DE69330343T2

DE69330343T2 - Verfahren zur herstellung von d-alpha-aminosäuren

Info

Publication number: DE69330343T2
Application number: DE69330343T
Authority: DE
Inventors: Yasuhiro Ikenaka; Hirokazu Nanba; Sakae Shimizu; Satomi Takahashi; Masayuki Takano; Kazuyoshi Yajima; Hideaki Yamada; Yukio Yamada
Original assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1992-10-05
Filing date: 1993-10-01
Publication date: 2002-05-02
Anticipated expiration: 2013-10-02
Also published as: SG55164A1; EP0628637A1; ES2159527T3; KR100293585B1; US5863785A; EP0628637A4; US5902736A; CN1221793A; DE69330343D1; KR100328111B1; CN1102672A; CN1048524C; EP0628637B1; WO1994008030A1; CN1187444C

Description

GEBIET DER ERFINDUNG:

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer D-α-Aminosäure, worin eine D-N-Carbamyl-α-aminosäure gemäss der allgemeinen. Formel:
worin R bedeutet: Phenyl, Hydroxy-substituiertes Phenyl, substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl, bevorzugt mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, oder Thienyl, durch ein Enzym mit der Fähigkeit, die Carbamoylgruppe zu eliminieren (nachstehend als "Decarbamylase" bezeichnet) in eine D-α- Aminosäure gemäss der Formel:
worin R wie oben definiert ist, umgewandelt wird.
Diese optisch aktiven D-α-Aminosäuren sind als pharmazeutische Zwischenprodukte wichtig. Insbesondere D-Phenylglycin und D-(4-Hydoxyphenyl)glycin (nachstehend als "D-HPG" bezeichnet) sind für die Herstellung semisynthetischen Penicillins und semisynthetischen Cephalosporins nützlich.

STAND DER TECHNIK:

Herstellung von D-α-Aminosäuren durch Eliminierung von Carbamylgruppen aus entsprechenden D-N-Carbamyl-α- aminosäuren war bekannt. Die Eliminierung wurde chemisch (JP-PS 4707/1983) oder durch enzymatische Reaktionen von Mikroorganismen (JP-PSen 18793/1982, 20520/1988 und 48758/1989) durchgeführt.
JP-B-57-18793 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von D-α-Aminosäuren unter Verwendung von Mikroorganismen. Diese Mikroorganismen besitzen die Fähigkeit, N-Carbamoyl- α-aminosäuren in D-α-Aminosäuren umzuwandeln und gehören zum Genus Pseudomonas, Arthrobacter, Alicagenes, Achromobacter, Maraxella oder Paracoccus.
In EP-A-0 610 517 wird eine Decarbamylase beschrieben, die künstlich durch genetische Rekombinationsverfahren hergestellt wird. Die offenbarte DNA codiert eine Decarbamylase, die eine verbesserte Thermostabilität besitzt. Diese verbesserte Thermostabilität ist das Resultat des Ersetzens mindestens einer Base eines DNA- Fragments, das ein Decarbamylaseprotein codiert, was zu einer Mikrobe mit einer anderen Base führt, und dem resultierenden Ersetzen mindestens einer der entsprechenden Aminosäuren. Agrobacterium radiobacter KNK712 wurde zur Herstellung eines Derivats mit zwei oder drei Aminosäuremutationen in drei Aminosäuren, die eine Beziehung zur Thermostabilität besitzen, verwendet.
In WO92/10579 ist ein Gen offenbart, welches zu D-N- Carbamoyl-α-aminosäureamidohydrolse gehört, die D-N- Carbamoyl-α-aminosäure in eine D-α-Aminosäure umwandelt. Sie beschreibt weiter ein rekombinantes Plasmid, das das Gen umfasst, und einen Mikroorganismus, der zum Genus Escherichia, Pseudomonas, Flavobacterium, Bacillus, Serratia, Corynebacterium oder Brevibacterium zählt, der durch Integration des rekombinanten Plasmids transformiert wird. Der Mikroorganismus kann in einem Verfahren zur Herstellung von D-α-Aminosäuren durch die Wirkung der Amidohydrolase verwendet werden.
Die meisten dieser mikrobiellen Enzyme besitzen optimale pH-Werte im neutralen Bereich. Jedoch wird in dem vorhergehenden Schritt, worin die N-Carbamyl-D-αaminosäuren durch selektive Hydrolyse der D-Form der entsprechenden DL-5-substituierten Hydantoine hergestellt werden, Hydantoinhydrolase mit einem optimalen pH von 8 bis 9 verwendet. Deshalb muss die anschliessende Umwandlung der N-Carbamyl-D-α-Aminosäuren durch Decarbamylase in einem unterschiedlichen Reaktionsmedium als in dem vorangehenden Schritt durchgeführt werden.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG:

Die Erfinder haben Mikroorganismen gesucht, die enzymatisch Carbamylgruppen aus D-N-Carbamyl-α-aminosäuren zur Bildung von D-α-Aminosäuren eliminieren (Decarbamylierung), hauptsächlich unter den Genera, von denen nicht bekannt ist, dass sie Decarbamylase besitzen. Es wurde nun gefunden, dass die Bakterien der Genera Comamonas, Blastobacter, Sporosarcina, Rhizobium und Bradyrhizobium eine Decarbamylaseaktivität besitzen.
Entsprechend betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer D-α-Aminosäure, worin eine N-Carbamyl-D-α-aminosäure gemäss der allgemeinen Formel:
worin R bedeutet: Phenyl, Hydroxy-substituiertes Phenyl, substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl, oder Thienyl, durch ein mikrobielles Enzym in einem wässrigen Medium in eine D-α-Aminosäure gemäss der allgemeinen Formel:
worin R das gleiche wie oben ist, umgewandelt wird, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Enzym um Decarbamylase handelt, die produziert wird durch einen Mikroorganismus des Genus Comamonas, Blastobacter, Sporosarcina, Rhizobium oder Bradyrhizobium.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN:

Fig. 1 ist ein Graph, der die Resultate der Decarbamylierung bei 50ºC und 30ºC neu gescreenter Stämme zeigt;
Fig. 2 ist ein Graph, der die Auswirkung verschiedener Additive zum Kulturmedium von Comamonas sp. E 222 C auf seine Decarbamylase-Produktivität zeigt;
Fig. 3 ist das Resultat von SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese von gereinigter Comamonas sp. E 222 C-Decarbamylase;
Fig. 4 ist das Resultat der Gelfiltration der · gereinigten Comamonas sp. E 222 C-Decarbamylase durch eine Sephadex G-150-Säule;
Fig. 5 ist ein Graph, der die Auswirkung des pH auf die Aktivität der gereinigten Comamonas sp. E 222 C- Decarbamylase zeigt;
Fig. 6 ist ein Graph, der die Wirkung der Temperatur auf die Aktivität der gereinigten Comamonas sp. E 222 C-Decarbamylase zeigt;
Fig. 7 ist ein Graph, der die Wirkung verschiedener Additive zum Kulturmedium von Blastobacter sp. A 17 p-4 auf seine Decarbamylaseproduktivität zeigt;
Fig. 8 ist ein Graph, der die Wirkung verschiedener Metallionen, die zu dem Kulturmedium von Blastobacter sp. A 17 p-4 gegeben werden, auf seine Decarbamylase-Produktivität zeigt;
Fig. 9 ist das Resultat der SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese von gereinigtem Blastobacter sp. A 17 p-4;
Fig. 10 ist das Resultat der Gelfiltration der gereinigten Blastobacter sp. A 17 p-4- Decarbamylase durch eine Sephadex G-150-Säule;
Fig. 11 ist ein Graph, der die Wirkung des pH auf die Aktivität der gereinigten Blastobacter sp. A 17 p-4-Decarbamylase zeigt;
Fig. 12 ist ein Graph, der die Wirkung der Temperatur auf die Aktivität der gereinigten Blastobacter sp. A 17 p-4-Decarbamylase zeigt.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG:

Gemäss der Erfindung können sowohl D-Isomer-spezifische Decarbamylase als auch unspezifische Decarbamylase verwendet werden. Ein Enzym, das streng stereoselektiv auf D-N-Carbamyl-α-aminosäuren ist, wird oft als D-N-Carbamyl- α-aminosäureamidhydrolase bezeichnet.
Unter den erfindungsgemässen Mikroorganismen befinden sich Stämme mit einer besonders hohen Decarbamylaseaktivität, wie z. B. Comamonas sp. E 222 C (FERM BP Nr. 4411, National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi, 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305, Japan, 18. September 1992), Comamonas sp. E 206a, Comamonas sp. E 217a, Blastobacter sp. NA 88-b, Blastobacter sp. A 17 p-4 (FERM BP Nr. 4410, National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 18. September 1992), Sporosarcina sp. NCA 28-b (FERM BP Nr. 4408, National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 24. September 1992), Rhizobium sp. KNK 1415 (FERM BP Nr. 4419, National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 22. September 1993) und Bradyrhizobium japonicum IFO 14783, Bradyrhizobium sp. IFO 15003.
Typische Beispiele der Stämme Comamonas sp. 4 222 C, Blastobacter sp. A 17 p-4, Sporosarcina sp. NCA 28-b und Rhizobium sp. KNK 1415 werden mikrobiologisch wie folgt gekennzeichnet:
Comamonas sp. E 222 C

(a) Morphologie:

Bacillus (gekrümmt), Gram-variabel
Spore: - - -
Kolonie: lederfarben, semitransluzent, rund, regelmässig, vollständig, glänzend, wenig konvex, glatt, Durchmesser 1 mm (48 h)
Wachstum (48 h) bei: 37ºC +
41ºC -
45ºC -

(b) Physiologische Aktivitäten:

Catalase +
Oxidase -
Glucosefermentation -
NO&sub3;-Reduktion -
Indolbildung -
Säurebildung aus Glucose -
Arginindehydrolase -
Urease -
Aesculinhydrolyse -
Gelatinhydrolyse -
β-Galactosidase -
Cytochromoxidase + (schwach)

(c) Assimilation:

Glucose -
Arabinose -
Mannose -
Mannit -
N-Acetylglucosamin -
Maltose -
Gluconsäure +
Capronsäure +
Adipinsäure -
Äpfelsäure +
Zitronensäure +
Phenylacetat. +

Blastobacter sp. A 17 p-4

(a) Morphologie:

Bacillus (oval), Gram-negativ
Spore: -
Kolonie: weiss, semitransluzent, rund, regelmässig, vollständig, glänzend, wenig konvex, glatt, mucoidbildend; Durchmesser 1,0 bis 1,5 mm (48 h)
Wachstum (48 h) bei: 37ºC +
41ºC -
45ºC -

(b) Physiologische Aktivitäten:

Catalase +
Oxidase + (schwach)
Glucosefermentation -
NO&sub3;-Reduktion -
Indolbildung -
Säurebildung aus Glucose -
Arginindehydrolase -
Urease +
Aesculinhydrolyse +
Gelatinhydrolyse -
β-Galactosidase +
Cytochromoxidase +

(c) Assimilation:

Glucose +
Arabinose +
Mannose +
Mannit +
N-Acetylglucosamin +
Maltose +
Gluconsäure -
Capronsäure
Adipinsäure -
Äpfelsäure -
Zitronensäure -
Phenylacetat -

Sporosarcina sp. NCA 28-b

(a) Morphologie:

Coccus, Gram-variabel
Spore: +
Mobilität: -
Kolonie: rund, regelmässig, vollständig, cremefarben bis weiss, semitransluzent; Durchmesser < 0,5 mm (48 h)
Wachstum bei: 37ºC -
45ºC -

(b) Physiologische Aktivitäten:

Catalane +
Oxidase +
Glucosefermentation -

Rhizobium sp. KNK-1415 (FERM BP-4419)

(a) Morphologie:

Bacillus (kurz), Gram-negativ
Spore: -
Flagellum: polar oder peritrich
Kolonie: gebrochenweiss, opak, vollständig, regelmässig, glänzend, wenig konvex, mucoidbildend, Durchmesser 5 mm (5 Tage)
Wachstum bei: 30ºC +
37ºC (+)

(b) Physiologische Aktivitäten:

Catalane +
Oxidase +
Glucosefermentation -
NO&sub3;-Reduktion +
Indolbildung -
Säurebildung aus Glucose -
Arginindehydrolase -
Urease +
Aesculinhydrolyse +
Gelatinhydrolyse -
β-Galactosidase +
Cytochromoxidase +
3-Ketolactosebildung -
H&sub2;S-Bildung

(c) Assimilation:

Glucose +
Arabinose +
Mannose +
Mannit +
N-Acetylglucosamin +
Maltose +
Gluconsäure -
Capronsäure -
Adipinsäure -
Äpfelsäure +
Zitronensäure
Phenylacetat -
GC-Anteil: 63,4%
Chinonanalyse: Q-10 95,7%
Q-9 3,3 St
Q-11 0,6%
Q-8 0,4 %

Mikrobielle Fettsäureanalyse:

(Gesamtfettsäuren)

KOMPONENTE: FLÄCHE (%):

3-OH C14 : 0 4,6
C16 : 1 5,9
C16 : 0 14,0
3-OH C16 : 0 0,1
C18 : 1 70,7
C18 : 0 3,3
unbekannt 1,4

(3-OH-Fettsäuren)

KOMPONENTE: FLÄCHE (%):

3-OH C14 : 0 88,8
3-OH C16 : 0 6,6
3-OH C18 : 0 4,6

(2-OH-Fettsäuren)

nicht gefunden
Die Enzymdecarbamylase kann durch Kultivieren der Mikroorganismen üblicherweise in einem flüssigen Medium auf eine übliche Weise erhalten werden. Jedoch kann auch ein festes Medium verwendet werden. Das Medium enthält üblicherweise assimilierbare Kohlenstoff-und Stickstoffquellen sowie anorganische Salze, die für das Wachstum eines jeden Mikroorganismus essentiell sind. Die Decarbamylase-Produktivität der Bakterien kann bevorzugt verbessert werden durch Zugabe zum Kulturmedium einer kleinen Menge einer Substanz oder eines Promotors, wie einer α-Aminosäure, z. B. D-p-Hydroxyphenylglycin oder D-Phenylglycin; einer N-Carbamyl-α-aminosäure, z. B. N-Carbamyl-DL-methionin oder N-Carbamyl-D-phenylalanin; einem substituierten Hydantoin, z. B. DL-5-p- Hydroxyphenylhydantoin oder DL-5-Phenylhydantoin; einem Pyrimidinmetaboliten, z. B. Uracil, Dihydrouracil oder β-Ureidopropionsäure; eines Metallions, z. B. Fe²&spplus;, Fe³&spplus;, Be²&spplus;, Co²&spplus;, Al³&spplus;, Li&spplus;, Mn²&spplus;, Mg²&spplus; oder Cs&spplus;; oder Harnstoff. Diese Additive können im Kulturmedium in einer Konzentration von 0,1 bis 10 mM für die Metallionen und von 0,01 bis 1 Gew.-% für die anderen Substrate vorhanden sein.
Die Kultivierung kann bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 85ºC und bei einem pH-Wert im Bereich von 4 bis 11 durchgeführt werden. Belüftung und Rühren können das Wachstum von Mikroorganismen fördern.
Nach der Kultivierung können das Kulturmedium oder die daraus gesammelten Mikroorganismen, als solche oder weiterverarbeitet, als eine Enzymquelle zur Decarbamylierung der D-N-Carbamyl-α-aminosäuren bereitgestellt werden. Lebendige oder getrocknete (z. B. lyophilisierte) Bakterien können verwendet werden. Sie können auch nach Homogenisierung, Extraktion, Behandlung mit einem Tensid oder Beschallung bereitgestellt werden. Ausserdem können reine oder unbehandelte Enzyme, die aus dem Bakterienhomogenat, Extrakt usw. zurückgewonnen werden, verwendet werden. Das reine oder unbehandelte Enzym kann z. B. gemäss der Offenbarung von PCT/JP91/01696 immobilisiert werden.
Im Prinzip sind Enzyme, die durch genmanipulierte Mikroorganismen hergestellt werden, genauso nützlich wie die von den ursprünglichen Bakterien.
Die Decarbamylierungsreaktion wird in einem wässrigen Medium bei einem pH-Wert im Bereich von 6 bis 11, bevorzugt 7 bis 9,5, durchgeführt. Manche Enzyme besitzen optimale pH-Werte von 8 bis 9. Die Decarbamylierung findet üblicherweise bei einer Temperatur von 20 bis 85ºC statt, wobei die Temperatur für das bestimmte Enzym optimal bestimmt wird.
In dem Verfahren sind die Substrate für die Decarbamylase: N-Carbamyl-D-α-aminosäuren, wie D-N-Carbamylalanin, D-N- Carbamylmethionin, D-N-Carbamylvalin, D-N-Carbamylleucin, D-N-Carbamylphenylglycin, D-N-Carbamyl-(4- hydroxyphenyl)glycin, D-N-Carbamyl-(2-thienyl)glycin und D-N-Carbamylphenylalanin. Die Gruppe R in den obigen Formeln kann z. B. Phenyl-, Indolyl-, Alkylthio-, Hydroxyl-, Amino- oder Carboxyl-substituiertes Alkyl sein.
D-α-Aminosäuren, die Decarbamylierungsprodukte, können durch übliche Verfahren, wie Konzentration, Neutralisation und Ionenaustauscherchromatografie zurückgewonnen werden. Um eine relativ hydrophobe D-α-Aminosäure, wie D-Phenylglycin, D- (4-Hydroxyphenyl)glycin, D-Leucin oder D-Phenylalanin, abzutrennen, kann die Decarbamylierungs- Reaktionsmischung angesäuert oder alkalisiert werden, um Verunreinigungen auszufällen, und dann auf eine übliche Weise, z. B. durch Konzentration und Neutralisation, um die Aminosäuren auszufällen, behandelt werden. Abtrennen relativ hydrophiler Produkte, wie D-Thienylglycin, D-Serin und D-Alanin, kann durch Ionenaustauschchromatografie erreicht werden. Das Eluat, z. B. mit einer Ammoniaklösung, wird dann neutralisiert und eingeengt.
Die N-Carbamyl-D-aminosäuren als die Substrate für Carbamylase, können aus 5-substituiertem Hydantoin durch eine enzymatische Reaktion erhalten werden. Als Enzymquelle für diese Reaktion können Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen, die davon gesammelten Mikroorganismen (als solche oder weiterverarbeitet) oder daraus extrahierte Enzyme verwendet werden. Diese Verfahren sind z. B. in den JP-OSen 44690/1978, 69884/1978, 91189/1978, 133688/1978, 84086/1979 und 7001/1980 offenbart.
Die D-Carbamyl-α-aminosäuren werden zu den entsprechenden optisch aktiven D-α-Aminosäuren durch das erfindungsgemässe Verfahren umgewandelt.

BEISPIELE

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.

BEISPIEL 1

Einzelne Proben (genommen von verschiedenen Orten in Japan) wurden in 2 ml eines Mediums A (1 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 1 g/l K&sub2;HPO&sub4;, 0,3 g/l MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 0,1 g/l Hefeextrakt, 1 g/2 NH&sub4;Cl, 1,5 g/l Kohlenstoffquelle wie unten angegeben; pH 7,0) oder eines Mediums B (1 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 1 g/l K&sub2;HPO&sub4;, 0,3 g/l MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 0,5 g/l Glucose, 0,1 g/l Hefeextrakt, 1,5 g/l Stickstoffquelle wie unten angegeben; pH 7,0) plaziert und bei 28ºC aerob kultiviert. Die Mikroorganismen wurden durch Subkulturen im gleichen Medium vervielfältigt. Dann wurde das Kulturmedium auf eine Agarplatte (enthaltend 2% Agar im Medium A oder B) gesprüht und 2 bis 6 Tage bei 28ºC inkubiert, um die Stämme zu isolieren.

Kohlenstoff- und Stickstoffquellen:

N-Carbamyl-D-p-hydroxyphenylglycin (C-D-HPG)
N-Carbamyl-D-phenylglycin (C-D-PG)
N-Carbamyl-D-alanin (C-D-Ala)
DL-5-Methylhydantoin (DL-Ala-hyd)
DL-5-Phenylhydantoin (DL-PG-hyd)
DL-5-p-Hydroxyphenylhydantoin (DL-HPG-hyd)
Citrullin
Phenylharnstoff
n-Butylcarbamat
Die isolierten Stämme wurden in 100 ul einer Substratlösung (35 mM C-D-HPG, 200 mM Kaliumphosphat; pH 7,0) suspendiert und 1 bis 3 Tage bei 28ºC inkubiert. Dann wurde eine Probe der Suspension auf die Carbamyl-D- HPG und D-HPG-Gehalte mit DSC auf einer Merck 60 F&sub2;&sub5;&sub4;®- Platte analysiert. Die Probe wurde mit Butanol/Essigsäure/Wasser 3 : 3 : 1 (V/V/V) entwickelt. Die Aminosäuren wurden mit einer UV-Lampe (254 nm) oder durch Sprühen von p-(Dimethylamino)zimtaldehyd und Ninhydrin detektiert. Es wurde gefunden, dass 1868 Stämme die verwendeten Kohlenstoff- und Stickstoffquellen assimilieren konnten. Unter diesen produzierten 37 Stämme D-HPG, wovon 16 Stämme hohe D-HPG-Ausbeuten ergaben (≥ 2 mM).

BEISPIEL 2

Die 16 Decarbamylase-produzierenden Stämme wurden einem weiteren Screening unterworfen. Für diesen Zweck wurden sie in 1 ml eines Mediums C (1,6 g/l C-D-HPG, 1 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 1 g/l K&sub2;HPO&sub4;, 0,3 g/l MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 3 g/l Hefeextrakt, 3 g/l Fleischextrakt, 10 g/l Glycerin, 2 g/l Polypepton; pH 7,0) 3 Tage bei 28ºC kultiviert. Dann wurde 1 ml des Kulturmediums zentrifugiert, um den Mikroorganismus zu sammeln, der in 100 ul der gleichen Substratlösung wie sie im Beispiel verwendet wurde; suspendiert wurde. Nach 24 Stunden bei 30ºC oder 50ºC wurde die Suspension auf den D-HPG-Gehalt analysiert. ·
Eine Probe der Suspension wurde HPLC (HPLC = Hochdruck- Flüssigchromatografie) mit einer Cosmosil 5 C 18®-Säule (φ 4,6 · 250 mm, Nacarai Tesque) unterworfen. D-HPG wurde mit Wasser/Acetonitril/Phosphorsäure 95 : 5 : 0,01 (V/V/V) eluiert. Die D-HPG-Konzentration wurde aus der Extinktion bei 254 nm bestimmt. Die Resultate sind in Fig. 1 gezeigt.
Unter den 16 Stämmen waren die 3 Stämme E 206a, E 222 C und E 215, welche auf C-D-Ala als alleiniger Kohlenstoffquelle wachsen gelassen wurden, bei 30ºC sehr aktiv. Die D-HPG-Ausbeute mit E 222 C betrug 30,8 mM bei 30ºC und lediglich 3,5 mM bei 50ºC. Drei andere Stämme A 17 p-1, A 17 p-3 und A 17 p-4, die auf C-D-HPG als alleiniger Kohlehstoffquelle kultiviert wurden, waren bei 50ºC sehr aktiv. Die D-HPG-Ausbeute von A 17 p-4 belief sich auf 28,8 mM bei 50ºC, und auf lediglich 2,5 mM bei 30ºC.

BEISPIEL 3

Substratspezifität von Decarbamylase:

Für die Bestimmung der Substratspezifität von Decarbamylase von Comamonas sp. E 222c und Blastobacter sp. A 17 p-4 wurden diese Stämme bei 28ºC in dem Medium C (wie in Beispiel 2 beschrieben) 1 Tag (E 222 C) und 7 Tage (A 17 p-4) kultiviert. 3 ml des Kulturmediums wurden zentrifugiert, um den Mikroorganismus abzutrennen, der in 300 ul einer Substratlösung [200 mM Kaliumphosphat, 1% (G/V) eines Substrats wie unten angegeben] suspendiert und 24 Stunden bei 30ºC (E 222 C) oder 50ºC (A 17 p-4) inkubiert würde.
Wie in Tabelle 1 gezeigt, besassen beide Mikroorganismen eine grosse Aktivität, um die N-Carbamyl-substituierten, aliphatischen und aromatischen D-Aminosäuren zu hydrolysieren. Jedoch würden die N-Carbamylderivate der Aminosäuren mit polaren Gruppen weniger hydrolysiert. Comamonas sp. E 222 C konnte β-Ureidopropionsäure hydrolysieren. Es zeigte sich auch, dass Blastobacter sp. A 17 p-4 eine Hydantoinaseaktivität besass. TABELLE 1 Substratspezifität neuer Decarbamylase
Umwandlung in Aminosäuren:
- : 0%
+ : < 10
++ : < 50%
+++ : < 80%
++++ : 100%

BEISPIEL 4

Promotoren für die Herstellung von Comamonas sp. E 222 C- Decarbamylase:

Es wurde nach den Substanzen, die die Ausbeute der Decarbamylase von Comamonas sp. E 222 C erhöhen konnten gesucht.
Der Stamm wurde in einem Nährmedium D (1 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 1 g/l K&sub2;HPO&sub4;, 0,3 g/l MgSC&sub4;·7H&sub2;O, 3 g/l Hefeextrakt, 3 g/l Fleischextrakt, 10 g/l Glycerin, 2 g/l Polypepton; pH 7,0) 2 Tage bei 28ºC kultiviert. Das Kulturmedium enthielt zusätzlich eine Substanz, wie in Fig. 2 angeführt, in einer Konzentration von 0,15% (G/V).
1 ml des Kulturmediums wurde zentrifugiert, um den Mikroorganismus zu sammeln, welcher in 100 ul einer Substratlösung (35 mM C-D-HPG, 200 mM Kaliumphosphat; pH 7,0) suspendiert wurde. Nach 24 Stunden bei 30ºC wurde das D-HPG mit HPLC gemäss dem Verfahren von Beispiel 2 quantifiziert. Es wurde gefunden, wie in Fig. 2 gezeigt, dass die Decarbamylase-Produktivität durch Harnstoff, β-Ureidopropionsäure, D-Phenylglycin oder N-Carbamyl-DL- methionin verbessert werden konnte.

BEISPIEL 5

Reinigung von Comamonas sp. E 222 C-Decarbamylase:

Comamonas sp. E 222 C wurde 3 Tage bei 28ºC in Medium D (wie in Beispiel 4 definiert), das 0,15% (G/V) β-Ureidopropionsäure enthielt, kultiviert. Insgesamt 3,6 l des Kulturmediums wurden zentrifugiert, um den Mikroorganismus zu sammeln, der in 100 ml 10 mM Kaliumphosphat (pH 7,0) suspendiert, durch Beschallung homogenisiert und dann zentrifugiert wurde, um den Überstand, enthaltend das Enzym, zu verwenden. Ammoniumsulfat würde zu der Enzymlösung gegeben. Die Präzipitationsfraktion bei einer Ammoniumsulfatkonzentration von 20 bis 40% Sättigung, wurde zentrifugiert, um das Enzym abzutrennen, das in der gleichen Pufferlösung, wie oben verwendet, gelöst wurde.
Dann wurden 177 ml der Enzymlösung zu 10 l des gleichen Puffers 12 Stunden dialysiert, auf eine DEAE-Sephacel®- Säule (DEAE = Diethylaminoethyl) (φ 5 · 15 cm) gegeben, und mit linearem Gradienten 0 bis 1 M NaCl eluiert. Das Eluat wurde auf eine NaCl-Konzentration von 4 M eingestellt, auf eine Phenyl-Sepharose CL-4B®-Säule (φ) 1,5 · 15 cm) gegeben und mit linearem Gradienten 4 bis 0 M NaCl eluiert. Die so erhaltene aktive Fraktion wurde durch Ultrafiltration durch eine YM-10-Membran® (Amicon) konzentriert.
Das Konzentrat (5 ml) wurde mit einer Sephacryl S-200 HR®- Säule (φ 1,8 · 80 cm) mit der gleichen Pufferlösung wie oben verwendet, jedoch zusätzlich enthaltend 0,2 M NaCl, gelfiltriert. Die aktive Fraktion wurde durch Dialyse entsalzt, auf eine Hydroxyapatit-Säule (φ 1,2 · 10 cm) gegeben und mit linearem Gradienten 0 bis 1 M Kaliumphosphat (pH 7,0) eluiert. Das aktive Eluat (8,5 ml) wurde 12 Stunden auf 500 ml 10 M Kaliumphosphat (pH 7,0) dialysiert, auf eine Mono Q HR 5/5®-Säule gegeben und mit linearem Gradienten 0 bis 1,0 M NaCl eluiert. Die so erhaltene aktive Fraktion (1,2 ml) wurde als eine gereinigte Enzymlösung analysiert.
Wie in Tabelle 2 gezeigt, war die spezifische Aktivität der gereinigten Enzymlösung 108 mal so gross wie die des Überstands der homogenisierten Zellsuspension. Die Enzymaktivitäts-Rückgewinnung betrug etwa 2%. 10 mg des gereinigten Enzyms wurden SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese (10% Polyacrylamid) (SDS = Natriumdodecylsulfat) gemäss dem Verfahren von King und Laemmli unterworfen (J. King, U.K. Laemmli, Journal of Molecular Biology, Bd. 62, 165-477 (1971)). Eine einzelne Bande wurde bei etwa Mr 38.000, wie in Fig. 3 gezeigt, detektiert. TABELLE 2 Reinigung von Comamonas sp. E 222 C-Decarbamylase
Zusätzlich wurde das gereinigte Enzym Gelfiltration mit einer Sephadex G-150®-Säule (φ 1,5 · 85 cm) mit 10 mM Kaliumphosphat (pH 7,0), enthaltend 0,2 M NaCl und 0,1 mM Dithiothreitol (DTT) unterworfen. Das Enzym wurde bei etwa Mr 111.000, wie in Fig. 4 gezeigt, eluiert.

BEISPIEL 6

Eigenschaften der Comamonas sp. E 222 C-Decarbamylase:

Optimaler pH und Temperatur der Comamonas sp. E 222 C- Decarbamylase wurden durch Verwendung der Enzymlösung, die in Beispiel 5 erhalten wurde, bestimmt.
Der optimale pH wurde wie folgt bestimmt: Die Enzymlösung wurde mit 10 mM N-Carbamyl-D-phenylalanin kontaktiert, das mit 200 mM Acetat-hydrochlorid (pH 4,2 bis 5,9), Kaliumphosphat (pH 5,0 bis 8,8), Tris-Hydrochlorid (pH 7,6 bis 9,9) oder Glycin-NaOH (pH 8,9 bis 11,1) gepuffert war (Das Volumen der Mischung betrug 500 ul). Nach der Reaktionszeit von 20 Minuten bei 30ºC wurde die Reaktion durch Zugabe von 500 ul Ethanol abgebrochen.
Um das gebildete D-Phenylalanin zu quantifizieren, wurde eine Probe einer Reaktionsmischung zu einer Lösung, enthaltend 200 mM Kaliumphosphat (pH 7,0), 1,5 mM 4-Aminoantipyrin, 2,1 mM Phenol, 2,25 U Peroxidase (erhalten aus Merrettich (Horse-Radish), Calzyme Lab.) und 0,375 Einheiten D-Aminosäureoxidase (Sigma) zu einem Gesamtvolumen von 500 ul gegeben. Nachdem die Mischung 60 Minuten bei 37ºC inkubiert worden war, wurde der Anstieg der Extinktion bei 500 nm gemessen.
Die optimale Temperatur wurde wie folgt bestimmt: Die Enzymlösung wurde mit der gleichen Substratlösung, wie sie oben verwendet wurde (gepuffert mit Kaliumphosphat;
pH 7,0) 20 Minuten bei 10 bis 80ºC kontaktiert. Dann wurde der gebildete Ammoniak mit dem Indophenol-Verfahren quantifiziert [W.T. Bollter et al., Analytical Chemistry, Bd. 33, 592-594 (1961)].
Die Resultate sind in Fig. 5 und Fig. 6 gezeigt. Es wurde gefunden, dass optimaler pH und Temperatur von Comamonas sp. E 222 C-Decarbamylase 8 bis 9 und 40ºC sind.

BEISPIEL 7

Aminosäuresequenz von Comamonas sp. E 222 C-Decarbamylase:

Die Aminosäuresequenz der Proteindecarbamylase wurde durch Verwendung der in Beispiel 5 erhaltenen Enzymlösung bestimmt. Die Enzymlösung wurde mit Centricon 10- Microcentrater® (Amicon) entsalzt und auf einen gepulsten Flüssig-Proteinsequenzierer gegeben. Das Enzym besass die folgende Aminosäuresequenz am aminoterminalen Ende (Arg bei 20 und 26 wurden nicht bestätigt aufgrund undeutlicher Peaks)

BEISPIEL 8

Promotoren für die Herstellung von Blastobacter sp. A 17 p-4-Decarbamylase:

Die Substanzen, die die Ausbeute von Decarbamylase von Blastobacter A 17 p-4 erhöhen konnten, wurden gesucht. Der Stamm wurde 3 Tage bei 28ºC im Medium D (wie in Beispiel 4 definiert), das zusätzlich 0,125% (G/V) einer Substanz, wie in Fig. 7 angeführt, enthielt, kultiviert. Dann wurde D-HPG auf die gleiche Weise wie in Beispiel 4 gebildet, ausser dass die Reaktionstemperatur 40ºC betrug, und mit HPLC quantifiziert. Wie in Fig. 7 gezeigt, erhöhte sich die Decarbamylaseausbeute in Gegenwart von Uracil, Dihydrouracil oder β-Ureidopropionsäure.
Um die Wirkung von Metallionen auf die Enzymproduktivität zu untersuchen, wurde der Stamm 4 Tage bei 98ºC im Medium D, das zusätzlich 0,15% (G/V) Uracil und 2 mM eines Metallions, wie in Fig. 8 angeführt, enthielt, kultiviert. Durch Quantifikation von D-HPG wurde gefunden, dass Ionen, wie Fe²&spplus;, Fe³&spplus;, Li&spplus;, Cs&spplus;, Be²&spplus;, Mg²&spplus;, Mn²&spplus;, Co²&spplus; und Al³&spplus;, die Decarbamylaseausbeute erhöhen.

BEISPIEL 9

Reinigung von Blastobacter sp. A 17 p-4-Decarbamylase:

Blastobacter sp. A 17 p-4 wurde 7 Tage bei 28ºC im Medium D (wie in Beispiel 4 definiert), das zusätzlich 0,15% (G/V) Uracil und 2 mM FeSO&sub4;·7H&sub2;O enthielt, kultiviert. Insgesamt 4,8 l des Kulturmediums wurden zentrifugiert, um den Mikroorganismus abzutrennen, der in 120 ml 10 mM Kaliumphosphat suspendiert, 20 Minuten mit Glaskügelchen (Durchmesser: 0,25 mm; Dyno-Mill KDL®, Schweiz) bei 5ºC homogenisiert und zentrifugiert worden war, um eine ungereinigte Enzymlösung als Überstand zu erhalten. Ammoniumsulfat wurde zu der Enzymlösung gegeben, um eine Präzipitationsfraktion bei einer Ammoniumsulfatkonzentration von 20 bis 40% Sättigung zu erhalten. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation abgetrennt und in der gleichen Pufferlösung wie oben verwendet gelöst.
Dann wurden 41 ml der Enzymlösung 12 Stunden auf 5 t der gleichen Pufferlösung wie oben verwendet, dialysiert, mit einer DEAE-Sephacel®-Säule und einer Phenyl-Sepharose CL-6B®-Säule gereinigt und durch Ultrafiltration auf die gleiche Weise wie in Beispiel 5 konzentriert. Das Konzentrat (3 ml) wurde mit einer Sephadex G-150®-Säule (φ 1,5 · 80 cm) mit der gleichen Pufferlösung wie oben verwendet (zusätzlich enthaltend 0,2 M NaCl) gelfiltriert, mit Dialyse entsalzt und durch das gleiche Verfahren wie in Beispiel 5 mit einer Mono Q HR 5/5 -Säule gereinigt. Die so erhaltene aktive Fraktion (2 ml) wurde als eine gereinigte Enzymlösung analysiert. Wie in Tabelle 3 gezeigt, war die spezifische Aktivität der gereinigten Enzymlösung 37 mal so gross wie die des Überstands der homogenisierten Zellsuspension. Die Enzymaktivitäts- Rückgewinnung betrug 2, 3%. TABELLE 3 Reinigung von Comamonas sp. E 222 C-Decarbamylase
Das gereinigte Enzym wurde SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese unterworfen. Eine einzelne Bande wurde bei etwa Mr 39.000 detektiert; siehe Fig. 9. Ausserdem wurde das gereinigte Enzym mit einer Sephadex G-150®-Säule auf die gleiche Weise wie in Beispiel 5 gelfiltriert. Das Enzym wurde bei etwa Mr 120.000 eluiert; siehe Fig. 10.

BEISPIEL 10

Eigenschaften von Blastobacter sp. A 17 p-4-Decarbamylase:

Optimaler pH und Temperatur von Blastobacter sp. A 17 p-4- Decarbamylase wurden durch Verwendung der in Beispiel 9 erhaltenen Enzymlösung gemäss dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 6 bestimmt. Die Resultate sind in den Fig. 11 und 12 gezeigt. Es zeigte sich, dass optimaler pH und Temperatur von Blastobacter sp. A 17 p-4-Decarbamylase 9 und 50ºC waren.

BEISPIEL 11

Aminosäuresequenz von Blastobacter sp. A 17 p-4- Decarbamylase:

Die Aminosäuresequenz der Proteindecarbamylase wurde durch Verwendung der in Beispiel 9 erhaltenen Enzymlösung mit dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 7 bestimmt. Das Enzym besass die folgende Aminosäuresequenz am aminoterminalen Ende (Arg bei 38 wurde nicht bestätigt aufgrund undeutlichen Peaks):

BEISPIEL 12

Die 7 Stämme der Genera Rhizobium und Bradyrhizobium, wie in Tabelle 4 angegeben, wurden 24 Stunden 30ºC in 1 ml der 805 flüssigen Mediums (Hefeextrakt 1 g/l, Mannit 5 g/l, K&sub2;HPO&sub4; 0,7 g/l, KH&sub2;PO&sub4; 0,1 g/l, MgSO&sub4;·7H&sub2;O 1 g/l, C-D-HPG 1 g/l pH 7,0), enthaltend C-D-HPG oder C-D-Ala in einer Endkonzentration von 1 g/l, kultiviert. Das Kulturmedium wurde zentrifugiert, um den Mikroorganismus abzutrennen, der in 0,5 ml einer Substratlösung (1% C-D-HPG oder C-D-Ala, 0,1 M Kaliumphosphat (pH 7,0), 0,1% Triton X-100) suspendiert wurde. Die Suspension wurde 24 Stunden bei 37ºC inkubiert und mit DSC auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 analysiert. In den Stämmen vom Genus Bradyrhizobium zeigte sich eine Decarbamylisierungsaktivität wie in Tabelle 4 gezeigt.

TABELLE 4

Stamm Decarbamylaseaktivität
Rhizobium loti IFO 14779 ++
Rhizobium meliloti IFO 14782 ++
Rhizobium Fredii IFO 14780 ++
Rhizobium galegae IFO 14965 ++
Rhizobium haukuii IFO 15243 +
Bradyrhizobium japonicum IFO 14783 +
Bradyrhizobium sp. IFO 15003 +

BEISPIEL 13

Einzelne Proben wurden einem weiteren Screening auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 unterworfen. N-Carbamyl-D- leucin (C-D-Leu), N-Carbamyl-D-alanin (C-D-Ala), N-Carbamyl-D-phenylglycin (C-D-PG) oder DL-5- Methylhydantoin (DL-Ala-hyd) wurden als Kohlenstoff- oder Stickstoffquelle verwendet. Unter den Stämmen, die gewachsen wurden, wurden 9 Stämme auf Decarbamylaseaktivität auf C-D-Ala oder C-D-HPG gemäss dem Verfahren von Beispiel 11 untersucht. Die Resultate sind in Tabelle 5 gezeigt. Einige Stämme waren spezifischer auf C-D-HPG als auf C-D-Ala, und die anderen waren spezifischer auf C-D-Ala als auf C-D-HPG. TABELLE 5

BEISPIEL 14

Der Stamm von Rhizobium sp. KNK 1415, der in Beispiel 13 erhalten wurde, wurde 40 Stunden bei 0ºC in 10 l des SE- Mediums (Saccharose 23 g/t, Hefeextrakt 4 g/l, Harnstoff 2 g/l, KH&sub2;PO&sub4; 2 g/l, Na&sub2;HPO&sub4; 2 g/l, MgSO&sub4;·7H&sub2;O 1 g/l, MnCl&sub2;·4H&sub2;O 0,01 g/l; pH 6,5) kultiviert. Das Kulturmedium wurde zentrifugiert, um den Mikroorganismus abzutrennen, der mit 0,9% Kochsalzlösung gewaschen, durch Beschallung homogenisiert und zentrifugiert wurde. Der Überstand wurde mit Protaminsulfat (0,1 mg/mg Protein) zur Enukleierung behandelt und dann zentrifugiert. Der Überstand wurde 30 Minuten auf 50ºC erwärmt und zentrifugiert, um denaturierte Proteine zu entfernen. Zu der Lösung wurde Ammoniumsulfat in einer Konzentration bis 30% Sättigung gegeben. Das Ammoniumsulfat-Präzipitat wurde durch Zentrifugation gesammelt, in 500 ml einer Pufferlösung [20 mM Tris·HCl (pH 7,5), 2 mM DTT] gelöst, mit der gleichen Pufferlösung dialysiert, auf eine DEAE-Cellulose- Säule gegeben und mit einer Lösung [10 mM Natriumphosphat (pH 7,2), 0,15 M NaCl, 1·mM DTT) eluiert. Das Eluat wurde durch Ultrafiltration mit einer YM-10®-Membran (Amicon) konzentriert und mit SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert. Die Enzymdecarbamylase wurde bei etwa 35.000 detektiert.

BEISPIEL 15

Der Teil der Decarbamylasebande des SDS-Polyacrylamidgels aus Beispiel 14 wurde ausgeschnitten, in einer Pufferlösung [50 mM Tris·HCl (pH 7,5), 0,1% SDS, 0,1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 5 mM DTT] homogenisiert und bei Raumtemperatur eluiert. Der Extrakt wurde durch Ultrafiltration eingeengt, auf eine Umkehrphasen-HPLC- Säule (AP-303; YMC) gegeben und mit Gradient Acetonitril eluiert. Die so erhaltene Decarbamylase enthaltende Fraktion wurde auf einen Gasphasen-Protein-Sequenzierer (Applied Biosystems) gegeben. Das Enzym besass die folgende Aminosäuresequenz am aminoterminalen Ende:

WIRKUNG DER ERFINDUNG:

Durch Verwendung neuer erfindungsgemässer Decarbamylase können D-α-Aminosäuren, die wichtige Zwischenprodukte für die Herstellung von Pharmazeutika, wie Antibiotika, sind, effizienter unter üblichen Bedingungen, wie pH 8 bis 9 und 50ºC, hergestellt werden.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer D-α-Aminosäure, worin eine N-Carbamyl-D-α-aminosäure gemäss der allgemeinen Formel:

worin R bedeutet: Phenyl, Hydroxy-substituiertes Phenyl, substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl, oder Thienyl, durch ein mikrobielles Enzym in einem wässrigen Medium in eine D-α-Aminosäure gemäss der allgemeinen Formel:

worin R das gleiche wie oben ist, umgewandelt wird, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Enzym um Decarbamylase handelt, die produziert wird durch einen Mikroorganismus des Genus Comamonas, Blastobacter, Sporosarcina, Rhizobium oder Bradyrhizobium, der natürlich vorkommt, und isoliert wird.

2. Verfahren gemäss Anspruch 1, worin ein Kulturmedium des Mikroorganismus, der Mikroorganismus als solcher oder bearbeitet, ein Homogenat oder Extrakt des Mikroorganismus, das reine oder rohe Enzym, oder eine immobilisierte Form davon als mikrobielle Decarbamylasequelle verwendet werden.

3. Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, worin der Mikroorganismus Comamonas sp. E 222 C (FERM BP Nr. 4411), Blastobacter sp. A 17 p-4 (FERM BP Nr. 4410), Sporosarcina sp. NCA 28-b (FERM BP Nr. 4408), Rhizobium sp. KNK 1415 (FERM BP Nr. 4419), Bradyrhizobium japonicum IFO 14783 oder Bradyrhizobium sp. IFO 15003 ist.

4. Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, worin die verwendete Carbamylase in einem Kulturmedium, das einen Promotor zur Carbamylaseherstellung enthält, hergestellt wurde.

5. Verfahren gemäss Anspruch 4, worin der Promotor ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus D-Aminosäuren, N-Carbamyl-α-aminosäuren, 5-substituierten Hydantoinen, Pyrimidinmetaboliten und Metallionen.

6. Verfahren gemäss Anspruch 4, worin der Mikroorganismus ein Stamm des Genus Comamonas und der Promotor Harnstoff, β-Ureidopropionsäure, D-Phenylglycin oder N-Carbamyl-DL-methionin ist.

7. Verfahren gemäss Anspruch 4, worin der Mikroorganismus ein Stamm des Genus Blastobacter ist und der Promotor Uracil, Dihydrouracil, β-Ureidopropionsäure, Li&spplus;, Cs&spplus;, Be&spplus;, Mg²&spplus;, Mn²&spplus;, Fe²&spplus;, Fe³&spplus;, Co²&spplus; oder Al³&spplus; ist.

8. Verfahren gemäss Anspruch 1, worin die Carbamylase einen optimalen pH-Wert im Bereich von 8 bis 9 hat und das wässrige Medium zwischen pH 7,5 und 9,5 gehalten wird.

9. Decarbamylase, hergestellt durch einen Mikroorganismus, der zum Genus Comamonas sp. E 222 C (FERM BP 4411) mit der aminoterminalen Sequenz

gehört.

10. Decarbamylase, hergestellt durch einen Mikroorganismus, der zum Genus Blastobacter sp. A 17 p-4 (FERM BP 4410) mit der aminoterminalen Sequenz

gehört.