KR100311891B1 - 아퀴펙스 파이로필러스의 내열성 글루타메이트 라세메이즈를 코딩하는 유전자, 이로부터 발현되는 내열성 글루타메이트 라세메이즈 및 그의 제조 방법 - Google Patents
아퀴펙스 파이로필러스의 내열성 글루타메이트 라세메이즈를 코딩하는 유전자, 이로부터 발현되는 내열성 글루타메이트 라세메이즈 및 그의 제조 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR100311891B1 KR100311891B1 KR1019990043339A KR19990043339A KR100311891B1 KR 100311891 B1 KR100311891 B1 KR 100311891B1 KR 1019990043339 A KR1019990043339 A KR 1019990043339A KR 19990043339 A KR19990043339 A KR 19990043339A KR 100311891 B1 KR100311891 B1 KR 100311891B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- glutamate
- racease
- gene
- heat
- isolated
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 73
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 11
- 241000207207 Aquifex pyrophilus Species 0.000 title abstract description 5
- 108700016167 Glutamate racemases Proteins 0.000 title description 14
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims abstract description 99
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 claims abstract description 91
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 29
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims abstract description 16
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 7
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 40
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 40
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 9
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 38
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 33
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 229930195713 D-glutamate Natural products 0.000 description 9
- WHUUTDBJXJRKMK-GSVOUGTGSA-N D-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 9
- 229930195714 L-glutamate Natural products 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical class N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 3
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- PJWWRFATQTVXHA-UHFFFAOYSA-N Cyclohexylaminopropanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCNC1CCCCC1 PJWWRFATQTVXHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N L-Aspartic acid Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 229930182821 L-proline Natural products 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 241001460678 Napo <wasp> Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000006340 racemization Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- NWZSZGALRFJKBT-KNIFDHDWSA-N (2s)-2,6-diaminohexanoic acid;(2s)-2-hydroxybutanedioic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O.NCCCC[C@H](N)C(O)=O NWZSZGALRFJKBT-KNIFDHDWSA-N 0.000 description 1
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 2-oxoglutaric acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)C(O)=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010008830 Amino Acid Isomerases Proteins 0.000 description 1
- 102000006534 Amino Acid Isomerases Human genes 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- -1 D-glutamate Chemical class 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 239000004278 EU approved seasoning Substances 0.000 description 1
- 102100021717 Early growth response protein 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100021720 Early growth response protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 101000896450 Homo sapiens Early growth response protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000896533 Homo sapiens Early growth response protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 101150017040 I gene Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L L-glutamate group Chemical group N[C@@H](CCC(=O)[O-])C(=O)[O-] WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L 0.000 description 1
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- HCHJSNHHBFGNGS-UHFFFAOYSA-L benzoyloxy(chloro)mercury Chemical compound Cl[Hg]OC(=O)C1=CC=CC=C1 HCHJSNHHBFGNGS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 235000011194 food seasoning agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 150000002306 glutamic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 1
- IKDUDTNKRLTJSI-UHFFFAOYSA-N hydrazine monohydrate Substances O.NN IKDUDTNKRLTJSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N hydron Chemical compound [H+] GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000006861 modified sme medium Substances 0.000 description 1
- 229940101270 nicotinamide adenine dinucleotide (nad) Drugs 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y501/00—Racemaces and epimerases (5.1)
- C12Y501/01—Racemaces and epimerases (5.1) acting on amino acids and derivatives (5.1.1)
- C12Y501/01003—Glutamate racemase (5.1.1.3)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
본 발명은 초고온 미생물 중 진정세균인 아퀴펙스 파이로필러스(Aquifex pyrophilus)로부터 단리한 강한 내열성을 갖는 글루타메이트 라세메이즈 효소의 유전자, 이로부터 발현되는 아미노산 서열을 갖는 글루타메이트 라세메이즈, 상기 유전자를 함유하는 발현 벡터로 형질전환된 대장균에서 상기 글루타메이트 라세메이즈를 제조하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 서열 3에 나타낸 염기 서열을 갖는 유전자 및 이로부터 발현된 아미노산 서열을 갖는 내열성 글루타메이트 라세메이즈에 관한 것이다.
본 발명에서 단리된 아퀴펙스 파이로필러스의 글루타메이트 라세메이즈의 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 대장균에서 생산된 글루타메이트 라세메이즈는 기존의 중온성 세균에서 단리된 효소보다 고온, pH 및 유기 용매 등의 조건 하에서도 높은 안정성을 갖기 때문에 의약품 생산 및 식품 소재의 생산 등과 같이 산업적으로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 초고온 미생물인 아퀴펙스 파이로필러스로부터 유래된 강한 내열성을 갖는 글루타메이트 라세메이즈 효소의 유전자, 이로부터 발현되는 아미노산 서열을 갖는 글루타메이트 라세메이즈 및 상기 유전자를 함유하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포에서 상기 글루타메이트 라세메이즈를 제조하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 서열 3에 나타낸 염기 서열을 갖는 유전자 및 이로부터 발현된 아미노산 서열을 갖는 내열성 글루타메이트 라세메이즈에 관한 것이다.
글루타메이트 라세메이즈 효소는 D-글루타메이트를 L-글루타메이트로, 또는 L-글루타메이트를 D-글루타메이트로 전환하는 효소로서 이 과정에서 생산되는 D-글루타메이트는 미생물의 세포막 형성에 이용된다. 한편, D-글루타메이트를 비롯한 D-아미노산은 항생제 생산을 위한 전구체로서 항생제 합성 원료로 사용되고 있으며, 감미료, 조미료, 식품 첨가물 등의 식품 산업에도 그 이용도가 증가하고 있다. 이러한 D-아미노산은 현재까지 유기 합성법으로 주로 생산되고 있으나 최근에는 아미노산 라세메이즈 등의 효소를 이용한 D-아미노산 생산 방법이 모색되고 있다.
특히, 아미노산 라세메이즈를 이용한 D-아미노산의 생산 공정에서 글루타메이트 라세메이즈는 핵심적인 효소 중의 하나이며, 보다 효율적인 D-아미노산의 생산 방법의 개발을 위하여 안정성이 높은 효소의 개발이 요구된다. 현재가지 글루타메이트 라세메이즈 효소는 주로 중온성 세균인 락토바실러스(Gallo, K.A., M.E. Tanner, and J. R. Knowles. 1993 Mechanism of the reaction catalyzed by glutamate racemase. Biochemistry 32:3991-3997)와 대장균(Doublet, P., J. van Heijenoort, J.P. Bohin, and M. -L. Dominique. 1993. The murI gene of Escherichia coli is an essential gene that encodes a glutamate-racemase activity. J. Bacteriol. 175:2970-2979)을 중심으로 연구가 진행되고 있으나 고온성 세균과 초고온성 세균에서의 글루타메이트 라세메이즈에 관한 연구는 전무한 상태이다.
지금까지의 효소공학에 이용되는 생물자원은 주로 상온 및 고온에서 성장하는 생물체에서 기원하는 효소들이다. 이러한 효소들은 고온, 산성, 염기성 또는 고염도와 같은 환경에서의 안정성 및 활성도가 제한된다. 그러나, 최근 물의 비등점인 100 ℃ 근처 또는 그 이상에서도 성장할 수 있는 초고온 미생물들이 보고되었으며 이러한 미생물에서 단리된 효소들 역시 고온에서도 변성되지 않고 활성을 유지하는 것으로 알려졌다. 따라서 이들 초고온 미생물에서 D-아미노산의 생산에 이용될 수 있는 효소를 개발하는 필요성이 대두되고 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 초고온 세균으로부터 글루타메이트 라세메이즈의 유전자를 단리하고, 이를 숙주 세포에서 발현시켜 고온, pH 및 유기 용매 등의 조건 하에서도 높은 안정성을 갖는 글루타메이트 라세메이즈를 제공하는 것이다.
도 1은 아퀴펙스 파이로필러스로부터 글루타메이트 라세메이즈 유전자를 클로닝하기 위한 프로브인 AQpU181의 위치와 글루타메이트 라세메이즈 유전자의 유전자 지도를 나타낸 도면.
도 2는 글루타메이트 라세메이즈 유전자 및 그의 인접 유전자의 DNA 염기서열 및 상기 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸 도면.
도 3은 글루타메이트 라세메이즈를 대장균에서 발현시키기 위한 플라스미드의 구성도.
도 4는 글루타메이트 라세메이즈 유전자의 발현 정도 및 정제된 글루타메이트 라세메이즈를 변성 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동한 결과를 나타낸 도면.
도 5는 글루타메이트 라세메이즈의 반응 적정 수소이온 농도 곡선을 나타낸 도면.
도 6은 글루타메이트 라세메이즈의 반응 적정 온도 곡선을 나타낸 도면.
도 7는 아퀴펙스 파이로필러스로부터 단리된 글루타메이트 라세메이즈 효소의 내열성을 측정한 결과를 나타낸 도면.
본 발명자들은 상기 목적을 달성하고자 심도있게 연구한 결과, 아퀴펙스 파이로필러스로부터 단리된 글루타메이트 라세메이즈가 매우 높은 온도에서도 안정한 상태를 유지하면서 활성을 갖는다는 사실을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.
즉, 본 발명은 D-아미노산의 생산에 이용될 수 있는 글루타메이트 라세메이즈의 유전자를 초고온 미생물인 아퀴펙스 파이로필러스에서 클로닝하고 그 유전자의 구조를 규명한 후 유전자 재조합 방법으로 상기 클로닝된 유전자를 대장균에서 발현시켜 상기 효소를 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 내열성 글루타메이트 라세메이즈를 갖는 초고온 세균인 아퀴펙스 파이로필러스로부터 단리된 내열성 글루타메이트 라세메이즈의 유전자를 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 서열 3의 염기 서열을 갖는, 80℃ 이상의 고온에서도 안정하고 반응성이 강한 내열성 글루타메이트 라세메이즈를 코딩하는 유전자 및 그의 변형 유전자를 제공한다.
또다른 면에서, 본 발명은 상기 내열성 글루타메이트 라세메이즈의 유전자로부터 발현된, 서열 3의 아미노산 서열을 갖는 내열성 글루타메이트 라세메이즈를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 포함한다. 상기 숙주 세포로는 대장균이 특히 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환된 숙주 세포를 배양하고, 배양된 대장균을파쇄한 후 대장균으로부터 발현된 내열성 글루타메이트 라세메이즈를 크로마토그래피법에 의해 회수하는 것을 포함하는, 내열성 글루타메이트 라세메이즈의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용된 초고온 미생물인 아퀴펙스 파이로필러스는 독일의 미생물 수탁기관인 DSM(Deutsche Sammlung von Mikroorganism und Zelkuturen GmbH)에서 구입한 것으로, 아퀴펙스 파이로필러스 균주의 배양은 공지된 방법으로 변형된 SME 배지를 사용하여 배양한다. 배양된 세포는 원심분리하여 회수하고 공지 방법으로 라이소자임(lysozyme)과 단백질 분해효소(protease)를 이용하여 세포를 파쇄한 후 게놈 DNA 분리 키트 (Qiagen, German)로 게놈 DNA를 단리한다. 단리된 게놈 DNA는 HindIII로 절단하여 λ DASH II 파지 DNA (Stratagene, USA)의 HindIII 위치에 서브클로닝하여 게놈 라이브러리를 제작한다.
글루타메이트 라세메이즈 효소를 코딩하는 유전자를 아퀴펙스 파이로필러스의 게놈 라이브러리에서 단리하기 위하여, 공지된 아퀴펙스 파이로필러스의 유전자 단편 중 대장균과 고초균(Bacillus)의 글루타메이트 라세메이즈와 유사성이 높은 염기 서열을 pUC19 벡터에 함유하는 클론인 AQpU181을 프로브로 사용한다
이 플라스미드 DNA에서 pUC19 벡터 내의 아퀴펙스 파이로필러스 DNA를 M13 순방향(forward) 프라이머와 M13 역방향(reverse) 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄 반응으로 증폭하고, 증폭된 DNA 단편을 프로브로 이용하여 아퀴펙스 파이로필러스의 게놈 라이브러리에서 플라크 혼성화(plaque hybridization)와 서던 혼성화 (Southern hybridization)를 수행하여 양성 신호를 보이는 클론을 검색 및 단리한다.
단리된 클론에서 글루타메이트 라세메이즈 유전자에 해당하는 부위의 염기 서열을 사슬 종결 방식에 의해 결정한다. 글루타메이트 라세메이즈를 코딩하는 유전자의 염기 서열은 762개의 염기로 구성되고, 이로부터 코딩되는 글루타메이트 라세메이즈는 254개의 아미노산으로 구성된다 (도 2 참조).
결정된 염기 서열을 이미 알려진 다른 종의 글루타메이트 라세메이즈와 비교 분석한 결과, 대장균과는 26.6%, 고초균과는 36.1%, 락토바실러스(Lactobacillus)와는 35.5%의 높은 유사성을 갖고, 특히 글루타메이트 라세메이즈의 효소 활성 부위인 두 개의 시스테인은 모두 같은 부위에 위치하고 있으며, 그 주변의 아미노산 서열의 유사성이 매우 높음을 확인할 수 있었다.
아퀴펙스 파이로필러스의 글루타메이트 라세메이즈 유전자로부터 활성을 갖는 단백질을 생산하기 위하여 상기 단리된 유전자를 대장균 발현 벡터인 pET21a에 클로닝한다. 이를 위해, 먼저 글루타메이트 라세메이즈 유전자의 5′말단 영역과 3′말단 영역에 혼성화하는, 제한 효소 NdeI과 XhoI의 인식 부위가 부가된 2개의 프라이머를 준비하고, 이 프라이머를 이용하여 아퀴펙스 파이로필러스의 게놈 DNA로부터 글루타메이트 라세메이즈 유전자를 중합효소 연쇄 반응으로 증폭한다. 이렇게 얻어진 DNA를 플라스미드 pET21a에 서브클로닝하여 글루타메이트 라세메이즈 발현 벡터 pGR1을 제조한다. 이 벡터를 사용하여 발현용 숙주 대장균인 BL21(DE3)을 형질전환시키고, 형질전환된 재조합 BL21(DE3)을 배지에서 배양한 후 단백질의 발현을 유도시키고, 원심분리법으로 균체를 회수한다.
대장균에서 발현된 아퀴펙스 파이로필러스로부터 유래된 글루타메이트 라세메이즈는 다음과 같은 방법으로 단리한다. 원심분리법에 의해 회수된 균체를 희석 용액에 현탁시킨 후 세포를 파쇄하여 생성되는 세포 추출물을 원심분리하여 파쇄되지 않은 균체를 제거한다. 상층액을 열처리하고, 원심분리하여 침전물로 회수된 변성된 단백질을 제거한 후 상층액을 크로마토그래피하여 발현 생산물을 정제한다.
발현 산물이 글루타메이트 라세메이즈의 효소 활성을 갖는지를 확인하기 위해 정제된 발현 산물을 L-, D-글루타메이트, L-프롤린, L-알라닌, L-아스파르트산, L-아스파라긴, L-글루타민에 첨가하여 각각의 기질에 대한 발현 산물의 라세미화 반응 활성을 조사한다. 그 결과, 발현 산물은 D-, L-글루타메이트 이외의 아미노산에 대해서는 활성을 보이지 않았고, L-글루타메이트를 D-글루타메이트로 또는 그 역반응으로의 활성만을 보여 이 단백질이 글루타메이트 라세메이즈임을 알 수 있었다.
발현된 글루타메이트 라세메이즈의 효소 활성의 최적 pH 조건을 조사하기 위해 pH 6-65(2-[N-모르폴리노]에탄술폰산; MES), pH 7-9(Tris-HCl), pH 9.5-11)(3-[시클로헥실아미노]-1-프로판술폰산; CAPS)의 완충액을 사용하여 다양한 pH에서의 효소 활성을 측정하여 조사할 수 있고, 이를 통해 8.5의 pH에서 활성이 가장 높다는 사실을 알 수 있었다. 효소의 최적 반응 온도는 30, 60, 80, 90 ℃에서 효소의 활성을 측정하여 결정할 수 있고, 80 ℃에서 가장 높은 활성을 보여 아퀴펙스 파이로필러스 글루타메이트 라세메이즈 효소의 활성을 위한 최적의 조건은 완충액 pH 8.5, 반응 온도 80 ℃로 밝혀졌다.
초고온 미생물에서 단리된 단백질에서 나타나는 높은 내열성은 발현된 글루타메이트 라세메이즈를 65, 85, 95 ℃에서 수 시간 동안 방치하여 변성 단백질을 제거한 후 남은 효소의 활성을 측정함으로써 조사할 수 있다.
도 7는 초고온 미생물인 아퀴펙스 파이로필러스로부터 단리된 글루타메이트 라세메이즈 효소의 내열성을 측정한 결과를 나타낸 것으로서, 글루타메이트 라세메이즈를 65 ℃(●), 85 ℃(▲) 또는 95 ℃(■)에서 주어진 시간 동안 항온 처리한 후 잔류 활성을 측정한 결과를 보여준다. 발현된 글루타메이트 라세메이즈는 65 ℃에서 24시간 이상 방치하여도 효소의 활성에는 변화가 없고, 85 ℃에서는 60분 방치할 경우에도 본래 활성의 90%를 유지하고, 90분 방치하였을 경우에는 약 50%의 활성을 유지하였다.
이러한 특성을 통하여 아퀴펙스 파이로필러스로부터 단리된 글루타메이트 라세메이즈가 높은 내열성을 갖고, 대장균에서 발현되었을 경우에도 본래의 초고온 세균에서의 효소 활성을 그대로 유지한다는 것을 알 수 있다.
이하 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> 아퀴펙스 파이로필러스의 게놈 라이브러리 제작
아퀴펙스 파이로필러스 균주의 배양은 공지된 방법으로 변형된 SME 배지를 사용하여 85℃에서 12-14시간 동안 배양하였다 (Huber, R., T. Williarm, D. Huber, A. Trincore, S. Burggraf, H. Konig, R. Rachel, I. Rockinger, H. Fricke, and K. O. Stetter. 1992. Aquifex pyrophilus gen. nov. sp. nov.,represents a novel group of marine hyperthermophilic hydrogen-oxidizing bacteria. System. Appl. Microbiol. 15:340-351). 배양된 세포는 원심분리하여 회수하였고 공지된 방법(Choi, I.G., S.S. Kim, J. R. Ryu, Y. S. Han, W. G. Bang, S. H. Kim, and Y. G. Yu. 1997. Random sequence analysis of genomic DNA of a hyperthermophile: Aquifex pyrophilus. Extremophiles 1: 125-134)으로 라이소자임과 단백질 분해효소를 이용하여 세포를 파쇄한 후 게놈 DNA 분리 키트 (Qiagen, German)로 게놈 DNA를 단리하였다. 단리된 게놈 DNA를 HindIII로 약 15-20 kb의 크기로 불완전 절단하여 λ DASH II 파지 DNA (Stratagene, USA)의 HindIII 위치에 서브클로닝하여 게놈 라이브러리를 제작하였다.
<실시예 2> 글루타메이트 라세메이즈 유전자의 클로닝
글루타메이트 라세메이즈 효소를 코딩하는 유전자를 실시예 1에서 제작된 아퀴펙스 파이로필러스의 게놈 라이브러리에서 단리하기 위하여, 공지된 아퀴펙스 파이로필러스의 유전자 단편 중 대장균과 고초균의 글루타메이트 라세메이즈와 유사성이 높은 염기 서열을 pUC19 벡터에 함유하는 클론인 AQpU181을 프로브로 사용하였다(Choi, I.G., S.S. Kim, J. R. Ryu, Y. S. Han, W. G. Bang, S. H. Kim, and Y. G. Yu. 1997. Random sequence analysis of genomic DNA of a hyperthermophile: Aquifex pyrophilus. Extremophiles 1: 125-134).
이 플라스미드 DNA에서 pUC19 벡터 내의 아퀴펙스 파이로필러스 DNA를 M13 순방향 프라이머와 M13 역방향 프라이머를 이용하여 96℃ 1분, 55℃ 30초, 72℃ 1분의 순서로 30회 반복되는 중합효소 연쇄 반응으로 증폭하였다. 증폭된 DNA 단편을 프로브로 이용하여 아퀴펙스 파이로필러스의 게놈 라이브러리에서 플라크 혼성화와 서던 혼성화를 수행하여 3개의 양성 신호를 보이는 클론을 검색 및 단리하였다.
단리된 3개의 클론에서 글루타메이트 라세메이즈 유전자에 해당하는 부위의 염기 서열을 사슬 종결 방식에 의해 결정하였다. 클로닝된 글루타메이트 라세메이즈 유전자의 유전자 지도 및 프로브로 사용된 AQpU181의 유전자 내에서의 위치는 도 1에 도시하였고, 클로닝된 유전자의 염기 서열 및 이로부터 코딩되는 아미노산의 서열은 도 2에 도시하였다. 결정된 염기 서열은 762개의 염기로 구성되고, 이로부터 코딩되는 아미노산은 254개의 아미노산으로 이루어짐을 알 수 있다.
결정된 염기 서열을 이미 알려진 다른 종의 글루타메이트 라세메이즈와 비교 분석한 결과, 대장균과는 26.6%, 고초균과는 36.1%, 락토바실러스(Lactobacillus)와는 35.5%의 높은 유사성을 보였다. 특히, 글루타메이트 라세메이즈의 효소 활성 부위인 두 개의 시스테인은 모두 같은 부위에 위치하고 있었으며, 특히 그 주변의 아미노산 서열의 유사성이 매우 높음을 확인할 수 있었다.
<실시예 3> 글루타메이트 라세메이즈 단백질의 발현 벡터 구축 및 발현
아퀴펙스 파이로필러스의 글루타메이트 라세메이즈 유전자로부터 활성을 갖는 단백질을 생산하기 위하여 상기 유전자를 대장균 발현 벡터인 pET21a에 클로닝하였다. 먼저 글루타메이트 라세메이즈 유전자의 5′말단 영역과 3′말단 영역에 혼성화하는, 제한 효소 NdeI과 XhoI의 인식 부위가 부가된 서열 1 및 서열 2의 염기 서열을 갖는 프라이머를 준비하였다.
프라이머 EGR3 (서열 1):
5' GGCCCGGCCCATATGAAGATAGGTATCTTTGACCGTGGT 3'
NdeI
프라이머 EGR4 (서열 2):
5' GGGCCCGCTCGAGTTAATGTGTAAAAACCCCCTCCGCAAG 3'
XhoI
상기 두 프라이머를 이용하여 아퀴펙스 파이로필러스의 게놈 DNA로부터 글루타메이트 라세메이즈 유전자를 중합효소 연쇄 반응으로 증폭하였다. 이렇게 얻어진 DNA를 플라스미드 pET21a의 NdeI과 XhoI 제한 부위에 결합시켜 글루타메이트 라세메이즈 발현 벡터인 pGR1을 제조하였다 (도 3). 제조된 벡터에 존재하는 글루타메이트 라세메이즈 유전자의 정확한 염기 서열을 확인한 후 이 벡터를 사용하여 발현용 숙주 대장균인 BL21(DE3)을 형질전환시켰다. pGR1에 의해 형질전환된 재조합 BL21(DE3)을 37℃에서 100㎍/㎖의 앰피실린을 포함하는 LB 배지에서 배양하고, OD600가 0.6이 되면 1mM의 이소프로필 β-D-티오갈락토시드(IPTG)를 첨가하여 단백질의 발현을 유도시키고, 3시간 후에 원심분리법으로 균체를 회수하였다.
<실시예 4> 대장균에서 생성된 글루타메이트 라세메이즈 효소의 정제
대장균에서 발현된 아퀴펙스 파이로필러스로부터 유래된 글루타메이트 라세메이즈를 아래와 같은 방법으로 단리하였다. 실시예 3에서 원심분리법에 의해 회수된 균체를 희석 용액 (50mM Tris-HCl 완충액, pH 7.8 및 50mM NaCl)에 현탁시킨후 프렌치 압착기 (French press)로 압력을 가하여 세포를 파쇄하였다. 이때 얻어진 세포 추출물을 16,000rpm에서 20분간 원심분리하여 파쇄되지 않은 균체를 제거하였다. 이때 상층액을 80℃에서 40분 동안 열처리하고, 16,000rpm에서 20분간 원심분리하여 침전물로 회수된 변성된 단백질을 제거한 후 상층액을 양이온 교환 수지 크로마토그래피(CM-Sepharose, 1.5x20cm; Pharmacia LKB Biotechnology Inc.)법을 이용하여 정제하였다.
도 4는 글루타메이트 라세메이즈의 발현 정도 및 정제된 글루타메이트 라세메이즈를 변성 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동한 결과를 나타낸 것이다. 도 4에서 1번 열은 단백질의 크기를 나타내는 마커이고, 2번 열은 글루타메이트 라세메이즈 유전자가 발현되기 전의 대장균 단백질 시료이고, 3번 열은 글루타메이트 라세메이즈 유전자가 발현된 후의 대장균의 단백질 시료이며, 4번 열은 열처리 후의 단백질 시료이고, 5번 열은 양이온 교환 수지로 단리된 글루타메이트 라세메이즈 효소이다. 글루타메이트 라세메이즈 단백질의 위치는 화살표로 표시되어 있다.
도 4에 도시한 바와 같이, 발현된 아퀴펙스 파이로필러스의 글루타메이트 라세메이즈는 15% 변성 폴리아크릴아미드 겔에서 확인한 결과 약 28kDa의 크기를 갖고, 발현 정도는 전체 단백질의 20% 이상인 것으로 확인되었다. 또한, 상기 발현된 효소는 높은 열 안정성을 보이는 본래의 특성을 그대로 유지하는 반면, 열처리시 대부분의 대장균 단백질들이 제거되어 발현된 글루타메이트 라세메이즈는 열처리 후에 약 80% 정도로 정제되었고 양이온 교환 크로마토그래피로 정제하였을 경우 약 95% 정도로 정제되었다.
<실시예 5> 발현 산물이 글루타메이트 라세메이즈의 효소 활성을 갖는지의 확인
정제된 발현 산물 0.1 mg을 0.1 ml의 50 mM Tris-HCl (pH 8.5)의 완충용액 중에서 10 mM의 L-, D-글루타메이트, L-프롤린, L-알라닌, L-아스파르트산, L-아스파라긴, L-글루타민을 첨가하여 80℃에서 1시간 동안 각각의 기질에 대한 발현 산물의 라세미화 반응 활성을 조사하였다. 그 결과, D-, L-글루타메이트 이외의 아미노산에 대해서는 활성을 보이지 않았고, L-글루타메이트를 D-글루타메이트로 또는 그 역반응으로의 활성만을 보여 이 단백질이 글루타메이트 라세메이즈임을 알 수 있었다.
또한, 두 개의 시스테인 위치에서 전자의 제거와 부착으로 발생하는 글루타메이트 라세메이즈의 활성을 제거하는, 시스테인을 변화시키는 1 mM 요오도아세트아미드 및 2 mM 클로로머큐리벤조에이트를 상기 발현된 글루타메이트 라세메이즈 100 ㎍에 첨가하여 글루타메이트 라세메이즈의 활성을 조사하였다. 그 결과, 라세메이즈의 활성이 거의 상실되었다. 이 결과로부터 아퀴펙스 파이로필러스에서 단리되어 대장균에서 발현된 단백질은 글루타메이트 라세메이즈 효소이고, 다른 종에서 단리된 글루타메이트 라세메이즈와 마찬가지로 라세메이즈 활성에 두 개의 시스테인 잔기가 관여하며, 이 잔기의 인접 서열이 특히 잘 보존되어 있음을 알 수 있었다.
<실시예 6> 아퀴펙스 파이로필러스 글루타메이트 라세메이즈 효소의 특성 분석
상기 발현된 글루타메이트 라세메이즈의 효소 활성의 최적 pH 조건을 조사하기 위해 pH 6-65(2-[N-모르폴리노]에탄술폰산; MES), pH 7-9(Tris-HCl), pH 9.5-11)(3-[시클로헥실아미노]-1-프로판술폰산; CAPS)의 완충액을 사용하여 다양한 pH에서의 효소 활성을 측정한 결과, 8.5의 pH에서 활성이 가장 높았고 (도 5 참조), 효소의 최적 반응 온도를 조사하기 위하여 30, 60, 80, 90 ℃에서 효소의 활성을 측정한 결과, 80 ℃에서 가장 높은 활성을 보였다 (도 6 참조). 따라서 아퀴펙스 파이로필러스 글루타메이트 라세메이즈 효소의 활성을 위한 최적의 조건은 완충액 pH 8.5, 반응 온도 80 ℃로 밝혀졌다.
이후의 글루타메이트 라세메이즈의 활성 측정은 Gallo 등의 방법에 따랐으며(Gallo, K. A., and J. R. Knowles. 1993 Purification, cloning, and cofactor independence of glutamate racemase from Lactobacillus. Biochemistry 32:3981-3990), 위에서 얻어진 최적의 조건에 따라 수행하였다.
글루타메이트 라세메이즈 효소의 활성 측정은 10mM D-글루타메이트를 포함하는 100㎕의 반응 완충액(50mM Tris-HCl, pH8.5, 2mM 디티오트레톨)에 80-100㎍의 정제된 단백질을 첨가한 후 80℃에서 1시간 동안 반응 시켰다. 0.3 배의 과염소산을 가하여 반응을 중지시킨 후 0.2 배의 1N 수산화나트륨(NaOH)을 가하여 중화시켰다. 반응이 종결된 시료에서 생산된 L-글루타메이트의 양은 50mM NaPO4, pH 7.5, 20mM 히드라진 히드레이트, L-글루타메이트 탈수소효소(dehydrogenase) 25 단위 및 5mM β-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD)가 포함된 시료에서 L-글루타메이트가 α-케토글루타레이트로 전환되면서 생성되는 NADH의 양을 340nm에서 측정함으로써 결정하였다.
<실시예 7> 아퀴펙스 파이로필러스 글루타메이트 라세메이즈 효소의 내열성 측정
초고온 미생물에서 단리된 단백질에서 나타나는 높은 내열성을 조사하기 위해, 발현된 글루타메이트 라세메이즈를 65, 85, 95 ℃에서 수 시간 동안 방치하여 변성 단백질을 제거한 후 남은 효소의 활성을 측정하였고 1M NaPO4를 가한 후 측정하였을 때 내열성이 증가하는 것을 알 수 있었다.
도 7은 초고온 미생물인 아퀴펙스 파이로필러스로부터 단리된 글루타메이트 라세메이즈 효소의 내열성을 측정한 결과를 나타낸 것으로서, 글루타메이트 라세메이즈를 65 ℃(●), 85 ℃(▲) 또는 95 ℃(■)에서 주어진 시간 동안 항온 처리한 후 잔류 활성을 측정한 결과를 보여준다. 65 ℃에서 24시간 이상 방치하여도 효소의 활성에는 변화가 없었고, 85 ℃에서는 60분 방치하였을 때에도 본래 활성의 90%를 유지하였으며, 90분 방치하였을 경우에는 약 50%의 활성을 유지하였다.
이러한 특성을 통하여 아퀴펙스 파이로필러스로부터 단리된 글루타메이트 라세메이즈가 높은 내열성을 갖고 있고, 대장균에서 발현되었을 경우에도 본래의 초고온 세균에서의 효소 활성을 그대로 유지한다는 것을 알 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명에서 단리된 글루타메이트 라세메이즈의 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 대장균에서 생산된 아퀴펙스 파이로필러스의 글루타메이트 라세메이즈는 기존의 중온성 세균에서 단리된 효소보다 고온, pH 및 유기 용매 등의 조건 하에서도 높은 안정성을 갖기 때문에 의약품 생산 및 식품 소재의 생산 등과 같이 산업적으로 유용하게 사용될 수 있다.
Claims (6)
- 아퀴펙스 파이로필러스에서 단리된 서열 3의 염기 서열을 갖는 유전자.
- 제1항의 유전자에 의해 코딩되는 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 내열성 글루타메이트 라세메이즈.
- 제1항의 유전자를 포함하는 발현 벡터 pGR1.
- 제3항의 발현 벡터로 형질전환된 대장균.
- 제4항의 대장균을 배양하고, 배양된 대장균을 파쇄한 후 대장균으로부터 발현된 내열성 글루타메이트 라세메이즈를 회수하는 것을 포함하는, 내열성 글루타메이트 라세메이즈의 제조 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 내열성 글루타메이트 라세메이즈가 크로마토그래피법에 의해 회수되는 것인 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019990043339A KR100311891B1 (ko) | 1999-10-08 | 1999-10-08 | 아퀴펙스 파이로필러스의 내열성 글루타메이트 라세메이즈를 코딩하는 유전자, 이로부터 발현되는 내열성 글루타메이트 라세메이즈 및 그의 제조 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019990043339A KR100311891B1 (ko) | 1999-10-08 | 1999-10-08 | 아퀴펙스 파이로필러스의 내열성 글루타메이트 라세메이즈를 코딩하는 유전자, 이로부터 발현되는 내열성 글루타메이트 라세메이즈 및 그의 제조 방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20010036363A KR20010036363A (ko) | 2001-05-07 |
| KR100311891B1 true KR100311891B1 (ko) | 2001-11-03 |
Family
ID=19614419
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1019990043339A KR100311891B1 (ko) | 1999-10-08 | 1999-10-08 | 아퀴펙스 파이로필러스의 내열성 글루타메이트 라세메이즈를 코딩하는 유전자, 이로부터 발현되는 내열성 글루타메이트 라세메이즈 및 그의 제조 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR100311891B1 (ko) |
-
1999
- 1999-10-08 KR KR1019990043339A patent/KR100311891B1/ko not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20010036363A (ko) | 2001-05-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4561010B2 (ja) | Ｄ−ヒダントインハイドロラーゼをコードするｄｎａ、ｎ−カルバミル−ｄ−アミノ酸ハイドロラーゼをコードするｄｎａ、該遺伝子を含む組み換えｄｎａ、該組み換えｄｎａにより形質転換された細胞、該形質転換細胞を用いるタンパク質の製造方法、および、ｄ−アミノ酸の製造方法 | |
| CN111876399B (zh) | 北极来源的β-葡萄糖苷酶基因、及其编码的蛋白和应用 | |
| WO2018165881A1 (zh) | 一种头孢菌素c酰化酶突变体及其应用 | |
| JP5394928B2 (ja) | サーマス・エガートソニイ（ｔｈｅｒｍｕｓｅｇｇｅｒｔｓｓｏｎｉｉ）ｄｎａポリメラーゼ | |
| US8105814B2 (en) | DNA replication factors | |
| EP3103877A1 (en) | 4-amino cinnamic acid production method using enzyme | |
| CN113106082A (zh) | 动物粪便宏基因组来源的丙氨酸消旋酶及其制备和应用 | |
| KR100311891B1 (ko) | 아퀴펙스 파이로필러스의 내열성 글루타메이트 라세메이즈를 코딩하는 유전자, 이로부터 발현되는 내열성 글루타메이트 라세메이즈 및 그의 제조 방법 | |
| KR100844358B1 (ko) | 돌연변이 ｄｎａ 중합효소들 및 그의 유전자들 | |
| KR100330688B1 (ko) | 아퀴펙스 파이로필러스의 내열성 알라닌 라세메이즈를코딩하는 유전자, 이로부터 발현되는 내열성 알라닌라세메이즈 및 그의 제조 방법 | |
| JP4405324B2 (ja) | 改変型ザルコシンオキシダーゼ、改変型ザルコシンオキシダーゼ遺伝子及び改変型ザルコシンオキシダーゼの製造法 | |
| KR102230151B1 (ko) | 이산화탄소 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소 스크리닝 시스템과 이의 용도 | |
| JP4371312B2 (ja) | 改変型ザルコシンオキシダーゼ、その遺伝子、組み換え体ｄｎａ及び改変型ザルコシンオキシダーゼの製造法 | |
| KR100449456B1 (ko) | 신규한 ｄ-입체특이적 아미노산 아미다아제, 그의 유전자, 그의 제조방법, 이를 이용한 ｄ-아미노산의 제조방법 | |
| KR0184755B1 (ko) | 재조합 내열성 티로신 페놀리아제 및 이를 이용한 엘-도파의 제조방법 | |
| WO2000004134A1 (fr) | Nouveau gene et transformant portant ce gene | |
| JP5354710B2 (ja) | 高活性カタラーゼ産生微生物及びその使用 | |
| KR100270508B1 (ko) | 신규세파로스포린디아세틸라아제유전자및이를이용한단백질제조방법 | |
| JP3478410B2 (ja) | 超耐熱性プロテアソーム | |
| US20230220449A1 (en) | Marine dna polymerase i | |
| US6403357B1 (en) | Thermostable D-hydantoinase and the application thereof | |
| Laksmi et al. | Expression and purification of Bst polymerase using a rhamnose-inducible system in Escherichia coli | |
| JP2923771B1 (ja) | アミノトランスフェラーゼ活性を有する耐熱性酵素及びそれをコードする遺伝子 | |
| JPH0530976A (ja) | 耐熱性スーパーオキシドジスムターゼをコードする遺伝子及びそれを含むプラスミド | |
| JP2000157278A (ja) | 新規ｄｎａ分解酵素 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20070831 Year of fee payment: 7 |
|
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |