JPH02231086A - 耐熱性アミノペプチダーゼをコードする遺伝子及びそれを含むプラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、高度好熱性細菌であるサーマス属に属する菌
株が生産する耐熱性アミノベブチダーゼをコードするＤ
ＮＡ配列に関するものである。このＤＮＡ配列でコード
されるアミノベブチダーゼは高い耐熱性をもち、７５℃
〜８０℃の高温で最も活性が高いという特徴を有してお
り、熱に対して極めて安定であり、産業上試薬用酵素，
バイオリアクター用酵素などとして極めて有用なもので
ある． ［従来の技術］ アミノベブチダーゼはタンパク買やベブチドのＮ一末端
からアミノ酸を順次遊離させる酵素で、微生物．植物及
び動物組織などに広く分布している．アミノベブチダー
ゼは酵素の分類学的にはα−アミノアシルペプチド　ヒ
ドロラーゼ（α−Ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｐｅｐｔｉｄｅ
　ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）　　ＥＣ３．４．１１．に属す
る（ＮｏｍｅｎｃＬａｔｕｒｅ　Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ　
ｏｆ　ｔｈｅＩｎｔａｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｕｎｉｏｎ
　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．　Ｅｎｘｙａ＋ｅ
Ｎｏａ＋ｅｎｃｌａｔｕｒｅ，　１９８４．　Ａｃａｄ
ｅｓｉｃ　Ｐｒｅｓｓ．参照）。

しかし、アミノペプチダーゼはその基質特異性や性質の
違いから、様々な種類に分けられており、その分類基準
はやや不明瞭である。これまで知られているアミノペプ
チダーゼはほとんどが常温生物から得られたものである
。また、ＤＮＡ配列が報告されているアミノベブチダー
ゼは少なく、大腸菌由来のアミノベブチダーゼＮ　［Ｍ
ｃＣａｍａｎ，Ｍ．Ｔ．ａｎｄ　Ｊ．Ｄ．Ｇａｂｅ，　
Ｇｅｎｅ、４８，　１４５−１５３（１９８６）．Ｆｏ
ｇｌｉｎｏ，　Ｍ．ｅｔ　ａｌ．　Ｇｅｎｅ、４９，　
３０１−３０７（１９８６）］及び大腸菌由来のメチオ
ニンアミノベブチダーゼ［Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔ，　Ａ
，κ．ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ％１６９
，７５１−７５７　（１９８７）　］及びヒト由来のア
ミノペプチダーゼＮ　［Ｏｌｓｅｎ，　Ｊ．ｅｔ　ａｌ
．、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，　２３８，３０７−３
１４　（１９８Ｂ）　］などが報告されている。高度好
熱性細菌由来のアミノペプチダーゼに関してＤＮＡ配列
が報告された例はまだない。

［発明が解決しようとする課題］ 本発明者らは、すでにサーマス属に属するサーマス・ア
クアティカスＹＴ−１　（ＡＴ（：Ｃ　２５１０４）か
ら高度に耐熱性を有するアミノベブチダーゼ（以下、Ａ
Ｐ−Ｔと呼ぶ。）を精製する方法とその利用法について
明らかにしている［特開昭６２−１１０９２．及びＭｉ
ｎａｇａｗａ，　Ｅ．ｅｔ　ａｌ．、Ａｇｒｉｃ．　Ｂ
ｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　５２．１７５５−１７６３　（
１９８８）　］。一般にアミノベプチダーゼの菌体内で
の存在量は少なく、精製には操作が煩雑になり経済的に
も不利である。同様にＡＰ−Ｔを効率的に生産し、精製
しやすくするためには、遺伝子工学的な生産が理想的で
あり、ＡＰ−ＴをコードするＤＮＡの塩基配列の解析が
望まれた。

［課題を解決するための千段］ 本発明者らは、鋭意努力の結果、サーマス・アクアティ
カスＹＴ−１のもつ染色体ＤＮＡからＡＰ−Ｔをコード
するＡＰ−Ｔ遺伝子を分離することに成功した。また、
ＡＰ−Ｔ遺怯子の性質について検討し、その全塩基配列
を決定することができた．その結果、ＡＰ−Ｔ遺伝子の
開始コドンがＧＴＧであることも知った。また、オリゴ
ヌクレオチド　ディレクテド　ミュータジェネシス（Ｏ
ｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＤｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕ
ｔａｇｅｎｅｓｆｓ）の手法［例えば、Ｚｏｌｌｅｒ，
　Ｍ．Ｊ．　ａｎｄ　Ｍ．　Ｓｍｉｔｈ，　Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　ｉｎＥｎｚｙＩＩｌｏｌ．　１５４．　３２９　
〜３４９（１９８７）　に詳しく紹介されている。］を
利用して開始コドンをＡＴＧに変異させ、合わせてこの
開始コドンが変異したＡＰ−Ｔ遺伝子を発現ベクターに
組込むことに成功した．このようなＡＰ−Ｔ遺伝子を組
み込んだプラスミドで形質転換された微生物を用いるこ
とによって、高度に耐熱性を有する＾Ｐ−Ｔをきわめて
効率良く生産できることを見い出した。特に大腸菌など
の中温性細菌にＡＰ−Ｔ遺伝子を導入して、ＡＰ−Ｔを
生産させた場合、大腸菌内で生産されたときでも、ＡＰ
−Ｔは天然のＡＰ−Ｔと同様に高い耐熱性を有するので
、このような菌体を超音波等の手段で破砕した後、単に
７０゜〜８０℃程度の加熱を一定時間行なうだけで、Ａ
Ｐ−Ｔ以外の大腸菌が元々もっている酵素やタンパク買
は熱変性して沈殿する．その結果、遠心分離後の上澄液
には、他の酵素活性を含まないほとんどＡＰ−Ｔ活性の
みを有する溶液が得られることを見い出した。それ故、
極めて容易にＡＰ−Ｔを精製することが可能である。本
発明はかかる知見により完成されたものである。

すなわち、本発明は高度好熱性細菌サーマス属由来の耐
熱性を有するアミノペプチダーゼ（ＡＰ−Ｔ）をコード
するＤＮＡ配列及びそれを含むプラスミドに関するもの
である。

本発明のＤＮＡ配列の決定は次の方法によって行うこと
ができる． （１）　ＡＰ−ＴをコードするＡＰ−Ｔ遺伝子のクロー
ニング本発明にかかわるクローニングの基本的手法は、
例えばＭａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ；＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｇｏｌｄ　ＳｐｒｌｎｇＨａｒｂ
ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎ
ｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８２：　Ｂｅｒｇｅ
ｒ．　Ｓ．Ｌ．　ａｎｄ　Ａ．Ｒ．　Ｋｉｍｍｅｌ（ｅ
ｄ．），Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ１．ｖｏ
ｌ．ｌ５２（Ｇｕｉｄｅ　ｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，（１９８７）及
びＰｅｒｂａｌ，　Ｂ．Ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ｇｕ
ｉｄ　ｔｏ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ（２ｎ
ｄ　ｅｄ．），　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ
，（１９８８）に詳しく紹介されている。

本発明のサーマス・アクアテイカスＹＴ−１（Ｔｈｅｒ
ｍｕｓ旦」工匡■ＹＴ−１）はすでにアメリカン・タイ
プ・カルチャー　コレクションに寄託番号ＡＴＣＣ２５
１０４で寄託されており、何人も人手可能である（Ｔｈ
ｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎＣａｔａｌｏｇｕｅ　ｏｆ　Ｓｔｒ
ａｉｎｓ　１４ｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ　１９８０．参照
）。サーマス・アクアテイカスＹＴ−１株を培養し、菌
体を回収後、Ｓａｉｔｏ−Ｍｉｕｒａ法［Ｂｉｏｃｈｉ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．＾ｃｔａ、７２，　６１９（１９
６３）］　などにより染色体ＤＮＡを抽出する。この染
色体ＤＮＡを制限酵素で切断する。切断された染色体Ｄ
ＮＡを、アガロースゲル電気泳動した後、メンプランフ
ィルター（例えば、ニトロセルロースメンブラン，ナイ
ロンメンブランなど）に例えばサザンの方法［Ｓｏｕｔ
ｈｅｒｎ，　Ｅ，　Ｍ．　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅａ
ａ．　９８，　５０８−５１７（１９７５）］　で移行
させる（以降、サザントランスファーと呼ぶ）．この染
色体ＤＮＡの制限酵素分解断片が結合したメンプランに
対して合成オリゴヌクレオチドをブローブとしてハイブ
リダイゼーションを実施する．これに用いるオリゴヌク
レオチドは、サーマス・アクアティカスＹＴ−１から精
製されたＡＰ−Ｔを化学分析して決定されたアミノ酸配
列から、それをコードするＤＮＡ配列を推定し、ＤＮＡ
合成装置で合成する．プローブとして用いるオリゴヌク
レオチドの設計は、多様な可能性があるが、例えばブル
ースらの考え方［Ｂｒｕｔｈ，　Ｒ．ｅｔａｌ．　　Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　　１５
２，４３２−４４３（１９８フ）】が参考になる。合成
オリゴヌクレオチドは５′末端を［γ一”Ｐ］ＡＴＰと
Ｔ４ボリヌクレオチドキナーゼを用いて常法［例えば、
Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ：　ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ｍａｎｕａｌ．　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ
ｒ，　Ｎ．Ｙ．（１９８２）　Ｐ．１２２参照］により
放射性ラベル化する。このラベルされたオリゴヌクレオ
チドを用いて、前述したメンプランのハイブリダイゼー
ションを実施する。パイプリダイゼーションの手法とし
てはＨａｒｎｅｓ，　Ｂ．Ｄ．　ａｎｄ　Ｓ．Ｊ．Ｈｉ
ｇｇｉｎｓ（ｅｄ．）、Ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ　ｈｙ
ｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ；　ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　
ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ　ＰＲＥＳＳ、（１９８５）
などが参考となる。パイプリダイゼーシミン後、オート
ラジオグラフィーにより検出する。合成オリゴヌクレオ
チドと特異的にパイプリダイズするバンドが見い出され
たならば、それに用いた制限酵素を用いて、再度サーマ
ス・アクアティカスの染色体ＤＮＡを分解し、アガロー
スゲル電気泳勅を実施し、ハイブリダイズしたＤＮＡ断
片の大きさに相当するＤＮＡ断片をアガロースゲルから
切り出した後、抽出する。抽出した断片を市販のベクタ
ーの役割をするプラスミドを制限酵素で消化したものと
りガーゼで連結する。この連結したＤＮＡを用いて標準
的な方法で宿主となりつる細菌を形質転換し、得られた
形質転換株のうち、コロニーハイプリダイゼーションに
より前記のオリゴヌクレオチドブローブに特異的にパイ
プリダイズするコロニーあるいはＡＰ−Ｔの活性を示す
コロニーを鈎菌し、これらの中から八Ｐ−Ｔ遺伝子を含
有すると予想されるプラスミドを抽出する。プラスミド
に組み込まれたＤＮＡ断片中のＡＰ−Ｔ遺伝子の位置は
次のようにして決定できる。ＡＰ−Ｔ遺伝子を含んでい
ると予想されるＤＮＡ断片あるいはプラスミドを各種制
限酵素で分解し、アガロースゲノレ電気冫永勤あるいは
ポリアクリルアミド電気泳勅などで分解物の各断片の大
きさを算出する。この結果を前記のＡ　ｐｒａｃｔｉｃ
ａｌｇｕｉｄｅ　　ｔｏ　　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　ｃ
ｌｏｎｉｎｇ（２ｎｄ　　ａｄ．）（１９８８）９．３
６３−３６７　．などに一般的に示されている考え方で
制限酵素地図を作成する。一方、これらの分解したＤＮ
Ａ断片をアガロースゲル電気泳勅し、メンプランにサザ
ントランスファーし、このメンプランを用いてオリゴヌ
クレオチドブローブに特異的にハイブリダイズするバン
ドを検出する。プローブにハイブリダイズしたバンドを
制限酵素地図より特定する。

（２）　ＡＰ−Ｔ遺伝子の塩基配列の決定ＡＰ−Ｔ遺伝
子を含んでいると予測される領域について、そのＤＮＡ
断片の全塩基配列をＳａｎｇｅｒのシデオキシ法［Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，　２１４．　１２０５（１９８１）］など
の方法を用いて決定する。このように決定された塩基配
列からそのコードするアミノ酸配列を推定し、それをＡ
Ｐ−Ｔを化学分析することによフて得られたアミノ酸配
列と比較することによって、どの部分がＡＰ−Ｔのタン
パクをコードしているかがわかる。

このようにして得られたＡＰ−Ｔ遺伝子配列の知見とＤ
ＮＡ断片中の位置から、ＡＰ−Ｔ遺伝子部分を切り出し
て、適当な市販の発現ベクターに組み込み、ＡＰ−Ｔを
遺伝子工学的に生産することが可能となる。

（３）ＡＰ−Ｔ遺伝子の発現 本発明のＡＰ−ＴをコードするＤＮＡの配列を含むＤＮ
Ａ断片を適当なプラスミドに組込んで大腸菌などの適当
な生物を形質転換し、ＡＰ−Ｔを生産することができる
。また、ＡＰ−Ｔ遺伝子の開始コドンあるいは終止コド
ンをその宿主に合った別の配列のコドンに変更しても良
い。遺伝子のコドン利用率は生物によフてその利用率が
異なるので、宿主に用いる生物に最適になるように、Ａ
Ｐ−Ｔ遺伝子中のアミノ酸をコードする配列を同じアミ
ノ酸をコードする別の配列のコドンに変更しても良い．
ＤＮＡ配列中の一部の塩基を他の塩基で置換することは
、例えばＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｄｉｒｅｃ
ｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓの手法を用いれば容易に
実施できる。

本発明においてクローニング．サブクローニングに用い
られる宿主としては、エッシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ）属細菌、例えばエツシエリヒア・コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＭＶ１１８４　（宝酒
造製）等が用いられる。ベクターとして用いられるプラ
スミドとしては、ｐＵＣ系のベクター（例えばｐＵ［：
１８　，ｐＵ［；１９，　ｐｌｌｃ１１８，　ｐｊｌＧ
１１９など）やｐＫＫ２２３−３など多くのプラスミド
が容易に市販品として人手できる。本発明で行ったクロ
ーニングや遺伝子組換えあるいは塩基配列の決定に用い
る器具や試薬，酵素類．菌株等についても容易に市販品
を人手できる。

上述したことから明らかなごとく、本発明のＡＰ−Ｔ遺
伝子の解明によって初めて可能となったＡＰ−Ｔの遺伝
子工学的な生産により、耐熱性の非常に高いＡＰ一丁を
効率良く生産できるので、本発明は産業上極めて有用な
ものである。

［実施例］ 以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。

実施例１　サーマス・アクアティカスＹＴ−１からの染
色体ＤＮＡの抽出 サーマス・アクアティカスＹＴ−１　（ＡＴＣＣ２５０
１４）株を特公昭６２−１１０９２号公報に記載の方法
と同様な方法で培養した。培養後、菌体を遠心分離で回
収した。得られた菌体６ｇ（湿物重）からＳａｉｔＯ−
Ｍｉｕｒａ法（前出）に従って染色体ＤＮＡを得た．実
施例２　オリゴヌクレオチドプローブの作製＾Ｐ−Ｔ遺
伝子を染色体ＤＮＡの制限酵素分解断片中から検出する
ためにオリゴヌクレオチドをブローブとして用いた。サ
ーマス・アクアティカスＹＴ−１の菌体より抽出、精製
されたＡＰ−Ｔの化学的分析により、すてにＮ一末端側
の一部のアミノ酸配列が、すでに明らかとなっている［
Ｍｉｎａｇａｗａ，　Ｅ．ｅｔ　ａｌ．，＾ｇｒｉｃ．
　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　５２．　１７５５−１７
６３（１９８８）］。このアミノ酸配列より、それをコ
ードするＤＮＡの配列を推定し、第１図に示した混合オ
リゴヌクレオチドを合成した．合成にはバイオサーチ社
（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ．　ＩＮＣ．）のサイクロン（Ｃ
ｙｃｌｏｎｅ）　　Ｄ　Ｎ　Ａ合成機を用いた。合成オ
リゴヌクレオチドの５′末端側の水酸基を次のようにし
て放射性リンでラベルした。すなわち、合成オリゴヌク
レオチド２０ｐｍｏＲ（ピコモル）　０．７５μｆ．　
１０ｘカイネーションバッファ一（κｌｎａｔｉｏｎ　
ｂｕｆｆｅｒ）［５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−｝１ｃｊ）（１
１８７．５），　　１０ｍＭ　Ｍｇ（１：ｊ’ｚ，５　
ｍＭジチオスレイトール（　Ｄ　Ｔ　Ｔ　）　，　０．
１ｍＭスペルミジン（Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ），　０．
１Ｍ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　３　２．５μ１．１０μＣｉ
／μＲ［γ−”Ｐ］　　ＡＴＰ　　５．０μＲ．８２０
　　１５．７５μ２Ｔ４キナーゼ（宝酒造製）１．０μ
ｐをエッペンドルフチェーブ内で混合し、３７℃で１時
間反応させた．６５℃で１０分間加熱し、Ｔ４キナーゼ
を失活させた。この反応混液は未反応の［γ−３２ＰＩ
ＡＴＰを含むので、セップパック（Ｓｅｐ−Ｐａｋ）　
　（ウォーターズ社製，　ＰＡＲＴＮｏ．５１９１０）
を用いて精製し、遊離の［γ一”ＰＩＡＴＰを除いた。

これをオリゴヌクレオチドプローブとして使用した。

実施例３　サザンハイプリダイゼーション実施例１で得
られた染色体ＤＮＡ約１００μｇをＨｉｎｄｌｌｌ　（
市ｆｆｉ品．ベーリンガーマンハイム製）１００Ｕで完
全に分解後、常法によりアガロース電気泳勤する。この
ゲルをサザンの方法（前出）に従って、ナイロンメンブ
ラン（Ｈｙｂｏｎｄ　Ｎ　，　アマシャム社製）にトラ
ンスファーした。この膜に紫外線を照射して固定化した
。このメンプランをプレパイプリダイゼーション溶液（
　６　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ　，５　ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶
液，　　５０ｍＭ　ｓｏｄｉｕｍ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５），　２５０μｇ／ｍＲのｓ
ｏｎｉｃａｔｅｄ　ｓａｌｍｏｎｔｅｓｔｅｓＤ　Ｎ　
Ａ　［Ｓ１ｇｍａ，　ｔｙｐｅｌｌｌ　Ｎａ　Ｓａｌｔ
ｙ）中に浸漬し、６５℃で３時間ブレパイプリダイゼー
ション反応後、そのメンプランをさらにパイプリダイゼ
ーション溶液（実施例２で調製した放射性オリゴヌクレ
オチドブローブ溶液２００μ２を含む、６　Ｘ　Ｓ　Ｓ
　Ｃ，　　Ｉ　ＸＤｅｎｈａｒｄｔ溶液，　　５０ｍＭ
　Ｓｏｄｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐ
Ｈ８．５），ｌｏｏμｇ／ｍｉ）のｓｏｎｉｃａｔｅｄ
ｓａｌｍｏｎ　ｔｅｓｔｅｓ　Ｄ　Ｎ　Ａ　［Ｓｉｇｍ
ａ．　ｔｙｐｅｌｌｌ　Ｎａ　Ｓａｌｔ］）中に浸漬し
、６０℃にて１６時間反応させた．メンプランの洗浄は
、洗浄液Ｉ　（２ＸＳＳＣ，Ｑ．１％ＳＤＳ）で室温に
て１５分洗浄後、洗浄液！１（０．ＩＸＳＳＣ，０．５
％ＳＤＳ）で５０℃にて３０分間洗浄して行った。メン
プランは水を切ったのち、フィルムカセットに入れ、−
７０℃で増感紙存在下でオートラジオグラフィーを実施
した。この結果、約５．０κｂ　（キロベース）付近の
ＤＮＡ断片が、オリゴヌクレオチドブローブと特異的に
結合することが判明した。

実施例４　　ＡＰ−Ｔ遺伝子を含むＤＮＡ断片の回収実
施例３で染色体ＤＮＡの旧ｎ　ｄ　ＩＩＩ断片のうち、
約５．ＯＫｂの断片がＡＰ−ＴのＮ一末端近くの配列に
相当するＤＮＡ配列をもっていることが示唆されたので
、新たに染色体Ｄ　Ｎ　Ａ　２００ｔＬｇをＨｉｎｄｌ
ｌ１で完全に分解し、アガロースゲル電気沫動により分
離した。約５．ＯＫｂに相当する部分をゲルから切り出
して、Ｍａｎｉａｔｉｓら（前出）の方法に従って、ゲ
ルからＤＮＡ断片を電気泳勤抽出法により抽出した。

抽出されたＤＮＡ断片をフェノール・クロロフォルムに
よる精製（Ｍａｎｉａｔｉｓら、前出、９．４６０）後
、２０ａｌのＴＥ．バッフｙ　−　（　ｌｏｍｈｌ　Ｔ
ｒｉｓ−４１Ｃｉｌ（ｐＨ７．４）　．１　ｍＭＥ　Ｄ
　Ｔ　Ａ　）に溶解した。

実施例５　マルチクローニングサイトをもち、アンビシ
リン耐性を有するｐＵｃｌ１８プラスミドベクターの回
収 あらかじめｐＵｃ１１８をルビジウム法（　Ｍａｎｉａ
ｔｉｓら、前出、９．２５２）でコンビテント化したＥ
．　ｃｏｌｔＭＶＩＬａ４を用いてｐｔｌｃ１１Ｂプラ
スミド（宝酒造製）を用いて形質転換した。このｐＵｃ
１１８をもつＥ．　ｃｏｌｉＭＶ１１８４株をＬ一プロ
ス（トリブトン１％．酵母エキス０．５％，　ＮａＣＪ
　Ｏ．５％．グルコース０．２％、ｐＨ７．０　，アン
ビシリン５０μｇ７１入り）で一昼夜培養後、菌体を遠
心して回収し、アルカリ溶菌法（前出）で菌体からプラ
スミドを回収した。次いで、Ｈ　ｉ　ｎ　ｄ　ＩＩ１で
完全に分解し、バクテリアルーアルカリフオスファター
ゼで処理（Ｍａｎｉａｔｉｓら、前出，　＋１．１３３
〜ｌ３４》することにより、５′末端のリン酸基を除去
し、ベクターとした。

実施例６　　ＡＰ−Ｔ遺伝子を含むＤＮＡ断片のベクタ
ーへの組込みと形質転換 実施例４で回収したＨ　ｉ　ｎ　ｄ　ＩＩ１断片０．１
μｇを実施例５で作製したベクターｐＵ（：１１８の旧
ｎ　ｄ　ＩＩＩ断片０　．　５ａｇと混合し、５０ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−｝ＩＣｊ）（ｐＨ７．４），　１０ｍＭ　
Ｍｇｃｇ２．１０ｍＭＤ　Ｔ　Ｔ　，　　１　ｍＭスベ
ルミジン．ｌｍＭＡＴＰ，０．１＋ｎｇ／Ｍ＋　　Ｂ　
Ｓ　Ａ　Ｃウシ血清アルブミン）溶液２０μｐ中で、３
５０ＵのＴ４ソガーゼを加えて室温で２時間反応させた
。このうち１　０Ｂを形質転換に用いた。

形質転換は宿主としてＥ．　ｃｏｌｉ　ＭＶ１１８４株
を用いた。Ｅ．　ｃｏ目ＭＶ　１１＆４株は前述のルビ
ジウム法に従ってコンビテント化した。Ｅ．　ｃｏｌｔ
　ＭＶｌｌ８４のコンビテントセル溶液１００μ２に、
上記ＤＮ，１８’ｔ１１０μｐを加え、０℃にて３０分
おいたのち４３，５℃で３０秒間加熱し、ヒートショッ
クを加えたのち１ｍｊ＋のＬ−ブロスを加え、振とうし
ながら３７℃で１時間培養した。この培養液を表面にナ
イロンメンブラン（ｌ｛ｙｂｏｎｄ−Ｎ　，アマシャム
社！！！｝を敷いたＨ−プレート寒天培地（１％バクト
トリブトン，０．８％ＮａＣ１，　１．２％寒天，　０
．０５＋ｎＭ　ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ　−β　−Ｄ−ｔｈ
ｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ　　（　　Ｉ
　　Ｐ　　Ｔ　　Ｇ　　）５０μｇ／ｍＲアンビシリン
，　５０μｇ／ｍｐ　５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈ１ｏｒ
ｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉ
ｄｅ　（Ｘ−ｇａｌ）含有）のメンプラン表面に６枚に
分けて接種し、コンラージ棒で分けて３７℃で培養した
。培養後、コロニーが肉眼で見える程度の大きさまで生
長したとき（約０．１〜０．５ｍｍ径）、無菌的にメン
プランをプレートから取り出し、同じ大きさのナイロン
メンブランをコロニー面に重ねて無菌的にプレスし、レ
プリカをとった。オリジナルとレプリカのメンプランを
それぞれＨ−プレート表面にのせて、さらに培養を続け
た。培養後、総数として７７６個のコロニーが生じ、そ
のうち７６３個がＸ−ｇａｌを分解しない白いコロニー
（すなわち、ベクターにＤＮＡ断片が挿入されたもの）
であった。コロニーが十分生長したとき（約８時間培養
後）、オリジナルプレートは冷蔵し、レプリカメンブラ
ンをコロニーパイプリダイゼーションに用いた。コロニ
ーが生育したこのレプリカメンブランを風乾後、０．５
　Ｎ　ＮａＯＨ，　１．５Ｍ　ＮａＧｉ　ｆＩ液に５分
間２回浸み込ませ、次に１．５　Ｍ　ＮａＣｊ！　，　
　Ｉ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−｝ＩＣＲ（ｐ｝１７．５）　ｌ液
に５分間２回浸漬して中和し、次いで３　Ｘ　Ｓ　Ｓ　
Ｃ　（ｐ｝１７．２）で１０分間浸漬した。十分風乾後
、紫外線を照射してＤＮＡをメンプランに固定した。こ
のメンプランを実施例３で述べたと同様に６５℃で３時
間ブレハイブリダイゼーション後、オリゴヌクレオチド
ブローブを含むハイブリダイゼーション溶液に浸漬し、
６５℃で２０時間反応させた。次に、２ＸＳＳＣ，０．
１％ＳＤＳで室温．にて１０分間洗浄後、０．Ｉ　Ｘ　
Ｓ　Ｓ　Ｃ，　Ｑ．５％ＳＤＳで４０℃にて３分間洗浄
した。増感紙を入れて−７０℃でオートラジオグラフィ
ーを行った。その結果、合計７７６個のコロニーのうち
、６個がオリゴヌクレオチドプローブと強くハイブリダ
イズすることが判明した。これらのコロニーと対応する
コロニーをオリジナルメンブランのコロニーから鈎菌し
、Ｌ−グロスで培養、アルカリ溶菌法でプラスミドを抽
出した。これらのブラスミトをＨ　ｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ
で分解し、アガロースゲル電気泳勅を実施した。その結
果、これらの６株はすべて約５．ＯＫｂの｝ｌ　ｉ　ｎ
　ｄ　Ｉｌ１断片が挿入されていることが確誌された。

さらに、このアガロースゲルをダイレクトゲルハイブリ
ダイゼーション法により確かにブローブが特異的にパイ
プリダイズすることを次のようにして確認した。

電気泳勅後得られたゲルを０．５　Ｎ−ＮａＯＨ，　０
．１５Ｎ　　ＮａＣＲ溶液で１時間浸漬しアルカリ変性
した後、０．５　Ｍ　　Ｔｒｉｓ．ＨＣＩ２（ｐＨ８．
０）　１５０ｍＭ　ＮａＣｉｌで３０分洗浄し、ベーバ
ータオルにはさみ、圧縮して水分をできるだけ除いた。

このようにして約１　ｍｍの厚さになったゲルをワット
マン３ＭＭペーパーに穆し、市販のゲル乾燥装置を用い
６０℃で３０分乾燥して完全に膜状にした．このメンプ
ランを実施例１〜３で示した方法と同じ方法でハイブリ
ダイゼーションを実施した．この結果、上述の６株のト
ランスフォーマントはすべてブローブにハイブリダイズ
するＨ　ｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ断片を含んでいることが示
された。これらのプラスミドを各種の制限酵素で分解し
、アガロース電気沫動でパターンを比較することにより
、これらがすべて同じＤＮＡ断片を含むことが示された
。

これらのうち、ベクターのＩ）Ｕ（：１１８のβａＣプ
ロモーターの方向に対して互いに逆向きにＢ　ｉ　ｎ　
ｄ　ＩＩ！断片が挿入されているプラスミドをそれぞれ
ｐＡＴ１５Ａ，　ｐＡＴ１５Ｇと命名し、以降の実験に
用いた。

実施例７　組換え体プラスミドｐＡＴ１５＾，　ｐＡ７
１５Ｇの制限酵素地図の作成 ｐＡＴ１５Ａ及びｐＡＴ１５Ｇをそれぞれ、ｐＵｃ１１
８においてマルチクローニングサイト部分以外を切断し
ない酵素で分解し、その電気泳勤パターンから制限酵素
地図を作成した。

また、これらの制限酵素分解物をアガロースゲルで電気
沫動し、実施例６と同様にアガロースダイレクトパイプ
リダイゼーションを行うことによってブローブが制限酵
素地図中でどこにハイブリダイズするかを特定できた。

このようにして得られた制限酵素地図を第２図に示した
。なお、この制限酵素地図にはκｐｎｌ　，　　Ｓｐｈ
Ｉ　，　　ＸｈｏＩ　，Ｈ　ｉ　ｎ　ｄ　ＩＩ１のサイ
トのみを示してある。

実施例８　＾Ｐ−Ｔ遺伝子の塩基配列の決定挿入された
ＤＮＡ断片中のＡＰ−Ｔ遺伝子の配列を決定するために
、制限酵素ＳｐｈＩ　　，　ＫｐｎＩＳｍａｌ　　，　
Ｘｈｏｌでそれぞれ分解しｐＵｃ１１８あるいはｐｔｌ
ｃ１１９のベクターのマルチクローニングサイトにサブ
クローニングした。

これらの新たに構築されたプラスミドの挿入断片のうち
ＡＰ−Ｔ遺伝子の断片を含むプラスミドについて塩基配
列の決定を行った。ｐｔｌｃ１１８及びｐＬＩｃ１１９
はファージＭ１３ＫＯ７を感染させることにより一本１
ｉＤＮＡを生産することができるベクターで、そのため
容易にＳａｎｇｅｒのジデオキシ法［Ｄｉｄｅｏｘｙｃ
ｈａｉｎ　ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ；　
Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　
ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏ
ｆＳｃｉｅｎｃｅ，　Ｕ．Ｓ．＾．，　７４．　５４６
３−５４６７（１９６７）参照］のテンプレートとして
利用できる。すなわちこれらのプラスミドをＭ１３ＫＯ
７を用いてそれぞれの一本釦を生産した．これをテンプ
レートとして、［ａ−”Ｐ］　ｄＣＴＰ　（アマシャム
社製）　，　ｄｅａｚａ−ｄ／ｄｄ　　ｄ　Ｘ　Ｔ　Ｐ
シークエンシングキット（ベーリンガー製）及びＭ１３
ユニバーサルブライマー（宝酒造）を用いてシークエン
シングを実施した。

シークエンシング用の電気泳勅用ゲルの作製はベルバル
の方法（前出）に従った。ゲルの大きさは４０ｘ　２０
ｘ　０．０３５ｃｍで、８Ｍ尿素を含む８％ポリアクリ
ルアミドゲルを主に用いた。泳勅は２０００　Ｖで行っ
た。サーマス属のＤＮＡはＧ．＋Ｃ含量が高く、バンド
のコンブレッションが問題となる。それ故泳動は出来る
だけ６０ｔ以上で実施した。また、ユニバーサルブライ
マーでシークエンシングをして得られた塩基配列をもと
に、実施例２で示したと同様な方法で１７−ｍａｒのオ
リゴヌクレオチドを合成し、これをシークエンシングブ
ライマーとして、シークエンシングを行った。このよう
にしてＡＰ−Ｔ遺伝子を含むと考えられる領域１，５　
８　２　ｂ　Ｉ）の全塩基配列を決定した。第３図にシ
ークエンシングの戦略を示した。また、ＡＰ−Ｔ遺伝子
を含む全領域の塩基配列を第４−１図及び第４−２図に
わたって示した。

塩基配列を決定したことにより、ＡＰ−Ｔ遺伝子が第４
−１図から第４−２図に示した塩基配列のうち第１７７
番目のＧからコードされていることが判明した。第１７
７番目から始まるコドンＧＴＧは原核生物の開始コドン
として知られており、このＧＴＧからのオープンリーデ
ングフレームは１４０１番目から始まる終止コドンＴＡ
Ａまで続いていた。また、このオープンリーディングフ
レームから推定されるアミノ酸配列は、精製ＡＰ−Ｔの
Ｎ一末端部分のアミノ酸配列及びプロモシアン分解物の
アミノ酸配列の分析値と良く一致した（第４−１図〜第
４−２図中、下線で示した。） 終止コドンの下流の１４２１Ｎ１４４４番目の塩基の部
分にインバーテッドリピート配列があり、これは典型的
なターミネーター構造を示していた。また１７７番目〜
１４００番目のオープンリーディングフレームがコード
するアミノ酸組成は、表１に示したように、天然物のア
ミノ酸組成ときわめて良く一致した．また、遺伝子配列
から推定されるＡＰ−Ｔの相対分子量は４４，８２０で
あり、精製したＡＰ−ＴのＳＤＳ−ディスク電気泳勤か
ら推定された千ノマーの相対分子量４８，０００　［皆
川らの推定による、Ｍｉｎａｇａｗａ，　Ｅ．　ｅｔ　
ａｌ．，　Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，５
２．１７５５−１７６３　（１９８８）　］とも良い近
似を示した。

このように決定されたｓｐｈ　ｒからＸｈｏ　Ｉサイト
までの１，５　８　２　ｂ　ｐ内に、ＡＰ−Ｔをコード
する全塩基配列が含まれていることが確認できた。また
、ｐＡ７１５Ｇはベクターのｌａｃプロモーターに対し
て正向きに、ｐＡＴ１５Ａは逆向きに、ＡＰ−Ｔ遺伝子
が組込まれていることが明らかとなった。ここで明らか
になったＡＰ−Ｔ遺伝子から推定されるＡＰ−Ｔの一次
構造、すなわちアミノ酸配列は、タンパク質データベー
スを用いたコンピューターによるホモロジー検索の結果
、高いホモロジーをもつ既知のタンパク質は存在しなか
った。使用したデータベースはＮＢＲＦ−ｆ’ＤＢ（Ｎ
ａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈＦｕｎｄａｔｉｏｎ，　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ
　Ｂａｓｅ）　（１９８８年、３月）であった．また、
すでにＤＮＡ配列の知られている大腸菌のアミノペプチ
ダーゼＮ　［Ｍｃ（：ａｍａｎ，Ｍ．Ｔ．．　ａｎｄ　
Ｊ．Ｄ．　Ｇａｂｅ，Ｇａｎｅ　４１Ｓ，　１４５−１
５３（１９８６）］及びメチオニンアミノベブチダーゼ
Ｂａｎ−Ｂａｓｓａｔ，Ａ．κ．　ａｔ　ａｌ．．　Ｊ
．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１６９．　７５１−７５
７（１９８７）］　及びヒト由来のアミノペプチダーゼ
Ｎ［０１ｓｅｎ，　　Ｊ．　　ｅｔ　　ａｌ．，ＦＥＢ
Ｓ　　Ｌａｔｔｅｒｓ，　　２３８，　　３０７−３１
４（１９８８）］　とはホモロジーは低かった。それ故
、ＡＰ−Ｔは全く新規なアミノベブチダーゼと考えられ
た． 表Ｉ　　ＡＰ−Ｔのアミノ酸組成 スレオニン セリン ｌ９ ｌ４ ｌ８ ｌ０ ブロリン グリシン アラニン システイン パリン メチオニン イソロイシン ロイシン チロシン フェニルアラニン リジン ヒスチジン アルギニン 実施例９　　ＡＰ−Ｔ遺伝子の大腸菌内での発現ｐＡＴ
ｌ５Ａ，　ｐＡＴ１５ＧはＡＰ−Ｔの遺伝子を全配列を
含むことが明らかとなった。これらのプラスミドを保有
するＥ．　ｃｏｌｔ　ＭＶ１１８４、すなわちＥ．　ｃ
ｏｌｉ　ＭＶ１１８４（ｐＡＴ１５Ａ）　，　Ｅ．匹坦
ＭＶ１１８４　（ｐＡＴ１５Ｇ）がＡＰ−Ｔの活性をも
つかどうか試験するために、次のような実験を行った，
　Ｅ．　ｃｏｌｔ　ＭＶ１１８４（ｐＡＴ１５Ａ），　
Ｅ．　ｃｏｉｌＭＶ１１８４　（＋）ＡＴＬ５Ｇｌ　＆
びＡＰ−Ｔ遺伝子をもたないＬｃｏｌｉ　ＭＶ１１８４
（ｐＬＩｃ１１８）をＬ−ブロス（１０ｍ１．５０μｇ
／ｍｆｆｉアンピシリン入り）に接種し、３７℃で振と
り培養し、Ｉ　ＰＴＧを加えるものはＯＤ５５。一約０
．５のときに、０．１ｍＭになるようＩ　ＰＴＧを添加
し、さらに約２０時間培養した。遠心分離により菌体を
回収し、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ）　（ｐＨ８．５
）で菌体を懸濁し、再度遠心した。５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ
−｝１ｃｉ’　（ｐＨａ．５）に再懸濁後、超音波破砕
し、次に７０℃の温渇中で１時間加熱した．遠心して変
性したタンパクを除去し、上澄液を回収した。合成基質
であるＬｅｕｃｉｎ−４一Ｎｉｔｒｏ−　ａｎｉｌｉｄ
ｅを加え、７０℃で１６時間反応させた。反応停止には
１０％トリクロ口酢酸溶液を加え、除タンパク後、上澄
液の４１Ｏｒ＋＋ｎにおける吸光度を測定した。その結
果を表２に示した。この結果から、このＡＰ−Ｔ遺伝子
を含むＤＮＡ断片は＾Ｐ−Ｔ遺伝子がベクターのＮａｃ
プロモーターに対して正向きに組み込まれていても、逆
向きに挿入されていても活性を示すことがわかクた。

表２　大腸菌，　Ｅ．　ｃｏｌｔ　ＭＶ１１８４におけ
るＡＰ−Ｔ遺伝子の発現例 ｐＵｃ１１８　（対照）　　　　　　　０．１５ｐＡＴ
１５＾　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｌ．０４
ｐＡＴｌ５八十　ｒＰＴＧ　　　　　　　　　　　　　
　Ｏ．９２ｐＡＴ１５Ｇ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　１．１３ｐＡＴ１５Ｇ＋　ＩＰＴＧ　　　　　
　　　　　　　　１．０８◆ロイシン−４−ニトロアニ
リドを基質として７０℃で測定 実施例１０　　オリゴヌクレオチド　ディレクテッドミ
ュータジネシスを用いたＡＰ−Ｔ遺伝子の発現プラスミ
ドの構築 実施例９で示したようにＡＰ−Ｔ遺伝子を含む１）ＡＴ
１５Ａ，　ｐＡＴ１５Ｇでも発現するが、あまり効率的
ではなかった。これは、このＡＰ−Ｔ遺伝子の開始コド
ンが大腸菌では使用頻度の少ないＧＴＧであること、ま
たベクターがもつプロモーター領域とかなり離れてＡＰ
−Ｔ遺伝子が存在することが主な理由と考えられた。そ
こで、次のようにして大腸菌でのＡＰ−Ｔの大量発産を
目指した。まず、スタートコドンのＧＴＧをＡＴＧに変
更し、合わせてクローニングされたｓｐｈ　Ｉサイトか
らスタートコドンの前の１７６ｂｐまでの余分な配列（
この部分はサーマス・アクアティカスＹＴ−１のＡＰ−
Ｔ遺伝子のプロモーター領域を含むと考えられた。）を
除去（デリーション）し、ｔａｃプロモーターのＥｃｏ
Ｒ　Ｉサイトに直接連結することにした。手法としては
オリゴヌクレオチド　ディレクテッド　ミュータジェネ
シスと呼ばれる技法によるもので、クンケルの方法［Ｋ
ｕｎｋｅｌ，　　Ｔ．Ａ．　　Ｐｒｏｃ．　　Ｎａ口．
　八ｃａｄ．　　Ｓｃｉ．　　ＵＳＡ，８２，　４８８
−４９２（１９８５）］をゾーラーとスミスの方法［Ｚ
ｏｌｌａｒ．　Ｍ．Ｊ．　ａｎｄ　Ｍ．Ｓｍｉｔｈ．　
Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４．　３２９−
３５０（１９８７）］　に従って改変して行った。

具体的には次のように実施した。ｐＡ７１５Ｇ　２００
μｇをｓｐｈ　Ｉで完全分解し、次にＸｈｏ　Ｉを加え
て部分分解し、ＡＰ−Ｔ遺伝子を全て含むＳｐｈ　１　
−Ｘｈｏ　Ｉ断片（１，５８２Ｍ）を得た．これをｐｔ
ｌｃ１１９のＳｐｈ　Ｉ　−Ｓａｌ　Ｉサイトにライゲ
ーションしプラスミドｐＧ１を得た（第５図），ｐＧ１
をＥｃｏＲ　ＩとＨ　ｉ　ｎ　ｄ　ＩＩ１で分解し、Ａ
Ｐ−Ｔ遺伝子を含むＥｃｏＲ　Ｉ　−　｝１ｉｎｄｌｌ
！断片（これをフラグメントＨと呼ぶ）を得た。一方発
現ベクターとしてはｔａｃプロモーターをもつｐＥＸＰ
７を用いた（第５図）　．ｐＥＸＰ７はｐＫＫ２２３−
３　（　７　７　ルマシ７社製）のＳｃａ　Ｉサイトか
らｓｐｈ　Ｉサイト（ここにはｔａｃプロモーター領域
．マルチクローニングサイト及びｒｒＢＴ＋’ｈターミ
ネーター領域が含まれる．）をＤＮＡポリメラーゼ■の
３′エキソヌクレアーゼ活性を利用して断片の末端を常
法により平滑化して９１１（：１１９のＰｖｕ　Ｈ　−
Ｐｖｕ　ＩＩフラグメント（この断片にはアンピシリン
耐性、Ｍ１３κ０７ファージのインタージェニツク領域
（ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ　ｒｅｇｉｏｎ）÷セ今゛　　
　が含まれる）とを連結して構 築されたプラスミドである。このｐＥＸＰ７はｐＵｃ１
１８やｐｕｔｔｑ　と同様にＭ１３κ０７ファージを感
染させることにより一本鎖Ｄ　Ｎ　Ａを回収でき、しか
もｐκκ２２３−３由来のｔａｃプロモーターをもった
発現ベクターである，　ｐＥＸＰ７をＳｍａ　Ｉで消化
し、アルカリフォスファターゼ処理した。一方、フラグ
メントＨは末端としてＥｃｏＲ　Ｉと旧ｎ　ｄ　ＩＩＩ
末端をもつ断片で、常法によりＫｌｅｎｏｗフラグメン
トとｄＮＴＰを用いて、３′末端伸長を行って平滑末端
にし、ｐＥＸＰ７のＳｍａ　Ｉサイトにライゲーション
した。クローニングして得られたプラスミドのうち、制
限酵素分解によるパターンからｔａｃプロモーターの向
きに対して正向きにＡＰ−Ｔ遺伝子が挿入されているプ
ラスミドを選び出しｐＥ１３と命名した（第５図参照）
。次に、ｐＥ１３を用いて大腸菌Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＢＷ
３１３（宝酒造製）をトランスフォーメーションしたＯ
Ｌ凹ＢＷ３１３はＦ０，鏝．出　の株で、ｄＵＴＰａｓ
ｅ　とＵｒａｃｉｌ−ＤＮＡ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ
　（Ｕｎｇ）　　を欠く［クンケル，前出参照］。それ
故、ｐＥ１３をもったＥ．　ｃｏｌｉ　ＢＷ３１３　に
Ｍ１３ＫＯ７ファージを感染させ、ところどころＴ（チ
ミン）がＵ（ウラシル）に置換されたｐＥＪ３の一本鎖
ＤＮＡを得ることが出来た。

一方、ｔａｃプロモーターの配列とＡＰ−ＴのＮ一末端
の配列の相補鎖に相当する配列（ただし、開始コドンの
ＧＴＧをＡＴＧに変更してある。）をもつ３６−ｍａｒ
の変異用のオリゴヌクレオチド（　５　’−Ｔ　ＴＣＣ
ＧＴＧＡＡＧＧＣＧＴＣＣＡＴＧＡＡＴＴＣＴＧＴＴＴ
ＣＣＴＧＴＧＴ−３’）及び第４−２図中のＡＰ−Ｔ遺
伝子の塩基配列中１４７６番目〜１４９２番目の塩基配
列の梠補鎮に相当する配列をもつ１７−ｍａｒのオリゴ
ヌクレオチド（　５　’−Ｔ　Ａ　Ｔ　Ｔ　Ｃ　Ｇ　Ｃ
　Ａ　ＣＡＣＡＡＡＡＧＣＡＣ−３’）を合成した。こ
の３６−ｎｅｒの変異用オリゴヌクレオチドの５′末端
のＯＨ基はＴ４ボリヌクレオチドキナーゼとＡＴＰによ
りリン酸化した．以上の２つのオリゴヌクレオチドをと
ころどころウラシルを含むｐＥ１３の一木鎖ＤＮＡに次
のようにしてアニールした。一末娘ＤＮＡ２μ１　（０
．５ｐｍｏｉ＋）を、５′一をリン酸化した変異用３６
−ｍａｒのオリゴヌクレオチド１　μ！！　（１０ｐｍ
ｏｊ））及び１７−ｍｅｒのオリゴヌクレオチド１　μ
ｊ！　（１０ｐｍｏｆ’）と混ぜ、ＩＯＸのバッフｙ−
Ａ　（０．２Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｉｌ，　０．１ＭＭｇ
ＣＲｚ．　０．５Ｍ　　ＮａＣＲ．　　１０ｍＭ　　Ｄ
　Ｔ　Ｔ　（ｐＨ７．５））　１　ｔｔｌ！を加え、さ
らに水を４μ！加えて合計１０μρとする．５５℃で５
分問おいたのち、室温で５分おき、これに２５μ２のＥ
ｘｔｅｎｓｉｏｎバッファ−（宝酒造製、ミュータンＫ
キット），ｘμｐのＡ　Ｔ　Ｐ　（　６　ｍｇ／ｍｊ！
）を加え、ざらにＴ４リガーゼ１μｐ　（　６　ｕｎｉ
ｔ）とκｌｅｎｏｗフラグメント１　ｕＲ（２．５ｕｎ
ｉｔ）　を加えた。ｌＯ℃±２℃で２０時問おいたのち
、０．２ＭＥＤＴＡ３μｐを加え、６５℃で５分間加熱
した．この混合液を実施例４と同様に調製したＥ．　ｃ
ｏｌｉＩＡＶｌｌ８４のコンビテントセル溶液１００μ
ｇに全量加えた．Ｏ℃中に３０分静置後、４２℃で３０
秒加温し、次に１　ｍＲのし一ブロスを加え、１時間振
どう培養した．次に、この培養液をＬＢ寒天培地（１％
バクトトリブトン，０．５％バクトイーストエクストラ
クト．Ｏ、５％ＮａＣＩｌ，　ｐＨ７．０、１５ｏμｇ
／ｍｊアンピシリン入り）６枚に分けて接種し、３７℃
で一畳夜培養した。その結果、合計６０８個のコロニー
が生じたこれらのコロニーのうち５４個を鈎菌し、し−
グロスで培養後、プラスミドを抽出し、制限酵素Ｂａｍ
Ｈ　Ｉで分解した。その結果、２４株がＡＰ−Ｔ遺伝子
の上流のＰｓｔｌから開始コドンまでの１７８ｂρに相
当する長さのデリーションが起っていることが判明した
。そのうちいくつかの株についてプラスミドを抽出し、
実施例８に述べたと同様にダイオキシーシークエンシン
グにより塩基配列を決定した。その結果、それらのプラ
スミドがＡＰ−Ｔ遺伝子のうちの開始コドンのＧ　Ｔ　
ａ　７！ｌ＜　Ａ　Ｔ　ａに変異し、ｔａｃプロモータ
ーのＥｃｏＲ　Ｉサイトに直結していることが明らかと
なった（第５図）。このうちの１株を選び出し、そのプ
ラスミドをｐＫＬ４と命名した（第５図）。

実施例１１　　ＡＰ−Ｔ遺伝子を組込んだｐＫＬ４によ
る大腸菌でのＡＰ−Ｔの大量生産 プラスミドｐＫＬ４をもつ大腸菌Ｅ．．　ｃｏｌｉ　Ｍ
Ｖ１１８４株を１０ｍｊのし一ブロス（　５０μｇ／ｍ
ｆ！アンビシリン）に入れ、３７℃にて一畳夜振どう培
養した。これをｌｍｊ！とり、ｉｆ）ＯｗＲのし−ブロ
ス（　ｓｏμｇ／ｍＲアンビシリン入り）に接種、十分
振とうしながら３７℃で培養した。菌が生育して５５０
ｒ＋ｍにおける吸光度が０．１のときに、Ｉ　ＰＴＧを
１　ｍＭになるように加えた。さらに、１６時間培養後
、遠心分離により菌体を回収した。回収した菌体を５０
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−｝ＩＣｊ）（ｐＨ８．５）で懸濁し、
合計５１となるようにした。

これを超音波破砕装置で十分菌体が破砕されるまで処理
し、次に７０℃のウォーターバスで７０℃にて３０分加
熱した．加熱後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ）　Ｌ／
て上澄液を得た。全く同様の過程でＩ＋ＡＴ１５Ｇある
いはｐＥ１３をもつ大腸菌についても試験した。それぞ
れのＡＰ−Ｔ活性を示したのが表３である．活性の測定
は皆川らの方法［Ｍｉｎａｇａｗａ，　Ｅ．　ｅｔ　ａ
ｌ．　Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　５２．　
１７５５−１７６３（１９８８）］に従った。

ｐＫＬ４をもつ大腸菌では、上澄液に１５００００７＋
ｉ）以上のＡＰ−Ｔの活性があることが示された。

表３　大腸菌によるＡＰ−Ｔの生産例 ｐＡＴ１５Ｇ　　　　　　　　　　　　Ｂ６．５２　　
　　　　　　　１６．９３ｐＥ１３　　　　　　　　　
　　　　　３７．０８　　　　　　　　　　６．４５ｐ
κし４　　　　　　　　　　　　　１５９２５．８６　
　　　　　　　２９１１．４９ｌ）ロイシン−４−ニト
ロアニリドを基質として、７０℃における活性、１ユニ
ットは１分間に１マククロモルのニトロアニリンが遊離
する酵素量と定義． ２）加熱処理後の上澄液ｍ１当り ３）タンパク貿ｍ８当りの比活性 実施例１２ＳＯＳ−ポリアクリルアミド電気株勅による
生産されたＡＰ−Ｔの確認 実施例１１で示したように、ＡＰ−Ｔ遺伝子をもつプラ
スミドｐＫＬ４を用いて大腸菌で生産させたＡＰ−ψビ
ムリーの方法［Ｌａｅｍ＋ｎｌｉ，　ｕ．κ．，　Ｎａ
ｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ］２２７，　６８０−６８５．
　（１９７０）］　で、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電
気泳勤により確記した．上澄液各５μρをレムリ一の方
法に従って各レーンにロードした．濃縮ゲルは６％アク
リルアミド，２．７％Ｎ，Ｎ’−ビスメチレンアクリル
アミド，　０．１２５　ＭＴｒｉｓ−ＨＣＲ（ｐＨ６．
８）．　０．１％ＳＤＳであった。分藺ゲルは１０％ア
クリルアミド，２．７％Ｎ，Ｎ’−ビスメチレンアクリ
ルアミド，　ＯＪ７５　Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ（ｐＨ
８．８）　，　０．１％ＳＤＳであった．分子量を比較
するために、分子量マーカータンバク質としてリボヌク
レアーゼＡ　（１３，７００），キモトリプシノーゲン
Ａ　＜２５，０００），オボアルブミン（４３，０００
）および牛血清アルブミン（６７，０００）の混合物を
用いた。結果を第６図に示す。なお、第６図の各レーン
の説明は次のとおりである。

レーン　　　　　　　　試　　　料 １　　　ｐＥＸＰ７をもつ犬腸菌菌体 ２　　　ｐＫ１４をもつ大腸菌菌体（ＩＰＴＧで話導し
ていないもの） ３　　　ｐＫＬ４をもつ大腸菌菌体（Ｉ　ＰＴＧで誘導
したもの） ４　　　ｐＫＬ４をもつ大陽菌菌体の超音波破砕抽出物
（Ｉ　ＰＴＧで話導、加熱処理せず）５　　　ｐＫＬ４
をもつ大腸菌菌体の超音波破砕後、７０℃で３０分加熱
処理した抽出物 （Ｉ　ＰＴＧで誘導） ６　　レーン５と同様、ただし８０℃、３０分加熱処理 ７　　レーン５と同様なサンプルを逆相系ＨＰＨＣで精
製し、活性を確認した画分 ｍは分子量マーカーを示す。

第６図から明らかなように、ｐＫＬ４をＩ　ＰＴＧで誘
導した大腸菌は約４３０００の分子量のところにＡＰ−
Ｔと考えられる新しいタンパクが出現していた．これは
加熱しても変性せずに上澄液に残ることが明らかとなっ
た。またＨＰＬＣで精製したこの画分は耐熱性のアミノ
ベブチダーゼ活性をもつことが確認された．このように
ｐＫＬ４をもった大腸菌でＡＰ−Ｔを生産した場合、菌
体破砕物を加熱し、遠心するだけで、極めて効率良＜Ａ
Ｐ一丁を精製できることが明らかとなフた。

［発明の効果］ 本発明によって、サーマス属に属するサーマス・アクア
ティカスＹＴ−１が有する極めて耐熱性の強いアミノペ
プチダーゼをコードする遺伝子の配列及びそのアミノ酸
配列が明らかとなった．また、遺伝子工学的に耐熱性ア
ミノベブチダーゼを大量に生産する製造方法を提供した
．本発明により、サーマス属の菌体から精製するよりも
極めて経済的に天然のものと同等の耐熱性を有するアミ
ノベプチダーゼを生産することが可能となった．

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の耐熱性アミノペプチダーゼであるＡ
Ｐ−ＴのＮ一末端部分のアミノ酸配列と、合成したオリ
ゴヌクレオチドプローブの配列を示す。 第２図は、プラスミドｐＡＴ１５ＡとｐＡＴ１５Ｇの制
限酵素地図を示す。ＡＰ−Ｔ遺伝子の位置は黒い矢印で
示してある。 第３図は、ＡＰ−Ｔ遺伝子の塩基配列決定のための戦略
を示す。白ヌキの矢印はＡＰ−Ｔ遺伝子を示す。 黒丸のついた矢印はユニバーサルシークエンシングプラ
イマーを用いて塩基配列を決定した方向と領域を示す。 白丸のついた矢印は合成オリゴヌクレオチドをシークエ
ンシングブライマーとして用いて塩基配列を決定した領
域と方向を示す．ＧＴＧは開始コドン，ＴＡＡは終止コ
ドンを示す，　Ｈｉは旧ｎｄｌｌｌ，　　Ｓｐは　ｓｐ
ｈｒ　．　Ｋｐは　κｐｎｌ．ＸｈはＸｈｏＩ　，　Ｓ
ｍはＳｍａ　ｉサイトを示す。 第４−１図〜第４−２図は、塩基配列を決定した全塩基
配列と、＾Ｐ−Ｔをコードする部分の推定されるアミノ
酸配列を示す。アミノ酸配列部分の下線は、精製ＡＰ−
Ｔの化学的分析でも確認された配列を示す。＊＊＊は終
止コドンを示す。一一はターミネーターと考えられるイ
ンバーテッド　リピートを示す。 第５図は、ＡＰ−Ｔを大腸菌で大量発現するためのプラ
スミドｐＫＬ４の構築方法を示す。ＰｔａｃはｐＫκ２
２３−３由来のｔａｃプロモーター，　ｒｒｎＢＴｔＴ
ｚはｐＫκ２２３−３由来のターミネーターを示す．Ｈ
ｉはＨｉｎｄｌｌｌ　，　Ｓｐは　Ｓｐｈｌ　，　Ｓｍ
は　Ｓｍａｌ，Ｋｐは　κｐｎＩ，Ｘｈは　Ｘｈｏｌ　
，　　ＥｃはＥｃｏＲＩ　，　　ＢａはＤａｍ｝ＩＩ　
，　　ＳａはＳａｃｌ　．　Ｐｓは　ＰｓｔＩサイトを
示す。Ｓ／Ｄはｔａｃプロモーターのシャイン　ダルガ
口　（ＳｈｉｎｅＤａｌｇａｒｏ）配列を示す． 第６図は、ｐＫＬ４をもつ大腸菌菌体抽出液のＳＤＳ−
ポリアクリルアミド電気泳動の結果を示す。 各レーンの試料は次のとおりである． レーン 試　　　　　料 ｐＥＸＰ７をもつ大腸菌 ｐＫＬ４をもつ大膓菌菌体（Ｉ　ＰＴＧで誘導していな
いもの） ｐＫＬ４をもつ大腸菌菌体（Ｉ　ＰＴＧ”Ｃ銹導したも
の） ｐＫＬ４をもつ大腸菌菌体の超音波破砕抽出物（Ｉ　Ｐ
ＴＯで誘導、加熱処理せず）ｐＫＬ４をもつ大腸菌菌体
の超音波破砕後、７０℃で３０分加熱処理した抽出物 （Ｉ　ＰＴＧで話導） レーン５と同様、ただし８０℃で３０分加熱処理 レーン５と同様なサンプルを逆相系ＨＰＬＣで精製し、
活性を確認した画分 分子量マーカー 特許出願人　よつ葉乳業株式会社 代　理　人　　弁理士　久保田　藤　郎第４−１図 第４−２図 ■ 手続補正書動劃 平成１年６月７　日

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）高度好熱性細菌サーマス属由来の耐熱性を有する
   アミノペプチダーゼをコードしているＤＮＡ配列。
2. （２）ＤＮＡが下記のアミノ酸配列またはそれと実質的
   に同一の機能を有するアミノ酸配列をコードするもので
   ある請求項１記載のＤＮＡ配列。 【遺伝子配列があります。】
3. （３）ＤＮＡが下記の塩基配列中、第１７７番目から第
   １４００番目に相当する塩基配列またはそれと実質的に
   同一の機能をもつ塩基配列を有するものである請求項１
   記載のＤＮＡ配列。 【遺伝子配列があります。】
4. （４）請求項３記載のＤＮＡのうち開始コドンであるＧ
   ＴＧ（請求項３記載の塩基配列のうち１７７番目から１
   ７９番目に対応）をＡＴＧに変更した塩基配列を有する
   請求項３記載のＤＮＡ配列。
5. （５）ＤＮＡが請求項２記載のアミノ酸配列またはそれ
   と実質的に同一の機能を有するアミノ酸配列をコードし
   、かつその上流にプロモーター、その下流にターミネー
   ターを有する請求項１記載のＤＮＡ配列。
6. （６）請求項２記載のＤＮＡ配列を含むプラスミド。
7. （７）請求項３記載のＤＮＡ配列を含むプラスミド。
8. （８）請求項４記載のＤＮＡ配列を含むプラスミド。