DE69314280T2

DE69314280T2 - Rekombinantes Nitrilase und deren Verwendung

Info

Publication number: DE69314280T2
Application number: DE69314280T
Authority: DE
Inventors: Edith Cerbelaud; Joel Crouzet; Sophie Levy-Schil; Dominique Petre
Original assignee: Rhone Poulenc Nutrition Animale SA
Current assignee: Adisseo France SAS
Priority date: 1992-08-10
Filing date: 1993-08-06
Publication date: 1998-02-05
Anticipated expiration: 2013-08-07
Also published as: EP0596812A1; FR2694571B1; KR940004057A; BR9305280A; CA2103616A1; FR2694571A1; JPH0751070A; DE69314280D1; MX9304825A; EP0596812B1; ES2108850T3; SG48047A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Polypeptide mit einer Nitrilase-Aktivität, die gentechnischen Mittel zu deren Produktion, d.h. eine DNA-Sequenz, Expressionskassetten, die diese DNA-Sequenz tragen, und die rekombinanten Mikroorganismen (Wirtsmikroorganismen), die die DNA-Sequenz enthalten.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur enzymatischen Transformation von Nitrilen in Carboxylate mit den erfindungsgemäßen Polypeptiden oder mit einem Wirtsmikroorganismus, der die erfindungsgemäße DNA-Sequenz enthält. Eine spezielle Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die enzymatische Synthese von Ammoniumadipat oder von Ammonium-5-cycanovalerat durch Hydrolyse von Adiponitril mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Polypeptids oder eines erfindungsgemäßen Mikroorganismus.
Es ist bekannt, daß Ammoniumadipat ein besonders wichtiges Produkt ist, weil es in Adipinsäure umgewandelt werden kann, die ihrerseits in großem Umfang zur Herstellung von Nylon-6,6 verwendet wird.
Die enzymatische Hydrolyse von Dinitrilen wurde von zahlreichen Autoren beschrieben. Jedoch wurden die Hydrolysewege dieser Dinitrile in organischen Säuren nicht häufig beschrieben. Das theoretische Hydrolyseschema ist wie folgt:
NH = Nitrilhydratase
Ni = Nitrilase
A = Amidase
R = (CH&sub2;)n, wobei n eine ganze Zahl von 4 im Falle von Adiponitril ist.
In der Tat wird häufig festgestellt, daß bestimmte Wege privilegiert sind, und daß bestimmte Produkte sich nicht bilden oder auch nicht hydrolysiert werden.
Unter den Mikroorganismen, bei denen man die Existenz einer enzymatischen Aktivität, die diese Hydrolyse erlaubt, nachweisen konnte, können insbesondere genannt werden die Stämme der Gattung Fusarlum, die Succinonitril und Adiponitril ohne Angabe der Reaktionsprodukte abbauen [Goldlust et al., Biotechnol. and Application Biochem., 1989, 11, 581], die Stämme der Gattung Pseudomonas, die Adiponitril abbauen [Yanase et al., Agric. Biol. Chem., 1982, 46, 2925] und die Stämme der Gattung Rhodococcus, insbesondere Rhodococcus rodochrous NCIB 11 216, der Adiponitril in Adipinsäure hydrolysiert [Bengis-Garber et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 1989, 32, II] und auch Rhodococcus rodochrous K22, dessen Nitrilase die Hydrolyse von Adiponitril und Glutaronitril [Yamada et al., J. Bacteriol., 1990, 172 (9), 4807-4815] erlaubt, jedoch mit einem geringen Aktivitätsverhältnis, verglichen mit dem der Hydrolyse von aromatischen Nitrilen.
Folglich ist klar, daß die enzymatische Hydrolyse von Dinitrilen ziemlich komplex ist. In allen Fällen wird die erste CN-Funktion durch die Enzyme gut hydrolysiert, während die zweite Funktion in einigen Fällen überhaupt nicht oder dann mit einer sehr geringen Geschwindigkeit gegenüber anderen hydrolysiert wird.
Es wurde nun gefunden, daß es möglich ist, Nitrile in Carboxylate und insbesondere Dinitrile in Carboxylate oder Dicarboxylate vollständig und rasch zu hydrolysieren, wenn in geeigneter Weise ausgewählte Enzyme eingesetzt werden, die entweder als solche oder bevorzugt in Form von sie produzierenden rekombinanten Mikroorganismen verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft so nun neue Polypeptide mit einer Nitrilase-Aktivität, die aus einem Stamm von Comamonas testosteroni isoliert wurden. Genauer wurden diese Polypeptide durch Extraktion und Reinigung aus Kulturen von natürlichen oder rekombinanten Mikroorganismen hergestellt, wobei die Reinigung durch eine Aufeinanderfolge von Stufen, bestehend aus der Herstellung eines enzymatischen Extrakts aus der Zellkultur, der Fällung dieses Extrakts mit Ammoniumsulfat und der Reinigung durch verschiedene Stufen der Chromatographie und der Gelfiltration durchgeführt wurde. Diese Stufen, bei denen einem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannte Methoden eingesetzt werden, werden in den nachstehenden erläuternden Beispielen ausführlich beschrieben.
Unter Nitrilaseaktivität wird in der vorliegenden Beschreibung die direkte Umwandlung eines Nitrils in Ammoniumcarboxylat bezeichnet, wobei das entsprechende Amid kein Substrat des Enzyms ist.
Weiterhin betrifft die Erfindung eine DNA-Sequenz, die ein Polypeptid mit Nitrilase-Aktivität codiert. Die DNA-Sequenz, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert, kann ausgewählt werden aus:
- der DNA-Sequenz, die ein Polypeptid mit einer Nitrilase- Aktivität codiert, wie in Figur 4 dargestellt ist und als SEQ ID NO : 4 in dem beigefügten Sequenzprotokoll bezeichnet wird,
- einem Analogon dieser Sequenz als Folge der Degeneriertheit des genetischen Codes,
- oder auch einer DNA-Sequenz, die mit einer dieser Sequenzen oder mit einem Fragment davon hybridisiert und ein Polypeptid mit Nitrilase-Aktivität codiert.
Eine derartige DNA-Sequenz kann durch Clonieren des genomischen DNA-Fragments, das das gewünschte Polypeptid codiert, mit Hilfe von Nukleotidsonden, die, ausgehend von dem gereinigten Polypeptid, hergestellt wurden, erhalten werden.
Die Erfindung betrifft auch Expressionskassetten, die die vorstehend definierte rekombinante DNA-Sequenz zusammen mit Signalen, die deren Expression gewährleisten, tragen. Diese Expressionskassetten können entweder in das Genom des Wirts eingebaut sein oder auf einem Expressionsvektor, wie einem Plasmid, das einen Selektionsmarker enthält, lokalisiert sein.
Diese Expressionskassetten umfassen insbesondere Startregionen für die Transkription und die Translation, die eine Ribosomenbindungsstelle und eine Promotorsequenz enthalten. Diese Regionen können für den Mikroorganismus, der natürlicherweise das Polypeptid produziert, homolog oder heterolog sein.
Die Wahl dieser Regionen hängt insbesondere von dem verwendeten Wirt ab. Insbesondere kann, wenn es sich um prokaryotische mikrobielle Wirte handelt, der heterologe Promotor aus starken bakteriellen Promotoren ausgewählt sein, wie dem Promotor des Tryptophanoperons Ptrp von E. coli, dem Promotor des Lactoseoperons Plac von E. coli, dem rechten Promotor des Phagen lambda PR, dem linken Promotor des Phagen lambda PL, den starken Promotoren von Pseudomonas und Comamonas, den starken Promotoren von Corynebakterien.
Insbesondere kann im Falle des rechten Promotors des Phagen lambda die thermosensible Form PRCIts bevorzugt sein. Im Falle von eukaryotischen Mikroorganismen, wie Hefen, können die Promotoren aus glykolytischen Hefegenen stammen, wie den Genen, die die Phosphoglyceratkinase (PGK), die Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GPD), die Lactase (LAC4), die Enolase (ENO) codieren.
Bezüglich der Ribosomenbindungsstellen werden diejenige, die von dem Gen CII von Lambda abgeleitet ist, sowie diejenigen, die von homologen Genen von Comamonas oder Pseudomonas abgeleitet sind, oder diejenigen, die von Genen von Corynebakterien abgeleitet sind, bevorzugt, wenn der Wirtsmikroorganismus prokaryotisch ist.
Eine Region, die die Termination der Translation und der Transkription erlaubt und in dem in Betracht gezogenen Wirt funktionell ist, kann 3' der codierenden Sequenz positioniert werden. Die Expressionskassette umfaßt auch einen oder mehrere Marker, der/die die Selektion des rekombinanten Wirts erlaubt/erlauben. Die bevorzugten Marker sind dominante Marker, d.h. solche, die Resistenz gegenüber Antibiotika, wie Ampicillin oder Streptomycin oder anderen toxischen Produkten, verleihen.
Unter den verwendeten Mikroorganismen können insbesondere Enterobakterien, wie E. Coli, Bakterien der Gattungen Comamonas oder Pseudomonas, coryneforme Bakterien, wie diejenigen der Gattungen Corynebakterium, Brevibacterium oder Rhodococcus genannt werden.
Die Erfindung betrifft auch die Mikroorganismen, die die erfindungsgemäße rekombinante DNA-Sequenz, beispielsweise auf einem Plasmid mit einem Selektionsmarker, enthalten.
Ein rekombinanter Mikroorganismus, der die DNA-Sequenz auf einer Plasmidstruktur enthält, wurde bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C.N.C.M.) (Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, Paris) unter der Hinterlegungsnummer I-1242 am 21. Juli 1992 hinterlegt. Dieser Mikroorganismus ist der Stamm E. coli TGL, der das Plasmid pXL2148 enthält; dieser Mikroorganismus wurde von der Anmelderin auch mit dem Bezugszeichen G4207 bezeichnet.
Die Erfindung betrifft auch Mikroorganismen, die Nitrile in Carboxylate und insbesondere aliphatische Dinitrile der Formel NC - R - CN, worin R ein linearer oder verzweigter Alkylenrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, in Carboxylate umwandeln können.
Abgesehen vom Erwerb ihrer Strukturen I und II während ihrer Synthese durch die erfindungsgemäßen Mikroorganismen, ist es wichtig, daß die betrachteten Polypeptide sich in ihren Strukturen III und IV so stabilisieren, daß sie mit einer optimalen Nitrilase-Aktivität versehen werden.
Es ist das Verdienst der Anmelderin, Mittel zur Begünstigung der vorstehend genannten Stabilisierung gefunden zu haben.
So enthält jeder erfindungsgemäße Mikroorganismus bevorzugt
- mindestens ein proteinisches Hilfsmittel zur Faltung der Polypeptide, die er synthetisiert, und insbesondere der Nitrilase, die in dem vorliegenden Text betrachtet wird,
- und/oder Gene, die ein derartiges Mittel codieren, wobei dieses Mittel in einer Menge vorhanden ist, die größer als diejenige ist, die der Grundmenge des in Betracht gezogenen Mikroorganismus entspricht.
Unter Grundmenge wird erfindungsgemäß die maximale Menge verstanden, die von dem entsprechenden, in Betracht gezegenen Wildmikroorganismus erzielt werden kann.
Vorteilhafterweise ist dieses Mittel das Chaperon GroE von E. coli oder das dazu homologe Molekül eukaryotischen oder prokaryotischen Ursprungs.
Das Chaperon GroE von E. coli ist normalerweise in den Wildstämmen vorhanden.
Die Gene, die das Mittel codieren, sind auf dem Chromosom oder auf einem extrachromosomalen Element (Plasmid, Phage) vorhanden. Es ist bevorzugt, sie durch jedes bekannte und geeignete Mittel zu amplifizieren, um die Synthese des Mittels in dem Mikroorganismus zu begünstigen.
Die Gene, die das Mittel codieren, stehen unter der Steuerung von für ihren Wirtsmikroorganismus homologen oder heterologen Expressionssystemen.
Die Erfindung betrifft auch das Verfahren zur Transformation von Nitrilen in Carboxylate mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Polypeptids oder eines dieses produzierenden rekombinanten Mikroorganismus. Bei diesem Verfahren wird das zu transformierende Nitril mit einem Polypeptid oder einem rekombinanten Mikroorganismus, wie vorstehend definiert, in Kontakt gebracht. Es wird im allgemeinen bei Umgebungstemperatur gearbeitet. Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung wird das Polypeptid oder der rekombinante Mikroorganismus auf oder in einem festen Träger immobilisiert.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zur Transformation von Nitrilen in Carboxylate und ganz besonders zur Transformation von Dinitrilen der Formel NC - R - CN, worin R ein linearer oder verzweigter Alkylenrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, in Carboxylate.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich besonders zur enzymatischen Synthese von Ammoniumadipat aus Adiponitril.
Die folgenden Beispiele erlauben die Erläuterung der charakteristischen Eigenschaften und Vorteile der vorliegenden Erfindung, ohne ihren Umfang zu beschränken.

BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Figur 1 zeigt die Ausbeute (%) der Hydrolyse von Adiponitril in Cyanovalerat (Kurve a) und in Ammoniumadipat (Kurve b) als Funktion der Reaktionszeit in Stunden für den Stamm Comamonas testosteroni sp.
Die Figuren 2a und 2b zeigen Restriktionskarten der Plasmide pXL2075 und pXL2076.
Die Figur 3 zeigt die Restriktionskarte des Fragments SstI-SstI mit 4,1 kb, das die DNA-Sequenz (in der Figur als Nitrilasegen bezeichnet) enthält, die das erfindungsgemäße Polypeptid mit Nitrilase-Aktivität codiert, wobei das Fragment in den Plasmiden pXL2075 und pXL2076 vorhanden ist. Die Strategie zur Ausarbeitung des Fragments XbaI-SstI, das die erfindungsgemäße DNA-Sequenz enthält, ist ebenfalls in dieser Figur dargestellt.
Die Figur 4 zeigt die Sequenz SEQ ID NO : 4 der erfindungsgemäßen DNA mit der davon abgeleiteten Aminosäuresequenz.
Die Figur 5 zeigt die Restriktionskarte des Plasmids pXL2087.
Die Figur 6 zeigt die Restriktionskarte des Plasmids pXL2148.
Die Figur 7 zeigt die SDS-PAGE-Gelelektrophorese mit 10% SDS, die die Expresslon der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz in dem Stamm E. coli TG1/pXL2072 zeigt. Jede Bahn entspricht einer Proteinmenge von 60 µl Kultur mit einer optischen Dichte bei 610 nm von 3.
Die Figur 8 zeigt die Restriktionskarte des Plasmids pXL2158.
Die Figur 9 zeigt die SDS-PAGE-Gelelektrophorese mit 12,5% SDS, die die Expression der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz in den Stämmen TGL/pXL2158 und TG1/pxL215B + pXL2035 (GroE) zeigt.
Die Figur 10 zeigt die Restriktionskarte des Plasmids pXL2169.
Die Figur 11 zeigt die SDS-PAGE-Gelelektrophorese mit 10% SDS, die die Expression der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz in dem Stamm Pseudomonas putida G2081 - pXL2169 zeigt.
Die in der folgenden Beschreibung verwendeten Abkürzungen besitzen die nachstehenden Bedeutungen:
SSC: Gegenwärtig für Hybridisierungen verwendeter Puffer; er enthält Natriumcitrat und NaCll (20XSSC = 3 M NaCl, 0,3 M Natriumcitrat, pH 7)
SDS: Natriumdodecylsulfat
FPLC: Flüssigchromatographie, die im Englischen als fast protein liquid chromatography bezeichnet wird
SDS-PAGE: Gelelektrophorese auf der Grundlage von Natriumdodecylsulfat und Polyacrylamid
IPTG: Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid

BEISPIELE

BEISPIEL 1: Reinigung der Nitrilase von Comamonas testosteroni sp.

1 - Herstellung der Zellen:

Ein Stamm von Gemamonas testosteroni sp. wurde in einem gerührten Kolben bei 28ºC 15 ½ Stunden in dem Medium A mit der folgenden Zusammensetzung gezüchtet:

Medium A

- Glucose 5 g/l
- (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 1 g/l
- Na&sub2;HPO&sub4; 5,24 g/l
- KHPO&sub4; 2,77 g/l
- Hefeextrakt 5 g/l
- Casaminosäuren 1 g/l
Diese Vorkultur diente der Beimpfung eines 20 l-Fermentersl der 15 l Medium A enthielt. Der pH-Wert, die Temperatur, die Luftzufuhr und die Rührgeschwindigkeit wurden jeweils auf 6,6, 28ºC, 300 l/h und 350 UpM eingestellt. Nach 24 Stunden wurden 84 g feuchte Zellen gewonnen. Dies entspricht einem Gehalt an Trockengewicht von Zellen von 0,9 g/l und mit einer optischen Dichte bei 660 nm (OD660nm) von 2.

2 - Bestimmung der enzymatischen Aktivität gegenüber Adiponitril

Ein Zellpellet, das 13,1 mg Trockengewicht an Zellen enthielt, wurde in 2 ml einer Suspension aus 52,3 mM Adiponitril in 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7, suspendiert. Die Reaktion wurde bei 25ºC unter Rühren durchgeführt, und die Kinetik wurde durch Probenahmen verfolgt. In jeder entnommenen Probe wurden mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) 5-Cyanovaleramid, Adipamid, 5-Cyanovalerat, Adipamat und Adipat bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Figur 1 zusammengestellt, die die Ausbeutekurven (als Ordonaten) an Cyanovalerat (Kurve a) und an Ammoniumadipat (Kurve b) zeigt. Die Geschwindigkeit der Bildung von Cyanovalerat und Adipat lag über 0,45 bzw. betrug 0,15 E/mg Zelltrockengewicht (1 E entspricht 1 µmol pro Minute gebildetem Produkt).

3 - Reinigung

Alle Reinigungsstufen wurden in einem Puffer aus 50 wM Tris/HCl, pH 7,5, 1 mM Dithioerythrit (DTE) durchgeführt, außer anders angegeben. In jeder der Stufen wurde die Nitrilase-Aktivität der Fraktionen bei pH-Wert 7 und bei 25ºC in dem 10 mM Phosphatpuffer in Gegenwart von 10 mM Adiponitril bestimmt. Die Proteinkonzentration der Pools wurde mit dem Coomassieblau-Verfahren (Kit PIERCE Proteinassay) bestimmt. Die Proteine wurden mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Phastsystem PHARMACIA ) analysiert. Die Arbeitsschritte jeder der Stufen sind nachstehend näher beschrieben.

Stufe 1: Rohextrakt

57 g feuchte Zellen wurden in 85 ml-Puffer aufgenommen und 30 min lang mit Ultraschall behandelt (Sonicateur VI- BRACELL von Bioblock: Sonde 13 mM; Stärke 7; 40% des ganzen Zyklus). Die OD660nm veränderte sich so von 97 auf 60. Nach Zentrifugation mit 48.000 g Maximum während 60 min wurde der Überstand gewonnen.
Dieser Überstand wurde durch stufenweise Zugabe von Ammeniumsulfat auf eine 15%ige Sättigung gebracht. Nach 1 h wurde die Suspension 30 min bei 30.000 g Maximalbeschleunigung zentrifugiert. Der Überstand wurde auf 50%ige Sättigung gebracht. Nach 1 h wurde die Suspension unter den gleichen Bedingungen zentrifugiert, das Präzipitat wurde gewonnen, anschließend gegen Puffer für 2 Tage dialysiert.

Stufe 2: Ionenaustauschsäule (Q Sepharose Fast Flow)

Die dialysierte Fraktion wurde mit einem Durchfluß von 125 ml/h auf eine Säule (26 x 380 mm) aus Q Sepharose Fast Flow aufgebracht, die mit dem Puffer mit einer Geschwindigkeit von 250 ml/h äquilibriert wurde. Die Säule wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 250 ml/h sukkzessive mit den folgenden Lösungen gespült:
- 166 ml Puffer
- 180 ml eines Gradienten von 0 auf 0,2 M KCl in dem Puffer
- 180 ml Puffer, versetzt mit 0,2 M KCl
- 270 ml eines Gradienten von 0,2 auf 0,4 M KCl in dem Puffer
- 180 ml Puffer, versetzt mit 0,4 M KCl
- 200 ml Puffer, versetzt mit 1 M KCl.
Die Fraktion mit Nitrilase-Aktivität wurde in einem Volumen von 129 ml im Verlauf des Stufengradienten bei 0,2 M KCl eluiert.
Die folgenden Stufen wurden an dem FPLC-System (Pharmacia ) durchgeführt.

Stufe 3: Gelfiltration (FPLC Superdex 200)

Die vorstehend erhaltene Fraktion mit der Nitrilase-Aktivität (129 ml) wurde bis aus 12 ml durch Fällen der Proteine mit Ammoniumsulfat in einer 80%igen Sättigung konzentriert, gefolgt von einer Dialyse gegen Puffer. Die so konzentrierte Fraktion (12 ml) wurde in 2 Gaben auf die Gelsäule (16 x 600 mm) aufgebracht, die mit dem Puffer, der mit 0,1 M KCl versetzt war, mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,8 ml/min äquilibriert worden war. Die Fraktionen mit einer Nitrilase-Aktivität wurden mit dem vorstehenden Puffer mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min und in einem Gesamtvolumen von 36 ml eluiert. Diese Fraktionen entsprechen einem Molekulargewicht von 280 kDa.

Stufe 4: Hydroxylapatitsäule (BIO-RAD HPHT ; 7,8 x 100 mm)

Die vorstehend erhaltenen Fraktionen wurden durch Ultrafiltration (Membran DIAFLO PM39 AMICON ) auf 8 ml eingeengt. Die konzentrierte Lösung wurde in die mit mit 10 µM CaCl&sub2; versetztem Puffer aquilibrierte Hydroxylapatitsäule injiziert. Die Säule wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min sukkzessive mit
- 5 ml Äquilibrierungspuffer,
- 15 ml Kaliumphosphatgradient von 0 auf 350 mM in Äquilibrierungspuffer,
- 10 ml Äquilibrierungspuffer, versetzt mit 350 mM Kaliumphosphat,
gespült.
Die Fraktionen mit Nitrilase-Aktivität eluierten zwischen 62 und 135 mM in Kaliumphosphat in einem Volumen von 3 ml.

Stufe 5: Hydrophobe Wechselwirkungssäule (PFLC-Phenyl Superose HR 5/5)

Die vorstehend erhaltenen aktiven Fraktionen, die auf 15% Ammoniumsulfatsättigung gebracht wurden, wurden mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,15 ml/min auf die Säule aufgetragen, die mit einem Puffer, der Ammoniumsulfat in einer 15%igen Sättigung enthielt, äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit
- 6 ml Äquilibrierungspuffer,
- 12 ml eines abnehmenden Ammoniumsulfatgradienten von 15% auf 0% der Sättigung an Ammoniumsulfat in dem Puffer,
- 23 ml Puffer
gespült.
Ein Teil der Fraktionen mit Nitrilase-Aktivität wurde während des Waschens der Säule mit dem Äquilibrierungspuffer eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden unter den gleichen Bedingungen erneut injiziert. Dieser Arbeitsschritt wurde zweimal durchgeführt. Die aktiven Fraktionen, die nach dem Gradienten eluieren, wurden vereinigt (Volumen 51 ml).

Stufe 6: Gelfiltration (FPLC-Superdex 200)

Die 51 ml wurden auf 3 ml durch Ultrafiltration über eine Membran (AMICON DIALFO PM30) konzentriert. Diese 3 ml wurden auf die Säule (16 x 600 mm) geladen, die mit mit 0,1 M KCl versetztem Puffer äquilibriert worden war. Die 9 ml, die Aktivität enthielten, wurden bei einer Position entsprchend einem Molekulargewicht von 280 kDa eluiert. Diese Lösung wurde auf 36% Glycerin gebracht, dann 15 Tage lang eingefroren.

Stufe 7: Ionenaustauschsäule (FPLC Mono Q HR 5/5)

Die Proteinlösung wurde aufgetaut und auf die Säule geladen, die mit 0,1 M KCl enthaltendem Puffer mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min äquilibriert worden war. Die Säule wurde sukkzessive mit
- 15 ml zu 0,5 ml/min mit 0,1 M KCl versetzter Puffer,
- 4,5 ml zu 1 ml/min mit 0,1 M KCl versetzter Puffer,
- 15 ml zu 1 ml/min KCl-Gradient von 0,1 bis 0,4 M in dem Puffer,
- 10 ml mit 0,4 M KCl versetzter Puffer
gespült.
Die aktiven Fraktionen eluierten zwischen 0,15 und 0,3 M KCl. Diese Fraktionen sind homogen. In der SDS-PAGE-Analyse sind zwei sehr enge Banden von 38 und 39 kDa sichtbar. Die so erhaltenen Fraktionen werden nachstehend als gereinigte Nitrilase bezeichnet.
Die Daten jeder der vorherigen Reinigungsstufen sind in der nachstehenden Tabelle 1 zusammengestellt: TABELLE 1: Reinigung von Nitrilase von Comamonas testosteroni sp.
ABKÜRZUNGEN: PF = Reinigungskoeffizient; E = 1 µmol/h.

4. Bestimmung der N-terminalen Sequenz der Nitrilase

Aus dem gereinigten Protein wurde die N-terminale 27 Aminosäuren lange Sequenz durch stufenweisen automatischen Edman-Abbau unter Verwendung eines Applied Biosystems Model 470 A-Geräts bestimmt. Diese Sequenz, die als SEQ ID NO : 1 in dem beigefügten Sequenzprotokoll bezeichnet ist, lautet wie folgt:
Die Recherche in Sequenzbanken erlaubte das Auffinden einer Identität von 53% mit Nitrilase von Klebsiella pneumoniae, die an Bromoxynil aktiv ist, das Gegenstand der Patentanmeldung EP 373 173 ist.

5 - Aktivität der gereinigten Nitrilase

a) Einfluß des pH-Werts auf die Nitrilase-Aktivität:

Die gereinigte Nitrilase wurden bei verschiedenen pH-Werten an zwei Substraten, Adiponitril und 5-Cyanovalerat, unter den in der nachstehenden Tabelle 2 angegebenen Bedingungen getestet. TABELLE 2: Aktivität der gereinigten Nitrilase als Funktion des pH-Werts auf Adiponitril und Cyanovalerat
Gemeinsame Bedingungen: [Substrat] = 10 mM; Puffer 10 mM; TºC 25;
[Nitrilase] 12 µg/ml für Cyanovalerat und 3 µg/ml für Adiponitril (Fraktion der Stufe 6);
E (Adiponitril) = µmol gebildetes Cyanovalerat/h, E (Cyanovalerat) = µmol gebildetes Adipat/h

b) Aktivitätsspektrum der gereinigten Nitrilase

Die Aktivitäten der gereinigten Nitrilase wurden an Adiponitril-5-Cyanovaleramid, 5-Cyanovaleriansäure, Benzonitril, Propionitril, Acrylnitril gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben. TABELLE 3: Relative Aktivität der gereinigten Nitrilase auf verschiedene Nitrile
Gemeinsame Bedingungen: Acetatpuffer: 10 mM pH 4; Substrat 10 mM;
Volumen = 3 ml; T = 25ºC; Reaktionsdauer 1 oder 3 h; Proteine: von 5 bis 30 µg/ml.

BEISPIEL 2: Clonierung der Nitrilase von Comamonas testosteroni sp.

Ausgehend von der NH&sub2;-terminalen Sequenz von Beispiel 1 wurde eine Nukleotidsonde synthetisiert. Der erhöhte GC- Prozentsatz der Stämme von Comamonas, die in der Literatur beschrieben sind (Tamaoka et al., Int. J. Syst. Bacteriol., 1987, 37, 52-59) diktierte eine Wahl für die dritte Position des Codons im Falle der Lysine und im Falle von Valin. Die Sonde ist ein 26meres, das 128fach degeneriert ist (in der Nukleotidbasensequenz steht N für A, C, G oder Aminosäuren Nukleotidbasen Varianten
Die vorstehend angegebene Aminosäuresequenz MKNYPTVKV entspricht SEQ ID NO : 2 in dem beigefügten Sequenzprotokoll.
Die verfolgte Strategie bestand zuerst in der Bestätigung der Spezifität dieser Nukleotidsonde und in der Bestimmung der Natur der clonierenden genomischen DNA-Fragmente. In Kürze, die genomische DNA von Comamonas testosteroni sp. wurde mit mehreren Restriktionsenzymen (SstI, SphI, BamHI, PstI ...) entsprechend den für die Clonierung verwendbaren Stellen gespalten.
Nach der Elektrophorese auf Agarosegel und der Überführung auf eine Nylonmembran wurden die verschiedenen Spaltansätze mit der Sonde hybridisiert. Es wurde festgestellt, daß die Sonde eine ausreichende Spezifität unter den verwendeten Hybridisierungsbedingungen hatte (Hybridisierungspuffer = 5x SSC, 5x Denhardt, 0,1% SDS, 50 mM Na&sub3;PO&sub4; pH 6,5, 250 µg/ml ssDNA; Hybridisierungstemperatur 50ºC. Waschbedingungen: 1 h, 6x SSC, Umgebungstemperatur und 5min in 2x SSC, 0,1% SDS bis 50ºC).
Unter diesen Bedingungen erlaubt die Sonde den Erhalt von wesentlichen Signalen und ohne Ambiguität, insbesondere im Falle der Spaltungen mit SstI, SphI, BamHI und PstI. Die Hybridisierungsbahnen zeigen insbesondere die Existenz eines einzigartigen SstI-SstI-Fragments von etwa 4 kb. Um dieses Fragment zu donieren, wurden die Fragmente zu 3,5 bis 4,5 kb einer SstI-Spaltung der genomischen DNA auf einer präparativen Agaroseelektrophorese und mit Elektroelution gereinigt, anschließend in das Plasmid pUC19 (YANISCH et al., Gene 33 (1985) 103) ligiert, das als solches mit SstI gespalten worden war. Nach Transformation in den Stamm DH5α (Clontech Laboratory, Palo Alto, Kalifornien) wurden 600 weiße Clone auf LB amp X-gal (SAMBROOK et al., Molecular Cloning. A laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Presse, Cold Spring Harbor Laberatory N.Y. 1989) erneut vereinzelt, auf Nylonmembran überführt, anschließend durch Hybridisierung mit der Sonde, die zur Hybridisierung des Southern Blots diente und unter den gleichen Stringenzbedingungen analysiert. Es stellte sich dadurch heraus, daß sechs Clone sehr stark mit der Sonde hybridisierten. Zwei Clone, in die das gleiche Fragment von etwa 4,1 kb in beiden Orientierungen insertiert war (pXL2075 [Figur 2a] und pXL2076 [Figur 2b]) wurden weiter ausführlicher analysiert (Restriktionskartierung, Teilsequenzierung unter Verwendung der Sonde als Starter und Southern Blot). Es konnte so gezeigt werden, daß der 5'-Anteil des Gens, der mit der Sonde hybridisiert, auf einem etwa 150 bp großen XhoI-XbaI- Fragment in der Richtung XhoI gegen XbaI orientiert ist. Die Figuren 2a und 2b zeigen die Restriktionskarten dieser Plasmide.

BEISPIEL 3: Sequenz eines 1194 bp großen Fragments, das die DNA enthält, das das Polypeptid mit Nitrilase-Aktivität codiert

Die Lokalisierung des 1194 bp großen Fragments, das das sequenzierte Nitrilasegen enthält, auf der donierten Insertion ist in Figur 3 gezeigt. Das Sequenzierschema dieses Fragments wurde nach einem Fachmann bekannten klassichen Methoden durchgeführt und ist ebenfalls in Figur 3 angegeben. Verschiedene Sequenzen wurden alle durch das Kettenabbruchverfahren erhalten (Sequenasekit in Gegenwart von 7-deaza-DGTP, (³&sup5;S)dATP, entweder an einzelsträngigen Matrizen von rekombinantem M13 (mp 18 oder 19, siehe YANISCH et al., a.a.O.), der Subfragmente trägt, oder direkt in dem Plasmid pXL2075). Mehrere spezifische Starter wurden zu diesem Zweck ebenfalls synthetisiert.
Die erfindungsgemäße DNA-sequenz, SEQ ID NO : 4 ist in Figur 4 dargestellt. Der mittlere Prozentsatz an G + C der so erhaltenen Sequenz beträgt 45,7%, was unter dem Prozentsatz G + C von 61,5%, der für andere Comamonas-Stämme beschrieben ist (Tamaoka et al., a.a.O.) liegt. Eine Analyse der so erhaltenen Sequenz erlaubt die Charakterisierung eines offenen Leserasters von 1064 bp, das nachstehend als nit-Gen bezeichnet wird, das ein Polypeptid aus 354 Resten, entsprechend einem Molekulargewicht von 38.725 Da, codiert. Die Aminosäuresequenz dieses Peptids ist in SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5 des beigefügten Sequenzprotokolls und in Figur 4 gezeigt. Dieses Polypeptid umfaßt die NH&sub2;-terminale Sequenz, die zur Sythese der Sonde verwendet wurde, sowie drei interne Sequenzen, die an Trypsinfragmenten der gereinigten Nitrilase bestimmt wurden (diese internen Sequenzen sind in Figur 4 unterstrichen).
So gibt dieses offene Leseraster die erfindungsgemäße DNA- Sequenz wieder.

BEISPIEL 4: Homologie mit anderen Proteinen, Identifikation der homologen Sequenz

Die erfindungsgemäße DNA-Sequenz wurde mit der Gesamtheit der Sequenzen der Proteinbank NBRF verglichen; nur eine signifikante Homologie wurde mit der Nitrilase von Klebsiella ozaenae festgestellt, die für das Herbizid Bromoxynil (Stalker et al., J. Biol. Chem., 1988, 263, 6310-6314) spezifisch ist. Die zwei Nitrilasen zeigen eine strikte Homologie von 34,9%, verteilt auf 320 Aminosäuren. Außerdem zeigt dieses Protein eine 34,4%ige strikte Homologie, verteilt auf 312 Aminosäuren mit der Nitrilase von Arabidopsis, die für 3-Indolacetonitril spezifisch ist [Bartling & al., Eur. J. Biochem., 205, 417-424, 1992].

BEISPIEL 5: Expression der Nitrilase in E. coli

Um die Identifikation des Rasters, das die gereinigte Nitrilase codiert, zu bestätigen, wurde das nit-Gen, dem seine eigene Ribosomenbindungsstelle vorausgeht, unter die Kontrolle des Promotors des Lactoseoperons von E. coli gemäß dem nachstehend beschriebenen Verfahren gegeben. Das Plasmid pXL2087, das in Figur 5 beschrieben ist, wurde durch Insertion des XhoI-NcoI-Fragments, das von dem Plasmid pXL2075 abgeleitet ist, zwischen die entsprechenden Stellen des Vektors pMTL25 (Chambers et al., Gene, 1988, 68, 139-149) erhalten. Dieses Plasmid enthält so den Promotor des Lactoseoperons Plac, gefolgt von der Ribosomenbindungsstelle und dem Strukturgen der Nitrilase sowie einem Gen, das Ampicillinresistenz verleiht.
Die Expression der Nitrilase wurde bei dem Stamm E. coli TG1, der das Plasmid pXL2087 enthält, sichtbar gemacht. Dazu wurden der Stamm TG1/pXL2087 sowie der Kontrollstamm TGL/pUC19 16 h in LB-Medium bei 37ºC (Miller, J.H. 1972, Experiments in Molecular Genetics - Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.), das 100 µg/ml Ampicillin enthält, und schließlich 10fach in dem gleichen Medium und bei der gleichen Temperatur verdünnt wurde, gezüchtet. Als die Kulturen einen OD&sub6;&sub1;&sub0;-Wert zwischen 0,5 und 1 erreicht hatten, wurde IPTG in einer Endkonzentration von 1 mM zugesetzt. Nach 2stündiger Kultur wurden die Bakterien gewonnen.
Die Expression der Nitrilase wurde nach Beschallen der Zellen in einem SDS-PAGE-Gel, in der Rohfraktion oder nach Zentrifugation in dem Bodensatz und im Überstand gemessen. Die Ergebnisse sind in Figur 7 dargestellt und zeigen eine erhöhte Expressionshöhe der Nitrilase in den in Gegenwart von IPTG gezüchteten Zellextrakten. Jedenfalls liegt dieses Protein im wesentlichen in unlöslicher Form vor.
In Figur 7 bezeichnet M den Molekulargewichtsmarker; diese sind in kDa angegeben. Andererseits besitzen die Bahnen die nachstehenden Bedeutungen:
Aus dem Plasmid pXL2087 wurde das Plasmid pXL2148 durch Insertion des XhoI-EcoRI-Fragments des Plasmids pXL2087, das das Gen, das Nitrilase codiert, trägt, zwischen die SalI- und EcoRI-Stellen von pBR322 hergestellt [SUTCLIFFE Nucleic Acid Res. 5, (1978): 2721-2730].
Dieses Plasmid pXL2148, dessen Restriktionskarte in Figur 6 dargestellt ist, wurde auch zur Transformation des Stamms E. coli TG1 nach dem Calciumchloridverfahren verwendet. Die Selektion von Mikroorganismen erfolgte auf Ampicillin. Der so transformierte Stamm E. coli TG1 (pXL2048) (G4207) wurde bei der Collection Nationale de Cultures des Micro-organismes in Paris (Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux) unter der Hinterlegungsnummer I- 1242 am 21. Juli 1992 hinterlegt. Andere Expressionssysteme wurden verwendet, um Nitrilase in einem rekombinanten Mikroorganismus zu produzieren.
Zuerst wurde das nit-Gen in E. coli hinter dem Promotor des Tryptophanoperons von E. coli unter der Steuerung von RBS des CII-Gens des Phagen λ exprimiert. Dazu wurde eine NdeI-Restriktionsspaltstelle auf dem Initiationscodon von nit erzeugt, und das NdeI/AhaII-Fragment zu 117 bp, das den 5'-Teil des nit-Gens enthält, wurde mit der PCR-Technik aus pXL2087 amplifiziert. Ein NdeI/XbaI-Fragment zu 61 bp, erhalten nach Spaltung des ersten Fragments, wurde an das EcoRI/NdeI-Fragment, das den Promotor des Tryptophanoperons von E. coli und die Ribosomenbindungsstelle des CII-Gens des Bakteriophagen λ (Ptrp-RBSCII) enthielt, zwischen die Stellen EcoRI und XbaI von pUC19 ligiert (Yanisch et al., Gene 33 (1985), 103), um zu dem Plasmid pXL2149 zu gelangen. Das EcoRI/XbaI-Fragment von pXL2149, das den 5'- Teil von nit hinter Ptrp-RBSCII enthielt, wurde mit dem Fragment XbaI/SalI von pXL2087, das den 3'-Teil des nit- Gens enthielt, zwischen die EcoRI und SalI-Stellen von pXL642 ligiert (Mayaux, Ergebnisse nicht veröffentlicht): pXL642 ist ein Derivat von pXL534 (Latta et al., 1990, DNA Cell Biol., 9, 129), in dem das überexprimierte Gen einen Gewebsinhibitor von Metallproteasen codiert und in dem die HindIII-Stelle stromabwärts des überexprimierten Gens durch eine EcoRI/HindIII-Mehrfachstelle von M13mp18 ersetzt wurde.
Das abschließend erhaltene Plasmid pXL2158 ist nun ein Derivat von pBR322 (Sutcliffe, Nucleic Acid Res. 5, (1978): 2721), das ein Gen, das Ampicillinresistenz verleiht und das nit-Gen unter der Kontrolle von Ptrp-RBSCII enthält. Die Restriktionskarte dieses Plasmids pXL2158 ist in Figur 8 dargestellt.
Das Plasmid pXL2158 wurde zur Transformation des Stamms E. coli TG1 verwendet. Der Stamm TG1/pXL2158 sowie der Kontrollstamm TG1, der den Vektor pMTL22 enthielt, wurden 16 h lang in M9-Glucosemedium bei 30ºC (Miller, J.H. 1972. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.), das 100 µg/ml Ampicillin und 100 µg/ml Tryptophan enthielt, gezüchtet. Diese Kulturen wurden 100fach in dem gleichen Medium in Abwesenheit von Tryptophan verdünnt und 6 h lang bei der gleichen Temperatur gezüchtet.
Die Expression der Nitrilase von Comamonas testosteroni NI 1 wurde nach Beschallen der Zellen auf einem 12,5%igen SDS-PAGE-Gel in der Rohfraktion oder nach Zentrifugation in dem Bodensatz und dem Überstand gemessen. Die Ergebnisse sind in Figur 9 dargestellt.
Man sieht auf dem Gel, daß pXL2158 eine starke Expression der Nitrilase hauptsächlich in unlöslicher Form induziert.
Die Wirksamkeit des Chaperons GroE wurde nun getestet (Hemmingsen et al., 1988. Nature 333: 330), um die korrekte Faltung der Nitrilase zu unterstützen. Dazu wurde das Plasmid pXL2035 wie folgt konstruiert. Das EcoRI/HindIII-Fragment zu 2,2 kb, das die Gene groES und groEL enthält, die die zwei Untereinheiten von GroE codieren, wurde von dem Plasmid pOF39 (Fayet et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202: 435) extrahiert und zwischen die EcoRI- und HindIII-Stellen des Vektors pDSK519 (Keen et al., 1988, Gene 70: 191) eingeschleust.
Das Plasmid pXL2035 wurde in den Stamm TG1 der pXL2158 enthielt, eingeschleust. Der so erhaltene Stamm wurde unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend in Gegenwart von 50 mg/l Kanamycin gezüchtet; die Ergebnisse der Expression sind in Figur 9 dargestellt. Daraus folgt, daß die Überexpression von GroE (nur die Untereinheit GroEL ist auf dem Gel sichtbar) einen Hauptteil der aus pXL2158 exprimierten Nitrilase solubilisiert.
Das gleiche Expressionssystem wurde verwendet, um Nitrilase in Pseudomonas putida zu produzieren. So wurden aus pXL2158 die NdeI/NcoI-Fragmente zu 1256 bp und die NcoI/BamHI-Fragmente zu 535 bp zwischen die NdeI- und BamHI-Stellen von pxL1841 eingeschleust. pxL1841 (Blanche et al., 1991, J. Bacteriol. 173:4637) ist ein Derivat von pKT230 (Bagdasarian et al., 1981. Gene. 15:237), das ein Gen von Methanobacterium ivanovii hinter Ptrp-RBSCII exprimiert.
Das abschließend erhaltene Plasmid pXL2169 ist nun ein Derivat von PKT230, das ein Gen enthält, das Kanamycinresistenz verleiht, und das nit-Gen unter der Kontrolle von Ptrp-RBSCII enthält (vergleiche Figur 10). Dieses Plasmid wurde in den Stamm von Pseudomonas putida G2081 eingeschleust. G2081 ist ein Derivat von Pseudomonas putida KT2440 (Bagdasarian and Timmis, 1981. In Hofschneid und Goebel. Topics in Microbiology and Immunology, 47, Springer Verlag. Berlin), das Nalidixin- und Rifampicin-resistent gemacht wurde. Der Vektor pDSK519 (Keen et al., 1988, Gene. 70: 191) wurde als Kontrollplasmid verwendet. G2081 (XL2169) und der Stamm G2081 (pDSK519) wurden über Nacht bei 30ºC in LB-Medium, das 20 mg/l Kanamycin enthielt, gezüchtet. Die Vorkulturen wurden bofach in dem gleichen Medium verdünnt. Die Kulturen wurden anschließend 7 h 30 min bei der gleichen Temperatur verfolgt. Die Expression der Nitrilase von Comamonas testosteroni NI 1 wurde nach Beschallen der Zellen auf einem 10% SDS-PAGE- Gel in der Rohfraktion oder nach Zentrifugation in dem Bodensatz und in dem Überstand gemessen. Die Ergebnisse sind in Figur 11 dargestellt. Nur der Rohextrakt des Stamms G2081 (pDSK519) wurde abgeschieden (Kavität D). Für den Stamm G2081 (pxL2169) wurden der Gesamtextrakt, der Bodensatz der Beschallung und der Überstand der Beschallung jeweils in den Kavitäten C, B und A abgeschieden. Aus diesem Versuch folgt, daß der Stamm Pseudomonas putida große Mengen an Nitrilase in löslicher Form exprimiert.

BEISPIEL 6: Bestimmung der Nitrilase-Aktivität von rekombinanten Stämmen

Die folgenden Beispiele erläutern die Nitrilase-Aktivität von rekombinanten Stämmen von E. coli TGL und Pseudomonas putida G2081.
Die verschiedenen, in diese Stämme integrierten Plasmide sind die folgenden.
Die Aktivitäten dieser Stämme, die induziert sind oder nicht, wurden an Adiponitril und 5-Cyanovalerat bei verschiedenen pH-Werten gemessen und mit negativen Kontrollstämmen verglichen: E. coli TG1, E. coli TG1 (pXL2035) und Pseudomonas putida G2081.

1 - Herstellung der Zellen:

Die Kulturen wurden unter den in Tabelle 4 beschriebenen Bedingungen hergestellt. Im Verlauf der exponentiellen Wachstumsphase wurde eine von zwei Kulturen des rekombinanten Stamms mit 1 mM IPTG induziert: nach 2 h bei 37ºC wurde diese Kultur behandelt. TABELLE 4: Kultur der Stämme
ABKÜRZUNGEN: a: LB-Medium; b: LB-Medium + 100 µg/ml Amp; c: Medium b + Zusatz von 1 mM IPTG bis zu einer OD660nm = 1; d: LB-Medium + 50 mg/l Kanamycin: e: M9-Medium + 100 mg/l Ampicillin + 50 mg/l Kanamycin; PS: Trockengewicht.
GEMEINSAME BEDINGUNGEN: 1 bis 3: Insemination von 1/100 aus einer 16 h alten Vorkultur; Kulturzeit 5,75 h; TºC = 37.
4 bis 8: Insemination von 1/100 aus einer 17 h alten Vorkultur bei 37ºC unter Zusatz von Tryptophan; Zeit der Fermentationskultur von 15 l: 23 h für E. coli und 7,5 h für P. putida; TºC = 30.

2 - Messung der spezifischen Aktivitäten:

Die Meßbedingungen der spezifischen Aktivitäten und die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengestellt. TABELLE 5: Bestimmung der Aktivitäten von Kontrollstämmen der rekombinanten Stämme
GEMEINSAME BEDINGUNGEN: [Substrat] = 50 µM; TºC = 25; Puffer 50 mM; Kinetik über 90 min für 1 bis 3 und über 120 min für 4 bis 8.
ABKÜRZUNGEN: E: ganze Zellen; S: beschaute Zellen; E: 1 µmol gebildetes Adipatih, außer (a) 1 µmol gebildetes 5-Cyanovalerat/h; Ua = µmol gebildetes Cyanovalerat/h/mg Zellen (Trockengewicht); Ub = mmol gebildetes Adipat/h/mg trockene Zellen; AdN: Adiponitril; CVA: 5-Cyanovalerat. PS: Trockengewicht

BEISPIEL 7: Synthese von Ammoniumadipat durch Hydrolyse von Adiponitril in einer charge durch E. coli (pXL2087) in Suspension.

Ein Anfangsvolumen von 50 ml 50 mM-Phosphatpuffer, pH 7, der den E. coli-Stamm (pXL2087) in einer Anfangskonzentration von 21 g/l enthielt, wurde bei 25ºC unter Rühren mit einem Magnetrührer mit 120 µl oder 1068 µmol Adiponitril bei 0, 1, 2, 3, 5, 6 und 7 h Reaktion versetzt. Die analytische Verfolgung wurde durch Probennahmen von 100 µl Reaktionsvolumen alle Stunden gewährleistet. Es wurde festgestellt, daß die Hydrolyse ohne nachweisbaren Verlust der Kinetik erfolgte. Die berechneten mittleren Aktivitäten auf 30 min nach dem Zusatz von Adiponitril sind in der nachstehenden Tabelle 6 zusammengestellt. TABELLE 6: Mittlere Aktivitäten der Zellen von E. coli (pXL2087) im Verlauf der Hydrolyse von Adiponitril

BEISPIEL 8: Synthese von Ammoniumadipat durch Hydrolyse von Adiponitril in einem Festbettreaktor mit an Harz immobilisiertem E. coli (pXL2087).

Die Zellen von E. coli (pXL2087) wurden zuerst gemäß der in dem Patent U.S. 4 732 851 beschriebenen Technik fixiert.
Der so erhaltene Biokatalysator wurde anschließend in einer Festbettsäule zur Hydrolyse von Adiponitril in Ammoniumadipat verwendet.

1 - Fixierung von E. coli (pXL2087) auf dem Harz

Die Zellen wurden gemäß dem folgenden Protokoll fixiert:
- 1 g (Feuchtgewicht) von E. coli (pXL2087) in einer Konzentration von 22% Trockenmasse,
- 1 g Polyazetidin POLYCUP,
- 1 g Harz DUOLITE A 171.
Ein Gramm Zellen wurden in einer Polyazetidinlösung suspendiert. Nach Homogenisierung wurde das Harz mit der Zellsuspension gespült. Alles wurde mit einem Spatel gerührt, anschließend 18 h lang unter freiem Luftzutritt unter einem Abzug zum Trocknen stehengelassen. Es wurden so 4 ml oder 1,3 g Biokatalysator gewonnen. Die Aktivitäten der immobilisierten und freien Zellen wurden bei 25ºC, pH 7, an einer 50 mM Adiponitrillösung bestimmt. Sie betragen jeweils 30 und 110 µmol 2-Cyanovalerat/h/mg Zellen (Trockengewicht). Daraus folgt eine Bindungsausbeute von 26%.

2 - Hydrolyse von Adiponitril in einem Festbettreaktor:

Die Bestimmung der Halbwertszeit wurde in einem Festbettreaktor, der kontinuierlich unter den folgenden Bedingungen beschickt wurde, durchgeführt:
TºC = 28; Katalysator 0,5 g oder 2 ml oder 85 mg Zellen (Trockengewicht); [Adiponitril] 50 mM; Phosphatpuffer 50 mM pH 7; Durchfluß 3,7 ± 0,1 ml/h; Säule: Durchmesser 1 cm, Höhe 3 cm.
Die Anfangsaktivität der Zellen betrug 1,5 µmol Adiphat/h/mg Zellen (Trockengewicht). 66% der Anfangsaktivität sind nach 32 Tagen oder 770 h noch vorhanden.

Claims

1) DNA-Sequenz, die ein Polypeptid mit einer Nitrilaseaktivität mit der Fähigkeit zur Hydrolyse von Nitrilen in Carboxylate codiert, dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgewählt ist aus:

- der DNA-Sequenz, ein Polypeptid mit einer Nitrilaseaktivität codiert, wie in der Figur 4 dargestellt ist und im beigefügten Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 4 bezeichnet ist,

- einem Analogen dieser Sequenz als Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Codes,

- einer DNA-Sequenz,die mit einer dieser Sequenzen oder einem Fragment davon hybridisiert und ein Polypeptid mit Nitrilaseaktivität codiert.

2)Rekombinante DNA-Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie die folgende Nucleotidsequenz (SEQ ID NO: 4) enthält:

3) Polypeptid als Ergebnis der Expression einer DNA- Sequenz nach einem der Ansprüche 1 oder 2 und mit einer Nitrilaseaktivität.

4) Polypeptid nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es die nachstehend angegebene Sequenz mit der Bezeichnung SEQ ID NO: 5 im beigefügten Sequenzprotokoll enthält:

5) Mikroorganismus, enthaltend die DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 4) nach den Ansprüchen 1 oder 2.

6) Mikroorganismus, enthaltend die DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 4) nach den Ansprüchen 1 oder 2 in einem Plasmid mit einem Selektionsmarker.

7) Mikroorganismus, bestehend aus dem das Piasmid pXL2148 enthaltenden E. coli-Stamm TG1, bezeichnet als G4207 und hinterlegt bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes unter der Hinterlegungsnummer I-1242.

8) Mikroorganismus, enthaltend eine Expressionskassette aus der DNA-Sequenz (SEQ ID No: 4) nach Anspruch 1 oder 2 unter der Steuerung von Signalen, die die Expression dieser Sequenz in dem Wirtsmikroorganismus gewährleisten.

9) Mikroorganismus nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß er stromaufwärts der DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 4) eine Ribosomenbindungsstelle und eine für das produzierte Polypeptid homologe oder heterologe Promotorsequenz umfaßt.

10) Mikroorganismus nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor aus den folgenden Promotoren ausgewählt ist: Promotor des Tryptophanoperons Ptrp von E. coli, Promotor des Lactoseoperons Plac von E. coli, rechter Promotor des Phagen Lambda PR, linker Promotor des Phagen Lambda PL, und die starken Promotoren von Corynebacterium, Comamonas oder Pseudomonas.

11) Mikroorganismus nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Ribosomenbindungsstelle diejenige ist, die von dem Gen CII des Phagen Lambda abgeleitet ist, oder diejenigen sind, die von den Genen von E. coli, Corynebacterium, Comamonas oder Pseudomonas abgeleitet sind.

12) Mikroorganismus nach den Ansprüchen 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Expressionskassette auf einem Plasmid mit einem Selektionsmarker vorhanden ist.

13) Mikroorganismus nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Selektionsmarker ein Marker ist, der Antibiotikaresistenz verleiht.

14) Mikroorganismus nach den Ansprüchen 5 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß er aus den Stämmen E. coli, Comamonas, Corynebacterium, Brevibacterium, Rhodococcus, Pseudomonas ausgewählt ist.

15) Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 5 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß

- er mindestens ein proteinisches Hilfsmittel zur Faltung von Polypeptiden, die er synthetisiert, und bevorzugt der Polypeptide nach Anspruch 3 oder 4, und/oder die dieses Mittel codierenden Gene enthält,

- und dieses Mittel in einer Menge vorhanden ist, die größer ist als die, die der Grundmenge des betrachteten Mikroorganismus entspricht.

16) Mikroorganismus nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel das Chaperon GroE von E. coli oder ein Homologes davon mit eukaryotischem oder prokaryotischem Ursprung ist.

17) Mikroorganismus nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Gene, die das Mittel codieren, auf einem Chromosom oder einem extrachromosomalen Element (Plasmid, Phage) vorhanden sind, und daß sie amplifiziert sind.

18) Mikroorganismen nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Gene, die das Mittel codieren, unter der Steuerung von für den Mikroorganismus homologen oder heterologen Expressionssystemen stehen.

19) Verfahren zur enzymatischen Transformation von Nitrilen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Nitrile mit einem Polypeptid mit einer Nitrilaseaktivität nach einem der Ansprüche 3 oder 4 oder einem Wirtsmikroorganismus nach einem der Ansprüche 5 bis 18 in Kontakt bringt.

20) Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Nitril ein Dinitril der Formel NC-R-CN ist, worin R ein Alkylenrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist.

21) Verfahren nach einem der Ansprüche 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Nitril Adiponitril ist.