JPH10286092A - α−グルコシダーゼ遺伝子、新規な組み換え体ＤＮＡ及びα−グルコシダーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 以下の(a)または(b)のタンパク質をコー
ドするα−グルコシダーゼ遺伝子、 (a)配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパ
ク質 (b)アミノ酸配列(a)において１もしくは複数のアミノ酸
が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつα−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質 該遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮ
Ａ、該遺伝子を含む形質転換体または形質導入体及び該
形質転換体または形質導入体を培地に培養し、培養物か
らα−グルコシダーゼを採取することからなるα−グル
コシダーゼの製造法。 【効果】 本発明によれば、Ｋｍ値が小さく、基質特異
性及び安定性に優れたα−グルコシダーゼを効率よく生
産することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、α−グルコシダー
ゼ遺伝子、新規な組み換え体ＤＮＡ及びα−グルコシダ
ーゼの製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】α−１，４−グルコシド結合を加水分解
し、α−Ｄ−グルコースを生成する酵素は、広く生物界
に存在し、例えば酵母、糸状菌、細菌、哺乳動物、植物
種子等に存在しているα−グルコシダーゼや、例えば、
カーボハイドレート リサーチ(Carbohydrate Researc
h)第１９７巻、第２２７−２３５頁、１９９０年に記載
のバチルス(Bacillus)属由来のオリゴ−１，６−Ｄ−グ
ルコシダーゼ等が知られている。従来知られているマル
トース及びＰＮＰＧによく作用するα−グルコシダーゼ
としては、バイオサイエンス バイオテクノロジー バ
イオケミストリー(Biosci.Biotech.Biochem.)第５７
巻、第１１号、第１９０２−１９０５頁、１９９３年に
記載の酵母由来のもの、バイオケミカ バイオフィジカ
アクタ(Biochimica Biophysica Acta)第７８７巻、第
２８１〜２８９頁、１９８４年、に記載のバチルス ス
テアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)
由来のもの等が知られている。また該市販酵素として、
酵母由来のもの〔シグマ社、東洋紡績（株）〕、そして
微生物由来酵素のもの〔東洋紡績（株）〕等がある。

【０００３】しかしながら、前記のα−グルコシダーゼ
において、酵母由来のα−グルコシダーゼは、熱、ｐ
Ｈ、阻害剤等の安定性に欠け、酵素製造や、常温での使
用に支障をきたす。また、バチルス ステアロサーモフ
ィラス由来酵素及び市販微生物由来酵素は、耐熱性には
優れているものの、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、ｐ
−クロロメルクリ安息香酸(PCMB)等の阻害剤に対する安
定性に欠け、基質特異性においてα−１，６−グリコシ
ド結合に作用せず、同結合を加水分解するような反応、
更にはマルトペンタオース以上の重合度を持つマルトオ
リゴサッカライドや可溶性澱粉にも作用するため、それ
らを基質に用いたα−アミラーゼ活性測定時に使用する
共役酵素としては不向きであった。α−グルコシダーゼ
は、α−アミラーゼ活性測定やクロルイオン定量の際の
共役酵素として、またマルトオリゴ糖の定量並びに消去
用酵素等として有用である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
α−グルコシダーゼの製造法によるときには、その生産
量が低く、また精製法が複雑になることから、製造コス
トが高くなる等の欠点があった。

【０００５】

【課題を解決するための手段】先に本発明者等は、広く
自然界よりα−グルコシダーゼを生産し得る微生物の検
索を行なった結果、土壌中より分離したバチルス(Bacil
lus)属に属する一菌株が、マルトース、マルトトリオー
ス、マルトテトラオース、ＰＮＰＧ、ＰＮＰＧ２には作
用するが、可溶性澱粉には作用しないという性質を有す
る、安定性に優れた新規なα−グルコシダーゼを生産す
ることを見出した。（特願平8-342400号明細書） 更に、本発明者等は、上記目的に鑑み種々検討した結
果、バチルス エスピー(Bacillus sp.)KS-108a（本菌
株は工業技術院生命工学工業技術研究所に、FERMBP-533
7として寄託されている。）起源のα−グルコシダーゼ
遺伝子を単離及び構造決定することに成功し、更にま
た、α−グルコシダーゼをコードする遺伝子をベクター
ＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを得、この組み換え
体をエッシェリシア(Escherichia)属に属する菌株に含
ませたα−グルコシダーゼ生産能を有する菌株を培地に
培養すると、効率よくα−グルコシダーゼが生産される
こと等を見出し、本発明を完成した。

【０００６】即ち、本願の第１の発明は、以下の(a)ま
たは(b)のタンパク質をコードするα−グルコシダーゼ
遺伝子であり、 (a)配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパ
ク質 (b)アミノ酸配列(a)において１もしくは複数のアミノ酸
が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつα−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質 本願の第２の発明は、上記のα−グルコシダーゼ遺伝子
をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする新規な組
み換え体ＤＮＡであり、また本願の第３の発明は、上記
組み換え体ＤＮＡを含む形質転換体または形質導入体で
あり、また更に本願の第４の発明は、上記の形質転換体
または形質導入体を培地に培養し、培養物からα−グル
コシダーゼを採取することを特徴とするα−グルコシダ
ーゼの製造法である。

【０００７】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のα−グルコシダーゼ遺伝子は、例えば、次のよ
うにして得ることができる。先ず、元株であるバチルス
エスピー(Bacillus sp.)KS-108aを、例えば、Current
Protocols in Molecular Biology(WILEY Intersciens
e,1989)記載の方法等により培養し、得られた菌株から
染色体ＤＮＡを抽出する。上記バチルス エスピーKS-1
08aは、本発明者等が熊本県内の土壌より採取した菌株
であり、その菌学的性質は、以下に示すとおりである。
なお菌学的性質の同定のための実験は、主として長谷川
武治編著「微生物の分類と同定」東京大学出版会（1975
年）によって行なった。また分類同定の基準として、バ
ージーズマニュアル オブ デターミネイティブ バク
テリオロジー（第８版）（１９７４年）を参考にした。

【０００８】バチルス エスピーKS-108aの菌学的性質 （Ａ）形態的性質 顕微鏡的観察〔肉汁寒天培地（ｐＨ７．０）上で、５０
℃、５〜７時間培養〕。 （１）細胞の形及び大きさ：０．１〜０．５×１〜７ミ
クロンの桿菌。 （２）運動性の有無：運動性あり。 （３）胞子の有無：あり。 （４）グラム染色性：陽性。

【０００９】（Ｂ）各培地（ｐＨ７．０）における生育
状態 （１）肉汁寒天平板培養 ５０℃、１６時間の静置培養で、淡茶色の円形コロニー
を形成する。色素の産生は認められない。 （２）肉汁寒天斜面培養 ５０℃、１６時間の培養で生育を示す。 （３）肉汁液体培養 ５０℃、１６時間の静置培養で培地全体に微かな生育
（濁り）が認められる。厚い菌膜を生ずる。 （４）肉汁ゼラチン穿刺培養 ５０℃、３日間の静置培養で、ゼラチンを液化しない。 （５）リトマスミルク培養 ５０℃、４８時間の静置培養で、リトマスミルクの凝
固、液化は認められず、酸もしくはアルカリの産生も認
められない。

【００１０】（Ｃ）生理的性質 主に、ｐＨ７．０に調製した培地を用いて試験した。 （１）硝酸塩の還元：還元する。 （２）脱窒反応：無し。 （３）ＭＲテスト：陰性。 （４）ＶＰテスト：非常に弱いが陽性。 （５）インドールの生成：生成しない。 （６）硫化水素の生成：生成しない。 （７）デンプンの加水分解：加水分解しない。 （８）クエン酸の利用：利用する。 （９）無機窒素源の利用：硝酸塩、アンモニウム塩共に
利用する。 （１０）色素の生成：生成しない。 （１１）ウレアーゼ：陽性。 （１２）オキシダーゼ：弱いが陽性。 （１３）カタラーゼ：陽性。 （１４）生育の範囲：温度；３３〜５５℃、ｐＨ；６．
１〜９．４ （１５）酸素に対する態度：好気性。 （１６）Ｏ−Ｆテスト（Ｈｕｇｈ−Ｌｅｉｆｓｏｎ
法）：酸化（炭素源としてグルコースを０．５％添
加。） （１７）糖類からの酸及びガスの生成の有無： 酸の生成 ガスの生成 (１） Ｄ−グルコース ＋ − （２） Ｄ−フラクトース ＋ − （３） Ｄ−ガラクトース − − （４） Ｄ−マンノース ＋ − （５） Ｄ−キシロース ＋ − （６） Ｌ−アラビノース ＋ − （７） シュークロース ＋ − （８） マルトース ＋ − （９） ラフィノース − − （１０）Ｄ−マンニトール ＋ − （１１）Ｄ−ソルビトール − − （１２）グリセリン − − （１３）デキストリン − − （１４）デンプン − − （１５）イヌリン − −

【００１１】前記した菌学的性質を有し、新規なα−グ
ルコシダーゼ生産能を有する本菌株は、グラム染色が陽
性であること、運動性を有すること、胞子形成能を有す
ること等から、バチルス属に属するものと判定される。
従って、本菌株をバチルスエスピー(Bacillus sp.)KS-1
08aと同定命名した。本菌株は、工業技術院生命工学工
業技術研究所に、FERM BP-5337として寄託されている。

【００１２】上記で得られた染色体ＤＮＡを、例えば、
Sau3AI 等の制限酵素で部分消化し、常法に従いベクタ
ーＤＮＡに組み込む。用いられるベクターＤＮＡとして
は、例えば、pUC119(宝酒造社製)、pBR322(宝酒造社
製)、pBluescript II KS+(Stratagene社製)、pMAL-C2(N
EW England Labs社製)等のプラスミドＤＮＡ、λENBL3
(Stratagene社製)、λDASH II （フナコシ社製）等のバ
クテリオファージＤＮＡ等が挙げられる。得られた組み
換えＤＮＡを用いて、例えば、大腸菌K-12、好ましくは
大腸菌JM109（東洋紡社製）、XL1-Blue（フナコシ社
製）等を形質転換または形質導入して夫々の形質転換体
または形質導入体を得る。

【００１３】形質転換は、例えば、D.M.Morrisonの方法
(Method in Enzymology,68,326-331,1979)に行なうこと
ができる。また、形質導入は、例えば、B.Hohnの方法(M
ethod in Enzymology,68,299-309,1979)により行なうこ
とができる。

【００１４】上記形質転換体または形質導入体より純化
された新規な組み換え体ＤＮＡを得るには、例えば、ピ
ー・グーリー(P.Guerry)等の方法〔ジェイ．バクテリオ
ロジー(J.Bacteriology)、第１１６巻、第１０６４〜１
０６６頁(1973年)〕、デー・ビー・クレウェル(Clewel
l)の方法〔ジェイ．バクテリオロジー(J.Bacteriolog
y)、第１１０巻、第６６７〜６７６頁(1972年)〕等によ
り得ることができる。

【００１５】更に、上記α−グルコシダーゼ遺伝子を含
有するＤＮＡを用いて、実施例に示す３７０ＤＮＡSequ
encing System（アプライドバイオシステム社製）を用
いてα−グルコシダーゼ遺伝子の全塩基配列の解析を行
ない（配列番号２参照）、次いで、前記塩基配列を有す
る遺伝子によって翻訳されるポリペプチドのアミノ酸の
一次配列を確定する。（配列番号１参照）

【００１６】なお、配列番号１に示されるアミノ酸配列
において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もし
くは付加されおり、かつ、α−グルコシダーゼ活性をも
たらすアミノ酸配列をコードするα−グルコシダーゼ遺
伝子は、全て本発明に含まれる。

【００１７】そして、配列番号１に示されるアミノ酸配
列において、１もしくは複数、好ましくは、数個のアミ
ノ酸が欠失、置換もしくは付加されおり、かつ、α−グ
ルコシダーゼ活性をもたらすアミノ酸配列をコードする
α−グルコシダーゼ遺伝子を得るには、如何なる方法で
もよく、例えば、遺伝子に点変異または欠失変異を生じ
させるための周知技術である部位特定変異誘導法；遺伝
子を選択的に開裂し、次いで、選択されたヌクレオチド
を除去または付加し、遺伝子を連結する方法；オリゴヌ
クレオチド変異誘導法等が挙げられる。

【００１８】上記のようにして得られたα−グルコシダ
ーゼ生産能を有する形質転換体または形質導入体、例え
ば、エッシェリシア属に属する菌株を用いてα−グルコ
シダーゼを生産するには、下記のようにして行なうこと
ができる。上記微生物を培養するには、通常の固体培養
法で培養してもよいが、なるべく液体培養法を採用して
培養するのが好ましい。

【００１９】また、上記微生物を培養する培地として
は、例えば、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーン
ステイープリカーあるいは大豆もしくは小麦麹の浸出液
等の１種以上の窒素源に、リン酸二水素カリウム、リン
酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第２鉄、硫
酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上
を添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜
添加したものが用いられる。

【００２０】なお、培地の初発ｐＨは、７〜９に調整す
るのが適当である。また培養は、30〜42℃、好ましくは
37℃前後で６〜24時間、通気撹拌深部培養、振とう培
養、静置培養等により実施するのが好ましい。培養終了
後、該培養物よりα−グルコシダーゼを採取するには、
通常の酵素採取手段を用いることができる。

【００２１】培養物から、例えば、濾過、遠心分離等の
操作により菌体を分離し、洗菌する。そして、この菌体
からα−グルコシダーゼを採取することが好ましい。こ
の場合、菌体をそのまま用いることもできるが、凍結融
解法、超音波破砕機、フレンチプレス、ダイナミル等の
種々の破壊手段を用いて菌体を破壊する方法、リゾチー
ムの如き細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する
方法、トリトンＸ-100等の界面活性剤を用いて菌体から
酵素を抽出する方法等により、菌体からα−グルコシダ
ーゼを採取するのが好ましい。

【００２２】このようにして得られた粗酵素液からα−
グルコシダーゼを単離するには、通常の酵素精製に用い
られる方法が使用できる。例えば、硫安塩析法、有機溶
媒沈澱法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲル濾過クロ
マトグラフ法、吸着クロマトグラフ法、電気泳動法等を
適宜組み合わせて行なうのが好ましい。

【００２３】本発明の製法により得られるα−グルコシ
ダーゼは、以下の性質を有する。(ａ)作用：α−グルコ
シド結合を加水分解して、α−Ｄ−グルコースを生成す
る。 (ｂ)基質特異性：マルトース、マルトトリオース、マル
トテトラオース、パラニトロフェニル−α−Ｄ−グルコ
ピラノシド、パラニトロフェニル−α−Ｄ−マルトシ
ド、イソマルトース、シュークロースに作用するが、マ
ルトペンタオシド以上の重合度を持つマルトオリゴサッ
カライドにはほとんど作用せず、可溶性澱粉には全く作
用しない。 (ｃ)至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：至適ｐＨは、６．０〜
９．０近辺であり、安定ｐＨ範囲は、０．２％牛血清ア
ルブミン存在下で２５℃、２０時間の処理で、ｐＨ５．
０〜１０．０である。 (ｄ)作用適温の範囲：作用適温の範囲は、５２〜５５℃
近辺である。 (ｅ）ｐＨ、温度等による失活の条件：０．２％牛血清
アルブミン存在下で２５℃、２０時間の処理で、ｐＨ
５．０〜１０．０の範囲で安定であり、ｐＨ４．５以下
またはｐＨ１１．０以上で完全に失活する。また、熱安
定性は、ｐＨ７．０、１５分間の処理で５０℃まで安定
であり、６０℃以上で完全に失活する。 (ｆ)分子量：約６１，３００±５，０００（ゲル濾過
法）。

【００２４】力価の測定法：本酵素の力価の測定は、下
記の方法で行ない、ＰＮＰＧより１分間に１μｍｏｌの
パラニトロフェノールを遊離する酵素量を１単位（Ｕ）
とした。

【００２５】（基質液、緩衝液、反応停止液、酵素希釈
液の調製） １液；基質液 ２０ｍＭ ＰＮＰＧ溶液 ＰＮＰＧ ０．６０３ｇを蒸留水に溶解し、１００ｍｌ
とした。 ２液；緩衝液 ０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０ ０．１Ｍ−リン酸１カリウム液と０．１Ｍ−リン酸２カ
リウム液を混合してｐＨ７．０に調製した。 ３液；反応停止液 ０．２Ｍ 炭酸ナトリウム液 ２１．２ｇの無水炭酸ナトリウムを蒸留水に溶解し１０
００ｍｌとした。 酵素希釈液 ０．２％ＢＳＡ含有０．０１Ｍ リン酸カリウム緩衝液
ｐＨ７．０を調製した。

【００２６】（測定手順）先ず、前記した１液 ０．２
５ｍｌ、２液 ０．５ｍｌを混合し、３７℃にて５分間
プレインキュベーションした後、該プレインキュベーシ
ョンした液と０．００５〜０．０３Ｕ／ｍｌ付近に調製
した酵素液０．２５ｍｌを混合し、３７℃において１５
分間正確に反応させた。次いで、反応時間終了後、３液
１ｍｌを添加して反応を停止させ、パラニトロフェノー
ルを発色させ、その発色液を分光光度計（Ｕ−２０００
Ａ、日立社製）で４００ｎｍにおけるサンプルの吸光度
を測定した。なお、ブランク値の測定は、基質液、緩衝
液を混合、プレインキュベーションの後、酵素液を添加
せず正確に１５分間インキュベーションを行ない、３液
１ｍｌを添加し、その後に酵素液を添加してブランク吸
光度を測定した。

【００２７】（力価の計算）前記の測定法で求めたサン
プル吸光度、ブランク吸光度の各値から、下式によって
力価を求めた。

【００２８】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明する。 （実施例）

【００２９】(1)元株の染色体の調製 バチルス エスピー(Bacillus sp.)KS-108a(FERM BP-53
37)をＴＹ培地（１％バクトトリプトン、0.5 ％バクト
イースト・エクストラクト、0.5 ％ 塩化ナトリウム、
ｐＨ ７．０）１００ ｍｌに接種して、５０℃で１２時
間振とう培養し培養物を得た。この培養物を６０００ｒ
ｐｍで１０分間遠心分離することにより集菌して菌体を
得た。この菌体よりCurrent Protocols in Molecular B
iology(WILEY Intersciense,1989)記載の方法に従い、
染色体ＤＮＡ１．２６ｍｇを得た。

【００３０】(2)ショットガン法による目的遺伝子のク
ローニング 上記の方法で得られたＤＮＡ ５０μｇを制限酵素Ｓａ
ｕ３ＡＩ（宝酒造社製）で部分分解を行ない、得られた
部分分解ＤＮＡについてアガロースゲル（０．７％）電
気泳動を行ない約４〜９ｋｂｐのサイズのＤＮＡ断片を
取得した。一方制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で切
断したpBluescript II KS+(Stratagene社製)を、バクテ
リアルアルカリホスファターゼ（宝酒造社製）により脱
リン酸化処理した後、両ＤＮＡをタカラライゲーション
キット・バージョンII（宝酒造社製）を用いて、１６
℃、１２時間反応させライゲーション反応を行ないＤＮ
Ａを連結した。連結したＤＮＡを用いて、大腸菌ＪＭ１
０９（東洋紡社製）のコンピテントセルを形質転換し、
その形質転換体をα−グルコシダーゼ活性検出培地
〔０．５％ 酵母エキス、１％ トリプトン、０．５％
塩化ナトリウム、５０μg／ｍｌアンピシリン、１
ｍＭ イソプロピルチオ−β−D−ガラクトシド（ＩＰ
ＴＧ）、０．２ ｍＭ パラニトロフェニル−α−Dー
グルコシド（ＰＮＰＧ）、２％ アガロースを含むプレ
ート培地〕に塗布した。ＰＮＰＧ加水分解活性（α−グ
ルコシダーゼ活性）の検出は、上記培地に生育し、かつ
パラニトロフェノールの黄色い発色を示すコロニーを指
標に行なった。この結果、同活性を示す形質転換体の取
得に成功した。同活性を有する株の保有するプラスミド
には約４ｋｂｐの挿入ＤＮＡが存在しており、このプラ
スミドをｐＧＬＳ１０１と命名した。該形質転換株大腸
菌(E.coli)ＪＭ１０９（ｐＧＬＳ１０１）は、工業技術
院生命工学工業技術研究所にFERM BP-５９１４として寄
託されている。

【００３１】活性の確認 大腸菌(E.coli)ＪＭ１０９（ｐＧＬＳ１０１）を５０
μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＴＹ培地（１％バクト
トリプトン、０．５％バクトイースト・イクストラク
ト、０．５％塩化ナトリウム、ｐＨ７．０）１０ｍｌに
て３７℃、１４時間振とうした後、培養液を超音波処理
にて破砕、遠心分離の後、その上清を前述した酵素活性
測定法によりα−グルコシダーゼ活性を測定したとこ
ろ、約 ０．５Ｕ／ｍｌであった。

【００３２】α−グルコシダーゼ遺伝子の解析 大腸菌(E.coli)ＪＭ１０９(ｐＧＬＳ１０１)の活性が確
認されたので、ｐＧＬＳ１０１の挿入断片がα−グルコ
シダーゼ遺伝子を含むことが明らかとなった。そこで、
このプラスミドＤＮＡについて370DNA Sequencing Syst
em（アプライドバイオシステム社製）を用いて塩基配列
の決定を行なった。決定した塩基配列を配列番号２に、
また、該ＤＮＡ配列から翻訳されるポリペプチドのアミ
ノ酸配列を配列番号１に夫々示した。α−グルコシダー
ゼ遺伝子は、１７０４ｂｐのコーディング領域をもち、
５６８個のアミノ酸残基をコードしているものであっ
た。

【００３３】

【発明の効果】本発明によれば、Ｋｍ値が小さく、基質
特異性及び安定性に優れたα−グルコシダーゼを効率よ
く生産することができる。

【配列表】

【００３４】配列番号：１ 配列の長さ：５６８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Met Ser Gln Trp Trp Lys Glu Ala Val Val Tyr Gln Ile Tyr Pro 5 10 15 Arg Ser Phe Tyr Asp Ser Asn Gly Asp Gly Phe Gly Asp Leu Gln 20 25 30 Gly Val Ile Gln Lys Leu Asp Tyr Ile Lys Ser Leu Gly Ala Asp 35 40 45 Val Ile Trp Leu Cys Pro Val Phe Asp Ser Pro Gln Asp Asp Asn 50 55 60 Gly Tyr Asp Ile Ser Asp Tyr Arg Ser Ile Tyr Glu Lys Phe Gly 65 70 75 Thr Asn Asp Asp Met Phe Gln Leu Ile Asp Glu Val His Lys Arg 80 85 90 Gly Met Lys Ile Ile Met Asp Leu Val Val Asn His Thr Ser Asp 95 100 105 Glu His Ala Trp Phe Ala Glu Ser Arg Lys Ser Lys Asp Asn Pro 110 115 120 Tyr Arg Asp Tyr Tyr Phe Trp Lys Asp Pro Lys Ala Asp Gly Ser 125 130 135 Glu Pro Asn Asn Trp Gly Ser Ile Phe Ser Gly Pro Ala Trp Thr 140 145 150 Leu Asp Glu Arg Thr Gly Gln Tyr Tyr Leu His Tyr Phe Ser Lys 155 160 165 Lys Gln Pro Asp Leu Asn Trp Glu Asn Glu Ala Val Arg Arg Glu 170 175 180 Val Tyr Asp Leu Met Thr Phe Trp Met Asp Arg Gly Val Asp Gly 185 190 195 Trp Arg Met Asp Val Ile Gly Ser Ile Ser Lys Phe Val Asp Phe 200 205 210 Pro Asp Tyr Glu Thr Asp Asp Ser Arg Pro Tyr Val Val Gly Arg 215 220 225 Tyr His Ser Asn Gly Pro Arg Leu His Glu Phe Ile Gln Glu Met 230 235 240 Asn Arg Glu Val Leu Ser Arg Tyr Asp Cys Met Thr Val Gly Glu 245 250 255 Ala Asn Gly Ser Asp Val Glu Glu Ala Lys Lys Tyr Thr Asp Pro 260 265 270 Ser Arg His Glu Leu Asn Met Ile Phe Thr Phe Glu His Met Asp 275 280 285 Ile Asp Thr Lys Gln His Ser Pro Asn Gly Lys Trp Gln Met Lys 290 295 300 Pro Phe Asp Pro Ile Ala Leu Lys Lys Thr Met Thr Arg Trp Gln 305 310 315 Thr Ala Leu Met Asn Val Gly Trp Asn Thr Leu Tyr Phe Glu Asn 320 325 330 His Asp Gln Pro Arg Val Ile Ser Arg Trp Gly Asn Asp Arg Glu 335 340 345 Leu Arg Lys Gln Cys Ala Lys Ala Phe Ala Thr Val Leu His Gly 350 355 360 Met Lys Gly Thr Pro Phe Ile Tyr Gln Gly Glu Glu Ile Gly Met 365 370 375 Thr Asn Ser Glu Met Pro Leu Glu Met Tyr Asp Asp Leu Glu Ile 380 385 390 Lys Asn Ala Tyr Arg Glu Leu Val Ile Glu Asn Lys Thr Met Thr 395 400 405 Glu Glu Asp Phe Arg Lys Ala Val Ala Lys Lys Gly Arg Asp His 410 415 420 Ala Arg Thr Pro Met Gln Trp Asp Asp Gly Lys Tyr Ala Gly Phe 425 430 435 Thr Asp Gly Glu Pro Trp Leu Ala Val Asn Pro Arg Tyr Gln Glu 440 445 450 Ile Asn Val Lys Glu Ser Leu Ala Asp Glu Asp Ser Ile Phe Tyr 455 460 465 Tyr Tyr Gln Lys Leu Ile Gly Leu Arg Lys Gln Asn Lys Val Ile 470 475 480 Val Tyr Gly Asp Tyr Arg Leu Leu Leu Glu Glu Asp Pro Arg Ile 485 490 495 Phe Ala Tyr Ile Arg Glu Tyr Arg Gly Glu Lys Leu Leu Val Ala 500 505 510 Val Asn Leu Ser Glu Glu Lys Ala Leu Phe His Ala Ser Pro Glu 515 520 525 Leu Leu Glu Asp Arg Trp Asp Val Leu Leu Ser Asn Tyr Ala Arg 530 535 540 Glu Arg Leu Asn Ile Ser Gly Ser Ile Asp Met Glu Pro Tyr Glu 545 550 555 Ala Phe Met Met Ile Ser Arg Ala Lys Asp Tyr Thr Ser 560 565 568

【００３５】配列番号：２ 配列の長さ：１７０４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：染色体ＤＮＡ 起源：バチルス エスピーKS-108a 菌名：FERM BP-5337 配列： ATG AGC CAA TGG TGG AAA GAG GCA GTC GTG TAT CAA ATT TAC CCG CGG 48 AGT TTT TAT GAT TCC AAC GGA GAC GGC TTC GGT GAT TTG CAG GGG GTG 96 ATT CAA AAG CTC GAT TAC ATC AAA AGC CTT GGA GCC GAT GTC ATA TGG 144 CTG TGT CCT GTG TTT GAT TCC CCG CAG GAT GAC AAC GGC TAC GAC ATC 192 AGC GAC TAT AGA AGC ATA TAC GAA AAG TTC GGG ACG AAC GAT GAT ATG 240 TTT CAA TTG ATT GAT GAA GTG CAT AAA CGC GGA ATG AAA ATC ATT ATG 288 GAT CTT GTC GTG AAT CAC ACG TCT GAT GAA CAT GCC TGG TTT GCC GAA 336 AGC CGC AAG TCA AAG GAC AAT CCT TAC CGT GAT TAT TAT TTT TGG AAG 384 GAT CCA AAG GCG GAC GGT TCA GAG CCG AAC AAT TGG GGA TCG ATC TTT 432 TCA GGG CCG GCA TGG ACG CTC GAT GAG CGG ACA GGA CAG TAT TAT CTT 480 CAC TAC TTT TCG AAA AAG CAG CCT GAC TTA AAC TGG GAG AAT GAA GCG 528 GTT CGC CGC GAA GTA TAC GAT TTG ATG ACA TTT TGG ATG GAC AGA GGC 576 GTG GAC GGC TGG CGG ATG GAC GTG ATC GGT TCC ATC TCC AAA TTC GTC 624 GAC TTT CCC GAT TAT GAA ACA GAT GAC AGC CGT CCA TAT GTC GTC GGC 672 CGC TAT CAT TCG AAC GGC CCC CGT CTG CAC GAA TTT ATA CAA GAG ATG 720 AAC CGG GAA GTG CTG TCC CGT TAC GAC TGT ATG ACG GTC GGC GAA GCA 768 AAC GGC TCA GAT GTT GAA GAA GCG AAA AAA TAC ACG GAT CCA AGC AGA 816 CAT GAG CTG AAC ATG ATT TTT ACA TTT GAA CAT ATG GAT ATT GAT ACC 864 AAA CAG CAT TCT CCG AAT GGG AAA TGG CAG ATG AAG CCG TTT GAC CCG 912 ATC GCT TTA AAA AAG ACG ATG ACG AGG TGG CAG ACC GCT TTA ATG AAT 960 GTC GGC TGG AAT ACG CTT TAT TTC GAA AAT CAT GAT CAG CCG AGG GTC 1008 ATA TCC CGC TGG GGC AAT GAC CGC GAG CTC CGC AAA CAA TGC GCC AAA 1056 GCA TTT GCA ACA GTT CTG CAC GGC ATG AAG GGA ACC CCG TTC ATT TAT 1104 CAA GGT GAA GAA ATC GGC ATG ACA AAC AGC GAG ATG CCG CTC GAA ATG 1152 TAT GAT GAT CTC GAA ATC AAA AAC GCA TAC CGC GAA CTT GTC ATT GAA 1200 AAC AAA ACG ATG ACA GAG GAA GAC TTT CGA AAA GCC GTG GCG AAA AAA 1248 GGG CGG GAT CAT GCG AGA ACG CCG ATG CAA TGG GAT GAC GGG AAA TAC 1296 GCG GGC TTT ACG GAT GGA GAG CCT TGG CTG GCG GTA AAT CCC CGC TAT 1344 CAA GAA ATC AAT GTG AAA GAG TCG CTT GCC GAT GAA GAT TCG ATT TTC 1392 TAT TAT TAT CAG AAG CTC ATC GGG CTG CGC AAA CAA AAT AAA GTC ATC 1440 GTG TAC GGA GAC TAT CGG CTG CTG CTC GAG GAA GAT CCG CGA ATC TTT 1488 GCG TAT ATC CGC GAA TAT CGG GGC GAA AAG CTG TTA GTC GCC GTG AAT 1536 TTA TCA GAA GAA AAG GCG CTG TTT CAT GCT TCG CCG GAA TTG CTT GAG 1584 GAC AGA TGG GAT GTG CTG TTG TCA AAC TAC GCC CGA GAG CGG CTT AAT 1632 ATA AGC GGC AGT ATC GAC ATG GAG CCT TAT GAA GCT TTC ATG ATG ATC 1680 AGC CGG GCA AAG GAT TAC ACA TCA 1704

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/26 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の(a)または(b)のタンパク質をコ
   ードするα−グルコシダーゼ遺伝子。 (a)配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパ
   ク質 (b)アミノ酸配列(a)において１もしくは複数のアミノ酸
   が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からな
   り、かつα−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質
2. 【請求項２】 請求項１記載のα−グルコシダーゼ遺
   伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする新規
   な組み換え体ＤＮＡ。
3. 【請求項３】 請求項２記載の組み換え体ＤＮＡを含
   む形質転換体または形質導入体。
4. 【請求項４】 請求項３記載の形質転換体または形質
   導入体を培地に培養し、培養物からα−グルコシダーゼ
   を採取することを特徴とするα−グルコシダーゼの製造
   法。