KR910005627B1 - 클론된 트립토판 합성효소 유전자 및 그를 함유하는 재조합 플라즈미드 - Google Patents

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KR910005627B1
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세쓰오 요시노
사토루 이와모리
다다시 스즈끼
노부요시 마키구치
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미쓰이 도오아쓰 가가쿠 가부시키가이샤
미시마 마사요시
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Abstract

내용 없음.

Description

클론된 트립토판 합성효소 유전자 및 그를 함유하는 재조합 플라즈미드
제1도는 본 발명의 재조합 플라즈미드 pISY 10에 대한 제한지도(restriction map)이다.
제2도는 본 발명의 재조합 플라즈미드 pISY 21에 대한 제한지도이다.
제3도는 trp A유전자 및 trp B유전자의 대략적인 위치를 보여주며 본 발명의 제조합 플라즈미드 pISY 21에 삽입되는 바실러스 스테아로터 모필러스(Bacillus stearothermophilus)염색체 DNA로부터 유래한 약 4.6kb크기를 지닌 DNA단편물에 대한 제한지도이다.
제4도는 본 발명의 재조합 플라즈미드 pISY 73에 대한 제한 지도이다.
제5도는 본 발명의 플라즈미드 pISY 73에 삽입된 DNA단편물의 염기성 서열을 결정하는 디데옥시방법을 사용한 도식을 도시한 것이다.
제6도는 본 발명의 플라즈미드 pISY 73에 삽입된 DNA단편물의 염기서열을 결정하는 맥삼∼길버트의 방법을 사용한 도식을 도시한 것이다.
제7도는 본 발명의 재조합 플라즈미드 pISY 73에 삽입된 약 2.5kb의 크기를 지닌 Hind Ⅲ-Eco Rv단편물의 염기서열을 나타낸다.
제8도는 본 발명의 클론된 유전자에 의해 암호화되어진 열안정성 트립토판 합성효소 B의 아미노산 서열을 나타낸다.
제9도는 본 발명의 클론된 유전자에 의해 암호화되어진 열안정성 트립토판 합성효소 A의 아미노산 서열을 나타낸다.
본 발명은 클론된 트립토판 합성효소 유전자, 그것을 포함하는 재조합 플라즈미드, 상기 재조합 플라즈미드에 의해 형질전환된 이.콜리와 트립토판 합성효소를 생성하는 방법에 관한 것이다.
트립토판 합성효소는 소위 다중기능성 효소이며, 그 기능들 중의 하나의 인돌 및 L-세린간의 반응을 촉매하여 L-트립토판을 생성하는 것이다.
(Miles,E,W.(1979) Adv.Enzymol, Vol 49, p127-186) 지금까지, 트립토판 합성효소 유전자는 에세리하아 콜리 (Hershfield, V. et al., (1974) proc. Nat1. Acad. Sci. U. S. A. ,Vol. 71, p. 3455-3459), 바실러스 서버틸리스(Bacilus Subtillis)(Henner, D. J. et atl., (1984), Gene, Vol. 34, pp. 169-177), 브레비박테리움 락토페멘텀(Brevibacterium lactofermentum)(Matsui, et al.,(1986), Agri. Biol. Chem. Bol.51, pp. 823-828) 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) (Kawasaki, H. et al., (1987) J. Biol. Chem. Bol. 262, pp. 10678-10683) 및 사카로마이시스 세레비지아(Saccharomyces Cerevisiae)(Waltz, A. et al., (1978), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 75, pp. 6172-6176)으로부터 유래한 것이 클론되었다.
그러나 상술한 중온성생물(mesophile)로부터 유래한 클론된 유전자를 이용하여 생성된 트립토판 합성효소는 만족할만한 열안정성을 가지지 못한다.
일반적으로 효소를 이용하여 생성물을 공업적으로 생성할 때, 열안정성효소를 사용하는 것이 바람직한 이유는 반응이 높은 온도에서 수행되고, 상기 효소의 분해율이 느리고, 다른 중온성 박테리아로 인한 오염을 방지할 수 있기 때문이다. 따라서 만약 유전공학 기술을 이용하여 열안정성 트립토판 합성효소를 대량으로 생산하게 된다면, 예를들어 인돌 및 L-세린간의 반응에 의해 트립토판을 공업적으로 생산하는데 유리할 것이다. 따라서, 본 발명의 목적은 클론된 열안정성 트립토판 합성효소를 제공하는데 있다.
또다른 목적은 숙주세포에서 열안정성 트립토판 합성효소를 생성할 수 있는 상기 열안정성 트립토판 합성효소 유전자를 포함하는 재조합 플라즈미드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 본 발명의 재조합 플라즈미드로써 형질전환된 형질전환체를 제공하여 상기 열안정성 트립토판 합성효소를 생성하게 하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 유전공학기술을 이용하여 열안정성 트립토판 합성효소를 생성하는 방법을 제공한다.
본 발명자는 중간 고온성 생물(moderate thermophile)인 바실러스 스테아로터모필러스(Bacillus Stearothermophilus)로부터 유래한 열안정성 트립토판 합성효소 유전자를 클로닝하고, 상기 열안정성 트립토판 합성효소 유전자를 함유한 재조합 플라즈미드를 제조하는 것은 물론, 본 발명을 완성하기 위해서, 이.콜리에서 상기 유전자를 발현시키는데 성공하였다.
즉, 본 발명은 하기의 아미노산 서열을 가진 트립토판 합성효소를 암호화하고 있는 부위가 포함된 클론된 유전자를 제공한다.
MERVPNEHGR FGDFGGKFVP ETLMLPLEEI EAELDKALAD
ESFKQEYIRI LQHYSGRPTP LTFAPNLTRQ LGGAKMYLKR
EDLNHTGAHK INNAIGQALL AKRMGKKKLI AETGAGQHGV
AAATVAAHFG MDCIVFMGEE DIKRQELNVF RMKLLGAEVV
PVSSGNRTLK DATNENIRYW VAHCDDHFYM IGSVVGPHPY
PKMVREFQRI IGDEAKEQFL ACEGKLPDVI VACVGGGSNA
IGMFYPFLQD DVRLVGVEAA GKGIDTPYHA ATITKGTKGV
IHGAMTYLLQ DEYGQIVEPY SISAGLDYPG VGPEHAYLAS
IGRVRYESVT DEEAVAAFRL LAQTEGIIPA IESAHAVAKA
VELAQSMSPD ETVLICLSGR GDKDVQTMMR HLGAKEGEDV
AAIR
(상기 서열에서 A는 알란닌, C는 시스테인, D는 아스파르트산, E는 글루탐산, F는 페닐알라닌, G는 글리신, H는 히스티딘, I는 이소루이신, K는 리신, L은 루이신, M은 메티오닌, N은 아스파라긴, P는 프롤린, Q는 글루타민, R은 알기닌, S는 세린, T는 트레오닌, V는 발린, Q는 트립토판 및 Y는 티로신을 표시한다.)
본 발명은 또한 하기의 아미노산 서열을 가진 트립토판 합성효소를 암호화하고 있는 부위가 포함된 클론된 유전자를 제공한다.
MLLLSVNPPL FIPFIVAGDP SPEVTVDLAL ALEEAGADLL
ELGVPYSDPL ADGPTIQRAA ARQLAGNMTL PKAIHLVAEM
PKKGVTIPII LFTYYNPVLQ LGEESFFALA RENGANGVLI
PDLPFEESGP LRELGERFDL PLISLVAPTS KQRIERIASV
AQGFLYCVSS LGVTGMRETL PESLGDFVSE VKRHSRVPVA
VGFGISTPEQ VAMLKEVCDG VVIGSALVQK VEQLGERLLA
PEEKEAAIAE FAAYARSLAA PLHARPCSLR
(상기 서열에서의 문자는 상술한 바와 동일한 의미를 나타낸다).
본 발명은 또한 상술한 아미노산 서열을 가진 트립토판 합성효소 B 및/또는 A를 암호화하고 있는 부위를 함유한 유전자를 포함하고 숙주 세포에서 트립토판 합성효소 B 및/또는 A를 발현시킬 수 있는 재조합 플라즈미드를 제공한다.
본 발명은 더욱이 본 발명의 재조합 플라즈미드로써 형질전환된 열안정성 트립토판 합성효소를 생성할 수 있는 이.콜리 형질전환체를 제공한다.
본 발명은 더 나아가 상기 트립토판 합성효소를 생성하는 조건에서 본 발명의 이.콜리 형질전환체를 배양하고 상기 생성된 트립토판 합성효소를 회수하는 단계를 포함하여, 트립토판 합성효소를 생성하는 방법을 제공한다.
본 발명에 의해서, 열안정성 트립토판 합성효소 유전자를 처음 클론하였고 상기 열안정성 트립토판 합성효소를 포함하고 있는 재조합 플라즈미드를 처음으로 재공하였다. 따라서, 본 발명에 의하여 유전공학 기술에 의한 열안정성 트립토판 합성효소의 생성을 처음으로 완성하였다. 환언하여, 유전공학 기술에 의한 열안정성 트립토판 합성효소의 대량생산이 처음으로 본 발명에 의하여 이루어졌다. 따라서 본 발명은 예를들어 인돌 및 K-세린으로부터 트립토판을 상업적 규모로 생산하는데 유리하다.
본 발명의 유전자는 아미노산 서열이 상기에서 설명된, 열안정성 트립토판 합성효소 A 및/또는 트립토판 합성효소 B를 암호화 한다. 상기 유전자는 예를들어, 중간 고온성 생물, 바실러스 스테아로터모필러스의 염색체 DNA에 존재한다.
상기 바실러스 스테아로터모필러스 균주의 실례는 수탁번호 IFO 12983 및 IFO 13737로 일본국 오사카시 소재의 일본국 재단법인발효연구소(IFO)에 기탁된 것들을 포함한다.
상기 유전자는 또한 다른 출저로부터 유도될 수도 있고 합성될 수도 있다.
상기 유전자의 클로닝을 예를들어, 하기와 같이 수행할 수 있다 : 먼저, 열안정성 트립토판 합성효소 유전자를 포함한 염색체 DNA를 가지는 비.스테아로필러스 균주를 통상적인방법에 의해 배양하고 및 상기 염색체 DNA를 페놀방법과 같은 통상적인방법에 의해 상기 세포로부터 추출 및 정제한다.(Saito, H.et al., (1963), Biochem. Biophys. Acta, Vol. 72, pp, 619-629).
다음 상기 염색체 DNA를 하나 또는 그 이상의 적절한 제한 효소를 사용하여 절단한다. 비.스테아로터모필러스의 염색체 DNA를 절단하기 위해 Hpa II, Acc I, Sau 3A I, Hpa I 및 Sca I과 같은 다양한 제한효소를 사용할 수 있다. 절단의 정도는 사용된 효소의 양 및/또는 상기 제한시간을 조정함 으로써 조절될 수 있다.
상기 절단된 열색체 DNA를 DNA리가아제 존재하에서 통상적인방법(예를들어, Maniatis, T. et al., (1982), Moleailan Cloning, cold Spring Harbot Lab.참조)에 의해 벡터와 재조합시켜 재조합 DNA를 형성한다. 상기 벡터는 숙주세포 바람직하게는 이.콜리 내에서 복제할 수 있는 플라즈미드 벡터인 것이 바람직하다. 이.콜리내에서 복제할 수 있는 플라즈미드 벡터의 실례는 pBR 322 및 pUC 19와 같이 상업적으로 이용가능한 ColE1시리즈 벡터를 포함한다. 열안정성 트립토판 합성효소 유전자를 포함하는 DNA단편물의 크기를 물론 상기 단편물을 절단하는데 사용된 제한효소를 이하의 실시예에서 설명한 바와같이 발견하였기 때문에 아가로즈 겔전기 영동법과 같은 통상적인방법에 의해 바람직한 DNA단편물을 선택한 후에 상기 바람직한 크기를 가지는 염색체 DNA단편물만을 상기 벡토와 봉합(ligation)할 수 있다.
상기 DNA리가아제로서 T4파지에서 유래하는 것을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 제조된 재조합 DNA는 트립토판 합성효소를 생성하는 능력이 결핍되어 트립토판을 필요로하는 이.콜리 돌연변이체와 같은 숙주를 형질변환하는데 사용된다. 트립토판 합성효소를 생성하는 능력이 결핍되어 트립토판을 필요로하는 이.콜리 돌연변이체의 실례는 수탁번호 FERM BP-2361 하의 일본극 이바라키 소재의 통상 산업성 공업기술원 미생물 공업기술연구원(FRI)에 부다페스트 조약에따라서 1988년 3월 15일에 기탁된 이.콜리 K12 W31100 MT-10347을 포함한다.
염화칼슘 방법과 같은 통상적인 방법을 사용하여 상기 형질전환을 수행할 수 있다. (Mandal, O. et. al,(1970), J. Mol. Bill. Vol. 53, pp. 159-162).
다음, 트립토판에 대하여 영양요구변이상태(auxotroph)를 상실한 형질전환체를 선택한다. 이러한 선택은 트립토판을 함유하지않는 배양배지에서 상기 형질전환체를 배양함으로써 수행될 수 있다. 트립토판에 대하여 영양요구변이상태를 상실하였다는 사실은 상기 세포가 그 세포에서 발현될 수 있는 트립토판 합성효소를 암화호하고 있는 유전자를 포함한 재조합 플라즈미드로써 형질전환되었다는 것 및 그것에 의해 트립토판 합성효소가 생성되었다는 것을 의미한다.
트립토판에 대하여 영양요구변이상태를 상실한 형질전환체에 함유되어있는 재조합 플라즈미드를 상기 형질전환체에서 추출하여 본 발명의 재조합 플라즈미드로 제공할 수 있다. Brinboim외 다수에 의한 문헌 Nucleic Acids Res.(1979)Vol.7,pp.1513-1523에서 설명된 것과 같은 통상적인방법에 의해 상기 형질전환체로부터 상기 재조합 플라즈미드를 추출하는 것을 수행할 수 있다. 상기 재조합 플라즈미드가 상기 트립토판 합성효소 유전자를 함유하고 있다는 사실은 상기 염색체 DNA절단용으로 사용되는 제한효소를 이용하여 전단계에서 상기 벡터와 재조합된 DNA단편물을 전달하고 상기 절단된 DNA단편물의 염기 서열을 결정함으로써 확인될 수 있다. 이하에서 설명된 실시예에서, 두개의 재조합 플라즈미드 pISY 10 및 pISY 21을 수득하였다.
상기 트립토판 합성효소 유전자의 발형효율을 더욱 촉진하기 위해서, 트립토판 합성효소 유전자를 포함하고있는 DNA단편물을 본 기술분야에 공지된 trp프로모터, lac UV5 플로모터, tac프로모터 및 λpL프로모터와 같은 강력한 프로모터를 가진 발현 벡터와 상기 트립토판 합성효소 유전자를 함유한 DNA단편물 재조합하의 상기 DNA단편물이 상기 강력한 프로모터 하부류(downstream)에 삽입되는 것이 바람직하다.강력한 프로모터 및 그것의 클로닝장소 하부류를 가진 그러한 발현 벡터는 본 기술분야에 공지되어 있고 및 그것의 실례는 Pharmacia로부터 시판되는 pKK223-3을 포함한다. 나중에 설명되는 실시예에서, 이러한 방법으로써 재조합 플라즈미드 pISY 73을 제조하였다. 말할 필요도 없이, 본 발명의 재조합 플라즈미드는 숙주세포에서 상기 트립토판 합성효소를 발현시킬 수 있기 때문에, 상기 프로모터 서열에 덧붙여 상기 플라즈미드는 상기 플라즈미드를 상기 세포에서 복제할 수 있게 하는 적어도 하나의 복제 시발점(replication origin)을 가지며 숙주세포가 원핵성일 경우는, SD 서열을 상기 트립토판 합성효소 유전자 상부류(upstream)에 결합시킨다. 상기 재조합 플라즈미드는 더 나아가서 전사과정을 종결시키는 터미네이터 서열 및 마커(marker)로서 유용하거나 또는 다른 미생물에 의한 오염을 방지하는데 유용한 내항생제 유전자를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 서열을 포함하는 발현 벡터는 본 기술분야에 공지되어있고 상업적으로 이용 가능하다. 상술된 pKK223-3벡터는 그 실례이다.
그러나, 상기 유전자를 클로닝하는 방법은 상술된 방법에 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 예를들어, 열안정성 트립토판 합성효소 유전자를 포함하는 DNA단편물은 상기 효소를 생성하는 세포에서 전달RNA를 회수하고, 역전사 효소를 이용하여 상기 전달 RNA로부터 DNA를 제조함으로써 제조될 수 있다. 이러한 방법에 의해 수득된 DNA단편물을 상술한 바와 동일한 방법으로 처리할 수 있다.
본 발명의 재조합 플라즈미드로써 이.콜리를 형질전환하여 상기 열안정성 트립토판 합성효소를 생성할 수 있는 본 발명의 이.콜리 형질전환체를 수득할 수 있다. 상술한 바와같이 이.콜리의 형질전환을 수행할 수 있다.
본 발명은 더 나아가 상기 트립토판 합성효소를 생성하는 조건에서 본 발명의 이.콜리 형질전환체를 배양하고 상기 생성된 트립토판 합성효소를 회수함으로써 트립토판 합성효소를 생성하는 방법을 제공한다. 상기 이.콜리 형질전환체의 배양은 이.콜리를 배양하는 통상적인방법에 의해 수행될 수 있다. 즉, 상기 이.콜리 형질전환체는 동화성 탄소원과 질소원은 물론 무기이온과 가능한 아미노산 및/또는 비타민을 포함하는 통상적인 배지에서 바람직게는 약37℃의 온도에서 배양될 수 있다. 상기 형질전환체에 함유된 재조합 플라즈미드의 프로모터가 tac프모터와 같이, 이소프로필-β-티오갈락토시드(IPTG)에 의해서 특정 조절된다면, 이러한 화합물을 상기 배지에 첨가시킬 수 있다. 더욱이, 상기 재조합 플라즈미드가 항생 유전자를 가질 때, 상기 항생제를 상기 배지에 첨가하여 다른 미생물에 의한 오염을 방지할 수도 있다. 또한, 상기 트립토판 합성효소의 생성물을 촉진시키기 위하여 필요하다면 상기 트립토판 합성효소의 생성을 촉진시키는 인돌아크릴 산과 같은 화합물을 상기 배지에 첨가시킬 수도 있다.
상기 열안정성 트립토판 합성효소 초음파법(Ultrasoni-cation)등에 의한 상기 세포를 교란시킨 후에 본 기술분야에 공지된 통상적인방법에 의해 상기 배양물로부터 정제될 수 있다. 상기 교란된 새포를 열처리함으로써 상기 열안정성 트립토판 합성효소를 효과적으로 회수할 수 있다. 그러나 상기 정제된 효소에 덧붙여, 상기 형질진환체가 배양된 배양 배지 자체는 물론, 상기 효소의 원추출물, 전체 형질전환세포 및 그것의 유도체를 열안정성 트립토판 합성효소를 생성하는 상업적 제조 설비에서 효소원으로서 또한 사용할 수 있다.
본 발명은 이제 그것의 실시예의 방법으로 더욱 상세히 설명된다. 그러나, 실시예는 설명 목적만을 위해 제공된 것일뿐 어떠한 제한방법으로 해석되어서는 안되는 것으로 이해되어야 한다.
[실시예1]
(a)바실러스 스테아로터모필러스의 염색체 DNA분리.
바실러스 스테아로터모필러스(일본국.오사카시 소재의 IFO에 수탁번호 IFO 13737로 기탁된)를 2리터의 L배지 (10g/ℓ의 박토트립톤, 5g/ℓ의 이스트 추출물 및 5g/ℓ의 염화나트륨, pH 7.2)에 접종시키고 55℃에서 교반하면서 15시간 동안 배양시킨 후 원심분리에 의해 수집하였다. 상기 제포를 160ml의 0.15M NaCl-50mM EDTA(pH 8.0)용액에 현탁시켰다. 이러한 현탁액에, 160mg의 리소짐을 첨가한 혼합물을 37℃에서 20분간 서서히 교반하였다. 다음, 4ml의 20wt% SDS용액을 상기 화합물에 첨가한 혼합물을 65℃에서 20분간 방치하였다. 다음, 그곳에 8mg의 단백질 분해효소 K(Boehringer Mannheim에서 시판)를 넣은 수득물을 37℃에서 1시간 방치하였다.
상기 수득한 혼합물에 0.15M NaCl-50mM EDTA(pH 8.0)으로 포화된 160ml의 페놀을 첨가하고 서서히 교반하였다. 이러한 혼합물을 원심분리시키고 (10,000rpm, 15분)상부 수성 상(phase)을 회수하였다.
상기 수득한 용액에 2배 부피의 냉각에탄올을 첨가하여 형성된 침전물을 유리막대로 감겨올려 수집하였다. 뒤이어 상기 침전물을 70wt%, 80wt% 및 90wt%의 에탄올에 각각 수분간 침지시킨 후 건조시켰다. 수득한 생성물을 40ml의 0.1M NsCl-0115M나트륨 시트레이트용액(pH 7.0)에 용해시켰다.
상기 수득한 원초(crude) DNA용액에, 6mg/l의 리보누클레아제 A (Boehringer Mannheim에서 시판)200μl 및 100U/ml의 리보누클레아제 T1(Boehringer Mannheim)200μl을 첨가하여 수득한 혼합물을 37℃에서 1.5시간 동안 교반하였다.
이러한 용액에, 0.15M NaCl-50mM EDTA(pH 8.0)으로 포함된 40ml의 페놀을 첨가한 용액을 서서히 교반하였다. 다음 상기 혼합물을 원심분리(10,000rpm, 15분)시키고 상부 수성상을 회수하였다.
상기 수득한 혼합물에, 2배 부피의 에탄올을 첨가하여 형성된 섬유성 침전물을 유막대로 감아올려 수집하였다. 뒤이어 상기 침전물을 70wt%, 80wt% 및 90wt%의 에탄올에 각각 수분간 침지시킨 후 건조시켰다. 다음 상기 수득한 생성물을 20ml의 10mM Tris-HCI(pH 8.0)-mM EDTA용액(이하에서는 ＂TE완충액＂으로 언급)에 용해시켰다.
상기 수득한 DNA용액을 2리터의 TE완충액에 대하여 투석시켜 4.5mg의 염색체 DNA를 20ml의 TE완충액을 얻었다.
[(b)염색체 DNA단편물의 제조.]
300μ의 DNA를 포함하고 (a)에서 수득한 TE완충액의 1350μl할당액(aliquote)에, 30유닛 제한효소 HpaII(Boehringer Mannheim에서 시판)을 첨가하였다. 10mM Tris-HCI (pH 7.5), 7mM MgCl2및 7mM2-메르캡토 에탄올을 함유한 1500μl 반응 배지에서 상기 반응을 수행하였다. 상기 반응 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 방치하여 상기 염색체 DNA를 부분적으로 전달하였다. 이러한 용액에, TE완충액으로 동 부피의 페놀/클로로포름(페놀 : 클로로포름=1 : 1)을 첨가한 혼합물을 부드럽게 교반하였다. 다음 상기 혼합물을 원심분리(15,000rpm, 5분)시키고 상부 수성상을 수집하였다. 2배부피의 냉각 에탄올을 상기 수집된 용액에 넣어 발생된 침전물을 건조시킨후 300μl의 TE완충액에 용해시켰다. 이러한 DNA용액을 10-40wt%수크로즈 밀도 구배 원심분리(20℃, 26,000rpm, 24시간)처리하고 약 4 내지 6kb 및 6 내지 10kb의 두 분획물을 회수하였다. TE완충액에 대하여 각 분획물을 투석시킨후, DNA를 에탄올 침전에 의해 수집하고 및 상기 수집된 DNA를 TE완충액에 용해시켰다.
[(b)염색체 DNA단편물과 플라즈미드 벡터와와 봉합.]
40마이크로그람의 통상적인 벡터 플라즈미드 pUC19(일본국 교토시 소재의 Takara Shuzo Co., Ltd에서 제조)를 제한 효소 Acc I(Boehringer Mannheim에서 시판)을 사용하여 완전히 절단시키고 절단된 괴(mass)를 알카라인 포스파타제를 사용하여 처리하였다. 상기 처리된 플라즈미드 벡터 각 20마이크로 그람을 (b)에서 제조된 염색체 DNA단편물의 각 분획물과 각각 혼합하고 상기 각 혼합물을 5mM MgCl2, 10mM디티오트레이톨(dithiothreitol), lmM ATP, 66mM Tris-HCI완충액(pH7.5)을 함유한 4ml의 반응배지에서 200유닛 T4 DNA리가아제 존재하의 16℃에서 16시간 동안 독립적으로 반응시켰다. 이용액을 그대로 이.콜리를 형질전환시키는 다음 단계에서 사용하였다.
[(d)트립토판 합성효소 유전자의 클로닝]
(c)에서 제조되어 상기 재조합 플라즈미드를 포함하는 반응혼합물을 사용하여 이.콜리의 형질전환을 하기와 같이 수행하였다 : 트립토판 합성효소의 생성능력을 상실하여 트립토판을 필요로 하는 돌연변이 이.콜리 K12 W3110 MT-10347(일본국 이바리키 소재의 통상 산업성 공업기술원의 미생물 공업기술연구소에 수탁번호 FERM-BP-2361로 1988년 3월 15일에 기탁된)를 350ml의 L배지(10g/ℓ의 박토트립톤, 5g/ℓ의 이스트 추출물 및 5g/ℓ의 염화나트륨, pH7.2)에 접종시키고 교반하의 37℃에서 3시간동안 배양하였다. 상기 배양된 세포를 원심분리로써 수집하였다. 상기 세포를 2ml의 0.1M CaCl2에 현탁시켜 수득한 현탁액을 0℃에서 30분간 방치하였다. 그후에 상기 현탁액을 원심분리시켜 수집한 세포를 40ml의 0.1M CaCl2에 재현탁시켰다.
상기 제조된 세포현탁액을 2개의 시험관에 각 20ml의 양으로 부었다. 상기 각 세포현탁액에, (c)에서 제조된 반응 혼합물을 첨가한 혼합물 각각을 0℃에서 3시간 방치하고 다음 42℃에서 2분간 방치하였다.
상기 세포를 원심분리에 의해 수집하고 10ml의 L배지를 상기 세포에 첨가하였다. 상기 세포를 37℃에서 30분간 배양한 다음 원심분리에 의해 수집하였다.
상기 세포를 10ml의 0.85wt% NaCl에 현탁시킨후, 상기 세포를 원심분리에 의해 수집하고 다음 1ml의 0.85wt% NaCl용액에 재현탁시켰다.
제조된 각 세포 현탁액을 100mg/ℓ의 암피실린, 25mg/ℓ의 이소프로필-β-티오갈락토시드(IPTG), 10g/ℓ에 카스아미노산 및 15g/ℓ의 아가가 첨가된 Vogel 및 Bonner의 배지(0.2g/ℓ의 MgSO4·7H2O, 2g/ℓ의 시트르산·H2O, 10g/ℓ의 K2HPO4, 3.5g/ℓ의 NaNH4PO4·4H2O 및 4g/ℓ의 글루코즈)에 적용하여 32℃에서 이틀간 배양하였다.
6 내지 10kb크기를 가진 염색체 DNA의 단편물로부터 제조된 재조합 플라즈미드로써 형질전환된 이.콜리를 배양한 아가 판 배지상에서 22개의 콜로니가 형성되었다. 대표적인 콜로니로부터 수집된 이.콜리를 에세리히아 콜리 MT-10471로 명명하고 FRI에 수탁번호 FERM BP-2362로 1988년 3월 15일에 기탁하였다.
한편, 4 내지 6kb의 크기를 가진 염색체 DNA의 단편물로부터 제조된 재조합 플라즈미드로써 형질전환된 이.콜리를 배양한 아가 판 배지상에서는 22콜로니가 형성되었다. 대표적인 콜로니로부터 수집된 이.콜리를 에세리히아 콜리 MT-10472로 명명하고 FRI에 수탁번호 FERM BP-2363으로 1988년 3월 15일에 기탁하였다.
[(e)이.콜리에 포함된 재조합 플라즈미드의 분리]
이.콜리 MT-10471 및 이.콜리 MT-10472로부터 재조합 플라즈미드를 이하와 같이 분리하였다 : 이.콜리 MT-10471 또는 이.콜리 MT-10472를 50ml의 L배지에 접종시키고 교반하의 37℃에서 15시간동안 배양하였다. 다음, 원심분리에 의해 세포를 수집하였다. 상기 세포를 2mg의 리소짐을 함유한 2ml의 50mM글루코즈-25mM Tris-HCl-10mM EDTA(pH 8.0)에 현탁시켰다.
이 현탁액에 1wt% SDS를 포함한 4ml의 0.2N NaOH를 첨가하여 수득한 혼합물을 교반하였다. 다음 그곳에 3ml의 3M CH3COO Na(pH5.2)용액을 첨가한 수득물을 4℃에서 5분간 방치하였다. 다음 결과된 혼합물을 원심분리시키고 상충액을 수집하였다.
상기 수득한 용액을 동부피의 페놀/클로로포름(페놀 : 클로로포름=1 : 1)을 첨가하여 수득한 혼합물을 부드럽게 교반하였다. 상기 수득물을 원심분리(10,000rpm, 5분)시키고 및 상충액을 수집하였다.
상기 상부 수성상에 2배 부피의 냉각 에탄올을 첨가하여 수득한 침전물을 건조시킨 후 1ml의 TE완충액에 용해시켰다.
상기 수득한 DNA용액에, 1mg/ℓ의 리보누클레아제 A(Boehringer Mannheim에서 시판)2μm을 첨가하여 수득물을 첨가하여 수득물을 37℃에서 20분간 방치하였다.
이용액에 동부피의 페놀/클로로포름(페놀 : 클로로포름=1 : 1)을 첨가하고 혼합물을 부드럽게 교반하였다. 상기 혼합물을 원심분리(10,000rpm, 5분)하고 상부 수성상을 수집하였다.
상기 수득한 DNA용액을 Bio-Gel A-50m컬럼(Bio-Rad에서 시판)상의 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하고 상기 플라즈미드 DNA를 에탄올 침전법에 의해 수집하였다.
상술한 방법에 의해 약 50μg의 플라즈미드를 이.콜리 MT-10471 및 이.콜리 MT-10472로부터 회수하고 각 플라즈미드 DNA를 100μl의 TE완충액에 용해시켰다.
이하의 플라즈미드 DNA분석에서 상기 수득한 플라즈미드 DNA를 사용하였다.
[(f)재조합 플라즈미드의 분석]
이.콜리 MT-10471로부터 분리된 재조합 플라즈미드를 pISY 10으로 명명하였다. 이 조환체 플라즈미드는 약 12.2kb의 크기이며 제한요소 EcoRI과 Hind Ⅲ로 절단하여 약 9.5kb의 DNA삽입단편물을 볼 수 있었다. 에세리히아 콜리 MT-10472(FERM P-9942)에서 분리한 조환체 플라즈미드를 pISY 21로 명명하였다. 이러한 플라즈미드는 약 7.3kb의 크기를 가지며 EcoRI 및 Ⅲ를 사용하여 절단될 수 있는 약 4.6kb DNA삽입물을 포함한다.
pISY 10 및 pISY 21의 제한지도는 각각 제1도 및 제2도에 도시되어 있다. 제1도 및 제2도에서, pISY 21에 삽입된 DNA단편물은 pISY 10에 삽입된 DNA단편물의 일부분이라는 것을 이해할 수 있다. pISY 10 또는 pISY 21에 삽입된 DNA단편물이 바실러스 테아로터모필러스로부터 유래한다는 사실은 하기와 같이 서던 블롯팅(Southern Blotting)방법에 의해 확인되었다.
상기 서던 블롯팅 방법을 통상적인 방법(T.Maniatis의 다수(91982), Moleculan Cloning, Cold Spring Harbor Lab)에 따라서 수행하였다. 바실러스 스테아로터모필러스 IFO 13737의 염색체를 (a)에서와 같은 방법으로 분리하였다. 한편, 재조합 플라지미드 pISY 10 및 pISY 21를 (e)에서 설명한 것같이 제조하였다.
상기 염색체 DNA를 Eco RI을 사용하여 절단하고 아가로즈 전기영동 처리한후 니트로 셀룰로즈 여과종이에 옮겼다. 상기 재조합 플라즈미드 pISY 10 및 pISY 21을 Eco RI 및 Hind Ⅲ을 사용하여 절단하고 상기 삽입된 DNA단편물만을 수집하여 32p로써 표지하였다.
탐침자로서 32p를 사용하여 표지된 DNA를 이용하여 상기 니트로 셀룰로즈 여과종이상에서 상기 탐침자 및 염색체 DNA의 하이브리드화를 수행하였다.
상기 염색체 DNA가 pISY 10 또는 pISY 21로부터 유래한 탐침자와 하이브리드화된 부위를 가지고 있다는 것을 오토라디오그래피(Autoradiography)로 밝혔다.
이러한 결과에 의해서 pISY 10 또는 pISY 21에 삽입된 단편물중 하나가 상기 염색체 DNA로부터 유래되었다는 것을 확인하였다.
[(g)형질전환의 재생성능력확인]
트립토판 합성효소를 생성하는 능력을 상실하여 트립토판을 필요로 하는 이.콜리 K12 W3110 MT-10347을 (e)에서 분리한 재조합 플라즈미드 pISY 10 또는 pISY 21을 사용하여 (d)에서 설명한 동일방법으로 형질전환 시키고 100mg/ℓ의 암피실린을 포함한 L배지 아가판에 적용시켰다. 발생된 콜로니로부터 20개의 콜로니를 선택하여 트립토판에 대한 영양요구변이주를 체크하였다. 결과로서, 상기 체크된 모든 콜로니에서 트립토판에 대한 영양요구변이상태는 상실되었다. 이것에 의해서 상기 pISY 10 및 pISY 21은 상기 트립토판 합성효소 유전자를 수반하는 DNA를 가지고 있다는 것을 확인하였다.
(h)DNA단편물의 서브크로닝(Subcloning) 및 분석 pISY 21에 삽입된 바실러스 스테아로터모필러스의 염색체 DNA로부터 유래한 DNA단편물은 약 4.6kb의 크기를 가졌다. 그것의 상세한 제한 지도는 제3도에 도시되어 있다. pISY 21에 삽입된 DNA단편물로부터 pISY 21에 삽입된 일부분을 상실한 다양한 DNA단편물을 제조하였다.
상기 다양한 각 간편물을 시판되는 발현 벡터 pKK223-3(Pharmacia로부터 시판)의 tac프로모터 하부류의 다중연결(Polylinker)부위에 삽입하였다. 이러한 각 재조합 플라즈미드를 사용하여, 이.콜리 MT-10347(trp AB-), 이.콜리 ATCC-23717(trp A-) 및 이.콜리 ATCC-23718(trp B-)를 형질전환시켰다. 이러한 형질전환체의 트립토판에 대한 영양요구변이상태 상실여부를 체킹함으로써 trp A유전자 및 trp B유전자의 개략적 위치를 결정하였다. pISY 21로부터 유래한 DNA삽입물중에서 상기 trp A와 trp B유전자를 포함하고 있다고 고려되는 단편물은 약 2.5kb의 크기를 지닌 Eco RV-Hind 단편물이다. 상기 재조합 플라즈미드 pISY 23은 Sma I-Hind Ⅲ로써 절단된 pKK223-3의 다중연결부위에 이러한 단편물을 삽입시킴으로써 제조된 플라즈미드이다. pISY 73의 제한지도는 제4도에 도시되어 있다. 이.콜리를 pISY 73으로써 형질전환시켜 FRI에 수탁번호 FERM BP-2364로 1988년 9월 9일에 기탁한 형질전환체 이.콜리 MT-10474를 수득하였다.
약 2.5kb의 크기를 가진, pISY 73의 Eco RV-Hind Ⅲ삽입물의 DNA서열을 M13시리즈 벡터(Messing.J.(1983) Methods in Engymology,Vol.101,pp.20-78)를 사용하여 제5도에 나타난 도식에 따른 통상적인 디데옥시방법(Messing J.(1983),Method in Enzymology,Vol.101,p.20-78)과 제6도에 나타난 도식에 따른 통상적인 맥삼-길버트방법(Maxam,A,M 및 길버트 W.(1980),Methods in Enzymology,Vol.65,p.499-560)에 의해서 결정하였다.
결과로서 상기 DNA삽입물은 제7도에 나타난 염기서열을 가지는 것을 확인하였다. 이러한 염기서열에서 각각 trp B유전자 및 trp A유전자에 상응하는 179번째 염기 및 1374번째 염기로부터 시작하는 2개의 개방판독 골격(frame)이 존재한다는 것을 확인하였다. 상기 2개의 개방 판독골격은 17염기쌍을 공유하였다. trp B의 아미노산 서열은 제6도에, trp A의 아미노산서열은 제9도에 나타나 있다.
[(i)트립토판 합성효소의 생성]
이.콜리 MT-10471, 이.콜리 MT-10472 및 이.콜리 MT-10474를 독립적으로 100mg/ℓ의 암피실린, 25mg/ℓ의 IPTG 및 10g/ℓ의 카스아미노(Casmino)산을 함유한 50ml의 Vogel 및 Bonner의 배지에 접종시키고 교반하의 37℃에서 24시간 배양하였다. 그후에 상기 세포를 원심분리에 의해 수집하였다. 상기 수집된 세포를 세척한 후 상기 세포를 0.1mM피리독살을 함유한 10ml의 100mM Tris-HCL완충액(pH7.8)에 현탁시켰다. 초음파법에 의해 세포를 포함하지 않는 추출물을 제조하고 상기 추출물의 트립토판 합성효소 활성을 Yanofsky의 방법(Yanofsky.C외 다수.,(1962) Methods in Enzymology,Vol.5,p.794-806)에 의해 측정하였다. 비교하기 위하여 상기에서 설명한 바와 같이 제조된 형질전환체의 숙주인 이.콜리 K19 W3110 MT-10347을 상기 동일 배지(그러나 20mg/ℓ의 트립토판을 함유한)에서 배양시키고 상기 설명한 것과 공일한 방법으로 상기 트립토판 합성효소 활성을 결정하였다.
각 균주의 트립토판 합성효소 활성은 하기표에 나타나있다. 트립토판 합성효소의 1유닛은 37℃에서의 20분간 반응에서 0.1μmol의 트립토판을 산출하는 효소의 양으로서 규정한다.
[표 1]
Figure kpo00001
상기 세포를 함유하지 않는 MT-10474의 추출물을 65℃에서 10분간 열처리하고 다음 상기 트립토판 합성효소 활성을 결정하였다. 결과로써 약 90%의 상기 효소활성이 잔류되었다.
비록 본 발명의 상기 바람직한 구체예에 근거하여 설명되었으나 본 기술분야에 숙달된 사람에게는 본 발명의 정신 및 범위를 이탈함없이 다양한 변경이 가능하다는 것은 명백하다.

Claims (21)

  1. 다음과 같은 아미노산 서열을 갖는 트립토판 합성효소 B를 암호화하는 부위를 함유하는 클론된 유전자.
    MERVPNEHGR FGDFGGKFVP ETLMLPLEEI EAELDKALAD
    ESFKQEYIRI LQHYSGRPTP LTFAPNLTRQ LGGAKMYLKR
    EDLNHTGAHK INNAIGQALL AKRMGKKKLI AETGAGQHGV
    AAATVAAHFG MDCIVFMGEE DIKRQELNVF RMKLLGAEVV
    PVSSGNRTLK DATNENIRYW VAHCDDHFYM IGSVVGPHPY
    PKMVREFQRI IGDEAKEQFL ACEGKLPDVI VACVGGGSNA
    IGMFYPFLQD DVRLVGVEAA GKGIDTPYHA ATITKGTKGV
    IHGAMTYLLQ DEYGQIVEPY SISAGLDYPG VGPEHAYLAS
    IGRVRYESVT DEEAVAAFRL LAQTEGIIPA IESAHAVAKA
    VELAQSMSPD ETVLICLSGR GDKDVQTMMR HLGAKEGEDV
    AAIR
    (상기식에서 A는 알란닌, C는 시스테인, D는 아스파르트, E는 글루탐산, F는 페닐알라닌, G는 글리신, H는 히스티딘, I는 이소루이신, K는 리신, L은 루이신, M은 메티오닌, N은 아스파라긴, P는 프롤린, Q는 글루타민, R은 알기닌, S는 세린, T는 트레오닌, V는 발린, W는 트립토판 및 Y는 티로신을 나타낸다.)
  2. 다음과 같은 아미노산 서열을 갖는 트립토판 합성효소 A를 암호화하는 부위를 함유하는 클론틴 유전자.
    MLLLSVNPPL FIPFIVAGDP SPEVTVDLAL ALEEAGADLL
    ELGVPYSDPL ADGPTIQRAA ARQLAGNMTL PKAIHLVAEM
    RKKGVTIPII LFTYYNPVLQ LGEESFFALA RENGANGVLI
    PDLPFEESGP LRELGERFDL PLISLVAPTS KQRIERIASV
    AQGFLYCVSS LGVTGMRETL PESLGDFVSE VKRHSRVPVA
    VGFGISTPEQ VAMLKEVCDG VVIGSALVQK VEQLGERLLA
    PEEKEAAIAE FAAYARSLAA PLHARPCSLR
    (상기식에서, 문자들은 제1항에서 정의한 바와 같다.)
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 다음과 같은 DNA서열을 갖는 클론된 유전자.
    ATGGAACGCG TTCCGAATGA ACATGGGCGA TTTGGCGATT
    TCGGCGGCAA GTTTGTCCCG GAGACGCTCA TGCTTCCGCT
    TGAGGAAATC GAAGCCGAGC TTGACAAAGC GCTGGCGGAC
    GAATCGTTCA AACAAGAATA TATCCGCATT TTGCAGCACT
    ACTCCGGTCG GCCGACTCCG CTCACGTTCG CGCCGAATTT
    GACACGGCAG CTTGGTGGCG CGAAAATGTA TTTAAAGCGC
    GAAGATTTAA ACCATACCGG CGCCCATAAA ATCAACAATG
    CCATCGGCCA GGCGCTTTTG GCGAAACGGA TGGGCAAGAA
    AAAGCTGATC GCGGAAACCG GCGCCGGCCA ACATGGGGTG
    GCGGCCGCGA CCGTGGCGGC CCATTTCGGG ATGGACTGCA
    TCGTCTTTAT GGGAGAGGAA GAGATCAAGC GGCAAGAGTT
    GAACGTATTT CGCATGAAGC TGCTTGGCGC GGAAGTGGTG
    CCGGTCTCAA GCGGCAACCG GACGTTGAAA GACGCGACAA
    ACGAGGCGAT TCGCTATTGG GTCGCCCATT GCGACGACAA
    TTTTTACATG ATCGGCTCGG TGGTCGGCCC GCACCCGTAC
    CCGAAAATGG TGCGCGAGTT TCAACGCATC ATTGGCGATG
    AGGCGAAAGA GCAGTTTCTC GCCTGCGAAG GGAAGCTGCC
    CGATGTCATC GTCGCCTGCG TTGGCGGCGG CAGCAACGCC
    ATCGGCATGT TTTACCCGTT TTTGCAAGAT GACGTCCGCC
    TTGTCGGGGT GGAAGCCGCC GGCAAAGGCA TTGACACCCC
    TTACCATGCC GCGACGATCA CGAAAGGGAC GAAAGGGGTC
    ATCCACGGGG CGATGACGTA CTTGCTGCAG GATGAGTACG
    GGCAAATTGT CGAGCCGTAC TCGATCTCAG CCGGAATCGA
    TTACCCCGGC GTCGGTCCGG AGCATGCCTA TTTAGCGAGC
    ATCGGCCGCG TCCGCTACGA AAGCGTGACC GACGAGGAAG
    CGGTCGCGGC GTTTCGGCTG CTGGCGCAAA CAGAAGGCAT
    CATTCCGGCG ATTGAGTCGG CCCATGCGGT GGCGAAAGCC
    GTGGAGCTCG CCCAATCGAT GTCGCCGGAT GAAACGGTGC
    TCATTTGCCT GTCCGGCCGC GGCGATAAAG ACGTGCAAAC
    GATGATGCGC CATCTTGGCG CGAAAGAAGG TGAAGATGTT
    GCTGCTATCC GTTAATCCGC CGCTGTTTAT TCCCTTTATT
    GTCGCCGGCG ACCCGTCGCC TGAGGTGACG GTGGATTTGG
    CCTTGGCGCT TGAGGAGGCC GGCGCCGATC TATTGGAGCT
    TGGCGTGCCG TACTCCGACC CGCTCGCCGA CGGACCGACG
    ATCCAGCGCG CCGCCGCCCG GGCGCTTGCC GGGAACATGA
    CGTTGCCGAA AGCCATTCAT CTCGTCGCCG AAATGCGAAA
    AAAGGGGGTA ACCATTCCGA TTATTCTCTT TACGTATTAC
    AATCCTGTGT TACAATTAGG AGAAGAATCC TTTTTTGCTT
    TAGCGCGGGA AAATGGCGCC AACGGCGTGC TCATTCCCGA
    TTTGCCGTTT GAAGAAAGCG GTCCGCTCCG CGAACTGGGC
    GAGCGGTTTG ACCTTCCGCT CATTTCGCTC GTCGCGCCGA
    CGTCAAAGCA GCGGATTGAG CGGATCGCTT CGGTAGCGCA
    AGGGTTTTTG TATTGCGTTT CCTCGCTTGG CGTCACCGGT
    ATGCGCGAAA CGTTGCCGGA GTCGCTTGGC GATTTTGTCA
    GTGAACTCAA GCGGCATAGC CGTGTGCCGG TCGCTGTCGG
    GTTCGGCATC TCCACGCCCG AACAAGTGGC GATGCTGAAA
    GAGGTGTGCG ATGGCGTCGT CATCGGCAGC GCCCTTGTGC
    AAAAAGTGGA ACAGTTGGGG GAACGGCTGC TGGCGCCGGA
    AGAAAAAGAA GCGGCCATCG CCGAGTTTGC CGCCTACGCC
    CGCTCGCTCG CCGCGCCGCT TCACGCGCCG TGTTCTTTGC
    GC
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 바실러스 스테아로터모필러스(Bacillus stearothermophilus)로부터 유래된 클론된 유전자.
  5. 제7도에 나타난 염기서열을 갖는 DNA단편물.
  6. 숙주세포내에서 트립토판 합성효소 B를 형질발현 시킬수 있는 제1항에서 정의한 아미노산 서열을 갖는 트립토판 합성효소 B를 암호화하는 부위를 함유하는 유전자를 갖는 재조합 플라즈미드.
  7. 숙주세포내에서 트립토판 합성효소 A를 형질발현 시킬수 있는, 제2항에서 정의한 아미노산 서열을 갖는 트립토판 합성효소 A를 암호화하는 부위를 함유하는 유전자를 갖는 재조합 플라즈미드.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 유전자가 제3항에 나타낸 DNA서열을 갖는 재조합 플라즈미드.
  9. 트립토판 합성효소 B유전자 및 트립토판 합성효소 A유전자를 형질발현 시킬수 있는, 제3항에서 정의한 DNA단편물을 함유하는 재조합 플라즈미드.
  10. 재조합 플라즈미드 pISY 10.
  11. 재조합 플라즈미드 pISY 21.
  12. 재조합 플라즈미드 pISY 73.
  13. 제6항에서 정의한 재조합 플라즈미드로 형질전환시킨 에세리히아 콜리(Escherichia coli).
  14. 제7항에서 정의한 재조합 플라즈미드로 형질전환시킨 에세리히아 콜리.
  15. 제8항에서 정의한 재조합 플라즈미드로 형질전환시킨 에세리히아 콜리.
  16. 제9항에서 정의한 재조합 플라즈미드로 형질전환시킨 에세리히아 콜리.
  17. 에세리히아 콜리 MT-10471 FERM BP-2362.
  18. 에세리히아 콜리 MT-10472 FERM BP-2363.
  19. 에세리히아 콜리 MT-10474 FERM BP-2364.
  20. 트립토판 합성효소를 생산할 수 있는 조건하에서 청구범위 제13항, 제15항, 제16항, 제17항, 제18항 및 제19항중 어느한 항에서 정의한 에세리히아 콜리를 배양하고, 이어서 생성된 트립토판 합성효소를 회수하는 단계들로 구성되는 트립토판 합성효소의 제조방법.
  21. 트립토판 합성효소를 생산할 수 있는 조건하에서 제14항에서 정의한 에세리히아 콜리를 배양하고, 이어서 생성된 트립토판 합성효소를 회수하는 단계들로 구성되는 트립토판 합성효소의 제조방법.
KR1019890006253A 1988-05-09 1989-05-09 클론된 트립토판 합성효소 유전자 및 그를 함유하는 재조합 플라즈미드 KR910005627B1 (ko)

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