JPH0538285A - ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ及びその塩基
配列、及びその工業的に有利な遺伝子工学的製造方法を
提供する。 【構成】 配列表の配列番号１で表される３２２個のア
ミノ酸の配列を有するＬ−フコースデヒドロゲナーゼ活
性を持つポリペプチド、それをコードする塩基配列、及
び組換え体プラスミドを導入させた形質転換体を培養す
る該ポリペプチドの製造方法。大腸菌による発現を確認
し、寄託している。 【効果】 この塩基配列を基にプローブやプライマーを
作成することや、アミノ酸配列を基に抗体を作成するこ
とが可能となった。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はＬ−フコースデヒドロゲ
ナーゼのアミノ酸配列を有するポリペプチド及びその塩
基配列と製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】Ｌ−フコースは生体内の複合糖鎖の非還
元末端に存在してその物質の抗原性や情報伝達に関与す
るなどの機能を持つほか、胃、腸粘液や海藻フコイダン
の構成糖としても存在する。また、悪性疾患々者の血清
中の結合型Ｌ−フコースが増加するという報告〔キャン
サー リサーチ( Cancer Research ) 、第３７巻、第４
１０１〜４１０３頁（１９７７）〕や、肝硬変、悪性疾
患々者において尿中遊離型Ｌ−フコースが増加するとい
う報告〔クリニカル ケミストリー( Clinical Chemist
ry )、第３６巻、第３号、第４７４〜４７６頁（１９９
０）〕もある。つまり、尿、血清、粘液など様々な試料
中のＬ−フコースを測定することにより、病態や生体内
でのＬ−フコースの代謝変化などの情報が得られる。Ｌ
−フコースの測定方法は化学法やＨＰＬＣによる方法、
酵素法等があるが、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼを用
いた酵素法が最も迅速簡便である。Ｌ−フコースデヒド
ロゲナーゼとしてはシュードモナド( Pseudomonad ) 由
来〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー
（ Journal of BiologicalChemisry )、第２４０巻、第
１１号 第４４９３〜４４９７頁（１９６５）〕、ブタ
肝臓由来〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミス
トリー、第２４４巻、第４７８５〜４７９２頁（１９６
９）〕、シュードモナス( Pseudomonas ) 由来〔アグリ
カルチュラル アンドバイオロジカル ケミストリー
（ Agricultural and Biological Chemistry )、第３９
巻、第１１号、第２２２７〜２２３４頁（１９７
５）〕、羊肝臓由来〔アーカイブズ オブ バイオケミ
ストリー アンド バイオフィジクス( Archieves of B
iochemistry and Biophysics )、第１３９巻、第８３〜
８６頁（１９７０）〕、ウサギ肝臓由来〔ジャーナル
オブバイオケミストリー（ Journal of Biochemistry
)、第８６巻、第１５５９〜１５６５頁（１９７
９）〕、プルラリア ( Pullularia ）由来〔カナディア
ン ジャーナル オブ ミクロバイオロジー ( Canadia
n Journal of Microbiology )、第３０巻、第７５３〜
７５７頁（１９８４）〕、コリネバクテリウム (Coryne
bacterium )由来（特開昭６２−１５５０８５号）、シ
ュードモナス由来〔アグリカルチュラル アンド バイ
オロジカル ケミストリー、第５３巻、第６号、第１４
９３〜１５０１頁（１９８９）〕のものが知られてお
り、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼはＬ−フコースの定
量に広く用いられている非常に有用な酵素である〔アグ
リカルチュラル アンド バイオロジカルケミストリ
ー、第３９巻、第１１号、第２２２７〜２２３４頁（１
９７５）、ジャーナル オブ バイオケミストリー、第
８６巻、第１５５９〜１５６５頁（１９７９）〕。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ほ乳動
物の肝臓からＬ−フコースデヒドロゲナーゼを精製する
方法は収量、収率共に低く実用的とは言い難い。また、
微生物を培養してＬ−フコースデヒドロゲナーゼを得る
方法は、培養時にＬ−フコースやＤ−アラビノースなど
の高価な糖を酵素の生産誘導に必要とするため、より安
価なＬ−フコースデヒドロゲナーゼの製造方法が求めら
れていた。Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼは動物肝細
胞、細菌、放射線、担子菌などに幅広く分布しており前
述の様に多くの酵素精製に関する報告はある。しかし、
Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼの遺伝子構造やアミノ酸
配列は不明であり、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼを遺
伝子工学的に製造する方法についても知られていない。
本発明の目的はＬ−フコースデヒドロゲナーゼ及びその
塩基配列、及びその工業的に有利な遺伝子工学的製造方
法を提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明は第１の発明は、配列表の配列番号１で表されるア
ミノ酸配列を有していることを特徴とするＬ−フコース
デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドに関する。
また、本発明の第２の発明は第１の発明のポリペプチド
をコードする塩基配列に関する。更に、本発明の第３の
発明は本発明の第１の発明のポリペプチドの製造方法に
関する発明であって、該ポリペプチドをコードするＤＮ
Ａを含有させた組換え体プラスミドを導入させた形質転
換体を培養し、該培養物より本発明の第１の発明のポリ
ペプチドを採取することを特徴とする。

【０００５】以下本発明を具体的に説明する。Ｌ−フコ
ースデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡのクローニン
グの方法は、公知の方法が用いられる。例えば、Ｌ−フ
コースデヒドロゲナーゼ生産能を有する微生物から、ゲ
ノムＤＮＡを抽出する。これを制限酵素で切片し、プラ
スミドやファージベクターに接続して、宿主に導入し、
ゲノミックＤＮＡライブラリーを作製する。このゲノミ
ックＤＮＡライブラリーから目的のＬ−フコースデヒド
ロゲナーゼ構造遺伝子を含むクローンをスクリーニング
するためには、まずＬ−フコースデヒドロゲナーゼの部
分アミノ酸配列を決定し、それから推定した合成ＤＮＡ
プローブを作成しなければならない。部分アミノ酸配列
を決定するためには、まず精製Ｌ−フコースデヒドロゲ
ナーゼに特異性の高いタンパク質加水分解酵素を作用さ
せ加水分解し、ペプチドを逆相ＨＰＬＣを用いて分離精
製する。これをエドマン分解法によりアミノ酸配列分析
を行い、決定するのが効果的である。この部分アミノ酸
配列から合成ＤＮＡプローブをデザインするには２種類
の方法がある。一つは考えられる組合せの配列をすべて
合成してゆく方法である。もう一つは、今まで調べられ
てきたコドンの使用頻度の高いものを用いて長いＤＮＡ
を合成して使う方法である。ＤＮＡプローブでライブラ
リーをスクリーニングする手段としては、まずライブラ
リーをプレート上で増幅させ、生育したコロニー又はプ
ラークをニトロセルロースやナイロンのフィルターに移
し取り、変性処理によりＤＮＡをフィルターに固定す
る。このフィルターをあらかじめ³²Ｐ等で標識したＤＮ
Ａプローブを含む溶液中でインキュベートし、フィルタ
ー上のＤＮＡと、プローブＤＮＡとのハイブリッドを形
成させる（以下、この操作をハイブリダイゼーションと
略す）。インキュベーションの温度は、用いるプローブ
のＴｍ（融解温度）を目安として設定する。ハイブリダ
イゼーション後、非特異的吸着を洗い流し、オートラジ
オグラフィーにより、プローブとハイブリッドを形成し
たクローンを同定する。この操作を再度行ってクローン
を単離し、次の分析を行う。組換え体が大腸菌の場合
は、試験管等で少量培養を行い、プラスミドを常法によ
って抽出、制限酵素による切断反応を行い、アガロース
又はアクリルアミドゲル電気泳動に付して、クローン化
された挿入断片の生成を調べる。更にその泳動パターン
をニトロセルロースやナイロン膜に移し取り、前述の方
法によりハイブリダイゼーションを行って挿入断片がＤ
ＮＡプローブとハイブリッドを形成するか否かを調べ
る。最終的には挿入断片の塩基配列を公知の方法により
決定する。組換え体がファージの場合も基本的には同様
のステップでクローンの分析を行う。あらかじめ培養し
た宿主大腸菌にクローン化ファージを感染させ、その溶
菌液からファージＤＮＡを調製する。ファージＤＮＡの
具体的な調製法に関しては、例えば続生化学実験講座１
「遺伝子研究法II」の第１００頁（東京化学同人出版）
に記載されている。ファージＤＮＡを制限酵素で切断し
てゲル電気泳動に付し、挿入断片の確認を行い、更に、
プローブＤＮＡとハイブリダイズすることを調べる。最
終的には塩基配列を決定することにより、クローンの確
認を行う。決定された塩基配列を、Ｌ−フコースデヒド
ロゲナーゼのＮ末端分析、アミノ酸組成分析、部分アミ
ノ酸配列分析、分子量等と比較して、その遺伝子構造及
びアミノ酸配列を知ることができる。また、得られたＬ
−フコースデヒドロゲナーゼ構造遺伝子を適当な宿主細
胞、例えば大腸菌において発現できるように発現ベクタ
ーに接続して、該宿主細胞に導入し、これを培養するこ
とにより、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ活性を持つポ
リペプチドを生産させることができる。発現の確認は、
Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ活性を測定することによ
り行うことができる。例えば、Ｌ−フコース、β−ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を含むＬ
−フコースデヒドロゲナーゼ活性測定系に、例えば組換
え体大腸菌の細胞抽出液を加える。この時ＮＡＤが還元
され増加する３４０nmの吸光度の増加を、分光光度計で
測定することによって、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ
活性を測定することができる。形質転換体の培養物か
ら、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼの精製には、通常の
クロマトグラフィーの手法が用いられる。すなわち、例
えば培養菌体を破砕し、上清を得る。これをイオン交
換、ゲルろ過、疎水等のクロマトグラフィーによって所
望のポリペプチドを得ることができる。

【０００６】以上述べてきたごとく、本発明により、Ｌ
−フコースデヒドロゲナーゼの一次構造及び遺伝子構造
が明らかとなり、その遺伝子工学的製造法を提供するこ
とが可能となった。

【０００７】

【実施例】次に本発明の実施例を示すが、これらは本発
明を限定するものではない。

【０００８】実施例１ Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ
構造遺伝子のクローニング ＜ゲノムＤＮＡの抽出精製＞Ｌ−フコースデヒドロゲナ
ーゼ高生産菌株であるアルスロバクター オキシダンス
（ Arthrobacter oxydans ) Ｆ１〔微工研菌寄第１２０
８１号（ＦＥＲＭＰ−１２０８１）〕を酵母エキス０．
５％、ペプトン１．０％、ＫＨ₂ ＰＯ₄ の０．３％及び
ＭｇＳｏ₄ ・７Ｈ₂ Ｏの０．１％、 pH ７．０からなる
培地７５０mlに接種し、３０℃で２４時間培養した。培
養終了後、培養液を遠心分離して菌体を集め、１０mlの
リゾチーム緩衝液〔１００mMトリス(tris)−ＨＣｌ、１
００mM ＥＤＴＡ、２０mg／mlリゾチーム pH ７．０〕
に懸濁し、０℃で３０分間処理した。これに５mlの抽出
緩衝液（５０mMトリス−ＨＣｌ、０．５％ＳＤＳ、０．
１Ｍ ＥＤＴＡ、１mg／mlプロティナーゼＫ、 pH ７．
５〕を加え５０℃で２時間保温した。これに、等容のＴ
Ｅ緩衝液（１０mMトリス−ＨＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、 p
H ８．０〕飽和フェノールを加え、穏やかにかくはん
し、３０００ｒｐｍで１５分間遠心した後、上層を回収
した（以下、フェノール抽出と略す）。上層をＴＥ緩衝
液に対し透析し、２０μｇ／mlとなるようにリボヌクレ
アーゼＡを加えた。３７℃で１時間保温した後、フェノ
ール処理を行い、ＴＥ緩衝液に対して透析した。以下の
操作により、ゲノムＤＮＡ１０mgを得た。 ＜ゲノミックＤＮＡライブラリーの調製＞得られたゲノ
ムＤＮＡ３０μｇを２５０ユニットの制限酵素ＥcoＲＩ
で３７℃６時間消化し、１０μｇ相当を０．７％アガロ
ースゲルで電気泳動をした。泳動後、サザンブロット法
（文献：遺伝子研究法II、第２１８〜２２１頁、東京化
学同人）により、アマシャム社製ナイロン膜〔商品名
ハイボンドＮ⁺ ( Hybond−Ｎ⁺ ）〕にＤＮＡを移した。
ハイブリダイゼーションのプローブとしては、Ｌ−フコ
ースデヒドロゲナーゼの部分アミノ酸配列より推定し
た、配列表の配列番号２で示す２０塩基の合成ＤＮＡの
混合物を用いた。部分アミノ酸配列は、精製されたＬ−
フコースデヒドロゲナーゼを、タンパク質加水分解酵素
トリプシン消化後、ＨＰＬＣで分離精製し、気相式ペプ
チドシークエンサーで決定した。配列表の配列番号３
が、該アミノ酸配列である。合成ＤＮＡ５０ngをメガラ
ベルキット〔宝酒造（株）製〕を用いて³²Ｐで標識し
た。このプローブの全量と、上記調製したフィルターを
用いて、６×ＳＳＣ〔１×ＳＳＣは、８．７７ｇのＮａ
Ｃｌ、及び４．４１ｇのクエン酸ナトリウムを１リット
ルの水に溶かしたもの〕、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ml
ニシン精子ＤＮＡ、５×デンハルト( Denhardt′s ）[
ウシ血清アルブミン、ポリビニルピロリドン、フィコー
ルをそれぞれ０．１％濃度で含む〕を含む約２０mlの溶
液中で５５℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。
次に室温の６×ＳＳＣ中で１０分解、５０℃の２×ＳＳ
Ｃ、０．５％ＳＤＳ中で１０分間を２回洗浄した。余分
な水分を除いた後、増感紙を当て一晩−７０℃でオート
ラジオグラフを行った。その結果約５kbの大きさの位置
に、プローブとハイブリダイズするバンドを認めた。先
にＥcoＲＩ消化した残りのＤＮＡ２０μｇを、０．７％
アガロースゲルで電気泳動をし、４．４〜６．６kbに相
当する部分を切り出した。これをＥＡＳＹＴＲＰ^TMキッ
ト〔宝酒造（株）製〕を用いて抽出精製した。得られた
ＤＮＡ断片の半量を、０．５μｇのλgt１１−ＥcoＲＩ
アーム〔ストラタジーン社（米国）〕と混ぜ、ライゲー
ションキット〔宝酒造（株）製〕を用いて、ライゲーシ
ョンし、ギガパックゴールド( GIGAPACK GOLD ）〔スト
ラタジーン社（米国）〕を用いてパッケージングを行
い、ゲノミックライブラリーを作製した。 ＜ポジティブクローンの同定単離＞アルスロバクター
オキシダンス ゲノミックＤＮＡライブラリーを、宿主
菌として大腸菌Ｙ１０９０を用い、１４cm×１０cmの角
シャーレ５枚に、１枚当り４００個のプラークを形成さ
せた。すなわち、４mg／mlのマルトースを含むＬ培地で
大腸菌Ｙ１０９０を３７℃で一晩培養した培養液０．２
mlに、ファージ液０．１mlを混ぜ３７℃で１５分間保温
した。これに軟寒天（Ｌ培地に終濃度０．６％となるよ
うにアガロースを加え、オートクレーブで処理した後、
５０℃に保ったもの）８mlを加え、Ｌ−プレート上に広
げ、固化後３７℃で１０時間程度保温してファージのプ
ラークを形成させた（以下、この操作をプレーティング
と略す）。次にこのプレートより２枚のハイブリダイゼ
ーション用フィルターを調製した。すなわち、プレート
表面にアマシャム社製ナイロン膜を３０秒間接触させ、
これを０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌの溶液
に浸したろ紙上で５分間（変性）、０．５Ｍトリス−Ｈ
Ｃｌ緩衝液（ pH ７．０）、１．５Ｍ ＮａＣｌの溶液
に浸したろ紙上で５分間（中和）処理した後、２×ＳＳ
Ｃでリンスした（以下、この処理をフィルター処理と略
す）。２枚目のフィルター処理は、プレートとナイロン
膜の接触時間を２分間として行った。このフィルター
を、前述と同じ条件でハイブリダイゼーションを行った
ところ、合計で６５個のポジティブシグナルが得られ
た。これらのシグナルに相当する位置のプラークのうち
適当に４個を、寒天ごと０．２mlのＳＭ溶液〔ＮａＣｌ
の５．８ｇ、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏの２ｇ、１Ｍトリス
−ＨＣｌ緩衝液（pH ７．５）５０ml、２％ゼラチン５m
lを水に溶かし全量を１リットルとする〕中に回収、懸
濁し、適度に希釈してプレーティングし（約３００プラ
ーク／φ９cm丸形シャーレ）上記と同様の操作を行った
（以下、２次スクリーニングと略す）。その結果この４
クローンに関してシングルプラークを単離することがで
きた。これらのクローンをλ_FDH Ｆ１〜Ｆ４と命名し
た。 ＜λＤＮＡの調製＞クローン化できたファージを宿主菌
として大腸菌Ｙ１０９０株を用いて液体培養（遺伝子研
究法II、第１００頁、東京化学同人出版）を行った。こ
れによって１００mlの培養液から調製し、約１００μｇ
のλＤＮＡを得た。 ＜挿入断片の同定と抽出精製＞調製した上記ＤＮＡ１０
μｇを５０ユニットのＥcoＲＩで２時間消化した。この
反応液の１／２０量を１．０％アガロースゲルで電気泳
動し、挿入断片を同定した。その結果、λ_FDH Ｆ１〜Ｆ
４すべてのクローンに、５．３kbの大きさの断片が挿入
されていることが判明した。次にＥcoＲＩ消化した残り
の反応液を１．０％アガロースゲルで電気泳動し、目的
の挿入断片を含む部分をゲルから切り出した。これを、
ＥＡＳＹＴＲＰ^TMキットを用いて抽出精製した。 ＜挿入断片の制限酵素認識配列の同定＞得られた挿入断
片を数種の制限酵素で消化し、電気泳動により、切片パ
ターンを解析した。その結果ＢamＨＩ、ＳphＩ、Ｐst
Ｉ、ＳalＩなどの制限酵素サイトがあることが判明し
た。この泳動後のアガロースゲルをサザンブロット法に
よりアマシャム社製ナイロン膜にＤＮＡを移し、ハイブ
リダイゼーションにより、どの切片断片に、Ｌ−フコー
スデヒドロゲナーゼがコードされているかを調べた。そ
の結果５．３kbの挿入断片がＢamＨＩにより切断され遊
離する２．７kbのＤＮＡ断片上にあることが推定され
た。 ＜塩基配列の決定＞この２．７kbのＢamＨＩ−ＥcoＲＩ
断片を、前述と同じ方法で抽出精製した。次にこれをＤ
ＮＡブランティングキット〔宝酒造（株）製〕を用いて
平滑末端化し、Ｍ１３mp１９ＲＦＤＮＡのＨinc IIサイ
トにクローニングした。組換え体Ｍ１３mp１９ＲＦＤＮ
ＡをＸbaＩ及びＳacＩで分解した後、エキソヌクレアー
ゼIII を用いた手法〔続生化学実験講座１．「遺伝子研
究法Ｉ」第１８６〜２００頁（１９８６）〕によりＸba
Ｉ末端から５′側に約３００bp（ベースペア）ずつ欠失
した変異体を作製した。挿入断片の方向が逆の組換え体
Ｍ１３mp１９ＲＦＤＮＡについても同様の操作を行い欠
失変異体を作製した。大腸菌ＪＭ１０９をそれぞれのＭ
１３mp１９誘導体ＲＦＤＮＡで形質転換し、Ｍ１３mp１
９誘導体一本鎖ＤＮＡを調製し、ジデオキシ法によって
２．７kb ＢamＨＩ−ＥcoＲＩ断片の塩基配列を決定し
た。その結果この断片中に９６６bpの読取り枠が見出さ
れた。この読取り枠中に、Ｌ−フコースデヒドロゲナー
ゼのアミノ酸配列分析により得られた配列がすべて見出
された。以上の結果より、Ｌ−フコースデヒドロゲナー
ゼ遺伝子の全塩基配列及び一次構造が決定された。その
結果を図１及び配列表の配列番号４に示す。すなわち図
１は、２．７kb ＢamＨＩ−ＥcoＲＩ断片の制限酵素地
図と、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ遺伝子の位置を示
した図、配列番号４は、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ
をコードする塩基配列の一例及びそのアミノ酸配列を示
すものである。

【０００９】実施例２ Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ
ポリペプチドを発現するプラスミドの構築 先に塩基配列決定したＭ１３mp１９誘導体中に、Ｌ−フ
コースデヒドロゲナーゼコード領域の開始コドンの上流
３２塩基のところまで欠損した誘導体が得られた。すな
わち、Ｍ１３mp１９マルチクローニングサイト中のＥco
ＲＩサイトより配列表の配列番号５の塩基配列、すなわ
ち５′−GAA TTC GGG ACA GGC CCC CAACCA GGA GAA AGA
CTG ATC −３′の配列が、開始コドンＡＴＧの上流に
ついている誘導体である。この配列中５′側のＧＡＡ
ＴＴＣ Ｇの配列はＭ１３mp１９由来、その他はアルス
ロバクター オキシダンス ゲノムＤＮＡ由来の配列で
ある。このＥcoＲＩサイトと、Ｌ−フコースデヒドロゲ
ナーゼ遺伝子の下流にあるＳcaＩサイトで本誘導体を切
断し、遊離する約１１００bpの断片を精製した。これを
ＤＮＡブランティングキットを用いて平滑末端化した。
ベクターとして、プラスミドｐＴＶ１１９ＮをＮcoＩサ
イトで切断し、ＤＮＡブランティングキットを用いて平
滑末端化したものを用い、先に調製した断片を挿入して
プラスミド pTFDH１０１を得た。このプラスミドは、Ｌ
−フコースデヒドロゲナーゼ３２２アミノ酸残基のポリ
ペプチドＮ末端に、配列表の配列番号６で示す１４アミ
ノ酸残基〔 Met Glu Phe Gly Thr Gly Pro Gln Pro Gly
Glu Arg Leu Ile〕が付加したポリペプチドをコードす
る。 pTFDH１０１を導入した大腸菌ＪＭ１０９を Esc
herichia coli ＪＭ１０９／ pTFDH１０１と命名した。
次に得られたプラスミド pTFDH１０１をｄａｍメチラー
ゼ欠損株大腸菌ＧＭ３３に導入し、この組換え体を培養
し、プラスミドＤＮＡを調製した。このプラスミドＤＮ
Ａを制限酵素ＮcoＩとＦbaＩで切断した。ｄＣＴＰ存在
下でクレノウフラグメントを用い一塩基を入れ、Ｓ１ヌ
クレアーゼを用い、平滑末端化した。これをセルフライ
ゲーションしてプラスミド pTFDH２１１を得た。このプ
ラスミドは、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ３２２アミ
ノ酸残基のポリペプチドを直接発現する。pTFDH２１３
を導入した大腸菌ＪＭ１０９を Escherichia coli ＪＭ
１０９／pTFDH２１３と表示し、工業技術院微生物工業
技術研究所に寄託した〔微工研菌寄第１２０８６号（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１２０８６）〕。

【００１０】実施例３ Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ
ポリペプチドの大腸菌における発現 実施例２で得られた Escherichia coli ＪＭ１０９／pT
FDH１０１あるいはEscherichia coli ＪＭ１０９／
pTFDH２１３（ＦＥＲＭ Ｐ−１２０８６）１００μｇ
／mlのアンピシリンを含むＬ−培地５mlに接種し、３７
℃で振とう培養した。培養後の濁度がＯ．Ｄ．₆₀₀ ＝
０．５となったところで、終濃度１mMとなるようにＩＰ
ＴＧ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−
Ｄ−ガラクトシド）を加え、３７℃で一夜振とう培養し
た。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を集め、２
０mlの５０mMリン酸緩衝液 pH ８．０に懸濁した後、超
音波処理で菌体を破砕した。これを遠心分離して上清を
回収し大腸菌抽出液とした。 この様にして得られた抽
出液のＬ−フコースデヒドロゲナーゼ活性を以下のよう
に測定した。３０mM Ｌ−フコース１．０ml、５mMリン
酸を含む２００mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液
（ pH ８．０）１．８ml、１５mM ＮＡＤ０．１ml及び
適当に希釈した抽出液０．１mlを３７℃で１０分間反応
させた後、３４０nmにおける吸光度を測定した（Ｏ．
Ｄ．サンプル）。別に対照として抽出液の代りに蒸留水
０．１mlを加え同様の操作によって吸光度を測定し
（Ｏ．Ｄ．ブランク）、△Ｏ．Ｄ．₃₄₀ （Ｏ．Ｄ．サン
プル−Ｏ．Ｄ．ブランク）を求めた。Ｌ−フコースデヒ
ドロゲナーゼは下記の式（数１）により算出した。

【数１】 単位／ml＝〔（△Ｏ．Ｄ．＜Ｏ．Ｄ．サンプル−Ｏ．Ｄ．ブランク＞）×３．０ ＜ml＞）／（６．２２×１０＜分＞×０．１＜ml＞×ｄ）〕×ｄｆ ６．２２：３４０nmにおけるＮＡＤＨのミリモル分子吸
光係数 ｄ：光路長（cm) ｄｆ：希釈率 活性測定の結果、先に調製した各抽出液２０mlは、約３
０単位のＬ−フコースデヒドロゲナーゼ活性を持ってい
た。なお、プラスミドを保持しない大腸菌ＪＭ１０９を
同様に処理したが、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ活性
は全く認められなかった。

【００１１】

【発明の効果】以上の結果から、本発明によりＬ−フコ
ースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列及び塩基配列が明
らかとなり、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼポリペプチ
ドの工業的に有利な遺伝子工学的製造方法が提供され
た。本発明によれば、本酵素生産において、Ｌ−フコー
スで誘導は不要であり、生産性は高い。またＬ−フコー
スデヒドロゲナーゼの存在、あるいは、発現の様子を調
べるターゲットが提供されたことにより、この塩基配列
を基にプローブやプライマーを作成することや、アミノ
酸配列を基に抗体を作成することなどが可能となった。

【配列表】配列番号：1 配列の長さ：322 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源：Arthrobactor oxydans 配列の特徴：1-322 E Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ 配列： Met Gln Glu Thr Arg Thr Ile Pro Gly Thr Asp Val Leu Leu Pro 1 5 10 15 Val Leu Gly Phe Gly Gly Ala Pro Ile Gly Asn Leu Tyr Arg Gln 20 25 30 Val Pro Glu Gln Glu Ala Val Asp Ala Val Ser Ala Ala Trp Glu 35 40 45 Gly Gly Val Arg Tyr Phe Asp Thr Ala Pro His Tyr Gly Leu Gly 50 55 60 Leu Ser Glu Arg Arg Met Gly Ala Ala Leu Ala Gly Gln Asp Arg 65 70 75 Asp Ser Tyr Val Leu Ser Thr Lys Ile Gly Arg Leu Leu Arg Pro 80 85 90 Asn Pro Ser Pro Gln Gly Lys Asp Thr Glu Gly Phe Asp Val Pro 95 100 105 Asp Asp Leu Ile Arg Val Arg Asp Tyr Ser Arg Asp Gly Val Leu 110 115 120 Arg Ser Ile Glu Glu Ser Leu Gln Arg Leu Gly Thr Asp Arg Ile 125 130 135 Asp Ile Val Tyr Ile His Asp Pro Asp Asp Tyr Trp Thr Glu Ala 140 145 150 Val Glu Gly Ala Ala Pro Ala Leu Ser Ala Leu Arg Asp Glu Gly 155 160 165 Val Ile Arg Ala Trp Gly Ala Gly Met Asn Gln Ser Gly Met Leu 170 175 180 His Arg Phe Ile Thr Glu Thr Asp Ile Asp Val Val Met Leu Ala 185 190 195 Gly Arg Tyr Thr Leu Leu Glu Gln Gly Ala Ala Gln Asp Leu Leu 200 205 210 Pro Ala Cys Leu Glu Arg Gly Val Gly Val Val Asn Val Gly Val 215 220 225 Phe Asn Ser Gly Leu Leu Ser Lys Glu Arg Pro Ala Ala Asn Ala 230 235 240 Thr Tyr Asn Tyr Ala Pro Ala Pro Gln Glu Leu Leu Asp Arg Ala 245 250 255 Asn Leu Leu Ala Asp Val Cys Glu Ser His Gly Thr Thr Leu Pro 260 265 270 Ala Ala Ala Leu His Phe Pro Tyr Gln His Pro Ala Val Thr Ser 275 280 285 Val Val Leu Gly Met Arg Thr Pro Ala Gln Val Lys Gln Asn Leu 290 295 300 Asp Leu Ala Ser Gln Thr Val Pro Asp Gln Leu Trp Ala Asp Leu 305 310 315 Arg Asp Arg Gly Leu Ile Ser 320 配列番号：2 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 配列の特徴： 1-20 E probe 配列： TGGGGNGCNG GNATGAAYCA 配列番号：3 配列の長さ：7 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ） 起源：Arthrobactor oxydans 配列番号：4 配列の長さ：2682 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源：Arthrobactor oxydans 配列の特徴： 844-1809 E CDS（Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ） 配列： GGATCCCGCC GGGCTCGACT ACACCTGGCT GGAGGATGCG CCCACCCTGA ACAAGCCATT 60 CCTTCCCCAA GACCTCCCGC ATACCGGGGC AAACACCCGT GCTGCCGTTT TTGTCCAGGC 120 CGACTGCCGT AATGACCAAG CCCTGAAGGA AGTGGACTGG GTATCGGGCC TGCACGCTGG 180 CTGGCCGCAG CTGGCGGGGA TTGTGGCCTT CGCCCCCATC AGCCGCGGTG ACGCGGTAGC 240 GGAGGACCTG GACCAGCTGC TGGAACGCCC GCTGGTACGG GGCATCAGGC AGCTGTTCCA 300 GGACCGGGAC GCATCATTCA TGGTGGACCC CAAGACGCTG GCCGGTGCAC GGCAGGTGGC 360 GGCGTCCAGG CTGGTATTCG ATGCGTGCAT CCGTGCCGGA CAGCTCGGCG CCCTGGCGGA 420 ATTTGCCTGC CGCGTCCCCG AGCTGCTGAT TGTGTTGGAC CACATGGGCA AGCCCCCTCT 480 GGCCAGCGGC GACCTGGCGA GTTGGAGCAA GGGGATGCGC GAACTCGCCG GGCACCCCAA 540 CGTCACCGTC AAGATTTCCG GGGCCGGCGC GGAACCGACC CGCAGCGTCC GCTGGCGCCC 600 CAGGCACAGC CGTCATTCAT GAAACACTGC GGCTCTTCGG TGCGGAGGCT GCATGATCGG 660 CAGCGACTTT CCCGTCTCGA TGACAAGCCC TGCCGCTTAC GAGGACTGGA TCACCATTGT 720 GGAAGAGTCG ATGGCAGGTG CTTCCGACGG CGAGCGCGCC AGCTCAACGC ACCGGACGGC 780 AGCCCGCGTC TACCAGCTCA CGGAAGAGCC AGGACAGGCC CCCAACCAGG AGAAAGACTG 840 ATC ATG CAA GAA ACG CGC ACC ATC CCC GGC ACG GAC GTC CTG CTG 885 Met Gln Glu Thr Arg Thr Ile Pro Gly Thr Asp Val Leu Leu 1 5 10 CCG GTG CTC GGC TTC GGC GGG GCC CCC ATC GGC AAC CTC TAC CGG 930 Pro Val Leu Gly Phe Gly Gly Ala Pro Ile Gly Asn Leu Tyr Arg 15 20 25 CAG GTC CCG GAG CAG GAA GCG GTC GAC GCC GTC AGC GCG GCC TGG 975 Gln Val Pro Glu Gln Glu Ala Val Asp Ala Val Ser Ala Ala Trp 30 35 40 GAG GGC GGC GTC CGC TAT TTC GAT ACC GCG CCG CAC TAC GGG CTG 1020 Glu Gly Gly Val Arg Tyr Phe Asp Thr Ala Pro His Tyr Gly Leu 45 50 55 GGG CTC TCG GAA CGC CGC ATG GGC GCC GCG CTC GCA GGG CAG GAC 1065 Gly Leu Ser Glu Arg Arg Met Gly Ala Ala Leu Ala Gly Gln Asp 60 65 70 CGC GAC AGT TAC GTG CTC AGC ACG AAG ATC GGG CGG CTC CTG CGC 1110 Arg Asp Ser Tyr Val Leu Ser Thr Lys Ile Gly Arg Leu Leu Arg 75 80 85 CCC AAC CCG TCC CCG CAG GGC AAG GAC ACC GAG GGC TTC GAC GTC 1155 Pro Asn Pro Ser Pro Gln Gly Lys Asp Thr Glu Gly Phe Asp Val 90 95 100 CCG GAC GAC CTC ATC CGG GTC CGC GAC TAC TCC CGC GAC GGG GTG 1200 Pro Asp Asp Leu Ile Arg Val Arg Asp Tyr Ser Arg Asp Gly Val 105 110 115 CTG CGC TCC ATC GAG GAA AGC CTG CAG CGG CTG GGG ACC GAC CGG 1245 Leu Arg Ser Ile Glu Glu Ser Leu Gln Arg Leu Gly Thr Asp Arg 120 125 130 ATC GAC ATC GTC TAC ATC CAC GAC CCT GAC GAC TAC TGG ACC GAG 1290 Ile Asp Ile Val Tyr Ile His Asp Pro Asp Asp Tyr Trp Thr Glu 135 140 145 GCC GTG GAG GGC GCC GCC CCG GCG CTG TCC GCC CTG CGG GAC GAA 1335 Ala Val Glu Gly Ala Ala Pro Ala Leu Ser Ala Leu Arg Asp Glu 150 155 160 GGG GTC ATC AGG GCC TGG GGC GCA GGC ATG AAC CAA TCC GGG ATG 1380 Gly Val Ile Arg Ala Trp Gly Ala Gly Met Asn Gln Ser Gly Met 165 170 175 CTC CAC AGG TTC ATC ACC GAA ACG GAC ATT GAC GTT GTC ATG CTG 1425 Leu His Arg Phe Ile Thr Glu Thr Asp Ile Asp Val Val Met Leu 180 185 190 GCC GGC CGG TAC ACG CTC CTG GAG CAG GGT GCA GCA CAG GAC CTG 1470 Ala Gly Arg Tyr Thr Leu Leu Glu Gln Gly Ala Ala Gln Asp Leu 195 200 205 CTT CCT GCC TGC CTG GAG CGC GGG GTT GGC GTG GTG AAC GTC GGT 1515 Leu Pro Ala Cys Leu Glu Arg Gly Val Gly Val Val Asn Val Gly 210 215 220 GTC TTC AAT TCG GGC CTG CTG TCC AAG GAG CGG CCC GCG GCC AAC 1560 Val Phe Asn Ser Gly Leu Leu Ser Lys Glu Arg Pro Ala Ala Asn 225 230 235 GCC ACC TAC AAC TAC GCC CCG GCC CCG CAG GAA CTG CTG GAC AGG 1605 Ala Thr Tyr Asn Tyr Ala Pro Ala Pro Gln Glu Leu Leu Asp Arg 240 245 250 GCC AAC CTG CTG GCA GAC GTC TGC GAA TCC CAC GGC ACC ACG CTG 1650 Ala Asn Leu Leu Ala Asp Val Cys Glu Ser His Gly Thr Thr Leu 255 260 265 CCC GCC GCC GCC CTC CAC TTC CCC TAC CAG CAC CCC GCC GTC ACC 1695 Pro Ala Ala Ala Leu His Phe Pro Tyr Gln His Pro Ala Val Thr 270 275 280 AGC GTT GTC CTT GGC ATG CGG ACG CCG GCA CAG GTG AAG CAA AAC 1740 Ser Val Val Leu Gly Met Arg Thr Pro Ala Gln Val Lys Gln Asn 285 290 295 CTG GAC CTC GCC TCG CAG ACC GTC CCG GAC CAG CTG TGG GCT GAC 1785 Leu Asp Leu Ala Ser Gln Thr Val Pro Asp Gln Leu Trp Ala Asp 300 305 310 CTG CGG GAC CGC GGA CTG ATC TCC TAAAAAGCAC AATCACGTAC 1829 Leu Arg Asp Arg Gly Leu Ile Ser 315 320 AACCAAGAAA AGAAGAAACG AATGCAATTT GCACGCATAG GTGCCCCCGG CAAGGAAGTC 1889 CCCGCCCTGC TGCACGGGAA GAAGTACTAC TCCCTGGAAC ACGTGGCCCG GGACATCGAC 1949 GCCGATTTCT GGGAATCCGA CGGTCCCGGC CCCGCGGCAA CGGCGCTGGC CGCGGGGGAA 2009 CTGGCGGAAC TGCGTGGACG GCGCCCGGAT CGGCGCTCCG ATCGCCAGGC CGTCCTCCGT 2069 GATCTGTGTG GGCATGAACT ACGCCGCGCA CGCCGCCGAG TCGGGCTCTG CTCCCCCTAC 2129 CGTGCCCATC ATCTTCCACA AGGCCCCCAA CACCGTGGCT GGCCCGTTCG ATGCCGTGGC 2189 GATTCCGCGT GGTTCCACGA AGACCGACTG GGAAGTCGAA CTGGGCGTGG TCATCGGCCG 2249 GCGCGCCTCG TACCTGGAAT CCCCTGCGCA GGCCCGGGAC TATATCGCCG GCTACGTCAC 2309 CGTCAATGAC CTGTCCGAGC GCACGTTCCA GCTGGAAGTG TCCGGAGGCC AATGGTCCAA 2369 GGGAAAGAGC TGTGCAGGAT TTTGTCCCAC CGGACCGTAC CTGGTCACCC CCGATGAGGT 2429 GGATGCCGGG GACCTTCGGC TGCGCAGCTG GGTCAACGGC GAAATCCGCC AGGACTCCAG 2489 CACCCGGGAC CTGATCTTCG GTGTGGAGCA GGTGATCTAT GACCTGAGCC AGTTCCTTGT 2549 CCTTGAACCG GGTGACCTGG TCTGCACCGG CACCCCGGAG GGAGTAGCCC TGTCCGGCCG 2609 CTTCCCGTAC CTGAAGGCCG GAGACGTCGT CGACATCGAA GTGGCGGGAC TGGGCCGCCA 2669 GCGCCAGGAA TTC 2682 配列番号：5 配列の長さ：39 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源：M13mp19 DNA carring Arthrobactoroxidans geno
mic DNA 配列の特徴： 1-7 E M13mp19 DNA 由来 8-39 E Arthrobactor oxidance genomic DNA 由来 配列： GAATTCGGGA CAGGCCCCCA ACCAGGAGAA AGACTGATC 39 配列番号：6 配列の長さ：14 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Met Glu Phe Gly Thr Gly Pro Gln Pro Gly Glu Arg Leu Ile 1 5 10

【図面の簡単な説明】

【図１】２．７kb ＢamＨＩ−ＥcoＲＩ断片の制限酵素
地図と、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ遺伝子の位置を
示した図である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成４年１月７日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００３

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ほ乳動
物の肝臓からＬ−フコースデヒドロゲナーゼを精製する
方法は収量、収率共に低く実用的とは言い難い。また、
微生物を培養してＬ−フコースデヒドロゲナーゼを得る
方法は、培養時にＬ−フコースやＤ−アラビノースなど
の高価な糖を酵素の生産誘導に必要とするため、より安
価なＬ−フコースデヒドロゲナーゼの製造方法が求めら
れていた。Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼは動物肝細
胞、細菌、放線菌、担子菌などに幅広く分布しており前
述の様に多くの酵素精製に関する報告はある。しかし、
Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼの遺伝子構造やアミノ酸
配列は不明であり、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼを遺
伝子工学的に製造する方法についても知られていない。
本発明の目的はＬ−フコースデヒドロゲナーゼ及びその
塩基配列、及びその工業的に有利な遺伝子工学的製造方
法を提供することにある。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００５

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００５】以下本発明を具体的に説明する。Ｌ−フコ
ースデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡのクローニン
グの方法は、公知の方法が用いられる。例えば、Ｌ−フ
コースデヒドロゲナーゼ生産能を有する微生物から、ゲ
ノムＤＮＡを抽出する。これを制限酵素で切断し、プラ
スミドやファージベクターに接続して、宿主に導入し、
ゲノミックＤＮＡライブラリーを作製する。このゲノミ
ックＤＮＡライブラリーから目的のＬ−フコースデヒド
ロゲナーゼ構造遺伝子を含むクローンをスクリーニング
するためには、まずＬ−フコースデヒドロゲナーゼの部
分アミノ酸配列を決定し、それから推定した合成ＤＮＡ
プローブを作成しなければならない。部分アミノ酸配列
を決定するためには、まず精製Ｌ−フコースデヒドロゲ
ナーゼに特異性の高いタンパク質加水分解酵素を作用さ
せ加水分解し、ペプチドを逆相ＨＰＬＣを用いて分離精
製する。これをエドマン分解法によりアミノ酸配列分析
を行い、決定するのが効果的である。この部分アミノ酸
配列から合成ＤＮＡプローブをデザインするには２種類
の方法がある。一つは考えられる組合せの配列をすべて
合成してゆく方法である。もう一つは、今まで調べられ
てきたコドンの使用頻度の高いものを用いて長いＤＮＡ
を合成して使う方法である。ＤＮＡプローブでライブラ
リーをスクリーニングする手段としては、まずライブラ
リーをプレート上で増殖させ、生育したコロニー又はプ
ラークをニトロセルロースやナイロンのフィルターに移
し取り、変性処理によりＤＮＡをフィルターに固定す
る。このフィルターをあらかじめ^３２Ｐ等で標識したＤ
ＮＡプローブを含む溶液中でインキュベートし、フィル
ター上のＤＮＡと、プローブＤＮＡとのハイブリッドを
形成させる（以下、この操作をハイブリダイゼーション
と略す）。インキュベーションの温度は、用いるプロー
ブのＴｍ（融解温度）を目安として設定する。ハイブリ
ダイゼーション後、非特異的吸着を洗い流し、オートラ
ジオグラフィーにより、プローブとハイブリッドを形成
したクローンを同定する。この操作を再度行ってクロー
ンを単離し、次の分析を行う。組換え体が大腸菌の場合
は、試験管等で少量培養を行い、プラスミドを常法によ
って抽出、制限酵素による切断反応を行い、アガロース
又はアクリルアミドゲル電気泳動に付して、クローン化
された挿入断片の生成を調べる。更にその泳動パターン
をニトロセルロースやナイロン膜に移し取り、前述の方
法によりハイブリダイゼーションを行って挿入断片がＤ
ＮＡプローブとハイブリッドを形成するか否かを調べ
る。最終的には挿入断片の塩基配列を公知の方法により
決定する。組換え体がファージの場合も基本的には同様
のステップでクローンの分析を行う。あらかじめ培養し
た宿主大腸菌にクローン化ファージを感染させ、その溶
菌液からファージＤＮＡを調製する。ファージＤＮＡの
具体的な調製法に関しては、例えば続生化学実験講座１
「遺伝子研究法ＩＩ」の第１００頁（東京化学同人出
版）に記載されている。ファージＤＮＡを制限酵素で切
断してゲル電気泳動に付し、挿入断片の確認を行い、更
に、プローブＤＮＡとハイブリダイズすることを調べ
る。最終的には塩基配列を決定することにより、クロー
ンの確認を行う。決定された塩基配列を、Ｌ−フコース
デヒドロゲナーゼのＮ末端分析、アミノ酸組成分析、部
分アミノ酸配列分析、分子量等と比較して、その遺伝子
構造及びアミノ酸配列を知ることができる。また、得ら
れたＬ−フコースデヒドロゲナーゼ構造遺伝子を適当な
宿主細胞、例えば大腸菌において発現できるように発現
ベクターに接続して、該宿主細胞に導入し、これを培養
することにより、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ活性を
持つポリペプチドを生産させることができる。発現の確
認は、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ活性を測定するこ
とにより行うことができる。例えば、Ｌ−フコース、β
−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を
含むＬ−フコースデヒドロゲナーゼ活性測定系に、例え
ば組換え体大腸菌の細胞抽出液を加える。この時ＮＡＤ
が還元され増加する３４０ｎｍの吸光度の増加を、分光
光度計で測定することによって、Ｌ−フコースデヒドロ
ゲナーゼ活性を測定することができる。形質転換体の培
養物から、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼの精製には、
通常のクロマトグラフィーの手法が用いられる。すなわ
ち、例えば培養菌体を破砕し、上清を得る。これをイオ
ン交換、ゲルろ過、疎水等のクロマトグラフィーによっ
て所望のポリペプチドを得ることができる。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００８

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００８】実施例１ Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ
構造遺伝子のクローニング ＜ゲノムＤＮＡの抽出精製＞Ｌ−フコースデヒドロゲナ
ーゼ高生産菌株であるアルスロバクター オキシダス
（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｉｄａｎｓ）Ｆ１
〔微工研条寄第３６７４号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３６７
４）〕を酵母エキス０．５％、ペプトン１．０％、ＫＨ
_２ＰＯ_４の０．３％及びＭｇＳｏ_４・７Ｈ_２Ｏの０．１
％、ｐＨ７．０からなる培地７５０ｍｌに接種し、３０
℃で２４時間培養した。培養終了後、培養液を遠心分離
して菌体を集め、１０ｍｌのリゾチーム緩衝液〔１００
ｍＭトリス（ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、２０ｍｇ／ｍｌリゾチームｐＨ７．０〕に懸濁し、
０℃で３０分間処理した。これに５ｍｌの抽出緩衝液
（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．５％ＳＤＳ、０．１Ｍ
ＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌプロティナーゼＫ、ｐＨ７．
５〕を加え５０℃で２時間保温した。これに、等容のＴ
Ｅ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、ｐＨ８．０〕飽和フェノールを加え、穏やかにかく
はんし、３０００ｒｐｍで１５分間遠心した後、上層を
回収した（以下、フェノール抽出と略す）。上層をＴＥ
緩衝液に対し透析し、２０μｇ／ｍｌとなるようにリボ
ヌクレアーゼＡを加えた。３７℃で１時間保温した後、
フェノール処理を行い、ＴＥ緩衝液に対して透析した。
以下の操作により、ゲノムＤＮＡ１０ｍｇを得た。 ＜ゲノミックＤＮＡライブラリーの調製＞得られたゲノ
ムＤＮＡ３０μｇを２５０ユニットの制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉで３７℃６時間消化し、１０μｇ相当を０．７％アガ
ロースゲルで電気泳動をした。泳動後、サザンブロット
法（文献：遺伝子研究法ＩＩ、第２１８〜２２１頁、東
京化学同人）により、アマシャム社製ナイロン膜〔商品
名 ハイボンドＮ^＋（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ^＋）〕にＤＮＡ
を移した。ハイブリダイゼーションのプローブとして
は、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼの部分アミノ酸配列
より推定した、配列表の配列番号２で示す２０塩基の合
成ＤＮＡの混合物を用いた。部分アミノ酸配列は、精製
されたＬ−フコースデヒドロゲナーゼを、タンパク質加
水分解酵素トリプシン消化後、ＨＰＬＣで分離精製し、
気相式ペプチドシークエンサーで決定した。配列表の配
列番号３が、該アミノ酸配列である。合成ＤＮＡ５０ｎ
ｇをメガラベルキット〔宝酒造（株）製〕を用いて^３２
Ｐで標識した。このプローブの全量と、上記調製したフ
ィルターを用いて、６×ＳＳＣ〔１×ＳＳＣは、８．７
７ｇのＮａＣｌ、及び４．４１ｇのクエン酸ナトリウム
を１リットルの水に溶かしたもの〕、１％ＳＤＳ、１０
０μｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ、５×デンハルト（Ｄｅ
ｎｈａｒｄｔ′ｓ）［ウシ血清アルブミン、ポリビニル
ピロリドン、フィコールをそれぞれ０．１％濃度で含
む〕を含む約２０ｍｌの溶液中で５５℃で一晩ハイブリ
ダイゼーションを行った。次に室温の６×ＳＳＣ中で１
０分解、５０℃の２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中で１０
分間を２回洗浄した。余分な水分を除いた後、増感紙を
当て一晩−７０℃でオートラジオグラフを行った。その
結果約５ｋｂの大きさの位置に、プローブとハイブリダ
イズするバンドを認めた。先にＥｃｏＲＩ消化した残り
のＤＮＡ２０μｇを、０．７％アガロースゲルで電気泳
動をし、４．４〜６．６ｋｂに相当する部分を切り出し
た。これをＥＡＳＹＴＲＡＰ^ＴＭキット〔宝酒造（株）
製〕を用いて抽出精製した。得られたＤＮＡ断片の半量
を、０．５μｇのλｇｔ１１−ＥｃｏＲＩアーム〔スト
ラタジーン社（米国）〕と混ぜ、ライゲーションキット
〔宝酒造（株）製〕を用いて、ライゲーションし、ギガ
パックゴールド（ＧＩＧＡＰＡＣＫ ＧＯＬＤ）〔スト
ラタジーン社（米国）〕を用いてパッケージングを行
い、ゲノミックライブラリーを作製した。 ＜ポジティブクローンの同定単離＞アルスロバクター
オキシダンス ゲノミックＤＮＡライブラリーを、宿主
菌として大腸菌Ｙ１０９０を用い、１４ｃｍ×１０ｃｍ
の角シャーレ５枚に、１枚当り４００個のプラークを形
成させた。すなわち、４ｍｇ／ｍｌのマルトースを含む
Ｌ培地で大腸菌Ｙ１０９０を３７℃で一晩培養した培養
液０．２ｍｌに、ファージ液０．１ｍｌを混ぜ３７℃で
１５分間保温した。これに軟寒天（Ｌ培地に終濃度０．
６％となるようにアガロースを加え、オートクレーブで
処理した後、５０℃に保ったもの）８ｍｌを加え、Ｌ−
プレート上に広げ、固化後３７℃で１０時間程度保温し
てファージのプラークを形成させた（以下、この操作を
プレーティングと略す）。次にこのプレートより２枚の
ハイブリダイゼーション用フィルターを調製した。すな
わち、プレート表面にアマシャム社製ナイロン膜を３０
秒間接触させ、これを０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ
ＮａＣｌの溶液に浸したろ紙上で５分間（変性）、０．
５Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）、１．５Ｍ
ＮａＣｌの溶液に浸したろ紙上で５分間（中和）処理し
た後、２×ＳＳＣでリンスした（以下、この処理をフィ
ルター処理と略す）。２枚目のフィルター処理は、プレ
ートとナイロン膜の接触時間を２分間として行った。こ
のフィルターを、前述と同じ条件でハイブリダイゼーシ
ョンを行ったところ、合計で６５個のポジティブシグナ
ルが得られた。これらのシグナルに相当する位置のプラ
ークのうち適当に４個を、寒天ごと０．２ｍｌのＳＭ溶
液〔ＮａＣｌの５．８ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏの２
ｇ、１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）５０ｍ
ｌ、２％ゼラチン５ｍｌを水に溶かし全量を１リットル
とする〕中に回収、懸濁し、適度に希釈してプレーティ
ングし（約３００プラーク／φ９ｃｍ丸形シャーレ）上
記と同様の操作を行った（以下、２次スクリーニングと
略す）。その結果この４クローンに関してシングルプラ
ークを単離することができた。これらのクローンをλ
_ＦＤＨＦ１〜Ｆ４と命名した。 ＜λＤＮＡの調製＞クローン化できたファージを宿主菌
として大腸菌Ｙ１０９０株を用いて液体培養（遺伝子研
究法ＩＩ、第１００頁、東京化学同人出版）を行った。
これによって１００ｍｌの培養液から調製し、約１００
μｇのλＤＮＡを得た。 ＜挿入断片の同定と抽出精製＞調製した上記ＤＮＡ１０
μｇを５０ユニットのＥｃｏＲＩで２時間消化した。こ
の反応液の１／２０量を１．０％アガロースゲルで電気
泳動し、挿入断片を同定した。その結果、λ_ＦＤＨＦ１
〜Ｆ４すべてのクローンに、５．３ｋｂの大きさの断片
が挿入されていることが判明した。次にＥｃｏＲＩ消化
した残りの反応液を１．０％アガロースゲルで電気泳動
し、目的の挿入断片を含む部分をゲルから切り出した。
これを、ＥＡＳＹＴＲＡＰ^ＴＭキットを用いて抽出精製
した。 ＜挿入断片の制限酵素認識配列の同定＞得られた挿入断
片を数種の制限酵素で消化し、電気泳動により、切片パ
ターンを解析した。その結果ＢａｍＨＩ、ＳｐｈＩ、Ｐ
ｓｔＩ、ＳａｌＩなどの制限酵素サイトがあることが判
明した。この泳動後のアガロースゲルをサザンブロット
法によりアマシャム社製ナイロン膜にＤＮＡを移し、ハ
イブリダイゼーションにより、どの切片断片に、Ｌ−フ
コースデヒドロゲナーゼがコードされているかを調べ
た。その結果５．３ｋｂの挿入断片がＢａｍＨＩにより
切断され遊離する２．７ｋｂのＤＮＡ断片上にあること
が推定された。 ＜塩基配列の決定＞この２．７ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｅｃ
ｏＲＩ断片を、前述と同じ方法で抽出精製した。次にこ
れをＤＮＡブランティングキット〔宝酒造（株）製〕を
用いて平滑末端化し、Ｍ１３ｍｐ１９ＲＦＤＮＡのＨｉ
ｎｃＩＩサイトにクローニングした。組換え体Ｍ１３ｍ
ｐ１９ＲＦＤＮＡをＸｂａＩ及びＳａｃＩで分解した
後、エキソヌクレアーゼＩＩＩを用いた手法〔続生化学
実験講座１．「遺伝子研究法Ｉ」第１８６〜２００頁
（１９８６）〕によりＸｂａＩ末端から５′側に約３０
０ｂｐ（ベースペア）ずつ欠失した変異体を作製した。
挿入断片の方向が逆の組換え体Ｍ１３ｍｐ１９ＲＦＤＮ
Ａについても同様の操作を行い欠失変異体を作製した。
大腸菌ＪＭ１０９をそれぞれのＭ１３ｍｐ１９誘導体Ｒ
ＦＤＮＡで形質転換し、Ｍ１３ｍｐ１９誘導体一本鎖Ｄ
ＮＡを調製し、ジデオキシ法によって２．７ｋｂ Ｂａ
ｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片の塩基配列を決定した。その結
果この断片中に９６６ｂｐの読取り枠が見出された。こ
の読取り枠中に、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼのアミ
ノ酸配列分析により得られた配列がすべて見出された。
以上の結果より、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ遺伝子
の全塩基配列及び一次構造が決定された。その結果を図
１及び配列表の配列番号４に示す。すなわち図１は、
２．７ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片の制限酵素地
図と、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ遺伝子の位置を示
した図、配列番号４は、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ
をコードする塩基配列の一例及びそのアミノ酸配列を示
すものである。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００９

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００９】実施例２ Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ
ポリペプチドを発現するプラスミドの構築 先に塩基配列決定したＭ１３ｍｐ１９誘導体中に、Ｌ−
フコースデヒドロゲナーゼコード領域の開始コドンの上
流３２塩基のところまで欠損した誘導体が得られた。す
なわち、Ｍ１３ｍｐ１９マルチクローニングサイト中の
ＥｃｏＲＩサイトより配列表の配列番号５の塩基配列、
すなわち５′−ＧＡＡ ＴＴＣ ＧＧＧＡＣＡ ＧＧＣ
ＣＣＣ ＣＡＡ ＣＣＡ ＧＧＡ ＧＡＡ ＡＧＡ
ＣＴＧＡＴＣ−３′の配列が、開始コドンＡＴＧの上流
についている誘導体である。この配列中５′側のＧＡＡ
ＴＴＣ Ｇの配列はＭ１３ｍｐ１９由来、その他はア
ルスロバクター オキシダンス ゲノムＤＮＡ由来の配
列である。このＥｃｏＲＩサイトと、Ｌ−フコースデヒ
ドロゲナーゼ遺伝子の下流にあるＳｃａＩサイトで本誘
導体を切断し、遊離する約１１００ｂｐの断片を精製し
た。これをＤＮＡブランティングキットを用いて平滑末
端化した。ベクターとして、プラスミドｐＴＶ１１９Ｎ
をＮｃｏＩサイトで切断し、ＤＮＡブランティングキッ
トを用いて平滑末端化したものを用い、先に調製した断
片を挿入してプラスミドｐＴＦＤＨ１０１を得た。この
プラスミドは、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ３２２ア
ミノ酸残基のポリペプチドＮ末端に、配列表の配列番号
６で示す１４アミノ酸残基〔Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｐｈｅ
Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｎ ＰｒｏＧｌ
ｙＧｌｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｉｌｅ〕が付加したポリペ
プチドをコードする。 ｐＴＦＤＨ１０１を導入した大
腸菌ＪＭ１０９をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＪＭ１０９／ｐＴＦＤＨ１０１と命名した。次に得られ
たプラスミドｐＴＦＤＨ１０１をｄａｍメチラーゼ欠損
株大腸菌ＧＭ３３に導入し、この組換え体を培養し、プ
ラスミドＤＮＡを調製した。このプラスミドＤＮＡを制
限酵素ＮｃｏＩとＦｂａＩで切断した。ｄＣＴＰ存在下
でクレノウフラグメントを用い一塩基を入れ、Ｓｌヌク
レアーゼを用い、平滑末端化した。これをセルフライゲ
ーションしてプラスミドｐＴＦＤＨ２１３を得た。この
プラスミドは、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ３２２ア
ミノ酸残基のポリペプチドを直接発現する。ｐＴＦＤＨ
２１３を導入した大腸菌ＪＭ１０９をＥｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＦＤＨ２１３と表
示し、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託した〔微
工研条寄第３６７５号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３６７
５）〕。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１０

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１０】実施例３ Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ
ポリペプチドの大腸菌における発現 実施例２で得られたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＪＭ１０９／ｐＴＦＤＨ１０１あるいはＥｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＦＤＨ２１３
（ＦＥＲＭ ＢＰ−３６７５）１００μｇ／ｍｌのアン
ピシリンを含むＬ−培地５ｍｌに接種し、３７℃で振と
う培養した。培養後の濁度がＯ．Ｄ．_６００＝０．５と
なったところで、終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧ
（イソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシド）
を加え、３７℃で一夜振とう培養した。培養終了後、培
養液を遠心分離して菌体を集め、２０ｍｌの５０ｍＭリ
ン酸緩衝液ｐＨ８．０に懸濁した後、超音波処理で菌体
を破砕した。これを遠心分離して上清を回収し大腸菌抽
出液とした。 この様にして得られた抽出液のＬ−フコ
ースデヒドロゲナーゼ活性を以下のように測定した。３
０ｍＭＬ−フコース１．０ｍｌ、５ｍＭリン酸を含む２
００ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．
０）１．８ｍｌ、１５ｍＭ ＮＡＤ０．１ｍｌ及び適当
に希釈した抽出液０．１ｍｌを３７℃で１０分間反応さ
せた後、３４０ｎｍにおける吸光度を測定した（Ｏ．
Ｄ．サンプル）。別に対照として抽出液の代りに蒸留水
０．１ｍｌを加え同様の操作によって吸光度を測定し
（Ｏ．Ｄ．ブランク）、△Ｏ．Ｄ．_３４０（Ｏ．Ｄ．サ
ンプル−Ｏ．Ｄ．ブランク）を求めた。Ｌ−フコースデ
ヒドロゲナーゼは下記の式（数１）により算出した。

【数１】 単位／ｍｌ＝〔（△Ｏ．Ｄ．＜Ｏ．Ｄ．サンプル−Ｏ．Ｄ．ブランク＞）×３． ０ ＜ｍｌ＞）／（６．２２×１０＜分＞×０．１＜ｍｌ＞×ｄ）〕× ｄｆ ６．２２：３４０ｎｍにおけるＮＡＤＨのミリモル分子吸光係数 ｄ：光路長（ｃｍ） ｄｆ：希釈率 活性測定の結果、先に調製した各抽出液２０ｍｌは、約
３０単位のＬ−フコースデヒドロゲナーゼ活性を持って
いた。なお、プラスミドを保持しない大腸菌ＪＭ１０９
を同様に処理したが、Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ活
性は全く認められなかった。

【書類名】 受託番号変更届

【提出日】 平成４年１月７日

【旧寄託機関の名称】 工業技術院微生物工業技術
研究所

【旧受託番号】 微工研菌寄第１２０８６号

【新寄託機関の名称】 工業技術院微生物工業技術
研究所

【新受託番号】 微工研条寄第３６７５号

【書類名】 受託番号変更届

【旧寄託機関の名称】 工業技術院微生物工業技術
研究所

【旧受託番号】 微工研菌寄第１２０８１号

【新寄託機関の名称】 工業技術院微■物工業技術
研究所

【新受託番号】 微工研条寄第３６７４号

フロントページの続き (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１で表されるアミノ酸
   配列を有していることを特徴とするＬ−フコースデヒド
   ロゲナーゼ活性を有するポリペプチド。
2. 【請求項２】 請求項１記載のポリペプチドをコードす
   る塩基配列。
3. 【請求項３】 請求項１記載のポリペプチドをコードす
   るＤＮＡを含有させた組換え体プラスミドを導入させた
   形質転換体を培養し、該培養物より請求項１記載のポリ
   ペプチドを採取することを特徴とする請求項１記載のポ
   リペプチドの製造方法。