JPH0722510B2 - 耐熱性トリプトファンシンターゼをコードする遺伝子とその利用 - Google Patents
耐熱性トリプトファンシンターゼをコードする遺伝子とその利用Info
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- JPH0722510B2 JPH0722510B2 JP63286728A JP28672888A JPH0722510B2 JP H0722510 B2 JPH0722510 B2 JP H0722510B2 JP 63286728 A JP63286728 A JP 63286728A JP 28672888 A JP28672888 A JP 28672888A JP H0722510 B2 JPH0722510 B2 JP H0722510B2
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- tryptophan synthase
- escherichia coli
- recombinant plasmid
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- tryptophan
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、耐熱性トリプトファンシンターゼ（tryptoph
an synthase）の生産に有用なトリプトファンシンター
ゼ遺伝子とその利用に関するものである。
an synthase）の生産に有用なトリプトファンシンター
ゼ遺伝子とその利用に関するものである。
トリプトファンシンターゼは、いわゆる多機能酵素であ
り、インドールとＬ−セリンからのＬ−トリプトファン
合成など種々の反応を触媒する（Miles,E.W.（1979）Ad
v.Enzymol.,Vol.49,p.127−186）、工業的にも重要な酵
素である。
り、インドールとＬ−セリンからのＬ−トリプトファン
合成など種々の反応を触媒する（Miles,E.W.（1979）Ad
v.Enzymol.,Vol.49,p.127−186）、工業的にも重要な酵
素である。
［従来の技術］ 従来、微生物由来のトリプトファンシンターゼ遺伝子と
しては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）（He
rshfield,V.et al.（1974）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.
A.,Vol.71,p.3455−3459）、バチルス・ズブチリス（Ba
cillus subtilus）（Henner,D.J.et al.（1984）Gene,V
ol.34,p169−177）、ブレビバクテリウム・ラクトファ
メンタム（Brevibacterium lactofermentum）（Matsui,
K.et al.（1986）Agric.Biol.Chem.,Vol.51,p823−82
8）、サルモネラ・チフィムリム（Salmonella typhimur
ium）（Kawasaki,H.et al.（1987）J.Biol.Chem.,Vol.2
62,p.10678−10683）、サッカロマイセス・セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）（Waltz,A.et al.（197
8）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,Vol.75,p.6172−6176）
由来の遺伝子がクローニングされている。
しては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）（He
rshfield,V.et al.（1974）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.
A.,Vol.71,p.3455−3459）、バチルス・ズブチリス（Ba
cillus subtilus）（Henner,D.J.et al.（1984）Gene,V
ol.34,p169−177）、ブレビバクテリウム・ラクトファ
メンタム（Brevibacterium lactofermentum）（Matsui,
K.et al.（1986）Agric.Biol.Chem.,Vol.51,p823−82
8）、サルモネラ・チフィムリム（Salmonella typhimur
ium）（Kawasaki,H.et al.（1987）J.Biol.Chem.,Vol.2
62,p.10678−10683）、サッカロマイセス・セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）（Waltz,A.et al.（197
8）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,Vol.75,p.6172−6176）
由来の遺伝子がクローニングされている。
［発明が解決しようとする課題］ しかし、これらの常温菌（mesophile）由来のトリプト
ファンシンターゼ遺伝子を有する組換え体プラスミドに
より形質転換された微生物の生産するトリプトファンシ
ンターゼは、耐熱性などの安定性が必ずしも満足できる
ものでなく、例えば、インドールとＬ−セリンからのＬ
−トリプトファン合成反応触媒として工業的に用いるに
は、耐熱性などの安定性に、よりすぐれた酵素が要望さ
れていた。
ファンシンターゼ遺伝子を有する組換え体プラスミドに
より形質転換された微生物の生産するトリプトファンシ
ンターゼは、耐熱性などの安定性が必ずしも満足できる
ものでなく、例えば、インドールとＬ−セリンからのＬ
−トリプトファン合成反応触媒として工業的に用いるに
は、耐熱性などの安定性に、よりすぐれた酵素が要望さ
れていた。
一方、中等度好熱菌（moderate thermophile）に属する
バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearot
hermophilus）の生産する酵素は、常温菌の酵素に比べ
耐熱性が高いことが知られている（Ohshima,T.et al.
（1985）Arch.Microbiol.,Vol.141,p407−411）。
バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearot
hermophilus）の生産する酵素は、常温菌の酵素に比べ
耐熱性が高いことが知られている（Ohshima,T.et al.
（1985）Arch.Microbiol.,Vol.141,p407−411）。
しかし、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus
stearothermophilus）由来の耐熱性トリプトファンシ
ンターゼ遺伝子、その遺伝子を有する組換え体プラスミ
ドおよびそれにより形質転換された微生物については、
全く知られていない。
stearothermophilus）由来の耐熱性トリプトファンシ
ンターゼ遺伝子、その遺伝子を有する組換え体プラスミ
ドおよびそれにより形質転換された微生物については、
全く知られていない。
［課題を解決するための手段］ そこで、本発明者らは、耐熱性のトリプトファンシンタ
ーゼを生産するために鋭意研究した結果、中等度好熱菌
に属するバチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus
stearothermophilus）由来の耐熱性トリプトファンシ
ンターゼをコードする遺伝子を担うDNA断片を分離する
ことに成功した。更に、この耐熱性トリプトファンシン
ターゼをコードする遺伝子の構造を確認し、この遺伝子
DNAをプラスミドベクターに連結した新規な組換え体プ
ラスミドおよびそれにより形質転換された新規な大腸菌
を創製し、この大腸菌が耐熱性のトリプトファンシンタ
ーゼを生産することを見い出し、本発明を完成するに至
った。
ーゼを生産するために鋭意研究した結果、中等度好熱菌
に属するバチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus
stearothermophilus）由来の耐熱性トリプトファンシ
ンターゼをコードする遺伝子を担うDNA断片を分離する
ことに成功した。更に、この耐熱性トリプトファンシン
ターゼをコードする遺伝子の構造を確認し、この遺伝子
DNAをプラスミドベクターに連結した新規な組換え体プ
ラスミドおよびそれにより形質転換された新規な大腸菌
を創製し、この大腸菌が耐熱性のトリプトファンシンタ
ーゼを生産することを見い出し、本発明を完成するに至
った。
すなわち、本発明によれば耐熱性トリプトファンシンタ
ーゼの生産に有用なトリプトファンシンターゼ遺伝子、
組換え体プラスミドおよび大腸菌と、この大腸菌を用い
るトリプトファンシンターゼの製造法が提供される。
ーゼの生産に有用なトリプトファンシンターゼ遺伝子、
組換え体プラスミドおよび大腸菌と、この大腸菌を用い
るトリプトファンシンターゼの製造法が提供される。
本発明の、トリプトファンシンターゼ遺伝子は、例え
ば、中等度好熱菌であるバチルス・ステアロサーモフィ
ラス（Bacillus stearothermophilus）の染色体DNA上に
存在する。バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacill
us stearothermophilus）の例としては、IFO 12983、IF
O 13737などがある。
ば、中等度好熱菌であるバチルス・ステアロサーモフィ
ラス（Bacillus stearothermophilus）の染色体DNA上に
存在する。バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacill
us stearothermophilus）の例としては、IFO 12983、IF
O 13737などがある。
トリプトファンシンターゼの遺伝子を担うDNAを採取す
る方法については、特に限定されないが、例えば、次の
ような方法を用いることが出来る。バチルス・ステアロ
サーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）のト
リプトファンシンターゼの遺伝子を担うDNAを有してい
る株を培養し、この菌体からフェノール法（Saito,H.et
al.（1963）Biochem.Biophys.Acta,Vol.72,p.619−62
9）などにより染色体DNAを抽出、精製する。この染色体
DNAを適当な制限酵素で切断し、大腸菌内で増殖可能な
プラスミドベクターにDNAリガーゼにより酵素的に接続
し、得られた組換えDNAを用いてトリプトファンシンタ
ーゼ生産能の欠如したトリプトファン要求性大腸菌変異
株を形質転換し、トリプトファン非要求となった菌株を
選択し、この菌株よりバチルス・ステアロサーモフィラ
スのトリプトファンシンターゼの遺伝子を担うDNAを分
離できる。
る方法については、特に限定されないが、例えば、次の
ような方法を用いることが出来る。バチルス・ステアロ
サーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）のト
リプトファンシンターゼの遺伝子を担うDNAを有してい
る株を培養し、この菌体からフェノール法（Saito,H.et
al.（1963）Biochem.Biophys.Acta,Vol.72,p.619−62
9）などにより染色体DNAを抽出、精製する。この染色体
DNAを適当な制限酵素で切断し、大腸菌内で増殖可能な
プラスミドベクターにDNAリガーゼにより酵素的に接続
し、得られた組換えDNAを用いてトリプトファンシンタ
ーゼ生産能の欠如したトリプトファン要求性大腸菌変異
株を形質転換し、トリプトファン非要求となった菌株を
選択し、この菌株よりバチルス・ステアロサーモフィラ
スのトリプトファンシンターゼの遺伝子を担うDNAを分
離できる。
染色体DNAを切断に用いる制限酵素は、酵素使用量や反
応時間などを調節して、DNAの切断の程度を調節すれ
ば、様々な種類のものが使用可能である。例えば、Hpa
II、Acc I、SaU3A I、Hpa I、Sca Iなどを用いることが
できる。
応時間などを調節して、DNAの切断の程度を調節すれ
ば、様々な種類のものが使用可能である。例えば、Hpa
II、Acc I、SaU3A I、Hpa I、Sca Iなどを用いることが
できる。
プラスミドベクターとしては、大腸菌内で増殖可能なも
のが用いられ、例えば、ColE1系のpBR322、pUC19などが
好適に用いられる。
のが用いられ、例えば、ColE1系のpBR322、pUC19などが
好適に用いられる。
プラスミドベクターは、染色体DNAを切断した際に用い
た制限酵素またはその制限酵素と同じ接着末端を生じさ
せることの出来る制限酵素で切断したのち、染色体DNA
断片にDNAリガーゼにより接続される。
た制限酵素またはその制限酵素と同じ接着末端を生じさ
せることの出来る制限酵素で切断したのち、染色体DNA
断片にDNAリガーゼにより接続される。
DNAリガーゼとしては、T4ファージ由来のものが好適に
用いられる。
用いられる。
染色体DNAは、制限酵素で切断したのち、ショ糖密度勾
配遠心、アガロース電気泳動などにより特定の大きさの
DNA断片だけを分画、回収してプラスミドベクターに接
続してもよい。
配遠心、アガロース電気泳動などにより特定の大きさの
DNA断片だけを分画、回収してプラスミドベクターに接
続してもよい。
このようにして得られた染色体DNA断片とプラスミドベ
クターとの組換えDNAを大腸菌に導入するには、塩化カ
ルシウムで菌体を処理する方法（Mandel,O.et al.（197
0）J.Mol.Biol.,Vol.53,p.159−162）などを用いること
ができる。
クターとの組換えDNAを大腸菌に導入するには、塩化カ
ルシウムで菌体を処理する方法（Mandel,O.et al.（197
0）J.Mol.Biol.,Vol.53,p.159−162）などを用いること
ができる。
トリプトファンシンターゼ生産能の欠如したトリプトフ
ァン要求性大腸菌変異株としては、例えば、E.coli K12
W3110 MT−10347（FERM P−9940）を用いることができ
る。
ァン要求性大腸菌変異株としては、例えば、E.coli K12
W3110 MT−10347（FERM P−9940）を用いることができ
る。
組換え体プラスミドを有する大腸菌から組換え体プラス
ミドを単離するには、アルカリ抽出法（Brinboim,H.et
al.（1979）Nucleic Acids Res.,Vol.7,p1513−1523）
などを用いることが出来る。
ミドを単離するには、アルカリ抽出法（Brinboim,H.et
al.（1979）Nucleic Acids Res.,Vol.7,p1513−1523）
などを用いることが出来る。
単離された組換え体プラスミドは、塩化カルシウムで菌
体を処理する方法（Mandel,O.et al.（1970）J.Mol.Bio
l.,Vol.53,p.159〜162）などにより、再び大腸菌に導入
することができる。
体を処理する方法（Mandel,O.et al.（1970）J.Mol.Bio
l.,Vol.53,p.159〜162）などにより、再び大腸菌に導入
することができる。
以上のようにして得られたバチルス・ステアロサーモフ
ィラス（Bacillus stearothermophilus）由来のトリプ
トファンシンターゼの遺伝子を担うDNAをプラスミドベ
クターに連結した組換え体プラスミドの例として、pISY
10とpISY21がある。
ィラス（Bacillus stearothermophilus）由来のトリプ
トファンシンターゼの遺伝子を担うDNAをプラスミドベ
クターに連結した組換え体プラスミドの例として、pISY
10とpISY21がある。
pISY10、pISY21をそれぞれ保持する大腸菌として次の２
株が微生物工業技術研究所に寄託されている。
株が微生物工業技術研究所に寄託されている。
エシェリヒア・コリ（Escherichia coli） MT−10471（MT−10347/pISY10）（FERM P−9941） エシェリヒア・コリ（Escherichia coli） MT−10472（MT−10347/pISY21）（FERM P−9942） pISY10またはpISY21上のトリプトファンシンターゼ遺伝
子の発現効率を高めるためには、pISY10またはpISY21か
らトリプトファンシンターゼ遺伝子部分を切り出し、そ
れを強力なプロモーターを有するベクターのプロモータ
ーの下流に接続することが有効である。プロモーターの
例としては、trp、lacUV5、tac、λPLなどがある。更
に、トリプトファンシンターゼ遺伝子の下流にターミネ
ーターを接続するのが有効なこともある。
子の発現効率を高めるためには、pISY10またはpISY21か
らトリプトファンシンターゼ遺伝子部分を切り出し、そ
れを強力なプロモーターを有するベクターのプロモータ
ーの下流に接続することが有効である。プロモーターの
例としては、trp、lacUV5、tac、λPLなどがある。更
に、トリプトファンシンターゼ遺伝子の下流にターミネ
ーターを接続するのが有効なこともある。
このような組換え体プラスミドの例として、pISY73があ
る。pISY73を保持する大腸菌として次の株が微生物工業
技術研究所に寄託されている。
る。pISY73を保持する大腸菌として次の株が微生物工業
技術研究所に寄託されている。
エシェリヒア・コリ（Escherichia coli） MT−10474（MT−10347/pISY73）（FERM P−10275） トリプトファンシンターゼを製造するには、トリプトフ
ァンシンターゼの遺伝子を担うDNAをプラスミドベクタ
ーに連結した組換え体プラスミドで形質転換された大腸
菌を培養し、培養物中にトリプトファンシンターゼを生
成させればよい。
ァンシンターゼの遺伝子を担うDNAをプラスミドベクタ
ーに連結した組換え体プラスミドで形質転換された大腸
菌を培養し、培養物中にトリプトファンシンターゼを生
成させればよい。
大腸菌の培養は、常法により行うことができる。すなわ
ち、培地として、炭素源、窒素源、無機イオン、更に必
要に応じてアミノ酸、ビタミンなどを含むものを用い、
好気的に培養すればよい。また、必要に応じ、培地に抗
生物質、イソプロピル−β−チオガラクトシド、インド
ールアクリル酸のような薬剤を加えることもできる。
ち、培地として、炭素源、窒素源、無機イオン、更に必
要に応じてアミノ酸、ビタミンなどを含むものを用い、
好気的に培養すればよい。また、必要に応じ、培地に抗
生物質、イソプロピル−β−チオガラクトシド、インド
ールアクリル酸のような薬剤を加えることもできる。
このようにして得られた培養物は、そのままトリプトフ
ァンシンターゼの酵素源として使用できるが、粗酵素抽
出液、精製酵素、分離生菌体、分離菌体の処理物なども
酵素源として使用できる。
ァンシンターゼの酵素源として使用できるが、粗酵素抽
出液、精製酵素、分離生菌体、分離菌体の処理物なども
酵素源として使用できる。
トリプトファンシンターゼの精製法としては、通常の酵
素精製法を用いることが出来る。また、トリプトファン
シンターゼの精製に際して、菌体破砕液の加熱処理を行
えば、効率よく耐熱性のトリプトファンシンターゼを採
取することが出来る。
素精製法を用いることが出来る。また、トリプトファン
シンターゼの精製に際して、菌体破砕液の加熱処理を行
えば、効率よく耐熱性のトリプトファンシンターゼを採
取することが出来る。
［実施例］ 以下に実施例で本発明を詳細に説明する。
実施例１ （ａ）バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus s
tearothermophilus）の染色体DNAの分離。
tearothermophilus）の染色体DNAの分離。
バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearot
hermophilus）IFO 13737を２のＬ培地（バクト・トリ
プトン10g/、酵母エキス5g/、塩化ナトリウム5g/
、pH7.2に調整）に植菌し、55℃で15時間振とう培養
した後、遠心分離により集菌した。菌体を160mlの0.15M
NaCl−50mM EDTA（pH8.0）溶液に懸濁し、160mgのリゾ
チームを加えて、37℃で20分間、ゆるやかにかくはんし
た。
hermophilus）IFO 13737を２のＬ培地（バクト・トリ
プトン10g/、酵母エキス5g/、塩化ナトリウム5g/
、pH7.2に調整）に植菌し、55℃で15時間振とう培養
した後、遠心分離により集菌した。菌体を160mlの0.15M
NaCl−50mM EDTA（pH8.0）溶液に懸濁し、160mgのリゾ
チームを加えて、37℃で20分間、ゆるやかにかくはんし
た。
ついで、20％ SDS溶液4mlを加え、65℃で20分間放置し
た。更に、8mgのプロテイナーゼＫ（Proteinase K,Boeh
ringer Mannheim社製）を加え、37℃で１時間放置し
た。
た。更に、8mgのプロテイナーゼＫ（Proteinase K,Boeh
ringer Mannheim社製）を加え、37℃で１時間放置し
た。
0.15M NaCl−50mM EDTA（pH8.0）溶液で飽和したフェノ
ール160mlを加え、ゆるやかにかくはんした後、遠心分
離（10,000rpm,15min）し、上層を回収する。
ール160mlを加え、ゆるやかにかくはんした後、遠心分
離（10,000rpm,15min）し、上層を回収する。
この溶液に、２倍量の冷エタノールを加え、ガラス棒に
より繊維状の沈澱を巻取り、70％,80％,90％のエタノー
ルに順次、数分づつ浸漬した後、乾燥し、0.1M NaCl−
0.15Mクエン酸ナトリウム（pH7.0）溶液40mlに溶解し
た。
より繊維状の沈澱を巻取り、70％,80％,90％のエタノー
ルに順次、数分づつ浸漬した後、乾燥し、0.1M NaCl−
0.15Mクエン酸ナトリウム（pH7.0）溶液40mlに溶解し
た。
この粗DNA溶液に、6mg/mlのリボヌクレアーゼＡ（Riboi
nulease A,Boehringer Mannheim社製）を200μ、1,00
0U/mlのリボヌクレアーゼT1（Riboinuleas T1,Boehring
er Mannheim社製）を200μ加え、37℃で1.5時間放置
した。
nulease A,Boehringer Mannheim社製）を200μ、1,00
0U/mlのリボヌクレアーゼT1（Riboinuleas T1,Boehring
er Mannheim社製）を200μ加え、37℃で1.5時間放置
した。
この溶液に、0.15M NaCl−50mM EDTA（pH8.0）溶液で飽
和したフェノール40mlを加え、ゆるやかにかくはんした
後、遠心分離（10,000rpm,15min）し、上層を回収し
た。
和したフェノール40mlを加え、ゆるやかにかくはんした
後、遠心分離（10,000rpm,15min）し、上層を回収し
た。
２倍量の冷エタノールを加え、ガラス棒により繊維状の
沈澱を巻取り、70％,80％,90％のエタノールに順次、数
分づつ浸漬した後、乾燥し、10mM Tris−HCl（pH8.0）
−1mM EDTA溶液（以下、TE緩衝液と記す）20mlに溶解し
た。
沈澱を巻取り、70％,80％,90％のエタノールに順次、数
分づつ浸漬した後、乾燥し、10mM Tris−HCl（pH8.0）
−1mM EDTA溶液（以下、TE緩衝液と記す）20mlに溶解し
た。
このDNA溶液を、２TE緩衝液に対して透析し、4.5mgの
染色体DNAを含むTE緩衝液を20ml得た。
染色体DNAを含むTE緩衝液を20ml得た。
（ｂ）染色体DNA断片の調製。
（ａ）で調製した染色体DNAを含むTE緩衝液の内、1,350
μ（DNA 300μｇを含む）に制限酵素Hpa II（Boehrin
ger Mannheim社製）を30Units加え、10mM Tris−HCl（p
H7.5）、7mM MgCl2、7mM 2−メルカプトエタノールを
含む反応液1,500μで、37℃で１時間放置して、染色
体DNAを部分的に切断した。
μ（DNA 300μｇを含む）に制限酵素Hpa II（Boehrin
ger Mannheim社製）を30Units加え、10mM Tris−HCl（p
H7.5）、7mM MgCl2、7mM 2−メルカプトエタノールを
含む反応液1,500μで、37℃で１時間放置して、染色
体DNAを部分的に切断した。
この溶液に、TE緩衝液で飽和したフェノール・クロロホ
ルム（フェノール：クロロホルム＝1:1）を等量加え
て、ゆるやかにかくはんした後、遠心分離（15,000rpm,
5min）し、上層を回収した。
ルム（フェノール：クロロホルム＝1:1）を等量加え
て、ゆるやかにかくはんした後、遠心分離（15,000rpm,
5min）し、上層を回収した。
回収した上層に２倍量の冷エタノールを加え、生じた沈
澱を乾燥後、TE緩衝液300μに溶解した。このDNA溶液
を10〜40％ショ糖密度勾配遠心（20℃,26,000rpm,24h
r）にかけ、およそ４〜6kbと６〜10kbの２つの画分を回
収した。それぞれの画分をTE緩衝液に対して透析した
後、エタノール沈澱によりDNAを回収し、TE緩衝液に溶
解した。
澱を乾燥後、TE緩衝液300μに溶解した。このDNA溶液
を10〜40％ショ糖密度勾配遠心（20℃,26,000rpm,24h
r）にかけ、およそ４〜6kbと６〜10kbの２つの画分を回
収した。それぞれの画分をTE緩衝液に対して透析した
後、エタノール沈澱によりDNAを回収し、TE緩衝液に溶
解した。
（Ｃ）染色体DNA断片とプラスミドベクターの結合。
pUC19（宝酒造製）40μｇを、制限酵素Acc（Boehringer
Mannheim社製）で完全消化後、アルカリフォスファタ
ーゼ処理した。このプラスミドベクター20μｇづつと、
（ｂ）で調製した染色体DNA断片の各画分をそれぞれ混
合し、それぞれ、5mM Mg−Cl2、10mMジチオスレイトー
ル、1mM ATP、66mM Tris−HCl緩衝液（pH7.5）の反応液
4ml中で、200UnitsのT4 DNAリガーゼ（Boehringer Mann
heim社製）により、16℃、16hr反応させた。
Mannheim社製）で完全消化後、アルカリフォスファタ
ーゼ処理した。このプラスミドベクター20μｇづつと、
（ｂ）で調製した染色体DNA断片の各画分をそれぞれ混
合し、それぞれ、5mM Mg−Cl2、10mMジチオスレイトー
ル、1mM ATP、66mM Tris−HCl緩衝液（pH7.5）の反応液
4ml中で、200UnitsのT4 DNAリガーゼ（Boehringer Mann
heim社製）により、16℃、16hr反応させた。
大腸菌の形質転換には、この反応液をそのまま用いた。
（ｄ）トリプトファンシンターゼの遺伝子のクローニン
グ。
グ。
（ｃ）で調製した組換え体プラスミドを含む反応液を用
いて大腸菌の形質転換を行った。トリプトファンシンタ
ーゼ生産能の欠如したトリプトファン要求性大腸菌変異
株であるE.coli K12 W3110 MT−10347（FERM P−9940）
を50mlのＬ培地（バクト・トリプトン10g/、酵母エキ
ス5g/、塩化ナトリム5g/、pH7.2に調整）に植菌
し、37℃で３時間振とう培養した後、遠心分離により集
菌した。
いて大腸菌の形質転換を行った。トリプトファンシンタ
ーゼ生産能の欠如したトリプトファン要求性大腸菌変異
株であるE.coli K12 W3110 MT−10347（FERM P−9940）
を50mlのＬ培地（バクト・トリプトン10g/、酵母エキ
ス5g/、塩化ナトリム5g/、pH7.2に調整）に植菌
し、37℃で３時間振とう培養した後、遠心分離により集
菌した。
菌体を0.1M CaCl2溶液2mlに懸濁し、０℃で30分間放置
した後、遠心分離し、0.1M CaCl2溶液40mlに再び懸濁し
た。
した後、遠心分離し、0.1M CaCl2溶液40mlに再び懸濁し
た。
このようにして調製した菌体懸濁液を20mlづつ２本の試
験管に分け、それぞれに、（ｃ）で調製した反応液を加
えて、０℃で３時間放置した後、42℃で２分間保った。
験管に分け、それぞれに、（ｃ）で調製した反応液を加
えて、０℃で３時間放置した後、42℃で２分間保った。
遠心分離により集菌し、Ｌ培地を10mlづつ加えて37℃で
30分間培養した後、遠心分離により集菌した。
30分間培養した後、遠心分離により集菌した。
菌体をそれぞれ10mlの0.85％NaClに懸濁した後、遠心分
離により集菌し、それぞれ1mlの0.18％NaClに懸濁し
た。
離により集菌し、それぞれ1mlの0.18％NaClに懸濁し
た。
このようにして調製した菌体懸濁液を、100mg/のアン
ピシリン、25mg/のイソプロピル−β−チオガラクト
シド、10g/のカザミノ酸、15g/の寒天を添加したVo
gelとBonnerの培地（MgSO27H2O:0.2g/、Citric acid
・H2O:2g/、K2HPO4:10g/、NaNH4PO4・4H2O:3.5g/
、Glucose:4g/）に塗布して、37℃で２日間培養し
た。
ピシリン、25mg/のイソプロピル−β−チオガラクト
シド、10g/のカザミノ酸、15g/の寒天を添加したVo
gelとBonnerの培地（MgSO27H2O:0.2g/、Citric acid
・H2O:2g/、K2HPO4:10g/、NaNH4PO4・4H2O:3.5g/
、Glucose:4g/）に塗布して、37℃で２日間培養し
た。
およそ６〜10kbの染色体DNA断片の画分を用いて調製し
た組換え体プラスミドで形質転換した大腸菌を塗布した
寒天平板培地には、22のコロニーが生じた。この内、代
表的なコロニーから分離した大腸菌をエシェリヒア・コ
リ（Escherichia coli）MT−10471と名付け、工業技術
院微生物工業研究所に寄託した（FERM P−9941）。
た組換え体プラスミドで形質転換した大腸菌を塗布した
寒天平板培地には、22のコロニーが生じた。この内、代
表的なコロニーから分離した大腸菌をエシェリヒア・コ
リ（Escherichia coli）MT−10471と名付け、工業技術
院微生物工業研究所に寄託した（FERM P−9941）。
一方、およそ４〜6kbの染色体DNA断片の画分を用いて調
製した組換え体プラスミドで形質転換した大腸菌を塗布
した寒天平板培地には、27のコロニーが生じた。この
内、代表的なコロニーから分離した大腸菌をエシェリヒ
ア・コリ（Escherichia coli）MT−10472と名付け、工
業技術院微生物工業研究所に寄託した（FERM P−994
2）。
製した組換え体プラスミドで形質転換した大腸菌を塗布
した寒天平板培地には、27のコロニーが生じた。この
内、代表的なコロニーから分離した大腸菌をエシェリヒ
ア・コリ（Escherichia coli）MT−10472と名付け、工
業技術院微生物工業研究所に寄託した（FERM P−994
2）。
（ｅ）大腸菌の保持する組換え体プラスミドの分離。
エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）MT−10471（F
ERM P−9941）とエシェリヒア・コリ（Escherichia col
i）MT−10472（FERM P−9942）より次のような方法によ
り組換え体プラスミドを分離した。
ERM P−9941）とエシェリヒア・コリ（Escherichia col
i）MT−10472（FERM P−9942）より次のような方法によ
り組換え体プラスミドを分離した。
エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）MT−10471（F
ERM P−9941）または、エシェリヒア・コリ（Escherich
ia coli）MT−10472（FERM P−9942）を50mlのＬ培地に
植菌し、37℃で15時間振とう培養した後、遠心分離によ
り集菌した。
ERM P−9941）または、エシェリヒア・コリ（Escherich
ia coli）MT−10472（FERM P−9942）を50mlのＬ培地に
植菌し、37℃で15時間振とう培養した後、遠心分離によ
り集菌した。
菌体を2mgのリゾチームを含む2mlの50mM Glucose−25mM
Tris−HCl−10mM EDTA（pH8.0）溶液に懸濁した。
Tris−HCl−10mM EDTA（pH8.0）溶液に懸濁した。
0.2N NaOH 1％SDS溶液4mlを加えて、かくはんした。3M
CH3COONa（pH5.2）溶液を3ml加え、４℃で５分間時間放
置したのち、遠心分離し、上澄液を回収した。
CH3COONa（pH5.2）溶液を3ml加え、４℃で５分間時間放
置したのち、遠心分離し、上澄液を回収した。
この溶液に、TE緩衝液で飽和したフェノール・クロロホ
ルム（フェノール：クロロホルム＝1:1）を等量加え、
ゆるやかにかくはんした後、遠心分離（10,000rpm,5mi
n）し、上層を回収した。
ルム（フェノール：クロロホルム＝1:1）を等量加え、
ゆるやかにかくはんした後、遠心分離（10,000rpm,5mi
n）し、上層を回収した。
回収した上層に２倍量の冷エタノールを加え、生じた沈
澱を乾燥後、TE緩衝液1mlに溶解した。
澱を乾燥後、TE緩衝液1mlに溶解した。
このDNA溶液に、1mg/のリボヌクレアーゼＡ（Riboinu
lease A,Boehringer Mannheim社製）を20μ加え、37
℃で20分間放置した。
lease A,Boehringer Mannheim社製）を20μ加え、37
℃で20分間放置した。
この溶液に、フェノール・クロロホルム（フェノール：
クロロホルム＝1:1）を等量加え、ゆるやかにかくはん
した後、遠心分離（10,000rpm,5min）し、上層を回収し
た。
クロロホルム＝1:1）を等量加え、ゆるやかにかくはん
した後、遠心分離（10,000rpm,5min）し、上層を回収し
た。
このDNA溶液をBio−Gel A−50m（Bio−Rad社製）による
カラムクロマトグラフィにより精製し、エタノール沈澱
によりプラスミドDNAを回収した。
カラムクロマトグラフィにより精製し、エタノール沈澱
によりプラスミドDNAを回収した。
このようにしてエシェリヒア・コリ（Escherichia col
i）MT−10471（FERM P−9941）とエシェリヒア・コリ
（Escherichia coli）MT−10472（FERM P−9942）から
約50μｇづつのプラスミドDNAを分離し、それぞれ100μ
のTE緩衝液に溶解した。
i）MT−10471（FERM P−9941）とエシェリヒア・コリ
（Escherichia coli）MT−10472（FERM P−9942）から
約50μｇづつのプラスミドDNAを分離し、それぞれ100μ
のTE緩衝液に溶解した。
以下の組換え体プラスミドの解析においては、上記のよ
うにして得たプラスミドを使用した。
うにして得たプラスミドを使用した。
（ｆ）組換え体プラスミドの解析。
エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）MT−10471（F
ERM P−9941）から分離した組換え体プラスミドをpISY1
0と名付けた。この組換え体プラスミドは約12.2kbの大
きさであり、制限酵素Eco R IとHind IIIで切断する
と、約9.5kbのDNA挿入断片が認められた。
ERM P−9941）から分離した組換え体プラスミドをpISY1
0と名付けた。この組換え体プラスミドは約12.2kbの大
きさであり、制限酵素Eco R IとHind IIIで切断する
と、約9.5kbのDNA挿入断片が認められた。
エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）MT−10472（F
ERM P−9942）から分離した組換え体プラスミドをpISY2
1と名付けた。この組換え体プラスミドは約7.3kbの大き
さであり、制限酵素Eco R IとHind IIIで切断すると、
約4.6kbのDNA挿入断片が認められた。
ERM P−9942）から分離した組換え体プラスミドをpISY2
1と名付けた。この組換え体プラスミドは約7.3kbの大き
さであり、制限酵素Eco R IとHind IIIで切断すると、
約4.6kbのDNA挿入断片が認められた。
pISY10とpISY21の制限酵素切断地図を第１図と第２図に
示した。第１図と第２図より、pISY21に挿入されている
DNA断片はpISY10に挿入されているのDNA断片の一部であ
ることがわかる。
示した。第１図と第２図より、pISY21に挿入されている
DNA断片はpISY10に挿入されているのDNA断片の一部であ
ることがわかる。
次にpISY10とpISY21に挿入されているDNA断片が、バチ
ルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearotherm
ophilus）のDNA断片であることを次のように、サザン法
（Southern transfer）により確認した。
ルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearotherm
ophilus）のDNA断片であることを次のように、サザン法
（Southern transfer）により確認した。
サザン法は、常法（Maniatis,T.et al.（1982）Molecul
ar Cloning,Cold Spring Harbor Lab.）に従った。
ar Cloning,Cold Spring Harbor Lab.）に従った。
バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearot
hermophilus）IFO 13737の染色体DNAを（ａ）と同様に
調整した。
hermophilus）IFO 13737の染色体DNAを（ａ）と同様に
調整した。
また、組換え体プラスミドpISY10およびpISY21を（ｅ）
と同様に調整した。
と同様に調整した。
染色体DNAを制限酵素Eco R Iで切断し、アガロース電気
泳動したのち、ニトロセルロースフィルターに移行させ
た。
泳動したのち、ニトロセルロースフィルターに移行させ
た。
組換え体プラスミドpISY10およびpISY21は、Eco R IとH
ind IIIでダブルダイジェスチョンしたのち、挿入DNA断
片のみを回収し、32Pでラベルした。
ind IIIでダブルダイジェスチョンしたのち、挿入DNA断
片のみを回収し、32Pでラベルした。
32PでラベルしたDNAをプローブとし、ニトロセルロース
フィルター上の染色体DNAとのハイブリダイゼーション
を行った。
フィルター上の染色体DNAとのハイブリダイゼーション
を行った。
オートラジオグラフィーを行ったところ、染色体DNAに
は、pISY10およびpISY21由来の何れのプローブに対して
も反応する断片が存在した。
は、pISY10およびpISY21由来の何れのプローブに対して
も反応する断片が存在した。
すなわち、pISY10とpISY21に挿入されているDNA断片
が、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus ste
arothermophilus）の染色体DNA断片であることが確認さ
れた。
が、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus ste
arothermophilus）の染色体DNA断片であることが確認さ
れた。
（ｇ）形質転換の再現性の確認 （ｅ）で分離した組換え体プラスミドpISY10およびpISY
21によりトリプトファンシンターゼ生産能の欠如したト
リプトファン要求性大腸菌変異株であるE.coli K12 W31
10 MT−10347（FERM P−9940）を（ｄ）と同様に形質転
換し、それぞれ100mg/のアンピシリンを含むＬ培地寒
天平板に塗布した。生じたコロニーからそれぞれ20個を
選び、トリプトファンの要求性を調べたところ、いずれ
もトリプトファンの要求性が、消失しており、pISY10お
よびpISY21上にトリプトファンシンターゼの遺伝子を担
うDNAが存在することが確認された。
21によりトリプトファンシンターゼ生産能の欠如したト
リプトファン要求性大腸菌変異株であるE.coli K12 W31
10 MT−10347（FERM P−9940）を（ｄ）と同様に形質転
換し、それぞれ100mg/のアンピシリンを含むＬ培地寒
天平板に塗布した。生じたコロニーからそれぞれ20個を
選び、トリプトファンの要求性を調べたところ、いずれ
もトリプトファンの要求性が、消失しており、pISY10お
よびpISY21上にトリプトファンシンターゼの遺伝子を担
うDNAが存在することが確認された。
（ｈ）サブクローニングとDNA断片の解析 pISY21に挿入されているバチルス・ステアロサーモフィ
ラス（Bacillus stearothermophilus）の染色体DNA由来
の断片は、約4.6kbであり、その詳細な制限酵素切断地
図を第３図に示した。pISY21の挿入DNA断片からその一
部が欠如した種々のDNA断片を調製し、それぞれリガー
ゼにより発現ベクターpKK223−３（ファルマシア社製）
のtacプロモーターの下流のポリリンカー部に挿入し
た。
ラス（Bacillus stearothermophilus）の染色体DNA由来
の断片は、約4.6kbであり、その詳細な制限酵素切断地
図を第３図に示した。pISY21の挿入DNA断片からその一
部が欠如した種々のDNA断片を調製し、それぞれリガー
ゼにより発現ベクターpKK223−３（ファルマシア社製）
のtacプロモーターの下流のポリリンカー部に挿入し
た。
これらの組換え体プラスミドにより、トリプトファン要
求変異株である、エシェリヒア・コリ（Escherichia co
li）MT−10347（trpAB−）、エシェリヒア・コリ（Esch
erichia coli）ATCC−23717（trpA−）、エシェリヒア
・コリ（Escherichia coli）ATCC−23718（trpB−）を
それぞれ形質転換した。これらの形質転換株のトリプト
ファン要求性が消失するか否かを調べることにより、tr
pAおよびtrpB遺伝子のおおよその位置を決定し第３図に
示した。pISY21の挿入DNA断片の中でtrpAおよびtrpB遺
伝子が含まれると思われるのがEcoR I−Hind III断片約
2.5kbである。この断片をpKK223−３のポリリンカー部
をSma I−Hind IIIで切断したものに挿入した組換え体
プラスミドがpISY73である。pISY73の制限酵素地図を第
４図に示した。
求変異株である、エシェリヒア・コリ（Escherichia co
li）MT−10347（trpAB−）、エシェリヒア・コリ（Esch
erichia coli）ATCC−23717（trpA−）、エシェリヒア
・コリ（Escherichia coli）ATCC−23718（trpB−）を
それぞれ形質転換した。これらの形質転換株のトリプト
ファン要求性が消失するか否かを調べることにより、tr
pAおよびtrpB遺伝子のおおよその位置を決定し第３図に
示した。pISY21の挿入DNA断片の中でtrpAおよびtrpB遺
伝子が含まれると思われるのがEcoR I−Hind III断片約
2.5kbである。この断片をpKK223−３のポリリンカー部
をSma I−Hind IIIで切断したものに挿入した組換え体
プラスミドがpISY73である。pISY73の制限酵素地図を第
４図に示した。
pISY73を保持する大腸菌として次の株が微生物工業技術
研究所に寄託されている。
研究所に寄託されている。
エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）MT−10474（M
T−10347/pISY73）（FERM P−10275）pISY73のEcoR V−
Hind III挿入DNA断片約2.5kbについて、第５図に示した
方針によりM13mp系のベクター（Messing,J.（1983）Met
hods in Enzymology,Vol.101,p.20〜78）を用いるジデ
オキシ法（Sager,F.et al.（1977）Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,Vol.74,p.5463〜5467）と第６図に示した方針に
よりマクサム・ギルバート法（Maxam,A.M.and Gilbert,
W.（1980）Methods in Enzymology,Vol.65,p.499−56
0）でDNA塩基配列を決定した。
T−10347/pISY73）（FERM P−10275）pISY73のEcoR V−
Hind III挿入DNA断片約2.5kbについて、第５図に示した
方針によりM13mp系のベクター（Messing,J.（1983）Met
hods in Enzymology,Vol.101,p.20〜78）を用いるジデ
オキシ法（Sager,F.et al.（1977）Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,Vol.74,p.5463〜5467）と第６図に示した方針に
よりマクサム・ギルバート法（Maxam,A.M.and Gilbert,
W.（1980）Methods in Enzymology,Vol.65,p.499−56
0）でDNA塩基配列を決定した。
その結果第７図に示したDNA塩基配列が得られた。この
塩基配列中には、179番目と1374番目の塩基から始ま
り、それぞれtrpBとtrpAに相当する２つのオープンリー
ディングフレームが確認された。２つのオープンリーデ
ィングフレームは17bpを共有していた。第８図に、trpB
のアミノ酸配列を、第９図にtrpAのアミノ酸配列を示し
た。
塩基配列中には、179番目と1374番目の塩基から始ま
り、それぞれtrpBとtrpAに相当する２つのオープンリー
ディングフレームが確認された。２つのオープンリーデ
ィングフレームは17bpを共有していた。第８図に、trpB
のアミノ酸配列を、第９図にtrpAのアミノ酸配列を示し
た。
（ｉ）トリプトファンシンターゼの製造 エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）MT−10471（F
ERM P−9941）、エシェリヒア・コリ（Escherichia col
i）MT−10472（FERM P−9942）およびエシェリヒア・コ
リ（Escherichia coli）MT−10474（FERM P−10275）、
を100mg/のアンピシリン、25mg/のイソプロピル−
β−チオガラクトシド、10g/のカザミノ酸を添加した
VogelとBonnerの培地（MgSO4・7H2O:0.2g/、Citric a
cid・H2O:2g/、K2HPO4:10g/、NaNH4PO4・4H2O:3.5g
/、Glucose:4g/）50mlにそれぞれ植菌し、37℃で24
時間振とう培養した後、遠心分離により集菌した。
ERM P−9941）、エシェリヒア・コリ（Escherichia col
i）MT−10472（FERM P−9942）およびエシェリヒア・コ
リ（Escherichia coli）MT−10474（FERM P−10275）、
を100mg/のアンピシリン、25mg/のイソプロピル−
β−チオガラクトシド、10g/のカザミノ酸を添加した
VogelとBonnerの培地（MgSO4・7H2O:0.2g/、Citric a
cid・H2O:2g/、K2HPO4:10g/、NaNH4PO4・4H2O:3.5g
/、Glucose:4g/）50mlにそれぞれ植菌し、37℃で24
時間振とう培養した後、遠心分離により集菌した。
この菌体を洗浄後、0.1mMのピリドキサールリン酸を含
む100mM Tris−HCl緩衝液（pH 7.8）10mlに懸濁した。
超音波処理により無細胞抽出液を調製し、Yanofskyらの
方法（Yanofsky,C.et al.（1962）Methods in Enzymolo
gy, Vol.5,p.794〜806）によりトリプトファンシンター
ゼ活性を測定した。
む100mM Tris−HCl緩衝液（pH 7.8）10mlに懸濁した。
超音波処理により無細胞抽出液を調製し、Yanofskyらの
方法（Yanofsky,C.et al.（1962）Methods in Enzymolo
gy, Vol.5,p.794〜806）によりトリプトファンシンター
ゼ活性を測定した。
比較のため、宿主として用いたE.coli K12 W3110 MT−1
0347を、同じ培地（ただし、トリプトファンを20mg/
添加）で培養して、そのトリプトファンシンターゼ活性
を同様に測定した。
0347を、同じ培地（ただし、トリプトファンを20mg/
添加）で培養して、そのトリプトファンシンターゼ活性
を同様に測定した。
各菌株のトリプトファンシンターゼ活性を第１表に示し
た。なお、トリプトファンシンターゼ活性の1 unitは、
37℃で20分間反応させた際に0.1μmolのトリプトファン
を生成する酵素量である。
た。なお、トリプトファンシンターゼ活性の1 unitは、
37℃で20分間反応させた際に0.1μmolのトリプトファン
を生成する酵素量である。
また、MT−10474の無細胞抽出液を65℃、10分間熱処理
した後、トリプトファンシンターゼ活性を測定したとこ
ろ、約90％の酵素活性が残存していた。
した後、トリプトファンシンターゼ活性を測定したとこ
ろ、約90％の酵素活性が残存していた。
本発明によれば耐熱性トリプトファンシンターゼの生産
に有用な耐熱性トリプトファンシンターゼをコードする
遺伝子、組換え体プラスミド、それにより形質転換され
た大腸菌およびこの大腸菌を用いるトリプトファンシン
ターゼの製造法が提供される。
に有用な耐熱性トリプトファンシンターゼをコードする
遺伝子、組換え体プラスミド、それにより形質転換され
た大腸菌およびこの大腸菌を用いるトリプトファンシン
ターゼの製造法が提供される。
第１図は、組換え体プラスミドpISY10の制限酵素切断地
図を示した。第２図は、組換え体プラスミドpISY21の制
限酵素切断地図を示した。第３図は、pISY21に挿入され
ているバチルス・ステアロサーモフィラスの染色体DNA
由来の約4.6kb断片の制限酵素切断地図とtrpAおよびtrp
B遺伝子のおおよその位置を示した。第４図は、組換え
体プラスミドpISY73の制限酵素切断地図を示した。第５
図は、ジデオキシ法によるDNA塩基配列決定の方針を示
した。第６図は、マクサム・ギルバート法によるDNA塩
基配列決定の方針を示した。第７図は、Hind III−EcoR
V断片約2.5kbについて、DNA塩基配列を示した。第８図
は、trpBのアミノ酸配列を示した。第９図は、trpAのア
ミノ酸配列を示した。
図を示した。第２図は、組換え体プラスミドpISY21の制
限酵素切断地図を示した。第３図は、pISY21に挿入され
ているバチルス・ステアロサーモフィラスの染色体DNA
由来の約4.6kb断片の制限酵素切断地図とtrpAおよびtrp
B遺伝子のおおよその位置を示した。第４図は、組換え
体プラスミドpISY73の制限酵素切断地図を示した。第５
図は、ジデオキシ法によるDNA塩基配列決定の方針を示
した。第６図は、マクサム・ギルバート法によるDNA塩
基配列決定の方針を示した。第７図は、Hind III−EcoR
V断片約2.5kbについて、DNA塩基配列を示した。第８図
は、trpBのアミノ酸配列を示した。第９図は、trpAのア
ミノ酸配列を示した。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:07）
Claims (14)
- 【請求項１】次のDNA塩基配列で表されるトリプトファ
ンシンターゼ遺伝子。 ATGGAACGCG TTCCGAATGA ACATGGGCGA TTTGGCGATT TCGGCGGCAA GTTTGTCCCG GAGACGCTCA TGCTTCCGCT TGAGGAAATC GAAGCCGAGC TTGACAAAGC GCTGGCGGAC GAATCGTTCA AACAAGAATA TATCCGCATT TTGCAGCACT ACTCCGGTCG GCCGACTCCG CTCACGTTCG CGCCGAATTT GACACGGCAG CTTGGTGGCG CGAAAATGTA TTTAAAGCGC GAAGATTTAA ACCATACCGG CGCCCATAAA ATCAACAATG CCATCGGCCA GGCGCTTTTG GCGAAACGGA TGGGCAAGAA AAAGCTGATC GCGGAAACCG GCGCCGGCCA ACATGGGGTG GCGGCCGCGA CCGTGGCGGC CCATTTCGGG ATGGACTGCA TCGTCTTTAT GGGAGAGGAA GACATCAAGC GGCAAGAGTT GAACGTATTT CGCATGAAGC TGCTTGGCGC GGAAGTGGTG CCGGTCTCAA GCGGCAACCG GACGTTGAAA GACGCGACAA ACGAGGCGAT TCGCTATTGG GTCGCCCATT GCGACGACCA TTTTTACATG ATCGGCTCGG TGGTCGGCCC GCACCCGTAC CCGAAAATGG TGCGCGAGTT TCAACGCATC ATTGGCGATG AGGCGAAAGA GCAGTTTCTC GCCTGCGAAG GGAAGCTGCC CGATGTCATC GTCGCCTGCG TTGGCGGCGG CAGCAACGCC ATCGGCATGT TTTACCCGTT TTTGCAAGAT GACGTCCGCC TTGTCGGGGT GGAAGCCGCC GGCAAAGGCA TTGACACCCC TTACCATGCC GCGACGATCA CGAAAGGGAC GAAAGGGGTC ATCCACGGGG CGATGACGTA CTTGCTGCAG GATGAGTACG GGCAAATTGT CGAGCCGTAC TCGATCTCAG CCGGCCTCGA TTACCCCGGC GTCGGTCCGG AGCATGCCTA TTTAGCGAGC ATCGGCCGCG TCCGCTACGA AAGCGTGACC GACGAGGAAG CGGTCGCGGC GTTTCGGCTG CTGGCGCAAA CAGAAGGCAT CATTCCGGCG ATTGAGTCGG CCCATGCGGT GGCGAAAGCC GTGGAGCTCG CCCAATCGAT GTCGCCGGAT GAAACGGTGC TCATTTGCCT GTCCGGCCGC GGCGATAAAG ACGTGCAAAC GATGATGCGC CATCTTGGCG CGAAAGAAGG TGAAGATGTT GCTGCTATCC GTTAATCCGC CGCTGTTTAT TCCCTTTATT GTCGCCGGCG ACCCGTCGCC TGAGGTGACG GTGGATTTGG CCTTGGCGCT TGAGGAGGCC GGCGCCGATC TATTGGAGCT TGGCGTGCCG TACTCCGACC CGCTCGCCGA CGGACCGACG ATCCAGCGCG CCGCCGCCCG GGCGCTTGCC GGGAACATGA CGTTGCCGAA AGCCATTCAT CTCGTCGCCG AAATGCGAAA AAAGGGGGTA ACCATTCCGA TTATTCTCTT TACGTATTAC AATCCTGTGT TACAATTAGG AGAAGAATCC TTTTTTGCTT TAGCGCGGGA AAATGGCGCC AACGGCGTGC TCATTCCCGA TTTGCCGTTT GAAGAAAGCG GTCCGCTCCG CGAACTGGGC GAGCGGTTTG ACCTTCCGCT CATTTCGCTC GTCGCGCCGA CGTCAAAGCA GCGGATTGAG CGGATCGCTT CGGTAGCGCA AGGGTTTTTG TATTGCGTTT CCTCGCTTGG CGTCACCGGT ATGCGCGAAA CGTTGCCGGA GTCGCTTGGC GATTTTGTCA GTGAAGTCAA GCGGCATAGC CGTGTGCCGG TCGCTGTCGG GTTCGGCATC TCCACGCCCG AACAAGTGGC GATGCTGAAA GAGGTGTGCG ATGGCGTCGT CATCGGCAGC GCCCTTGTGC AAAAAGTGGA ACAGTTGGGG GAACGGCTGC TGGCGCCGGA AGAAAAAGAA GCGGCCATCG CCGAGTTTGC CGCCTACGCC CGCTCGCTCG CCGCGCCGCT TCACGCGCCG TGTTCTTTGC GC - 【請求項２】次のアミノ酸配列で表されるトリプトファ
ンシンターゼＢ蛋白をコードする遺伝子。 MERVPNEHGR FGDFGGKFVP ETLMLPLEEI EAELDKALAD ESFKQEYIRI LQHYSGRPTP LTFAPNLTRQ LGGAKMYLKR EDLNHTGAHK INNAIGQALL AKRMGKKKLI AETGAGQHGV AAATVAAHFG MDCIVFMGEE DIKRQELNVF RMKLLGAEVV PVSSGNRTLK DATNEAIRYW VAHCDDHFYM IGSVVGPHPY PKMVREFQRI IGDEAKEQFL ACEGKLPDVI VACVGGGSNA IGMFYPFLQD DVRLVGVEAA GKGIDTPYHA ATITKGTKGV IHGAMTYLLQ DEYGQIVEPY SISAGLDYPG VGPEHAYLAS IGRVRYESVT DEEAVAAFRL LAQTEGIIPA IESAHAVAKA VELAQSMSPD ETVLICLSGR GDKDVQTMMR HLGAKEGEDV AAIR（ただし、Ａ アラニン、Ｃ システイン、Ｄ ア
スパラギン酸、Ｅ グルタミン酸、Ｆ フェニルアラニ
ン、Ｇ グリシン、Ｈ ヒスチジン、Ｉ イソロイシ
ン、Ｋ リジン、Ｌ ロイシン、Ｍ メチオニン、Ｎ
アスパラギン、Ｐ プロリン、Ｑ グルタミン、Ｒ ア
ルギニン、Ｓ セリン、Ｔ スレオニン、Ｖ バリン、
Ｗ トリプトファン、Ｙ チロシンを示す。） - 【請求項３】次のアミノ酸配列で表されるトリプトファ
ンシンターゼＡ蛋白をコードする遺伝子。 MLLLSVNPPL FIPFIVAGDP SPEVTVDLAL ALEEAGADLL ELGVPYSDPL ADGPTIQRAA ARALAGNMTL PKAIHLVAEM RKKGVTIPII LFTYYNPVLQ LGEESFFALA RENGANGVLI PDLPFEESGP LRELGERFDL PLISLVATPS KQRIERIASV AQGFLYCVSS LGVTGMRETL PESLGDFVSE VKRHSRVPVA VGFGISTPEQ VAMLKEVCDG VVIGSALVQK VEQLGERLLA PEEKEAAIAE FAAYARSLAA PLHAPCSLR （ただし、Ａ アラニン、Ｃ システイン、Ｄ アスパ
ラギン酸、Ｅ グルタミン酸、Ｆ フェニルアラニン、
Ｇ グリシン、Ｈ ヒスチジン、Ｉ イソロイシン、Ｋ
リジン、Ｌ ロイシン、Ｍ メチオニン、Ｎ アスパ
ラギン、Ｐ プロリン、Ｑ グルタミン、Ｒ アルギニ
ン、Ｓ セリン、Ｔ スレオニン、Ｖ バリン、Ｗ ト
リプトファン、Ｙ チロシンを示す。） - 【請求項４】請求項第１項、第２項または第３項記載の
遺伝子を担うDNAをプラスミドベクターに連結した組換
え体プラスミド。 - 【請求項５】請求項第１項、第２項または第３項記載の
遺伝子を担うDNAをプロモーターの下流に連結した請求
項第４項記載の組換え体プラスミド。 - 【請求項６】バチルス・ステアロサーモフィラス（Baci
llus stearothermophilus）由来のトリプトファンシン
ターゼの遺伝子を担うDNAをプラスミドベクターに連結
した組換え体プラスミド。 - 【請求項７】新規な組換え体プラスミドであるpISY10。
- 【請求項８】新規な組換え体プラスミドであるpISY21。
- 【請求項９】新規な組換え体プラスミドであるpISY73。
- 【請求項１０】請求項第４項から第９項記載の何れかの
組換え体プラスミドで形質転換された大腸菌。 - 【請求項１１】新規な大腸菌であるMT−10471。
- 【請求項１２】新規な大腸菌であるMT−10472。
- 【請求項１３】新規な大腸菌であるMT−10474。
- 【請求項１４】請求項第10項から第13項記載の何れかの
大腸菌を培養し、培養物中にトリプトファンシンターゼ
を生成させることを特徴とするトリプトファンシンター
ゼの製造法。
Priority Applications (6)
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| JP63286728A JPH0722510B2 (ja) | 1988-05-09 | 1988-11-15 | 耐熱性トリプトファンシンターゼをコードする遺伝子とその利用 |
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| BR898902160A BR8902160A (pt) | 1988-05-09 | 1989-05-09 | Gene clonado,fragmento de dna,plasmidio recombinante,escherichia coli e processo de produzir sintase de triptofano |
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| AU34587/89A AU610395B2 (en) | 1988-05-09 | 1989-05-09 | Cloned tryptophan synthase gene and recombinant plasmid containing the same |
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-
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