JPH0648985B2

JPH0648985B2 - 耐熱性ザルコシン・オキシダーゼｎ遺伝子

Info

Publication number: JPH0648985B2
Application number: JP62327484A
Authority: JP
Inventors: 泰二小山; 衛一中野; 勝鈴木
Original assignee: Kikkoman Corp; Noda Inst for Scientific Res
Current assignee: Kikkoman Corp; Noda Inst for Scientific Res
Priority date: 1987-12-25
Filing date: 1987-12-25
Publication date: 1994-06-29
Anticipated expiration: 2009-06-29
Also published as: JPH01168287A; DE3843729A1

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮ遺伝子に
関する。

ザルコキシ・オキシダーゼは、ザルコキシ＋H₂O＋O₂→ グリシン＋ホルムアルデヒド＋H₂O₂ の反応を触媒する酵素であり、例えば、特開昭54-52789
号公報、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー、第89
巻、第599頁、1981年ジャパン〔J.Biochem.89,599(198
1)JAPAN〕に記載され、公知である。

一方、クレアチニンあるいはクレアチンを酵素的に定量
する方法が報告され〔臨床化学シンポジウム、第19集，
第196頁(1979)〕、該定量法にザルコシン・オキシダー
ゼが使用されており、該酵素は、有用な酵素である。該
定量法は、下記の通りであり、下記の式中、括弧内は使
用酵素である。

クレアチニン＋H₂Oクレアチニン（クレアチニン・アミドヒドロラーゼ）クレアチン＋H₂O→ザルコシン＋尿素（クレアチン・アミジノヒドロラーゼ）ザルコシン＋H₂O＋Ｏ_２→ グリシン＋ホルムアルデヒド＋H₂O₂ （ザルコシン・オキシダーゼ）〔従来の技術〕先に、本発明者等の内の１人が、新たに土壌より分離し
たバチルス属に属する菌株を培養したものより、微酸性
でも充分酵素活性を示し、耐熱性で、ザルコシンに対す
るkm値の低い新規なザルコシン・オキシダーゼが得られ
ることを知り、耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮ及び
その製造法の特許出願を行なった（特開昭61-162174号
公報）。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、上記の耐熱性ザルコシン・オキシダーゼ
Ｎ製造法により、該酵素の収率を最大にするためには、
培地中に高価なクレアチニン、クレアチン及び／又はザ
ルコシンを添加することが必要であり、経済的に不利で
あり、また、製造操作も煩雑になる等の問題があった。

〔問題点を解決するための手段〕

そこで、本発明者等は、上記の問題点を解決すべく種々
検討した結果、耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮをコ
ードする遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿
入した組み換え体ＤＮＡを得、この組み換え体をエッシ
ェリシア(Escherichia)属に属する菌株に含ませた耐熱
性ザルコシン・オキシダーゼＮ生産能を有する菌株を培
地に培養すると、培地中に、クレアチニン、クレアチン
及び／又はザルコシンを全く添加することなしに、効率
よく耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮが生産されるこ
と等を知り特許出願を行なった。（特開昭61-201289及
び特願昭61-201290号明細書）。

その後、本発明者等は、バチルス属菌由来の耐熱性ザル
コシン・オキシダーゼＮ遺伝子について更に検討した結
果、バチルス属菌由来の耐熱性ザルコシン・オキシダー
ゼＮ遺伝子を初めて単離及び構造決定することに成功
し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、第３図に示されるアミノ酸配列を
コードする耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮ遺伝子で
ある。

以下、本発明について詳細に説明する。

先ず、耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮ（以下、ＳＯ
Ｎと略称する。）をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ
の調製について述べる。

バチルス・エスピーNS-129〔微工研条寄第671号（FERM
BP-671）〕株を、特開昭61-162174号公報記載の方法と
全く同様にして培養し、培養物を得る。この培養物を、
例えば3000r.p.m.以上、好ましくは8000〜10000r.p.m.
で５分以上、好ましくは10〜15分間遠心分離してバチル
ス・エスピーNS-129株の菌株を得る。

この菌株より、例えば斎藤、三浦の方法〔バイオケム．
バイオフィズ．アクタ．(Biochem.Biophys.Acta.)、第7
2巻、第619頁（1963年）〕等により染色体ＤＮＡを得る
ことができる。

ついで、この染色体ＤＮＡに、突出末端を生じさせる制
限酵素、例えばSau 3AI（東洋紡績社製）を温度30℃以
上、好ましくは37℃、酵素濃度は１〜10ユニット／mlで
20分以上、好ましくは0.5〜２時間作用させて消化し、
種々の染色体ＤＮＡ断片混合物を得る。

このようにして得たＤＮＡ断片混合物から、例えば通常
のアガロースゲル電気泳動法によりＤＮＡ断片混合物を
得、更に例えばフェノール抽出等の精製手段により精製
し、また更に例えばエタノール沈澱法等の濃縮手段によ
り濃縮し、純化されたＤＮＡ断片混合物（この中にＳＯ
Ｎをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片が含まれ
る）を得る。

一方、本発明において用いることのできるベクターＤＮ
Ａとしては、如何なるものでもよく、例えばプラスミド
ベクターＤＮＡ、バクテリオファージベクターＤＮＡ等
が挙げられるが、具体的には例えばプラスミドpBR322Ｄ
ＮＡ〔ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ(Bethesda
Research Laboratories)社製〕などが好ましい。

上記ベクターＤＮＡに、突出末端を生じさせる制限酵
素、例えばBam HI（宝酒造社製）を、温度30℃以上、好
ましくは37℃、酵素濃度10〜1000ユニット／mlで１時間
以上、好ましくは２〜３時間作用させて消化し、切断さ
れたベクターＤＮＡを得る。

ついで、上記のようにして得たバチルス・エスピーNS-1
29由来で、ＳＯＮをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ
断片混合物と、切断されたベクターＤＮＡを混合し、こ
れに例えば大腸菌ＤＮＡリガーゼ（ニュー・イングラン
ド・バイオ・ラブス社製）、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベー
リンガー・マンハイム社製）など、好ましくはＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを、温度４〜37℃、好ましくは４〜16℃、酵
素濃度１〜100ユニット／mlで１時間以上、好ましくは
６〜24時間作用させて組み換え体ＤＮＡを得る。

この組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば大腸菌ｋ-12、
好ましくは大腸菌ＨＢ101（ＡＴＣＣ33694）、大腸菌Ｄ
ＨＩ（ＡＴＣＣ33849）、大腸菌Ｘ-1776（ＡＴＣＣ3124
4）、などを形質転換あるいは形質導入してそれぞれの
菌株を得る。この形質転換はディー・エム・モーリソン
(D.M.Morrison)の方法〔メソヅ・イン・エンザイモロジ
ー(Methods in Enzymology)、第68巻、第326〜331頁（1
979年）〕により行なうことができる。また形質導入は
ビ・ホーン(B.Hohn)の方法〔メソヅ・イン・エンザイモ
ロジー第68巻、第299〜309頁（1979年）〕によって行な
うことができる。

そして、上記菌株よりＳＯＮ生産能を有する菌株をスク
リーニングすることにより、ＳＯＮをコードする遺伝子
を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換え
体ＤＮＡを含み、ＳＯＮ生産能を有するエッシェリシア
属に属する菌株を得ることができる。

このようにして得られた菌株より純化された組み換え体
ＤＮＡを得るには、例えばピー・グーリー(P.Guerry)等
の方法〔ジェイ．バクテリオロジー(J.Bacteriology)第
116巻、第1064〜1066頁（1973年）〕、デー・ビー・ク
レウェル(D.B.Clwell)の方法〔ジェー・バクテリオロジ
ー第110巻、第667〜676頁（1972年）〕などにより得る
ことができる。

そして、以上の如くして得られ、かつ純化された組み換
え体ＤＮＡ中のＳＯＮをコードする遺伝子を含有するＤ
ＮＡには、ＳＯＮをコードする遺伝子以外に不用なＤＮ
Ａが存在するため、以下の操作により該不用なＤＮＡを
除去するのである。

次いで、このようにして得られ、かつ純化された組み換
え体ＤＮＡに、制限酵素、例えばHpa I及びBgl II（夫
々、宝酒造社製）を、温度30℃以上、好ましくは37℃、
酵素濃度10〜1000ユニット／mlで20分以上、好ましくは
１〜６時間作用させて消化し、ＤＮＡ断片混合物を得
る。

一方、本発明において用いることのできるベクターＤＮ
Ａとしては、如何なるものでもよく、例えばプラスミド
ベクターＤＮＡ、バクテリオファージベクターＤＮＡ等
が挙げられるが、具体的には例えばプラスミドpUC18、pU
C12、pUC8ＤＮＡ〔ファルマシア社製〕などが好ましい。

上記ベクターＤＮＡに、制限酵素、例えばBam HI及びHi
ncII（夫々、宝酒造社製）を、温度30℃以上、好ましく
は37℃、酵素濃度夫々10〜1000ユニット／mlで１時間以
上、好ましくは１〜３時間作用させて消化し、切断され
たベクターＤＮＡを得る。

ついで、上記のようにして得たバチルス・エスピーNS-1
29由来で、ＳＯＮをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ
断片混合物と、切断されたベクターＤＮＡを混合し、こ
れに例えば大腸菌ＤＮＡリガーゼ（ニュー・イングラン
ド・バイオ・ラブス社製）、Ｔ４ＤＮＭリガーゼ（ベー
リンガー・マンハイム社製）など、好ましくはＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを、温度４〜37℃、好ましくは４〜16℃、酵
素濃度１〜100ユニットで１時間以上、好ましくは６〜2
4時間作用させて組み換え体ＤＮＡを得る。

この組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば大腸菌Ｋ-12、
好ましくは大腸菌ＪＭ101（ＡＴＣＣ33876）、大腸菌Ｈ
Ｂ101（ＡＴＣＣ33694）、大腸菌ＤＨＩ（ＡＴＣＣ3384
9）、大腸菌Ｘ-1776（ＡＴＣＣ31244）、などを形質転
換あるいは形質導入してそれぞれの菌株を得る。この形
質転換はディー・エム・モーリソン(D.M.Morrison)の方
法〔メソヅ・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzy
mology)、第68巻、第326〜331頁（1979年）〕により行
ななうことができる。また形質導入はビ・ホーン(B.Hoh
n)の方法〔メソヅ・イン・エンザイモロジー第68巻、第
299〜309頁（1979年）〕によって行なうことができる。

このようにして得られた菌株より純化された新規な組み
換え体ＤＮＡを得るには、例えばピー・グーリー(P.Gue
rry)等の方法〔ジェイ・バクテリオロジー(J.Bacteriol
ogy)第116巻、第1064〜1066頁（1973年）〕、デー・ビ
ー・クレウェル(D.B.Clewell)の方法〔ジェー・バクテ
リオロジー第110巻、第667〜676頁（1972年）〕などに
より得ることができる。

次いで、上記の純化された新規な組み換え体ＤＮＡに、
例えば、制限酵素Eco RI及びPst I（いずれも宝酒造社
製）を温度30℃以上、好ましくは37℃、酵素濃度５〜20
ユニット／mlで0.5〜２時間、好ましくは約１時間作用
させて消化し、ＤＮＡ断片混合物を得る。

上記ＤＮＡ断片混合物よりＳＯＮをコードする遺伝子を
含有するＤＮＡを単離するには、ティー・マニアティス
(T.Maniatis)等の方法〔モレキュラー・クローニング(M
olecular Cloning)、コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)、第1
73頁〜第178頁（1982年）〕により得ることができる。

上記のようにして得られたＳＯＮをコードする遺伝子を
含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換え体
ＤＮＡを含み、ＳＯＮ生産能を有するエッシェリシア属
に属する菌株を用いてＳＯＮを生産するには、この菌株
を通常の固体培養法で培養してもよいが、なるべく液体
培養法を採用して培養するのが好ましい。

また、上記菌株を培養する培地としては、例えば酵母エ
キス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーあ
るいは大豆もしくは小麦▲麩▼の浸出液等の１種以上の
窒素源に、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、
硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫
酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上
を添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜
添加したものが用いられる。

なお、培地の初発pHは、７〜９に調整するのが適当であ
る。また培養は30〜42℃、好ましくは37℃前後で４〜24
時間、好ましくは６〜８時間、通気撹拌深部培養、振盪
培養、静置培養等により実施するのが好ましい。

培養終了後、該培養物よりＳＯＮを採取するには、通常
の酵素採取手段を用いて得ることができる。

例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理
などするか、または、リゾチーム等の溶菌酵素を用いて
本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪
もしくは放置して自己消化を行なわせ本酵素を菌体外に
排出させる。この溶液を濾過、遠心分離などして固形部
分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プ
ロタミン硫酸塩あるいは硫酸マンガンにより除核酸した
のち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して
分画し、沈澱物を採取し、これを水に対し透析したのち
真空乾燥して粗酵素標品を得る。

そして本酵素は、必要により酵素の単離精製の常法に従
って、例えば、(1)ＤＥＡＥ−セルロースのカラムクロ
マトグラフィー、(2)硫安分画、(3)ＱＡＥ−セファデッ
クスのカラムクロマトグラフィー、(4)ＴＳＫ−ＧＥＬ
ブチル−トーヨーパール650Ｃ〔東洋ソーダ（株）製〕
の疎水クロマトグラフィー、(5)セスァデックスによる
ゲル濾過等の方法、又はその他の方法を必要に応じて組
み合わせて用いることにより高度に精製されたＳＯＮ標
品を得ることができる。

上記精製手段により得られる精製ＳＯＮの理化学的性質
は、特開昭61-162174号公報記載のＳＯＮの理化学的性
質と全く同様である。

〔発明の効果〕

上述したことから明らかな如く、本発明のＳＯＮ遺伝子
の組み込まれた新規な組み換え体ＤＮＡを含むエッシェ
リシア属に属する菌株を培地に培養すると、クレアチ
ン、クレアチニン、ザルコシン等を添加使用することな
く、ＳＯＮを効率よく得ることができるので、本発明は
産業上極めて有用なものである。

〔実施例〕

以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明す
る。

実施例 (1)バチルス・エスピーNS-129株の染色体ＤＮＡの調整バチルス・エスピーNS-129(FERM BP-671)株を、Ｔ−Ｙ
培地〔１％（Ｗ／Ｖ）バクト−トリプトン(Bactco-tryp
ton〔ディフコ(Difco)社製〕、0.5％（Ｗ／Ｖ）バクト
−イースト・エキストラクト(Bacto-yeast extract)
〔ディフコ(Difco)社製〕、0.5％（Ｗ／Ｖ）NaCl(pH7.
2)〕200mlに接種し、温度30℃で16時間振盪培養し、培
養物を得た。

この培養物を10000r.p.m.で10分間常法により遠心分離
処理し、湿潤菌体0.5ｇを得たのち、該菌体から斎藤、
三浦の方法〔バイオケム．バイオフィズ．アクタ．(Bio
chem.Biophys.Acta.)、第72巻、第619頁（(1963年）〕
により染色体ＤＮＡを得た。

ついで、この染色体ＤＮＡ0.1mg及び制限酵素Sau 3AI
（東洋紡績社製）２ユニットを、10mMトリス塩酸緩衝液
(50mM NaCl 10mM MgSO₄及び１mMジチオスレイトール含
有）（ｐＨ7.4）にそれぞれ混合し、温度37℃で45分間
反応させた。反応終了液を常法により0.7％(W/V)アガロ
ースゲル（宝酒造社製）電気泳動処理したものより、４
〜８Kb（キロベースペアー）の大きさのＤＮＡ断片をア
ール・シー・エイ・ヤング(R.C.A.Yang)等の方法〔メソ
ズ・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymolog
y)、第68巻、第176〜182頁（1979年）〕により溶出して
溶出物を得、これから常法によりフェノール抽出処理
し、更にエタノール沈澱処理してSau 3AIで消化された
バチルス・エスピーNS-129株の染色体ＤＮＡ断片10μｇ
を得た。

(2)組み換え体プラスミドpKLS601ＤＮＡの作製プラスミドpBR322ＤＮＡ〔ベセスダ・リサーチ・ラボラ
トリーズ(Bethesda Research Laborato-ries）社製〕10
μｇと制限酵素Bam HI（宝酒造社製）100ユニットを50m
Mトリス塩酸緩衝液（100mM NaCl、及び10mM MgSO₄含
有）（ｐＨ7.4）に混合し、温度37℃で２時間反応させ
て消化液を得、該液を常法によりフェノール抽出及びエ
タノール沈澱処理して、Bam HIで消化されたプラスミド
pBR322ＤＮＡを得た。

ついで、このBam HIで消化されたプラスミドpBR322ＤＮ
Ａ10μｇ、上記(1)で得られたSau 3AIで消化されたバチ
ルス・エスピーNS-129株の染色体ＤＮＡ断片10μｇ及び
５ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ〔ベーリンガー・マン
ハイム(Boehriger Mannheim)社製〕を6.6mM MgCl₂、10mM
ジチオスレイトール及び10mMＡＴＰを含有する66mMトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ7.5）に添加し、温度16℃で16時間
反応し、ＤＮＡを連結させた。

ついで、ディー・エム・モーリソン(D.M.Mo-rrison)の
方法〔メソヅ・イン・エンザイモロジー(Methods in En
zymology)、第68巻、第326〜331頁（1979年）〕で、塩
化カルシウム処理した大腸菌ＤＨＩ株（ＡＴＣＣ3384
9）を、上記のように連結させたＤＮＡで形質転換し、
アンピシリン耐性及びテトラサイクリン感受性の形質転
換株1000株を得た。

このようにして得られた形質転換株がＳＯＮ活性を有す
るか否かを以下のようにして試験した。

各菌株を、0.5％(W/V)ザルコシン（東京化成工業社製）
及び50μｇ／mlアンピシリンを含有するＴ−Ｙ培地５ml
に接種し、温度30℃で24時間培養して培養液を得た。こ
れを3500r.p.m.で10分間遠心分離処理して湿潤菌体を
得、該菌体を１％（Ｗ／Ｖ）ザルコシンを含有する10mM
リン酸緩衝液（ｐＨ7.0）１mlに懸濁し、これに、20μ
トルエンを添加し、温度37℃で１時間反応させた液を
常法により3500r.p.m.で10分間遠心分離処理して反応液
を得、この反応液に１％（Ｗ／Ｖ）４−アミノ−３−ヒ
ドラジノ−５−メルカプト−1,2,4−トリアゾール、23
％（Ｗ／Ｖ）水酸化カリウム及び0.08％（Ｗ／Ｖ）メタ
過ヨウ素ナトリウムを夫々0.15mlずつ添加し、反応液が
紫色に変化したものがＳＯＮ活性を有する形質転換株で
あり、ＳＯＮ活性を有する形質転換株である大腸菌(E.c
oli)ＤＨＩ(pKLS 601)株を得た。

(3)組み換え体プラスミドpKLS601ＤＮＡの単離トリプトン１％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス0.5％（Ｗ／
Ｖ）、及びNaCl0.5％（Ｗ／Ｖ）からなる培地１に、
該培地を用い温度37℃で16〜24時間前培養して得た大腸
菌(E.coli)ＤＨＩ(pKLS 601)の培養液20mlを接種し、温
度37℃で３時間振盪培養したのち、培養液にクロラムフ
ェニコール0.2ｇを添加し、更に同一温度で20時間培養
し、培養液を得た。

ついで、この培養液を、常法により10000r.p.m.で10分
間遠心分離処理して湿潤菌体を得、これを20mlの25％
（Ｗ／Ｖ）ショ糖を含有する50mMトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ8.0）に懸濁したのち、更に、これに、リゾチーム10m
g、0.25M ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ8.0)８ml及び20％（Ｗ／
Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム溶液８mlをそれぞれ添加
し、温度60℃で30分間保温して溶菌し、溶菌液を得た。

この溶菌液に、５Ｍ NaCl溶液13mlを添加し、温度４℃
で16時間処理したものを常法により15000r.p.m.で30分
間遠心分離して抽出液を得、常法によりフェノール抽出
処理したのち、常法によりエタノール沈澱処理し、沈澱
物を得た。

ついで、この沈澱物を通常の減圧乾燥処理したものを、
１mMＥＤＴＡを含有する10mMトリス塩酸緩衝液６ml（ｐ
Ｈ7.5）に溶解し、更に、これに塩化セシウム６ｇ及び1
0mg/mlエチジウムブロマイド0.2mlを添加したものを、
常法により39000r.p.m.で42時間超遠心分離機を用いて
平衡密度勾配遠心処理を行ない組み換え体プラスミドpK
LS601ＤＮＡを単離し、また、更に、ノルマルブタノー
ルを使用してエチジウムブロマイドを除去したのち、１
mMＥＤＴＡを含有する10mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ7.
5）に対して透析を行ない純化された組み換え体プラス
ミドpKLS601ＤＮＡ（大きさは、9.1Kbである）2700μｇ
を得た。

(4)新規な組み換え体pKLS612ＤＮＡの作製プラスミドpUC18ＤＮＡ（ファルマシア社製）0.2μｇ並
びに制限酵素HincII（宝酒造社製）及びBam HI（宝酒造
社製）を夫々10ユニットずつを10mMトリス塩酸緩衝液(5
0mM NaCl、10mM MgSO₄及び１mMジチオスレイトール含
有）（ｐＨ7.4）に混合し、温度37℃で１時間反応させ
て消化液を得、該液を常法によりフェノール抽出及びエ
タノール沈澱処理して、HincII及びBam HIで消化された
プラスミドpUC18ＤＮＡを得た。

次いで、上記(3)で得られた組み換え体pKLS 601ＤＮＡ1
2μｇ並びに、Hpa I（宝酒造社製）12ユニット及びBgl
II（宝酒造社製）30ユニットを10mMトリス塩酸緩衝液(5
0mM NaCl、10mM MgSO₄及び１mMジチオスレイトール含
有）（ｐＨ7.4）に混合し、温度37℃で５時間反応させ
て消化液を得た。

該消化液を0.7％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲル電気泳動し
たものより1.7KbのＤＮＡ断片を、アール・シー・エイ
・ヤング(R.C.A.Yang)等の方法〔メソズ・イン・エンザ
イモロジー(Methods in Enzymology)、第08巻、第176〜
182頁（1979年）〕により溶出して溶出物を得、常法に
よりフェノール抽出及びエタノール沈澱処理してＤＮＡ
断片1.3μｇを得た。

なお，該断片は、ＳＯＮをコードする遺伝子を含有する
ＤＮＡ断片である。

そして、上記ＤＮＡ断片を、BaI II、Dra I、PvuII、HindI
II、Hpa I〔いずれも宝酒造社製、制限酵素〕、Asu II
（プロメガバイオテク社製、制限酵素）及びBst EII
（ニッポンジーン社製、制限酵素）を夫々用い単一消化
及び２重消化して得られたＤＮＡ断片をアガロースゲル
電気泳動法により移動度パターンを分析し、得られた移
動度パターンと、λＤＮＡを、前記HindIIIにより消化
して得られたＤＮＡ断片の標準移動度パターンと対比す
ることにより得られた分子量は、1,700bp（ベースペア
ー）であり〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジー(Journal of Molecular Biology)第98巻、551〜5
64頁、1975年参照〕、上記ＤＮＡ断片の制限酵素による
切断地図は、第１図に示すとおりであった。

このようにして得たＤＮＡ断片0.15μｇ、HincII及びBa
m HIで消化されたプラスミドpUC18ＤＮＡ0.2μｇ及びＴ
４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）１ユ
ニットを、66mMトリス塩酸緩衝液（6.6mM MgCl₂、10mMジ
チオスレイトール及び10mMＡＴＰ含有）（ｐＨ7.5）に
混和し、温度４℃で16時間反応させてＤＮＡを連結させ
た。

次いで、前述のディー・エム・モーリソン(D.M.Morriso
n)の方法により塩化カルシウム処理した大腸菌ＪＭ101
（ＡＴＣＣ33876）を、上記のように連結させたＤＮＡ
で形質転換し、得られた形質転換株を50μｇ／mlアンピ
シリン、0.5mMイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシ
ド及び0.004％（Ｗ／Ｖ）５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシドを、夫々含有する
Ｔ−Ｙ寒天平板培地を用いて温度37℃で24時間培養し、
白色のコロニーを形成するものがＳＯＮを生産する株で
あるので、白色のコロニーを形成する大腸菌ＪＭ101(pK
LS 612)を得た。

このようにして得られたＳＯＮ生産能を有する形質転換
株である大腸菌(E.coli)ＪＭ101(pKLS 612)は、工業技
術院微生物工業技術研究所に微工研条寄第1146号(FERM
BP-1146)として寄託されている。

(5)組み換え体プラスミドpKLS612ＤＮＡの単離トリプト
ン１％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス0.5％（Ｗ／Ｖ）、及びN
acl 0.5％（Ｗ／Ｖ）からなる培地１に、該培地を用
い温度37℃で16〜24時間前培養して得た大腸菌(E.coli)
ＪＭ101(pKLS 612)の培養液20mlを接種し、温度37℃で
３時間振盪培養したのち、培養液にクロラムフェニコー
ル0.2ｇを添加し、更に同一温度で20時間培養し、培養
液を得た。

ついで、この培養液を、常法により10000r.p.m.で10分
間遠心分離処理して湿潤菌体を得、これを20mlの25％(W
/V)ショ糖を含有する50mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.0）
に懸濁したのち、更に、これに、リゾチーム10mg、0.25
MＥＤＴＡ溶液（ｐＨ8.0）８ml及び20％（Ｗ／Ｖ）ドデ
シル硫酸ナトリウム溶液８mlをそれぞれ添加し、温度60
℃で30分間保温して溶菌し、溶菌液を得た。

この溶菌液に、５ＭNaCl溶液13mlを添加し、温度４℃で
16時間処理したものを常法により15000r.p.m.で30分間
遠心分離して抽出液を得、常法によりフェノール抽出処
理したのち、常法によりエタノール沈澱処理し、沈澱物
を得た。

ついで、この沈澱物を通常の減圧乾燥処理したものを、
１mMＥＤＴＡを含有する10mMトリス塩酸緩衝液６ml（ｐ
Ｈ7.5）に溶解し、更に、これに塩化セシウム６ｇ及び1
0mg/mlエチジウムブロマイド0.2mlを添加したものを、
常法により39000r.p.m.で42時間超遠心分離機を用いて
平衡密度勾配遠心処理を行ない組み換え体プラスミドpK
LS612ＤＮＡを単離し、また、更に、ノルマルブタノー
ルを使用してエチジウムブロマイドを除去したのち、１
mMＥＤＴＡを含有する10mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ7.
5）に対して透析を行ない純化された組み換え体プラス
ミドpKLS612ＤＮＡ（大きさは、4.4Kbである。）2300μ
ｇを得た。

(6)大腸菌(E.coli)ＪＭ101(pKLS 612)によるＳＯＮの生
産及び該酵素の分離、精製トリプトン１％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス0.5％（Ｗ／
Ｖ）、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラチトシド１mM、
及び食塩0.5％（Ｗ／Ｖ）からなる培地２を撹拌式小
型培養装置（いわしや社製）の培養槽に分注し、常法に
より高圧滅菌処理したものに、上記と同一組成の培地で
予め温度37℃で24時間振盪培養した大腸菌(E.Coli)ＪＭ
101(pKLS612)の培養液20mlを接種し、温度37℃で８時間
通気撹拌培養する操作を５回繰り返して湿潤菌体35ｇを
得た。

この菌体を0.01Mリン酸緩衝液（ｐＨ8.0）100mlに懸濁
し、常法により超音波破壊処理したのち、15000r.p.m.
で30分間通常の遠心分離処理し、ＳＯＮの粗酵素液120m
l（290ユニット／ml）を得た。

このようにして得た粗酵素液に硫酸ストレプトマイシン
を用いて除核酸処理を施したものを、温度50℃で１時間
加温処理を行なったのち、不溶性物質を10000r.p.m.で1
0分間遠心分離処理して除去した。

0.01Mリン酸緩衝液で平衡化済みのＱＡＥ−セファデッ
クスＡ−50カラム(1.4×40cm)に吸着させたのち、0.27M
塩化カリウムを含有する0.01Mリン酸緩衝液で洗浄した
のち、0.37M塩化カリウムを含有する0.01Mリン酸緩衝液
を用いて溶出し、ＳＯＮ含有溶出液を得た。

このＳＯＮ含有溶出液を、常法により濃縮したのち、凍
結乾燥することにより純化されたＳＯＮ粉末20,800単位
を得た。なお、収率は、60％であった。

(7)ＳＯＮ遺伝子を含有するＤＮＡの塩基配列の解析項目(5)で得られた組み換え体プラスミドpKLS612ＤＮＡ
15μｇを、制限酵素Eco RI及びPst I（いずれも宝酒造
社製）で切断し、ＳＯＮ遺伝子を含有する1.8KbＤＮＡ
断片3.5μｇを得、このＤＮＡ断片を、プラスミドpUC11
8及びpUC119ＤＮＡ（いずれも宝酒造社製）のEco RI及
びPst I部位にクローニングし、得られた組み換え体え
体プラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ101（ＡＴＣＣ3
3876）を形質転換し、形質転換株、大腸菌ＪＭ101(pUSO
8B)及びＪＭ101(pUSO 9H)を夫々得た。

なお、ＤＮＡの制限酵素による切断、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼによる連結及び形質転換方法は、前記項目(2)に記載
の方法に、また、ＤＮＡ断片のアガロースゲル電気泳動
による単離は、前記項目(1)に記載の方法に準拠した。

このようにして得られた形質転換株に、ヘルパーファー
ジM13K07（宝酒造社製）を感染させメッシッグ(Messin
g)の方法〔メンゾ・イン・エンザイモロジー(Methods i
n Enzymology)、第101巻、第20〜78頁（1983）〕に従い
１本鎖ＤＮＡを調製した。

得られた１本鎖ＤＮＡによるシークエンシングは、７−
ＤＥＡＺＡシークエンスキット（宝酒造社製）を用い上
記メッシッグの方法に従って行なった。また、プライマ
ーは、システム１プラスＤＮＡ合成機（ベックマン社
製）を用いて合成した。更に、塩基配列の解析のための
ゲル電気泳動は、８％（Ｗ／Ｖ）ポリアクリルアミドゲ
ル（富士写真フィルム社製）を用いて行なった。

得られたＳＯＮ遺伝子のみの全塩基配列を第２図に、ま
た、該遺伝子から翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配
列を第３図に夫々示した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＳＯＮをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ
断片の制限酵素による切断地図を示す図であり、また、
第２図は、本発明ＳＯＮ遺伝子のみの全塩基配列を示す
図であり、更に、第３図は、本発明ＳＯＮ遺伝子から翻
訳されるポリペプチドのアミノ酸配列を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/06 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記に示されるアミノ酸配列をコードする
耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮ遺伝子。
【請求項２】下記に示される塩基配列で表わされる特許
請求の範囲第１項記載の耐熱性ザルコシン・オキシダー
ゼ遺伝子。