JPH0530976A - 耐熱性スーパーオキシドジスムターゼをコードする遺伝子及びそれを含むプラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 高度好熱性細菌サーマス属由来の耐熱性を有
するスーパーオキシドジスムターゼをコードしているＤ
ＮＡ配列。 【効果】 本発明によって、サーマス属に属するサーマ
ス・アクアティカスYT-1が有する極めて耐熱性の強い、
マンガン型スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ−
Ｔ）をコードする遺伝子の配列及びそれから推定される
アミノ酸配列が明らかとなった。また、本発明により、
遺伝子工学的に耐熱性ＳＯＤを大量に生産する製造方法
が提供され、サーマス属の菌体から分離、精製するより
も極めて経済的に天然のものと同等の耐熱性を有するＳ
ＯＤを生産することが可能となった。また、本発明のＤ
ＮＡ配列をもつオリゴヌクレオチドもしくはＤＮＡ断片
あるいはその一部の配列のＤＮＡ断片をプローブとし
て、他のサーマス属菌種あるいはサーマス属と近縁の他
属の生物のスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子をクロ
ーニングすることも、常法によって可能となった。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、高度好熱性細菌である
サーマス属に属する菌株が生産する耐熱性スーパーオキ
シドジスムターゼをコードするＤＮＡ配列に関するもの
である。スーパーオキシドジスムターゼはＥＣ１．１
５．１．１．に分類される酵素であり、超酸化物不均化
酵素とも呼ばれる。このＤＮＡ配列でコードされるスー
パーオキシドジスムターゼは高い耐熱性を持ち、７５〜
８０℃でも活性を失わないという特徴を有しており、熱
に対して極めて安定であり、常温でも活性がある。その
ため、炎症剤や放射線防御剤などの医薬として、さらに
は研究試薬，酵素電極，バイオリアクター用酵素等とし
て極めて有用なものである。

【０００２】

【従来の技術】スーパーオキシドジスムターゼは活性酵
素（O₂ ^- ) を酸素（O₂) と過酸化水素（H₂O₂）に不均化
する酵素で、ほとんどの生物に存在し、生体中で、活性
酸素によるＤＮＡの損傷、過酸化物の生成を防止すると
いう、極めて重要な役割を担っている。また、この酵素
は活性中心に金属を含むもので、銅／亜鉛型, 鉄型及び
マンガン型の３種類のスーパーオキシドジスムターゼ
（以下、ＳＯＤと略称することがある。）が知られてい
る。すでに多くの生物のＳＯＤが分離、精製され、その
性質が決定されている。しかし、このうち高度好熱性細
菌であるサーマス（Thermus ）属のMn型ＳＯＤの遺伝子
配列については報告された例はまだない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】微生物由来のＳＯＤ
は、菌体内に比較的微量にしか存在せず、またその他の
共存タンパク質と分離して精製するのは、多くの労力を
要し、経済的にも不利である。ＳＯＤを効率的に生産
し、精製しやすくするためには、遺伝子工学的な生産が
理想的である。しかし、高度好熱性細菌のＳＯＤに関し
ては、前述したように、その遺伝子配列はまだ報告され
ていない。本発明の目的は、高度好熱性細菌由来のＳＯ
Ｄ遺伝子の塩基配列を決定し、ＳＯＤの遺伝子工学的な
生産を可能とすることにより、耐熱性のＳＯＤを効率的
に製造することを可能とすることである。

【０００４】また、本発明によって得られたＤＮＡ配列
を持つオリゴヌクレオチドもしくはＤＮＡ断片あるいは
その一部の配列のＤＮＡ断片をプローブとして、他のサ
ーマス属菌種あるいはサーマス属と近縁の他属の生物の
スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子をクローニングす
ることも可能となる。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意検討
した結果、サーマス・アクアティカス(Thermus aquatic
us)YT-1 株が持つ染色体ＤＮＡからMn−型ＳＯＤ（以
下、ＳＯＤ−Ｔと称することがある。）遺伝子を分離す
ることに成功した。また、ＳＯＤ−Ｔ遺伝子の全塩基配
列を決定することが出来た。さらに、このようなＳＯＤ
−Ｔ遺伝子を組み込んだプラスミドで形質転換された微
生物を用いることによって、耐熱性を有するＳＯＤ−Ｔ
を極めて効率良く生産することが出来ることを見出し
た。特に、大腸菌などの中温性菌にＳＯＤ−Ｔ遺伝子を
導入して、ＳＯＤ−Ｔを生産させた場合、生産されたＳ
ＯＤ−Ｔは天然物と同等の耐熱性を有するので、このよ
うな大腸菌菌体を遠心分離等によって回収し、超音波等
の手段で破砕した後、単に７０〜８０℃程度の加熱を一
定時間行うだけで、ＳＯＤ−Ｔ以外の大腸菌由来の菌体
タンパク質は大部分熱変性して不溶化する。次いで、こ
れを遠心分離することにより、可溶性の画分に含まれる
タンパク質の大部分がＳＯＤ−Ｔである溶液が得られ
た。それ故、極めて容易にＳＯＤ−Ｔを分離、精製する
ことが可能となった。本発明はかかる知見により完成さ
れたものである。

【０００６】本発明は、高度好熱性細菌サーマス属由来
の耐熱性を有するスーパーオキシドジスムターゼをコー
ドしているＤＮＡ配列を提供するものである。

【０００７】本発明のに用いる高度好熱性細菌サーマス
属微生物としては、例えばサーマス・アクアティカスYT
-1株がある。本菌は、アメリカンタイプカルチャーコレ
クションにＡＴＣＣ２５１０４として寄託されており、
何人も入手可能である(American Type Culture Collect
ion Catalogue of Bacteria and Phages 17th ed. 1989
参照）。

【０００８】本発明の上記ＤＮＡ配列の決定は次の方法
で行うことが出来る。 （１）ＳＯＤ−ＴをコードするＳＯＤ−Ｔ遺伝子のクロ
ーニング。 本発明にかかわるクローニングの基本的手法は、例えば
J.Sambrook,E.F.Fritsch, T. Maniatis(ed.), "Molecu
lar Cloning:A Laboratory Manual,2nd edition,"Cold
Spring Harbor Laboratory Press,1989 等に詳しく紹介
されており、何人も実行可能である。

【０００９】まず、サーマス・アクアティカスYT-1株を
栄養培地で培養し、菌体を回収後、Saito-Miura 法[Bio
chim. Biophys. Acta, 72,619(1963)]などにより染色体
ＤＮＡを抽出し、制限酵素で切断する。これをアガロー
ス電気泳動した後、メンブランフィルターに、例えばサ
ザンの方法[E,M,Southern, J. Biol.Chem.98, 508(197
5)]で移行させる（以降、サザントランスファーと称す
ることがある。）。一方、天然のＳＯＤ−ＴのＮ−末端
のアミノ酸配列を参考にして合成したオリゴヌクレオチ
ドをプローブとしてハイブリダイゼーションを実施す
る。合成オリゴヌクレオチドと特異的にハイブリダイズ
するバンドが見出されたなら、その大きさに相当するＤ
ＮＡ断片をアガロースゲルから抽出する。一方、適当な
ベクタープラスミドを同じ制限酵素で切断したのち、こ
の抽出した断片をリガーゼを用いて連結させる。この連
結したＤＮＡを用いて標準的な方法で宿主となりうる細
菌を形質転換し、得られた形質転換株のうち、コロニー
ハイブリダイゼーションにより前記のプローブと特異的
にハイブリダイズするコロニーを釣菌し、これらの中か
らＳＯＤ−Ｔ遺伝子を含むと予想されるプラスミドを抽
出する。次いで、このプラスミドの制限酵素地図を常法
に従い作製する。一方、これらの分解したＤＮＡ断片を
アガロース電気泳動し、メンブランにサザントランスフ
ァーし、このメンブランを用いてＳＯＤ−Ｔ遺伝子に特
異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプロー
ブとしてハイブリダイゼーションを実施する。プローブ
にハイブリダイズしたバンドを制限酵素地図より特定す
る。

【００１０】（２）ＳＯＤ−Ｔ遺伝子のＤＮＡ配列の決
定 ＳＯＤ−Ｔ遺伝子を含んでいると予測される領域につい
て、そのＤＮＡ配列の全ＤＮＡ配列を常法により決定す
る。このように決定された配列から、そのコードするア
ミノ酸配列を推定し、それを天然物のアミノ酸配列と比
較することによって、その領域がＳＯＤ−Ｔのタンパク
をコードしているか否かを知ることが出来る。このよう
にして得られたＳＯＤ−Ｔ遺伝子配列の知見に基づい
て、ＳＯＤ−Ｔ遺伝子を含むプラスミドの中からＳＯＤ
−Ｔ遺伝子を含む領域を切り出して適当な市販の発現ベ
クターに組み込み、ＳＯＤ−Ｔを遺伝子工学的に生産す
ることが可能となる。

【００１１】（３）ＳＯＤ−Ｔ遺伝子の発現 本発明のＳＯＤ−ＴをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮ
Ａ断片を適当なプラスミドに組み込み、これを大腸菌な
どの適当な微生物に導入して形質転換し、該形質転換微
生物を培養してＳＯＤ−Ｔを生産することが出来る。Ｓ
ＯＤ−Ｔ遺伝子のアミノ酸をコードする配列を同じアミ
ノ酸をコードする別の塩基で置換することも可能であ
る。また、同等の機能を有する別のアミノ酸をコードす
る塩基に置換することも可能である。ＤＮＡ配列中の一
部の塩基を他の塩基で置換することは、部位特異的変更
法等の常法により容易に可能である。

【００１２】本発明においてクローニング，サブクロー
ニング及びＤＮＡ配列決定等に用いる宿主，プラスミ
ド，試薬，酵素類等はいずれも市販されており、容易に
入手できる。上述したことから明らかな如く、本発明の
ＳＯＤ−Ｔ遺伝子の解明によって初めて可能となったＳ
ＯＤ−Ｔ遺伝子工学的な生産により、耐熱性の非常に高
いＳＯＤ−Ｔを効率良く生産できるので、本発明は産業
上極めて有用なものである。

【００１３】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明する。 実施例１ サーマス・アクアティカスYT-1からの染色体ＤＮＡの抽
出サーマス・アクアティカスYT-1(ATCC25104）株を特公
昭６２−１１０９２号公報に記載の方法と同様に培養し
た。培養後、菌体を遠心分離で回収後、菌体６ｇ（湿物
量）からSaito-Miure 法（前出）に従って染色体ＤＮＡ
を得た。

【００１４】実施例２ オリゴヌクレオチドプローブの作製 ＳＯＤ−Ｔ遺伝子を染色体ＤＮＡの制限酵素分解断片か
ら検出するために合成オリゴヌクレオチドをプローブと
して用いた。サーマス・アクアティカスYT-1の菌体より
抽出、精製されたＳＯＤ−Ｔの化学的分析により、Ｎ−
末端側の一部のアミノ酸配列がすでに明らかとなってい
る[S.Sato and J.I.Harris, Eur. J.Biochem. 73,373(1
977)] 。このアミノ酸配列から、それをコードするＤＮ
Ａの配列を推定し、図１に示したイノシン（Ｉ）１３個
を含む９９mer のオリゴヌクレオチドを合成し、プロー
ブとした。

【００１５】プローブの設計においてサーマス属の遺伝
子のコドンの利用率においてコドンの３番目の塩基が著
しくＧかＣに偏っているということを利用して、３番目
の塩基をＧかＣあるいはイノシンに置き換えて合成し、
混合オリゴヌクレオチドとなるのを避けた。合成にはア
プライドバイオシステムズ社の３８１Ａ型ＤＮＡ合成機
を用いた。このプローブを５３pmol／μｌの濃度に調製
した。これをアマシャム社(Amersham Corp.)のＥＣＬ遺
伝子検出システムを用いて非放射性のラベリングを行っ
た。方法はアマシャム社のプロトコルに従った。具体的
には２μｌのオリゴヌクレオチド溶液（５３pmol）を１
８μｌの水に溶かして５分間煮沸後、冷却し、２０μｌ
のラベリング試薬（アマシャム社）を加え混合後、さら
に２０μｌグルタルアルデヒド溶液を加え混合した。３
７℃１０分間反応させプローブ溶液とした。

【００１６】実施例３ ハイブリダイゼーション 実施例１で得られた染色体ＤＮＡ約１００μｇをHind I
II，Pst I, Kpn Iで分解し、常法によりアガロース電気
泳動した。このゲルをサザントランスファーを行い、Ｄ
ＮＡをナイロンメンブラン(Hybond N , アマシャム社
製）に移した。0.４Ｎ NaOH で２０分固定後、２× SSC
で約３０秒すすいだ。この膜を0.５Ｍ NaCl , ５％ブロ
ッキング剤（アマシャム社製）を含むハイブリダイゼー
ションバッファー(ECL用, アマシャム社製）５０mlに入
れ、密閉容器内で４２℃にて１０分間プレハイブリダイ
ゼーションを行った。次に、実施例２で作製したプロー
ブ溶液約６０μｌ全量を加えて４０℃で一昼夜ゆっくり
と振とうしながらハイブリダイゼーション反応を行っ
た。その後、メンブランを取り出し洗浄液Ｉ（６Ｍ尿
素，0.５×SSC 、４２℃）約１００mlで２０分間の洗浄
を２回行った後、５×SSCで室温にて５分間、２回洗浄
し、これをＥＣＬ検出試薬（アマシャム社製）によりフ
ィルムに感光させた。その結果、約2.８KbのHind III断
片にハイブリダイズすることが明らかとなった（図
２）。

【００１７】実施例４ マルチクローニングサイトを持ちアンピシリン耐性を有
するベクタープラスミドの回収 プラスミドpUC118あるいはpUC119（宝酒造製）を保持す
る宿主E.coli MV1184株をＬブロス（トリプトン１％，
酵母エキス0.５％，NaCl0.５％，グルコース0.２％、pH
7.０、アンピシリン５０μｇ／ml含有）で一昼夜培養
後、菌体を遠心分離により回収し、これよりアルカリ溶
菌法でプラスミドを回収した。次いで、Hind IIIで完全
に分解し、バクテリアルアルカリフォスファターゼで処
理することにより５’末端のリン酸基を除去し、ベクタ
ーとした。

【００１８】実施例５ ＳＯＤ−Ｔを含むＤＮＡ断片のベクターへの組み込みと
形質転換 サーマス・アクアティカスYT-1の染色体ＤＮＡ約１００
μｇを新たにHind IIIで完全に分解し、アガロース電気
泳動を実施した。約2.８Kbに相当するHind III断片をゲ
ルから切り出し、常法により抽出した。このＤＮＡ断片
約0.１μｇを、実施例４で得たpUC119のHind III分解物
約0.５μｇと混合し常法に従い、Ｔ４リガーゼを用いて
ライゲーションした。この約0.１μｇをあらかじめルビ
ジウム法[S.R.Kushner,in "Genetic Engineering",ed.b
y H.B. Boyer and S.Nicosia, Elsevier/North-Hollan
d,Amsterdam, 1978, pp.17-23] に従ってコンピテント
化したE. coli MV1184のコンピテントセル１００μｌ
に、上記ＤＮＡ0.１μｇを加え、０℃に３０分おいたの
ち、４3.５℃で３０秒ヒートショックを加え、１mlのＬ
−ブロスを加えた。次に、３７℃で１時間振とう培養し
た。この培養液を、表面にナイロンメンブラン(Hybond
N,アマシャム社製）を敷いたＨ−プレート寒天培地〔１
％バクトトリプトン，0.８％ NaCl,1.２％寒天，0.０５
mM Isopropylβ−D-thiogalactopyranoside(IPTG),５０
μｇ/ml アンピシリン，５０μｇ/ml 5-bromo-4-chloro
-3-indolyl−β−D-galactoside(X-gal)含有〕のメンブ
ラン表面に塗布した。

【００１９】３７℃で培養後、コロニーが、肉眼で見え
る程度の大きさに成長したとき、同じ大きさのメンブラ
ンを重ねてレプリカをとった。オリジナルとレプリカの
メンブランをそれぞれＨ−プレート表面にのせて、さら
に約８時間培養した。このレプリカのメンブランを風乾
後、0.５N NaOH, 1.５M NaClバッファーで５分間、２回
処理してアルカリ変性した。次に、1.５M NaCl, 0.５M
Tris HCl (pH7.５）0.００１mM EDTA で５分間、２回中
和したのち３×SCC で１０分間、１回洗浄した。次に、
0.４N NaOHで２０分間アルカリ固定し、５×SCC で軽く
洗浄した。このメンブランを実施例３と同様にＳＯＤ−
Ｔのプローブを用いたハイブリダイゼーションに用い
た。その結果、合計２０２個のコロニーのうち７個がＳ
ＯＤ−Ｔのプローブと特異的にハイブリダイズすること
がわかった。オリジナルのプレートから、対応するコロ
ニーを釣菌し、Ｌ−ブロスで培養したのち、菌体からア
ルカリ溶菌法でプラスミドを抽出した。これらのプラス
ミドの制限酵素分解パターンを比較したところ、すべて
同一の断片がクローニングされていることが明らかとな
った。制限酵素地図を図３に示す。

【００２０】実施例６ ＳＯＤ−Ｔ遺伝子の全ＤＮＡ配列の決定 図３に示した制限酵素地図のうち、ＳＯＤ−Ｔのタンパ
クをコードしていると考えられる領域について、サンガ
ーのジデオキシ法[F.Sanger, S.Nicklen and A.R. Coul
son, Proc. Natl.Acad. Sci. U.S.A., 74, 5463(1977)]
に従った方法により、その全ＤＮＡ配列を決定した。具
体的には、アプライドバイオシステムズ社の３７０Ａ
ＤＮＡシーケンサーを用いて行った。

【００２１】このようにして、ＳＯＤ−Ｔをコードして
いる構造遺伝子部分を完全に決定することが出来た。配
列表の配列番号２にＳＯＤ−Ｔの構造遺伝子のＤＮＡ配
列並びにそれから推定されるアミノ酸配列を示した。こ
の結果、ＳＯＤ−ＴはＡＴＧを開始コドンとして、２０
４個のアミノ酸に相当する塩基によりコードされている
ことが明らかとなった。また、推定される分子量は開始
メチオニンを含めると２２９０3.９ダルトンであった。

【００２２】実施例７ ＳＯＤ−Ｔ遺伝子の大腸菌での発現 実施例５で得られた約2.８KbのHind III断片を含むプラ
スミドpHS6と、このpHS6をHind III,SacI で分解しＳＯ
Ｄ−Ｔ遺伝子を含む断片を回収し、pUC119のHind III，
SacIサイトに挿入して構築したpS６を図４に示した。こ
れらを持つ大腸菌ではＳＯＤ−Ｔ遺伝子が発現したが、
pHS6についてその例を示す。pHS6をもつ大腸菌E.coli M
V1184 株を２本の１０mlのＬ−ブロス（５０μｇ／mlア
ンピリシン含有）に接種し、３７℃で十分振盪しながら
培養し、６００nmにおける吸光度が約0.３に相当したと
ころで、一方にはIPTGを１mMになるように加え、さらに
１６時間培養後、1.５mlずつ４回にわけて８０００ｇ，
５分間で遠心分離を行い、菌体を回収した。次いで、こ
の菌体に１mlのバッファー（５０mM Tris HCl(pH8.
５），１mM CoCl₂) を加え、超音波で菌体を破砕した。
８０℃で３０分間加熱後、１５０００ｇで５分間遠心分
離を行い、上澄液を回収した。この上澄液のＳＯＤ活性
をシトクロムＣ法[J.M.McCord and I, Fridorich, J.Bi
ol. Chem., 244,6049(1969)]に従って測定した。その１
例を表１に示す。

【００２３】

【表１】 表１ 大腸菌におけるＳＯＤ−Ｔの生産例 ───────────────────────── プラスミド IPTGの有無 上澄液のＳＯＤ活性 （Ｕ／ml) ───────────────────────── pUC119 有 ０ pHS6 無 ７４3.１ 有 ８７7.５ ─────────────────────────

【００２４】実施例８ ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による大腸菌で生
産されたＳＯＤ−Ｔの確認 実施例７で得られた上澄液をレムリーの方法[Laemmli,
U.K.,Nature(London)227,680-685(1970)]に準じて、Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動により分析した。上
澄液５μｌをレムリーの方法に従って処理し、泳動した
結果を図５に示した。なお、濃縮ゲルは4.５％アクリル
アミドゲル、分離ゲルは１2.５％のアクリルアミドゲル
を使用した。また、分子量を比較するために、分子量マ
ーカーとして、フォスフォリラーゼｂ（９４，００
０）、アルブミン（６７，０００）、オボアルブミン
（４３，０００）、カルボニックアンヒドラーゼ（３
０，０００）、トリプシンインヒビター（２０，００
０）、α−ラクトアルブミン（１４，０００）を用い
た。なお、図５の各レーンの説明は次のとおりである。

【００２５】 レーン 試 料 の 説 明 ──────────────────────────────── １ pUC119を持つ大腸菌菌体 ２ pHS6を持つ大腸菌菌体（IPTGで誘導したもの） ３ pHS6を持つ大腸菌菌体を超音波破砕後、８０℃で３０分加熱処 理し、遠心して回収した上澄液（IPTGで誘導導したもの） ４ 同上（ただしIPTGで誘導しなかったもの） ５ pS6 をもつ大腸菌で生産したＳＯＤ−ＴをHPLCで精製したもの ６ サーマス・アクアティカスYT-1菌体から精製した天然物由来Ｓ ＯＤ−Ｔ ｍ 分子量マーカー ────────────────────────────────

【００２６】図５から明らかなように、pHS6をもつ大腸
菌はIPTGで誘導しても、誘導しなくても、分子量が約２
５，０００のＳＯＤ−Ｔタンパクと発現していることが
判った。また、このタンパクは加熱しても、変性せずに
上澄液に残ることが明らかとなった。このことにより、
本発明で明らかとなったＳＯＤ−Ｔ遺伝子を含むプラス
ミドpHS6を持つ大腸菌を用いてＳＯＤ−Ｔを生産した場
合、菌体破砕物を加熱し、遠心分離するだけで、極めて
効率良くＳＯＤ−Ｔを粗精製できることが明らかとなっ
た。

【００２７】実施例９ 大腸菌で生産されたＳＯＤ−Ｔの耐熱性 実施例７で示した大腸菌で生産したＳＯＤ−Ｔを、サー
マス・アクアティカスYT-1の菌体から精製したＳＯＤ−
Ｔ（天然物由来ＳＯＤ−Ｔ）、他の中温菌である大腸菌
由来のMn−型ＳＯＤ（シグマ社製）及び好熱性菌である
バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearot
hermophilus)由来のMn−型ＳＯＤ（シグマ社製）と、そ
の熱安定性を比較した。なお、大腸菌で生産したＳＯＤ
−ＴはMono Q HR5/5（ファルマシア社製）で精製し、Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動的に一本のバンドを
示すまで精製した（図５のレーン５に相当）。これら４
種類のMn−型ＳＯＤをタンパク量で約１００μg ／mlに
調製してバッファー（５０mM Tris HCl(pH8.５）、１mM
CoCl₂）に溶解した。この溶液を８０℃及び７０℃でそ
れぞれ0.５，２，５，２４時間インキュベートした後、
サンプリングし、シトクロムＣ法に従って活性を測定し
た。インキュベーションしていないサンプルのＳＯＤ活
性を１００としてその相対活性の経時的変化を図６（８
０℃）及び図７（７０℃）に示した。

【００２８】この図から明らかなように、大腸菌で生産
されたＳＯＤ−Ｔは天然物由来のＳＯＤ−Ｔと全く同様
の耐熱性を示し、８０℃で２４時間保持後でも、ＳＯＤ
の活性を失なわないことが明らかとなった。また、好熱
菌バチルス・ステアロサーモフィルス由来のMn−ＳＯＤ
と比べても一層安定であることが明らかとなった。

【００２９】

【発明の効果】本発明によって、サーマス属に属するサ
ーマス・アクアティカスYT-1が有する極めて耐熱性の強
い、マンガン型スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ
−Ｔ）をコードする遺伝子の配列及びそれから推定され
るアミノ酸配列が明らかとなった。また、本発明によ
り、遺伝子工学的に耐熱性ＳＯＤを大量に生産する製造
方法が提供され、サーマス属の菌体から分離、精製する
よりも、極めて経済的に天然のものと同等の耐熱性を有
するＳＯＤを生産することが可能となった。また、本発
明のＤＮＡ配列をもつオリゴヌクレオチドもしくはＤＮ
Ａ断片あるいはその一部の配列のＤＮＡ断片をプローブ
として、他のサーマス属菌種あるいはサーマス属と近縁
の他属の生物のスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子を
クローニングすることも、常法によって可能となった。

【００３０】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：204 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Pro Tyr Pro Phe Lys Leu Pro Glu Leu Gly Tyr Pro Tyr Glu Ala 1 5 10 15 Leu Glu Pro His Ile Asp Ala Arg Thr Met Glu Ile His His Gln Lys 20 25 30 His His Gly Ala Tyr Val Thr Asn Leu Asn Ala Ala Leu Glu Lys Tyr 35 40 45 Pro Tyr Leu Gln Gly Ala Glu Val Glu Thr Leu Leu Arg His Leu Thr 50 55 60 Ala Leu Pro Ala Asp Ile Gln Ala Ala Val Arg Asn Asn Gly Gly Gly 65 70 75 80 His Leu Asn His Ser Leu Phe Trp Arg Leu Leu Thr Pro Gly Gly Ala 85 90 95 Lys Glu Pro Val Gly Glu Leu Lys Lys Ala Ile Asp Glu Gln Phe Gly 100 105 110 Gly Phe Ala Ala Leu Lys Glu Lys Leu Thr Gln Ala Ala Met Gly Arg 115 120 125 Phe Gly Ser Gly Trp Ala Trp Leu Val Lys Asp Pro Phe Gly Lys Leu 130 135 140 His Val Ile Ser Thr Ala Asn Gln Asp Asn Pro Val Met Gly Gly Phe 145 150 155 160 Ala Pro Ile Val Gly Ile Asp Val Trp Glu His Ala Tyr Tyr Leu Lys 165 170 175 Tyr Gln Asn Arg Arg Ala Asp Tyr Leu Gln Ala Ile Trp Asn Val Leu 180 185 190 Asn Trp Asp Val Ala Glu Glu Ile Tyr Lys Gly Ala 195 200 配列番号：2 配列の長さ：612 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：サーマス・アクアティカス （Thermus aquaticus ） 株名：YT-1 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..615 特徴を決定した方法：E 配列 ATG CCG TAC CCG TTC AAG CTA CCC GAG CTA GGC TAC CCC TAC GAG GCC 48 Met Pro Tyr Pro Phe Lys Leu Pro Glu Leu Gly Tyr Pro Tyr Glu Ala 1 5 10 15 CTC GAG CCC CAC ATT GAC GCC AGG ACC ATG GAG ATC CAC CAC CAG AAG 96 Leu Glu Pro His Ile Asp Ala Arg Thr Met Glu Ile His His Gln Lys 20 25 30 CAC CAC GGC GCC TAC GTC ACC AAC CTG AAC GCC GCC CTG GAG AAG TAC 144 His His Gly Ala Tyr Val Thr Asn Leu Asn Ala Ala Leu Glu Lys Tyr 35 40 45 CCC TAC CTC CAA GGC GCC GAG GTG GAA ACC CTC CTC CGG CAC CTC ACC 192 Pro Tyr Leu Gln Gly Ala Glu Val Glu Thr Leu Leu Arg His Leu Thr 50 55 60 GCC CTC CCC GCC GAC ATC CAG GCC GCC GTG CGC AAC AAC GGG GGC GGG 240 Ala Leu Pro Ala Asp Ile Gln Ala Ala Val Arg Asn Asn Gly Gly Gly 65 70 75 80 CAC CTG AAC CAC AGC CTC TTC TGG CGC CTC CTC ACC CCG GGC GGG GCC 288 His Leu Asn His Ser Leu Phe Trp Arg Leu Leu Thr Pro Gly Gly Ala 85 90 95 AAG GAG CCC GTG GGG GAG CTG AAG AAG GCC ATT GAC GAG CAG TTT GGC 336 Lys Glu Pro Val Gly Glu Leu Lys Lys Ala Ile Asp Glu Gln Phe Gly 100 105 110 GGC TTC GCC GCC CTA AAG GAG AAG CTC ACC CAG GCG GCC ATG GGG CGC 384 Gly Phe Ala Ala Leu Lys Glu Lys Leu Thr Gln Ala Ala Met Gly Arg 115 120 125 TTC GGC TCC GGG TGG GCC TGG CTG GTC AAG GAC CCC TTC GGC AAG CTC 432 Phe Gly Ser Gly Trp Ala Trp Leu Val Lys Asp Pro Phe Gly Lys Leu 130 135 140 CAC GTG ATC TCC ACC GCC AAC CAG GAC AAC CCA GTG ATG GGA GGC TTC 480 His Val Ile Ser Thr Ala Asn Gln Asp Asn Pro Val Met Gly Gly Phe 145 150 155 160 GCC CCC ATC GTG GGC ATT GAC GTC TGG GAG CAC GCC TAC TAC CTG AAG 528 Ala Pro Ile Val Gly Ile Asp Val Trp Glu His Ala Tyr Tyr Leu Lys 165 170 175 TAC CAG AAC CGC CGG GCC GAC TAC CTG CAG GCC ATC TGG AAC GTC CTG 576 Tyr Gln Asn Arg Arg Ala Asp Tyr Leu Gln Ala Ile Trp Asn Val Leu 180 185 190 AAC TGG GAC GTG GCC GAG GAG ATC TAC AAG GGC GCC TGA 615 Asn Trp Asp Val Ala Glu Glu Ile Tyr Lys Gly Ala 195 200

【００３１】

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明に用いたＳＯＤ−ＴのＮ−末端のアミ
ノ酸配列から推定して合成したイノシン（Ｉ）１３個を
含む９９−mer の合成オリゴヌクレオチドの配列を示
す。

【図２】 サザンハイブリダイゼーションの結果を示
す。矢印は図１で示したプローブがハイブリダイズした
約2.８Kbのバンドの位置を示す。

【図３】 プラスミドpHS6中でサーマス・アクアティカ
スYT-1由来のＳＯＤ−Ｔ遺伝子を含む約2.８Kbの断片の
制限酵素地図を示す。黒い矢印部分はＳＯＤ−Ｔの構造
遺伝子部分を示す。制限酵素サイトは主なもののみ示し
た。下部の矢印は塩基配列を決定した領域を読み取り方
向を示した。

【図４】 ＳＯＤ−Ｔ遺伝子を含むプラスミドpHS6とpS
6 の構造を簡単に示した。図中の太い線で描かれた領域
はpUC119に由来する。サーマス・アクアティカスYT-1由
来の部分は細い線で示し、ＳＯＤ−Ｔをコードする部分
は、白ヌキの矢印で示した。ここではサーマス・アクア
ティカス由来の制限酵素サイトのうちSacIサイトのみを
示してある。

【図５】 ＳＯＤ−を生産させた大腸菌のＳＤＳ−ポリ
アクリルアミド電気泳動の写真である。

【図６】 組換え体ＳＯＤ−Ｔと天然物由来ＳＯＤ−
Ｔ、好熱菌バチルス・ステアロサーモフィルス由来Mn−
型ＳＯＤ及び大腸菌E.coli由来のMn−ＳＯＤの耐熱性を
８０℃で比較した図である。

【図７】 組換え体ＳＯＤ−Ｔと天然物由来ＳＯＤ−
Ｔ、好熱菌バチルス・ステアロサーモフィルス由来Mn−
型ＳＯＤ及び大腸菌E.coli由来のMn−ＳＯＤの耐熱性を
７０℃で比較した図である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 高度好熱性細菌サーマス属由来の耐熱性
   を有するスーパーオキシドジスムターゼをコードしてい
   るＤＮＡ配列。
2. 【請求項２】 ＤＮＡが配列表の配列番号１記載のアミ
   ノ酸配列またはそれと実質的に同一の機能を有するアミ
   ノ酸配列をコードするものである請求項１記載のＤＮＡ
   配列。
3. 【請求項３】 ＤＮＡが配列表の配列番号２記載の塩基
   配列またはそれと実質的に同一の機能をもつ塩基配列を
   有するものである請求項１記載のＤＮＡ配列。
4. 【請求項４】 請求項２記載のＤＮＡ配列にハイブリッ
   ドするＤＮＡ配列であって、かつ耐熱性スーパーオキシ
   ドジスムターゼ活性を有するポリペプチドをコードする
   ＤＮＡ配列。