DE3714532C2 - Neue Rekombinations-DNA und Verfahren zur Herstellung von Sarkosinoxidase N - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine neue rekombinante DNA, die zur Herstellung von Sarkosinoxidase N geeignet ist, sowie ein Verfahren zur Herstellung von Sarkosinoxidase N.

Sarkosinoxidase ist ein Enzym, welches die folgende Reaktion katalysiert:

Sie wird beispielsweise in der JP-OS 52 789/79 und in J. Biochem. 89, 599 (1981) Japan erwähnt und ist infolgedessen bekannt.

Weiterhin wird in "Symposium on Clinical Chemistry", 19. Kollektion, Seite 196 (1979) eine enzymatische quantitative Analyse von Kreatinin und von Kreatin unter Verwendung von Sarkosinoxidase berichtet. Sarkosinoxidase ist also auch für diesen Zweck geeignet. Diese analytische Methode wird nachfolgend erläutert, wobei der in Klammern gesetzte Ausdruck das verwendete Enzym beschreibt:

Zuvor hat einer der vorliegenden Erfinder einen neuen Stamm von Genus Bacillus aus der Erde isoliert und festgestellt, daß ein kultiviertes Produkt dieses Stammes eine neue Sarkosinoxidase mit einer hohen enzymatischen Aktivität auch in schwach saurer Umgebung ergibt, wobei die Sarkosinoxidase eine hohe Wärmebeständigkeit und einen niedrigen Km-Wert gegenüber Sarkosin aufweist. Basierend auf dieser Feststellung wurde eine Patentanmeldung für die wärmebeständige Sarkosinoxidase N und ein Verfahren zu deren Herstellung eingereicht (Japanische Offenlegungsschrift 162 174/86).

Um eine maximale Enzymausbeute bei dem vorerwähnten Herstellungsverfahren für die wärmebeständige Sarkosinoxidase N zu erzielen, muß man teures Kreatinin, Kreatin und/oder Sarkosin zu dem Medium geben. Dies ist aus wirtschaftlichen Gründen nachteilig und erschwert eine Produktion.

Die vorliegenden Erfinder haben nun zahlreiche Untersuchungen durchgeführt, um die vorerwähnten Probleme zu lösen. Sie haben dabei gefunden, daß man wärmebeständige Sarkosinoxidase N mit einer hohen Effizienz ohne Zugabe von Kreatinin, Kreatin und/oder Sarkosin zu einem Medium erhalten kann, einem für wärmebeständige Sarkosinoxidase N codierenden in eine Vektor-DNA einsetzt unter Erhalt einer rekombinanten DNA, wobei dann, wenn man diese rekombinante DNA in einen Stamm, der zum Genus Escherichia gehört, einführt, man einen Stamm erhält, der die Fähigkeit hat, wärmebeständige Sarkosinoxidase N zu erzeugen, worauf man dann den letzteren in einem Medium kultiviert. Auf dieser Feststellung aufbauend, wurde die vorliegende Erfindung gemacht.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit eine neue rekombinante DNA mit den Merkmalen des Anspruchs 1, die hergestellt wurde, indem man eine DNA mit einem für Sarkosinoxidase N codierendem Gen in eine Vektor-DNA einsetzt. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von Sarkosinoxidase N gemäß den Ansprüchen 8 bis 14, umfassend die Schritte: Einfügen einer DNA mit einem für Sarkosinoxidase N codierendem Gen gekennzeichnet durch die Restriktionsschnittstellen gemäß der Figur in eine Vektor-DNA, Klonieren der rekombinanten DNA in einen Mikroorganismus vom Genus Escherichia, Kultivieren des Mikroorganismus in einem Medium und anschließend Gewinnung des Produkts Sarkosinoxidase N.

Die anliegende Figur beschreibt die Spaltungskarte mittels Restriktionsenzym eines DNA-Fragmentes mit einer Gencodierung für Sarkosinoxidase N (nachfolgend einfach als "SON" bezeichnet).

Die Erfindung wird nachfolgend ausführlicher beschrieben.

Zunächst wird die Herstellung von DNA mit einem codierenden Gen für wärmebeständige Sarkosinoxidase N (SON) beschrieben.

Bacillus sp. NS-129-Stamm (hinterlegt im Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science & Technology, Japan als FERM BP-671) wird in gleicher Weise, wie dies in der JP-OS 162 174/86 beschrieben wird, unter Erhalt des kultivierten Produktes kultiviert. Das kultivierte Produkt wird dann beispielsweise mit 3000 Upm oder mehr, vorzugsweise mit 8000 bis 10.000 Upm, während eines Zeitraums von 5 Minuten oder mehr, vorzugsweise während 10 bis 15 Minuten, zentrifugiert unter Erhalt von Bakterienzellen vom Bacillus sp. NS-129-Stamm.

Aus diesen Bakterienzellen kann man Chromosom-DNA erhalten, z. B. nach der Methode von Saito und Miura (Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)).

Dann wird die Chromosomen-DNA durch Behandeln mit einem Restriktionsenzym, welches ein kohäsives Ende ausbildet, wie Sau 3AI (hergestellt von Toyo Boseki K.K.), bei einer Temperatur von 30°C oder darüber, vorzugsweise bei 37°C, bei einer Enzymkonzentration von 1 bis 10 Einheiten/ml während eines Zeitraums von 20 Minuten oder mehr und vorzugsweise von 0,5 Stunden bis 2 Stunden unter Erhalt einer Mischung, bestehend aus verschiedenen Chromosom-DNA-Fragmenten, verdaut.

Aus der so erhaltenen DNA-Fragment-Mischung wird die DNA-Fragment-Mischung hergestellt, z. B. durch übliche Agarosegel-Elektrophorese. Diese wird dann durch Reinigungsmaßnahmen, z. B. durch eine Phenolextraktion, gereinigt. Weiterhin wird sie durch Konzentrationsmaßnahmen, wie eine Ethanolausfällung und dgl., unter Erhalt einer gereinigten DNA-Fragment-Mischung, in welcher die DNA-Fragmente eine Gencodierung für SON haben, konzentriert.

Als Vektor-DNA wird bei der vorliegenden Erfindung irgendeine beliebige Vektor-DNA verwendet. Beispielsweise können hier Plasmid-Vektor-DNA, Bacterophagen-Vektor-DNA und dgl. erwähnt werden. Genauer gesagt, wird beispielsweise Plasmid pBR322-DNA (hergestellt von Bethesda Research Laboratories), Plasmid pUC18 (hergestellt von Pharmacia Co.) und Bacteriophagen EN501S-Tc-DNA bevorzugt.

Die vorerwähnte Vektor-DNA wird durch Behandeln mit einem kohäsive Enden bildenden Restriktionsenzym, z. B. Bam HI (hergestellt von Takara Shuzo K.K.) bei einer Temperatur von 30°C oder höher, vorzugsweise bei 37°C, bei einer Enzymkonzentration von 10 bis 1.000 Einheiten/ml während eines Zeitraums von 1 Stunde oder mehr, vorzugsweise 2 bis 3 Stunden unter Erhalt einer aufgespaltenen Vektor-DNA aufgeschlossen.

Anschließend wird die vom Bacillus sp. NS-129-Stamm stammende vorerwähnte DNA-Fragment-Mischung mit einer Gencodierung für SON mit der aufgespaltenen Vektor-DNA vermischt und die erhaltene Mischung wird beispielsweise mit E. coli DNA-Ligase (hergestellt von New England Bio Labs Co.), T4-DNA-Ligase (hergestellt von Boehringer-Mannheim Co.) und dergl. und vorzugsweise mit T4-DNA-Ligase bei einer Temperatur von 4 bis 37°C, vorzugsweise 4 bis 16°C, bei einer Enzymkonzentration von 1 bis 100 Einheiten/ml während eines Zeitraums von 1 Stunde oder mehr und vorzugsweise 6 bis 24 Stunden unter Erhalt einer Rekombinations-DNA behandelt.

Mittels dieser Rekombinations-DNA werden dann E. coli K-12-Stamm, vorzugsweise E. coli HB 101 (ATCC 33694), E. coli DHI (ATCC 33849), E. coli X-1776 (ATCC 31244) und dgl., die frei von der allgemeinen American Type Culture Collection-Sammelstelle erhältlich sind, transformiert oder überführt unter Erhalt der jeweiligen Stämme. Diese Transformation kann nach der Methode von D.M. Morrison (Methods in Enzymology, Band 68, Seiten 326-331 (1979)) erfolgen. Die Transduktion kann nach der Methode von B. Hohn (Methods in Enzymology, Band 68, Seiten 299-309 (1979) durchgeführt werden.

Indem man einen Stamm mit einer SON-bildenden Fähigkeit aus den so erhaltenen Stämmen ausscreent, erhält man einen Stamm vom Genus Escherichia mit SON-produzierender Fähigkeit und enthaltend eine rekombinante DNA, die hergestellt wurde, indem man eine DNA mit einem SON-codierenden Gen in eine Vektor-DNA einsetzt.

Von dem so erhaltenen Stamm kann man eine gereinigte Rekombinations-DNA beispielsweise nach der Methode von P. Guerry (J. Bacteriology, Band 116, Seiten 1064-1066 (1973)), nach der Methode von D. B. Clewell (J. Bacteriology, Band 110, Seiten 667-676 (1972)) und dergl. erhalten.

Da die in der so erhaltenen Rekombinations-DNA vorliegende DNA mit einem SON-codierenden Gen nach der Reinigung nicht nur SON-codierendes Gen, sondern auch unnötigte DNA enthält, muß man die unnötige DNA nach dem nachfolgenden Verfahren entfernen.

Die, wie vorher angegeben erhaltene und gereinigte Rekombinations-DNA wird durch Behandeln mit einem Restriktions-Enzym, wie Hpa I und Bgl II (beide hergestellt von Takara Shuzo K.K.) bei einer Temperatur von nicht weniger als 30°C und vorzugsweise 37°C bei einer Enzymkonzentration von 10 bis 1.000 Einheiten/ml während eines Zeitraums von 20 Minuten oder mehr, vorzugsweise 1 bis 6 Stunden, unter Erhalt einer DNA-Fragment-Mischung verdaut.

Aus der so erhaltenen DNA-Fragment-Mischung wird ein DNA-Fragment, welches eine Gencodierung für SON enthält, beispielsweise durch übliche Agarosegel-Elektrophorse gewonnen. Weiterhin erfolgt eine Reinigung durch Reinigungsverfahren, z. B. eine Phenolextraktion, und dann erfolgt eine Konzentrierung, z. B. durch eine Ethanolausfällung. Auf diese Weise erhält man gereinigtes DNA-Fragment, enthaltend ein DNA-Fragment mit SON-codierendem Gen.

Als Vektor-DNA kann man bei der vorliegenden Erfindung jede Vektor-DNA verwenden. So kann man beispielsweise Plasmid-Vektor-DNA, Bakteriophagen-Vektor-DNA und dgl. einsetzen. Genauer gesagt, werden bevorzugt Plasmid-puC18-, pUC12-, pUC8-DNA (hergestellt von Pharmacia Co.), Bacteriophagen EN501S-Tc-DNA und dgl. verwendet.

Die vorerwähnte Vektor-DNA wird durch Behandeln mit einem Restriktions-Enzym, wie Bam HI und Hinc II (hergestellt von Takara Shuzo K.K.) bei einer Temperatur von nicht weniger als 30°C und vorzugsweise 37°C bei einer Enzymkonzentration von 10 bis 1.000 Einheiten/ml während eines Zeitraums von 1 Stunde oder mehr und vorzugsweise 1 bis 3 Stunden unter Erhalt einer aufgespaltenen Vektor-DNA verdaut.

Dann wird das in vorerwähnter Weise erhaltene DNA-Fragment, das vom Bacillus sp. NS-129-Stamm abstammt, und ein SON-codierendes Gen enthält, mit der vorerwähnten aufgespaltenen Vektor-DNA vermischt und die Mischung wird mit T4-DNA-Ligase (hergestellt von Boehringer-Mannheim Co.) und dgl. (vorzugsweise T4-DNA-Ligase) bei einer Temperatur von 4 bis 37°C, vorzugsweise 4 bis 16°C, bei einer Enzymkonzentration von 1 bis 100 Einheiten/ml während eines Zeitraums von 1 Stunde oder mehr und vorzugsweise 6 bis 24 Stunden unter Erhalt einer Rekombinations-DNA behandelt.

Unter Verwendung dieser Rekombinations-DNA wird E. coli K-12-Stamm, vorzugsweise E. coli JM-101 (ATCC 33876), E. coli HB 101 (ATCC 33694), E. coli DHI (ATCC 33849), E. coli X-1776 (ATCC 31244) und dgl. transformiert oder transduziert unter Erhalt der entsprechenden Stämme. Die Transformation kann man nach der Methode von D. M. Morrison (Methods in Enzymology, Band 68, Seiten 326-331 (1979)) durchführen. Die Transduktion kann man nach der Methode von B. Hohn (Methods in Enzymology, Band 68, Seiten 299-309 (1979)) durchführen.

Indem man einen Stamm mit SON-bildender Fähigkeit aus den so erhaltenen Stämmen aussiebt, kann man einen Stamm vom Genus Escherichia mit SON-bildender Fähigkeit und enthaltend eine Rekombinations-DNA, die durch Einsetzen eines DNA mit SON-bildendem Gen in eine Vektor-DNA erhalten wurde, erhalten.

Zur Herstellung von gereinigter neuer Rekombinations-DNA aus dem wie oben erhaltenen Stamm kann man beispielsweise die Methode von P. Guerry (J. Bacteriology, Band 116, Seiten 1064-1066 (1973)), die Methode von D.B. Clewell (J. Bacteriology, Band 110, Seiten 667-676 (1972)) anwenden.

Zur Ausbildung von SON unter Verwendung eines Stammes vom Genus Escherichia mit SON-bildender Fähigkeit und enthaltend eine Rekombinations-DNA, die hergestellt wurde durch Einsetzen von DNA mit SON-Gen in eine Vektor-DNA, wobei der SON-Stamm in vorerwähnter Weise erhalten wurde, kann man den Stamm nach einer üblichen Festkulturmethode kultivieren. Vorzugsweise wird er jedoch mittels einer Flüssigkulturmethode kultiviert.

Als Kulturmedium für den Stamm kann man ein Medium verwenden, bei dem man wenigstens ein anorganisches Salz, wie primäres Kaliumphosphat, sekundäres Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Magnesiumchlorid, Eisen(III)chlorid, Eisen(III)sulfat, Mangansulfat und dgl. und gewünschtenfalls weitere Komponenten, wie Zucker, Vitamine und dgl. zu wenigstens einer Stickstoffquelle, wie Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt, Maismeische, Sojabohnenmeische, Weizenkleie-Einweichflüssigkeit und dgl. zugibt.

Vorzugsweise beträgt der Anfangs-pH-Wert des Mediums 7 bis 9. Die Kultivierung wird bei einer Temperatur von 30 bis 42°C und vorzugsweise etwa 37°C während eines Zeitraums von 4 bis 24 Stunden und vorzugsweise 6 bis 8 Stunden mittels einer belüfteten und gerührten Eintauchkultur, einer Schüttelkultur, einer Standkultur und dgl. durchgeführt.

Nach Beendigung der Kultivierung kann man SON aus dem kultivierten Produkt in der für die Sammlung von Enzymen üblichen Weise gewinnen.

Beispielsweise werden Bakterienzellen einer Ultraschallabbaubehandlung oder einem Mahlen in üblicher Weise unterworfen. Andererseits kann man das angestrebte Enzym auch mittels einem bakteriolytischen Enzyms, wie einem Lysozym und dergl. extrahieren. Weiterhin kann man Bakterienzellen schütteln oder in Gegenwart von Toluol und dgl. stehenlassen und eine Selbstverdauung durchführen, wodurch dann das angestrebte Enzym aus den Bakterienzellen freigegeben wird. Aus der dabei erhaltenen Lösung wird das Festprodukt durch Filtrieren, Zentrifugieren usw. entfernt und gewünschtenfalls können Nucleinsäuren mittels Streptomycinsulfat, Protaminsulfat oder Mangansulfat entfernt werden, worauf man dann durch Zugabe von Ammoniumsulfat, Alkohol, Aceton und dergl. fraktioniert. Der so erhaltene Niederschlag wird gesammelt, gegen Wasser dialysiert und dann im Vakuum getrocknet unter Erhalt einer rohen Enzymprobe.

Gewünschtenfalls kann man eine hochreine Probe von SON aus dem wie oben erhaltenen Enzym durch eine geeignete Kombination von üblichen Methoden zur Isolierung und Reinigung von Enzymen herstellen, z. B. (1) Säulenchromatographie unter Verwendung von DEAE-Cellulose, (2) Fraktionieren unter Verwendung von Ammoniumsulfat, (3) Säulenchromatographie unter Verwendung von QAE-Sephadex, (4) hydrophobe Chromatographie unter Verwendung von TSK-GEL-Butyl-Toyopearl 650 C (hergestellt von Toyo Soda K.K.), (5) Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex und andere Methoden.

Die physikochemischen Eigenschaften des mittels der obigen Methoden gereinigten SON werden nachfolgend gezeigt und sind identisch mit denen, die in der JP-OS 162 174/86 angegeben sind.

• (a) Wirkung
  Sarkosinoxidase N katalysiert die nachfolgende Enzymreaktion, bei welcher Sarkosin oxidativ unter Bildung von Glycin, Formaldehyd und Wasserstoffperoxid zersetzt wird:
• b) Substratspezifität
  Sarkosinoxidase N hat eine Km-Zahl (Michaelis-Konstante) für Sarkosin von 4,7 mM bei 37°C bei einem pH-Wert von 7,7 (Phosphatpufferlösung).
• c) Optimaler pH-Wert und stabiler pH-Bereich
  Der optimale pH-Wert von Sarkosinoxidase N ist 6,7 bis 10,0, wenn man Sarkosin als ein Substrat verwendet. Der stabile pH-Bereich liegt zwischen 6,5 und 11,5.
• d) Optimaler Temperaturbereich
  45 bis 60°C
• e) Wärmestabilität
  Sarkosinoxidase N behält seine enzymatische Aktivität von 98% bei, wenn man es während 10 Minuten bei 55°C behandelt und eine Aktivität von 75%, wenn man es bei 60°C 10 Minuten behandelt.
• f) Molekulargewicht
  Etwa 49.000, gemessen durch Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-150.
• g) Flavinenzymprotein
  Sarkosinoxidase N enthält 1 Mol kovalent-gebundenes Flavinadenindinucleotid (FAD) pro Mol des Enzyms.

Aus der vorhergehenden Beschreibung geht hervor, daß man Sarkosinoxidase mit einer hohen Effizienz erhalten kann, ohne daß man Kreatin, Kreatinin oder Sarkosin und dgl. zugeben muß, wenn man einen Stamm vom Genus Escherichia, der die neue Rekombinations-DNA der vorliegenden Erfindung enthält, in einem Kulturmedium kultiviert. Infolgedessen ist die vorliegende Erfindung von hohem wirtschaftlichen Interesse.

Die Erfindung wird ausführlicher in den nachfolgenden Beispielen erläutert.

Beispiel 1 (1) Herstellung von Chromosom-DNA von Bacillus sp. Ns-129-Stamm

Bacillus sp. NS-129 (FERM BP-671)-Stamm wurde in 200 ml T-Y-Medium (1% (G/V) von Bacto-trypton (hergestellt von Difco Co.), 0,5% (G/V) Bacto-Hefeextrakt (hergestellt von Difco Co.) und 0,5% (G/V) von NaCl (pH-Wert 7,2) inokuliert und 16 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur unterworfen, wobei man ein kultiviertes Produkt erhielt.

Das kultivierte Produkt wurde in üblicher Weise 10 Minuten mit 10.000 Upm zentrifugiert unter Erhalt von 0,5 g feuchten Bakterienzellen. Anschließend wurde chromosome DNA aus den feuchten Bakterienzellen nach der Methode von Saito und Miura (Biochem. Biophys. Acta, Band 72, Seite 619 (1963)) hergestellt.

Dann wurden 0,1 mg dieser chromosomen DNA und zwei Einheiten Restriktionsenzym Sau 3AI (hergestellt von Toyo Boseki K.K.) zu 10 mM Tris-salzsäure-Pufferlösung (enthaltend 50 mM NaCl, 10 mM MgSO₄ und 1 inM Dithiothreitol) (pH 7,4) eingemischt und 45 Minuten bei 37°C umgesetzt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch in üblicher Weise elektrophoretisiert unter Verwendung von 0,7% (G/V) Agarosegel (hergestellt von Takara Shuzo K.K.) und das DNA-Fragment mit einer Größe von 4 bis 8 kb (kilo base pair) wurde nach der Methode von R.C.A. Yang et al. (Method in Enzymology, Band 68, Seiten 176-182 (1979)) unter Erhalt eines Eluats eluiert. Das Eluat wurde in üblicher Weise einer Phenolextraktion unterworfen und dann einer Ethanolausfällung unter Erhalt von 10 µg von Chromosom-DNA-Fragment von Bacillus sp. NS-129-Stamm, der in Sau 3AI verdaut war.

(2) Herstellung von Rekombinations-Plasmid pKLS601-DNA

10 µg Plasmid-pBR322-DNA (hergestellt von Bethesda Research Laboratories Co.) und 100 Einheiten von Restriktionsenzym Bam HI (hergestellt von Takara Shuzu K.K.) wurden in 50 ml Tris-salzsäure-Puffer, enthaltend 100 ml NaCl und 10 mM MgSO₄ (pH-Wert 7,4) eingemischt und 2 Stunden bei 37°C unter Erhalt einer abgebauten Lösung umgesetzt. Die letztere wurde in üblicher Weise einer Phenolextraktion und dann einer Ethanolausfällung unterworfen unter Erhalt von Plasmid-pBR322-DNA, aufgeschlossen durch Bam HI.

Anschließend wurden 10 µg der so erhaltenen durch Bam HI aufgeschlossenen Plasmid-pBR322-DNA, 10 µg der chromosomen DNA-Fragmente von Bacillus sp. NS-129-Stamm, aufgeschlossen durch Sau 3AI, erhalten gemäß (1) und 5 Einheiten T4-DNA-Ligase (hergestellt von Boehringer Mannheim Co.) zu 66 mM Tris-salzsäure-Puffer (pH-Wert 7,5), enthaltend 6,6 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreitol und 10 mM ATP gegeben und 16 Stunden bei 16°C unter Erhalt einer verbundenen DNA umgesetzt.

Dann wurde E. coli-DHI-Stamm (ATCC 33849), der nach der Methode von D.M. Morrison (Method in Enzymology, Band 68, Seiten 326-331 (1979)) einer Calciumchloridbehandlung unterworfen war, mit der verbundenen, in obiger Weise erhaltenen DNA transformiert. Auf diese Weise wurden 1.000 transformierte Stämme, die beständig gegen Ampicillin und empfindlich gegenüber Tetracyclin waren, erhalten.

Ob die so erhaltenen transformierten Stämme eine SON-Aktivität aufwiesen oder nicht, wurde in folgender Weise untersucht:

Jeder Stamm wurde zu 5 ml T-Y-Medium, enthaltend 0,5% (G/V) Sarkosin (hergestellt von Tokyo Kasei Kogyo K.K.) und 50 µg/ml Ampicillin inokuliert und 24 Stunden bei 30°C unter Erhalt einer kultivierten Flüssigkeit kultiviert. Diese wurde dann mit 3.500 Upm während 10 Minuten unter Erhalt von feuchten Bakterienzellen zentrifugiert. Die letzteren wurden in 1 ml 10 mM Phosphatpuffer (pH-Wert 7,5), enthaltend 1% (G/V) Sarkosin, suspendiert und dazu wurden 20 µl Toluol gegeben und die erhaltene Mischung wurde 1 Stunde bei 37°C umgesetzt und dann in üblicher Weise mit 3.500 Upm während 10 Minuten zentrifugiert unter Erhalt einer Reaktionsflüssigkeit. Zu der Reaktionsflüssigkeit wurden 0,15 ml einer 1%igen (G/V) Lösung von 4-Amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4-triazol, 0,15 ml einer 23%igen (G/V) Lösung von Kaliumhydroxid und 0,15 ml einer 0,08%igen (G/V) Lösung von Natriummetaperiodat gegeben. Als Ergebnis schlug die Farbe der Reaktionsflüssigkeit nach violett um und dies bedeutete einen transformierten Stamm mit SON-Aktivität. Es wurde somit ein transformierter E. coli DHI-(pKLS 601)-Stamm mit SON-Aktivität erhalten.

(3) Isolierung von Rekombinations-Plasmid-pKLS 601-DNA

E. coli DHI-(pKLS 601) wurde in ein Medium aus 1% (G/V) Trypton, 0,5% (G/V) Hefeextrakt und 0,5% (G/V) NaCl bei 37°C während 16 bis 24 Stunden vorkultiviert. 20 ml der so erhaltenen Kulturflüssigkeit wurden zu 1 l des gleichen Mediums, wie oben, inokuliert und 3 Stunden bei 37°C einer Schüttelkultur unterworfen und anschließend wurden 0,2 g Chloramphenicol zu der Kulturflüssigkeit gegeben. Die Kultur wurde 20 Stunden bei dieser Temperatur gehalten, wobei man eine kultivierte Flüssigkeit erhielt.

Dann wurde die kultivierte Flüssigkeit in üblicher Weise mit 10.000 Upm während 10 Minuten unter Erhalt von feuchten Bakterienzellen zentrifugiert. Nach dem Suspendieren der feuchten Bakterienzellen in 20 ml 50 mM Tris-salzsäure-Pufferlösung (pH-Wert 8,0), enthaltend 25% (G/V) Saccharose, 10 mg Lysozym, 8 ml 0,25M EDTA-Lösung (pH-Wert 8,0) wurden 8 ml einer 20%igen (G/V) Lösung von Natriumdodecylsulfat zugegeben. Nach 30-minütiger Bakteriolyse bei 60°C erhielt man eine bakteriolysierte Flüssigkeit.

Die bakteriolysierte Flüssigkeit wurde 13 ml einer 5M NaCl-Lösung bei 4°C während 16 Stunden behandelt und anschließend in üblicher Weise mit 15.000 Upm während 30 Minuten unter Erhalt einer Extraktionslösung zentrifugiert. Die letztere wurde in üblicher Weise einer Phenolextraktion und einer Ethanolausfällung unter Erhalt eines Niederschlags behandelt.

Nach dem Trocknen des Niederschlags unter vermindertem Druck in üblicher Weise wurde dieser in 6 ml 10 mM Tris-salzsäure-Pufferlösung (pH-Wert 7,5), enthaltend 1 mM EDTA gelöst und dazu wurden 6 g Cäsiumchlorid und 0,2 ml einer 10 mg/ml-Lösung Ethidiumbromid gegeben. Die so erhaltene Mischung wurde einer Gleichgewichts-Dichtegradienten-Zentrifugierung mittels einer Ultrazentrifuge bei 39.000 Upm während 42 Stunden in üblicher Weise unterworfen unter Isolierung der Rekombinations-Plasmid-pKLS 601-DNA. Nach der Entfernung von Ethidiumbromid unter Verwendung von n-Butanol wurde die DNA gegen 10 mM Tris-salzsäure-Puffer (pH-Wert 7,5), enthaltend 1 mM EDTA, dialysiert, wobei man 2.700 µg gereinigte Rekombinations-Plasmid-pKLS 601-DNA erhielt. Deren Größe war etwa 9,1 kb.

(4) Herstellung der neuen Rekombinations-Plasmid-pKLS 612-DNA

Zur 10 mM Tris-salzsäure-Pufferlösung (enthaltend 50 mM NaCl, 10 mM MgSO₄ und 1 mM Dithiothreitol) (pH-Wert 7,4) wurden 0,2 µg Plasmid-pUC18-DNA (hergestellt von Pharmacia Co.), 10 Einheiten von Restriktionsenzym Hinc 11 (hergestellt von Takara Shuzo K.K.) und 10 Einheiten von Restriktionsenzym Bam HI (hergestellt von Takra Shuzo K.K.) gegeben. Die Mischung wurde 1 Stunde bei 37°C umgesetzt unter Erhalt einer aufgeschlossenen Flüssigkeit.

Die aufgeschlossene Flüssigkeit wurde in üblicher Weise einer Phenolextraktion und dann einer Ethanolausfällung unterworfen unter Erhalt von Plasmid-pUC18-DNA, aufgeschlossen durch Hinc II und Bam HI.

Dann wurden 12 µg der in Absatz (3) erhaltenen Rekombinations-pKLS601-DNA, 12 Einheiten Hpa I (hergestellt von Takara Shuzo K.K.) und 30 Einheiten von Bgl II (hergestellt von Takara Shuzo K.K.) in 10 mM Tris-salzsäure-Puffer (enthaltend 50 mM NaCl, 10 mM MgSo₄ und 1 mM Dithiothreitol) (pH-Wert 7,4) eingemischt und 5 Stunden bei 37°C umgesetzt unter Erhalt einer aufgeschlossenen Flüssigkeit.

Die aufgeschlossene Flüssigkeit wurde einer 0,7% (G/V) Agarosegel-Elektrophorese unterworfen und dabei wurde ein DNA-Fragment von 1,7 kb nach der Methode von R.C.A. Yang et al. (Methods in Enzymology, Band 68, Seiten 176-182 (1979)) eluiert unter Erhalt eines Eluats. Das Eluat wurde in üblicher Weise einer Phenolextraktion und Ethanolausfällung unterworfen unter Erhalt von 1,3 µg DNA-Fragment.

Dieses DNA-Fragment war ein DNA-Fragment, welches eine Gencodierung für SON enthielt.

Anschließend wurde dieses DNA-Fragment einem Einfachaufschluß und einem Doppelaufschluß unter Verwendung von Bgl II, Dra I, Pvu II, Hinc III, Hpa I (dies sind alles Restriktionsenzyme hergestellt, von Takara Shuzo K.K.), Asu II (Restriktionsenzym, hergestellt von Promega Biotec Co.) und Bst EII (Restriktionsenzym, hergestellt von Nippon gene Co.) unterworfen unter Erhalt von DNA-Fragmenten und deren Mobilitätsmuster wurde durch Agarosegel-Elektrophorese analysiert. Durch einen Vergleich der so gefundenen Mobilitätsmuster mit dem Standard-Mobilitätsmuster von DNA-Fragment, erhalten durch Aufschluß von DNA mit Hinc III wurde das Molekulargewicht mit 1.700 bp (Basenpaar) (vgl. Journal of Molecular Biology, Band 98, Seiten 551-564 (1975)) festgestellt. Die Spaltungskarte des vorerwähnten DNA-Fragmentes durch die Restriktionsenzyme wird in der anliegenden Zeichnung gezeigt.

Dann wurden 0,15 µg der so erhaltenen DNA-Fragmente, 0,2 µg von Plasmid-pUC18-DNA, aufgeschlossen durch Hinc II und Bam HI und eine Einheit von T4-DNA-Ligase (hergestellt von Boehringer Mannheim Co.) zu 66 mM Tris-salzsäure-Puffer (enthaltend 6,6 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreitol und 10 mM ATP) (pH-Wert 7,5) gemischt und 16 Stunden bei 4°C unter Erhalt einer verbundenen DNA umgesetzt.

Dann wurden die vorerwähnten E. coli-JM 101 (ATCC 33876), die nach der vorerwähnten Methode von D. M. Morrison einer Calciumchloridbehandlung unterworfen worden waren, mit der obigen erhaltenen verbundenen DNA transformiert und der erhaltene transformierte Stamm wurde in einem T-Y-Agarplattenmedium, enthaltend 50 µg/ml Ampicillin, 0,5 mM Isopropyl-β-D-thiogalactosid und 0,004% (G/V) 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid bei 37°C während 24 Stunden kultiviert. Bei dieser Kultur ist der Stamm, der sich als weiße Kolonie bildet, der gesuchte SON-produzierende Stamm. Man erhielt auf diese Weise einen E. coli JM101-(pKLS612)-Stamm, der eine weiße Kolonie bildete.

Der E. coli JM101-(pKLS612)-Stamm, der ein transformierter Stamm mit SON-produzierender Fähigkeit ist, wurde im Fermentations Research Institute, Agency of Industrial Science & Technology, Japan, unter FERM BP-1146 hinterlegt.

(5) Isolation von Rekombinations-Plasmid-pKLS612-DNA

E. coli JM101-(pKLS612)-Stamm wurde in ein Medium, umfassend 1% (G/V) Trypton, 0,5% (G/V) Hefeextrakt und 0,5% (G/V) NaCl 16 bis 24 Stunden bei 37°C unter Erhalt einer kultivierten Flüssigkeit vorkultiviert. 20 ml der Kulturflüssigkeit wurden zu 1 l des gleichen Mediums wie oben inokuliert und einer Schüttelkultur während 3 Stunden bei 37°C unterworfen und dann wurden zu der Kulturflüssigkeit 0,2 g Chloramphenicol gegeben und die Kultivierung wurde bei der gleichen Temperatur 20 Stunden fortgesetzt unter Erhalt einer Kulturflüssigkeit.

Die Kulturflüssigkeit wurde in üblicher Weise mit 10.000 Upm während 10 Minuten zentrifugiert, wobei man feuchte Bakterienzellen erhielt. Die feuchten Bakterienzellen wurden in 20 ml 50 mM Tris-salzsäure-Pufferlösung (pH-Wert 8,0), enthaltend 25% (G/V) Saccharose suspendiert und dann wurden 10 mg Lysozym, 8 mM einer 0,25M EDTA-Lösung (pH-Wert 8,0) und 8 ml einer 20%igen (G/V) Lösung von Natriumdodecylsulfat zugegeben. Die Suspension wurde 30 Minuten bei 60°C zur Durchführung der Bakteriolyse gehalten. Anschließend wurde die bakteriolysierte Flüssigkeit gewonnen.

Die bakteriolysierte Flüssigkeit wurde mit 13 ml einer 5M NaCl-Lösung während 16 Stunden bei 4°C behandelt und dann in üblicher Weise mit 15.000 Upm während 30 Minuten zentrifugiert, wobei man eine Extraktionslösung erhielt. Die Extraktionslösung wurde in üblicher Weise einer Phenolextraktion und dann einer Ethanolausfällung unterworfen unter Erhalt eines Niederschlags.

Der Niederschlag wurde unter vermindertem Druck in üblicher Weise getrocknet und in 6 ml 10 mM Tris-salzsäure-Pufferlösung (pH-Wert 7,5), enthaltend 1 mM EDTA, gelöst. Nach Zugabe von 6 g Cäsiumchlorid und 0,2 ml 10 mg/ml Lösung von Ethidiumbromid wurde die Mischung einer Gleichgewichts-Dichtegradienten-Zentrifugierung in üblicher Weise unterworfen unter Verwendung einer Ultrazentrifuge mit 39.000 Upm während 42 Stunden unter Isolierung der Rekombinations-Plasmid-pKLS612-DNA. Nach der Entfernung von Ethidiumbromid unter Verwendung von n-Butanol wurde die DNA in 10 mM Tris-salzsäure-Pufferlösung (pH-Wert 7,5), enthaltend 1 mM EDTA, dialysiert. Auf diese Weise wurden 2.300 µg gereinigte Rekombinations-Plasmid-pKLS612-DNA mit einer Größe von 4,4 kb erhalten.

(6) Herstellung von SON unter Verwendung von E. coli JM101-(pKLS6I2)-Stamm und Isolierung und Reinigung des Enzyms.

2 l eines Mediums aus 1% (G/V) Trypton, 0,5% (G/V) Hefeextrakt, 1 mM Isopropyl-β-D-thiogalactosid und 0,5% (G/V) Natriumchlorid wurden getrennt in Kultivierungstanks vom Schütteltyp einer Kultivierungsvorrichtung kleiner Größe (hergestellt von Iwashiya Co.) gegeben unter erhöhtem Druck und in üblicher Weise sterilisiert. Zu diesem Medium wurden 20 ml einer Kultivierungsflüssigkeit gegeben, die zuvor hergestellt worden war, indem man E. coli JM101-(pKLS612)-Stamm in dem gleichen Medium wie oben während 24 Stunden bei 37°C kultivierte, und dann wurde eine Belüftungsschüttelkultur bei 37°C während 8 Stunden durchgeführt. Durch fünfmalige Wiederholung dieses Verfahrens erhielt man 35 g feuchte Bakterienzellen.

Die so erhaltenen feuchten Bakterienzellen wurden zu 100 ml eines 0,01M Phosphatpuffers (pH-Wert 8,0) gegeben und einer Ultraschallzerstörung in üblicher Weise unterworfen und anschließend in üblicher Weise mit 15.000 Upm während 30 Minuten zentrifugiert unter Erhalt von 120 ml (290 Einheiten/ml) einer rohen Enzymlösung von SON.

Aus dieser so erhaltenen rohen Enzymlösung wurde Nucleinsäure unter Verwendung von Streptomycinsulfat entfernt. Nach einer Wärmebehandlung der Enzymlösung bei 50°C während 1 Stunde wurden die unlöslichen Stoffe durch Zentrifugieren mit 10.000 Upm während 10 Minuten entfernt.

Nachdem man die Enzymlösung auf eine QAE-Sephadex-A-50-Säule (1,4 × 40 cm), die zuvor mit 0,01M Phosphatpuffer ins Gleichgewicht gebracht worden war, adsorbiert wurde und Waschen der Säule mit 0,01M Phosphatpuffer, enthaltend 0,27M Kaliumchlorid, wurde mit 0,01M Phosphatpuffer, enthaltend 0,37M Kaliumchlorid, eluiert, wobei man eine SON-enthaltende Eluatlösung erhielt.

Die SON-enthaltende Eluatlösung wurde konzentriert und in üblicher Weise gefriergetrocknet. Man erhielt 20.800 Einheiten von gereinigtem SON-Pulver. Die Ausbeute betrug 60%.

Beispiel 2 (1) Herstellung von Bakteriophagen-EN501S-Tc

In gleicher Weise, wie in dem Arbeitsbeispiel in der JP-OS 212 781/83 beschrieben, wurden Bakteriophagen λcI857 1121 hergestellt (diese Phagen sind im Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science & Technology, Japan, in Form eines lysogenen Bakteriums, das erhältlich ist, indem man E. coli 1100 (erhalten vom Max-Planck-Institut, Heidelberg, Westdeutschland) in diesen Phagen nach üblichen Verfahren, d. h. in Form von E. coli 1100 lysogenisierte (λcI857 1121 (FERM BP-133)) hinterlegt worden). Von diesen Bakteriophagen λcI857 1121, wurden nach der Methode von T. Maniatis et al. (Molecular Cloning, Seiten 76-85 (1982)) DNA von Bakteriophagen λcI857 1121 erhalten.

Anschließend wurde 1 µg DNA von Bakteriophagen λcI857/1121 und 10 Einheiten EcoRI (hergestellt von Takara Shuzo K.K.) bei 37°C während 1 Stunde in 50 mM Tris-salzsäure-Pufferlösung, enthaltend 100 mM NaCl und 10 mM MgSo₄ (pH-Wert 7,4) umgesetzt. Nach üblicher Phenolextraktion und Ethanolausfällung wurden 0,8 µg eines Eco RI-aufgeschlossenen Produktes von Bakteriophagen-λcI857 1121-DNA erhalten.

In 50 mM Tris-salzsäure-Puffer, enthaltend 100 mM NaCl und 10 mM MgSO₄ (pH-Wert 7,4) wurden 1 µg der Bakteriophagen λcI85757-DNA (hergestellt von Takara Shuzo K.K.) und 10 Einheiten Eco RI (hergestellt von Takara Shuzo K.K.) bei 37°C während 1 Stunde umgesetzt unter Erhalt einer umgesetzten Flüssigkeit und dann wurde eine übliche Phenolextraktion und Ethanolausfällung durchgeführt unter Erhalt von 0,8 µg des aufgeschlossenen Produktes.

Dann wurden 0,8 µg des so aufgeschlossenen Produktes, 0,8 µg der oben erwähnten Bakteriophagen λcI857 1121-DNA und 1 Einheit T4-DNA-Ligase (hergestellt von Boehringer Mannheim Co.) in 60 mM Tris-salzsäure-Puffer, enthaltend 6,6 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreitol und 10 mM ATP (pH-Wert 7,5) 20 Stunden bei 4°C umgesetzt unter Erhalt einer umgesetzten Flüssigkeit. Unter Verwendung dieser umgesetzten Flüssigkeit wurde ein E. coli-QD 5003-Stamm, der zuvor mit Calciumchlorid nach der vorerwähnten Methode von D.M. Morrison et al. behandelt worden war, transformiert unter Erhalt von Bakteriophagen λcI857 1121S, die einen Belag auf E. coli QD 5003-Stamm bildeten und keinen Belag auf dem zuvor erwähnten E. coli 1100-Stamm.

Anschließend wurde 1 µg λcI857 1121S-DNA, hergestellt nach der Methode von T. Maniatis et al. aus der obigen erhaltenen Bakteriophagen-λcI857 1121S mit 10 Einheiten Eco RI (hergestellt von Takara Shuzo K.K.) in 50 mM Tris-salzsäure-Pufferlösung, enthaltend 100 mM NaCl und 10 mM MgSo₄ (pH-Wert 7,4) bei 37°C 1 Stunde umgesetzt und das Produkt wurde einer üblichen Phenolextraktion und Ethanolausfällung unterworfen unter Erhalt von 0,8 µg Eco RI-aufgeschlossener Bakteriophagen-λcI857 1121S-DNA.

Weiterhin wurde 1 µg der nach der Methode von T. Masuda et al. (Agri. Biol. Chem., Band 50, Seiten 271-278 (1986)) hergestellten Plasmid-pKN 206-DNA und 10 Einheiten Pvu II (hergestellt von Takara Shuzo K.K.) bei 37°C während 2 Stunden in 10 mM Tris-salzsäure-Pufferlösung, enthaltend 50 mM NaCl, 10 mM MgSo₄ und 1 M Dithiothreitol (pH-Wert 7,4) umgesetzt und dann wurde das Produkt einer üblichen Phenolextraktion and Ethanolausfällung unterworfen, wobei man 0,8 µg des Pvu II-aufgeschlossenen Produktes von Plasmid-pKN 206-DNA erhielt.

Dann wurden 0,8 µg von Pvu II-aufgeschlossenem Produkt der Plasmid pKN 206-DNA, 1 µg Eco RI-Verknüpfer mit einer phosphorylierten 5′-Endgruppe (hergestellt von New England Biolabs Co.) und 1 Einheit von T4-DNA-Ligase (hergestellt von Boehringer Mannheim Co.) 20 Stunden bei 4°C in 66 mM Tris-salzsäure-Pufferlösung, enthaltend 6,6 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreitol und 10 mM ATP (pH-Wert 7,5) umgesetzt unter Erhalt von 0,8 µg Plasmid-pKN 306.

Mit der so erhaltenen Plasmid-pKN 306-DNA wurde E. coli DH 1-Stamm (ATCC 33849), der nach der Methode von D.M. Morrison (Methods in Enzymology, Band 68, Seiten 326-331) mit Calciumchlorid behandelt worden war, transformiert unter Erhalt von E. coli-DH 1 (pKN 306).

In gleicher Weise wie im Absatz (3) des Beispiels 1 wurden 1.200 µg von Plasmid-pKN 306-DNA hergestellt. 10 µg davon und 50 Einheiten von Eco RI (hergestellt von Takara Shuzo K.K.) wurden in 50 mM Tris-salzsäure-Puffer, enthaltend 100 mM NaCl und 10 mMol MgSo₄ (pH-Wert 7,4) 2 Stunden bei 37°C umgesetzt und nach der Umsetzung wurde nach der Methode von R.C.A. Yang et al. (Methods in Enzymology, Band 68, Seiten 176-182 (1979)) fraktioniert, wobei man 3,5 µg eines 2,3 Kb DNA-Fragmentes, enthaltend einen Tetracyclin-resistenten Gen, erhielt.

Dann wurden 1 µg der oben erwähnten 2,3 Kb DNA, 1 µg 5′-pAATTGTCTAGA-Verknüpfer, hergestellt als DNA-Synthesizer-SYSTEM 1 Plus von Beckmann Co., 0,8 µg Eco RI-aufgeschlossene Bakteriophagen λcI857 1121S-DNA und 1 Einheit von T4-DNA-Ligase (hergestellt von Boehringer Mannheim Co.) bei 4°C während 20 Minuten in 66 mM Tris-salzsäure-Pufferlösung, enthaltend 6,6 mM MgSO₄, 10 mM Dithiothreitol und 10 mM ATP (pH-Wert 7,5) unter Erhalt von einer DNA, umgesetzt. E. coli QD 5003-Stamm, der mit Calciumchlorid behandelt worden war (nach der Methode von D.M. Morrison) wurde mit der so erhaltenen DNA transformiert unter Erhalt von E. coli QD 5003 (λcI857 1121S-Tc/xb).

In 50 mM Tris-salzsäure-Puffer, enthaltend 100 mM NaCl und 10 mM MgSO₄ (pH-Wert 7,4) wurden 2 µg Bakteriophagen λcI857 1121S-Tc/xb-DNA, die aus E. coli QD 5003 (λcI857 1121S-Tc/xb) nach der Methode von T. Maniatis et al. (Molecular Cloning, Seiten 76-85 (1982)) erhalten worden war und 10 Einheiten Xho I (hergestellt von Takara Shuzo K.K.) eingemischt und während 1 Stunde bei 37°C umgesetzt. Dann wurde das Produkt einer üblichen Phenolextraktion und Ethanolausfällung unterworfen unter Erhalt von 1,6 µg Xho I-aufgeschlossenem Produkt von Bakteriophagen-λcI857 1121S-Tc/xb-DNA.

Weiterhin wurden 1 µg von Bakteriophagen- λcI857S₇8042-DNA, die wie in Absatz (6) des Arbeitsbeispiels in der JP-OS 212.781/83 beschrieben, hergestellt worden war, 1 µg Bakteriophagen-λgtWES λB-DNA (hergestellt von Bethesda Research Laboratory Co.) und 10 Einheiten Eco RI (hergestellt von Takara Shuzo K.K.) bei 37°C während 1 Stunde in 50 mM Tris-salzsäure-Puffer, enthaltend 100 mM NaCl und 10 mM MgSO₄ (pH-Wert 7,4) umgesetzt und das Produkt wurde einer üblichen Phenolextraktion und Ethanolausfällung unterworfen, wobei man 1,6 µg des aufgeschlossenen Produktes erhielt.

Dann wurden 1,6 µg des wie oben aufgeschlossenen Produktes und 1 Einheit von T4-DNA-Ligase in 66 mM Tris-salzsäure-Puffer, enthaltend 6,6 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreitol und 10 mM ATP (pH-Wert 7,5) bei 4°C während 16 Stunden unter Erhalt einer DNA umgesetzt. Mit der so erhaltenen DNA wurde E. coli 1100, der zuvor mit Calciumchlorid behandelt worden war, nach der oben erwähnten Methode von D.M. Morrison transformiert, wobei man Bakteriophagen-12-2-WE erhielt, welcher in der Lage war, einen Belag auf E. coli 1100-Stamm zu bilden.

Dann wurde E. coli 1100 mit der oben erhaltenen Bakteriophagen-12-2-WE und mit Bakteriophagen-Φ-80 (hergestellt aus E. coli W3110 (Φ80) (ATCC 31277) nach der im Absatz 1 des Arbeitsbeispiels der JP-OS 212.781/83 beschriebenen bzw. nach der Methode in Absatz 2 des Arbeitsbeispiels in der JP-OS 212.781/83 infiziert unter Erhalt der bakteriolysierten Flüssigkeit. Dann wurde E. coli-W3110 (Φ80) (ATCC 31277), welches ein lysogenes Bakterium ist, mit der vorerwähnten bakteriolysierten Flüssigkeit infiziert unter Erhalt von Bakteriophagen-12-2-300, die in der Lage waren, einen Belag auszubilden.

Anschließend wurde Bakteriophagen-12-2-300-DNA, hergestellt aus Bakteriophagen-12-2-300, nach der vorerwähnten Methode von T. Maniatis et al. hergestellt und 2 µg davon wurden mit 20 Einheiten Xho I in 50 mM Tris-salzsäure-Puffer, enthaltend 100 mM NaCl und 10 mM MgSO₄ (pH-Wert 7,4) 1 Stunde bei 37°C umgesetzt und das Produkt wurde einer üblichen Phenolextraktion und Ethanolausfällung unterworfen unter Erhalt von 1,6 µg des aufgeschlossenen Produktes.

Dann wurde 1 µg von Xho I-aufgeschlossenes Produkt von Bakteriophagen-12-2-300-DNA, 1 µg des vorerwähnten Xho I-aufgeschlossenen Produktes von Bakteriophagen λcI857 1121-Tc/Xb-DNA und 1 Einheit von T4-DNA-Ligase in 66 mM Tris-salzsäure-Puffer, enthaltend 6,6 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreitol und 10 mM ATP (pH-Wert 7,5) während 16 Stunden bei 16°C umgesetzt. Mit der so erhaltenen DNA wurde E. coli QD 5003 (erhalten von Kyushu University), der zuvor nach der vorerwähnten Methode von D.M. Morrison mit Calciumchlorid behandelt worden war, transformiert, wobei man Bakteriophagen-EN501S-Tc, die in der Lage waren, einen Belag auf E. coli QD-5003-Stamm auszubilden, erhielt.

(2) Herstellung von Rekombinations-SNF1-DNA

0,2 µg von Bakteriophagen-EN501S-Tc-DNA, hergestellt nach der Methode von T. Maniatis: "Molecular Cloning", Seiten 75-85 (1982) und 10 Einheiten Eco RI (hergestellt von Takara Shuzo K.K.) wurden zu 50 mM Tris-salzsäure-Puffer (enthaltend 100 mM NaCl und 10 mM MgSO₄) (pH-Wert 7,4) gegeben und 1 Stunde bei 37°C umgesetzt, wobei man 0,2 µg Baktiophagen-EN501S-Tc-DNA, aufgeschlossen durch Eco RI erhielt.

Weiterhin wurden 20 µg der in Absatz 3 von Beispiel 1 erhaltenen Plasmid-pKLS601-DNA und 50 Einheiten von Eco RI (hergestellt von Takara Shuzo K.K.) in einen gleichen Puffer wie oben zusammengemischt und 2 Stunden bei 37°C umgesetzt unter Erhalt einer aufgeschlossenen Flüssigkeit.

Die aufgeschlossene Flüssigkeit wurde einer 0,7% (G/V) Agarosegel-Elektrophorese unterworfen und daraus wurde ein DNA-Fragment mit einer Größe von 3,3 kb nach der Methode von R.C.A. Yang et al. (Methods in Enzymology, Band 68, Seiten 176-182 (1979)) eluiert unter Erhalt von 3,5 µg eines DNA-Fragmentes.

1 µg des so erhaltenen DNA-Fragmentes, 0,2 µg der vorerwähnten bakteriophagen-EN501S-Tc-DNA und 1 Einheit von T4-DNA-Ligase (hergestellt von Boehringer Mannheim Co.) wurden zu 66 mM Tris-salzsäure-Puffer (enthaltend 6,6 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreitol und 10 mM ATP) (ph-Wert 7,5) gegeben und 16 Stunden bei 4°C unter Erhalt einer Rekombinations-DNA-SNF1 umgesetzt.

Dann wurde die SNF1-DNA nach der Methode von B. Hohn (Methods in Enzymology, Band 68, Seiten 299-309) (1979) einer in vitro-Packung unterworfen und zu E. coli 1100 (hergestellt vom Max-Plank-Institut, Bundesrepublik Deutschland) überführt unter Erhalt von E. coli 1100 (SNF1)-Stamm, der ein lysogenes Bakterium ist (hinterlegt in Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science & Technology, Japan, unter FERM BP-1301).

(3) Herstellung von SON unter Verwendung von E. coli 1100 (SNF1) und Isolierung und Reinigung des Enzyms

2 l eines Mediums, enthaltend 1% (G/V) Trypton, 0,5% (G/V) Hefeextrakt und 0,5% (G/V) Natriumchlorid wurden getrennt zu Kulturtanks vom Schütteltyp in einer klein-gefäßigen Kulturvorrichtung gegeben und in üblicher Weise bei erhöhtem Druck sterilisiert. Weiterhin wurde E. coli 1100 (SNF1) im gleichen Medium wie oben 24 Stunden bei 32°C kultiviert und 10 mM der so erhaltenen Kulturflüssigkeit wurden zu dem oben erwähnten sterilisierten Medium inokuliert. Eine Belüftungsschüttelkultur wurde bei 32°C durchgeführt bis die Konzentration an Bakterienzellen 100 Klett-Einheiten erreichte und dann wurde die Kultivierungstemperatur auf 42°C erhöht und 15 Minuten bei dieser Temperatur gehalten. Dann wurde die Temperatur auf 37°C erniedrigt und die Kultur wurde bei dieser Temperatur weitergeführt. Indem man dieses Verfahren fünfmal wiederholte, erhielt man 20 g feuchte Bakterienzellen.

Anschließend wurde das gleiche Verfahren zur Isolierung und Reinigung, wie es im Absatz 6 des Beispiels 1 beschrieben wird, wiederholt. Man erhielt 110 ml einer rohen Enzymlösung (450 Einheiten/ml), aus denen 32.000 Einheiten eines gereinigten SON-Pulvers hergestellt werden konnten (Ausbeute 65%).

Claims (14)

1. Rekombinante DNA, umfassend eine DNA mit einem für Sarkosinoxidase N codierendem Gen, gekennzeichnet durch die Restriktionsschnittstellen gemäß der Figur, eingefügt in eine Vektor-DNA, wobei die Figur Bestandteil dieses Anspruchs ist.

2. Neue rekombinante DNA gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA mit einem für Sarkosinoxidase N codierendem Gen eine DNA ist, die von einem Bacterium von Genus Bacillus abstammt.

3. Neue rekombinante DNA gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA mit einem für Sarkosinoxidase N codierendem Gen eine DNA ist, die von FERM BP-671 abstammt.

4. Neue rekombinante DNA gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Sarkosinoxidase N ein monomeres Protein ist.

5. Neue rekombinante DNA gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Sarkosinoxidase N durch eine covalente Bindung mit FAD verbunden ist.

6. Neue rekombinante DNA gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Vektor-DNA ein Plasmid von pUC18-DNA ist.

7. Neue rekombinante DNA gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Vektor-DNA Bacteriophagen EN501S-Tc-DNA ist.

8. Verfahren zur Herstellung von Sarkosinoxidase N, umfassend die Schritte: Einfügen einer DNA mit einem für Sarkosinoxidase N codierendem Gen gekennzeichnet durch die Restriktionsschnittstellen gemäß der Figur in eine Vektor- DNA, Klonieren der rekombinanten DNA in einen Mikroorganismus vom Genus Escherichia, Kultivieren des Mikroorganismus in einem Medium und anschließend Gewinnung des Produkts Sarkosinoxidase N, wobei die Figur Bestandteil dieses Anspruchs ist.

9. Verfahren zur Herstellung von Sarkosinoxidase N gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA mit einem für Sarkosinoxidase N codierendem Gen eine DNA ist, die von einem Bacterium vom Stamme Genus Bacillus abstammt.

10. Verfahren zur Herstellung von Sarkosinoxidase N gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA mit einem für Sarkosinoxidase N codierendem Gen eine DNA ist, die von FERM BP-671 abstammt.

11.Verfahren zur Herstellung von Sarkosinoxidase N gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Sarkosinoxidase N ein monomeres Protein ist.

12. Verfahren zur Herstellung von Sarkosinoxidase N gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Sarkosinoxidase N mit FAD mittels einer covalenten Bindung verknüpft ist.

13. Verfahren zur Herstellung von Sarkosinoxidase N gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Vektor-DNA Plasmid pUC18-DNA ist.

14. Verfahren zur Herstellung von Sarkosinoxidase N gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Vektor-DNA Bacteriophagen EN501S-Tc-DNA ist.