JPH06343475A - フォスフォトランスアセチラーゼ遺伝子を含有す るｄｎａ断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 下記の制限酵素開裂地図を有し、かつ分子量
約77.2kdを有するフォスフォトランスアセチラーゼ遺伝
子を含有するＤＮＡ断片。 【化１】 【効果】 フォスフォトランスアセチラーゼ遺伝子を含
有するＤＮＡ断片が提供された。そして、このフォスフ
ォトランスアセチラーゼ遺伝子が組み込まれた組み換え
体ＤＮＡを含む微生物を培地に培養することによりＰＴ
Ａを高収率で得ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、フォスフォトランスア
セチラーゼ (Phosphotransacetylase)の製造に有用なフ
ォスフォトランスアセチラーゼをコードする遺伝子（以
下、フォスフォトランスアセチラーゼ遺伝子と略称す
る。）を有するＤＮＡ断片に関する。

【０００２】

【従来の技術】フォスフォトランスアセチラーゼ(Phosp
hotransacetylase、EC 2.3.1.8、以下ＰＴＡと略称す
る。）は、アセチルリン酸(acetyl phosphate)及びコエ
ンザイムＡ(CoA) からアセチル-CoA及びリン酸を形成す
る反応を触媒する酵素であり、その反応式は下記のとお
りである。

【０００３】

【０００４】ＰＴＡは、アセチル−CoA の製造及び再生
に用いることができ、また、アセチル−CoA, CoA及びア
セチルリン酸の定量用酵素として極めて有用なものであ
る。従来、ＰＴＡは、例えば、大腸菌(E.coli)Ｂを培地
に培養し、菌体よりＰＴＡを分離、精製することにより
製造されている［バイオキム. バイオフィズ. アクタ.
(Biochim.Biophys.Acta.), 191, p.550〜558 (1969年)
］。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記の
ＰＴＡの製造法によるときには、該酵素の収率が著しく
低く、ＰＴＡの多量生産には適さない等の欠点があっ
た。そこで、本発明者等は、上記の点を解決すべく鋭意
検討し、ＰＴＡをコードする遺伝子を含有するＤＮＡを
ベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを得、この
組み換え体ＤＮＡでエッシェリシア(Escherichia) 属に
属する菌株を形質転換し、得られるＰＴＡ生産能を有す
る菌株を培地に培養することにより、高収率でＰＴＡが
生産されることの知見を得、これを既に特許出願を行っ
ている（特開平2-177888号公報参照）。

【０００６】その後、本発明者等は、エッシェリシア・
コリ (Escherichia coli) 由来のフォスフォトランスア
セチラーゼ遺伝子を初めて単離し、その構造を決定する
ことに成功し、本発明を完成した。

【０００７】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明の第１
の発明は、下記の制限酵素開裂地図を有し、かつ分子量
約77.2kdを有するフォスフォトランスアセチラーゼ遺伝
子を含有するＤＮＡ断片である。

【０００８】

【化２】

【０００９】また、第２の発明は、配列番号２に示され
るアミノ酸配列をコードするフォスフォトランスアセチ
ラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片である。また、第３
の発明は、配列番号１に示される塩基配列を有するフォ
スフォトランスアセチラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断
片である。以下、本発明について詳細に説明する。

【００１０】先ず、ＰＴＡをコードする遺伝子を含有す
るＤＮＡの調製について述べる。ＰＴＡをコードする遺
伝子を含有するＤＮＡを有する微生物、例えば、大腸菌
(Escherichia coli) 1100 ［マックス−プランク−イン
スチチュート (Max-Plank-Institut) 西独、ハイデルベ
ルグより入手］株を通常の固体培養法で培養してもよい
が、なるべく液体培養法を採用して培養し、培養物を得
る。

【００１１】また、上記菌株を培養する培地としては、
例えば、酵素エキス、ペプトン、肉エキス、コーンステ
ィープリカーあるいは大豆もしくは小麦ふすまの浸出液
等の１種以上の窒素源に、リン酸第１カリウム、リン酸
第２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、
塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機
塩類の１種以上を添加し、更に必要により糖質原料、ビ
タミン等を適宜添加したものが用いられる。

【００１２】なお、培地の初発 pＨは、７〜９に調整す
るのが適当である。また培養は30〜42℃、好ましくは37
℃前後で４〜24時間、好ましくは６〜８時間、通気攪拌
深部培養、振盪培養、静置培養等により実施するのが好
ましい。この培養物を、例えば3000r.p.m.以上、好まし
くは8000〜10000r.p.m. で５分以上、好ましくは10〜15
分間遠心分離して大腸菌1100株の菌体を得る。

【００１３】この菌体より、例えば斎藤、三浦の方法
［バイオケム. バイオフィズ. アクタ.(Biochem.Biophy
s.Acta.)、第72巻、第619頁 (1963年) ］、ケー・エス
・カービー(K.S.Kirby) の方法［バイオケム. ジェイ.
(Biochem.J.) 、第64巻、第405頁 (1956年) ］等の方法
により染色体ＤＮＡを得ることができる。次いで、この
染色体ＤＮＡに、突出末端を生じさせる制限酵素、例え
ばSau３AI(東洋紡績社製) を、温度30℃以上、好ましく
は37℃、酵素濃度１〜10ユニット／mlで20分以上、好ま
しくは0.5〜２時間作用させて消化し、種々の染色体Ｄ
ＮＡ断片混合物を得る。

【００１４】このようにして得たＤＮＡ断片混合物か
ら、例えば通常のアガロースゲル電気泳動法によりＤＮ
Ａ断片混合物を得、更に例えばフェノール抽出等の精製
手段により精製し、また更に例えばエタノール沈澱法等
の濃縮手段により濃縮し、純化されたＤＮＡ断片混合物
(この中にＰＴＡをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ
断片が含まれる) を得る。

【００１５】一方、本発明において用いることのできる
ベクターＤＮＡとしては、如何なるものでもよく、例え
ばプラスミドベクターＤＮＡ、バクテリオファージベク
ターＤＮＡ等が挙げられるが、具体的には例えばプラス
ミドpBR322ＤＮＡ［ベセスダ・リサーチ・ラボラトリー
ズ(Bethesda Research Laboratories)社製］、プラスミ
ドpUC118ＤＮＡ (宝酒造・社・製) などが好ましい。

【００１６】上記ベクターＤＮＡに、突出末端を生じさ
せる制限酵素、例えばBamHI（宝酒造社製) を、温度30
℃以上、好ましくは37℃、酵素濃度10〜1000ユニット／
mlで１時間以上、好ましくは２〜３時間作用させて消化
し、切断されたベクターＤＮＡを得る。ついで、上記の
ようにして得た大腸菌1100由来で、ＰＴＡをコードする
遺伝子を含有するＤＮＡ断片混合物と、切断されたベク
ターＤＮＡを混合し、これに例えば大腸菌ＤＮＡリガー
ゼ (ニュー・イングランド・バイオ・ラブス社製) 、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼ (ベーリンガー・マイハイム社製) な
ど、好ましくはＴ４ＤＮＡリガーゼを、温度４〜37℃、
好ましくは４〜16℃、酵素濃度１〜100ユニットで１時
間以上、好ましくは６〜24時間作用させて組み換え体Ｄ
ＮＡを得る。

【００１７】この組み換え体ＤＮＡを用いて、エッシェ
リヒア属に属する菌株例えば大腸菌Ｋ-12 、好ましくは
大腸菌ＨＢ101(ATCC 33694) 、大腸菌ＤＨＩ(ATCC 3384
9)、大腸菌χ−1776(ATCC 31244)、大腸菌1100(Max-Pla
nk-Institut 西独、ハイデルベルグより入手) 、大腸菌
ＪＭ101(ATCC 33876) などを形質転換あるいは形質導入
してそれぞれの菌株を得る。この形質転換はディー・エ
ム・モーリソン(D.M.Morrison)の方法［メソヅ・イン・
エンザイモロジー (Methods in Enzymology)、第68巻、
第326〜331頁 (1979年) ］により行なうことができる。
また形質導入はビー・ホーン(B.Hohn)の方法［メソヅ・
イン・エンザイモロジー第68巻、第299〜309頁 (1979
年) ］によって行なうことができる。

【００１８】そして、上記菌株よりＰＴＡ生産能を有す
る菌株をスクリーニングすることにより、ＰＴＡをコー
ドする遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入
した組み換え体ＤＮＡを含み、ＰＴＡ生産能を有するエ
ッシェリシア属に属する菌株を得ることができる。この
ようにして得られた菌株より純化された新規な組み換え
体ＤＮＡを得るには、例えばピー・グーリー(P.Guerry)
等の方法［ジェイ・バクテリオロジー(J.Bacteriology)
第116巻、第1064〜1066頁 (1973年）］、デ・クレウエ
ル(D.B.Cleweel) の方法［ジェー・バクテリオロジー第
110巻、第667〜676頁 (1972年) ］などにより得ること
ができる。

【００１９】次いで、上記の純化された新規な組み換え
体ＤＮＡに、例えば、制限酵素SmaＩ及びKpnＩ（いずれ
も宝酒造（株）製）を温度30℃以上、好ましくは、37
℃、酵素濃度５〜20ユニット／mlで0.5〜２時間、好ま
しくは約１時間作用させて消化し、ＤＮＡ断片混合物を
得る。上記ＤＮＡ断片混合物よりフォスフォトランスア
セチラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡを単離するには、テ
ィ・マニアティス (T.Maniatis)等の方法（モレキュラ
ー・クローニング (Molecular Cloning)、コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー (Cold Spring Harb
or Laboratory)、第173頁〜第178頁（1982年))により得
ることができる。

【００２０】上記フォスフォトランスアセチラーゼ遺伝
子を含有するＤＮＡを用いて、後述の実施例の項目
（５）に示す方法によって、フォスフォトランスアセチ
ラーゼ遺伝子のみの全塩基配列の解析を行ない（配列番
号１参照）、次いで、前塩基配列を有する遺伝子によっ
て翻訳されるポリペプタイドのアミノ酸配列を確定する
（配列番号２参照）。

【００２１】このようにして確定されたフォスフォトラ
ンスアセチラーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配
列の全てが、本発明のフォスフォトランスアセチラーゼ
遺伝子として含まれる。上記のフォスフォトランスアセ
チラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片をベクターＤＮＡ
に挿入して得られる組み換え体ＤＮＡをエッシェリシア
属に属する菌株に導入し、この菌株を培養してＰＴＡを
含む培養物を得る。

【００２２】この培養物よりＰＴＡを採取するには、通
常の酵素採取手段を用いることができる。例えば、常法
により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理などを施す
か、または、リゾチーム等の溶菌酵素を用いて本酵素を
抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪もしくは
放置して自己消化を行なわせ本酵素を菌体外に排出させ
る。この溶液を濾過、遠心分離などして固形部分を除去
し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン
硫酸塩あるいは硫酸マンガンにより除核酸したのち、こ
れに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、
沈澱物を採取し、これを水に対し透析したのち真空乾燥
して粗酵素標品を得る。

【００２３】更に、高度に精製されたＰＴＡ標品は、上
記粗酵素標品に例えばＤＥＡＥ−セルロース (ジ・エチ
ル・アミノ・エチル・セルロース、米国ブラウン社製)
、ＤＥＡＥ−セファデックス (ジ・エチル・アミノ・
エチル・セファデックス・スウェーデン国、ファルマシ
ア社製) 、ＱＡＥ−セファデックス (スウェーデン国、
ファルマシア社製) 等のイオン交換物質を用いる吸着溶
出法にて精製するか、またセファデックスＧ−200(スウ
ェーデン国、ファルマシア社製）、セファロース６B(ス
ウェーデン国、ファルマシア社製）等を用いるゲル濾過
法、ハイドロキシルアパタイト (米国バイオラッド社
製、バイオゲルＨＴ) を用いる吸着溶出法、ポリアクリ
ルアミドゲル等を用いる電気泳動等を適宜選択、組み合
わせて実施することにより得ることができる。

【００２４】上記手段により得られるＰＴＡの理化学的
性質は、バイオキム. バイオフィズ. アクタ.(Biochem.
Biophys.Acta.)、191 、 p.550〜558(1969) 記載のＰＴ
Ａの理化学的性質と全く同様である。

【００２５】

【発明の効果】本発明により、フォスフォトランスアセ
チラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片が提供された。そ
して、このフォスフォトランスアセチラーゼ遺伝子が組
み込まれた組み換え体ＤＮＡを含む微生物を培地に培養
することによりＰＴＡが高収率で得ることができる。し
たがって、本発明は産業上極めて有用なものである。

【００２６】以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明する。ただし、これらの実施例は本発明の技術
的範囲を限定するものではない。

【００２７】

【実施例】

（１） 大腸菌1100株の染色体ＤＮＡの調整 大腸菌 (Escherichia coli)1100 (Max-Plank-Institut
西独、ハイデルベルグより入手) 株を、Ｔ−Ｙ培地［１
％(W/V) バクト−トリプトン(Bacto-trypton)〔ディフ
コ(Difco)・社・製〕、0.5％(W/V) バクト−イーストエ
クストラクト (Bactoyeast extract) 〔ディフコ(Difc
o)・社・製〕及び0.5％(W/V) NaCl(pＨ7.2)］100mlに接
種し、温度37℃で８時間振盪培養し、培養物を得た。

【００２８】この培養物を、10,000r.p.m.で15分間、常
法により遠心分離処理し、湿潤菌体0.5ｇを得たのち、
該菌体から斎藤、三浦の方法［バイオケム. バイオフィ
ズ.アクタ.(Biochem.Biophys.Acta.)、第72巻、第619頁
(1963年)］により染色体ＤＮＡを得た。次いで、この
染色体ＤＮＡ60μｇ及び制限酵素Sau３AI (東洋紡績・
社・製)３ユニットを、10mMトリス−塩酸緩衝液(50mM N
aCl、10mM MgSO₄及び１mMジチオスレイトール含有、 p
Ｈ7.4)に夫々混合し、温度37℃で30分間反応させた。反
応終了液を常法により、フェノール抽出処理したのち、
エタノール沈澱処理し、このSau３AIで消化されたＤＮ
Ａ断片が再結合することを防止するために、モレキュラ
ー・クローニング(Molecular Cloning)、第133〜134頁
の方法でバクテリアル・アルカリフォスファターゼ(Bac
terial Alkaline Phosphatase)処理により、ＤＮＡ断片
の脱リン酸化を行ない、常法によりフェノール抽出処理
し、更に、エタノール沈澱処理して、Sau３AIで消化さ
れた大腸菌1100株の染色体ＤＮＡ断片50μｇを得た。

【００２９】（２） 組み換え体プラスミドpPT100ＤＮ
Ａの作製 プラスミドpBR322ＤＮＡ〔ベセスダ・リサーチ・ラボラ
トリーズ(Bethesda Research Laboratories)・ 社・製〕
10μｇ及び制限酵素BamHI(宝酒造社製)100ユニットを50
mMトリス−塩酸緩衝液(100mM NaCl、及び10mM MgSO₄含
有、 pＨ7.4)に混合し、温度37℃で２時間反応させて消
化液を得、該液を常法によりフェノール抽出及びエタノ
ール沈澱処理して、BamHIで消化されたプラスミド pBR3
22ＤＮＡを得た。

【００３０】次いで、このBamHIで消化されたプラスミ
ドpBR 322ＤＮＡ10μg 、項目（１）で得られたSau３AI
で消化された大腸菌1100株の染色体ＤＮＡ断片10μｇ及
び５ユニットＴ４ＤＮＡリガーゼ〔ベーリンガー・マン
ハイム(Boehringer Manheim)・ 社・製〕を、6.6mM MgCl
₂、10mMジチオスレイトール及び10mMＡＴＰを含有する6
6mMトリス塩酸緩衝液(pＨ7.5)に添加し、温度16℃で16
時間反応させ、ＤＮＡを連結させ、種々の組み換え体プ
ラスミドＤＮＡを得た。

【００３１】そして、ディー・エム・モーリソン(D.M.M
orrison)の方法［メソズ・イン・エンザイモロジー (Me
thods in Enzymology)、第68巻、第326〜331頁 (1979
年) ］により、塩化カルシウム処理した大腸菌1100株
を、上記のように連結させた種々の組み換え体プラスミ
ドＤＮＡで形質転換し、アンピシリン耐性及びテトラサ
イクリン感受性の形質転換株3000株を得た。

【００３２】このようにして得られた形質転換株のＰＴ
Ａ活性が上昇しているか否かを以下のようにして試験し
た。各菌株を、50μｇ／mlアンピシリンを含有するＴ−
Ｙ培地1.5mlに接種し、温度30℃で24時間振盪培養して
培養液を得た。これを3,500r.p.m.で10分間遠心分離処
理して湿潤菌体を得、該菌体を10mM MgCl₂及び１mMＥＤ
ＴＡを含有する10mMリン酸緩衝液(pＨ7.5)１mlに懸濁
し、これに20μｌトルエンを添加し、温度37℃で20分間
振盪した。この反応液１00μｌを、５mM MgCl₂、0.5mM
ＮＡＤ、0.5mMCoA(コエンザイムA)、５mM L−リンゴ
酸、12.5μｇ／mlマレート・デヒドロゲナーゼ、25μｇ
／mlクエン酸シンターゼ及び10mMアセチルリン酸を含有
する100mMトリス−塩酸緩衝液(pＨ8.0)2.9mlに添加し、
温度25℃における340nm の吸収の変化を測定することに
より、ＰＴＡの酵素活性を測定した。340nmの時間当り
の吸収量の変化が大きいものが、ＰＴＡ活性が上昇して
いる形質転換株であり、宿主大腸菌1100株よりＰＴＡ活
性が上昇している形質転換株である大腸菌 (E.coli)110
0 (pPT100)株を得た。

【００３３】（３） 組み換え体プラスミドpPT100ＤＮ
Ａの単離 トリプトン１％(W/V)、酵母エキス0.5％(W/V)、及びNaC
l 0.5％(W/V) からなる培地１Ｌに、該培地を用い温度3
7℃で24時間前培養して得た大腸菌(E.coli)1100(pPT10
0)株の培養液20mlを接種し、温度37℃で３時間振盪培養
したのち、培養液にクロラムフェニコール0.2ｇを添加
し、更に同一温度で20時間培養し、培養液を得た。

【００３４】次いで、この培養液を、常法により10,000
r.p.m.で10分間遠心分離処理して湿潤菌体を得、これを
20mlの25％(W/V)ショ糖を含有する50mMトリス−塩酸緩
衝液(pＨ8.0)に懸濁したのち、更に、これに、 リゾチー
ム10mg、0.25M EDTA溶液(pＨ8.0)８ml及び20％(W/V)ド
デシル硫酸ナトリウム溶液８mlを夫々添加し、温度60℃
で30分間保温して溶菌し、溶菌液を得た。

【００３５】この溶菌液に、５M NaCl溶液13mlを添加
し、温度４℃で16時間処理したものを常法により15,000
r.p.m.で30分間遠心分離して抽出液を得、常法によりフ
ェノール抽出処理したのち、常法によりエタノール沈澱
処理し、沈澱物を得た。そして、この沈澱物を、常法に
より減圧乾燥処理したものを、１mM ＥＤＴＡを含有す
る10mMトリス−塩酸緩衝液６ml(pＨ7.5)に溶解し、更
に、これに塩化セシウム６g 及び10mg／mlエチジウムブ
ロマイド0.2mlを添加したものを、常法により39,000r.
p.m.で42時間超遠心分離機を用いて平衡密度勾配遠心処
理を行ない組み換え体プラスミドpPT100ＤＮＡを単離
し、また、更に、ｎ−ブタノールを使用してエチジウム
ブロマイドを除去したのち、１mM ＥＤＴＡを含有する1
0mMトリス−塩酸緩衝液(pＨ7.5)に対して透析を行ない
純化された組み換え体プラスミドpPT100ＤＮＡ (大きさ
は、10.0Kbである。)1500μｇを得た。

【００３６】（４） 新規な組み換え体プラスミドpPT2
00ＤＮＡの作製 プラスミドpUC118ＤＮＡ (宝酒造・社・製)0.2μg 並び
に制限酵素KpnI (宝酒造・社・製) 10ユニットを10mMト
リス−塩酸緩衝液 (10mM MgCl₂、及び１mMジチオスレイ
トール含有、 pＨ7.4)に混合し、温度37℃で１時間反応
させたのち、更に、50mM NaCl となるようにNaClを添加
し、制限酵素HindIII (宝酒造・社・製)10ユニットを加
え、37℃で１時間反応させて消化液を得、該液を常法に
よりフェノール抽出及びエタノール沈澱処理して、KpnI
及びHindIIIで消化されたプラスミドpUC118ＤＮＡを得
た。

【００３７】次いで、前記項目（３）で得られた組み換
え体プラスミドpPT100ＤＮＡ１μg並びに KpnI 10ユニ
ットを10mMトリス−塩酸緩衝液 (10mM MgCl₂、及び１mM
ジチオスレイトール含有、 pＨ7.4)に混合し、温度37℃
で１時間反応させたのち、更に最終濃度50mMとなるよう
にNaClを添加したものに、制限酵素HindIII 10ユニット
を加え、温度37℃で１時間反応させて消化液を得た。

【００３８】該消化液を、0.7％(W/V) アガロースゲル
電気泳動したものより3.3KbのＤＮＡ断片をアール・シ
ー・エイ・ヤング(R.C.A.Yang)等の方法［メソズ・イン
・エンザイモロジー (Methods in Euzy-mology) 、第68
巻、第176〜182頁 (1979年) ］により溶出して溶出物を
得、常法によりフェノール抽出及びエタノール沈澱処理
してＤＮＡ断片0.3μｇ得た。

【００３９】上記のようにして得た0.3μｇのKpnI及びH
indIIIで消化したプラスミドpUC118ＤＮＡ及び0.3μｇ
のpPT100 プラスミドＤＮＡ由来の3.3KbpのKpnI／HindI
II で消化したＤＮＡ断片を、夫々７μｌの水に溶解
し、これに、混液〔77mMトリス−塩酸緩衝液(pＨ7.4)／
15mM MgCl₂／15mMジチオスレイトール／0.15mMＡＴＰ〕
13μｌ及び１ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼを添加し、
温度８℃で18時間連結反応を行なった。この反応液を用
い、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(Journalof B
acteriology）、第119巻、第1072〜1074頁 (1974年) 記
載の形質転換法により、大腸菌ＪＭ1100株 (ATCC 3387
6) を形質転換し、薬剤耐性 (アンピシリン耐性) 及
び、β−ガラクトシダーゼ活性を検討し、形質転換株を
得、その株の含有する組み換え体プラスミドＤＮＡを p
PT200 と命名した。このようにして形質転換して得られ
た大腸菌ＪＭ1100(pPT200)は、工業技術院微生物工業技
術研究所に微工研条寄第2195号(FERM BP-2195)として寄
託されている。

【００４０】（５） フォスフォトランスアセチラーゼ
遺伝子の塩基配列の解析 前記項目（４）で得られたプラスミドpPT200ＤＮＡ15μ
ｇを、制限酵素KpnＩ及びSmaＩ（いずれも宝酒造（株）
製）で切断し、フォスフォトランスアセチラーゼ遺伝子
を含有する2.7KbＤＮＡ断片を得、このＤＮＡ断片をプ
ラスミドpUC118及びpUC119ＤＮＡ（いずれも宝酒造
（株）製）のKpnＩ及びSmaＩ部位にクローニングした。
得られた組み換え体プラスミドＤＮＡを用いて大腸菌Ｊ
Ｍ109（宝酒造（株）より入手）を形質転換し、各々の
形質転換株を得た。

【００４１】なお、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによる連結及び
形質転換方法は、項目（２）に記載の方法に、また、Ｄ
ＮＡ断片のアガロースゲル電気泳動による単離は、項目
（４）に記載の方法に準拠した。このようにして得られ
た形質転換株に、ヘルパーファージＭ13Ｋ07（宝酒造
（株）製）を感染させメッシング（Messing）の方法
（メソズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzym
ology）、第10巻、第20〜78頁（1983年）に従い一本鎖
ＤＮＡを調製した。

【００４２】得られた一本鎖ＤＮＡによるシークエンシ
ングは、Sequenase Version 2.0 ＤＮＡ Sequencing Ki
t (United States Biochemicals Corporation)を用い、
同社添付の方法に従って行なった。また、プライマー
は、合成ＤＮＡ合成機392（アプライドバイオシステム
ズ社製）を用いて合成した。更に、塩基配列の解析のた
めのゲル電気泳動は、50％（W/V）の尿素を含む８％（W
/V）ポリアクリルアミドゲルを用いて行なった。

【００４３】得られたフォスフォトランスアセチラーゼ
遺伝子のみの全塩基配列を配列番号１に、また、該遺伝
子から翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番
号２に各々示した。 （６） 大腸菌ＪＭ1100(pPT200)の培養及び粗酵素液の
調製 上記項目（４）で得た大腸菌ＪＭ1100(pPT200)(FERM BP
-2195）を、ＬＢ-amp培地〔バクトトリプトン１％(W/
V)、酵母エキス0.5％(W/V)、NaCl 0.5％(W/V)及びアン
ピシリン50 (μｇ／ml) 〕３mlにて温度37℃で18時間振
盪培養を行なって得た培養液0.5mlを、10mlのイソプロ
ピル−β−Ｄ−チオガラクトシド１mMを含む上記ＬＢ-a
mp培地に接種し、温度37℃で６時間振盪培養したのち、
3,500r.p.m. で10分間遠心分離処理して湿潤菌体を得、
該菌体を、10mM MgCl₂及び１mMＥＤＴＡを含有する10mM
リン酸緩衝液(pＨ7.5)１mlに懸濁し、常法により超音波
破壊処理し、粗酵素液を得た。このようにして得られた
粗酵素液中のＰＴＡ活性の測定は、下記の方法により行
なった。

【００４４】上記粗酵素液100μｌを、５mM MgCl₂、0.5
mMＮＡＤ、0.5mM CoA、5mM Ｌ−リンゴ酸、12.5μｇ／m
lマレート・デヒドロゲナーゼ、25μｇ／mlクエン酸シ
ンターゼ及び10mMアセチルリン酸を含有する100mM トリ
ス−塩酸緩衝液(pＨ8.0) 2.9mlに添加し、温度25℃にお
ける 340nmの吸収の変化より、生成したＮＡＤＨの量を
算出した値を下表に示した。

【００４５】また、比較のため、プラスミドpUC118ＤＮ
Ａを有する大腸菌ＪＭ1100株〔大腸菌ＪＭ1100 (pUC 11
8)〕についても同様にＰＴＡ活性を測定した結果を下表
に示した。

【００４６】

【００４７】上表より明らかな如く、本発明により得ら
れる粗酵素値は、対照の粗酵素液に比して、ＮＡＤＰＨ
生成量が著しく増加しており、ＰＴＡが発現されている
ことが判る。 （７） ＰＴＡ遺伝子を含む組み換え体プラスミドpPT2
00ＤＮＡの調製 上記項目（４）で得られた大腸菌1100(pPT200)株(FERM
BP-2195)を、トリプトン１％(W/V) 、酵母エキス0.5％
(W/V) 及びNaCl 0.5％(W/V) からなる培地１Ｌに、該培
地を用い、温度37℃で24時間前培養して得られた大腸菌
1100(pPT200)株の培養液20mlを接種し、温度37℃で３時
間振盪培養したのち、0.2ｇのクロラムフェニコールを
添加し、更に同一温度で20時間同培養を行ない、培養液
を得た。

【００４８】次いで、この培養液を、常法により6,000
r.p.m.で10分間遠心分離処理して湿潤菌体２ｇを得、こ
れを20mlの25％(W/V) ショ糖を含有する350mM トリス−
塩酸緩衝液(pＨ8.0)に懸濁したのち、更に、これにリゾ
チーム (シグマ・社・製) 10mg、0.25mMＥＤＴＡ溶液(p
Ｈ8.0)８ml及び20％(W/V) ドデシル硫酸ナトリウム溶液
８mlを夫々添加し、温度60℃で30分間保温して溶菌し、
溶菌液を得た。この溶菌液に、５M NaCl水溶液13mlを添
加し、温度４℃で16時間処理したものを常法により、1
5,000r.p.m.で30分間遠心分離して得た抽出液を、常法
によりフェノール抽出処理及びエタノール沈澱処理を行
ない沈澱物を得た。

【００４９】次いで、この沈澱物を通常の減圧乾燥処理
したものを、１mMＥＤＴＡを含有する10mMトリス−塩酸
緩衝液(pＨ7.5)６mlに溶解し、更に、これに塩化セシウ
ム６ｇ及びエチジウムブロマイド(19mg／ml) 0.2mlを添
加したものを、常法により39,000r.p.m.で42時間超遠心
分離機を用いて平衡密度勾配遠心分離処理を行ない、組
み換え体プラスミドpPT200ＤＮＡを単離し、また更に、
ｎ−ブタノールを使用してエチジウムブロマイドを除去
したのち、１mMＥＤＴＡを含有する10mMトリス−塩酸緩
衝液(pＨ7.5)に対して透析を行ない純化された組み換え
体プラスミドpPT200ＤＮＡ 600μg を得た。

【００５０】該組み換え体プラスミドpPT200ＤＮＡを制
限酵素EcoRI、KpnI 、BamHI、EcoRV及びHindIII (いず
れも宝酒造・社・製) を用い、単一消化及び二重消化し
て得られたＤＮＡ断片を、アガロース電気泳動法によ
り、移動度パターンを分析し、得られた移動度パターン
とバクテリオファージλＤＮＡ (宝酒造・社・製) をHi
ndIIIにより消化して得られたＤＮＡ断片の標準移動度
パターンとを対比することにより得られた制限酵素開裂
地図は、図１に示す通りであった。

【００５１】該組み換え体プラスミドpPT200ＤＮＡ中の
フォスフォトランスアセチラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断
片（３Kb）を制限酵素KpnI 、BamHI、PstＩ及びSmaＩ
(いずれも宝酒造・社・製) を用い、単一消化及び二重
消化して得られたＤＮＡ断片を、アガロース電気泳動法
により、移動度パターンを分析し、得られた移動度パタ
ーンとバクテリオファージλＤＮＡ (宝酒造・社・製)
をHindIIIにより消化して得られたＤＮＡ断片の標準移
動度パターンとを対比することにより得られた制限酵素
開裂地図は、以下に示す通りであった。

【００５２】

【化３】

【００５３】

【配列表】

１．配列番号１ 配列の長さ：２１３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：エッシェシア・コリ 株名：K12 1100 配列 TCCCGTATTA TTATGCTGAT CCCTACCGGA ACCAGCGTCG GTCTGACCAG CGTAGCTTGG 60 CGTGATCCGT GCAATGGAAC GCAAAGGCGT TCGTCTGAGC GTTTTCAAAC CTATCGCTCA 120 GCCGCGTACC GGTGGCGATG CGCCGATCAG ACTACGACTA TCGTGCGTGC GAACTCTTCC 180 ACCACGACGG CCGCTGAACC GCTGAAAATG AGCTACGTTG AAGGTCTGCT TTCCAGCAAT 240 CAGAAAGATG TGCTGATGGA AGAGATCGTC GCAAACTACC ACGCTAACAC CAAAGACGCT 300 GAAGTCGTTC TGGTTGAAGG TCTGGTCCCG ACACGTAAGC ACCAGTTTGC CCAGTCTCTG 360 AACTACGAAA TCGCTAAAAC GCTGAATGCG GAAATCGTCT TCGTTATGTC TCAGGGCACT 420 GACACCCCGG AACAGCTGAA AGAGCGTATC GAACTGACCC GCAACAGCTT CGGCGGTGCC 480 AAAAACACCA ACATCACCGG CGTTATCGTT AACAAACTGA ACGCACCGGT TGATGAACAG 540 GGTCGTACTC GCCCGGATCT GTCCGAGATT TTCGACGACT CTTCCAAAGC TAAAGTAAAC 600 AATGTTGATC CGGCGAACGT GCAAGAATCC AGCCCGCTGC CGGTTCTCGG CGCTGTGCCG 660 TGGAGCTTTG ACCTGATCGC GACTCGTGCG ATCGATATGG CTCGCCACCT GAATGCGACC 720 ATCATCAACG AAGGCGACAT CAATACTCGC CGCGTTAAAT CCGTCACTTT CTGCGCACGC 780 CAGCATTCCG CACATGCTGG AGCACTTCGT GCCGGTTCTC TGCTGGTGAC TTCCGCAGAC 840 CGTCCTGACG TGCTGGTGGC CGCTTGCCTG GCAGCCATGA ACGGCGTAGA AATCGGTGCC 900 CTGCTGCTGA CTGGCGGTTA CGAAATGGAC GCGCGCATTT CTAAACTGTG CGAACGTGCT 960 TTCGCTACCG GCCTGCCGGT ATTTATGGTG AACACCAACA CCTGGCAGAC CTCTCTGAGC 1020 CTGCAGAGCT TCAACCTGGA AGTTCCGGTT GACGATCACG AACGTATCGA GAAAGTTCAG 1080 GAATACGTTG CTAACTACAT CAACGCTGAC TGGATCGAAT CTCTGACTGC CACTTCTGAG 1140 CGCAGCCGTC GTCTGTCTCC GCCTGCGTTC CGTTATCAGC TGACTGAACT TGCGCGCAAA 1200 GCGGGCAAAC GTATCGTACT GCCGGAAGGT GACGAACCGC GTACCGTTAA AGCAGCCGCT 1260 ATCTGTGCTG AACGTGGTAT CGCAACTTGC GTACTGCTGG GTAATCCGGC AGAGATCAAC 1320 CGTGTTGCAG CGTCTCAGGG TGTAGAACTG GGTGCAGGGA TTGAAATCGT TGATCCAGAA 1380 GTGGTTCGCG AAAGCTATGT TGGTCGTCTG GTCGAACTGC GTAAGAACAA AGGCATGACC 1440 GAAACCGTTG CCCGCGAACA GCTGGAAGAC AACGTGGTGC TCGGTACGCT GATGCTGGAA 1500 CAGGATGAAG TTGATGGTCT GGTTTCCGGT GCTGTTCACA CTACCGCAAA CACCATCCGT 1560 CCGCCGCTGC AGCTGATCAA AACTGCACCG GGCAGCTCCC TGGTATCTTC CGTGTTCTTC 1620 ATGCTGCTGC CGGAACAGGT TTACGTTTAC GGTGACTGTG CGATCAACCC GGATCCGACC 1680 GCTGAACAGC TGGCAGAAAT CGCGATTCAG TCCGCTGATT CCGCTGCGGC CTTCGGTATC 1740 GAACCGCGCG TTGCTATGCT CTCCTACTCC ACCGGTACTT CTGGTGCAGG TAGCGACGTA 1800 GAAAAAGTTC GCGAAGCAAC TCGTCTGGCG CAGGAAAAAC GTCCTGACCT GATGATCGAC 1860 GGTCCGCTGC AGTACGACGC TGCGGTAATG GCTGACGTTG CGAAATCCAA AGCGCCGAAC 1920 TCTCCGGTTG CAGGTCGCGC TACCGTGTTC ATCTTCCCGG ATCTGAACAC CGGTAACACC 1980 ACCTACAAAG CGGTACAGCG TTCTGCCGAC CTGATCTCCA TCGGGCCGAT GCTGCAGGGT 2040 ATGCGCAAGC CGGTTAACGA CCTGTCCCGT GGCGCACTGG TTGACGATAT CGTCTACACC 2100 ATCGCGCTGA CTGCGATTCA GTCTGCACAG CAGCAG 2136 ２．配列番号２ 配列の長さ：７１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 SerArgIleIleMetLeuIleProThrGlyThrSerValGlyLeuThrSerValAlaTrp 20 ArgAspProCysAsnGlyThrGlnArgArgSerSerGluArgPheGlnThrTyrArgSer 40 AlaAlaTyrArgTrpArgCysAlaAspGlnThrThrThrIleValArgAlaAsnSerSer 60 ThrThrThrAlaAlaGluProLeuLysMetSerTyrValGluGlyLeuLeuSerSerAsn 80 GlnLysAspValLeuMetGluGluIleValAlaAsnTyrHIsAlaAsnThrLysAspAla 100 GluValValLeuValGluGlyLeuValProThrArgLysHisGlnPheAlaGlnSerLeu 120 AsnTyrGluIleAlaLysThrLeuAsnAlaGluIleValPheValMetSerGlnGlyThr 140 AspThrProGluGlnLeuLysGluArgIleGluLeuThrArgAsnSerPheGlyGlyAla 160 LysAsnThrAsnIleThrGlyValIleValAsnLysLeuAsnAlaProValAspGluGln 180 GlyArgThrArgProAspLeuSerGluIlePheAspAspSerSerLysAlaLysValAsn 200 AsnValAspProAlaAsnValGlnGluSerSerProLeuProValLeuGlyAlaValPro 220 TrpSerPheAspLeuIleAlaThrArgAlaIleAspMetAlaArgHisLeuAsnAlaThr 240 IleIleAsnGluGlyAspIleAsnThrArgArgValLysSerValThrPheCysAlaArg 260 GlnHisSerAlaHisAlaGlyAlaLeuArgAlaGlySerLeuLeuValThrSerAlaAsp 280 ArgProAspValLeuValAlaAlaCysLeuAlaAlaMetAsnGLyValGluIleGlyAla 300 LeuLeuLeuThrGlyGlyTyrGluMetAspAlaArgIleSerLysLeuCysGluArgAla 320 PheAlaThrGlyLeuProValPheMetValAsnThrAsnThrTrpGlnThrSerLeuSer 340 LeuGlnSerPheAsnLeuGluValProValAspAspHisGluArgIleGluLysValGln 360 GluTyrValAlaAsnTyrIleAsnAlaAspTrpIleGluSerLeuThrAlaThrSerGlu 380 ArgSerArgArgLeuSerProProAlaPheArgTyrGlnLeuThrGluLeuAlaArgLys 400 AlaGlyLysArgIleValLeuProGluGlyAspGluProArgThrValLysAlaAlaAla 420 IleCysAlaGluArgGlyIleAlaThrCysValLeuLeuGlyAsnProAlaGluIleAsn 440 ArgValAlaAlaSerGlnGlyValGluLeuGlyAlaGlyIleGluIleValAspProGlu 460 ValValArgGluSerTyrValGlyArgLeuValGluLeuArgLysAsnLysGlyMetThr 480 GluThrValAlaArgGluGlnLeuGluAspAsnValValLeuGlyThrLeuMetLeuGlu 500 GlnAspGluValAspGlyLeuValSerGlyAlaValHisThrThrAlaAsnThrIleArg 520 ProProLeuGlnLeuIleLysThrAlaProGlySerSerLeuValSerSerValPhePhe 540 MetLeuLeuProGluGlnValTyrValTyrGlyAspCysAlaIleAsnProAspProThr 560 AlaGluGlnLeuAlaGluIleAlaIleGlnSerAlaAspSerAlaAlaAlaPheGlyIle 580 GluProArgValAlaMetLeuSerTyrSerThrGlyThrSerGlyAlaGlySerAspVal 600 GluLysValArgGluAlaThrArgLeuAlaGlnGluLysArgProAspLeuMetIleAsp 620 GlyProLeuGlnTyrAspAlaAlaValMetAlaAspValAlaLysSerLysAlaProAsn 640 SerProValAlaGlyArgAlaThrValPheIlePheProAspLeuAsnThrGlyAsnThr 660 ThrTyrLysAlaValGlnArgSerAlaAspLeuIleSerIleGlyProMetLeuGlnGly 680 MetArgLysProValAsnAspLeuSerArgGlyAlaLeuValAspAspIleValTyrThr 700 IleAlaLeuThrAlaIleGlnSerAlaGlnGlnGln 712

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例で得られた新規な組み換え体pPT200プ
ラスミドＤＮＡの制限酵素開裂地図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の制限酵素開裂地図を有し、かつ分
   子量約77.2kdを有するフォスフォトランスアセチラーゼ
   遺伝子を含有するＤＮＡ断片。 【化１】
2. 【請求項２】 配列番号２に示されるアミノ酸配列をコ
   ードするフォスフォトランスアセチラーゼ遺伝子を含有
   するＤＮＡ断片。
3. 【請求項３】 配列番号１に示される塩基配列を有する
   フォスフォトランスアセチラーゼ遺伝子を含有するＤＮ
   Ａ断片。