DE69531725T2

DE69531725T2 - Verfahren zur herstellung von d-aminosäure durch eine zusammengesetzte immobilisierte enzymenverbindung

Info

Publication number: DE69531725T2
Application number: DE69531725T
Authority: DE
Inventors: Hirokazu Kakogawa-shi NANBA; Yukio Kakogawa-shi YAMADA; Kazuyoshi Akashi-shi YAJIMA; Masayuki Kakogawa-shi TAKANO; Yasuhiro Akashi-shi IKENAKA; Satomi Kobe-shi TAKAHASHI; Takchisa Kobe-shi OHASHI
Original assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1994-06-24
Filing date: 1995-06-23
Publication date: 2004-07-08
Anticipated expiration: 2015-06-24
Also published as: DE69531725D1; CN1129957A; KR960704058A; ES2206512T3; EP0725142A1; KR100396536B1; EP0725142B1; WO1996000296A1; CN1088473C; JP3996183B2; EP0725142A4

Description

Erfindungsgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein zusammengesetztes immobilisiertes Enzympräparat und ein Verfahren zum Herstellen von D-Aminosäuren unter Verwendung dieses Präparats. Insbesondere ist das zusammengesetzte immobilisierte Enzympräparat der vorliegenden Erfindung nützlich zur Herstellung von D-α-Aminosäuren, welche Zwischenprodukte zur Herstellung von Antibiotika sind, wie beispielsweise D-(p-Hydroxyphenyl)glycin, das zur Herstellung des Antibiotikums Amoxycillin und ähnlichem verwendet werden soll.
Hintergründe der Erfindung
Optisch aktive D-Aminosäuren sind wichtige Verbindungen als Zwischenverbindungen für Medikamente, und es war bekannt, dass sie in effizienter Weise durch das Kombinieren einer asymmetrischen Hydrolysereaktion von 5-substituierten Hydantoinen in die entsprechenden D-N-Carbamyl-α-aminosäuren mit Enzymen, Hydantoinasen (nachfolgend manchmal als "Hase" abgekürzt) (GB-A-2 042 531 und JP-B 62-30785) und eine Umwandlungsreaktion der dadurch erhaltenen D-N-Carbamyl-α-aminosäuren in die entsprechenden D-α-Aminosäuren mit Enzymen, den D-N-Carbamyl-α-aminosäureamidohydrolasen (nachfolgend manchmal als "Decarbamylase" oder "DCase" abgekürzt) (PCT/JP91/0696: WO 92/10579) hergestellt werden können.
Außerdem offenbaren EP-A-0261836 (JP-A-63-185382), WO 92/22643 und ähnliche, dass entsprechende Reaktionen in effizienterer Weise durch Verwenden dieser Enzyme in Form sogenannter immobilisierter Enzyme durchgeführt werden können, wobei diese auf Trägern wie beispielsweise Ionenaustauschharzen und ähnlichen immobilisiert sind.
Es ist jedoch eine Zweischrittreaktion zum Durchführen dieser Reaktionen benutzt worden, da die optimalen und stabilen pH-Werte beider Enzyme beträchtlich voneinander abweichen. Deswegen mussten beide immobilisierten Enzyme getrennt voneinander hergestellt werden, und komplizierte Reaktionsarbeitsverfahren werden benötigt.
WO 93 21 335 A betrifft ein Verfahren zum Herstellen von D-Aminosäuren aus einem racematischen Gemisch unter Verwendung von Mikroorganismen, die enzymatische Hydantoinase- und Carbamylase-Wirkungen enthalten, die auf einem Träger immobilisiert sind. Die Einzelenzyme Hydantoinase und Carbamylase wurden nicht voneinander getrennt. Das bedeutet, dass dem Dokument zufolge der Mikroorganismus auf dem Träger immobilisiert ist und nicht das Enzym.
US-A-4,211,840 und JP-2119796 A beschreiben ein Verfahren zum Herstellen von D-α-Aminosäuren durch das Kontaktieren eines 5-substituierten Hydantoins mit einem Enzym, das in der Lage ist, das 5-substituierte Hydantoin in die D-α-Aminosäure umzuwandeln. Für die Umwandlung des 5-substituierten Hydantoins in die D-α-Aminosäure wird nur ein notwendiges Enzym verwendet.
WO 94 00577 A betrifft die Herstellung eines Carbamoylaseenzyms durch das Exprimieren rekombinanter DNA, die ein Carbamoylasegen in einem homologen Wirt codiert. Sie betrifft auch spezifische rekombinante DNA-Vektoren, die ein Carbamoylaseenzym und/oder ein Hydantoinaseenzym umfassen, um D-α-Aminosäuren herzustellen. Unter Verwendung der DNA, die in diesem Dokument beschrieben ist, wird D,L-5-substituiertes Hydantoin in seine D-α-Aminosäure umgewandelt. WO 92 00577 A beschreibt jedoch nicht die Immobilisierung beider Enzyme, die beispielsweise aus einem Mikroorganismus auf einem Träger, der diese unter Verwendung von DNA-Vektoren beide herstellt, erhalten werden.
EP-261 836 betrifft ein immobilisiertes Enzympräparat. Das Enzympräparat umfasst eine immobilisierte Hydantoinase zur Herstellung von D(–)(gegebenenfalls substituiertem Phenyl)glycin oder ein N-Carbamoylderivat davon durch die Hydrolyse von 5-(gegebenenfalls substituiertem Phenyl)hydantoin. Es wurde herausgefunden, dass die Gegenwart eines divalenten Metallions in einem immobilisierten Enzymsystem dem Präparat Stabilität verleiht. Das Hydantoinenzym ist aus einem Mikroorganismus gewonnen.
JP 211 9796 A betrifft ein Verfahren zum Herstellen von L-Homophenylalanin unter Verwendung eines Mikroorganismus, der eine L-spezifische Hydantoinase besitzt, die aus einer Hydantoinhydrolase und N-Carbamylaminosäurehydrolase besteht, oder einem Enzym dieser Art wird ermöglicht, auf 5-Benzylmethylhydantoin einzuwirken, um L-Homophenylalanin herzustellen.
JP 227 6586 A betrifft ein Verfahren zum Herstellen von D-Homophenylalanin. D-Homophenylalanin wird mit einem Mikroorganismus hergestellt, der zu Pseudomonas, Achromobacter, Alcaligenes, Serratia, Aspergillus und Rhizomocur gehört, oder mit einem D-Hydantoin-zersetzenden Enzym, das aus einem dieser Mikroorganismen stammt, dem ermöglicht wird, auf 5-Benzylmethylhydantoin einzuwirken.
Ziele der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine effiziente Technik zum Herstellen von D-α-Aminosäuren unter Verwendung eines immobilisierten Enzymharzes, das durch das gleichzeitige Immobilisieren von Hydantoinase und Decarbamylase direkt auf einem Immobilisierungsharzträger in einem Zustand der Koexistenz der Enzyme (nachfolgend als "zusammengesetzte Enzyme" bezeichnet) erhalten wird.
In diesen zwei enzymatischen Umsetzungen zum Umwandeln von 5-substituierten Hydantoinen in D-α-Aminosäuren ist der optimale pH-Wert der Hydantoinaseumsetzung pH 8 bis 9 und die Löslichkeit des Substrats wird mit einem Anstieg des pH-Werts gesteigert. Zusätzlich wird die racematische Umsetzung des Hydantoinrings in einem alkalischen Bereich gefördert. Deswegen ist es beabsichtigt, die Hydantoinasereaktion in einem pH-Wert durchzuführen, der von 7 bis 10 reicht, bevorzugt in einem alkalischen Bereich. Andererseits ist der optimale pH-Wert der Decarbamylasereaktion im allgemeinen 6,5 bis 9,0, aber die Hemmung der Reaktion durch gebildetes Ammonium wird durch Anstieg des pH-Werts bemerkenswert gesteigert. Deswegen ist es beabsichtigt, die Decarbamylaseumsetzung bei einem pH-Wert über dem Neutralwert durchzuführen.
Wenn eine sogenannte Einschrittreaktion zum Durchführen dieser Umsetzungen verwendet werden kann, d. h. dass diese zwei enzymatischen Reaktionen in einem Reaktionsgefäß gleichzeitig durchgeführt werden, verglichen mit einer sogenannten Zweischrittreaktion, indem zwei verschiedene Enzyme mit den Substraten getrennt reagieren, werden die Reaktionsarbeitsschritte einfach, und die Gesamtreaktionsdauer kann verkürzt werden. Indem die Hydantoinaseumsetzung, welche eine Umkehrreaktion ist, und die Decarbamylasereaktion, welche eine nicht umkehrbare Reaktion ist, zusätzlich kombiniert werden, kann die Konversionsausbeute von Hydantoin ebenso verbessert werden, wie die anschließende Reinigung der D-α-Aminosäuren vereinfacht werden kann. So ist es zu erwarten, dass die Produktionskosten signifikant gesenkt werden können. Wenn jedoch die entsprechenden Enzyme auf verschiedenen Immobilisierungsträgern immobilisiert sind und sie bei deren Verwendung gemischt werden, werden die Reaktionsfähigkeiten aufgrund des Unterschieds beim optimalen pH-Wert schlechter, und es gibt ein Problem hinsichtlich der Stabilität der immobilisierten Enzyme.
Die vorstelligen Erfinder haben intensiv geforscht, um ein zusammengesetztes immobilisiertes Enzympräparat herzustellen, in dem beide Enzyme gleichzeitig direkt auf einem Immobilisierungsträger immobilisiert werden.
Wenn diese zwei Enzyme gleichzeitig immobilisiert werden, treten nacheinander in den Mikrozwischenräumen der Harze zwei enzymatische Reaktionen ein. Deswegen wird eine Bewegung des Substrats für die Decarbamylase, eine D-N-Carbamyl-α-aminosäure, von der immobilisierten Hase zu der immobilisierten DCase mittels Diffusion nicht benötigt, und die Variierung des pH-Werts in den Mikrozwischenräumen kann minimiert werden. Auf diese Weise wird erwartet, dass zusätzlich zum Anstieg der Reaktivitäten der entsprechenden Enzyme und der Verhinderung der Hemmung des Produkts aufgrund von Ammonium, die Stabilität der Enzyme nach wiederholter Verwendung verbessert wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur effizienten Herstellung einer D-Aminosäure des entsprechenden DL-5-substituierten Hydantoins mit Hilfe einer Einschrittreaktion zur Verfügung, welche das Verwenden eines zusammengesetzten immobilisierten Enzyms bei einem pH-Wert bei ungefähr neutralem Wert umfasst, wobei das zusammengesetzte immobilisierte Enzym durch die gleichzeitige Immobilisierung eines Gemisches einer Hydantoinase, die ihren optimalen pH-Wert innerhalb eines alkalischen Bereichs hat, und einer D-N-Carbamyl-α-aminosäureamidohydrolase mit einem optimalen pH-Wert über dem neutralen Wert in einem Zustand der Koexistenz direkt auf einem Immobilisierungsträger eines anionischen Ionenaustauschharzes umfasst (nachfolgend als zusammengesetztes Enzym bezeichnet).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Hinsichtlich der Hydantoinase, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, können Enzyme von Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen verwendet werden. Die Hydantoinasen aus Mikroorganismen sind für die industrielle Herstellung geeignet. Als ein solcher Mikroorganismus kann einer, der in GB-A-2 042 531 (JP-B-62-30759) offenbart ist, exemplarisch dargestellt werden. Diese Bakterien schließen Achromobacter, Aerobacter, Aeromonas, Agrobacterium, Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Klebsiella, Microbacterium, Micrococcus, Protaminobacter, Proteus, Pseudomonas, Sarcina, Serratia, Xanthomonas und ähnliche ein. Die Actinomyceten schließen Actinomyces, Mycobacterium, Nocardia, Streptomyces, Actinoplanes und ähnliche ein. Die filamentösen Pilze schließen Aspergillus, Paecilomyces und Penicillium und ähnliche ein. Die Hefen schließen Candida, Pichia, Rhodotorula, Torulopsis und ähnliche ein.
Von den oben genannten Mikroorganismen schließen Beispiele für Stämme, die relativ hohe Hydantoinaseaktivitäten haben und zur praktischen Verwendung hervorragend geeignet sind, Aerobacter cloacae IAM 1221, Agrobacterium rhizogenes IFO 13259, Brevibacterium incertum IFO 12145, Corynebacterium sepedonicum IFO 3306, Microbacterium flavum ATCC 10340, Micrococcus roseus IFO 3764, Pseudomonas striata IFO 12996, Mycobacterium smegmatis ATCC 607, Nocardia corallina IFO 3338, Streptomyces flaveolus IFO 3241, Bacillus sp. KNK108 (FERM P-6056), Bacillus sp. KNK245 (FERM BP-4863) und ähnliche ein.
Zusätzlich können Enzyme verwendet werden, die durch künstliche Mikroorganismen hergestellt werden, in denen die Hydantoinaseproduktionsfähigkeit durch Genrekombinationstechnologie verliehen wird, z. B. E. coli HB101pTH104 (FERM BP-4864), oder erhöht ist, oder eine Dihydropyrimidinase mit ähnlicher Aktivität wie in JP-A 53-136583 kann verwendet werden.
Hinsichtlich der Decarbamylase, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, sind deren Ursprünge nicht spezifisch beschränkt, und solche, die von Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen stammen, können verwendet werden. Für die industrielle Herstellung sind jedoch Enzyme aus Mikroorganismen geeignet. Beispiele solcher Mikroorganismen schließen natürlich auftretende Mikroorganismen ein, wie beispielsweise Agrobacterium, Pseudomonas, Arthrobacter, Alcaligenes, Achromobacter, Moraxella, Paracoccus, Aerobacter, Aeromonas, Brevibacterium, Bacillus, Flavobacterium und Serratia ein, die in JP-B 57-18793, GB-A 2022 591 (JP-B-63-20520) und GB-A-2042 531 (JP-B-I-48758) offenbart sind, oder die artifiziellen Mikroorganismen, die in WO 92/10579 beschrieben werden, in denen die Decarbamylaseproduktionsfähigkeit durch die Genrekombinationstechnologie verliehen oder gesteigert wird. Repräsentative Beispiele solcher Mikroorganismen schließen Agrobacterium sp. KNK712 (FERM BP-1900), Pseudomonas sp. KNK003A (FERM BP-3181), Pseudomonas sp. KNK505 (FERM BP-3182), Escherichia coli JM109pAD108 (FERM BP 3184), E. coli JM109pPD304 (FERM BP-3183) und ähnliche ein.
Wenn eine stabilisierte Decarbamylase verwendet wird, in der die Aminosäure, die für eine Hitzeresistenz der Decarbamylase verantwortlich ist, welche durch eine andere ersetzt ist, können die folgenden Transformanten, die in WO 94/03613 offenbart sind, verwendet werden. Die Transformanten schließen beispielsweise E. coli JM109pAD402 (FERM BP-3912), E. coli JM109pAD404 (FERM BP-3913), E. coli JM109pAD406 (FERM BP 3914), E. coli JM109pAD416 (FERM BP-3915), E. coli JM109pAD429 (FERM BP-4035), E. coli JM109pAD421, E. coli JM109pAD422, E. coli JM109pAD423, E. coli JM109pAD424 (FERM BP-4034), E. coli JM 109pAD426, E. coli JM109pAD427, E. coli JM109pAD451, E. coli JM109pAD455 (FERM BP-4036), E coli HB101pNT4553 (FERM BP-4368) oder ähnliche ein. Wenn solche stabilisierten Enzyme verwendet werden, können bei wiederholter Verwendung der zusammengesetzten immobilisierten Enzympräparate der vorliegenden Erfindung bessere Ergebnisse erhalten werden.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Enzyme können gleichzeitig unter Verwendung eines Mikroorganismus hergestellt werden, der in der Lage ist, beide Enzyme herzustellen. Alternativ dazu können die Enzyme getrennt voneinander oder simultan unter Verwendung von Mikroorganismen hergestellt werden, die in der Lage sind, die entsprechenden Enzyme alleine herzustellen. Als Mikroorganismus, der in der Lage ist, beide Enzyme herzustellen, kann ein Mikroorganismus, der aus einer natürlichen Quelle isoliert wurde, wie beispielsweise ein Agrobacterium, das in GB-A-202 2591 (JP-8-63-20520) beschrieben ist und ähnliche verwendet werden. Zusätzlich kann ein rekombinanter Mikroorganismus, der durch das Isolieren von Genen beider Enzyme aus Mikroorganismen, die aus einer natürlichen Quelle isoliert wurden und durch das Einschleusen davon in einen Wirt hergestellt werden, beispielsweise die Mikroorganismen, die in WO 94/00577 offenbart sind, verwendet werden. Ein Mikroorganismus, der beide Enzyme gleichzeitig produziert, ist auch Agrobacterium spKNK-712 (FERM BP-1900), Rhizobium sp. KNK 1415 (FERM BP-4419) oder Pseudomonas sp. KNK 003A (FERM BP-3181). Alternativ dazu können beide Enzyme aus gleichen oder verschiedenen Mikroorganismen isoliert werden und in den gleichen Sektor in der exprimierbaren Form beider Gene inseriert werden oder in verschiedene Vektoren inseriert werden, die verschiedene Replikationsmodi besitzen, z. B. pUC19 und pACYC184. Dann kann ein Empfängerwirt wie beispielsweise E. coli mit dem obengenannten Vektor oder den Vektoren transformiert werden, so dass ein einzelner Mikroorganismus beide Enzyme herstellen kann. In diesen Fällen kann das Verhältnis der Herstellung jedes Enzyms durch das Auswählen der Promotorarten mit verschiedenen Fähigkeiten und von Plasmiden mit verschiedenen Kopienanzahlen entsprechend des besonderen Zwecks variiert werden. Es wird jedoch bevorzugt, das Verhältnis so einzustellen, dass fast gleiche Mengen der Enzymproteine erhalten werden. Im Fall, dass Mikroorganismen verwendet werden, die die verschiedenen Enzyme getrennt voneinander herstellen, können auch Stämme verwendet werden, die aus ihren natürlichen Quellen isoliert wurden oder rekombinante Mikroorganismen, die unter Verwendung von rekombinanten Gentechnologien hergestellt wurden, verwendet werden. In einem solchen Fall kann die Herstellung der Enzyme durch das getrennte Kultivieren der Herstellermikroorganismen durchgeführt werden oder durch das Kultivieren in einer gemischten Kultur in verschiedenen Verhältnissen, bevorzugt in einem solchen Verhältnis, dass fast gleiche Mengen der Enzyme hergestellt werden.
Die Kultivierung kann aerobisch durchgeführt werden, z. B. durch eine Schüttelkultur unter Verwendung von Flaschen oder durch eine Spinnerkultur mit Belüftung. Als normalerweise verwendetes Kulturmedium, das bei der Kultivierung normalerweise verwendet wird, kann ein Nährmedium, das allgemein verwendete natürliche Nährstoffe enthält, wie beispielsweise Fleischextrakt oder Polypepton und ähnliche, verwendet werden. Wenn die Hydantoinase getrennt oder gleichzeitig mit Decarbamylase hergestellt wird, kann ein gutes Ergebnis durch das Durchführen der Kultivierung unter der Zugabe von Manganionen in einer Menge von beispielsweise 1 bis 100 mg/l, bevorzugt ungefähr 20 mg/l Manganchlorid durchgeführt werden.
Und sofern die Enzyme unter den Bedingungen sind, dass die enzymatischen Wirkungen gezeigt werden können, können die Enzyme in jeder Form vorliegen und von jeder Substanz begleitet werden.
Bei der Herstellung oder Verwendung des zusammengesetzten immobilisierten Enzympräparats der vorliegenden Erfindung können bessere Ergebnisse durch Zugeben eines Antioxidationsmittels für eine wiederholte Verwendung erhalten werden. Als ein solches Antioxidationsmittel kann Dithiothreitol, 2-Mercaptoethanol, L-Cysteinhydrochlorid, Cysteaminhydrochlorid, Dithioerythritol oder ein Gemisch aus Dithiothreitol und Dithioerythritol, reduziertem Glutathion und ähnlichem verwendet werden.
Der immobilisierte Träger, der verwendet wird, kann entsprechend den besonderen Verwendungsbedingungen der immobilisierten Enzyme variiert werden. Wenn eine Rohenzymlösung wie beispielsweise ein zellfreier Extrakt oder eine teilweise gereinigte Enzymlösung, die mit Ammoniumsulfatpräzipitierung oder ähnlichem behandelt wurden, einer Immobilisierung unterworfen werden, können Polymerträger mit Ionenaustauschgruppen oder kovalenten Bindungsgruppen verwendet werden.
Als Polymerträger mit einer Ionenaustauschgruppe, können z. B. Duolit (registrierte Handelsmarke)-Serien, oder Amberlite IRA (registrierte Handelsmarke)-Serien verwendet werden, wobei die Austauschgruppen primäre, sekundäre, tertiäre, und quaterniäre Amine sind; oder ein Polystyrolharz mit einer funktionalen diethanolartigen Gruppe, beispielsweise Diaion EX.
Als Träger mit einer kovalenten Bindungsgruppe kann ein substituiertes Polymethacrylatpolymer mit einem Aldehyd als Bindungsgruppe, eine Tonerde mit hoher Dichte, die mit einem Polyethylenimin/Glutaraldehydkomplex bedeckt ist und ähnliche verwendet werden.
Das zusammengesetzte immobilisierte Enzympräparat der vorliegenden Erfindung wird wie folgt hergestellt. Eine Lösung der Roheenzymzusammensetzung, in der die Aktivitäten von Hase und DCase entsprechend eingestellt sind, wird mit einem Träger in Kontakt gebracht, um die entsprechenden Enzyme zu absorbieren und dann zur Stabilisierung mit einem Vernetzungsmittel behandelt. Um eine Lösung der zusammengesetzten Rohenzyme herzustellen, wird jedes Enzym zuerst durch die Kultivierung der mikrobiellen Zellen hergestellt. In diesem Fall kann ein zellfreier Extrakt durch das Einsammeln der Zellen und deren Zerstören beispielsweise durch Beschallung, mechanisches Aufschließen (z. B. Homogenisator) oder eine Enzymbehandlung hergestellt werden, wenn ein Mikroorganismus, der in der Lage ist, die Enzyme gleichzeitig zu produzieren, verwendet wird. Wenn eine Lösung der Enzymzusammensetzung unter Verwendung verschiedener Mikroorganismen hergestellt wird, kann diese durch das getrennte Kultivieren der Mikroorganismen, das Einsammeln der Zellen, das Herstellen entsprechender zellfreier Extrakte und dem Mischen davon hergestellt werden. Oder es kann durch das Kultivieren der entsprechenden Mikroorganismenproduzenten zusammen hergestellt werden, und durch das Zerstören dieser Zellen zum gleichen Zeitpunkt, um einen zellfreien Extrakt herzustellen, in dem beide Enzyme gemischt sind. Sind beide Enzyme von verschiedenen Mikroorganismen hergestellt werden, können die Produktionsfähigkeiten in großem Ausmaß, entsprechend den Arten der Mikroorganismen und dem Unterschied der Kultivierungsverfahren, variieren. Hinsichtlich der Hydantoinase produziert ein normaler Mikroorganismenproduzent im allgemeinen jedoch die Hydantoinase zu ungefähr 0,1 bis ungefähr 10 Units/ml (ein Unit des Enzyms, wie es hier verwendet wird, ist als die Menge definiert, die benötigt wird, um das Substrat 5-(p-Hydroxyphenyl)hydantoin in D-N-Carbamyl-p-hydroxyphenylglycin bei einem pH-Wert von 8,7, 40°C für eine Minute umzuwandeln) und ein rekombinanter künstlicher Mikroorganismenproduzent produziert es zu ungefähr 5 bis ungefähr 150 Units/ml.
Hinsichtlich der Decarbamylase, produziert ein normaler Mikroorganismenproduzent die Decarbamylase zu ungefähr 0,01 bis ungefähr 2 Units/ml (ein Unit des Enzyms, wie es hier verwendet wird, ist als die Menge definiert, die benötigt wird, um das Substrat D-N-Carbamyl-p-hydroxyphenylglycin in D-p-Hydroxyphenylglycin bei einem pH-Wert von 7,0, 40°C für eine Minute umzuwandeln), und ein rekombinanter künstlicher Mikroorganismenproduzent produziert es zu ungefähr 0,1 bis ungefähr 20 Units/ml. Die Verhältnisse der Hase und DCase-Aktivitäten in einer Lösung der Rohenzymzusammensetzung werden eingestellt, so dass die Reaktionen, die die D-α-Aminosäure aus 5-substituiertem Hydantoin hervorbringt, am effizientesten voranschreiten kann. Wie nachfolgend beschrieben, wird diese Reaktion bei einem neutralen pH-Wert durchgeführt, welcher nahezu der optimale pH-Wert für die DCase ist, und deswegen sind die Bedingungen verschieden von denen, die eine maximale Wirkung der Hase aufweisen. Ferner ist es gewünscht, dass beide enzymatischen Aktivitäten so eingestellt werden, dass fast gleiche Aktivitäten bei dem Reaktions-pH-Wert erreicht werden. Im Fall, dass die Reaktion beispielsweise bei einem pH-Wert von 7,5 durchgeführt wird, kann das gewünschte zusammengesetzte immobilisierte Enzympräparat hergestellt werden, indem die Immobilisierungsreaktion unter Verwendung einer Enzymlösung durchgeführt wird, in der fast gleiche Mengen an Proteinen und enzymatische Aktivitäten vorhanden sind, so dass die Hydantoinase ungefähr fünf Mal mehr ist als die DCase in Units. Um solche Aktivitäten nach der Immobilisierung zu bewahren, ist es gewünscht, dass das Verhältnis der Enzymaktivitäten (Hase zu DCase) in einer Lösung der Rohenzymzusammensetzung in einem Verhältnis von 1 bis 10 : 1 sein sollte. Deswegen werden die Aktivitäten der Rohenzymzusammensetzung nach dem Zerstören der mikrobiellen Zellen und vor der Absorbierung auf solche Niveaus eingestellt.
Um außerdem geeignete Mengen der Enzyme auf dem Träger zu absorbieren, wird bevorzugt die Konzentration der Decarbamylase in der Lösung der Rohenzymzusammensetzung auf 10 bis 300 Units/ml einzustellen. Die absorbierte Aktivität ist ungefähr 20 bis ungefähr 90% der hinzugegebenen Aktivität, und zwischen beiden Enzymen können keine wesentlichen Unterschiede erkannt werden.
Der Träger wird nach der Aktivierung seiner Austauschgruppe mit beispielsweise einer wässrigen Natriumchloridlösung und durch Equilibrieren, beispielsweise in einer Pufferlösung, verwendet. Es ist bevorzugt, dass das Verhältnis der Lösung der Rohenzymzusammensetzung und des Trägers so eingestellt wird, dass die Gesamtmenge des Proteins in der Rohenzymlösung fast die gleiche ist wie die maximale Adsorptionskapazität des Trägers. Falls notwendig, kann 1 bis 10 mM eines Antioxidationsmittels und/oder 0,5 bis 20 mM Manganion vorhanden sein. Das Gemisch wird bei 4 bis 30°C, bevorzugt bei 15°C, gerührt und der Träger wird durch Filtrieren nachdem die Menge des absorbierten Enzyms die gegebene Menge erreicht, eingesammelt (normalerweise 8 bis 48 Stunden, bevorzugt wird dieses in einer trägen Gasatmosphäre, wie beispielsweise Stickstoff, durchgeführt). Dann wird der Träger gewaschen und durch die Behandlung mit einem Vernetzungsmittel zum Stabilisieren unlöslich gemacht. Als Vernetzungsmittel kann ein bekanntes Mittel zu weniger als 1%, bevorzugt 0,1 bis 0,2% Glutaraldehyd verwendet werden. Das vernetzte immobilisierte Präparat der Enzymzusammensetzung wird mit destilliertem Wasser und einer Pufferlösung (bevorzugt 0,1 bis 20 mM, normalerweise 1 bis 5 mM Antioxidationsmittel wie oben beschrieben enthalten) gewaschen und in feuchtem Zustand in einem versiegelten Gefäß bei niedriger Temperatur (4°C) gelagert. Im allgemeinen liegen die Aktivitäten des zusammengesetzten immobilisierten Enzympräparats, das so erhalten wird, bei 5 bis 80 Units/g Träger hinsichtlich der Decarbamylase. Bei der Hydantoinase ist ihre Wirkung entsprechend den Adsorptionsbedingungen 1 bis 10 mal weniger als die der Decarbamylaseaktivität.
Das Verfahren zum Herstellen von D-α-Aminosäuren aus 5-substituierten Hydantoinen unter Verwendung des zusammengesetzten immobilisierten Enzympräparats der vorliegenden Erfindung wird nachfolgend beschrieben.
Die Reaktion wird durchgeführt, indem das Substrat, 5-substitutiertes Hydantoin, mit dem zusammengesetzten immobilisierten Enzympräparat, falls notwendig in Gegenwart eines Antioxidationsmittels und/oder Manganionen, umgesetzt wird. Normalerweise wird es bevorzugt, dass die Reaktion in Gegenwart von 0,1 bis 20 mM eines Antioxidationsmittels und Manganionen durchgeführt wird. Die Reaktion verläuft gemäß dem folgenden Reaktionsschema:
wobei R eine Phenylgruppe, Phenylgruppe, die mit einer Hydroxygruppe, Alkylgruppe, substituierten Alkylgruppe, Aralkylgruppe oder Thienylgruppe substituiert ist, darstellt.
Die Konzentration des Substrats 5-substituiertes Hydantoin, das verwendet werden soll, beträgt 0,1 bis 30% (W/V), bevorzugt 1 bis 5% (W/V). Es wird bevorzugt, dass die Menge des zusammengesetzten immobilisierten Enzympräparats, die verwendet werden soll, ungefähr 10 bis ungefähr 20 Units/g Substrat als Decarbamylaseaktivität ist. Die Reaktionstemperatur variiert gemäß den besonderen Enzymen, aber im allgemeinen beträgt sie 30 bis 60°C. Enzyme mit Wärmeresistenz können bei viel höheren Temperaturen verwendet werden.
Der pH-Wert der Reaktion wird passend aus einem Bereich von 6,5 bis 8,0 ausgewählt. Der pH-Wert ist für die DCase fast optimal. Er ist jedoch beträchtlich weit vom optimalen pH-Wert für die Hase entfernt, und die Hase-Aktivität sinkt mehrere Male unter die Aktivität bei optimalem pH-Wert. Dadurch sinkt auch die Racematisierungsrate. Schließlich wird die Herstellung von D-α-Aminosäure jedoch durch das Enzym des letzten Schritts, die DCase bestimmt, so dass es bevorzugt wird, die Menge des Enzyms und die Reaktionsbedingungen basierend auf der DCase einzustellen (d. h. die optimalen Bedingungen für die DCase), und die Hase-Aktivität im Verhältnis zu der DCase-Aktivität zu kombinieren. Im allgemeinen wird das Verhältnis der Enzyme, die auf dem Träger absorbiert werden sollen, so eingestellt, so dass fast gleiche Aktivitäten exprimiert werden können, obwohl dies von den besonderen Reaktionsbedingungen abhängt. Die "fast gleichen Aktivitäten" bedeutet eine Situation, wo das Verhältnis der Hydantoinaseaktivität, die bei pH-Wert 7,5 gemessen wird, dargestellt in "Units (pH 7,5"), und die Decarbamylaseaktivität wie oben beschrieben bei ungefähr 0,5 bis 1,5 : 1 liegt. Die Reaktion wird unter Einstellen eines Reaktions-pH-Werts zum so gewählten pH-Bereich durchgeführt, normalerweise auf pH 7,5. Durch diese Arbeitsschritte werden die ungünstigen Bedingungen für die Hase überwunden und das Reaktionsgleichgewicht neigt sich in Richtung der Herstellung von D-N-Carbamylaminosäure. Auf diese Weise kann die Reaktion effizienter durchgeführt werden als erwartet und die Umwandlung des Substrats, einem 5-substituierten Hydantoin, kann verbessert werden. Wenn die Reaktion bei einem alkalischen pH-Bereich nahe dem optimalen pH-Wert der Hydantoinase durchgeführt wird, sinkt die Decarbamylaseaktivität auf unter die Hälfte der Aktivität bei optimalem pH-Wert, obwohl die Herstellung von einer D-N-Carbamylaminosäure erfolgreich voranschreiten kann. Zusätzlich ist beobachtet worden, dass die Gesamtausbeute sinkt und dass die Stabilität der Decarbamylase selbst gesenkt wird, da die Reaktion stark durch das Ammonium gehemmt wird, was während der Reaktion hergestellt wird. Aus diesen Gründen kann die Reaktion unter Verwendung des zusammengesetzten immobilisierten Enzympräparats wirksam durchgeführt werden, wenn das zusammengesetzte immobilisierte Enzympräparat mit einem solchen Immobilisierungsverhältnis, dass die Decarbamylasereaktion unter Bedingungen nahe den optimalen Reaktionsbedingungen und der Substratkonzentration der Decarbamylase leicht ratenbestimmend ist. Zusätzlich ist es vorteilhaft, dass die Gesamtaktivität des zusammengesetzten immobilisierten Enzympräparats leicht kontrolliert werden kann, da die Produktivität der Hase hoch ist und die DCase die irreversible Reaktion katalysiert.
Die Reaktion wird normalerweise mittels eines Säulenverfahrens oder durch das Suspendieren des zusammengesetzten immobilisierten Enzympräparats in einem Reaktionsgefäß durchgeführt. Im letzteren Fall wird für gewöhnlich eine Batch-Reaktion durchgeführt und die Reaktionsdauer beträgt ungefähr 6 bis ungefähr 48 h je Batch. Unter Verwendung des erfindungsgemäßen zusammengesetzten immobilisierten Enzympräparats kann die entsprechende D-Aminosäure aus einem 5-substituierten Hydantoin in einer hohen Ausbeute in einer Einschrittreaktion hergestellt werden. Die folgenden Beispiele stellen die vorliegende Erfindung weiter detailliert dar, aber sollen nicht so verstanden werden, dass sie deren Umfang begrenzen.
Beispiel 1
Zuerst wurde Bacillus sp. KNK108 (FERM P-6056) zum Herstellen einer Hydantoinaseenzymlösung in 250 ml eines Saatkulturmediums inokuliert (Fleischextrakt 1%, Polypepton 1%, Hefeextrakt 0,5% (pH 7,0)) und bei 33°C für ungefähr 25 h kultiviert. Diese Saatkultur wurde in 2,5 1 eines Kulturmediums inokuliert (Fleischextrakt 1%, Polypepton 1%, Hefeextrakt 0,5%, Urazil 0,1%, MnCl₂ 20 ppm (pH 7,5)) und bei 33°C für ungefähr 16 h kultiviert. Die mikrobiellen Zellen wurden durch Zentrifugierung gesammelt und in 50 ml 20 mM MnSO₄ wässriger Lösung suspendiert. Nach dem Einstellen des pH-Werts auf 8,5 wurden die Zellen durch Beschallung aufgeschlossen und der Rest wurde entfernt, um eine Rohenzymlösung der Hydantoinase zu erhalten (107 Units/ml).
Um zusätzlich eine Enzymlösung der Decarbamylase herzustellen, wurde E. coli HB101pNT4553 (FERM BP-4368) in 20 ml 2YT-Medium kultiviert (Bactopepton 1,6%, Bactohefeextrakt 1,0%, NaCl 0,5%), supplementiert mit 50 μg/ml Ampicillin bei 37°C für ungefähr 16 h. Diese Kultur wurde in 1,4 l 2YT-Medium in einer Menge von 1% inokuliert und bei 37°C für ungefähr 28 h kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren eingesammelt und in 140 ml 5 mM Dithiothereitollösung suspendiert. Nach dem Einstellen des pH-Werts auf 7,0 wurden die Zellen durch Beschallung aufgeschlossen und der Rest wurde entfernt, um den Überstand als Decarbamylaserohenzymlösung zu erhalten (36 Units/ml).
Beispiel 2
Unter Verwendung der in Beispiel 1 erhaltenen Rohenzymlösungen wurde eine Immobilisierung der Enzyme durchgeführt. Duolite A-568 (Rohm & Haas) als Immobilisierungsträger wurde zuerst mit 1 M NaCl und Ionenausgetauschtem Wasser gewaschen und in das ionenausgetauschte Wasser getan, und der pH-Wert wurde auf 7,5 eingestellt. Zu 8,4 g dieses Harzes wurden 20 ml der Hydantoinaserohenzymlösung hinzugegeben und 11,5 ml der Decarbamylaserohenzymlösung, wobei der pH-Wert von beiden auf 7,5 eingestellt worden ist, und das Gemisch wurde bei 15°C für ungefähr 20 h in einer Stickstoffatmosphäre gerührt. Nachdem dieses Harz zweimal mit 0,5 nM MnSO₄-Lösung gewaschen wurde, wurde das Harz in fünfmal dem Volumen des ionenausgetauschten Wassers suspendiert. Danach wurde der pH-Wert auf 7,5 eingestellt, die Suspension wurde für 35 min unter portionsweiser Zugabe von 544 μl 2,5% Glutaraldehyd gerührt. Diese Suspension wurde mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM DTT und 1 mM MnSO₄ über Nacht behandelt, und dann wurde das zusammengesetzte immobilisierte Enzympräparat durch Filtrieren eingesammelt (Hydantoinaseaktivität 8,2 Units (pH 7,5) und Decarbamylaseaktivität 9,9 Units je 1 g Harz).
Dann wurden als Kontrollen Harze, auf denen die zwei Enzyme getrennt voneinander immobilisiert wurden, hergestellt.
Jeweils 20 ml der Hydantoinaserohenzymlösung und 60 ml der Decarbamylaserohenzymlösung wurden mit jeweils 4,2 g und 22,0 g des oben genannten Immobilisierungsträgers gemischt und die gleichen Arbeitsschritte wie oben beschrieben wurden durchgeführt, um jeweils ein immobilisiertes Enzymharz zu erhalten, auf dem jedes Enzym getrennt voneinander immobilisiert war (immobilisiertes Hydantoinase-Enzym: 24 Units/g Harz, 2,7 Units/g Harz (pH 7,5), und immobilisiertes Decarbamylase-Enzym: 37 Units/g Harz).
Beispiel 3
Unter Verwendung des zusammengesetzten immobilisierten Enzympräparats und der immobilisierten Enzyme, die die entsprechenden einzelnen Enzyme enthalten, die in Beispiel 2 erhalten wurden, wurden Reaktionen zum Herstellen der entsprechenden D-α-Aminosäure aus 5-substituiertem Hydantoin durchgeführt.
Nach der Zugabe von 1 g 5-(p-Hydroxyphenyl)hydantoin als Substrat zu 100 ml an 0,1 M KPB (pH 7,5), 1 mM MnSO₄ und 5 mM DTT wurde ausreichend Stickstoffgas eingeschleust und die Reaktionsbedingungen wurden auf 40°C und pH 7,5 eingestellt. Um die gleichen enzymatischen Aktivitäten beider Enzyme zu erhalten, wurden 0,97 g des zusammengesetzten immobilisierten Enzympräparats oder 3,0 g des immobilisierten Hydantoinaseenzyms und 0,26 g des immobilisierten Decarbamylaseenzyms hinzugegeben. Die Reaktion wurde unter Einleiten von Stickstoffgas und dem Kontrollieren des Reaktions-pH-Werts auf 7,5 mit 2 N H₂SO₄ oder 6 N NaOH durchgeführt. Die Reaktion wurde für 29 h unter periodischem Probenziehen durchgeführt. Die hergestellte Menge an p-Hydroxyphenylglycin an jedem Probenentnahmepunkt wurde durch Hochleistungsflüssigchromatographie (Nippon Bunko, Finepack SIL C-18 column) bestimmt.
Die Ergebnisse werden in 1 gezeigt.
Wie aus 1 ersichtlich wird, wurde gefunden, dass die Reaktion effizienter durchgeführt werden kann, wenn zwei Enzyme gleichzeitig auf dem gleichen Harz immobilisiert sind.
Beispiel 4
Die Stabilität der Enzymaktivitäten wurde durch das wiederholte Durchführen der Reaktion mit dem zusammengesetzten immobilisierten Enzympräparat durchgeführt.
Zwei Gramm 5-(p-Hydroxyphenyl)hydantoin wurden zu 100 ml 1 mM MnSO₄ und 5 mM DTT gegeben, und der pH-Wert wurde auf 7,5 eingestellt. Zu dem Gemisch wurden 8,9 g des zusammengesetzten immobilisierten Enzympräparats, das in Beispiel 2 erhalten wurde, hinzugegeben und die Reaktion wurde bei 40°C für 23 h unter Einleiten von Stickstoffgas und dem Kontrollieren des pH-Werts auf 7,5 durchgeführt. Nach dem Filtrieren des Reaktionsgemisches durch Saugen, wurde ein weiteres Gemisch in der gleichen Weise wie oben beschrieben zu dem zusammengesetzten immobilisierten Enzym hinzugegeben und die Reaktion wurde durchgeführt. Dieser Arbeitsschritt wurde fünfmal wiederholt und beide Enzymaktivitäten wurden an dem Ende jeder Reaktion bestimmt.
Die relativen Aktivitäten bezogen auf die erste Reaktion werden in 2 gezeigt.
Die Abnahme der Aktivitäten wurde in diesen fünf Reaktionen selten beobachtet.
Beispiel 5
Zum Herstellen einer Hydantoinaseenzymlösung wurde E. coli HB101pTH104 (FERM BP-4864), enthaltend ein Hydantoingen aus Bacillus sp. KNK245 (FERM BP-4863), in 20 ml 2YT-Medium bei 37°C für ungefähr 16 h kultiviert. Diese Kultur wurde in 1,2 l 2YT-Medium transferiert, welches mit 50 μg/ml Ampicillin und 400 ppm an MnCl₂·4H₂O supplementiert war und für 26 h bei 37°C kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt und in 80 ml wässriger 1 mM MnSO₄ Lösung suspendiert. Nach dem Einstellen des pH-Werts auf 8,5 mit Ammoniumwasser wurden die Zellen durch Beschallung aufgeschlossen und der Rest wurde durch Zentrifugieren entfernt. Nach dem Einstellen des pH-Werts des Überstandes auf 8,5 wurde eine Wärmebehandlung bei 60°C über 20 min durchgeführt. Die denaturierten Proteine wurden durch Zentrifugieren entfernt, um eine Rohenzymlösung der Hydantoinase zu erhalten (1.100 Units/ml).
Unter Verwendung dieser Rohenzymlösung und einer Rohenzymlösung der Decarbamylase, die auf die gleiche Weise hergestellt wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben (240 Units/ml), wurde das zusammengesetzte immobilisierte Enzympräparat auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 beschrieben, hergestellt. Unter Verwendung von 30 ml der Decarbamylaserohenzymlösung und 13 ml der Hydantoinaserohenzymlösung wurden die Enzyme auf 29 g nach dem gleichen Verfahren, wie in Beispiel 2 beschrieben, auf dem Harz immobilisiert (Decarbamylase: 45 Units und Hydantoinase: 119 Units, 44 Units (pH 7,5) je 1 g Harz).
Als Kontrollen wurden Harze, auf denen zwei Enzyme getrennt immobilisiert waren, verwendet. Das immobilisierte Decarbamylaseenzym (43 Units/g Harz) wurde wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt. Das immobilisierte Hydantoinaseenzym wurde entsprechend dem Verfahren, das in Beispiel 2 beschrieben wurde, durch Mischen von 21,8 g des Harzes zur Immobilisierung mit 60 ml der Rohenzymlösung hergestellt (177 Units/g Harz, 51 Units/g (pH 7,5)).
Beispiel 6
Unter Verwendung von 5 g des zusammengesetzten immobilisierten Enzympräparats, das in Beispiel 5 erhalten wurde und als immobilisierte Enzyme, die durch das Immobilisieren der entsprechenden Enzyme auf verschiedenen Harzen hergestellt wurde, wurde ein Gemisch von 5,6 g des immobilisierten Hydantoinaseenzyms und 5,2 g des immobilisierten Decarbamylaseenzyms, das in Beispiel 5 erhalten wurde (die Decarbamylaseaktivität (pH 7,5) war gleich der des zusammengesetzten immobilisierten Enzympräparats und die Hydantoinaseaktivität (pH 8,7) war zweimal höher als die des zusammengesetzten immobilisierten Enzympräparats), wurde die Reaktion mit 3% Substrat entsprechend dem Verfahren, das in Beispiel 3 beschrieben wurde, durchgeführt.
Die Ergebnisse werden in 3 gezeigt.
Wie in 3 gezeigt wird, war die Reaktivität des zusammengesetzten immobilisierten Enzympräparats ähnlich der Reaktivität der getrennt immobilisierten Enzyme, obwohl die Hydantoinaseaktivität der Hälfte des getrennt immobilisierten Enzyms entsprach. So wurde herausgefunden, dass die Reaktion mittels des zusammengesetzten immobilisierten Enzympräparats effizienter ist und dass die Menge des teuren Harzes zur Immobilisierung stark reduziert werden kann.
Beispiel 7
Indem jeweils 5 g des zusammengesetzten immobilisierten Enzyms, das in Beispiel 5 erhalten wurde, verwendet wurden, wurde die Wirkung des pH-Werts der Reaktion untersucht. Bei drei pH-Niveaus von 7,0, 7,25 und 7,5 wurden die Reaktionen mit 3% Substrat durchgeführt. Die Dauern, die benötigt wurden, um 99% des Substrats umzuwandeln, wurden gemessen. Die Dauern betrugen 5,5, 5,4 und 6,75 h. So wurde herausgefunden, dass pH 7,0 und 7,25 für die Reaktion vorteilhaft sind.
Wie oben beschrieben, ist es entsprechend der vorliegenden Erfahrung unter Verwendung eines zusammengesetzten immobilisierten Enzympräparats, das durch das gleichzeitige Immobilisieren der Hydantoinase und der Decarbamylase auf dem gleichen Harz bei der Herstellung der entsprechenden D-α-Aminosäuren aus 5-substituierten Hydantoinen hergestellt werden, eine Einschrittreaktion mit viel einfacheren Arbeitsschritten durchzuführen, als eine Zweischrittreaktion, und effizienter als die Reaktion mit einem Gemisch der zwei immobilisierten Enzyme, die durch das getrennte Immobilisieren dieser Enzyme auf verschiedenen Harzen erhalten werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Graph, der die zeitlichen Verläufe der Reaktionen zur Herstellung des entsprechenden D-p-Hydroxyphenylglycins aus 5-(p-Hydroxyphenyl)-hydantoin in Beispiel 3 unter Verwendung des zusammengesetzten immobilisierten Enzympräparats der vorliegenden Erfindung und des Gemisches, das durch das getrennte Immobilisieren von Hydantoinase und Decarbamylase auf verschiedene Harze hergestellt wurde, darstellt.
2 ist ein Graph, der die Stabilität der Enzyme in wiederholten Reaktionen unter Verwendung des zusammengesetzten immobilisierten Enzympräparats an Beispiel 4 zeigt.
3 ist ein Graph, der den Vergleich der Aktivität des zusammengesetzten immobilisierten Enzympräparats und der Aktivität des Gemischs der getrennt hergestellten immobilisierten Enzympräparate darstellt (die Hydantoinaseaktivität ist zweimal höher als das zusammengesetzte immobilisierte Enzympräparat) in Beispiel 6.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer D-Aminosäure aus dem entsprechenden DL-5-substituierten Hydantoin durch ein Einschrittverfahren umfassend die Verwendung einer immobilisierten Enzymzusammensetzung bei einem pH im neutralen Bereich, diese immobilisierte Enzymzusammensetzung wird erhalten durch gleichzeitiges Immobilisieren einer Mischung einer Hydantoinase, die ihren optimalen pH im alkalischen Bereich aufweist (im folgenden abgekürzt als Hase) und einer D-N-Carbamyl-α-aminosäureamidohydrolase, deren optimaler pH im neutralen Bereich liegt (im folgenden abgekürzt als DCase), direkt an einen immobilisierenden Träger.
Verfahren zur Herstellung einer D-Aminosäure gemäß Anspruch 1, wobei eine Enzymzusammensetzung zur Immobilisierung verwendet wird, hergestellt durch getrennten Produzieren der Hase und der DCase und anschließendem Vermischen dieser.
Verfahren zur Herstellung einer D-Aminosäure gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die zu verwendende Hase eine ist, die von einem Mikroorganismus der Gattung Bacillus stammt.
Verfahren zur Herstellung einer D-Aminosäure gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die zu verwendende Hase eine ist, die von Bacillus sp. KNK108 (FERM P-6056) oder Bacillus sp. KNK245 (FERM BP-4863) stammt.
Verfahren zur Herstellung einer D-Aminosäure gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die zu verwendende Hase eine ist, die von einem rekombinanten E. coli stammt, insbesondere E. coli HB101pTH104 (FERM BP-4864).
Verfahren zur Herstellung einer D-Aminosäure gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die zu verwendende DCase eine ist, die von Agrobacterium sp. KNK712 (FERM BP-1900), Pseudomonas sp. KNK003A (FERM BP-3181), Pseudomonas sp. KNK505 (FERM BP-3182), E. coli JM109pAD108 (FERM BP-3184), E. coli JM109pPD304 (FERM BP-3183) stammt.
Verfahren zur Herstellung einer D-Aminosäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder 6, wobei die DCase eine ist, die von einem rekombinanten Mikroorganismus stammt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus E. coli JM109pAD402 (FERM BP-3912), E. coli JM109pAD404 (FERM BP-3913), E. coli JM109pAD406 (FERM BP-3914), E. coli JM109pAD416 (FERM BP-3915), E. coli JM109pAD429 (FERM BP-4035, E. coli JM109pAD421, E. coli JM109pAD422, E. coli JM109pAD423, E. coli JM109pAD424 (FERM BP-4034), E. coli JM109pAD426, E. coli JM109pAD427, E. coli JM109pAD451, E. coli JM109pAD455 (FERM BP-4036) oder E. coli JM109pRD4553 (FERM BP-4368), wobei die Stabilität verbessert ist durch Aminosäureaustausch in der DCase, die von Agrobacterium sp. KNK712 (FERM BP-1900) stammt.
Verfahren zur Herstellung einer D-Aminosäure gemäß Anspruch 1, wobei eine zur Immobilisierung verwendete Enzymzusammensetzung hergestellt wird durch gleichzeitiges Produzieren von Hase und DCase.
Verfahren zur Herstellung einer D-Aminosäure gemäß Anspruch 8, wobei ein Mikroorganismus, der gleichzeitig Hase und die DCase produziert, ist: Agrobacterium sp. KNK-712 (FERM BP-1900), Rhizobium sp. KNK1415 (FERM BP-4419) oder Pseudomonas sp. KNK003A (FERM BP-3181).
Verfahren zur Herstellung einer D-Aminosäure gemäß Anspruch 8, wobei die Enzymzusammensetzung hergestellt wird durch Kultivieren eines Wirts enthaltend ein Plasmid, hergestellt durch Ligieren eines Hase-Gens und eines DCase-Gens in gleichen Vektor.
Verfahren zur Herstellung einer D-Aminosäure gemäß Anspruch 10, wobei der Wirt enthaltend ein Plasmid, hergestellt durch Ligieren des Hase-Gens und des DCase-Gens in einen gleichen Vektor ist: E. coli HB101pPHD301 (FERM BP-4866) oder E. coli JM109pAHD101.
Verfahren zur Herstellung einer D-Aminosäure gemäß Anspruch 8, wobei die Enzymzusammensetzung hergestellt wird durch Ligieren des Hase-Gens und des DCase-Gens in verschiedene Vektoren mit verschiedenen Replikationsmodi, Einfügen dieser Vektoren in den gleichen Wirt und Kultivieren des Wirts.
Verfahren zur Herstellung einer D-Aminosäure gemäß Anspruch 8, wobei die Enzymzusammensetzung hergestellt wird durch ein Miteinanderkultivieren eines Hase herstellenden Mikroorganismus und eines DCase herstellenden Mikroorganismus.
Immobilisierte Enzymzusammensetzungspräparation umfassend eine Hydantoinase und eine Decarbamylase, die von gleichen oder verschiedenen Mikroorganismen stammen, ein Antioxidans, Manganion und einen Träger, der direkt diese Enzyme trägt, die enzymatischen Aktivitäten der Hydantoinase und der Decarbamylase, die direkt auf den Träger aufgebracht sind, sind fast identisch bei einem Reaktions-pH zwischen 6,5 bis 8,0.