KR900004427B1 - L-페닐알라닌의 제조방법 - Google Patents

L-페닐알라닌의 제조방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

L-페닐알라닌의 제조방법
제 1 도는 pEaroG-pheA1의 제한효소 절단지도로서 플라스미드를 구축하는 단계를 설명하며, 유전자는화살표 방향으로 전사된다.
제 2 도 및 제 3 도는 각각 pCDS-CM1 및 pCDCP1의 제한효소.절단지도로서각각의 플라스미드를 구축하는 단계를 설명한다.
Figure kpo00001
로 나타낸 염색체 DNA 단편은 DS 유전자를 포함하고,
Figure kpo00002
로 나타낸 단편은 CM유전자를 포함하고 ;
Figure kpo00003
로 나타낸 단편은 PD 유전자를 포함한다. 플라스미드의 크기는 kb로 표현한다.
코리네박테리움 또는 브레비박테리움속에 속하는 미생물을 이용하는 발효법에 의해 L-페닐알라닌을 제조하는데 있어서, 아이노산-요구변이 및/또는 아미노산 유사체-내성변이를 일으킨 변이주가 이용되어 왔다.[J.Agric.Chem.Soc.,50(l).p.R.79(l976)].
한편, L-페닐알라닌-생산균주는 재조합 DNA 기술에 의해 구축되어 왔다. 예를들면,　3-데옥시-D-아라비노-헵투로소네이트-7-포스페이트 신타제(이후에는 DS로 표기한다)를 코딩하는 유전자, 또는 코리스메이트 뮤타제(이후에는 CM으로 표기한다)룰 코딩하는 유전자 및 프레페네이트 데히드라타제(이후에는PD로 표기한다)를 코딩하는 유전자(이후에는 이 유전자들을 각각 DS 유전자, CM 유전자 및 PD 유전자로 표기한다)를 함유하는 재조합 DNA를 포함하는 L-페닐알라닌-생산균주가 알려져 있다.[일본국 특허 공개 제 24l92/85호(유럽공고 제 136359호), 일본국 특허 공개 제 260892/86호 및 일본국 특허 공개 제 124375/86호.]
최근에, L-페닐알라닌에 대한 요구의 증가에 따라 그의 공업제조를 위한 개선된 공정이 요구되고 있다.　재조합 DNA 기술에 의해 더 높은 L-페닐알라닌 생산성을 갖는 새로운 균주를 구축하기 위하여 예의 연구한 결과, 본 발명자들은 CD,CM 및 PD 합성에 필요한 모든 유전정보를 갖고 있는 재조합 DNA를 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속에 속하는 미생물에 도입시킴으로써 L-페닐알라닌 생산성을 개선할 수있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다. 재조합 DNA를 갖는 L-페닐알라닌-생산균주로는 DS 유전자(일본국 특허공개 제 l24375/1986호), 또는 CM 및 PD 유전자[일본국 특허공개 제 24192/85호 (유럽공고 제136359호) 및 일본국 특허공개 제 260892/86호]를 포함하는 재조합 DNA를 갖는 것들이 알려져 있지만,　DS,CM 및 PD 유전자를 모두 포함하는 재조합 DNA를 갖는것은 알려져 있지 않다. 본 발명자들은 먼저 세가지 유전자의 증폭에 의해 L-페닐알라닌의 생산성을 상당히 증가시킬수 있음을 발견하였다.
본 발명은, DS,CM 및 PD 합성에 필요한 모든 유전정보를 갖는 DNA 단편을 포함하는 재조합 DNA를 코리내박테리움 또는 브레비박테리움속에 속하는 미생물에 도입시키고 : 회수 가능한 양의 L-페닐알라닌이 배양 브로쓰에 축적될 때까지 형질 전환체를 배지에서 배양하고 : L-페닐알라닌을 회수함을 특징으로하는 L-페닐알라닌.의 제조방법에　관한 것이다. 따라서, 본 발명은 생명산업의 분야 보다 상세히 설명하면 의약품 및 식품에서 유용한 L-페닐알라닌의 제조분야에 속한다.
본 발명은, DS,CM 및 PD 합성에 필요한 모든 유전정보를 갖는 DNA 단편을 포함하는 재조합 DNA를 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속에 속하는 미생물에 도입시키고, 회수가능한 양의 L-페닐알라닌이배양브로쓰에 축적될때까지 형질 전환체를 배지에서 배양하고, L-페닐알라닌을 회수함을 특징으로 하는 L-페닐알라닌의 제조방법을 제공한다. 본 발명에서 이용되는 DNA 단편으로는, 에스케리키아, 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속에 속하는 미생물로부터 분리된 것들을 언급할 수 있다.
페닐알라닌 합성능력을 갖고 있는한 모든 미생물을 DS,CM 및 PD를 코딩하는 각 유전자의 원(源)으로사용할 수 있다. 특히, 원핵생물　예를들면, 에스케리키아, 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속에 속하는 세균으로부터 분리된 DS,CM 및 PD 유전자가 바람직하며, 이들 세균으로부터 유도된 방향족 아미노산-생산 변이주로부터 분리된 유전자가 가장 바람직하다.
코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속에 속하는 글루탐산-생산 코리네형 세균 모두를 숙주 미생물로 이용할 수 있다. 하기 균주는 숙주 미생물의 실례이다 :
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032
코리네박테리움 아세토아시도필름 ATCC 13870
코리네박테리움 헤르쿨리스 ATCC 13868
코리네박테리움 릴룸 ATCC 15990
브레비박테리움 디바리카툼 ATCC 14020
브레비박테리움 플라붐 ATCC 14067
브레비박테리움 임마리오필름 ATCC 14068
브레비박테리움 락토페르멘툼 ATCC l3869
브레비박테리움 티오게니탈리스 ATCC 19240
무엇보다도, 상술한 미생물로부터 변이에 의해 유도된 L-페닐알라닌, L-트립토판 또는 L-티로신-생산균주를 바람직하게 사용할 수 있다. 이들 변이체는 아미노산 요구-변이 및/또는 아미노산유사체-내성변이를 일으키는 균주를 선택함으로써 얻을 수 있다[J.Agric.Chem.Soc.,5０（1),p.R.79(l976)].
L-트립토판-또는 L-티로신 생산미생물을 숙주 미생물로 사용하는 경우에는, L-트립토판 또는 L-티로신 생산이 L-페닐알라닌 생산으로 전환되기 때문에 상당량의 L-페닐알라닌을 생산하는 능력을 가진 균주를 얻을 수 있다. 본 발명의 재조합 DNA를 L-트립토판-또는 L-티로신-생산미생물에 도입시킴으로써 상당량의 L-페닐알라닌을 생산할 수 있다는 것이 처음으로 발견되었다.
DNA의 취입에 이용되는 벡터는 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속에 속하는 미생물내에서 자기 복제할 수 있는 것에만 한정된다. 특히 적절한 플라스미드는 pCGl(일본국 특허공개 제 134500/82호, 유럽특허 제 58889호,미합중국 특허 제 46l7267호), pCG2(일본국 특허공개 제 35197/83호, 유럽특허 제 73062호, 미합중국 특허 제 4489160호), pCG4 및 pCGll(일본국 특허공개 제 183799/82호,유럽특허 제 63763호, 미합중국 특허 제 4500640호), pCE54 및 pCB0l(일본국 특허공개 제 l05999/83호, 유럽공고 제 82485호), pCE51(일본국 특허공개 제 341９7/85호, 유럽공고 제 136359호), pCE52 및 pCE53[Mol.Gen.Genet.,196,l75(1984) ] 등이 다.
DS 유전자를 포함하는 공여체 DNA 및 벡터 DNA를 포함하는 재조합 DNA는 공지의 방법에 따라, 예를들면, 시험관 내에서 제한효소를 이용하여 염색체 DNA와 벡터플라스미드를 소화시킨후에 DNA 리가제로 처리하거나, 또는 제한효소로 염색체 DNA와 벡터플라스미드를 소화시킨후에 절단된 말단을 말단트렌스퍼라제, DNA 폴리머라제로 처리하고 DNA 리가제로 계속 처리함으로써 각종 재조합체의 혼합물과 함께　얻을 수 있다.[Methods in Enzymology,68(1979)]
DS 유전자를 함유하는 재조합 DNA는, 문헌[일본국 특허공개 제 l86492/82호(유럽공고 제 63764호) 및　일본국 특허공개 제 186489/82호(유럽공고 제 64680)]에 기술된 대로 원형질체를 이용하는 방법에 따라 상기 재조합 혼합물로 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속에 속하는 DS-결핍 변이주를 형질전환시키고,결핍 성상이 보충된 형질전환체를 선택하고 형질전환체로부터 플라스미드 분리함으로써 얻을 수 있다.
비슷하게, CM 유전자 또는 PD 유전자를 함유하는 공여체 DNA 및 벡터　DNA를 포함하는 재조합 DNA를 얻을 수 있다.　(일본국 특허공개 제 24192/85호, 유럽공고 제 l36359호). 즉, 염색체 DNA와 벡터DNA의 재조합체 혼합물로 코리네박테리움 또는 브레비박테리움속의 폐닐알라닌-및 티로신-요구(CM 유전자의 결핍에 기인)변이주 또는 페닐알라닌-요구(PD 유전자의 결핍에 기인)변이주를 형질전환시키고, 페닐알라닌- 및 티로신-비-요구 형질전환체 또는 페닐알라닌-비-요구 형질전환체 선택한 후에 CM 유전자 또는 PD 유전자를 함유하는 재조합 DNA를 분리함으로써 얻을 수 있다.
코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속의 형질전환체로부터 목적 재조합 DNA를 직접 얻는　대신에, 유전자 재조합 기술이 이미 확립해 놓은 에스케리키아콜리같은 숙주-벡터게를 이용하여 목적 재조합 DNA를얻을 수 있다. 즉, DS 유전자, CM 유전자 또는 PD 유전자가 결핍된 에스케리키아콜리 변이체를 시험관내에서, 공여체 DNA 및 벡터 DNA의 결찰 혼합물로 형질전환시키고, 결핍 성상이 보충된 형질전환체를 선택한다. 형질전환체로부터 분리한 클로닝된 DNA 와 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속의 미생물 내에서 자기 복제되는 벡터 DNA를 시험관내에서 제한효소로 소화시키고, DNA 리가제로 결찰 반응시킨다.그후에, DS 유전자, CM 유전자 또는 PD 유전자가 결핍된 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속의 변이체를 결찰 반응 혼합물로 형질전환시키고, 결핍 성상이 보충된 형질전환체를 선택한다. 따라서, 이 방법에　의해 목적 재조합 DNA를 얻을 수 있다(일본국 특허공개 제 260892/86호),
이렇게하여 수득한 DS 유전자, CM 유전자 또는 PD 유전자를 포함하는 DNA 단편을 더 재조합하여　DS,CM 및 PD 유전자를 모두 함유하는 재조합 DNA를 얻는다. 재조합 DNA를 숙주 미생물에　도입시킴으로써 세개의 유전자를 증폭시킬 수 있다. 동일한 세포내에서 공존할 수 있는 서로 다른 벡터 플라스미드에　이들 세 유전자가 포함되어 있고, 이들 플라스미드를 한 숙주 미생물에 동시에 도입하있다면, 세 유전자를증폭시킬 수 있다. 두 경우 모두, 증가된 L-페닐알라닌 생산성에 도달할 수 있다.
상술한 단계에서 에스케리키아, 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속의 야생형 균주의 염색체 DNA를공여체 DNA로 사용하는 경우에는, 야생형의 DS,CM 및 PD 유전자를 모두 함유하는 재조합 DNA를 코리내박테리움 또는 브레비박테리움 속에 속하는 미생물에 도입시킨다. 그러나, 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속의 미생물내에서는, DS와 CM이 페닐알라닌 및 티로신에 의해 길항 억제되며, PD가 페닐알라닌에 의해 길항 억제되는것이 알려져 있다．[Agric.Bio1.Chem.,39,351(1975)]. 따라서 코리네박테리움 또는브레비박테리움 속 미생물내에서의 더 높은 L-페닐알라닌 생산성을 확실히 하기 위해서는, 이러한 억제를　받지않는 DS,CM 및 PD를　코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 DNA를 사용하는 것이 바람직하다. 변이체DS,CM 및 PD 유전자는, 그 DS,CM 또는 PD가 길항억제를 받지않는 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속의 변이주의 염색체 DNA를 팻센저(passenger)DNA로 사용한다. 클로닝은 코리네박테리움 또는 브레비박테리움의 변이주에서 DS,CM 또는 PD 결핍을 보충하거나, 또는 야생형 균주를 수용체로 사용하여p-플루오로페닐알라닌(이후에는 PEP로 약칭한다)같은 페닐알라닌 유사체에 내성을 갖는 형질전환체를 선택함으로써 실시할 수 있다. 변이체 DS,CM 및 PD 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드는 야생형 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드의 구축에서와 동일한 방법으로 제조할 수 있다. 한편, 변이체 DS,CM 및PD 유전자를 함유하는 비슷한 재조합 DNA도, 문헌[Mｏｌ.Gen.Genet.１４５，101(1９7９)]에 기재된 방법에 따라 야생형 유전자를 함유하는 재조합　플라스미드의 시험관내 변이생성에 의해 수득하거나, 또는 재조합 플라스미드를 갖는 균주의 생체내 변이생성에 의해 수득할 수 있다.
야생형 또는 변이체 DS,CM 및 PD 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드는 원형질체를 이용하는 상술한　형질전환법에 따라 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속의 미생물에 도입시킬 수 있다.
이들 재조합 플라스미드를 함유하는 균주에 의한 L-페닐 알라닌의 제조는 발효에 의해 아미노산을 제조하는데 이용되는 공지방법에 따라 실시할 수 있다. 즉, 형질전환체를 호기조건하에서 탄소원, 질소원, 무기화합물, 아미노산, 비타민 등을 함유하는 통상의 배지에서 배양함으로써 L-페닐알라닌을 형성시키고 배양브로쓰내에 축적시킬 수 있다. 그후에 L-페닐알라닌을 배양브로쓰에서 회수한다.
탄소원으로는, 글루코스, 글리세롤, 프록토스, 수크로스, 말로스, 만노스, 전분, 전분 가수분해물 , 당밀등의 탄수화물 : 폴리알코올 : 피루브산, 푸마르산, 락트산,·아세트산 등의 각종 유기산을 사용할 수 있다.　덧붙여, 사용되는　미생물의 적응성에 따라 탄화수소, 알코올 등을 사용할 수 있다. 사탕수수 당밀이 바람직하게 이용된다.
질소원으로는 암모니아 : 염화암모늄, 황산암모늄, 탄산암모늄, 암모늄 아세테이트등의 유기 암모늄염,우레아 및 기타 질소-함유 화합물 뿐만 아니라 펩톤, NZ-아민, 육즙, 효모추출액, 옥수수 침지액, 카제인 가수분해물, 생선살 또는 그의 소화제품, 크리살리스 가수분해물 등의 질소-함유 유기화합물을 사용할수있다.
무기 화합물로는, 인산수소이 칼륨, 인산이 수소칼륨, 황산암모늄, 염 화암모늄, 황산마그네 슘, 염 화나트륨,황산제일철, 황산망간, 탄산칼슘 등을 사용할 수 있다. 미생물의 생장에 요구되는 비타민, 아미노산등을 상술한 기타 배지성분에 의해 공급하는 경우에, 이들 특별한 영양소를 따로 배지에 가할 필요는 없다.
배양은 진탕배양, 통기-교반배양 등에의해 호기조건하에서 실시한다. 배양온도는 일반적으로 20∼40℃이다. 배지의 pH를 중성근처로 유지하는 것이 바람직하다. 이러한 조건하에서 1∼5일간 배양하면, 회수할 수있는 만큼의 양의 L-페닐알라닌이 배양브로쓰내에 측적된다. 배양을 완료한 후에, 세포를 배양 브로쓰로부터 제거하고, 공지의 방법, 예를들면, 활성탄처리, 이온교환수지처리에 의해 상층액으로부터 L-페닐알라닌을 회수한다.
따라서, DS,CM 및 PD 유전자를 모두 갖는 재조합 DNA를 포함하는　코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속의 균주를 이용하여 L-페닐알라닌을 고수율로 생산할 수 있다.
본 명세서에는, DS,CM 및 PD 유전자를 모두 함유하는 재조합 DNA를 코리내박테리움 글루타미큼에 도입시켜, L-페닐암라닌의 생산성을 중가시키는 경우가 주어져 있으며, 이러한 목적은 또한 코리네박테리움　글루타미쿰 대신에 다른 글루탐산-생산 토리네형 세균을 이용하여서도 달성할 수 있다.
많은 공통의 미생물학적 특성에도 불구하고, 높은 글루탐산 생산성을 갖는 미생물(소위 글루탐산-생산미생물)은 연구자에 의해 많은 종으로 분류되어 있으며 심지어 코리네박테리움 및 브레비박테리움 속으로나누어져 있는데, 이는 아마도 그의 산업적 중요성 때문인 것 같다. 그러나, 이들 미생물은 세포벽의 아미노산과 DNA의 염기조성이 서로 동일하다는 점에서 한가지 종으로 분류되어야만 한다는 것이 지적되었다.　덧붙여, 이들 미생물이 DNA-DNA 하이브리드 형성에서 70∼80% 이상의 상등성을 갖는 것으로 보고되었는데, 이는 이들 미생물이 매우 밀접하게 관련되어 있음을 시사한다[참고. Komatsu,Y. : Report of theFermentative Research Institute, No.55,l(1９80),Suzuki,K.,Kaneko,T.,＆ Komagata,K. : Int.J.Syst. Bacteriol.,31,131(1981) ] .
글루탐산-생산 미생물의 이러한 매우 밀접한 관련성을 생각해 볼때, 본 발명이 모든 글루탐산-생산 미생물에 적용될 수 있음을 쉽게 추정할 수 있다.　본 발명의 효과는 제조합 DNA가 글루탐산-생산 미생물내에서 자기 복제할 수 있는가, DS,CM 및 PD 유전자가 형질발현 되는가의 여부에 따라 결정되기 때문에,글루탐산-생산 코리네형 세균사이의 이러한 상등성의 미미한 차이는 무시할 수 있다. 글루탐산-생산 미생물이 플라스미드가 복제되고 유전자가 형질발현되게 하는 공통의 특성을 갖는다는 것은, 코리네박테리움 글루타미쿰 225-250(일본국 특허공개 제 183799/82호, 유럽공고 제 63763호, 미합중국 특허 제 4500640호)으로부터 분리되고, 스펙티노마이신 및/또는 스트렙토마이신 내성 유전자를 갖는 플라스미드 pCG4가 일반적으로 복제될 수 있고 유전자가 코리네박테리움 및 브레비박테리움 속의 균주같은 글루탐산-생산 코리네형　세균내에서 형질 발현될 수 있다는 점에서 드러난다(일본국　특허공개 제 186492/82호, 유럽공고 제 63764호).
본 발명의 DS,CM 및 PD 유전자가 모두 포함하는 재조합 DNA를 도입시킴으로써 L-페닐알라닌-생사미생물을 구축하는 방법을 적용할 수 있는 종에는 코리네박테리움 글루타큼 뿐만 아니라, 코리네박테리움및 브레비박테리움 속의 세균을 포함하여 모든 글루탐산-생산코리네형 세균이 포함된다.
본 발명의 특별한 구현에는 다음의 실시예 및 참고예에서 보다 상세히 설명된다. [실시예 1]
에스케리키아 콜리 K-12의 DS,CM 및 PD 유전자를 모두 함유하는 재조합 플라스미드를 갖는 균주에의한 페닐알라닌의 제조
(1) 에스케리키아콜리 JA194의 염색체 DNA, 플라스미드 pPHEA1 및 벡터 pBR322 및 pCE5l의 제조 : 에스케리키아콜리 K-l2[Proc.Natl.Acad.Sci.,94,487∼491(1977)]로부터 유도되는 에스케리키아콜리-JAl94의 염색체 DNA를 다음과같은 방법으로 제조한다 :
처음에, 20ml의 종 배양물을 400ml의 L-브로쓰배지(10g의 박토-트립톤, 5g의 박토-효모추출액 및 1ℓ의 물에 용해시킨 5g의 NaCl을　함유하는 배지, pH7.０으로 조절, 이후에는 LB배지로 표기)에 접종시키고,37℃에서 진탕하여 배양시킨다. 후 로그기까지 생장한 세포를 배양 브로쓰로 부터 수집하고, 수집된 세포로부터 사이또-미우라의 방법.[Biochem.Biophys.Acta.72,61９(1９63)]에 따라 고분자량 염색체 DNA를 분리한다.　플라스미드 pPHEA1은 일본국 특허공개 제 2608９2/86의 방법에 따라, 에스케리키아콜리의 CM 및 PD를　코딩하는 pheA 유전자를 함유하는 EcoRI-BamHI-절단 DNA 단편을 에스케리키아콜리의 플라스미드 pBR322의 EcoRI-BamHI-절단부위에 삽입함으로써 구축된 플라스미드이다(이 것의 제조방법은 참고예에나타나 있다).
벡터로 사용되는 pCE51(일본국 특허공개 제 34197/85호, 유럽공고 제 136359호)은 코리네박테리움 글루타미쿰(일본국 특허공개 제 l34500/82호, 유럽특허 제 58889호, 미합중국 특허 제 4617267호)에서 자기 복제될 수 있는 플라스미드 PCGl을 에스케리키아콜리[J.Bacterio1.,140,400(1979)]내에서 자기 복제될 수 있는 플라스미드 pGA22와 결합시켜 구축한 플라스미드이다.
각각의 플라스미드를 함유하는 에스케리키아콜리 JA194의 배양세포로부터 다음과 같은 방법으로pPHEAl,pBR322 및 pCE51을 분리한다.
처음에, pPHEA1 또는 pBR322를 갖는 균주의 종 배양액 20ml 및 pCE51을 갖는 균주의 종 배양액 20ml를, 각각 100μg/ml 암피실린-함유 LB 배지 400ml및 20μg/ml 카나마이신-함유 LB 배지 400ml에 접종시키고, 660nm에서의 흡광도(OD)가 약 0.7이 될 때까지 배양한다(흡광도는 다른 언급이 없는한 660nm에서 측정한다). 배양세포를 수집하고, 0.03M 트리스(히도록시메틸)아미노메탄(이후에는 트리스로 표기한다),0.05M 디소듐 에틸렌디아민테트라아세테이트(이후에는 EDTA로 표기한다) 및 0.05M. NaCl을 함유하는 TES 완충액 (pH 8.0)으로 세척하고, 25% 수크로스,0.05 M 트리스, 0.1M NaCl 및 0.8mg/ml 리소자임을 함유하는 10ml의 리소자임용액(pH 8.0)에 현탁시키고, 37℃에서 1시간동안 반응시킨다. 2.4ml의 5M NaCl, 0.6ml의 0.5M EDTA(pH 8.5) 및 4% 소듐 라우릴설페이트와 0.7M NaCl로 이루어진 용액4.4ml를 반응액에 차례로 가하고, 혼합물을 부드럽게 교반하고 얼음위에 15시간동안 놓아둔다. 혼합물을　원심분리용 튜브에 옮기고, 69,400×g,4℃에서 60분간 원심분리하여 상층액을 회수한다.10중량％에 해당하는 양의 폴리에틸렌글리콜(PEG) 6,000(Nakarai Chemicals Co.,Ltd.의 제품)을 가하고 혼합물을 부드럽게 교반하고 얼음위에 놓아둔다. 10시간후에, 혼합물을 1,500×ｇ에서 10분간,원심분리하여 펠릿을 회수한다. 5ml의 TES 완충액을 가하여 폘릿을 천천히 용해시킨다. 2.0ml의 1.5mg/ml 에티듐 브로마이드를 용액에 가한다. 염화세슘을 가하여 용액의 밀도를 1.580으로 조절한다. 용액을 18℃에서 105,000×g로 48시간동안 초원심분리하고, 원심분리용 튜브 밑부분의 고밀도 밴드(자외선 조사하에서 검출)를 주사기를 이용하여 원심분리용 튜브의 측면으로부터 꺼내어 pPHEAl,pBR322 또는 pCE51 플라스미드 DNA를 회수한다. 분획을 등 부피의 이소프로필 알코올 용액[90%(v/v)이소프로필알코올 및 10%(v/v)TES 완충액(포화량의.염화세슘 함유)]으로 5회 처리하여 추출에 의해 에티듐 브로마이드를 제거한다. 용액을 TES 완충액에 대해 투석한다.
(2) aroG 유전자의 클로닝 : 5단위의 제한효소 Hind III(Takara Shuzo Co.,Ltd.의 제품)를 단계(1)에서 제조한 3μg의 pBR 322플라스미드 DNA를 함유하는 제한효소 Hind III의 반응완충액(10mM 트리스,6mM MgCl2및 50mM NaCl 함유. pH7.5)100μl에 가한다.　한편, 5단위의 제한효소 Hind III를, 상기 단계(1)에서 제조한 에스케리키아 콜리 JA194의 염색체 DNA 3μg을 함유하는　제한효소 Hind III의 반응완충액 100μl에 가한다. 반응혼합물을 37℃에서 60분간 반응시킨다. 각각의 두 반응 혼합물에 5μl의 2M NaCl및 5단위의 제한효소 SaII(Takara Shuzo Co.,Ltd.의 제품)을 가하고, 반응액을 37℃에서 60분간 더 반응시킨다.　65℃에서 10분간 반응액을 가열하여 반응을 중단시킨다. 두 반응액을 혼합하고, 혼합물에 T4 리가제 완충액(660mM 트리스,66mA MgCI2및 100mM 디티오트레이톨 함유, pH7.5)40μl,5mM ATP 40μ1T4 리가제(1단위의 1μl, Takara Shuzo Co.,Ltd.제품)1μl 및 물 110μl 를 가하고, 혼합물을 12℃에서 16시간동안 반응시킨다.　DS를 코딩하는 유전자(aroF363, aroG365, aroH367, thi, his, pro, arg, ilv,T6r,F-)[J.Bacterio1.９３,237(1９67)]가 결핍된 에스케리키아콜리 AB3248 균주(FERM BP-865)에.의한 형질발현을 위하여 리가제　반응혼합물을 수용체로 사용한다.
밤새 배양한 에스케리키아콜리 AB3248 균주의 종 배양물을 LB 배지에 접촉시켜 문헌에 기술된 방법[M.Dagert.ｅtａｌ.,Gene,６,23(1979)]에 따라 수용능력이 있는 세포를 제조한다.
약 109세포/ml의 농도로 수용 가능성 세포를 포함하는 현탁액 0.2ml에 리가제 반응 혼합물 50μl를 가하고, 혼합물을 10분간 얼음위에 놓아둔다. 혼합물을 37℃에서 5분간 가열하고, 2ml의 LB배지와 혼합한다. 혼합물을 37℃에서 90∼120분간 방치한다. 세포를 생리식염수로 2회 원심 세척하고, 각 50μl/ml씩의 히스티딘, 프롤린, 아르기닌, 이소루이신 및 발린을 함유하는 M9판 배지(lℓ의 물에 용해시킨 2g의 글루코스,lg의 NH4Cl,6g의 Na2HPO4,3g의 KH2PO4,0.1g의 MgSO4·7H2O),15mg의 CaCI2·2H2O,4mg의 티아민 히드로클로라이드 및 15g의 한천을 함유하는 배지, pH 7.2로 조절)에 펴바른다. M9판 배지에서 자란 콜로니를 10μg/ml 암피실린 함유 LB판 배지(1.6%한천을 함유하는 LB배지, pH 7.０）와 20μg/ml 테트라사이클린 함유 LB판 배지에 펴바르고 암피실린-함유 배지에서 자라면서 테트라사이클린-함유 배지에서자라지 못하는 형질전환체를 선택한다.
이렇게 하여 선택한, 히스티딘, 프롤린, 아르기닌, 이소루이신 및 발린을 함유하는 M9판 배지에서 자라는 암피실린-내성 및 테트라사이클린-민감성 형질전환체로부터, 단계 (1)에서와 동일한 방법으로 플라스미드 DNA를 분리한다. 한 형질전환체로부터 분리한 플라스미드 pAROG1을 각종 제한 효소로 소화시키고　아가로스 겔 전기영동하여 분석한다. 플라스미드 pAROG1은 6킬로염기(이후에는 kb로 표기한다)의 HindⅢ-SalI -절단 DNA단편이 pBR322의 HindIII-와 SalI -절단 부위 사이의 구역에 삽입된 구조를 갖는것으로 밝혀졌다.
덧붙여, HindIII-SalI-절단 DNA단편은 문헌[Ｗ.D.Davies, et, a1., Nuc1.Acids.Res.,10,4045(1982)](제 1 도 참조)에 보고된 바와같이 aroG유전자와 동일한 제한 효소 절단 부위를 가지며, pAROG1을 갖는 에스케리키아 콜리 AB 3248균주의 생장은 500μg/m1페닐알라닌을 함유하는 M９판 배지에서 완전히 억제된다. 따라서, 이들 사실로부터 에스케리키아 콜리의 aroG유전자가 pAROG1에 삽입된 약 6kb의 DNA단편에 코딩되어 있다는 것이 밝혀진다.
(3) aroG와 pheA유전자를 함께 함유하는 재조합 플라스미드의 구축
pAROG1에서 분리한 aroG유전자를 함유하는 DNA단편 및 pPHEA1에서 분리한 pheA유전자를 함유하는DNA단편을 pCE51과 결합시킨다.
각 5단위씩의 제한 효소 BglII와 HpaI (Takara Shuzo Co.,.Ltd.의 제품)을 3μg의 pAROG1플라스미드 DNA를 함유하는 반응액(l0mM트리스,6mM MgCl2및 100mM NaCl함유, pH 7.5) 100μl에 가하고, 5단위씩의 제한효소 ScaI 및 BamHI(Takara Shuzo Co., Ltd.제품)을 3μg의 pPHEA1플라스미드DNA를 함유하는 반응액(10mM트리스,6mM MgC12및 100mM NaCl함유, pH 7.5) 100μl에 가하고, 두　혼합물을 37℃에서 60분간 반응시킨다.
한편, 5단위의 제한 효소 EcoRV(Takara Shuzo Co., Ltd.제품)를 3μg의 ｐｃE51 플라스미드 DNA를　함유하는 반응액(10mM트리스, 6mM MgCl2및 100mM NaCl함유, pH 7.5) 100μl에　가하고, 혼합물을　37℃에서 60분간 반응시킨다. 각각의 혼합물을 65℃에서 10분간 가열하여 반응을 중단시킨다. 세 반응 혼합물을 혼합하고, T4리가제 완충액 40μl,5mM ATP 40μl, T4리가제 1μl(1단위/μl, Takara Shuzo Co.,Ltd.제품) 및 20μl의 물을 가하고, 혼합물을 12℃에서 16시간동안 반응시킨다.
단계 (2)와 동일한 방법으로, 상기 리가제 반응 혼합물을 이용하여 에스케리키아 콜리 AB 3248균주를 형질전환시키고,　세포를 생리식염수로 2회 원심 세척하고,50μ1/ml씩의 히스티딘, 프롤린, 아르기닌, 이소루이신 및 발린을 함유하는 M9판 배지에 펴바른다. M9판 배지상에서 자란 콜로니를 스크래핑에 의해 수집하고 단계 (1)에서와 동일한 방법으로 플라스미드 DNA를 분리한다.
에스케리키아 콜리GS245균주(pheA９05, araD13９, △lacU16９, △gIyA, strA, thi)[Gene,14,63(1９8l)]를　분리된 플라스미드 DNA를 이용하여 단계 (2)와 동일한 방법으로 형질전환시킨다.　50μg/mI글리신을 함유하는 M9판 배지에서 자라는 콜로니로부터,　20μg/ml카나마이신을 함유하는 LB판 배지에서 자라는 형질전환체를 선택한다.
얻어진 형질전환체로부터, 단계 (1)과 동일한 방법으로 플라스미드 DNA를 분리한다. 한 형질전환체로부터 얻은 플라스미드 pEaroG―pheA1을 각종 제한효소로 소화시키고 아가로스겔 전기영동하여 분석한다.　플라스미드 pEaroG-pheA1은 2.8kb의 aroG유전자를 갖는 BglII-HpaI-절단 DNA단편 및 2.5kb의pheA유전자를 포함하는 Sca I -BamH I -절단 DNA단편이 pCE51의 EcoRV-절단 부위에 삽입된 구조를갖는 것으로 밝혀졌다(제 1 도 참고).
(4) aroG유전자에 의해 코딩된 DS가 페닐알라닌에 의한 억제를 받지 않는 변이체 플라스미드　pEaroG-pheA2의 제조 :
단계 (3)에서 얻어진 pEaroG-pheAl을 갖는 에스케리키아 콜리 AB3248균주를 20μg/ml카나마이신을　함유하는 LB배지내에서 배양한다. 후 로그기까지 생장한 세포를 50mM트리스-말레에이트 완충액(20mM트리스와 50mM말레산 함유, pH 6.0)으로 2회 원심 세척하고 200μg/ml,N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘을 함유하는 50mM트리스-말레에이트 완충용액(pH 6.０）으로 실온에서 30분간 처리한다. 처리된 세포를 50mM트리스-말레에이트 완충액(pH 6.０)으로 2회 원심세척하고, 세척한 세포를 20μg/m1카나마이신을 함유하는 LB배지내에서 30℃에서 16시간 동안 배양한다．단계 (1)과 동일한 방법으로 플라스미드 DNA를 분리한다.
분리된 플라스미드를 이용하여 에스케리키아 콜리 AB3248균주를 단계 (2)와 동일한 방법으로 형질전환시킨다.6mg/ml페닐알라닌 및 50μg/ml씩의 히스티딘, 프롤린, 아르기닌, 이소루이신 및 발린을 함유하는M9판 배지상에서 형질전환체를 선택한다. 콜로니로부터,6mg/ml 페닐알라닌 및 50μg/ml씩의 히스티딘,프롤린, 아르기닌, 이소루이신 및 발fls을 함유하는 M9판 배지 및 20μg/m1카나마이신을 함유하는 LB판 배지에서 자랄 수 있는 형질전환체를 수득한다.
이렇게 하여 얻은 형질전환체로부터 분리한 플라스미드는 에스케리키아 콜리 AB3248균주에게 페닐알라닌-내성을 부여할 수 있다. 한 형질전환체로부터 분리한 플라스미드는 pEaroG-pheA2로 명명한다.
(5) pEaroG-pheA2에 의한 코리네박테리움 글루타미쿰의 형질·변환 및 pheA유전자에 의해 코딩된 CM및 PD가 페닐알라닌에 의한 억제를 받지 않는 변이체 플라스미드 pEaroG-pheA3의 제조 :
우선, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 3９01９(코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 31833으로부터 유도된리소자임-민감성 변이를 갖는 균주)의 종 배양물 4ml를 NB배지(1ℓ의 물에 용해시킨 육즙 분말 20g 및효모 추출액 5g을 함유하는 배지, pH 7.2로 조정) 40ml에 접종시키고 30℃에서 진탕하여 배양시킨다. OD가 0.6에 도달하면 세포를 수집하고, 약 109세포/ml의 농도로 1mg/ml리소자임을 함유하는 RCGP배지[1ℓ의 물에 용해시킨,5g의 글루코스,5g의 카사미노산,2.5g의 효모 추출액,3.5g의 K2HPO4,1.5g의 KH2PO4,0.41g의 MgCl2·6H2O,10mg의 FeSO4·7H2O,2mg의 MnSO4·4∼6H2O, 0.9mg의 ZnSO4·7H2O,0.04mg의 (NH4)6Mo7O244H2O,30μg의 비오틴, 2mg의 티아민 히드로클로라이드, 135g의 디소듐 숙시네이트 및 10,000의 분자량을 갖는 폴리비닐 피롤리돈 30g을 함유하는 배지, pH 7.６10ml에 현탁시킨다.
현탁액을 L-형 시험관에 옮기고 30℃에서 5시간 동안 부드럽게 진탕하여 원형질체를 제조한다.
0.5ml의 원형질체 현탁액을 조그만 시험관에 넣고, 2,500×g에서 5분간 원심 분리한다. 원형질체를 1ml의 TSMC완충액(10mM MgCl2,30mM CaCl2,50mM트리스 및 400mM수크로스 함유, pH 7.5)에 현탁시키고 원심세척한다. 원형질체를 0.1ml의 TSMC완충액에 재현탁시킨다. 2배 농도의 TSMC완충액과 상기pEaroG-pheA2 DNA용액의 1 : 1혼합물 100μl를 원형질체 현탁액에 가하고, 생성된 혼합물을, 20% PEG6,000을 함유하는 TSMC완충액 0.8ml와 혼합한다.　3분 후, 2ml의 RCGP배지(pH 7.2)를 가하고, 혼합물을 2,500×g에서 5분간 원심분리하여 상층액을 제거한다. 침전된 원형질체를 1ml의 RCGP배지에 현탁시키고, 현탁액 0.2ml를 200μｇ/ml카나마이신을 함유하는 RCGP한천 배지(1.4% 한천을 함유하는 RCGP배지, pH 7.2)에 펴바르고, 30℃에서 7일간 배양한다.
단계 (1)과 동일한 방법으로, 카나마이신-내성 형질 전환체의 배양세포로부터 플라스미드 DNA를 분리한다. 한 형질전환체로부터 얻은 플라스미드는 각종 제한 효소를 이용한 소화 분석에 의해 pEaroG-pheA2와 동일한 플라스미드인 것으로 밝혀졌다.
pEaroG-pheA2를 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 3９01９를 10μg/m1카나마이신을 함유하는 NB배지에서 배양한다. 후 로그기까지 자란 세포를 단계 (4)와 동일한 방법으로 변이 처리하고, 단계 (1)과 동일한 방법으로 세포로부터 플라스미드 DNA를 분리한다.
상술한 것과 동일한 방법으로, 분리된 플라스미드를 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 39019를　형질전환시키고, 200μg/ml카나마이신을 함유하는 RCGP한천 배지에서 자라는 카나마이신-내성 　콜로니를　긁어서 수집하고, 생리식염수로 2회 원심세척하고 1ml의 생리 식염수에 현탁시킨다. 2000μg/ml PEP와 10μg/ml카나마이신을 함유하는 최소 한천 배지 Ml[1ℓ의 물에 용해시킨 10g의 글루코스, 1g의 (NH４)H２PO４,0.2g의 KCl,0.2g의 MgSO４·7H２O,10mg의 FeSO４·7H２O,0.2mg의 MnSO４·4∼6H２O,0.9mg의　ZnSO４·7H２O,0.4mg의 CuSO４·5H２O,0.0９gmg의 Na２B４O７·10H２O,0.04mg의 (NH４)６Mo７O２４·4H２O,50μg의 비오틴, 2.5mg의 p-아미노벤조산, 1mg의 티아민 히드로클로라이드 및 16g의 한천을 함유, pH7.2로 조정]에 세포 현탁액을 펴바르고, 30℃에서 5일간 배양하여 PEP- 및 카나마이신-내성 형질전환체를 선택한다. 한 균주로부터 분리한 플라스미드를 pEaroG-pheA3으로 명명한다.
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 39019, 및 pEaroG-pheA3을 함유하는 형질전환체의 DS, CM 및PD활성을 결정한다. DS활성의 결정은 스프리나바산 등의 방법[P.R.Sprinavasan, D.B.Sprinson, et.al.,J.Biol.Chem.,234,716(1959)]에 따라 실시하고, CM 및 PD활성의 결정은 코톤 등의 방법[R.G.H.Cotton ＆ F.Gibson, Biochem.Biophys.Acta,100,76(1９65)]에 따라 실시한다.
pEaroG-pheA3을 갖는 형질전환체의 DS, CM 및 PD의 활성을 표 1에 나타내었으며,　코리네박테리움　글루타미쿰 ATCC 39019의 값에 대한 상대치로 표현하였다.
덧붙여, 100mM페닐알라닌을 반응액에 가했을 때의 pEaroG-pheA1, pEaroG-pheA2 또는 pEaroG-pheA3를 함유하는 형질전환체의 DS, CM 및 PD활성을 결정한다. 그 활성은 표 2에 나타냈으며, 페닐알라닌을 가하지 않았을 때의 ％로 나타낸다.
[표 1]
Figure kpo00004
[표 2]
Figure kpo00005
(6) pEaroG-pheA3을 갖는　균주에 의한 페닐 알라닌의 제조 :
페닐알라닌-생산 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 K38(FERM BP-454,　이 균주는 1988년 2월 11일자로 한국 과학기술원에 KCTC 8339P의 수탁번호로 기탁되었다.)[PFP-및 파라아미노페닐알라닌-내성을　갖는 균주〕 트립토판-생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 K-55(FERM BP-864)[페닐알라닌- 및 티로신-요구성, 및 5-메틸트립토판-, 트립토판 히도록사메이트-,6-플루오로트립토판,-,4-메틸 트립토판-, PFP-, p一아미노페닐알라닌-, 티로신 히도록사메이트- 및 페닐알라닌 히도록사메이트-내성을　갖는 균주〕 및 티로신-생산균주　코리네박테리움 글루타미쿰 K43(FERM BP-457)[3-아미노티로신-,p-아미노페닐알라닌-, PFP- 및 티로신 히도록사메이트-내성을 갖는 균주〕을 pEaroG-pheA3으로 형질전환시킨다.
다음과 같은 방법으로 제조한 원형질체를 형질전환에 이용한다. 우선 K38, K-55 및 43균주의 종 배양물 4ml씩을 100μg/ml 페닐알라닌과 티로신을 함유하는 반합성 배지 SSM[1ℓ의 물에 용해시킨 20g의 글루코스, 10g의 (NH４)２SO４,3g의 우레아, 1g의 효모 추출액, 1g의 KH２PO４,0.4g의 MgCl２·6H２O,10mg의 FeSO４7H２O,0.2mg의 MnSO4·4∼6H2O,0.９mg의 ZnSO4·7H2O,0.4mg의 CuSO45H2O,0.0gmg의 Na２B４.O7·10H２O,0.04mg의 (NH４)６Mo７O２４·4H２O,30μg의 비오틴 및 1mg의 티아민 히드로클로라이드를 함유하는 배지,　pH 7.2로 조정, 이후에는 SSM배지로 표기한다.] 40ml에 각각 접종하고,　30℃에서 진탕배양한다. OD가 0．2에 도달하면, 페니실린 G를 0.5단위/ml의 농도로 가한다. 배양을 계속하고, OD가 0.6에 도달하면, 단계 (5)와 동일한 방법에 따라 배양 세포를 리소자임으로 처리하여 원형질체를 제조한다. 이렇게하여 얻은 원형질체를 단계 (5)와 동일한 방법으로 pEar0G-pheA3으로 형질전환시켜 카나마이신-내성 형질전환체를 얻는다. 각각의 형질전환체를 40ml의 SSM배지에서 배양하고, 상기와 동일한 방법으로　페니실린 G로 처리한다. 수집된 배양 세포로부터 단계 (1)과 동일한 방법으로 플라스미드 DNA를 분리한다. 플라스미드는, 각종 제한효소를 이용한 소화 분석에 의하면 pEaroG-pheA3과 동일한 플라스미드인것으로 밝혀졌다. 이렇게 하여 얻은, pEaroG-pheA3을 갖는 형질전환체는 각각 1986년　8월 7일자로, 일본국 통상산업성 공업기술원 미생물 공업기술연구소(FRI)에 코리네박테리움 글루타미쿰 K-66(FERMBP-1120) 및 코리네박테러움 글루타미쿰 K-67(FERM BP-1121)로서 기탁되어 있다. 상기 형질전환체는 또한 1９88년 2월 11일자로 한국과학기술원(KAIST)에 각각 KCTC 8345P 및 KCTC 8346P의 수탁번호로 기탁되었다.
형질전환체와 각각의 모균주의 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판 생산 시험을 다음과 같은 방법으로 실시한다.
우선, NB배지 내에서 30℃에서 16시간동안 진탕배양하여 수득한 0·5ml의 종배양물을, 5ml의 생산배지[1ℓ의 물에 용해시킨 60g의 글루코스, 1g의 KH２PO４,1g의 K２HPO４, 1g의 MgSO4·7H２O,20g의 (NH４)２SO４,5g의 옥수수침지액, 10mg의 MnSO４,30/g의 비오틴　및 20g의 CaCO３를 함유하는 배지, pH7.2로 조정]를 함유하는 시험관에 접종시키고,30℃에서 72시간동안 진탕배양한다. 배양후에,lm1의 배양브로쓰를 50μ1의 6N NaOH와 혼합하고,65℃에서 5분간 가열하여 침전티로신을 용해시킨다. 배양여액을　페이퍼크로마토그래피하고 닌히드린으로 착색시킨 후에, 비색 정량법으로 L-페닐알라닌, L-티로신 및　L-트립토판의 수율을 결성한다. 결과를 표 3에 나타낸다.
[표 3]
Figure kpo00006
[실시예 2]
코리네박테리움 글루타미쿰 K38의 DS, CM 및 PD유전자를 모두 함유하는 재조합폴라스미드를 갖는 균주에 의한 페닐알라닌의 제조 :
(1) 코리네박테라움 글루타미쿰 K38균주의 염색체 DNA, 플라스미드 pCS-CM2 및 벡터 pCE 53과pCGl15의 제조
우선, NB배지에서 배양한 코리네박테리움 글루타미쿰 K38(FERM BP-454, KCTC 833９P)의 종 배양물 20ml을　400m1의 SSM배지에 접종시키고,　30℃에서 진탕 배양한다.OD가 0.2에 도달하면, 페니실린 G를 0.5단위/m1의 농도로 배지에 가한다.OD가 0.6이 될때까지 계속 배양한다.
배양 브로쓰로부터 세포를 수집하고, TES완충액으로 세척하고,10m1의 리소자임 용액에 현탁시키고37℃에서 4시간 동안'반응시킨다. 수집된 세포로부터 실시예 1, 단계 (1)과 동일한 방법으로 고분자량 염색체 DAN를 분리한다.
플라스미드 pCS-CM2는 일본국 특허 공개 제24192/85호에 기재된 대로, 코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 자기 복제될 수 있는 플라스미드 pCGl1의 BglII一절단 부위에, 코리네박테리움 글루타미쿰 K38로부터 분리되었으며 페닐알리닌- 및 티로신-요구성을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 KY９456[Agric.Bio1.Chem.,3９,331(1９75)]의 결핍 성상이 보충된 BamH I -절단 DNA　단편을 삽입하여 구축한 플라스미드이다.
벡터로 사용되는 pCE53은 코리네박테리움 글루타미쿰의 플라스미드 pCG1을 에스케리키아 콜리의 플라스미드 pGA22[J.Bacteriｏｌ.,140,40０（1979)]와 합하여 수득한 플라스미드이다. 보다 상세히 설명하면, 두제한 효소의 동일한 부착말단에 의해 두 BamH I -절단 부위를 갖는 PGA22의 테트라 사이클린 내성 유전자 바깥의 BamHI-절단 부위에 pCGl의 BglII-절단 DNA단편을 삽입한다. pCE53은 pGA22로부터 유도된 카나마이신 내성 유전자와 같은 선택 표식 및 제한 효소 SalI의 한 절단부위를 갖는다.
비슷하게, 벡터로 사용되는 pCG115는 M13 mp 18RF DNA(Takara Shuzo Co., Ltd.의 제품)를 제한효소 BamHI 및 PstI으로 소화시켜 수득한 링커를 동일한 부착 말단에 의해 pCGl1의 BglII- 및 PstI -절단 부위에 삽입하여 얻는 플라스미드이다. pCG115는 6.4kb의 분자 크기를 갖는 플라스미드이며, 단일 제한효소 절단 부위로서 XbaI-, SalI- 및 PstI-절단 부위를 가지며 숙주에게 스트렙토마이신-및/또는 스펙티노마이신-내성의 표현형을 부여한다(제 2 도 참고).
다음과 같은 방법으로, 코리네박테리움　글루타미쿰 K-3９(FERM BP-459)의 배양 세포로부터 pCS-CM2를 분리하고, pCE53 또는 pCGl15를 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 3９01９(ATCC 31833으로부터 유도된 리소자임-민감성 변이를 갖는 균주)의 배양세포로부터 pCE53 및 pCGl15를 분리한다 :
코리네박테리움 글루타미쿰 K39를 400m1의 SSM배지내에서,30℃에서 진탕 배양하고, 상술한 것과 동일한 방법으로 페니실린 G로 처러하고,OD가 0.6에 도달할 때까지 배양한다. 한편, pCE53 또는 pCG115를　갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 3９01９를 30℃에서, NB배지 400m1내에서 OD가 약 0.7에 도달할때까지 진탕 배양한다. 세포를 수집하고, 실시예 1, 단계 (1)과　동일한 방법으로 세포로부터 각각의 플라스미드를 분리한다.
(2) DS유전자를 포함하는 DNA단편의 클로닝 :
우선, 상기에서 제조한 pCE53플라스미드 DNA 3μg을 포함하는 제한 효소 SalI용 반응액(10mM트리스,6mM MgCI２및 150mM NaCI함유, pH 7.5) 60μl에 6단위의 SaI I (Takara Shuzo Co.,Ltd.제품)을가하고, 혼합물을 37℃에서 60분간 반응시킨다. 혼합물을 65℃에서 10분간 가열하여 반응을 중단시킨다. 한편, 코리네박테리움 글루타미쿰 K38균주의 염색체 DNA 3μg을 함유하는 SalI용 반응액 140μl에 6단위의　SalI을 가하고, 혼합물을 37℃에서 60분간 반응시킨다. 혼합물을 65℃에서 10분간 가열하여 반응을 중단시킨다.
이들 두 혼합물을 혼합하고 l0배 농도의　T4　리가제용 완충액 40μ1,5mM ATP 40μl, T4리가제(1단위/m1,Takara ShuzoCo.,Ltd.의제품)0.3μ1　및　물120μ1를　가하고,혼합물을12℃에서16시간동안반응시킨다.
코리네막테리움 글루타미쿰 ATCC 39019의 형질전환에 리가제 반응 혼합물을 사용한다. 즉, 코리내박테리움 글루타미쿰 ATCC 3９01９의 종 배양액 4m1을 NB 배지 40m1에 접종시키고,30℃에서 진탕 배양한다.OD가 0.6에 도달하면, 세포를 수집하고,lmg/m1리소자임을 함유하는 RCGP 배지(pH 7.6)10ｍｌ에 약 10９세포/m1의 농도로 현탁시키고, 현탁액을 L-형 시험관에 옮기고,　30℃에서 5시간 동안 부드럽게 진탕하여원형질체를 제조한다
0.5m1의 원형질체 현탁액을 작은 시험관에 옮기고,2,500xg에서 5분간 원심분리하고,1m1의 TSMC 완충액에 현탁시킨다. 현탁액을 원심 세척하고, 세척한 세포를 0.lml의 TSMC 완충액에 재현탁시킨다. 세포현탁액에,2배 농도의 TSMC 완충액 및 상기 리가제 반응액의 1 : 1혼합물 100μ1를 가하고 20%PEG 6,000을 함유하는 TSMC완충액 0.8m1와 혼합한다.3분 후,2ml의 RCGP 배지ｐＨ 7.2)를 혼합물에 가하고, 혼합물을 2,500xg에서 5분간 원심분리하여 상충액을 제거한다. 침전된 원형질체를 RCGP 배지 1m1에 현탁시키고,200μg/m1카나마이신을 함유하는 RCGP한천 배지에 0.2m1의 세포 현탁액을 펴 바르고 30℃에서 7일간 배양한다.
한천 배지위에 자란 콜로니를 긁어서 수집하고, 생리식염수로 2회 원심세척하고,lm1의 생리식염수에 현탁시킨다.
800μg/mlPFP 및 10μg/m1 카나마이신을 함유하는 최소한천배지 M1에 세포현탁액을 다시 펴바르고 30℃에서 5일간 배양한다. PFP- 및 카나마이신-내성을 갖는 형질전환체를 선택한다.
형질 전환체를 NB 배지에서 배양하고, 실시예 2, 단계(1)의 pCE53의 분리와 동일한 방법으로, 수집된　배양 세포로 부터 플라스미드 DNA를 분리한다. 한 형질전환체로 부터 얻고 pCDS1이라 명명된 플라스미드는, 각종 제한효소로 소화시킨 생성물을 아가로스 겔 전기영동하여 분석한 것에 따르면 6.7kb의 SalI-절단 DNA단편의 pCE53의 SalI-절단 부위에 삽입된 구조를 갖는 것으로 밝혀졌다(제 2 도참조).
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 3９01９ 및 pCDS1을 갖는 형질전환체의 DS활성을 실시예1, 단계(5)와　동일한 방법으로 결정한다.
pCDS1을　갖는 형질전환체의 DS활성은.ATCC 3９01９균주의 활성보다 약 10배 높으며, 페닐알라닌 및 티로신에 의한 억제를 받지 않는다. 따라서, 코리네박테리움 글루타미쿰 K38 균주로 부터 유도된 DS유전자는 pCDS1에 삽입된 6.7kb의 DNA 단편에 코딩되어 있는 것으로 판명된다.
(3) CM·유전자를 포함하는 DNA단편의 서브클로닝 : 우선, 실시예 2, 단계(1)에서 제조한 cCS-CM2플라스미드 DNA 3μg을 함유하는 제한 효소 SalI용 반응액 100μl에 SalI(Takara Shuzo Co., Ltd.제품)　5단위를 가하고, 혼합물을 37℃에서 60분간 반응시킨다. 혼합물을 65℃에서 10분간 가열하여 반응을 중단시킨다. 한편,3μg의 pCE53플라스미드 DNA를 포함하는 제한효소 SalI용 반응액 100μ1에 5단위의 SalI을가하고, 혼합물을 37℃에서 60분간 반응시킨다. 혼합물을 65℃에서 10분동안 가열하여 반응을 중단 시킨다.
두 반응 혼합물을 혼합하고,10배 농도의 T4리가제용 완충액 액 40μl,5mM ATP 40μ1, T4리가제(1단위/μｌ, Takara Shuzo Co., Ltd. 제품) 0.3μ1 및 물 120μ1/m1를 가한다. 혼합물을 12℃에서 16시간동안반응 시킨다.
이렇게하여 얻은 리가제 반응혼합물은 코리네박테리움 글루타미쿰 KY 9457
(CM 활성의 결핍에 의해 페닐알라닌- 및 티로신-요구성을 가짐) [Agric.Ｂiol Chem., 3９, 331(1９75)](1986년 8월 7일에 FRI에　FERM BP-1l23의 수탁번호로 기탁됨.1９88년 2읠 11일자로 KAIST에 KCTC8348 P의 수탁번호로 기탁됨)의 형질전환에 사용한다.
다음과 같은 방법으로 제조한 원형질체를 형질전환에 이용한다. 우선,1OOμg/m1페닐알라닌 및 티로신을　함유하는 SSM 배지 40m1에 KY９457군주의 종 배양물 4ml를 접종시키고,30℃에서 진탕 배양한다.OD가0.2에 도달하면, 페니실린 G를 0.5단위/ml의 농도로 가하고 계속 배양한다.OD가 0.6에 도달하면, 새포를수집하고 실시예 2, 단계(2)와 동일한 방법으로 리소자임으로 처리하여 원형질체를 제조한다. 실시예 2, 단계(2)와 동일한 방법으로 상기리 가제 반응 혼합물을 이용하여 원형질체를 형질전환시킨다.
200μg/m1카나마이신을 함유하는 RCGP한천 배지에서 자라는 카나마이신-내성 콜로니를 긁어서 수집하고, 생리식염수로 2회 원심세척하고 1ml의 생리식염수에 현탁시킨다. 이렇게 하여 얻은 세포 현탁액을 10μg/m1카나마이신을 함유하는 최소 한천 배지 M1에 다시 펴바르고 30℃에서 3일간 배양한다.
카나마이신-내성 및 페닐알라닌- 및 티로신-비-요구성 형질 전환체를 선택한다. 형질전환체를 SSM배지에서 배양하고, 상술한 것과 동일한 방법으로 페니실린 G로 처리하고, 수집한 배양세포로부터 실시예2, 단계(1)의 pCE53의 분리와 동일한 방법으로 플라스미드 DNA를 분리한다. 한 형질 전환체로부터 얻은　플라스미드 pCCM1을 각종 제한 효소로 소화시키고 아가로스겔 전기영동으로 분석한다. 이 플라스미드는　1.9kb의 SalI-절단 DNA단편이 pCE53의 SalI-절단 부위에 삽입된 구조를 갖는 것으로 밝혀졌다(제 2 도참고).
(4) PD유전자를 갖는 DNA단편의 클로닝 : 우선, 실시예 2, 단계(1)에서 제조한 pCE53.플라스미드DNA 3μg을 함유하는 제한효소 BamHI(10mM 트리스,6mM MgCl２및 100mM NaC1 함유, pH7.5)용반응액 60μ1에 6단위의 BamHI(Takara Shuzo Co., Ltd.의 제품)를 가하고, 혼합물을 37℃에서 60분간 반응시킨다. 혼합물을 65℃에서 10분간 가열하여 반응을 중단시킨다． 한편， 코리네박테리움 글루타미쿰　k38균주의 염색체 DNA3μg을 함유하는 BamH1용 반응액 140μl/m1에 6단위의 BamHl를 가하고, 혼합물을 37C에서 60분간 반응시킨다. 혼합물을 65℃에서 10분간 가열하여 반응을 중단시킨다. 두반응 혼합물을　혼합하고,　10배 농도의 T4리가제 반응 완충액 40μ1/ml,5mM ATP 40μ1, T4 리카제(1만위/μ1, TakaraShuzo Co., Ltd.제품)0.3μ1 및 물 120μ1를 혼합물에 가한다．혼합물을 12℃에서 16시간 동안 반응시킨다． 이렇게 하여 얻은 리가제 반응 혼합물을 이용하여, 실시예 2, 단계(3)과 동일한 방법으로 코리네박테리움　글루타미쿰 KY 9182(PD 활성의 결핍에 의하여 페닐알라닌-요구성을 가짐)
[Agric. Bio1. Chem.,39,331(1975) ]를 형질전환시킨다.　200μg/m1카나마이 신을 함유하는 RCGP 한천배지에서 자라는 카나마이신-내성 콜로니를 긁어서 수집하고, 생리식염수로 2회 원심 세척하고,lm1의 생리식염수에 현탁시킨다. 새포 현탁액을 10μg/m1카나마이신을 함유하는 최소 한천 배지 M1에 다시 펴바르고,30℃에서 3일간 배양한다. 카나마이신-내성 및 페닐알라닌-비-요구성 형질전환체를 선택한다. 형질전환체를 SSM배지내에서 배냥하고 페니실린 G로 처리한다. 실시예 2, 단계(1)의 ＰCE53의 분리와 동일한　방법으로 형질전환체로 부터 플라스미드 DNA를 분리한다. 한 형질 전환체로 부터 수득한 플라스미드pCPD1을 각종 제한 효소로 소화시키고 아가로스 겔 전기영동하여 분석한다．이 플라스미드는 4·9kb의　BamHI-절단 DNA 단편이 pCE53의 BamHI-절단 부위에 삽입된 구조를 갖는 것으로 밝혀졌다(제 3 도참고).
(5) DS와 CM 유전자 모두를 포함하는 제조합 플라스미드의 구측 : DS 유전자를 갖는 DNA단편을　pCDS1으로부터 분리하고 CM 유전자를 갖는 DNA 단편을 pCCM1으로 부터 분리한 후에, 이 들 두　DNA단편을 pCG115에 삽입시킨다.
우선, 각각 3μg씩의 pCDS1, pCCM1 또는 pCGl15 플라스미드 DNA를 함유하는 SalI반응액 100μ1에 5단위의 SalI(Takara Shuzo Co., Ltd. 제품)을 가하고, 각 혼합물을 37℃에서 60분간 반응시킨다. 혼합물을 65℃에서 10분간 가열하여 반응을 중단시킨다.
세 반응액을 혼합하고,10배 농도의 T4리가제 완충액 40μ1,5mM ATP 40μ1, T4리가제(1단위1μ1,Takara Shuzo Co., Ltd.제품)1μg 및 물 20μ1를 가한다. 혼합물을 12℃에서 16시간 동안 반응 시킨다.
이렇게 하여 얻은 리가제 반응 혼합물을 이용하여, 실시예 2, 단계(3)과 동일한 방법으로 CM 활성이 결핍된 코리네박테리움 클루타미쿰 KY 9457(FERM BP-1l23, KCTC 8348P)을 형질전환 시킨다. 400μ1/m1 스펙티노마이신을 포함하는 PCGP한천배지에서 자라는 스펙티노아이신-내성 콜로니를 긁어서 수집하고, 생리식염수로 2회 원심 세척하고,lm1의 생리식염수에 현탁시킨다.3mg/mlPFP 및 100μg/m1 스펙티노마이신을 함유하는　최소 한천 배지 M1에 세포 현탁액을 펴바르고 30℃에서 5일간 배양한다．스펙티노마이신- 및 PFP-내성, 및 페닐알라닌- 및 티로신-비-요구성 형질전환체를 선택한다．실시예 2, 단계(3)과 동일한 방법으로, 형질전환체로 부터 플라스미드 DNA를 분리한다. 한 형질전환체로 부터 얻은 플라스미드 pCDS-CM1을 각종 제한 효소로 소화시키고 아가로스 겔 전기 영동하여 분석한다. 이 플라스미드는, DS 유전자를 함유하는 6.7kb의 SalI-절단 DNA 단편 및 CM 유전자를 함유하는 1.9kb의 SalI 절단DNA 단편이 pCG l15의 SalI-절단 부의에 삽입된 구조를 갖는 것으로 밝혀졌다(제 2 도 참고). pCDS-CM1을 갖는 형질전환체는 FRI에 코리네박테리움 글루타미쿰 K-68(FERM BP-1122)로서 1986년 8월 7일에 기탁되었다. 이 형질전환체는 또한 1988년 2월 11일자로 KAIST에 KCTC 8347 P의 수탁번호로 기탁되었다.
(6) DS,CM 및 PD유전자를 모두 함유하는 제조합　플라스미드의 구측 : PD 유전자를 포함하는 DNA 단편을 pCPD1으로 부터 분리하고 pCDS-CM1에 삽입 시킨다.
우선,3μ1의 pCPD1 플라스미드 DNA를 포함하는 BamHI용 반응액 100μl에 5단위의 BamHI(TakaraShuzo Co., Ltd제품)를 가하고, 혼합물을 37℃에서 60분간 반응 시킨다. 혼합물을 65℃에서 10분간 가열하여 반응을 중단 시킨다. 한편,3μg의 pCDS-CM1 플라스미드 DNA를 포함하는 BalII(l0mM 트리스,6mM MgC1２및 100mM NaC1, pH7.5)의 반응액l00μ1에 5단위의 BalII(Takara Shuzo Co., Ltd.제품)을 가하고, 혼합물을 37℃에서 60분간 반응시킨다. 페놀-처리하여 반응을　중단시킨다. 두 반응액을 혼합하고,2배 부피의 에탄올을 혼합물에 가한다. 혼합물을 -20℃에서 6시간 동안 방치하고, 침전된 DNA를 원심분리하여 회수하고,100μ1의 TES완충액을 용해시킨다.
10배　농도의 T4의 리가제용 완충액 20μ1,5mM ATP 20μ1, T4 리가제(1단위/μ1, Takara Shuzo Co.,Ltd.제품) 0.3μ1 및 물 60μ1를 반응액에 가하고 혼합물을 l2℃에서 16시간 동안 반응시킨다.
이렇게 하여 얻은 리가제 반응 혼합물을 이용하여, 실시예 2, 단계(3)과 동일한 방법으로 PD활성이 결핍된 코리네박테리움 글루타미쿰 KY 9182균주를 형질전환시킨다· 400μg/ml스펙티노마이신을 포함하는　RCGP한천 배지에서 자라는 스펙티노 마이신-내성 콜로니를 긁어서 수집하고, 생리식염수로 2회 원심 세척하고,lml의 생리식염수에 현탁시킨다.100μg/ml　스펙티노마이신을 포함하는 최소 한천 배지 Ml에 세포현탁액을 다시 펴바르고,30℃에서 3일간 배양한다. 스펙티노마이신-내성 및 페닐알라닌-비-요구성 형질전환체를 선택한다.
실시예 2, 단계(3)과 동일한 방법으로, 이들 형질전환체로 부터 플라스미드 DNA를 수득한다. 한 형질전환체로 부터 얻은 플라스미드 pCDCP1을 각종 제헌 효소로 소화 시키고, 아가로스 겔 전기영동하여 분석한다. 플라스미드는, PD 유전자를 갖는 4.9kb의 BamHI-절단 DNA 단편이 pCDS-CM1 의 BglII-단편부위에 삽입된 구조를 갖는 것으로 밝혀졌다(제 3 도 참고).
실시예 2,단계(5)와 동일한 방법으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 39019 및 pCDCP1을 갖는 형질전환체의 DS,CM 및 PD 활성을 절정한다. pCDCP1을 갖는 형질전환체의 DS, CM 및 PD활성을 표4에나타냈으며, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 390l9의 값에 대한 상대값으로 표현하였다.
[표 4]
Figure kpo00007
(7) pCDCPl을 갖는 균주에 의한 페닐알라닌의 제조： 실시예 2, 단계(3)과 동일한 방법으로, 페닐알라닌-생산 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 K38(FERM BP-454, KCTC 833９P), 트립토판-생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 K-55(FERM BP-864) 및 티로신-생산 균주 코리네박테리움 클루타미쿰K43(FERM BP-457)을 pCDCP1으로 형질전환 시켜 스펙티노마이신一내성 형질전환체를 수득한다. 실시예 2, 단계(3)과 동일한 방법으로 형질전환체로 부터 플라스미드 DNA를 분리하고, 각종 제한 효소로 소화시켜 분석한다. 플라스미드는 pCDCP1과 동일한 플라스이드로 밝혀졌다.
형질 전환체 및 각각의 모균주의 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판 생산 시험을 실시예 1, 단계(6)과 동일한 방법으로 실시하고, 종이 크로마토그래피에 의해 L-페닐알라닌, L-티로신 및 L-트립토판의 수율을　결정한다. 결과를 표5에 나타내었다.
[표 5]
Figure kpo00008
참고예
(1) 에스케리키아 콜리의 CM 및 PD를 코딩하는 pheA 유전자를 함유하는 플라스미드 DNA의 제조 : 일본국 특허 공개 제34197/85호, 유럽 공고 제136359호에 기술된 대로, 에스케리키아 콜리 K-12 균주[Proc.Natl. Acad.·Sci., ９4,487(1９77)]로부터 유도된 에스케리키아 콜리 JA194의 염색체 DNA를 원(源)으로,-pBR322를 백터로 사용하여 에스케리키아　콜리로 부터 유래된　야생형 pheA 유전자를 포함하는 DNA 단편을4.2kb의 EcoRI-HindIII-절단 DNA 단편으로 클로닝한다. 이렇게 하여 얻은 DNA 단편을 포함하는 재조합 플라스미드 pEaroF1는 EcoRI, BamHI, HindIII등의 각종 제한 효소에 대한 절단 부위를 가지며, 즐로브스키 등[Z1owsky, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA,75,4271(1９7８〕에 의해 클로닝된 DNA 단편과의 비교에 의해서 pheA 유전자 뿐만 아니라 aroF 및 tyrA 유전자도, 클로닝된 DNA 단편에 위치하고　있음이 밝혀졌다. 따라서, pEaroFl으로 부터 pheA 유전자만을 포함하는 DNA 단편을 서브클로닝하기 위해서는, 우선 실시예1, 단계(1)과 동일한 방법으로 pEaroF1을 갖는 에스케리키아 콜리 AB 3248(이 균주의 제법은 일본국 특허공개 제34197/85호, 유럽 공고 제136359호에 기재되어 있다)의 배양세포로 부터pEaroF1을 분리해야 한다.
(2) pheA 유전자의 서브 클로닝 : 상기에서 제조한 플라스미드 pEaroF1 DNA로부터 pheA 유전자를 포함하는 DNA 단편을 분리하고, 이를 에스케리키아 콜리내에서 자기 복제할 수 있는 벡터 pBR322에 삽입한다.
우선 3μg의 플라스미드 pFaroFl DNA를 포함하는 제한 효소 EcoRI 및 BamHI용 반응액(10mM 트리스,..6mM　 MgC1２및 100mM NaC1 함유,pH 7.5)100μl에 각 5단위씩의 제한효소 EcoRI 및 BamHI(Takara Shuzo Co., Ltd. 제품)을 가하고, 혼합물을 37℃에서 60분간 반응시킨다. 한편,3μg의 pBR322
DNA를 포함하는 제한효소 EcoRI 및 BamHI용 반응액 100μl에 각 5단위씩의 EcoRI 및 BamHI를 가하고, 혼합물을 37℃에서 60분간 반응시킨다. 반응 혼합물을 65℃에서 10분간 가열하여 반응을 중단시킨다.두 반응액을 혼합하고, T4리자제용 완충액(660mM 트리스,66mM MgC1２및 l00mM 디티오트레이톨 함유, pH7.6)40μl,5mM ATP 40μ1, T4리가재(1단위 1μ1, Takara Shuzo Co., Ltd.제품)0.4μ1 및 물 120μ1를 혼합물에 가한다. 혼합물을 l2℃에서 16시간 동안 반응시킨다. 혼합물은 65℃에서 15분간 가열하여반응을 중단시킨다. 에스케리키아콜리 K12 균주(pheA９05,araD13９, △lacU16９, △glyA,strA,thi)[Gene,14,63,(1981)]로 부터 유도된 에스케리키아 콜리 GS245 균주를, 이렇게 하여 얻은 리가제 혼합물을　이용하여 실시예1, 단계(2)와 동일한 방법으로 형질전환시킨다.
세포를 생리식염수로 2회 원심세척하고,　50μg/ml 글리신을 함유하는 M9판 배지에 펴바른다. M9판 배지에서 자라는 콜로니를,100μg/ml 암피실린-함유 LB판 배지 및 20μg/ml 테트라사이클린-함유 LB관 배지위에 펴바르고, 암피실린-함유 배지에서 자라고 테트라사이클린-함유 배지에서 자라지 못하는 형질전환체를 선택한다.
실시예 1, 단계(1)과 동일한 방법으로, 글리신-함유 M9판 배지 위에서 자라는 이렇게 선택된 암피실린-내성, 및 테트라사이클린-민감성 형질 전환체로 부터 플라스미드 DNA를 분리한다. 한 형질 전환체로부터 얻은 플라스미드 pPHEA1을 각종 제한효소로 소화시키고 아가로스 겔 전기영동하여 분석한다. 이 플라스미드는 1.8kb의 EcoRI-BamHI-절단 DNA 단편이 pBR322의 EcoRI- 및 BamHI-절단 부위 사이의 구역에 삽입된 구조를 갖는 것으로 밝혀졌다.

Claims (5)

  1. 3-데옥시-D-아라비노-헵투로소네이트-7-포스페이트신타제, 코리스메이크　뮤타제　및　프래패네이트 데히드라타제의 합성에 관여하는 모든 유전 정보를 갖는 DNA 단편을 포함하는 재조합 DNA를 코리네박테리움 또는 브레비박테이움 속에 속하는 미생물에 도입시키고 : 이렇게 하여 얻은 형질전환체를 회수가능한 양의 L-페닐알라닌이 배양 브로쓰내에 측적될　때까지 배지에서 배양하고; 그로부터 L-페닐알라닌을 회수함을 특징으로 하는 L-페닐알라닌의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 미생물이 L-트립토판 또는 L-티로신을 생산할 수 있는 능력을 가짐을 특징으로하는 제조방법.
  3. 제 1 항에 있어서, DNA 단편을 에스케리키아, 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속에 속하는 미생물로 부터 분리함을 특징으로 하는 제조방법.
  4. 코리네박테리움, 브레비박테리움 또는 에스케리키아 속에 속하는 미생물로 부터 분리되며,3-데옥시 -D-아라비노-헵투로소네이트-7-포스페이트 신타제, 코리스메이트 뮤타제 및 프래네이트 데히드라타제의 합성에 관여하는 모든 유전 정보를 갖고, 코리네박테리움 또는 브레비박테리움속에 속하는 미생물에게 페닐알라닌 유사체에 대한 내성을 부여할 수 있는 DNA 단편을 포함하는 재조합 DNA.
  5. 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속에 속하는 미생물로부터　분리되며,3-데옥시-p-아라비노-헵투로소네이트-7-포스페이트신타제, 코리스메이트 뮤타제 및 프레페네이트 데히드라타제의 합성에 관여하는 모든 유전 정보를 갖는 DNA 단편을 포함하는 재조합 DNA를 갖는 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속에 속하는 미생물.
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