verfahren zur Herstellung von L-Fucosedehydrogenase durch Gentechnik gibt.
Die Erfindung kann ein isoliertes Gen von L-Fucosedehydrogenase, neue Mikroorganismen (insbesondere neue Stämme von Escherichia coli), die ein Plasmid beherbergen, das das L-Fucosedehydrogenasegen trägt, und eine geeignete industrielle Herstellung der L-Fucosedehydrogenase und ein Verfahren zur Herstellung von L-Fucosedehydrogenase durch Verwendung des neuen Mikroorganismus bereitstellen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Polypeptid bereit, das L-Fucosedehydrogenaseaktivität besitzt und die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 3 aufweist. Im zweiten Aspekt stellt die Erfindung eine DNA-Sequenz nach Anspruch 2 bereit, die ein Polypeptid, das L-Fucosedehydrogenaseaktivität besitzt, codiert. Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids bereit, das L-Fucosedehydrogenaseaktivität besitzt.
Nachstehend wird die Erfindung im einzelnen erläutert.
Bekannte nachstehende Verfahren können zum Klonen von DNA verwendet werden, die für L-Fucosedehydrogenase codiert.
Zunächst kann beispielsweise DNA aus Mikroorganismen isoliert werden, die dieses Enzym erzeugen können. Die erhaltene DNA kann mit Restriktionsenzymen geschnitten werden, die erhaltenen DNA-Fragmente können mit Plasmiden oder einem Phagenvektor ligiert werden, und die ligierten Fragmente können zur Herstellung einer DNA-Genbank in Wirtszellen eingebaut werden.
Zum Absuchen von Klonen, die ein für L-Fucosedehydrogenase codierendes Gen enthalten, das aus dieser DNA-Genbank zu suchen ist, sollte zunächst ein Teil der Aminosäuresequenz von L-Fucosedehydrogenase identifiziert werden und dann diese Sequenz mit einem DNA-Synthesizer synthetisiert werden. Zur Identifizierung der Aminosäureteilsequenz sollte zunächst gereinigte L-Fucosedehydrogenase mit einer Protease hydrolysiert werden, die für einen bestimmten Aminosäurerest hochspezifisch ist und die erhaltenen hydrolysierten Peptide sollten durch Umkehrphasen-HPLC isoliert werden. Die Aminosäuresequenzen dieser Peptide werden durch Edman-Abbau identifiziert. Es gibt zwei Verfahren, durch die eine synthetische DNA-Sonde auf Grundlage dieser Aminosäuresequenzen konstruiert werden kann. Bei einem Verfahren können alle diese Sequenz-Kombinationen synthetisiert werden. Bei dem anderen Verfahren können lange Oligonucleotide unter Verwendung der Codone hoher Häufigkeit, die bislang identifiziert wurden, synthetisiert werden.
Bei dem Verfahren zum Absuchen der Genbank mit einer DNA- Sonde wird zunächst Plattieren ausgeführt und die gewachsenen Kolonien oder Plaques werden auf einen Nitrocellulose- oder Nylonfilter übertragen und die DNA wird denaturiert und an dem Filter fixiert. Der Filter wird in eine Lösung inkubiert, die eine DNA-Sonde enthält, welche mit 32P markiert ist und die an den Filter fixierte DNA hybridisiert mit der Sonden-DNA (nachstehend wird dieser Schritt "Hybridisierung" genannt). Die Inkubationstemperatur sollte bei etwa der Schmelztemperatur, Tm, der Sonde liegen. Nach der Hybridisierung werden nicht spezifisch gebundene Stoffe durch Waschen entfernt und Klone, mit denen die Sonde hybridisierte, wurden durch Autoradiographie identifiziert. Klone wurden durch dieses Verfahren in wiederholter Weise isoliert und wie nachstehend analysiert.
Wenn die Rekombinanten Escherichia coli-Zellen waren, wurden sie in kleinem Maßstab in Reagenzröhrchen oder dergleichen gezüchtet und die Plasmide wurden durch übliche Verfahren extrahiert und durch Restriktionsenzyme geschnitten, bevor sie durch Agarose oder Acrylamidgelelektrophorese untersucht wurden, um geklonte Insertionsfragmente, die erzeugt worden sind, aufzufinden. Die elektrophoretischen Muster wurden auf Nitrocellulose- oder Nylonmembran übertragen und wie vorstehend beschrieben hybridisiert, bevor sie geprüft wurden, um herauszufinden, ob Insertionsfragmente mit der DNA-Sonde hybridisiert hatten. Beim Schlußschritt wurde die Grundsequenz der Insertionsfragmente durch bekannte Verfahren identifiziert. Wenn die Rekombinanten Phagen waren, erfolgte Analyse der Klone durch grund sätzlich dieselben Schritte. Geklonte Phagen wurden verwendet, um gezüchtete Wirtszellen E. coli zu infizieren und Phagen-DNA wurde aus der Kulturbrühe erhalten. Einzelheiten zu dem Verfahren zur Reinigung der Phagen-DNA sind beispielsweise in Course in Biochemical Experimentation Band 1, wie "Method II for genetic research", von Seite 100 (Tokyo Kagaku Dojine Co., Ltd., Tokio), 1986, angeführt. Wie dort beschrieben, werden Phagen in Kultur wachsen lassen und nach Reinigen wird ihre DNA isoliert und gereinigt, und die erhaltene Phagen-DNA wird mit Restriktionsenzymen geschnitten und durch Gel-Elektrophorese getrennt, um Insertionsfragmente aufzufinden. Hybridisierung mit Sonden-DNA wird zum Suchen eingesetzt. Schließlich wird die Grundsequenz der Insertionsfragmente identifiziert, um hinsichtlich Klonen zu prüfen.
Aus der Grundsequenz wird die Primärstruktur von L-Fucosedehydrogenase geschlußfolgert und die Analyse des N-Terminus, die Aminosäurezusammensetzung, die Teilaminosäuresequenzen und das Molekulargewicht der gereinigten L-Fucosedehydrogenase kann hergenommen werden, um die Struktur des Gens und die Sequenz der Aminosäuren dieses Enzyms herauszufinden.
Es ist möglich, das Strukturgen für L-Fucosedehydrogenase, das in dieser Weise erhalten wird, in geeignete Wirtszellen, wie E. coli-Zellen, die dieses Enzym exprimieren können, durch Ligation des Strukturgens mit einem Expressionsvektor und durch seine Einführung in die Wirtszellen zu inserieren, durch ihre Züchtung ist es möglich, Polypeptide mit L-Fucosedehydrogenaseaktivität zu erzeugen.
Die gewünschte Expression kann hinsichtlich der Messung von L- Fucosedehydrogenaseaktivität geprüft werden. Beispielsweise kann in einem Assaygemisch für L-Fucosedehydrogenase, das L-Fucose und β-Nicotinamidadenindinucleotid (NAD+) enthält, ein Zellextrakt von rekombinanten E. coli- Zellen oder dergleichen zugegeben werden. Die Reduktion von NAD+ zu diesem Zeitpunkt kann als zusätzliche Absorption bei 340 nm gemessen werden, beispielsweise gemessen mit einem Spektrometer, aus dessen Ergebnis die Aktivität von L-Fucosedehydrogenase berechnet werden kann.
L-Fucosedehydrogenase kann durch Chromatographie von Transformanten gereinigt werden. Die gezüchteten Zellen können aufgebrochen werden und der Überstand kann erhalten werden. Dieser Überstand kann durch Ionenaustausch-Chromatographie, Gelfiltration, hydrophobe Chromatographie usw. zu dem gewünschten Peptid behandelt werden.
Wie vorstehend beschrieben, stellt diese Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung von L-Fucosedehydrogenase durch Gentechnik bereit, wobei die Primärstruktur und die Aminosäuresequenz davon hierin offenbart werden.
Anschließend wird die Erfindung des weiteren mit Hinweis auf die nachstehenden Beispiele beschrieben, jedoch ist diese Erfindung nicht als auf diese Beispiele begrenzt aufzufassen.
Fig. 1 zeigt die Restriktionskarte von BamHI-EcoRI-Fragment, 2,7 kB und die Lage des Gens, das für L-Fucosedehydrogenase codiert.

Beispiel 1. Klonen von Strukturgen von L-Fucosedehydrogenase

Isolierung und Reinigung von genomer DNA:

Zunächst wurden Zellen von Arthrobacter oxidans F1 (hinterlegt am Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, unter der Zugangsnummer FERM BP-3674), die viel L-Fucosedehydrogenaseaktivität erzeugen, verwendet, um 750 ml Kulturbrühe von 0,5% Hefeextrakt, 1,0% Pepton, 0,3% KH&sub2;PO&sub4; und 0,1% MgSO&sub4;·7H&sub2;O, bei pH 7,0, zu inokulieren und wurden bei 30ºC 24 Stunden gezüchtet. Die Kulturbrühe wurde dann zentrifugiert, um die Zellen zu ernten, die dann in 10 ml Lysozympuffer suspendiert wurden (100 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 20 mg/ml Lysozym, pH 7,0) und die Suspension wurde für 30 Minuten bei 0ºC gehalten. Zu der Suspension wurden 5 ml Extraktionspuffer (50 mM Tris-HCl, 0,5% SDS, 0,1M EDTA und 1 mg/ml Proteinase K, pH 7,5) gegeben und das Gemisch wurde 2 Stunden bei 50ºC gehalten. Zu dem Gemisch wurde dasselbe Volumen Phenol, gesättigt mit TE-Puffer (10 mM Tris-HCl und 1 mM EDTA, pH 8,0) gegeben und das Gemisch wurde vorsichtig gerührt und 15 Minuten bei 3000 U/min zentrifugiert. Die obere Schicht wurde gesammelt. Nachstehend wird dieses Verfahren "Phenolextraktion" genannt. Die obere Schicht wurde gegen TE-Puffer dialysiert und Ribonuclease A wurde zu der Endkonzentration von 20 ug/ml gegeben. Das Gemisch wurde bei 37ºC für 1 Stunde inkubiert, Phenolextraktion wurde ausgeführt und Dialyse gegen TE- Puffer wurde wiederholt. Durch die nachstehend beschriebenen Schritte wurden 10 mg Genom-DNA erhalten.

Herstellung einer DNA-Genbank

Einige 30 ug der erhaltenen genomen DNA wurden mit 250 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRl bei 37ºC für 6 Stunden aufgeschlossen und die 10 pg des Aufschlusses (Verdau) entsprechende Menge wurde mit 0,7% Agarosegelelektrophorese behandelt. Nach der Elektrophorese wurde Southern-blotting (Methode II für Genetic Research II, vorstehend, Seiten 218-221) ausgeführt, um die DNA auf eine Nylonmembran (Hybond-N&spplus;, Amersham) zu übertragen.
Ein Teil der Aminosäuresequenz von L-Fucosedehydrogenase wurde deduziert und die als Sequenz SEQ ID Nr. 1 in den Sequence Listing gezeigte 20-Basen-Sequenz wurde mit einem DNA-Synthesizer zur Verwendung als Hybridisierungssonde synthetisiert.
Zur Identifizierung einer Teilaminosäuresequenz wurden 5 nMol der erhaltenen, gereinigten L-Fucosedehydrogenase für A. oxidans mit 50 pMol Proteasetrypsin 15 Stunden bei 37ºC aufgeschlossen und der Verdau wurde getrennt und durch HPLC mit einer Butylkieselgelsäule gereinigt und die Sequenz einiger Fraktionen wurde mit einem Gasphasen-Peptidsequenzer (Applied Bio-Systems 477A) identifiziert. Die identifizierte Aminosäuresequenz war jene, die als Sequenz SEQ ID Nr. 2 in dem Sequence Listing angeführt ist.
Anschließend wurden 50 ng der synthetisierten DNA mit 32P mit einem Megalabel Kit (Takara Shuzo) markiert. Die Gesamtheit der erhaltenen Sonde wurde über Nacht bei 55ºC zur Hybridisierung in etwa 20 ml einer Lösung, die 6 · SSC (1 · SSC enthält 8,77 g NaCl und 4,41 g Natriumcitrat auf einem gesamten Volumen von 1 Liter), 1% SDS, 100 4ug/ml Heringsperma DNA, 5 · Denhardt's (Rinderserumalbumin), Poly(vinylpyrrolidon) und Ficoll, enthielt (jeweils bei einer Konzentration von 0,1%) inhibiert, unter Verwendung des Filters, der wie vorstehend beschrieben hergestellt wurde. Dann wurde der Filter bei Raumtemperatur in 6 · SSC für 10 Minuten gewaschen und zweimal bei 50ºC in 2 · SSC, das 0,5% SDS enthielt, für 10 Minuten gewaschen. Nach Entfernen von überschüssigem Wasser wurde der Filter zur Autoradiographie über Nacht bei -70ºC mit Verstärkerschirm verwendet. Sondenhybridisierung wurde bei der Position einer Größe von etwa 5 kB gefunden.
Einige 20 ug der verbliebenen DNA, die mit EcoRl aufgeschlossen wurden, wurden mit 0,7% Agarosegelelektrophorese behandelt und die Region, entsprechend einer Größe von 4,4 bis 6,6 kB, wurde ausgeschnitten, extrahiert und mit EASYTRAP Kit (Takara Shuzo) gereinigt. Die Hälfte der erhaltenen DNA-Fragmente wurde mit 0,5 ug λgt11-EcoRl-Armen (Stratagene) vermischt und Ligierung wurde mit einem Ligationskit (Takara Shuzo) ausgeführt, gefolgt von Verpacken mit einem Gigapack Gold Kit (Stratagene), unter Gewinnung einer Genbank.

Identifizierung und Isolierung von positiven Klonen:

Mit E. coli Y1090 als Hostzellen wurde die DNA-Genbank von A. oxidans in fünf rechteckige Platten mit den Abmessungen von 14 · 10 cm so plattiert, daß etwa 400 Plaques auf jeder Platte wuchsen. Um dies auszuführen, wurden E. coli-Zellen Y1090 über Nacht bei 37ºC in L-Brühe mit 0,4 mg/ml Maltose gezüchtet. Dann wurden 0,2 ml dieser Kulturbrühe mit 0,1 ml der Phagenlösung vermischt und das Gemisch wurde 15 Minuten bei 37ºC inkubiert. Dazu wurden 8 ml Weichagar (L-Medium, das zu Agarose zu einer Endkonzentration von 0,6% zugegeben und dann autoklaviert wurde, nachdem das Gemisch bei 50ºC gehalten wurde) gegeben, und das Gemisch wurde auf rechteckigen Platten auf dem Oberen von L-Medium verteilt und abkühlen lassen, wonach die Platten bei 37ºC zur Bildung von Phagenplaques (nachstehend wird dieses Verfahren als "Plattieren" bezeichnet) 10 Stunden gehalten wurden.
Danach wurden aus jeder dieser Platten zwei Hybridisierungsfilter hergestellt. Um dies auszuführen, wurde eine Nylonmembran auf der Oberfläche der Platte 30 Sekunden angeordnet und die Membran wurde dann auf Papier, das in eine Lösung von 0,5M NaOH und 1,5M NaCl für 5 Minuten (zur Denaturierung) getaucht wurde, und auf Papier, das in einen Puffer von 0,5M Tris-HOI (pH 7,0) getaucht wurde, das 1,5M NaCl enthielt (zur Neutralisation) angeordnet. Die Membran wurde dann in 2 · SSC gewaschen (nachstehend wird dieses Verfahren als "Filterbehandlung" bezeichnet). Für den zweiten Filter betrug die Kontaktzeit zwischen der Platte und der Nylonmembran 2 Minuten. Diese Filter wurden unter denselben Bedingungen behandelt wie vorstehend zur Hybridisierung beschrieben und 65 positive Signale wurden gefunden.
Unter diesen Signalen wurden vier geeignete Plaques, die den Signalen entsprachen, selektiert und wurden aus dem Agar in 0,2 ml SM-Lösung gewonnen (die aus 5,8 g NaCl, 2 g MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 50 ml 1 M Tris-HCl- Puffer, pH 7,5, und 5 ml 2% Gelatine, gelöst in Wasser und aufgefüllt auf ein Gesamtvolumen von 1 Liter, hergestellt wurde). Eine Suspension wurde hergestellt und die Suspension wurde geeigneterweise verdünnt und durch das vorstehend beschriebene Verfahren zu etwa 300 Plaques in runden Schalen mit einem Durchmesser von 9 cm plattiert. Es war möglich, einzelne Plaques unter den vier Plaques zu isolieren. Diese Klone wurden λFDHF1-F4 genannt.

Herstellung von λ-DNA:

Flüssige Kultur von E. coli Y1090-Zellen als Hostzellen für die geklonten Phagen wurden hergenommen, um Phagen-DNA herzustellen (Verfahren II für Genetic Research, vorstehend, Seite 100). Um dies auszuführen, wurde die Phagenlösung verwendet, um Wirtszellen zu infizieren, die Zellen wurden aufgebrochen und Polyethylenglycol 6000 und NaCl wurden zu dem Kulturüberstand gegeben und die Phagenteilchen wurden durch Fällung gesammelt. Diese Phagenteilchen wurden in TE-Puffer suspendiert und mit Phenol extrahiert, zu gereinigter Phagen-DNA. Aus 100 ml Kulturbrühe wurden etwa 100 pg DNA erhalten.

Identifizierung von Insertionsfragmenten und deren Isolation und Reinigung:

Ein 10 ug-Teil von jeder der wie vorstehend hergestellten DNA wurde mit 50 Einheiten EcoRl für 2 Stunden aufgeschlossen. Dann wurden 1/20 dieses Reaktionsgemisches durch Elektrophorese an 1,0% Agarosegel behandelt und die Insertionsfragmente wurden identifiziert. Es wurde gefunden, daß λFDHF1-F4 alle geklont waren und daß ein Fragment mit einer Länge von 5,3 kB in jedes inseriert wurde.
Anschließend wurde das übrige Reaktionsgemisch von EcoRl-Aufschluß durch Elektrophorese an 1,0% Agarosegel behandelt und die Teile des Gels, das das gewünschte Insertionsfragment enthielt, wurden ausgeschnitten und mit EASYTRAP Kit extrahiert.

Identifizierung der Restriktionsstellen der Insertionsfragmente:

Die erhaltenen Insertionsfragmente wurden mit einer Vielzahl von Restriktionsenzymen aufgeschlossen und die Aufschlußprodukte wurden mit Elektrophorese behandelt. Die Elektrophoresemuster der geschnittenen Fragmente wurden analysiert. BamHl-, Sphl-, Pstl- und Sall-Stellen wurden als Restriktionsstellen gefunden. Southern-blotting wurde verwendet, um DNA aus dem Agarosegel auf eine Nylonmembran (Amersham) zu übertragen, und Hybridisierung wurde ausgeführt, um herauszufinden, welche geschnittenen Fragmente für L-Fucosedehydrogenase codieren. Das gewünschte Fragment wurde in jedem der vier Klone als 2,7 kB-DNA-Fragment, geschnitten aus einem 5,3 kB-Insertionsfragment mit BamHl, identifiziert.

Identifizierung der Basenseguenz:

Das 2,7 kB-BamHl-EcoRl-Fragment aus λFDHF1 wurde isoliert und wie vorstehend beschrieben gereinigt. Anschließend wurde es mit einem DNA Blunting-Kit (Takara Shuzo) behandelt, um ihm glatte Enden zu verleihen und wurde in die Hinchl-Stelle von M13mp19RF-DNA geklont.
Die rekombinante M13mp19RF-DNA wurde mit Xbal und Sacl aufgeschlossen, und die Mutanten wurden durch das Exonuclease III-Verfahren (Method for Genetic Research, Seiten 186-200) hergestellt, wobei etwa 300 Bp von der Xbal-Stelle deletiert wurden. Deletionsmutanten wurden in derselben Weise aus rekombinanter M13mp19RF-DNA, die das Insertionsfragment mit entgegengesetzter Orientierung inseriert enthielt, hergestellt. Dann wurden E. coli JM109-Zellen mit den anderen M13mp19-Derivat-DNA transformiert. Einsträngige DNA aus M13mp19-Derivaten wurden hergestellt und die Basensequenz eines 2,7 kB BamHl-EcoRl-Fragments wurde durch das Didesoxy-Verfahren identifiziert. Ein offener Leserahmen mit einer Länge von 966 Bp wurde in dem Fragment gefunden. Die vor dem Trypsinverdau von L-Fucosedehydrogenase identifizierten Sequenzen wurden alle für diesen offenen Leserahmen codiert. In dieser Weise wurde die vollständige Basensequenz, die für L-Fucosedehydrogenase codierte und die primäre Sequenz des Enzyms identifiziert. Fig. 1 zeigt die Restriktionskarte des 2,7 kB BamHl-EcoRl-Fragments und die Lage des Gens, das für L-Fucosedehydrogenase codiert und die Sequenz von SEQ ID Nr. 3 in dem Sequence Listing zeigt die vollständige Basensequenz des 2,7 kB-Fragments, das die Basensequenz enthält, welche für L-Fucosedehydrogenase codiert und die Aminosäuresequenz von L-Fucosedehydrogenase, die nachstehend angeführt ist.

Beispiel 2. Konstruktion eines Plasmids, das das L-Fucosedehydrogenasepeptid exprimiert.

Aus den M13mp19-Derivaten, für die die Basensequenz identifiziert wurden, wurde das Derivat, dem die Sequenz bis zum Rest 32 stromaufwärts des Startcodons für den L-Fucosedehydrogenasebereich fehlt, erhalten. Dieses Derivat hatte die Basensequenz, die als Sequenz SEQ ID Nr. 4 in dem Sequence Listing dargestellt ist, ausgehend bei der EcoRl-Stelle in der Multiklonstelle von M13mp19, nämlich der Sequenz 5' -GAA TTC GGG ACA GGC CCC CAA CCA GGA GAA AGA CTG ATC -3', von dem Startcodon ATG stromaufwärts. Die Sequenz GAA TTC G am 5'-Ende ist von M13mp19 und der Rest der Sequenz stammt aus der genomen DNA von A. oxidans. Diese EcoRl-Stelle und die Scal-Stelle stromabwärts des L-Fucosedehydrogenase gens wurden gespalten, unter Bereitstellung eines Fragments von etwa 1100 Bp Länge. Dem Fragment wurden glatte Enden unter Verwendung eines DNA Blunting-Kit verliehen. Plasmid pTV119 N (Takara) wurde an der Ncol-Stelle unter Verwendung eines Vektors geschnitten, und die Enden wurden unter Verwendung eines DNA Blunting-Kit glattgemacht. Dann wurde das vorstehend hergestellte Fragment inseriert, unter Bereitstellung von pTFDH 101- Plasmid. Dieses Plasmid codiert für ein Polypeptid, das den N-Terminus 322 Aminosäuren von L-Fucosedehydrogenase plus der Sequenz von 14 Aminosäuren, dargestellt als Sequenzen SEQ ID Nr. 5 in dem Sequence Listing aufwies. Das Plasmid pTFDH101 wurde in E. coli JM109-Zellen eingeführt und die erhaltenen Zellen wurden E. coli JM109/pTFDH101-Zellen bezeichnet.
Anschließend wurde das Plasmid pTFDH101 in E. coli GM33-Zellen ohne dam-Methylase inseriert und die Rekombinanten wurden gezüchtet und Plasmid-DNA wurde aus ihnen hergestellt. Diese Plasmid-DNA wurde mit den Restriktionsenzymen Ncol und Fbal geschnitten. In Anwesenheit von dCTP wurde Klenow-Fragment verwendet, um eine Base zu addieren und die Enden wurden mit S1-Nuclease glattgemacht. Die erhaltenen Fragmente ergaben Plasmid pTFDH213 durch Selbstligation. Dieses Plasmid exprimiert direkt das Polypeptid mit 322 Aminosäuren von L-Fucosedehydrogenase, dargestellt in SEQ ID Nr. 3 im Sequence Listing.
pTFDH213 wurde in E. coli JM109-Zellen eingeführt und die erhaltenen Zellen wurden E. coli JM109/pTFDH213 bezeichnet und beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, hinterlegt unter der Zugangsnummer FERM BP-3675.

Beispiel 3. Expression von L-Fucosedehydrogenasepeptid durch E. coli.

Wie in Beispiel 2 vorstehend beschriebene Zellen von entweder E. coli JM109/pTFDH101 oder E. coli JM109/pTFDH213 wurden zum Inokulieren von 5 ml L-Medium, enthaltend 100 ug/ml Ampicillin, verwendet, welches bei 37ºC in Schüttelkultur gezüchtet wurde. Wenn das Absorptionsvermögen (Extinktion) O. D.&sub6;&sub0;&sub0; von 0,5 erreichte, wurde Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranosid zu einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben und das Gemisch wurde über Nacht bei 37ºC inkubiert. Dann wurden diese Zellen durch Zentrifugieren der Kulturbrühe geerntet und in 20 ml 50 mM Phosphatpuffer, pH 8,0, suspendiert. Die Zellen wurden durch Ultraschallbehandlung aufgebrochen und zentrifugiert. Der Überstand wurde erhalten und Zellextrakt genannt. Die L-Fucosedehydrogenaseaktivität des Zellextrakts wurde wie nach stehend bestimmt. Das Reaktionsgemisch des erhaltenen Assays enthielt 1,0 ml 30 mM L-Fucose, 5 mM KH&sub2;PO&sub4; in 1,8 ml eines Puffers von Glycin-Natriumhydroxid (pH 8,0), 0,1 ml 15 mM NAD und 0,1 ml des Zellextrakts, geeigneterweise verdünnt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 37ºC 10 Minuten gehalten und dann seine Extinktion bei 340 nm gemessen (diese wurde O. D.- Probe genannt). Als Kontrolle wurde 0,1 ml destilliertes Wasser anstelle des Zellextrakts verwendet und das Absorptionsvermögen der Extinktion dieses Gemisches wurde gemessen (dies wurde O. D. der Blindprobe genannt).
Die L-Fucosedehydrogenaseaktivität wurde als ΔO. D.340 berechnet, nämlich O. D. der Probe minus O. D. der Blindprobe, wie in nachstehender Gleichung I gezeigt.
wobei 6,22 der millimolare Extinktionskoeffizient von NADH bei 340 nm ist, d die Länge des Lichtwegs (cm) ist und df die Verdünnung bezeichnet.
Die Bestimmung zeigte, daß 20 ml des vorstehend hergestellten Zellextrakts etwa 30 Einheiten L-Fucosedehydrogenaseaktivität hatten. Wenn E. coli JM109-Zellen, die nicht das Plasmid tragen, in derselben Weise behandelt wurden, wurde keine L-Fucosedehydrogenaseaktivität nachgewiesen.
Wie vorstehend beschrieben, offenbart die Erfindung die Aminosäuresequenz von L-Fucosedehydrogenase und die Basensequenz, die für dieses Enzym codiert und liefert auch ein bequemes Verfahren, durch das das L-Fucosedehydrogenasepolypeptid industriell durch die Verfahren der Gentechnik hergestellt werden kann. Mit dieser Erfindung ist es nicht erforderlich, L-Fucose zu verwenden, um das Enzym zu induzieren und die Produktivität ist hoch. Außerdem ist es durch Konstruktion einer Sonde und eines Primers auf Grundlage dieser Basensequenz möglich, L-Fucosedehydrogenase zu bestimmen und das Ausmaß seiner Expression zu bewerten. Mit dieser Erfindung ist es auch möglich, Antikörper auf der Grundlage der Aminosäuresequenz des Enzyms zu erzeugen.
Sequence Listing
SEQ ID NR.: 1
SEQUENZLÄNGE: 20
SEQUENZART: Nucleinsäure
STRÄNGIGKEIT: einzeln
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: andere Nucleinsäure (synthetische DNA)
HYPOTHETISCH: nein
ANTISENSE: nein
MERKMAL: 1-20 E Sonde
SEQUENZBESCHREIBUNG:
TGGGGNGCNG GNATGAAYCA 20
SEQ ID NR.: 2
SEQUENZLÄNGE: 7
SEQUENZTYP: Aminosäure
STRÄNGIGKEIT: einzeln
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLART: Peptid
FRAGMENTTYP:
Innenfragment (L-Fucosedehydrogenase)
HERKUNFT: Arthrobacter oxidans
SEQUENZBESCHREIBUNG:
Trp Gly Ala Gly Met Asn Gln
SEQ ID NR.: 3
SEQUENZLÄNGE: 2682
SEQUENZART: Nucleinsäure
STRÄNGIGKEIT: doppelt
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLART: Genom-DNA
HERKUNFT: Arthrobacter oxidans
MERKMAL:
844-1809 E CDS (L-Fucosedehydrogenase)
SEQUENZBESCHREIBUNG:
SEQ ID NR.: 4
SEQUENZLÄNGE: 39
SEQUENZART: Nucleinsäure
STRÄNGIGKEIT: doppelt
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLART: Genom-DNA
HERKUNFT: M13mp19 DNA, die Arthrobacter oxidans Genom-DNA trägt
MERKMAL:
1-7 E M13mp19 DNA
8-39 E Arthrobacter oxidans Genom-DNA
SEQUENZBESCHREIBUNG:
GAATTCGGGA CAGGCCCCCA ACCAGGAGAA AGACTGATC 39
SEQ ID NR.: 5
SEQUENZLÄNGE: 14
SEQUENZART: Aminosäure
STRÄNGIGKEIT: einzeln
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLART: Peptid
SEQUENZBESCHREIBUNG:

Claims

1. Polypeptid, das L-Fucose-Dehydrogenase-Aktivität besitzt und die Aminosäuresequenz der SEQ. ID Nr. 3 aufweist.

2. DNA, umfassend

(a) die DNA-Sequenz der SEQ ID Nr. 3 oder ein Fragment davon;

(b) eine DNA-Sequenz, welche die Aminosäure Sequenz der SEQ ID Nr. 3 oder ein Fragment davon kodiert; oder

(c) eine DNA-Sequenz, welche zur Hybridisierung mit irgendeiner von (a) bis (b) fähig ist,

wobei die DNA eine Sequenz aufweist, welche ein Polypeptid kodiert, das L-Fucose-Dehydrogenase-Aktivität besitzt.

3. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das L-Fucose-Dehydrogenase-Aktivität besitzt, welches Kultivieren von Escherichia coli, ein rekombiniertes Plasmid enthaltend, das eine DNA gemäß Anspruch 2 trägt, um das Polypeptid, welches L-Fucose-Dehydrogenase-Aktivität besitzt, herzustellen, und Gewinnen des Polypeptids aus der Kultur umfaßt.