DE3714532C2 - Neue Rekombinations-DNA und Verfahren zur Herstellung von Sarkosinoxidase N - Google Patents
Neue Rekombinations-DNA und Verfahren zur Herstellung von Sarkosinoxidase NInfo
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Description
Die Erfindung betrifft eine neue rekombinante DNA, die
zur Herstellung von Sarkosinoxidase N geeignet ist, sowie
ein Verfahren zur Herstellung von Sarkosinoxidase N.
Sarkosinoxidase ist ein Enzym, welches die folgende
Reaktion katalysiert:
Sie wird beispielsweise in der JP-OS 52 789/79 und in J.
Biochem. 89, 599 (1981) Japan erwähnt und ist
infolgedessen bekannt.
Weiterhin wird in "Symposium on Clinical Chemistry",
19. Kollektion, Seite 196 (1979) eine enzymatische
quantitative Analyse von Kreatinin und von Kreatin unter
Verwendung von Sarkosinoxidase berichtet. Sarkosinoxidase
ist also auch für diesen Zweck geeignet. Diese analytische
Methode wird nachfolgend erläutert, wobei der in Klammern
gesetzte Ausdruck das verwendete Enzym beschreibt:
Zuvor hat einer der vorliegenden Erfinder einen neuen
Stamm von Genus Bacillus aus der Erde isoliert und
festgestellt, daß ein kultiviertes Produkt dieses Stammes
eine neue Sarkosinoxidase mit einer hohen enzymatischen
Aktivität auch in schwach saurer Umgebung ergibt, wobei
die Sarkosinoxidase eine hohe Wärmebeständigkeit und einen
niedrigen Km-Wert gegenüber Sarkosin aufweist. Basierend
auf dieser Feststellung wurde eine Patentanmeldung für die
wärmebeständige Sarkosinoxidase N und ein Verfahren zu
deren Herstellung eingereicht (Japanische
Offenlegungsschrift 162 174/86).
Um eine maximale Enzymausbeute bei dem vorerwähnten
Herstellungsverfahren für die wärmebeständige
Sarkosinoxidase N zu erzielen, muß man teures Kreatinin,
Kreatin und/oder Sarkosin zu dem Medium geben. Dies ist
aus wirtschaftlichen Gründen nachteilig und erschwert eine
Produktion.
Die vorliegenden Erfinder haben nun zahlreiche
Untersuchungen durchgeführt, um die vorerwähnten Probleme
zu lösen. Sie haben dabei gefunden, daß man
wärmebeständige Sarkosinoxidase N mit einer hohen
Effizienz ohne Zugabe von Kreatinin, Kreatin und/oder
Sarkosin zu einem Medium erhalten kann,
einem für wärmebeständige Sarkosinoxidase N codierenden
in eine Vektor-DNA einsetzt unter Erhalt einer
rekombinanten DNA, wobei dann, wenn man diese
rekombinante DNA in einen Stamm, der zum Genus
Escherichia gehört, einführt, man einen Stamm erhält, der
die Fähigkeit hat, wärmebeständige Sarkosinoxidase N zu
erzeugen, worauf man dann den letzteren in einem Medium
kultiviert. Auf dieser Feststellung aufbauend, wurde die
vorliegende Erfindung gemacht.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit eine neue
rekombinante DNA mit den Merkmalen des Anspruchs 1, die hergestellt wurde, indem man eine
DNA mit einem für Sarkosinoxidase N codierendem Gen in eine
Vektor-DNA einsetzt. Die Erfindung betrifft auch ein
Verfahren zur Herstellung von Sarkosinoxidase N gemäß den Ansprüchen 8 bis 14, umfassend
die Schritte: Einfügen einer DNA mit einem für
Sarkosinoxidase N codierendem Gen gekennzeichnet durch die
Restriktionsschnittstellen gemäß der Figur in eine Vektor-DNA,
Klonieren der rekombinanten DNA in einen
Mikroorganismus vom Genus Escherichia, Kultivieren des
Mikroorganismus in einem Medium und anschließend Gewinnung
des Produkts Sarkosinoxidase N.
Die anliegende Figur beschreibt die Spaltungskarte
mittels Restriktionsenzym eines DNA-Fragmentes mit einer
Gencodierung für Sarkosinoxidase N (nachfolgend einfach
als "SON" bezeichnet).
Die Erfindung wird nachfolgend ausführlicher beschrieben.
Zunächst wird die Herstellung von DNA mit einem
codierenden Gen für wärmebeständige Sarkosinoxidase N (SON)
beschrieben.
Bacillus sp. NS-129-Stamm (hinterlegt im Fermentation
Research Institute, Agency of Industrial Science &
Technology, Japan als FERM BP-671) wird in gleicher Weise,
wie dies in der JP-OS 162 174/86 beschrieben wird, unter
Erhalt des kultivierten Produktes kultiviert. Das
kultivierte Produkt wird dann beispielsweise mit 3000 Upm
oder mehr, vorzugsweise mit 8000 bis 10.000 Upm, während
eines Zeitraums von 5 Minuten oder mehr, vorzugsweise
während 10 bis 15 Minuten, zentrifugiert unter Erhalt von
Bakterienzellen vom Bacillus sp. NS-129-Stamm.
Aus diesen Bakterienzellen kann man Chromosom-DNA
erhalten, z. B. nach der Methode von Saito und Miura
(Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)).
Dann wird die Chromosomen-DNA durch Behandeln mit einem
Restriktionsenzym, welches ein kohäsives Ende ausbildet,
wie Sau 3AI (hergestellt von Toyo Boseki K.K.), bei einer
Temperatur von 30°C oder darüber, vorzugsweise bei
37°C, bei einer Enzymkonzentration von 1 bis 10
Einheiten/ml während eines Zeitraums von 20 Minuten oder
mehr und vorzugsweise von 0,5 Stunden bis 2 Stunden unter
Erhalt einer Mischung, bestehend aus verschiedenen
Chromosom-DNA-Fragmenten, verdaut.
Aus der so erhaltenen DNA-Fragment-Mischung wird die
DNA-Fragment-Mischung hergestellt, z. B. durch übliche
Agarosegel-Elektrophorese. Diese wird dann durch
Reinigungsmaßnahmen, z. B. durch eine Phenolextraktion,
gereinigt. Weiterhin wird sie durch
Konzentrationsmaßnahmen, wie eine Ethanolausfällung und
dgl., unter Erhalt einer gereinigten
DNA-Fragment-Mischung, in welcher die DNA-Fragmente eine
Gencodierung für SON haben, konzentriert.
Als Vektor-DNA wird bei der vorliegenden Erfindung
irgendeine beliebige Vektor-DNA verwendet. Beispielsweise
können hier Plasmid-Vektor-DNA, Bacterophagen-Vektor-DNA
und dgl. erwähnt werden. Genauer gesagt, wird
beispielsweise Plasmid pBR322-DNA (hergestellt von
Bethesda Research Laboratories), Plasmid pUC18
(hergestellt von Pharmacia Co.) und Bacteriophagen
EN501S-Tc-DNA bevorzugt.
Die vorerwähnte Vektor-DNA wird durch Behandeln mit einem
kohäsive Enden bildenden Restriktionsenzym, z. B. Bam HI
(hergestellt von Takara Shuzo K.K.) bei einer Temperatur
von 30°C oder höher, vorzugsweise bei 37°C, bei einer
Enzymkonzentration von 10 bis 1.000 Einheiten/ml während
eines Zeitraums von 1 Stunde oder mehr, vorzugsweise 2 bis
3 Stunden unter Erhalt einer aufgespaltenen Vektor-DNA
aufgeschlossen.
Anschließend wird die vom Bacillus sp. NS-129-Stamm
stammende vorerwähnte DNA-Fragment-Mischung mit einer
Gencodierung für SON mit der aufgespaltenen Vektor-DNA
vermischt und die erhaltene Mischung wird beispielsweise
mit E. coli DNA-Ligase (hergestellt von New England Bio
Labs Co.), T4-DNA-Ligase (hergestellt von
Boehringer-Mannheim Co.) und dergl. und vorzugsweise mit
T4-DNA-Ligase bei einer Temperatur von 4 bis 37°C,
vorzugsweise 4 bis 16°C, bei einer Enzymkonzentration
von 1 bis 100 Einheiten/ml während eines Zeitraums von
1 Stunde oder mehr und vorzugsweise 6 bis 24 Stunden unter
Erhalt einer Rekombinations-DNA behandelt.
Mittels dieser Rekombinations-DNA werden dann E. coli
K-12-Stamm, vorzugsweise E. coli HB 101 (ATCC 33694), E.
coli DHI (ATCC 33849), E. coli X-1776 (ATCC 31244) und
dgl., die frei von der allgemeinen American Type Culture
Collection-Sammelstelle erhältlich sind, transformiert
oder überführt unter Erhalt der jeweiligen Stämme. Diese
Transformation kann nach der Methode von D.M. Morrison
(Methods in Enzymology, Band 68, Seiten 326-331 (1979))
erfolgen. Die Transduktion kann nach der Methode von
B. Hohn (Methods in Enzymology, Band 68, Seiten 299-309
(1979) durchgeführt werden.
Indem man einen Stamm mit einer SON-bildenden Fähigkeit
aus den so erhaltenen Stämmen ausscreent, erhält man einen
Stamm vom Genus Escherichia mit SON-produzierender
Fähigkeit und enthaltend eine rekombinante DNA, die
hergestellt wurde, indem man eine DNA mit einem
SON-codierenden Gen in eine Vektor-DNA einsetzt.
Von dem so erhaltenen Stamm kann man eine gereinigte
Rekombinations-DNA beispielsweise nach der Methode von P.
Guerry (J. Bacteriology, Band 116, Seiten 1064-1066
(1973)), nach der Methode von D. B. Clewell (J.
Bacteriology, Band 110, Seiten 667-676 (1972)) und dergl.
erhalten.
Da die in der so erhaltenen Rekombinations-DNA vorliegende
DNA mit einem SON-codierenden Gen nach der Reinigung nicht
nur SON-codierendes Gen, sondern auch unnötigte DNA
enthält, muß man die unnötige DNA nach dem nachfolgenden
Verfahren entfernen.
Die, wie vorher angegeben erhaltene und gereinigte
Rekombinations-DNA wird durch Behandeln mit einem
Restriktions-Enzym, wie Hpa I und Bgl II (beide
hergestellt von Takara Shuzo K.K.) bei einer Temperatur
von nicht weniger als 30°C und vorzugsweise 37°C bei
einer Enzymkonzentration von 10 bis 1.000 Einheiten/ml
während eines Zeitraums von 20 Minuten oder mehr,
vorzugsweise 1 bis 6 Stunden, unter Erhalt einer
DNA-Fragment-Mischung verdaut.
Aus der so erhaltenen DNA-Fragment-Mischung wird ein
DNA-Fragment, welches eine Gencodierung für SON enthält,
beispielsweise durch übliche Agarosegel-Elektrophorse
gewonnen. Weiterhin erfolgt eine Reinigung durch
Reinigungsverfahren, z. B. eine Phenolextraktion, und dann
erfolgt eine Konzentrierung, z. B. durch eine
Ethanolausfällung. Auf diese Weise erhält man gereinigtes
DNA-Fragment, enthaltend ein DNA-Fragment mit
SON-codierendem Gen.
Als Vektor-DNA kann man bei der vorliegenden Erfindung
jede Vektor-DNA verwenden. So kann man beispielsweise
Plasmid-Vektor-DNA, Bakteriophagen-Vektor-DNA und dgl.
einsetzen. Genauer gesagt, werden bevorzugt
Plasmid-puC18-, pUC12-, pUC8-DNA (hergestellt von
Pharmacia Co.), Bacteriophagen EN501S-Tc-DNA und dgl.
verwendet.
Die vorerwähnte Vektor-DNA wird durch Behandeln mit einem
Restriktions-Enzym, wie Bam HI und Hinc II (hergestellt
von Takara Shuzo K.K.) bei einer Temperatur von nicht
weniger als 30°C und vorzugsweise 37°C bei einer
Enzymkonzentration von 10 bis 1.000 Einheiten/ml während
eines Zeitraums von 1 Stunde oder mehr und vorzugsweise 1
bis 3 Stunden unter Erhalt einer aufgespaltenen Vektor-DNA
verdaut.
Dann wird das in vorerwähnter Weise erhaltene
DNA-Fragment, das vom Bacillus sp. NS-129-Stamm abstammt,
und ein SON-codierendes Gen enthält, mit der vorerwähnten
aufgespaltenen Vektor-DNA vermischt und die Mischung wird
mit T4-DNA-Ligase (hergestellt von Boehringer-Mannheim
Co.) und dgl. (vorzugsweise T4-DNA-Ligase) bei einer
Temperatur von 4 bis 37°C, vorzugsweise 4 bis 16°C,
bei einer Enzymkonzentration von 1 bis 100 Einheiten/ml
während eines Zeitraums von 1 Stunde oder mehr und
vorzugsweise 6 bis 24 Stunden unter Erhalt einer
Rekombinations-DNA behandelt.
Unter Verwendung dieser Rekombinations-DNA wird E. coli
K-12-Stamm, vorzugsweise E. coli JM-101 (ATCC 33876),
E. coli HB 101 (ATCC 33694), E. coli DHI (ATCC 33849),
E. coli X-1776 (ATCC 31244) und dgl. transformiert oder
transduziert unter Erhalt der entsprechenden Stämme. Die
Transformation kann man nach der Methode von D. M.
Morrison (Methods in Enzymology, Band 68, Seiten 326-331
(1979)) durchführen. Die Transduktion kann man nach der
Methode von B. Hohn (Methods in Enzymology, Band 68,
Seiten 299-309 (1979)) durchführen.
Indem man einen Stamm mit SON-bildender Fähigkeit aus den
so erhaltenen Stämmen aussiebt, kann man einen Stamm vom
Genus Escherichia mit SON-bildender Fähigkeit und
enthaltend eine Rekombinations-DNA, die durch Einsetzen
eines DNA mit SON-bildendem Gen in eine Vektor-DNA
erhalten wurde, erhalten.
Zur Herstellung von gereinigter neuer Rekombinations-DNA
aus dem wie oben erhaltenen Stamm kann man beispielsweise
die Methode von P. Guerry (J. Bacteriology, Band 116,
Seiten 1064-1066 (1973)), die Methode von D.B. Clewell
(J. Bacteriology, Band 110, Seiten 667-676 (1972))
anwenden.
Zur Ausbildung von SON unter Verwendung eines Stammes vom
Genus Escherichia mit SON-bildender Fähigkeit und
enthaltend eine Rekombinations-DNA, die hergestellt wurde
durch Einsetzen von DNA mit SON-Gen in eine Vektor-DNA,
wobei der SON-Stamm in vorerwähnter Weise erhalten wurde,
kann man den Stamm nach einer üblichen Festkulturmethode
kultivieren. Vorzugsweise wird er jedoch mittels einer
Flüssigkulturmethode kultiviert.
Als Kulturmedium für den Stamm kann man ein Medium
verwenden, bei dem man wenigstens ein anorganisches Salz,
wie primäres Kaliumphosphat, sekundäres Kaliumphosphat,
Magnesiumsulfat, Magnesiumchlorid, Eisen(III)chlorid,
Eisen(III)sulfat, Mangansulfat und dgl. und
gewünschtenfalls weitere Komponenten, wie Zucker, Vitamine
und dgl. zu wenigstens einer Stickstoffquelle, wie
Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt, Maismeische,
Sojabohnenmeische, Weizenkleie-Einweichflüssigkeit und
dgl. zugibt.
Vorzugsweise beträgt der Anfangs-pH-Wert des Mediums 7 bis
9. Die Kultivierung wird bei einer Temperatur von 30 bis
42°C und vorzugsweise etwa 37°C während eines
Zeitraums von 4 bis 24 Stunden und vorzugsweise 6 bis
8 Stunden mittels einer belüfteten und gerührten
Eintauchkultur, einer Schüttelkultur, einer Standkultur
und dgl. durchgeführt.
Nach Beendigung der Kultivierung kann man SON aus dem
kultivierten Produkt in der für die Sammlung von Enzymen
üblichen Weise gewinnen.
Beispielsweise werden Bakterienzellen einer
Ultraschallabbaubehandlung oder einem Mahlen in üblicher
Weise unterworfen. Andererseits kann man das angestrebte
Enzym auch mittels einem bakteriolytischen Enzyms, wie
einem Lysozym und dergl. extrahieren. Weiterhin kann man
Bakterienzellen schütteln oder in Gegenwart von Toluol und
dgl. stehenlassen und eine Selbstverdauung durchführen,
wodurch dann das angestrebte Enzym aus den Bakterienzellen
freigegeben wird. Aus der dabei erhaltenen Lösung wird das
Festprodukt durch Filtrieren, Zentrifugieren usw. entfernt
und gewünschtenfalls können Nucleinsäuren mittels
Streptomycinsulfat, Protaminsulfat oder Mangansulfat
entfernt werden, worauf man dann durch Zugabe von
Ammoniumsulfat, Alkohol, Aceton und dergl. fraktioniert.
Der so erhaltene Niederschlag wird gesammelt, gegen Wasser
dialysiert und dann im Vakuum getrocknet unter Erhalt
einer rohen Enzymprobe.
Gewünschtenfalls kann man eine hochreine Probe von SON aus
dem wie oben erhaltenen Enzym durch eine geeignete
Kombination von üblichen Methoden zur Isolierung und
Reinigung von Enzymen herstellen, z. B. (1)
Säulenchromatographie unter Verwendung von DEAE-Cellulose,
(2) Fraktionieren unter Verwendung von Ammoniumsulfat,
(3) Säulenchromatographie unter Verwendung von
QAE-Sephadex, (4) hydrophobe Chromatographie unter
Verwendung von TSK-GEL-Butyl-Toyopearl 650 C (hergestellt
von Toyo Soda K.K.), (5) Gelfiltration unter Verwendung
von Sephadex und andere Methoden.
Die physikochemischen Eigenschaften des mittels der obigen
Methoden gereinigten SON werden nachfolgend gezeigt und
sind identisch mit denen, die in der JP-OS 162 174/86
angegeben sind.
- (a) Wirkung
Sarkosinoxidase N katalysiert die nachfolgende Enzymreaktion, bei welcher Sarkosin oxidativ unter Bildung von Glycin, Formaldehyd und Wasserstoffperoxid zersetzt wird: - b) Substratspezifität
Sarkosinoxidase N hat eine Km-Zahl (Michaelis-Konstante) für Sarkosin von 4,7 mM bei 37°C bei einem pH-Wert von 7,7 (Phosphatpufferlösung). - c) Optimaler pH-Wert und stabiler pH-Bereich
Der optimale pH-Wert von Sarkosinoxidase N ist 6,7 bis 10,0, wenn man Sarkosin als ein Substrat verwendet. Der stabile pH-Bereich liegt zwischen 6,5 und 11,5. - d) Optimaler Temperaturbereich
45 bis 60°C - e) Wärmestabilität
Sarkosinoxidase N behält seine enzymatische Aktivität von 98% bei, wenn man es während 10 Minuten bei 55°C behandelt und eine Aktivität von 75%, wenn man es bei 60°C 10 Minuten behandelt. - f) Molekulargewicht
Etwa 49.000, gemessen durch Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-150. - g) Flavinenzymprotein
Sarkosinoxidase N enthält 1 Mol kovalent-gebundenes Flavinadenindinucleotid (FAD) pro Mol des Enzyms.
Aus der vorhergehenden Beschreibung geht hervor, daß man
Sarkosinoxidase mit einer hohen Effizienz erhalten kann,
ohne daß man Kreatin, Kreatinin oder Sarkosin und dgl.
zugeben muß, wenn man einen Stamm vom Genus Escherichia,
der die neue Rekombinations-DNA der vorliegenden Erfindung
enthält, in einem Kulturmedium kultiviert. Infolgedessen
ist die vorliegende Erfindung von hohem wirtschaftlichen
Interesse.
Die Erfindung wird ausführlicher in den nachfolgenden
Beispielen erläutert.
Bacillus sp. NS-129 (FERM BP-671)-Stamm wurde in 200 ml
T-Y-Medium (1% (G/V) von Bacto-trypton (hergestellt von
Difco Co.), 0,5% (G/V) Bacto-Hefeextrakt (hergestellt von
Difco Co.) und 0,5% (G/V) von NaCl (pH-Wert 7,2)
inokuliert und 16 Stunden bei 30°C einer Schüttelkultur
unterworfen, wobei man ein kultiviertes Produkt erhielt.
Das kultivierte Produkt wurde in üblicher Weise 10 Minuten
mit 10.000 Upm zentrifugiert unter Erhalt von 0,5 g
feuchten Bakterienzellen. Anschließend wurde chromosome
DNA aus den feuchten Bakterienzellen nach der Methode von
Saito und Miura (Biochem. Biophys. Acta, Band 72, Seite
619 (1963)) hergestellt.
Dann wurden 0,1 mg dieser chromosomen DNA und zwei
Einheiten Restriktionsenzym Sau 3AI (hergestellt von Toyo
Boseki K.K.) zu 10 mM Tris-salzsäure-Pufferlösung
(enthaltend 50 mM NaCl, 10 mM MgSO₄ und 1 inM
Dithiothreitol) (pH 7,4) eingemischt und 45 Minuten bei
37°C umgesetzt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde das
Reaktionsgemisch in üblicher Weise elektrophoretisiert
unter Verwendung von 0,7% (G/V) Agarosegel (hergestellt
von Takara Shuzo K.K.) und das DNA-Fragment mit einer
Größe von 4 bis 8 kb (kilo base pair) wurde nach der
Methode von R.C.A. Yang et al. (Method in Enzymology, Band
68, Seiten 176-182 (1979)) unter Erhalt eines Eluats
eluiert. Das Eluat wurde in üblicher Weise einer
Phenolextraktion unterworfen und dann einer
Ethanolausfällung unter Erhalt von 10 µg von
Chromosom-DNA-Fragment von Bacillus sp. NS-129-Stamm, der
in Sau 3AI verdaut war.
10 µg Plasmid-pBR322-DNA (hergestellt von Bethesda
Research Laboratories Co.) und 100 Einheiten von
Restriktionsenzym Bam HI (hergestellt von Takara Shuzu
K.K.) wurden in 50 ml Tris-salzsäure-Puffer, enthaltend
100 ml NaCl und 10 mM MgSO₄ (pH-Wert 7,4) eingemischt
und 2 Stunden bei 37°C unter Erhalt einer abgebauten
Lösung umgesetzt. Die letztere wurde in üblicher Weise
einer Phenolextraktion und dann einer Ethanolausfällung
unterworfen unter Erhalt von Plasmid-pBR322-DNA,
aufgeschlossen durch Bam HI.
Anschließend wurden 10 µg der so erhaltenen durch
Bam HI aufgeschlossenen Plasmid-pBR322-DNA, 10 µg der
chromosomen DNA-Fragmente von Bacillus sp. NS-129-Stamm,
aufgeschlossen durch Sau 3AI, erhalten gemäß (1) und
5 Einheiten T4-DNA-Ligase (hergestellt von Boehringer
Mannheim Co.) zu 66 mM Tris-salzsäure-Puffer (pH-Wert
7,5), enthaltend 6,6 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreitol und
10 mM ATP gegeben und 16 Stunden bei 16°C unter Erhalt
einer verbundenen DNA umgesetzt.
Dann wurde E. coli-DHI-Stamm (ATCC 33849), der nach der
Methode von D.M. Morrison (Method in Enzymology, Band 68,
Seiten 326-331 (1979)) einer Calciumchloridbehandlung
unterworfen war, mit der verbundenen, in obiger Weise
erhaltenen DNA transformiert. Auf diese Weise wurden 1.000
transformierte Stämme, die beständig gegen Ampicillin und
empfindlich gegenüber Tetracyclin waren, erhalten.
Ob die so erhaltenen transformierten Stämme eine
SON-Aktivität aufwiesen oder nicht, wurde in folgender
Weise untersucht:
Jeder Stamm wurde zu 5 ml T-Y-Medium, enthaltend 0,5%
(G/V) Sarkosin (hergestellt von Tokyo Kasei Kogyo K.K.)
und 50 µg/ml Ampicillin inokuliert und 24 Stunden bei
30°C unter Erhalt einer kultivierten Flüssigkeit
kultiviert. Diese wurde dann mit 3.500 Upm während 10
Minuten unter Erhalt von feuchten Bakterienzellen
zentrifugiert. Die letzteren wurden in 1 ml 10 mM
Phosphatpuffer (pH-Wert 7,5), enthaltend 1% (G/V)
Sarkosin, suspendiert und dazu wurden 20 µl Toluol
gegeben und die erhaltene Mischung wurde 1 Stunde bei
37°C umgesetzt und dann in üblicher Weise mit 3.500 Upm
während 10 Minuten zentrifugiert unter Erhalt einer
Reaktionsflüssigkeit. Zu der Reaktionsflüssigkeit wurden
0,15 ml einer 1%igen (G/V) Lösung von
4-Amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4-triazol, 0,15 ml
einer 23%igen (G/V) Lösung von Kaliumhydroxid und 0,15 ml
einer 0,08%igen (G/V) Lösung von Natriummetaperiodat
gegeben. Als Ergebnis schlug die Farbe der
Reaktionsflüssigkeit nach violett um und dies bedeutete
einen transformierten Stamm mit SON-Aktivität. Es wurde
somit ein transformierter E. coli DHI-(pKLS 601)-Stamm mit
SON-Aktivität erhalten.
E. coli DHI-(pKLS 601) wurde in ein Medium aus 1% (G/V)
Trypton, 0,5% (G/V) Hefeextrakt und 0,5% (G/V) NaCl bei
37°C während 16 bis 24 Stunden vorkultiviert. 20 ml der
so erhaltenen Kulturflüssigkeit wurden zu 1 l des gleichen
Mediums, wie oben, inokuliert und 3 Stunden bei 37°C
einer Schüttelkultur unterworfen und anschließend wurden
0,2 g Chloramphenicol zu der Kulturflüssigkeit gegeben.
Die Kultur wurde 20 Stunden bei dieser Temperatur
gehalten, wobei man eine kultivierte Flüssigkeit erhielt.
Dann wurde die kultivierte Flüssigkeit in üblicher Weise
mit 10.000 Upm während 10 Minuten unter Erhalt von
feuchten Bakterienzellen zentrifugiert. Nach dem
Suspendieren der feuchten Bakterienzellen in 20 ml 50 mM
Tris-salzsäure-Pufferlösung (pH-Wert 8,0), enthaltend 25%
(G/V) Saccharose, 10 mg Lysozym, 8 ml 0,25M EDTA-Lösung
(pH-Wert 8,0) wurden 8 ml einer 20%igen (G/V) Lösung von
Natriumdodecylsulfat zugegeben. Nach 30-minütiger
Bakteriolyse bei 60°C erhielt man eine bakteriolysierte
Flüssigkeit.
Die bakteriolysierte Flüssigkeit wurde 13 ml einer 5M
NaCl-Lösung bei 4°C während 16 Stunden behandelt und
anschließend in üblicher Weise mit 15.000 Upm während 30
Minuten unter Erhalt einer Extraktionslösung
zentrifugiert. Die letztere wurde in üblicher Weise einer
Phenolextraktion und einer Ethanolausfällung unter Erhalt
eines Niederschlags behandelt.
Nach dem Trocknen des Niederschlags unter vermindertem
Druck in üblicher Weise wurde dieser in 6 ml 10 mM
Tris-salzsäure-Pufferlösung (pH-Wert 7,5), enthaltend 1 mM
EDTA gelöst und dazu wurden 6 g Cäsiumchlorid und 0,2 ml
einer 10 mg/ml-Lösung Ethidiumbromid gegeben. Die so
erhaltene Mischung wurde einer
Gleichgewichts-Dichtegradienten-Zentrifugierung mittels
einer Ultrazentrifuge bei 39.000 Upm während 42 Stunden in
üblicher Weise unterworfen unter Isolierung der
Rekombinations-Plasmid-pKLS 601-DNA. Nach der Entfernung
von Ethidiumbromid unter Verwendung von n-Butanol wurde
die DNA gegen 10 mM Tris-salzsäure-Puffer (pH-Wert 7,5),
enthaltend 1 mM EDTA, dialysiert, wobei man 2.700 µg
gereinigte Rekombinations-Plasmid-pKLS 601-DNA erhielt.
Deren Größe war etwa 9,1 kb.
Zur 10 mM Tris-salzsäure-Pufferlösung (enthaltend 50 mM
NaCl, 10 mM MgSO₄ und 1 mM Dithiothreitol) (pH-Wert 7,4)
wurden 0,2 µg Plasmid-pUC18-DNA (hergestellt von
Pharmacia Co.), 10 Einheiten von Restriktionsenzym Hinc 11
(hergestellt von Takara Shuzo K.K.) und 10 Einheiten von
Restriktionsenzym Bam HI (hergestellt von Takra Shuzo
K.K.) gegeben. Die Mischung wurde 1 Stunde bei 37°C
umgesetzt unter Erhalt einer aufgeschlossenen Flüssigkeit.
Die aufgeschlossene Flüssigkeit wurde in üblicher Weise
einer Phenolextraktion und dann einer Ethanolausfällung
unterworfen unter Erhalt von Plasmid-pUC18-DNA,
aufgeschlossen durch Hinc II und Bam HI.
Dann wurden 12 µg der in Absatz (3) erhaltenen
Rekombinations-pKLS601-DNA, 12 Einheiten Hpa I
(hergestellt von Takara Shuzo K.K.) und 30 Einheiten von
Bgl II (hergestellt von Takara Shuzo K.K.) in 10 mM
Tris-salzsäure-Puffer (enthaltend 50 mM NaCl, 10 mM
MgSo₄ und 1 mM Dithiothreitol) (pH-Wert 7,4) eingemischt
und 5 Stunden bei 37°C umgesetzt unter Erhalt einer
aufgeschlossenen Flüssigkeit.
Die aufgeschlossene Flüssigkeit wurde einer 0,7% (G/V)
Agarosegel-Elektrophorese unterworfen und dabei wurde ein
DNA-Fragment von 1,7 kb nach der Methode von R.C.A. Yang
et al. (Methods in Enzymology, Band 68, Seiten 176-182
(1979)) eluiert unter Erhalt eines Eluats. Das Eluat wurde
in üblicher Weise einer Phenolextraktion und
Ethanolausfällung unterworfen unter Erhalt von 1,3 µg
DNA-Fragment.
Dieses DNA-Fragment war ein DNA-Fragment, welches eine
Gencodierung für SON enthielt.
Anschließend wurde dieses DNA-Fragment einem
Einfachaufschluß und einem Doppelaufschluß unter
Verwendung von Bgl II, Dra I, Pvu II, Hinc III, Hpa I
(dies sind alles Restriktionsenzyme hergestellt, von
Takara Shuzo K.K.), Asu II (Restriktionsenzym, hergestellt
von Promega Biotec Co.) und Bst EII (Restriktionsenzym,
hergestellt von Nippon gene Co.) unterworfen unter Erhalt
von DNA-Fragmenten und deren Mobilitätsmuster wurde durch
Agarosegel-Elektrophorese analysiert. Durch einen
Vergleich der so gefundenen Mobilitätsmuster mit dem
Standard-Mobilitätsmuster von DNA-Fragment, erhalten durch
Aufschluß von DNA mit Hinc III wurde das Molekulargewicht
mit 1.700 bp (Basenpaar) (vgl. Journal of Molecular
Biology, Band 98, Seiten 551-564 (1975)) festgestellt. Die
Spaltungskarte des vorerwähnten DNA-Fragmentes durch die
Restriktionsenzyme wird in der anliegenden Zeichnung
gezeigt.
Dann wurden 0,15 µg der so erhaltenen DNA-Fragmente,
0,2 µg von Plasmid-pUC18-DNA, aufgeschlossen durch
Hinc II und Bam HI und eine Einheit von T4-DNA-Ligase
(hergestellt von Boehringer Mannheim Co.) zu 66 mM
Tris-salzsäure-Puffer (enthaltend 6,6 mM MgCl₂, 10 mM
Dithiothreitol und 10 mM ATP) (pH-Wert 7,5) gemischt und
16 Stunden bei 4°C unter Erhalt einer verbundenen DNA
umgesetzt.
Dann wurden die vorerwähnten E. coli-JM 101 (ATCC 33876),
die nach der vorerwähnten Methode von D. M. Morrison einer
Calciumchloridbehandlung unterworfen worden waren, mit der
obigen erhaltenen verbundenen DNA transformiert und der
erhaltene transformierte Stamm wurde in einem
T-Y-Agarplattenmedium, enthaltend 50 µg/ml Ampicillin,
0,5 mM Isopropyl-β-D-thiogalactosid und 0,004% (G/V)
5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid bei 37°C während
24 Stunden kultiviert. Bei dieser Kultur ist der Stamm,
der sich als weiße Kolonie bildet, der gesuchte
SON-produzierende Stamm. Man erhielt auf diese Weise einen
E. coli JM101-(pKLS612)-Stamm, der eine weiße Kolonie
bildete.
Der E. coli JM101-(pKLS612)-Stamm, der ein transformierter
Stamm mit SON-produzierender Fähigkeit ist, wurde im
Fermentations Research Institute, Agency of Industrial
Science & Technology, Japan, unter FERM BP-1146
hinterlegt.
E. coli JM101-(pKLS612)-Stamm wurde in ein Medium,
umfassend 1% (G/V) Trypton, 0,5% (G/V) Hefeextrakt und
0,5% (G/V) NaCl 16 bis 24 Stunden bei 37°C unter Erhalt
einer kultivierten Flüssigkeit vorkultiviert. 20 ml der
Kulturflüssigkeit wurden zu 1 l des gleichen Mediums wie
oben inokuliert und einer Schüttelkultur während 3 Stunden
bei 37°C unterworfen und dann wurden zu der
Kulturflüssigkeit 0,2 g Chloramphenicol gegeben und die
Kultivierung wurde bei der gleichen Temperatur 20 Stunden
fortgesetzt unter Erhalt einer Kulturflüssigkeit.
Die Kulturflüssigkeit wurde in üblicher Weise mit
10.000 Upm während 10 Minuten zentrifugiert, wobei man
feuchte Bakterienzellen erhielt. Die feuchten
Bakterienzellen wurden in 20 ml 50 mM
Tris-salzsäure-Pufferlösung (pH-Wert 8,0), enthaltend 25%
(G/V) Saccharose suspendiert und dann wurden 10 mg
Lysozym, 8 mM einer 0,25M EDTA-Lösung (pH-Wert 8,0) und
8 ml einer 20%igen (G/V) Lösung von Natriumdodecylsulfat
zugegeben. Die Suspension wurde 30 Minuten bei 60°C zur
Durchführung der Bakteriolyse gehalten. Anschließend wurde
die bakteriolysierte Flüssigkeit gewonnen.
Die bakteriolysierte Flüssigkeit wurde mit 13 ml einer 5M
NaCl-Lösung während 16 Stunden bei 4°C behandelt und
dann in üblicher Weise mit 15.000 Upm während 30 Minuten
zentrifugiert, wobei man eine Extraktionslösung erhielt.
Die Extraktionslösung wurde in üblicher Weise einer
Phenolextraktion und dann einer Ethanolausfällung
unterworfen unter Erhalt eines Niederschlags.
Der Niederschlag wurde unter vermindertem Druck in
üblicher Weise getrocknet und in 6 ml 10 mM
Tris-salzsäure-Pufferlösung (pH-Wert 7,5), enthaltend 1 mM
EDTA, gelöst. Nach Zugabe von 6 g Cäsiumchlorid und 0,2 ml
10 mg/ml Lösung von Ethidiumbromid wurde die Mischung
einer Gleichgewichts-Dichtegradienten-Zentrifugierung in
üblicher Weise unterworfen unter Verwendung einer
Ultrazentrifuge mit 39.000 Upm während 42 Stunden unter
Isolierung der Rekombinations-Plasmid-pKLS612-DNA. Nach
der Entfernung von Ethidiumbromid unter Verwendung von
n-Butanol wurde die DNA in 10 mM
Tris-salzsäure-Pufferlösung (pH-Wert 7,5), enthaltend
1 mM EDTA, dialysiert. Auf diese Weise wurden 2.300 µg
gereinigte Rekombinations-Plasmid-pKLS612-DNA mit einer
Größe von 4,4 kb erhalten.
2 l eines Mediums aus 1% (G/V) Trypton, 0,5% (G/V)
Hefeextrakt, 1 mM Isopropyl-β-D-thiogalactosid und 0,5%
(G/V) Natriumchlorid wurden getrennt in Kultivierungstanks
vom Schütteltyp einer Kultivierungsvorrichtung kleiner
Größe (hergestellt von Iwashiya Co.) gegeben unter
erhöhtem Druck und in üblicher Weise sterilisiert. Zu
diesem Medium wurden 20 ml einer Kultivierungsflüssigkeit
gegeben, die zuvor hergestellt worden war, indem man E.
coli JM101-(pKLS612)-Stamm in dem gleichen Medium wie oben
während 24 Stunden bei 37°C kultivierte, und dann wurde
eine Belüftungsschüttelkultur bei 37°C während 8 Stunden
durchgeführt. Durch fünfmalige Wiederholung dieses
Verfahrens erhielt man 35 g feuchte Bakterienzellen.
Die so erhaltenen feuchten Bakterienzellen wurden zu
100 ml eines 0,01M Phosphatpuffers (pH-Wert 8,0) gegeben
und einer Ultraschallzerstörung in üblicher Weise
unterworfen und anschließend in üblicher Weise mit 15.000
Upm während 30 Minuten zentrifugiert unter Erhalt von 120
ml (290 Einheiten/ml) einer rohen Enzymlösung von SON.
Aus dieser so erhaltenen rohen Enzymlösung wurde
Nucleinsäure unter Verwendung von Streptomycinsulfat
entfernt. Nach einer Wärmebehandlung der Enzymlösung bei
50°C während 1 Stunde wurden die unlöslichen Stoffe
durch Zentrifugieren mit 10.000 Upm während 10 Minuten
entfernt.
Nachdem man die Enzymlösung auf eine
QAE-Sephadex-A-50-Säule (1,4 × 40 cm), die zuvor mit 0,01M
Phosphatpuffer ins Gleichgewicht gebracht worden war,
adsorbiert wurde und Waschen der Säule mit 0,01M
Phosphatpuffer, enthaltend 0,27M Kaliumchlorid, wurde mit
0,01M Phosphatpuffer, enthaltend 0,37M Kaliumchlorid,
eluiert, wobei man eine SON-enthaltende Eluatlösung
erhielt.
Die SON-enthaltende Eluatlösung wurde konzentriert und in
üblicher Weise gefriergetrocknet. Man erhielt
20.800 Einheiten von gereinigtem SON-Pulver. Die Ausbeute
betrug 60%.
In gleicher Weise, wie in dem Arbeitsbeispiel in der
JP-OS 212 781/83 beschrieben, wurden Bakteriophagen
λcI857 1121 hergestellt (diese Phagen sind im Fermentation
Research Institute, Agency of Industrial Science &
Technology, Japan, in Form eines lysogenen Bakteriums, das
erhältlich ist, indem man E. coli 1100 (erhalten vom
Max-Planck-Institut, Heidelberg, Westdeutschland) in
diesen Phagen nach üblichen Verfahren, d. h. in Form von E.
coli 1100 lysogenisierte (λcI857 1121 (FERM BP-133))
hinterlegt worden). Von diesen Bakteriophagen λcI857 1121,
wurden nach der Methode von T. Maniatis et al. (Molecular
Cloning, Seiten 76-85 (1982)) DNA von Bakteriophagen
λcI857 1121 erhalten.
Anschließend wurde 1 µg DNA von Bakteriophagen
λcI857/1121 und 10 Einheiten EcoRI (hergestellt von Takara
Shuzo K.K.) bei 37°C während 1 Stunde in 50 mM
Tris-salzsäure-Pufferlösung, enthaltend 100 mM NaCl und 10
mM MgSo₄ (pH-Wert 7,4) umgesetzt. Nach üblicher
Phenolextraktion und Ethanolausfällung wurden 0,8 µg
eines Eco RI-aufgeschlossenen Produktes von
Bakteriophagen-λcI857 1121-DNA erhalten.
In 50 mM Tris-salzsäure-Puffer, enthaltend 100 mM NaCl und
10 mM MgSO₄ (pH-Wert 7,4) wurden 1 µg der
Bakteriophagen λcI85757-DNA (hergestellt von Takara Shuzo
K.K.) und 10 Einheiten Eco RI (hergestellt von Takara
Shuzo K.K.) bei 37°C während 1 Stunde umgesetzt unter
Erhalt einer umgesetzten Flüssigkeit und dann wurde eine
übliche Phenolextraktion und Ethanolausfällung
durchgeführt unter Erhalt von 0,8 µg des
aufgeschlossenen Produktes.
Dann wurden 0,8 µg des so aufgeschlossenen Produktes,
0,8 µg der oben erwähnten Bakteriophagen λcI857
1121-DNA und 1 Einheit T4-DNA-Ligase (hergestellt von
Boehringer Mannheim Co.) in 60 mM Tris-salzsäure-Puffer,
enthaltend 6,6 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreitol und 10 mM
ATP (pH-Wert 7,5) 20 Stunden bei 4°C umgesetzt unter
Erhalt einer umgesetzten Flüssigkeit. Unter Verwendung
dieser umgesetzten Flüssigkeit wurde ein E. coli-QD
5003-Stamm, der zuvor mit Calciumchlorid nach der
vorerwähnten Methode von D.M. Morrison et al. behandelt
worden war, transformiert unter Erhalt von Bakteriophagen
λcI857 1121S, die einen Belag auf E. coli QD 5003-Stamm
bildeten und keinen Belag auf dem zuvor erwähnten E. coli
1100-Stamm.
Anschließend wurde 1 µg λcI857 1121S-DNA, hergestellt
nach der Methode von T. Maniatis et al. aus der obigen
erhaltenen Bakteriophagen-λcI857 1121S mit 10 Einheiten
Eco RI (hergestellt von Takara Shuzo K.K.) in 50 mM
Tris-salzsäure-Pufferlösung, enthaltend 100 mM NaCl und
10 mM MgSo₄ (pH-Wert 7,4) bei 37°C 1 Stunde umgesetzt
und das Produkt wurde einer üblichen Phenolextraktion und
Ethanolausfällung unterworfen unter Erhalt von 0,8 µg
Eco RI-aufgeschlossener Bakteriophagen-λcI857 1121S-DNA.
Weiterhin wurde 1 µg der nach der Methode von T. Masuda
et al. (Agri. Biol. Chem., Band 50, Seiten 271-278 (1986))
hergestellten Plasmid-pKN 206-DNA und 10 Einheiten Pvu II
(hergestellt von Takara Shuzo K.K.) bei 37°C während
2 Stunden in 10 mM Tris-salzsäure-Pufferlösung, enthaltend
50 mM NaCl, 10 mM MgSo₄ und 1 M Dithiothreitol (pH-Wert
7,4) umgesetzt und dann wurde das Produkt einer üblichen
Phenolextraktion and Ethanolausfällung unterworfen, wobei
man 0,8 µg des Pvu II-aufgeschlossenen Produktes von
Plasmid-pKN 206-DNA erhielt.
Dann wurden 0,8 µg von Pvu II-aufgeschlossenem Produkt
der Plasmid pKN 206-DNA, 1 µg Eco RI-Verknüpfer mit
einer phosphorylierten 5′-Endgruppe (hergestellt von New
England Biolabs Co.) und 1 Einheit von T4-DNA-Ligase
(hergestellt von Boehringer Mannheim Co.) 20 Stunden bei
4°C in 66 mM Tris-salzsäure-Pufferlösung, enthaltend
6,6 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreitol und 10 mM ATP
(pH-Wert 7,5) umgesetzt unter Erhalt von 0,8 µg
Plasmid-pKN 306.
Mit der so erhaltenen Plasmid-pKN 306-DNA wurde E. coli
DH 1-Stamm (ATCC 33849), der nach der Methode von D.M.
Morrison (Methods in Enzymology, Band 68, Seiten 326-331)
mit Calciumchlorid behandelt worden war, transformiert
unter Erhalt von E. coli-DH 1 (pKN 306).
In gleicher Weise wie im Absatz (3) des Beispiels 1 wurden
1.200 µg von Plasmid-pKN 306-DNA hergestellt. 10 µg
davon und 50 Einheiten von Eco RI (hergestellt von Takara
Shuzo K.K.) wurden in 50 mM Tris-salzsäure-Puffer,
enthaltend 100 mM NaCl und 10 mMol MgSo₄ (pH-Wert 7,4) 2
Stunden bei 37°C umgesetzt und nach der Umsetzung wurde
nach der Methode von R.C.A. Yang et al. (Methods in
Enzymology, Band 68, Seiten 176-182 (1979)) fraktioniert,
wobei man 3,5 µg eines 2,3 Kb DNA-Fragmentes,
enthaltend einen Tetracyclin-resistenten Gen, erhielt.
Dann wurden 1 µg der oben erwähnten 2,3 Kb DNA, 1 µg
5′-pAATTGTCTAGA-Verknüpfer, hergestellt als
DNA-Synthesizer-SYSTEM 1 Plus von Beckmann Co., 0,8 µg
Eco RI-aufgeschlossene Bakteriophagen λcI857 1121S-DNA und
1 Einheit von T4-DNA-Ligase (hergestellt von Boehringer
Mannheim Co.) bei 4°C während 20 Minuten in 66 mM
Tris-salzsäure-Pufferlösung, enthaltend 6,6 mM MgSO₄, 10
mM Dithiothreitol und 10 mM ATP (pH-Wert 7,5) unter Erhalt
von einer DNA, umgesetzt. E. coli QD 5003-Stamm, der mit
Calciumchlorid behandelt worden war (nach der Methode von
D.M. Morrison) wurde mit der so erhaltenen DNA
transformiert unter Erhalt von E. coli QD 5003 (λcI857
1121S-Tc/xb).
In 50 mM Tris-salzsäure-Puffer, enthaltend 100 mM NaCl und
10 mM MgSO₄ (pH-Wert 7,4) wurden 2 µg Bakteriophagen
λcI857 1121S-Tc/xb-DNA, die aus E. coli QD 5003 (λcI857
1121S-Tc/xb) nach der Methode von T. Maniatis et al.
(Molecular Cloning, Seiten 76-85 (1982)) erhalten worden
war und 10 Einheiten Xho I (hergestellt von Takara Shuzo
K.K.) eingemischt und während 1 Stunde bei 37°C
umgesetzt. Dann wurde das Produkt einer üblichen
Phenolextraktion und Ethanolausfällung unterworfen unter
Erhalt von 1,6 µg Xho I-aufgeschlossenem Produkt von
Bakteriophagen-λcI857 1121S-Tc/xb-DNA.
Weiterhin wurden 1 µg von Bakteriophagen-
λcI857S₇8042-DNA, die wie in Absatz (6) des
Arbeitsbeispiels in der JP-OS 212.781/83 beschrieben,
hergestellt worden war, 1 µg Bakteriophagen-λgtWES
λB-DNA (hergestellt von Bethesda Research Laboratory Co.)
und 10 Einheiten Eco RI (hergestellt von Takara Shuzo
K.K.) bei 37°C während 1 Stunde in 50 mM
Tris-salzsäure-Puffer, enthaltend 100 mM NaCl und 10 mM
MgSO₄ (pH-Wert 7,4) umgesetzt und das Produkt wurde
einer üblichen Phenolextraktion und Ethanolausfällung
unterworfen, wobei man 1,6 µg des aufgeschlossenen
Produktes erhielt.
Dann wurden 1,6 µg des wie oben aufgeschlossenen
Produktes und 1 Einheit von T4-DNA-Ligase in 66 mM
Tris-salzsäure-Puffer, enthaltend 6,6 mM MgCl₂, 10 mM
Dithiothreitol und 10 mM ATP (pH-Wert 7,5) bei 4°C
während 16 Stunden unter Erhalt einer DNA umgesetzt. Mit
der so erhaltenen DNA wurde E. coli 1100, der zuvor mit
Calciumchlorid behandelt worden war, nach der oben
erwähnten Methode von D.M. Morrison transformiert, wobei
man Bakteriophagen-12-2-WE erhielt, welcher in der Lage
war, einen Belag auf E. coli 1100-Stamm zu bilden.
Dann wurde E. coli 1100 mit der oben erhaltenen
Bakteriophagen-12-2-WE und mit Bakteriophagen-Φ-80
(hergestellt aus E. coli W3110 (Φ80) (ATCC 31277) nach der
im Absatz 1 des Arbeitsbeispiels der JP-OS 212.781/83
beschriebenen bzw. nach der Methode in Absatz 2 des
Arbeitsbeispiels in der JP-OS 212.781/83 infiziert unter
Erhalt der bakteriolysierten Flüssigkeit. Dann wurde E.
coli-W3110 (Φ80) (ATCC 31277), welches ein lysogenes
Bakterium ist, mit der vorerwähnten bakteriolysierten
Flüssigkeit infiziert unter Erhalt von
Bakteriophagen-12-2-300, die in der Lage waren, einen
Belag auszubilden.
Anschließend wurde Bakteriophagen-12-2-300-DNA,
hergestellt aus Bakteriophagen-12-2-300, nach der
vorerwähnten Methode von T. Maniatis et al. hergestellt
und 2 µg davon wurden mit 20 Einheiten Xho I in 50 mM
Tris-salzsäure-Puffer, enthaltend 100 mM NaCl und 10 mM
MgSO₄ (pH-Wert 7,4) 1 Stunde bei 37°C umgesetzt und
das Produkt wurde einer üblichen Phenolextraktion und
Ethanolausfällung unterworfen unter Erhalt von 1,6 µg
des aufgeschlossenen Produktes.
Dann wurde 1 µg von Xho I-aufgeschlossenes Produkt von
Bakteriophagen-12-2-300-DNA, 1 µg des vorerwähnten
Xho I-aufgeschlossenen Produktes von Bakteriophagen λcI857
1121-Tc/Xb-DNA und 1 Einheit von T4-DNA-Ligase in 66 mM
Tris-salzsäure-Puffer, enthaltend 6,6 mM MgCl₂, 10 mM
Dithiothreitol und 10 mM ATP (pH-Wert 7,5) während 16
Stunden bei 16°C umgesetzt. Mit der so erhaltenen DNA
wurde E. coli QD 5003 (erhalten von Kyushu University),
der zuvor nach der vorerwähnten Methode von D.M. Morrison
mit Calciumchlorid behandelt worden war, transformiert,
wobei man Bakteriophagen-EN501S-Tc, die in der Lage waren,
einen Belag auf E. coli QD-5003-Stamm auszubilden, erhielt.
0,2 µg von Bakteriophagen-EN501S-Tc-DNA, hergestellt
nach der Methode von T. Maniatis: "Molecular Cloning",
Seiten 75-85 (1982) und 10 Einheiten Eco RI (hergestellt
von Takara Shuzo K.K.) wurden zu 50 mM
Tris-salzsäure-Puffer (enthaltend 100 mM NaCl und 10 mM
MgSO₄) (pH-Wert 7,4) gegeben und 1 Stunde bei 37°C
umgesetzt, wobei man 0,2 µg Baktiophagen-EN501S-Tc-DNA,
aufgeschlossen durch Eco RI erhielt.
Weiterhin wurden 20 µg der in Absatz 3 von Beispiel 1
erhaltenen Plasmid-pKLS601-DNA und 50 Einheiten von Eco RI
(hergestellt von Takara Shuzo K.K.) in einen gleichen
Puffer wie oben zusammengemischt und 2 Stunden bei 37°C
umgesetzt unter Erhalt einer aufgeschlossenen Flüssigkeit.
Die aufgeschlossene Flüssigkeit wurde einer 0,7% (G/V)
Agarosegel-Elektrophorese unterworfen und daraus wurde ein
DNA-Fragment mit einer Größe von 3,3 kb nach der Methode
von R.C.A. Yang et al. (Methods in Enzymology, Band 68,
Seiten 176-182 (1979)) eluiert unter Erhalt von 3,5 µg
eines DNA-Fragmentes.
1 µg des so erhaltenen DNA-Fragmentes, 0,2 µg der
vorerwähnten bakteriophagen-EN501S-Tc-DNA und 1 Einheit
von T4-DNA-Ligase (hergestellt von Boehringer Mannheim
Co.) wurden zu 66 mM Tris-salzsäure-Puffer (enthaltend 6,6
mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreitol und 10 mM ATP) (ph-Wert
7,5) gegeben und 16 Stunden bei 4°C unter Erhalt einer
Rekombinations-DNA-SNF1 umgesetzt.
Dann wurde die SNF1-DNA nach der Methode von B. Hohn
(Methods in Enzymology, Band 68, Seiten 299-309) (1979)
einer in vitro-Packung unterworfen und zu E. coli 1100
(hergestellt vom Max-Plank-Institut, Bundesrepublik
Deutschland) überführt unter Erhalt von E. coli 1100
(SNF1)-Stamm, der ein lysogenes Bakterium ist (hinterlegt
in Fermentation Research Institute, Agency of Industrial
Science & Technology, Japan, unter FERM BP-1301).
2 l eines Mediums, enthaltend 1% (G/V) Trypton, 0,5%
(G/V) Hefeextrakt und 0,5% (G/V) Natriumchlorid wurden
getrennt zu Kulturtanks vom Schütteltyp in einer
klein-gefäßigen Kulturvorrichtung gegeben und in üblicher
Weise bei erhöhtem Druck sterilisiert. Weiterhin wurde E.
coli 1100 (SNF1) im gleichen Medium wie oben 24 Stunden
bei 32°C kultiviert und 10 mM der so erhaltenen
Kulturflüssigkeit wurden zu dem oben erwähnten
sterilisierten Medium inokuliert. Eine
Belüftungsschüttelkultur wurde bei 32°C durchgeführt bis
die Konzentration an Bakterienzellen 100 Klett-Einheiten
erreichte und dann wurde die Kultivierungstemperatur auf
42°C erhöht und 15 Minuten bei dieser Temperatur
gehalten. Dann wurde die Temperatur auf 37°C erniedrigt
und die Kultur wurde bei dieser Temperatur weitergeführt.
Indem man dieses Verfahren fünfmal wiederholte, erhielt
man 20 g feuchte Bakterienzellen.
Anschließend wurde das gleiche Verfahren zur Isolierung
und Reinigung, wie es im Absatz 6 des Beispiels 1
beschrieben wird, wiederholt. Man erhielt 110 ml einer
rohen Enzymlösung (450 Einheiten/ml), aus denen 32.000
Einheiten eines gereinigten SON-Pulvers hergestellt werden
konnten (Ausbeute 65%).
Claims (14)
1. Rekombinante DNA, umfassend eine DNA mit einem für
Sarkosinoxidase N codierendem Gen, gekennzeichnet durch
die Restriktionsschnittstellen gemäß der Figur, eingefügt
in eine Vektor-DNA, wobei die Figur Bestandteil dieses Anspruchs ist.
2. Neue rekombinante DNA gemäß Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß die DNA mit einem für
Sarkosinoxidase N codierendem Gen eine DNA ist, die von einem Bacterium
von Genus Bacillus abstammt.
3. Neue rekombinante DNA gemäß Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß die DNA mit einem für
Sarkosinoxidase N codierendem Gen eine DNA ist, die von FERM BP-671 abstammt.
4. Neue rekombinante DNA gemäß Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß die Sarkosinoxidase N ein monomeres
Protein ist.
5. Neue rekombinante DNA gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Sarkosinoxidase N durch eine
covalente Bindung mit FAD verbunden ist.
6. Neue rekombinante DNA gemäß Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß die Vektor-DNA ein Plasmid von
pUC18-DNA ist.
7. Neue rekombinante DNA gemäß Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß die Vektor-DNA Bacteriophagen
EN501S-Tc-DNA ist.
8. Verfahren zur Herstellung von Sarkosinoxidase N, umfassend
die Schritte: Einfügen einer DNA mit einem für
Sarkosinoxidase N codierendem Gen gekennzeichnet durch die
Restriktionsschnittstellen gemäß der Figur in eine Vektor-
DNA, Klonieren der rekombinanten DNA in einen
Mikroorganismus vom Genus Escherichia, Kultivieren des
Mikroorganismus in einem Medium und anschließend Gewinnung
des Produkts Sarkosinoxidase N, wobei die Figur Bestandteil dieses
Anspruchs ist.
9. Verfahren zur Herstellung von Sarkosinoxidase N gemäß
Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA mit
einem für Sarkosinoxidase N codierendem Gen eine DNA ist,
die von einem Bacterium vom Stamme Genus Bacillus
abstammt.
10. Verfahren zur Herstellung von Sarkosinoxidase N gemäß
Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA mit
einem für Sarkosinoxidase N codierendem Gen eine DNA ist,
die von FERM BP-671 abstammt.
11.Verfahren zur Herstellung von Sarkosinoxidase N gemäß
Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die
Sarkosinoxidase N ein monomeres Protein ist.
12. Verfahren zur Herstellung von Sarkosinoxidase N gemäß
Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die
Sarkosinoxidase N mit FAD mittels einer covalenten
Bindung verknüpft ist.
13. Verfahren zur Herstellung von Sarkosinoxidase N gemäß
Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Vektor-DNA
Plasmid pUC18-DNA ist.
14. Verfahren zur Herstellung von Sarkosinoxidase N gemäß
Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Vektor-DNA
Bacteriophagen EN501S-Tc-DNA ist.
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-
1987
- 1987-04-30 DE DE19873714532 patent/DE3714532C2/de not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
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DE3714532A1 (de) | 1988-03-03 |
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