JPS6265691A - 芳香族アミノ酸の製造法 - Google Patents
芳香族アミノ酸の製造法Info
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- JPS6265691A JPS6265691A JP60205104A JP20510485A JPS6265691A JP S6265691 A JPS6265691 A JP S6265691A JP 60205104 A JP60205104 A JP 60205104A JP 20510485 A JP20510485 A JP 20510485A JP S6265691 A JPS6265691 A JP S6265691A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- genus
- dna
- gene
- aromatic amino
- corynebacterium
- Prior art date
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- Pending
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
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- Biomedical Technology (AREA)
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- Molecular Biology (AREA)
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- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
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- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−へブツロソネ
ート−７−ホスフェートシンセターゼ（以下ＤＳと略す
）の合成に関与する漬格子を含むＤＮＡ断片とベクター
ＤＮＡとの組換え体ＤＮＡをコリネバクテリウド、属ま
たはプレビバクテリウト属に属する微生物に保有させ、
該微生物を培地中で培養し、培養物中に生成蓄積した芳
香族アミノ酸たとえばＬ−フェニルアラニンおよび１．
−トリプトファンを採取することを特徴とする芳香族ア
ミノ酸の製造法に関する。従って、本発明はバイオイン
ダストリーの産業分野に関し、特に医薬。
ート−７−ホスフェートシンセターゼ（以下ＤＳと略す
）の合成に関与する漬格子を含むＤＮＡ断片とベクター
ＤＮＡとの組換え体ＤＮＡをコリネバクテリウド、属ま
たはプレビバクテリウト属に属する微生物に保有させ、
該微生物を培地中で培養し、培養物中に生成蓄積した芳
香族アミノ酸たとえばＬ−フェニルアラニンおよび１．
−トリプトファンを採取することを特徴とする芳香族ア
ミノ酸の製造法に関する。従って、本発明はバイオイン
ダストリーの産業分野に関し、特に医薬。
食品工業において有用なＬ−フェニルアラニン。
１、−トリプトファンなどの芳香族アミノ酸の製造分野
に関する。
に関する。
従来の技術
］リネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
する微生物を用いた発酵法によるＬ−フェニルアラニン
またはＩ７−トリプトファンの製造法としては、アミノ
酸の栄養要求性変異やアミノ酸のアナログに対する耐性
変異あるいはそれらの変異を共有する菌株を用いる方法
が知られている〔農芸化学会誌、５０（１）ρ、Ｒ７９
（１９７６））。
する微生物を用いた発酵法によるＬ−フェニルアラニン
またはＩ７−トリプトファンの製造法としては、アミノ
酸の栄養要求性変異やアミノ酸のアナログに対する耐性
変異あるいはそれらの変異を共有する菌株を用いる方法
が知られている〔農芸化学会誌、５０（１）ρ、Ｒ７９
（１９７６））。
一方、生産性変異の付与による育種とは全く異なる組換
えＤＮＡ技術によるＬ−フェニルアラニンまたはＬ −
） ＩＪブトファンの生産菌が作成されており、Ｌ−フ
ェニルアラニンではコリスメートムターゼとプレフェネ
ートデヒドラターゼの遺伝子を、Ｌ−トリプトファンで
はアンスラニル酸シンセターセまたはアンスラニル酸フ
ォスホリボンルトランスフエラーゼの遺伝子を含む組換
え体ＤＮＡを用いた生産菌が知られている（特開昭６０
−２４１９２、特開昭５９−１５ ［’ｉ ２９２．特
開昭５９、−１９６０９８ ）。
えＤＮＡ技術によるＬ−フェニルアラニンまたはＬ −
） ＩＪブトファンの生産菌が作成されており、Ｌ−フ
ェニルアラニンではコリスメートムターゼとプレフェネ
ートデヒドラターゼの遺伝子を、Ｌ−トリプトファンで
はアンスラニル酸シンセターセまたはアンスラニル酸フ
ォスホリボンルトランスフエラーゼの遺伝子を含む組換
え体ＤＮＡを用いた生産菌が知られている（特開昭６０
−２４１９２、特開昭５９−１５ ［’ｉ ２９２．特
開昭５９、−１９６０９８ ）。
発明が解決しようとする問題点および解？Ｃ）ノコー吟
の手段 近年、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−）ＩＪブトファンな
どの芳香族アミノ酸の需要が増大するにつれてその製造
法の改善が強く望まれている。本発明者は、このような
状況を考慮し、組換えＤＮＡ技術を有効に活用し、すぐ
れた１、−フェニルアラニンおよびＬ−） ＩＪブトフ
ァン生産菌を造成するため鋭意研究を重ねた。その結果
、微生物のＤＳの遺伝情報を含む組換え体ＤＮＡをコリ
ネバクテリウム属またはプレビバクテリウト属菌種に導
入することにより、［７−フェニルアラニンおよびＩ４
−トリプトファンの生産性が改良されることを見出し、
本発明を完成するに至った。ＤＳの遺伝情報を含む組換
え体ＤＮＡが、１、−フェニルアラニンおよびＬ−）Ｉ
Ｊブトファンの生産性に寄与することは、本発明者らに
より初めて見出されたものである。
の手段 近年、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−）ＩＪブトファンな
どの芳香族アミノ酸の需要が増大するにつれてその製造
法の改善が強く望まれている。本発明者は、このような
状況を考慮し、組換えＤＮＡ技術を有効に活用し、すぐ
れた１、−フェニルアラニンおよびＬ−） ＩＪブトフ
ァン生産菌を造成するため鋭意研究を重ねた。その結果
、微生物のＤＳの遺伝情報を含む組換え体ＤＮＡをコリ
ネバクテリウム属またはプレビバクテリウト属菌種に導
入することにより、［７−フェニルアラニンおよびＩ４
−トリプトファンの生産性が改良されることを見出し、
本発明を完成するに至った。ＤＳの遺伝情報を含む組換
え体ＤＮＡが、１、−フェニルアラニンおよびＬ−）Ｉ
Ｊブトファンの生産性に寄与することは、本発明者らに
より初めて見出されたものである。
以下、本発明の詳細な説明する。
本発明によれば、芳香族アミノ酸の生合成に関与する酵
素ＤＳの合成に係る遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクター
ＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを保有するコリネバクテリウ
ム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物を培地
に培養し、培養物中に芳香族アミノ酸を生成蓄積させ、
該培養物から芳香族アミノ酸を採取することにより、芳
香族アミノ酸を製造することができる。芳香族アミノ酸
としてはＬ−フェニルアラニンおよびＬ−トリプトファ
ンが例示される。
素ＤＳの合成に係る遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクター
ＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを保有するコリネバクテリウ
ム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物を培地
に培養し、培養物中に芳香族アミノ酸を生成蓄積させ、
該培養物から芳香族アミノ酸を採取することにより、芳
香族アミノ酸を製造することができる。芳香族アミノ酸
としてはＬ−フェニルアラニンおよびＬ−トリプトファ
ンが例示される。
宿主微生物として用いるコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属に属する微生物としては、コリネ型
グルタミン酸生産菌として知られている微生物は全て用
いることができるが、好適には下記の菌株が用いられる
。
レビバクテリウム属に属する微生物としては、コリネ型
グルタミン酸生産菌として知られている微生物は全て用
いることができるが、好適には下記の菌株が用いられる
。
コリネバクテリウド・グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３
２コリネバクテリウム・アセトアシドフィラムＡＴＣＣ
１３８７０ コリネバクテリウム・ハーキュリス ＡＴＣＣ１３８６
Ｂコリネバクテリウム・リリウム ＡＴＣＣ１５９
９０ブレビバクテリウム・ディバリカラム ＡＴＣＣ１
４０２０ブレビバクテリウム・フラブム ＡＴＣＣ
１４０６７ブレビバクテリウム・イマリオフィラム ＾
ｒｃｆｆｌ ’１４０６８ブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタムＡＴ［：Ｃ１３８６９ ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ１９２
４０これらの菌株から変異誘導されたＬ−フェニルアラ
ニンまたはＬ−トリプトファン生産性菌株はさらに好ま
しい宿主として用いることができる。
２コリネバクテリウム・アセトアシドフィラムＡＴＣＣ
１３８７０ コリネバクテリウム・ハーキュリス ＡＴＣＣ１３８６
Ｂコリネバクテリウム・リリウム ＡＴＣＣ１５９
９０ブレビバクテリウム・ディバリカラム ＡＴＣＣ１
４０２０ブレビバクテリウム・フラブム ＡＴＣＣ
１４０６７ブレビバクテリウム・イマリオフィラム ＾
ｒｃｆｆｌ ’１４０６８ブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタムＡＴ［：Ｃ１３８６９ ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ１９２
４０これらの菌株から変異誘導されたＬ−フェニルアラ
ニンまたはＬ−トリプトファン生産性菌株はさらに好ま
しい宿主として用いることができる。
これら生産性変異株はアミノ酸要求性、アミノ酸アナロ
グ耐性あるいはこれを併用する菌株として取得すること
ができる。
グ耐性あるいはこれを併用する菌株として取得すること
ができる。
本発明において、ＤＳをコードする遺伝子の供給源とな
る微生物としては、芳香族アミノ酸の生合成において自
己栄養性の微生物であればいかなる微生物でもよい。と
りわけ、原核生物である細菌、たとえばエシェリシア属
、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ミク
ロバクテリウム属、バチルス属、スタフィロコッカス属
、ストレプトコッカス属またはセラチア属に属する菌株
のＤＳ遺伝子が望ましく、とくにこれらの細菌から誘導
された芳香族アミノ酸の生産性変異株由来の遺伝子が好
適である。
る微生物としては、芳香族アミノ酸の生合成において自
己栄養性の微生物であればいかなる微生物でもよい。と
りわけ、原核生物である細菌、たとえばエシェリシア属
、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ミク
ロバクテリウム属、バチルス属、スタフィロコッカス属
、ストレプトコッカス属またはセラチア属に属する菌株
のＤＳ遺伝子が望ましく、とくにこれらの細菌から誘導
された芳香族アミノ酸の生産性変異株由来の遺伝子が好
適である。
該ＤＮＡを組み込むためのベクターとしては、コリネバ
クテリウム属またはプレビバクテリウノ・属菌種牛で自
律複製できるものであれば特に限定されないが、例えば
本発明者らの開発に係るｐＣＧ １（特開昭５７−１３
４５００）、ｐｃＧ２ （特開昭５８−３５１９７）、
ｐｃＧ４．ｐｃＧｌｌ（いずれも特開昭５７−１８３
７９９ ） 、 ｐｃＥ５４、ｐＣＢ１０１ （イずれ
も特開昭５８−１０５９９９ ＞ 。
クテリウム属またはプレビバクテリウノ・属菌種牛で自
律複製できるものであれば特に限定されないが、例えば
本発明者らの開発に係るｐＣＧ １（特開昭５７−１３
４５００）、ｐｃＧ２ （特開昭５８−３５１９７）、
ｐｃＧ４．ｐｃＧｌｌ（いずれも特開昭５７−１８３
７９９ ） 、 ｐｃＥ５４、ｐＣＢ１０１ （イずれ
も特開昭５８−１０５９９９ ＞ 。
ｐｃＥ５１（特開昭６０−３４１９７ ）およびｐＣＥ
５２．ｐＣＥ５３ Ｃいずれもモレキュラー・アンド・
ジェネラル・ジェネティクス（Ｍｏｌ。
５２．ｐＣＥ５３ Ｃいずれもモレキュラー・アンド・
ジェネラル・ジェネティクス（Ｍｏｌ。
Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、） １９６ 、１７５ （１９８
４）］などのププラストを使用することができる。
４）］などのププラストを使用することができる。
ＤＳをコードする遺伝子を含む供与体ＤＮＡとベクター
ＤＮＡとの組換え体ＤＮＡは、試験管内で両ＤＮＡを制
限酵素で切断した後、Ｄ Ｎ Ａ ＩＪガーゼで処理す
るか、またはその切断末端をターミナルトランスフェラ
ーゼやＤＮＡポリメラーゼなどで処理した後、ＤＮＡリ
ガーゼを作用させて結合する常法〔メソッヅ・イン・エ
ンチモロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ） ６Ｂ （１９７９） 〕により種々の組換
え体温放物とともに生成させることができる。この混成
物を用いて、ＤＳをコードする遺伝子の欠失したコリネ
バクテリウム属またはプレビバクテリウノ、属の変異株
を形質転換し、欠損形質が相補された形質転換株を選択
し、この形質転換株の有するプラスミドを単離すること
にょって、ＤＳをコードする遺伝子を含む組換え体ＤＮ
Ａを取得できる。コリネバクテリウム属またはプレビバ
クテリウト属微生物の形質転換法としては、本発明者ら
が開発したプロトプラストを用いる方法（特開昭５７−
１８６４９２および特開昭５７−１８６４８９）により
実施することができる。
ＤＮＡとの組換え体ＤＮＡは、試験管内で両ＤＮＡを制
限酵素で切断した後、Ｄ Ｎ Ａ ＩＪガーゼで処理す
るか、またはその切断末端をターミナルトランスフェラ
ーゼやＤＮＡポリメラーゼなどで処理した後、ＤＮＡリ
ガーゼを作用させて結合する常法〔メソッヅ・イン・エ
ンチモロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ） ６Ｂ （１９７９） 〕により種々の組換
え体温放物とともに生成させることができる。この混成
物を用いて、ＤＳをコードする遺伝子の欠失したコリネ
バクテリウム属またはプレビバクテリウノ、属の変異株
を形質転換し、欠損形質が相補された形質転換株を選択
し、この形質転換株の有するプラスミドを単離すること
にょって、ＤＳをコードする遺伝子を含む組換え体ＤＮ
Ａを取得できる。コリネバクテリウム属またはプレビバ
クテリウト属微生物の形質転換法としては、本発明者ら
が開発したプロトプラストを用いる方法（特開昭５７−
１８６４９２および特開昭５７−１８６４８９）により
実施することができる。
コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌株
で直接組換え体ＤＮＡを選択する代わりに、例えば大腸
菌のように既に遺伝子組換え技術が確立している宿主・
ベクター系を用いることもできる。すなわち、供与体Ｄ
ＮＡとベクターＤＮＡの試験管内結合反応物を用いＤＳ
をコードする遺伝子が欠損した大腸菌の変異株を形質転
換し、欠損変異が相補された形質転換株を選択する。こ
の形質転換株からクローン化したＤＮＡとコリネバクテ
リウム属またはブレビバクテリウム属微生物のベクター
ＤＮＡとを取り出し、これを試験管内で制限酵素で切断
した後、ＤＮＡＩＪガーゼで再結合反応させる。この反
応物を用いてＤＳをコードする遺伝子の欠損したコリネ
バクテリウム属またはブレビバクテリウム属の変異株を
形質転換し、欠損変異が相補された形質転換株を選択す
る。この手段によっても同様に目的の組換え体ＤＮＡを
取得できる。
で直接組換え体ＤＮＡを選択する代わりに、例えば大腸
菌のように既に遺伝子組換え技術が確立している宿主・
ベクター系を用いることもできる。すなわち、供与体Ｄ
ＮＡとベクターＤＮＡの試験管内結合反応物を用いＤＳ
をコードする遺伝子が欠損した大腸菌の変異株を形質転
換し、欠損変異が相補された形質転換株を選択する。こ
の形質転換株からクローン化したＤＮＡとコリネバクテ
リウム属またはブレビバクテリウム属微生物のベクター
ＤＮＡとを取り出し、これを試験管内で制限酵素で切断
した後、ＤＮＡＩＪガーゼで再結合反応させる。この反
応物を用いてＤＳをコードする遺伝子の欠損したコリネ
バクテリウム属またはブレビバクテリウム属の変異株を
形質転換し、欠損変異が相補された形質転換株を選択す
る。この手段によっても同様に目的の組換え体ＤＮＡを
取得できる。
本発明で用いるＤＳをコードする遺伝子を含むＤＮＡの
具体的に好適な例としては、エシェリシア・コＩＪ Ｋ
−１２株のＤＳをコードする遺伝子があげられる。エシ
ェリシア・コリに一１２株はａｒｏＧ。
具体的に好適な例としては、エシェリシア・コＩＪ Ｋ
−１２株のＤＳをコードする遺伝子があげられる。エシ
ェリシア・コリに一１２株はａｒｏＧ。
ａｒｏＦおよびａｒｏｔｌ遺伝子にコードされる３種の
Ｏ８を有する〔バーバラ ジエイ、バックマン（Ｂａｒ
ｂａｒａＪ、Ｂａｃｈｍａｎｎ） ：マイクロバイオ
ロジカル・レビ５−（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｒｅｖ、）
郵、 ０） １８０〜２３０ （１９８３） ：］こと
が知られているが、ａｒｏＧおよびａｒｏＰ遺伝子を例
にあげて本発明をさらに詳細に説明する。
Ｏ８を有する〔バーバラ ジエイ、バックマン（Ｂａｒ
ｂａｒａＪ、Ｂａｃｈｍａｎｎ） ：マイクロバイオ
ロジカル・レビ５−（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｒｅｖ、）
郵、 ０） １８０〜２３０ （１９８３） ：］こと
が知られているが、ａｒｏＧおよびａｒｏＰ遺伝子を例
にあげて本発明をさらに詳細に説明する。
エシェリシア・コリに一１２株のａｒｏＧまたはａｒｏ
Ｆを含むＤＮＡ断片は大腸菌の宿主・ベクター系を用い
てあらかじめクローン化することができる。宿主大腸菌
で遺伝子をクローン化する方法は例えばメリッゾ・イン
・エンチモロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｂｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ） ６８ （１９７９年）に記載されている
。
Ｆを含むＤＮＡ断片は大腸菌の宿主・ベクター系を用い
てあらかじめクローン化することができる。宿主大腸菌
で遺伝子をクローン化する方法は例えばメリッゾ・イン
・エンチモロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｂｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ） ６８ （１９７９年）に記載されている
。
具体的には下記のように行う。
ＤＳの遺伝子の供給源となる染色体ＤＮＡは、ＤＳ活性
を有するエシェリシア・コＩＪＫ−１２株の培養菌体を
リゾチートおよび界面活性剤で処理して溶菌した後、除
蛋白し、ついでエタノールで沈殿させる常法〔バイオキ
ミカ・工・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、
Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ）７２．６１９（１９６３
） ）により単離できる。ベクターとしては、エシェリ
シア属に属する微生物で複製できるプラスミドであれば
いかなるものでも構わないが、例えば頻用されるｐＢＲ
３２２Ｃジーン（Ｇｅｎｅ）、 ２．９５（１９７５
）〕ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４［：いずれも
ジャーナル・オブＩハクテリオロジイ（Ｊ、 Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、） １３１ 。
を有するエシェリシア・コＩＪＫ−１２株の培養菌体を
リゾチートおよび界面活性剤で処理して溶菌した後、除
蛋白し、ついでエタノールで沈殿させる常法〔バイオキ
ミカ・工・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、
Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ）７２．６１９（１９６３
） ）により単離できる。ベクターとしては、エシェリ
シア属に属する微生物で複製できるプラスミドであれば
いかなるものでも構わないが、例えば頻用されるｐＢＲ
３２２Ｃジーン（Ｇｅｎｅ）、 ２．９５（１９７５
）〕ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４［：いずれも
ジャーナル・オブＩハクテリオロジイ（Ｊ、 Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、） １３１ 。
１１４１（１９７８）） 、ｐＧＡ２２ Ｃジャーナ
ル・オブ・バクテリオロジイ（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ、） １４０ 、４００（１９７９） 〕などを用い
ることができる。染色体ＤＮＡとプラスミドとの試験管
内組換えは、両者を制限酵素で切断したのちＤＮＡ リ
ガーゼで処理するか、あるいはその切断片をターミナル
トランスフェラーゼやＤＮＡポリメラーゼなどで処理し
たのちＤＮＡリガーゼを作用させて結合する前記の常法
により実施できる。この結合反応物を用いて、エンエリ
シア・コＩＪ Ｋ −１２株の有ずろ３種のＤＳ活性を
欠失した変異株（ａｒｏＧ、 ａｒｏＦおよびａｒｏＨ
遺伝子を欠損した変異株で生育に芳香族アミノ酸を要求
する）を形質転換し、芳香族アミノ酸非要求性となった
形質転換株を選択することによって、ＤＳをコードする
遺伝子（ａｒｏＧまたはａｒｏＦ ）をベクタープラス
ミド上にクローン化することができる。ここで用いる形
質転換法は、例えば低温下で塩化カルシウムで受容菌細
胞を処理してＤＮＡを細胞中にとり込ませる方法〔ジャ
ーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジイ（ＪｌＭｏ
ｌ、Ｄｉｏｌ、） ５３． １５９（１９７（１） ；
ジーン（Ｇｅｎｅ）、則、 ２３（１９７９）〕に従っ
て行うことができる。このようにして、ａｒｏＧ遺伝子
は、制限酵素Ｓａｌ ｌとＩＩ ｉ ｎｄ Ｊｌで切り
出される約６．０十「１ベース（ｋｈ）のｒ）ＮＡ断片
としてベクターｐＢＲ３２２−）−にクローン化できる
。また、ａｒｏｐ遺伝ｒは制限酵素ＲｃｏＲＩと１ｌｉ
ｎｄｌＴｌで切り出される約４．２キロベース（ｋｈ）
のＤＮＡ断片としてベクターｐＢＲ３２２＋にクローン
化できる。この４．２ｋｂのＤＮＡ断片上にはエシェリ
ジｒ・コリに一１２株の染色体−■−で隣接して存在す
るｔｙｒＡ遺伝子とｐｈｅＡ遺伝Ｊ’ Ｃマイクロバイ
」ロジカル・レビュー（Ｍｉｃｒｏｈｉｏｌ、 Ｒｅｖ
、） ４７ 、 （２） １８０（１９８３））が含ま
れているが、さらにａｒｏＦ遺伝子を別の制限酵素で切
り出し、再度ベクターと組換え、前記と同様に３種のＤ
Ｓをコードする遺伝子を欠損した変異株を形質転換し、
芳香族アミノ酸非要求性の形質転換株を選択することに
より、ａｒｏＦ遺伝子のみを含むＤＮＡ断片を取得でき
る。
ル・オブ・バクテリオロジイ（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ、） １４０ 、４００（１９７９） 〕などを用い
ることができる。染色体ＤＮＡとプラスミドとの試験管
内組換えは、両者を制限酵素で切断したのちＤＮＡ リ
ガーゼで処理するか、あるいはその切断片をターミナル
トランスフェラーゼやＤＮＡポリメラーゼなどで処理し
たのちＤＮＡリガーゼを作用させて結合する前記の常法
により実施できる。この結合反応物を用いて、エンエリ
シア・コＩＪ Ｋ −１２株の有ずろ３種のＤＳ活性を
欠失した変異株（ａｒｏＧ、 ａｒｏＦおよびａｒｏＨ
遺伝子を欠損した変異株で生育に芳香族アミノ酸を要求
する）を形質転換し、芳香族アミノ酸非要求性となった
形質転換株を選択することによって、ＤＳをコードする
遺伝子（ａｒｏＧまたはａｒｏＦ ）をベクタープラス
ミド上にクローン化することができる。ここで用いる形
質転換法は、例えば低温下で塩化カルシウムで受容菌細
胞を処理してＤＮＡを細胞中にとり込ませる方法〔ジャ
ーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジイ（ＪｌＭｏ
ｌ、Ｄｉｏｌ、） ５３． １５９（１９７（１） ；
ジーン（Ｇｅｎｅ）、則、 ２３（１９７９）〕に従っ
て行うことができる。このようにして、ａｒｏＧ遺伝子
は、制限酵素Ｓａｌ ｌとＩＩ ｉ ｎｄ Ｊｌで切り
出される約６．０十「１ベース（ｋｈ）のｒ）ＮＡ断片
としてベクターｐＢＲ３２２−）−にクローン化できる
。また、ａｒｏｐ遺伝ｒは制限酵素ＲｃｏＲＩと１ｌｉ
ｎｄｌＴｌで切り出される約４．２キロベース（ｋｈ）
のＤＮＡ断片としてベクターｐＢＲ３２２＋にクローン
化できる。この４．２ｋｂのＤＮＡ断片上にはエシェリ
ジｒ・コリに一１２株の染色体−■−で隣接して存在す
るｔｙｒＡ遺伝子とｐｈｅＡ遺伝Ｊ’ Ｃマイクロバイ
」ロジカル・レビュー（Ｍｉｃｒｏｈｉｏｌ、 Ｒｅｖ
、） ４７ 、 （２） １８０（１９８３））が含ま
れているが、さらにａｒｏＦ遺伝子を別の制限酵素で切
り出し、再度ベクターと組換え、前記と同様に３種のＤ
Ｓをコードする遺伝子を欠損した変異株を形質転換し、
芳香族アミノ酸非要求性の形質転換株を選択することに
より、ａｒｏＦ遺伝子のみを含むＤＮＡ断片を取得でき
る。
このようにクローニングされたａｒｏＧまたはａｒｏＦ
遺伝了含有ＤＮＡ断片とコリネバクテリウノ、属または
プレビバクテリウト属に属する微生物のベクタープラス
ミドとを制限酵素による切断およびＤ Ｎ Ａ ＩＪガ
ーゼによる結合により試験管内で組換えてコリネバクテ
リウム属またはプレビバクテリウｌ−属で複製可能な組
換え体プラスミドを作製できる。該ベクタープラスミド
としては、前述のｐＣＧ１、ｐＣＧ２．ｐｃＧ４．ｐｃ
ＧＩ Ｉ。
遺伝了含有ＤＮＡ断片とコリネバクテリウノ、属または
プレビバクテリウト属に属する微生物のベクタープラス
ミドとを制限酵素による切断およびＤ Ｎ Ａ ＩＪガ
ーゼによる結合により試験管内で組換えてコリネバクテ
リウム属またはプレビバクテリウｌ−属で複製可能な組
換え体プラスミドを作製できる。該ベクタープラスミド
としては、前述のｐＣＧ１、ｐＣＧ２．ｐｃＧ４．ｐｃ
ＧＩ Ｉ。
ｐ（Ｊ：５４．ｐｃＦ３１０］、ｐｃＥ５１．ｐＣＥ５
２およびｐＣＥ５３などが用いられろ。
２およびｐＣＥ５３などが用いられろ。
ａｒｏＧまたはａｒｏＦ遺伝子を含むＤＮＡ断片とベク
タープラスミドとの組換え体ＤＮＡは、試験管内組換え
混合物を用いて、通常の変宜操作によって誘導されるＤ
Ｓ酵素活性の欠失したコリネバクテリウム属またはプレ
ビハクテリウノ・属の芳香族−ｒミノ酸要求性変異株を
直接形質転換し、芳香族アミノ酸非要求性となった形質
転換株を選択することによって取得できる。特にｐＣＥ
５１のようなエシェリシア・コリとコリネバクテリウノ
・属またはブレビバクテリウム属徹生物との両方で複製
可能なシャトルベクターを使用ずろ場合は、前記のよう
にエシェリシア・コリの３種のＤＳをコードする遺伝子
の欠損変異株の相補性によりａｒｏＧまたａｒｏＦ遺伝
子をシャトルベクター−■―にサブクローン化し、その
後にコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属
に属する微生物に導入することもできる。これら微生物
に組換え体ＤＮＡを導入する形質転換法としては、前述
のプロトプラストを使用する方法（下記実施例を参照）
により実施することができる。
タープラスミドとの組換え体ＤＮＡは、試験管内組換え
混合物を用いて、通常の変宜操作によって誘導されるＤ
Ｓ酵素活性の欠失したコリネバクテリウム属またはプレ
ビハクテリウノ・属の芳香族−ｒミノ酸要求性変異株を
直接形質転換し、芳香族アミノ酸非要求性となった形質
転換株を選択することによって取得できる。特にｐＣＥ
５１のようなエシェリシア・コリとコリネバクテリウノ
・属またはブレビバクテリウム属徹生物との両方で複製
可能なシャトルベクターを使用ずろ場合は、前記のよう
にエシェリシア・コリの３種のＤＳをコードする遺伝子
の欠損変異株の相補性によりａｒｏＧまたａｒｏＦ遺伝
子をシャトルベクター−■―にサブクローン化し、その
後にコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属
に属する微生物に導入することもできる。これら微生物
に組換え体ＤＮＡを導入する形質転換法としては、前述
のプロトプラストを使用する方法（下記実施例を参照）
により実施することができる。
以−１−のようにして野性型ａｒｏ［ｉまたはａｒｏＦ
遺伝子をもつエシェリシア・コリの染色体ＤＮＡを供与
源とした場合には、野性型ａｒｏＧまたはａｒｏＦ遺伝
子を組換え体ＤＮＡとしてコリネバクテリウム属または
プレビバクテリウト属微生物に導入できる。
遺伝子をもつエシェリシア・コリの染色体ＤＮＡを供与
源とした場合には、野性型ａｒｏＧまたはａｒｏＦ遺伝
子を組換え体ＤＮＡとしてコリネバクテリウム属または
プレビバクテリウト属微生物に導入できる。
しかしながら、野性型ａｒｏＧまたはａｒｏＦ遺伝子が
コードする遺伝子産物ＤＳ合成は、エシェリシア・コリ
中で生産されるフェニルアラニンまたはチロシンにより
抑制され、またＤＳ活性は生産されるフェニルアラニン
またはチロノンで阻害されることが知られている〔ジャ
ーナル・オブ・バタテリオロジｄＪ、 Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、） １１５ 、１１３５（１９７３） 〕。
コードする遺伝子産物ＤＳ合成は、エシェリシア・コリ
中で生産されるフェニルアラニンまたはチロシンにより
抑制され、またＤＳ活性は生産されるフェニルアラニン
またはチロノンで阻害されることが知られている〔ジャ
ーナル・オブ・バタテリオロジｄＪ、 Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、） １１５ 、１１３５（１９７３） 〕。
従って、この抑制および阻害から解除された変異型ａｒ
ｏＧまたはａｒｏＦ遺伝子を導入する方が、コリネバク
テリウム属またはブレビバクテリウム属微生物に高いＬ
−フェニルアラニンまたはＬ−トリプトファン生産能を
付与できるので好ましい。変異型ａｒｏＧまたはａｒｏ
Ｐ遺伝子を導入するには、所望の変異を受けたａｒｏＧ
またはａｒｏＦ遺伝子を有するエシェリシア・コリ変異
株の染色体ＤＮＡを供与源として、野性型ａｒｏＧまた
はａｒｏＦ遺伝子を得たのと同様な方法で組換え体プラ
スミドを作製することにより果たされる。あるいは野性
型ａｒｏＧまたはａｒｏＦ遺伝子を含む組換え体プラス
ミドを保有する微生物をｉｎ ｖｉｖｏで変異処理する
か、組換え体プラスミドをｉｎ ｖｉｔｒｏで変異を誘
起し形質転換して変異型ａｒｏＧまたはａｒｏＦ遺伝子
を含む組換え体プラスミドを作成し、これを使用するこ
ともできる。
ｏＧまたはａｒｏＦ遺伝子を導入する方が、コリネバク
テリウム属またはブレビバクテリウム属微生物に高いＬ
−フェニルアラニンまたはＬ−トリプトファン生産能を
付与できるので好ましい。変異型ａｒｏＧまたはａｒｏ
Ｐ遺伝子を導入するには、所望の変異を受けたａｒｏＧ
またはａｒｏＦ遺伝子を有するエシェリシア・コリ変異
株の染色体ＤＮＡを供与源として、野性型ａｒｏＧまた
はａｒｏＦ遺伝子を得たのと同様な方法で組換え体プラ
スミドを作製することにより果たされる。あるいは野性
型ａｒｏＧまたはａｒｏＦ遺伝子を含む組換え体プラス
ミドを保有する微生物をｉｎ ｖｉｖｏで変異処理する
か、組換え体プラスミドをｉｎ ｖｉｔｒｏで変異を誘
起し形質転換して変異型ａｒｏＧまたはａｒｏＦ遺伝子
を含む組換え体プラスミドを作成し、これを使用するこ
ともできる。
野性型または変異型ａｒｏＧ、 ａｒｏＦ遺伝子を含む
組換え体プラスミドは前記のようなプロトプラストを用
いる形質転換法によりコリネバクテリウム属またはブレ
ビバクテリウム属微生物に導入できる。
組換え体プラスミドは前記のようなプロトプラストを用
いる形質転換法によりコリネバクテリウム属またはブレ
ビバクテリウム属微生物に導入できる。
これらの組換え体プラスミド保有株によるＩ、−フェニ
ルアラニンまたはＩ、−トリプトファンの生産は、従来
の発酵法によるこれらのアミノ酸の製造に用いられる培
養方法により行うことができる。
ルアラニンまたはＩ、−トリプトファンの生産は、従来
の発酵法によるこれらのアミノ酸の製造に用いられる培
養方法により行うことができる。
すなわち、該形質転換株を炭素源、窒素源、無機物、ア
ミノ酸、ビタミンなどを含有する通常の培地中、好気的
条件下、温度、ｐｌ＋などを調節しつつ培養を行えば、
培養物中にＬ−フェニルアラニンまたはＬ−） ＩＪブ
トファンが生成蓄積するのでこれを採取する。
ミノ酸、ビタミンなどを含有する通常の培地中、好気的
条件下、温度、ｐｌ＋などを調節しつつ培養を行えば、
培養物中にＬ−フェニルアラニンまたはＬ−） ＩＪブ
トファンが生成蓄積するのでこれを採取する。
炭素源としてはグルコース、グリセロール、フラクトー
ス、シュークロース、マルトース、マンノース、ｉｌ粉
、Ｓ粉加水分解液、糖蜜などの炭水化物、ポリアルコー
ル、ピルビン酸、フマール酸。
ス、シュークロース、マルトース、マンノース、ｉｌ粉
、Ｓ粉加水分解液、糖蜜などの炭水化物、ポリアルコー
ル、ピルビン酸、フマール酸。
ｌＬ酸、酢酸などの各種有機酸が使用できる。さらに微
生物の資化性によって、炭化水素、アルコール類なども
用いられる。特に廃糖蜜は好適に用いられろ。
生物の資化性によって、炭化水素、アルコール類なども
用いられる。特に廃糖蜜は好適に用いられろ。
窒素源としてはアンモニアまたは塩化アンモニウム、硫
酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム
などの各種無機および有機アンモニラｌ、塩類あるいは
尿素および他の窒素含有物質ならびにペプトン、ＮＺ−
アミン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・リ
カー、カゼイン加水分解物、フィツシュミールまたはそ
の消化物。
酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム
などの各種無機および有機アンモニラｌ、塩類あるいは
尿素および他の窒素含有物質ならびにペプトン、ＮＺ−
アミン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・リ
カー、カゼイン加水分解物、フィツシュミールまたはそ
の消化物。
輛加水分解物などの窒素含有有機物など種々のものが使
用可能である。
用可能である。
さらに無機物としては、リン酸第−水素カリウム、リン
酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム。
酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム。
塩化アンモニラｌ２．硫酸マグネシウム、塩化ナトリウ
ム、硫酸第一鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウドな
どを使用する。微生物の生育に必要とするビタミン、ア
ミノ酸源などは、前記したような他の培地成分によって
培地に供給されれば特に加えなくてもよい。
ム、硫酸第一鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウドな
どを使用する。微生物の生育に必要とするビタミン、ア
ミノ酸源などは、前記したような他の培地成分によって
培地に供給されれば特に加えなくてもよい。
培養は振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件下
に行う。培養温度は一般に２０〜４０℃が好適である。
に行う。培養温度は一般に２０〜４０℃が好適である。
培地のｐＨは中性付近に維持することが望ましい。培養
期間は通常１〜５日間で培地中にＬ−フェニルアラニン
またはＬ−トリプトファンが蓄積する。培養終了後、菌
体を除去して活性炭処理、イオン交換樹脂処理などの公
知の方法で培養液からＬ−フェニルアラニンまたはＩ、
−トリプトファンが回収されろ。
期間は通常１〜５日間で培地中にＬ−フェニルアラニン
またはＬ−トリプトファンが蓄積する。培養終了後、菌
体を除去して活性炭処理、イオン交換樹脂処理などの公
知の方法で培養液からＬ−フェニルアラニンまたはＩ、
−トリプトファンが回収されろ。
こうしてａｒｏＧまたはａｒｏＦ遺伝子を含む組換え体
ＤＮＡを保有させたコリネバクテリウド・属またはブレ
ビバクテリウム属菌株を用いることにより、高い収率で
Ｌ−フェニルアラニンまたはＩ７−トリプトファンを生
産することができる。
ＤＮＡを保有させたコリネバクテリウド・属またはブレ
ビバクテリウム属菌株を用いることにより、高い収率で
Ｌ−フェニルアラニンまたはＩ７−トリプトファンを生
産することができる。
本発明の有用性は、微生物由来のＤＳをコードする遺伝
子を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮ
Ａをコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属
菌種に導入すればＩ７−フェニルアラニンまたはＩ７−
トリプトファンの生産能を強化できる点にある。本発明
ではエシェリシア・コリのＤＳをコードする遺伝子であ
るａｒｏＧとａｒｏＦを用いる例を示したが、代わりに
他の微生物のＤＳをコードする遺伝子を用いても目的が
達成される。それゆえ、ＤＳをコードする遺伝子は本発
明で例示した大腸菌のＤＳをコードする遺伝子に限定さ
れるものではない。またベクタープラスミドは組換え体
として連結されたＤＳをコードする遺伝子を安定に遺伝
させるために、その自律複製能を提供しているにすぎな
い。従って、本発明に例示したｐｃＥ５１やｐＣＥ５３
に限らず、コリネバクテリウム属またはプレビパクテリ
ム属で自律複製できるプラスミドも本発明方法のプラス
ミドに包括される。
子を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮ
Ａをコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属
菌種に導入すればＩ７−フェニルアラニンまたはＩ７−
トリプトファンの生産能を強化できる点にある。本発明
ではエシェリシア・コリのＤＳをコードする遺伝子であ
るａｒｏＧとａｒｏＦを用いる例を示したが、代わりに
他の微生物のＤＳをコードする遺伝子を用いても目的が
達成される。それゆえ、ＤＳをコードする遺伝子は本発
明で例示した大腸菌のＤＳをコードする遺伝子に限定さ
れるものではない。またベクタープラスミドは組換え体
として連結されたＤＳをコードする遺伝子を安定に遺伝
させるために、その自律複製能を提供しているにすぎな
い。従って、本発明に例示したｐｃＥ５１やｐＣＥ５３
に限らず、コリネバクテリウム属またはプレビパクテリ
ム属で自律複製できるプラスミドも本発明方法のプラス
ミドに包括される。
グルタミン酸高生産能を有するいわゆるグルタミン酸生
産菌は、主な菌学的性質を同じくしているにもかかわら
ず、産業ｊ１の重要性から、各研究者により、種々の菌
名が付されており、属名までも、コリネバクテリウド・
属またはブレビバクテリウム属など、種々である。しか
しながら、これらの菌群は、細胞壁のアミノ酸構成やＤ
ＮＡの塩基組成が画一的であることから、同一の菌種で
あることが指摘されていた。さらに、最近、これらの菌
種間には、７０〜８０％以上のＤＮＡの相同性があるこ
とが明らかにされ、非常に近縁な微生物であることが明
白である。
産菌は、主な菌学的性質を同じくしているにもかかわら
ず、産業ｊ１の重要性から、各研究者により、種々の菌
名が付されており、属名までも、コリネバクテリウド・
属またはブレビバクテリウム属など、種々である。しか
しながら、これらの菌群は、細胞壁のアミノ酸構成やＤ
ＮＡの塩基組成が画一的であることから、同一の菌種で
あることが指摘されていた。さらに、最近、これらの菌
種間には、７０〜８０％以上のＤＮＡの相同性があるこ
とが明らかにされ、非常に近縁な微生物であることが明
白である。
〔コマツ ワイ（Ｋｏｍａｔｓｕ Ｙ、） ニレポート
オブザ ファーメンテイティブ リサーチ インステ
ィチュート（Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｅｒｍｅ
ｎｔａｔｉｖｅ Ｒｅ５ｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ
） 、 Ｎｏ、５５． １ （１９８０）およびスズキ
ケイ、。
オブザ ファーメンテイティブ リサーチ インステ
ィチュート（Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｅｒｍｅ
ｎｔａｔｉｖｅ Ｒｅ５ｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ
） 、 Ｎｏ、５５． １ （１９８０）およびスズキ
ケイ、。
カネコ ティ、、：］−／ガタ ケイ（Ｓｕｚｕｋｉ、
Ｋ、 、 Ｋａｎｅｋｏ。
Ｋ、 、 Ｋａｎｅｋｏ。
Ｔ、、 ａｎｄ Ｋｏｍａｇａｔａ、 Ｋ、） ：イ
ンターナンヨナルジャーナル オブ システマティック
バクテリオロジイ（Ｉｎｔ、 Ｊ ５ｙｓｔ、 Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ、） 、 ３１．１３１（１９８１）
参照〕。
ンターナンヨナルジャーナル オブ システマティック
バクテリオロジイ（Ｉｎｔ、 Ｊ ５ｙｓｔ、 Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ、） 、 ３１．１３１（１９８１）
参照〕。
本発明書では、コリネバクテリウム・グルタミクムにＤ
Ｓ遺伝子の組換え体を導入し、１７−フェニルアラニン
またはＬ−トリプトファン生産性の向上について例示し
たが、上記の事実を踏まえればグルタミン酸生産菌全般
での効果が容易に類推される。その効果の有無は組換え
体ＤＮＡがグルタミン酸生産菌全般で自律的に複製し、
Ｉ）Ｓをコードする遺伝子が形質発現できるか否かに係
わり、グルタミン酸生産菌間のＤＮＡ相同性などにおけ
る若干の相違は何ら関係ない。しかるにこれらの菌種が
プラスミドの複製と遺伝子発現に係わる機能を等しく保
持していることは、特開昭５７−１８３７９９に開示し
たコリネバクテリウム・グルタミクム２２５−２５０株
から分離され、スペクチノマイシンおよび／またはスト
レプトマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドｐｃｃ４
がコリネバクテリウム属およびプレビバクテリウｌ、属
菌種などグルタミン酸生産菌内で同じく複製でき、また
その耐性遺伝子が発現されろ（特開昭５７−１８６４９
２）ことから明らかである。従って、本発明のＤＳをコ
ードする遺伝子を含む絹換え体ｒ）ＮΔを導入ずろこと
によるＩ７−フェニルアラニンおよびｌ−） ＩＪブト
ファン生産菌の作製法を適用し得る菌種は、コリネバク
テリウド・グルタミクトに限らずコリネバクテリウｌ、
属およびプレビバクテリウノ、属菌種を含むグルタミン
酸生産菌全てが含まれる。
Ｓ遺伝子の組換え体を導入し、１７−フェニルアラニン
またはＬ−トリプトファン生産性の向上について例示し
たが、上記の事実を踏まえればグルタミン酸生産菌全般
での効果が容易に類推される。その効果の有無は組換え
体ＤＮＡがグルタミン酸生産菌全般で自律的に複製し、
Ｉ）Ｓをコードする遺伝子が形質発現できるか否かに係
わり、グルタミン酸生産菌間のＤＮＡ相同性などにおけ
る若干の相違は何ら関係ない。しかるにこれらの菌種が
プラスミドの複製と遺伝子発現に係わる機能を等しく保
持していることは、特開昭５７−１８３７９９に開示し
たコリネバクテリウム・グルタミクム２２５−２５０株
から分離され、スペクチノマイシンおよび／またはスト
レプトマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドｐｃｃ４
がコリネバクテリウム属およびプレビバクテリウｌ、属
菌種などグルタミン酸生産菌内で同じく複製でき、また
その耐性遺伝子が発現されろ（特開昭５７−１８６４９
２）ことから明らかである。従って、本発明のＤＳをコ
ードする遺伝子を含む絹換え体ｒ）ＮΔを導入ずろこと
によるＩ７−フェニルアラニンおよびｌ−） ＩＪブト
ファン生産菌の作製法を適用し得る菌種は、コリネバク
テリウド・グルタミクトに限らずコリネバクテリウｌ、
属およびプレビバクテリウノ、属菌種を含むグルタミン
酸生産菌全てが含まれる。
以下に本発明の実施例を示す。
実施例１゜
（１）染色体ＤＮＡとプラスミドＤＮＡの調製：エシェ
リシア・コリ、ＩΔ１９４株［プロシーディング・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス（Ｐ
ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、）。
リシア・コリ、ＩΔ１９４株［プロシーディング・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス（Ｐ
ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、）。
財、 ４８７−４９１（１９７７） ：ｌの染色体ＤＮ
Ａを以下の方法で調製した。
Ａを以下の方法で調製した。
４００ｍＭのＩ、−ｂｒｏｔｈ 培地（バンド・トリプ
トン１０ｇ、バンド・イースト・エキス５ｇ。
トン１０ｇ、バンド・イースト・エキス５ｇ。
ＮａＣ１５ｇを水ｌ！に含み、ｐｌ＋７．０に調整した
培地、以下ＬＢ培地と呼ぶ）に種培養を接種して、３７
℃で振盪培養し、対数後期まで生育させた。培養液から
菌体を集菌し、集菌した菌体から斎藤らの方法〔バイオ
キミカ・工・ハイオフィジカ・アクタ（口ｉｏｃｈｅｍ
、ｒｌｉｏｐｈｙｓ、八ｃｔａ）。
培地、以下ＬＢ培地と呼ぶ）に種培養を接種して、３７
℃で振盪培養し、対数後期まで生育させた。培養液から
菌体を集菌し、集菌した菌体から斎藤らの方法〔バイオ
キミカ・工・ハイオフィジカ・アクタ（口ｉｏｃｈｅｍ
、ｒｌｉｏｐｈｙｓ、八ｃｔａ）。
７２ ６１９（１９６３） 〕に従って高分子染色体Ｄ
ＮＡを単離した。
ＮＡを単離した。
ベクターとして用いるｐＢＦ、！３３２は、次の方法で
その保有株エシェリシア・コリＪＡＩ９４株の培養菌体
から単離した。
その保有株エシェリシア・コリＪＡＩ９４株の培養菌体
から単離した。
アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む４ ｎ Ｏｍｌの
ＬＢ培地に種培養を接種し、３７℃で振盪培養し、対数
後期まで生育させた。培養液上り集菌後、菌体を、国中
らの方法〔ジャーナル・４ブ・バタテリオロジイ（Ｊ、
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １２１ 、３５４−３６２
（＋９７５） ］に従い溶菌した。得られた溶菌液を
、２８．０００ｒｐｍ、 ４℃で１時間遠心し、−？−
？ｎを採取した。上清に１１５容の５０％（Ｗ／Ｖ）ポ
リエチレングリコール（Ｐ Ｅ Ｇ ） ６０００水溶
液を加え、ゆるやかに混合した後、４℃で一夜放置した
。生じた沈殿を、４℃、３０００ｒｐｍ、 ５分間の遠
心で集め、５ｍＭのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
・ＨＣＩ！、 １ｍＭ Ｅ ＤＴＡ−Ｎ ａ２ｐ
ｆ１７．５）に溶解し、１．５ ｍｇ ／ｍｌａ度のエ
チジウムブロマイド１ｍｌを加え、さらにＴＥ緩衝液で
正確に７５ｍ１とした。この溶液に、Ｃｓ Ｃ（！ ７
．８７５ｇを加え、完全に溶解した後、１０５．０００
ｘ ｇ 、 ２０℃、４０時間遠心した。紫外線照射
下検出されるプラスミドバンドを、注射器でぬき取り、
１５％（Ｖ／Ｖ）のＴＥ緩衝液を含むイソプロパツール
で、エチジウムブロマイドを３回抽出した後、４℃で−
夜ＴＥ緩衝液に対して透析し、透析液をプラスミドＤＮ
Ａとして用いた。
ＬＢ培地に種培養を接種し、３７℃で振盪培養し、対数
後期まで生育させた。培養液上り集菌後、菌体を、国中
らの方法〔ジャーナル・４ブ・バタテリオロジイ（Ｊ、
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １２１ 、３５４−３６２
（＋９７５） ］に従い溶菌した。得られた溶菌液を
、２８．０００ｒｐｍ、 ４℃で１時間遠心し、−？−
？ｎを採取した。上清に１１５容の５０％（Ｗ／Ｖ）ポ
リエチレングリコール（Ｐ Ｅ Ｇ ） ６０００水溶
液を加え、ゆるやかに混合した後、４℃で一夜放置した
。生じた沈殿を、４℃、３０００ｒｐｍ、 ５分間の遠
心で集め、５ｍＭのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
・ＨＣＩ！、 １ｍＭ Ｅ ＤＴＡ−Ｎ ａ２ｐ
ｆ１７．５）に溶解し、１．５ ｍｇ ／ｍｌａ度のエ
チジウムブロマイド１ｍｌを加え、さらにＴＥ緩衝液で
正確に７５ｍ１とした。この溶液に、Ｃｓ Ｃ（！ ７
．８７５ｇを加え、完全に溶解した後、１０５．０００
ｘ ｇ 、 ２０℃、４０時間遠心した。紫外線照射
下検出されるプラスミドバンドを、注射器でぬき取り、
１５％（Ｖ／Ｖ）のＴＥ緩衝液を含むイソプロパツール
で、エチジウムブロマイドを３回抽出した後、４℃で−
夜ＴＥ緩衝液に対して透析し、透析液をプラスミドＤＮ
Ａとして用いた。
（２） ａ ｒ ｏ Ｇ遺伝子のクローン化：」−記
で調製したプラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡ３μｇを含む
制限酵素Ｈｉ ｎ ｄ Ｉｎ反応液（１０ｍＭＴｒｉｓ
−）（（１，６ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、５０ｍＭＮａＣ
Ｒ，ｐＨ７，５） Ｉ ００ａＱに５単位のｔｌｉｎ
ｄＴＩ（宝酒造社製）を、また染色体ＤＮＡ９μｇを含
む制限酵素１１ｉｎ［１反応液１００μＱに５眼位の旧
ｎｄＴＩＴを加え、それぞれ３７℃で６０分間反応させ
た。
で調製したプラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡ３μｇを含む
制限酵素Ｈｉ ｎ ｄ Ｉｎ反応液（１０ｍＭＴｒｉｓ
−）（（１，６ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、５０ｍＭＮａＣ
Ｒ，ｐＨ７，５） Ｉ ００ａＱに５単位のｔｌｉｎ
ｄＴＩ（宝酒造社製）を、また染色体ＤＮＡ９μｇを含
む制限酵素１１ｉｎ［１反応液１００μＱに５眼位の旧
ｎｄＴＩＴを加え、それぞれ３７℃で６０分間反応させ
た。
両反応液に２Ｍ ＮａＣβを５μＱおよび５単位の５
ａｆｌ（宝酒造社製）を加え、３７℃でさらに６０分間
反応させた。反応後、６５℃で１０分間加熱して反応を
停止ｌ−させた。両反応液を混合後、この混合物にＴ４
１Ｊガーゼ用緩衝液（トリス６６０ｍＭ ＭｇＣｌ２
６６ｍＭ、ジチオスレイトール１００ｍＭ、 ｐＨ１７
，５） ４０μＬΔＴＰ（５ｍＭ） ４０ａＱ、 Ｔ
４リガーゼ（宝酒造社製。
ａｆｌ（宝酒造社製）を加え、３７℃でさらに６０分間
反応させた。反応後、６５℃で１０分間加熱して反応を
停止ｌ−させた。両反応液を混合後、この混合物にＴ４
１Ｊガーゼ用緩衝液（トリス６６０ｍＭ ＭｇＣｌ２
６６ｍＭ、ジチオスレイトール１００ｍＭ、 ｐＨ１７
，５） ４０μＬΔＴＰ（５ｍＭ） ４０ａＱ、 Ｔ
４リガーゼ（宝酒造社製。
１単位／ρ）０．４μｇおよび１１２０１１０ｇｇを加
え、４℃で２４時間反応させた。
え、４℃で２４時間反応させた。
このリガーゼ反応混合物を形質転換に供する。
形質転換に供する受容菌として、ＤＳをコードする遺伝
子を欠損したエシェリシア・コリＡ３３２４８株［ジャ
ーナル・オブ・バタテリオロジイ（Ｊ、 Ｂａｃｔ、）
９２ 、 ２３７〜２４４（１９６７） 〕Ｃ昭和６
０年８月８日付で工業技術院微生物工業技術研究所（微
工研）にＦＥＲＭ ＢＰ−８６５として寄託されてい
る〕を用いた。本閑の一夜培養液を、ＬＢ培地に植菌し
、Ｍ、 Ｑａｇｅｒｔ らの方法〔ジーン（Ｇｅｎｅ）
、 ６ 、２３〜２８（１９７９） ：ｌに従って、
コンピテントな細胞を調整した。
子を欠損したエシェリシア・コリＡ３３２４８株［ジャ
ーナル・オブ・バタテリオロジイ（Ｊ、 Ｂａｃｔ、）
９２ 、 ２３７〜２４４（１９６７） 〕Ｃ昭和６
０年８月８日付で工業技術院微生物工業技術研究所（微
工研）にＦＥＲＭ ＢＰ−８６５として寄託されてい
る〕を用いた。本閑の一夜培養液を、ＬＢ培地に植菌し
、Ｍ、 Ｑａｇｅｒｔ らの方法〔ジーン（Ｇｅｎｅ）
、 ６ 、２３〜２８（１９７９） ：ｌに従って、
コンピテントな細胞を調整した。
コンピテントな細胞１０９／ｍｌを含む液０．２ｍｌに
リガーゼ反応混合物５０μｇを加え、水冷下１０分間放
置した。次いで３７℃で５分間熱処理した後、ＬＢ培地
２ｍｌを加え、３７℃で９０〜１２０分間静置した。そ
の後、菌体を生理食塩水で２回遠心洗浄後、各々５０μ
ｍ ／ｍｌのヒスチジン。
リガーゼ反応混合物５０μｇを加え、水冷下１０分間放
置した。次いで３７℃で５分間熱処理した後、ＬＢ培地
２ｍｌを加え、３７℃で９０〜１２０分間静置した。そ
の後、菌体を生理食塩水で２回遠心洗浄後、各々５０μ
ｍ ／ｍｌのヒスチジン。
プロリン、アルギニン、イソロイシン、バリンを含むＭ
９平板培地（ブドウ糖２ｇ 、 ＮＨ４ＣＲＩｇ、Ｎａ
２ＨＰＯ４６ｇ、ＫＨ２ＰＯ４３ｇ。
９平板培地（ブドウ糖２ｇ 、 ＮＨ４ＣＲＩｇ、Ｎａ
２ＨＰＯ４６ｇ、ＫＨ２ＰＯ４３ｇ。
Ｍｇ ＳＯ４’ ７８２００．１ｇ、ＣａＣＣ・２ Ｈ
２Ｏ１５ｍｇ、サイアミン塩酸塩４ｍｇおよび寒天１５
ｇを水１１に含み、ｐＨ７，２に調整した培地）に塗布
した。Ｍ９平板培地に生育しタコロニーヲ各々アンピシ
リン１００μｇ／ｍ１゜テトラサイクリン２０μｇ７ｍ
ｌを含むＬＢ平板培地に塗布し、アンピシリン含有培地
で生育し、テトラサイクリン含有培地で生育しないコロ
ニ−を選択した。
２Ｏ１５ｍｇ、サイアミン塩酸塩４ｍｇおよび寒天１５
ｇを水１１に含み、ｐＨ７，２に調整した培地）に塗布
した。Ｍ９平板培地に生育しタコロニーヲ各々アンピシ
リン１００μｇ／ｍ１゜テトラサイクリン２０μｇ７ｍ
ｌを含むＬＢ平板培地に塗布し、アンピシリン含有培地
で生育し、テトラサイクリン含有培地で生育しないコロ
ニ−を選択した。
このようにして選択したヒスチジン、プロリン、アルギ
ニン、イソロイシン、バリンヲ含ムＭ９平板培地で生育
し、アンピシリン耐性、テトラサイクリン感受性の形質
転換株より前記と同様にして、プラスミドＩ）Ｎ Ａを
単離した。形質転換株の一株から得たプラスミドｐＡＲ
ｎＧ １を各種制限酵素で消化後、アガロースゲル電気
泳動で解析した結果、ｐＢＲ３２２の旧ｎｄｌｌｌと５
ａｆｌの間の領域に約６Ｋｈの１ｌｉｎｄｌＴｌ −Ｓ
ａ Ｒｌ切断ＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドである
ことが判明した。
ニン、イソロイシン、バリンヲ含ムＭ９平板培地で生育
し、アンピシリン耐性、テトラサイクリン感受性の形質
転換株より前記と同様にして、プラスミドＩ）Ｎ Ａを
単離した。形質転換株の一株から得たプラスミドｐＡＲ
ｎＧ １を各種制限酵素で消化後、アガロースゲル電気
泳動で解析した結果、ｐＢＲ３２２の旧ｎｄｌｌｌと５
ａｆｌの間の領域に約６Ｋｈの１ｌｉｎｄｌＴｌ −Ｓ
ａ Ｒｌ切断ＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドである
ことが判明した。
さらに、この１ｌｉｎｄｒ［−３ａ Ｒｌ切断ＤＮＡ断
片は、Ｗ、Ｄ、 ｎａｖｉｅｓらの報告している〔ヌク
レイツク・アシッヅ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄ
ｓ Ｒｅｓ、）１０、４０４５（１９８２）：ｌ ａｒ
ｏＧ遺伝子と同一の制限酵素切断点を有しており（第１
図参照）、またｐＡＲＯＧ ｌを有するエシェリシア・
コリＡ３３２４１Ｈ＊はフェニルアラニン５００μｇ／
ｍｌを含むＭ９平板培地でその生育がほぼ完全に阻害さ
れたことから、ｐＡＲ１］Ｇ １に挿入されている約６
ＫｂのＤＮＡ断片」−にはエシェリシア・コリのａｒｏ
Ｇ遺伝子が存在することが判明した。
片は、Ｗ、Ｄ、 ｎａｖｉｅｓらの報告している〔ヌク
レイツク・アシッヅ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄ
ｓ Ｒｅｓ、）１０、４０４５（１９８２）：ｌ ａｒ
ｏＧ遺伝子と同一の制限酵素切断点を有しており（第１
図参照）、またｐＡＲＯＧ ｌを有するエシェリシア・
コリＡ３３２４１Ｈ＊はフェニルアラニン５００μｇ／
ｍｌを含むＭ９平板培地でその生育がほぼ完全に阻害さ
れたことから、ｐＡＲ１］Ｇ １に挿入されている約６
ＫｂのＤＮＡ断片」−にはエシェリシア・コリのａｒｏ
Ｇ遺伝子が存在することが判明した。
（３） ａ ｒ ｏ Ｇ遺伝子のシャトルベクターｐ
ｃＥ５１へのサブクローン化： 上記で調製したプラスミドｐＡＲＯＧ １より、ａｒｏ
Ｇ遺伝子部分のＤＮＡ断片を取得し、エシェリシア・コ
リとコリネバクテリウド・グルタミクムとのシャトルベ
クターｐｃＥ５１に連結する。
ｃＥ５１へのサブクローン化： 上記で調製したプラスミドｐＡＲＯＧ １より、ａｒｏ
Ｇ遺伝子部分のＤＮＡ断片を取得し、エシェリシア・コ
リとコリネバクテリウド・グルタミクムとのシャトルベ
クターｐｃＥ５１に連結する。
ｐｃＥ５１は特開昭５７、、−１３４５００に開示した
コリネバクテリウム・グルクミクｌ、のプラスミドｐｃ
Ｇｌとエシェリシア・コリのプラスミドｐＧＡ２２（ジ
ャーナル・オブ・ハタテリオロジイ（Ｊ、 Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、）皿、 ４００（１９７９））を連結せし
めたプラスミドである。詳しくは、特開昭５８−１４２
８０４に記載されているがｐｃＧｌ−Ｌに１カ所しかな
いＢｇｌ切断部位とｐＧＡ２２のカナマイシン耐性遺伝
子を含む方のＢａｍＨ１断片とを両制限酵素の同一接着
末端を利用して連結したものである。
コリネバクテリウム・グルクミクｌ、のプラスミドｐｃ
Ｇｌとエシェリシア・コリのプラスミドｐＧＡ２２（ジ
ャーナル・オブ・ハタテリオロジイ（Ｊ、 Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、）皿、 ４００（１９７９））を連結せし
めたプラスミドである。詳しくは、特開昭５８−１４２
８０４に記載されているがｐｃＧｌ−Ｌに１カ所しかな
いＢｇｌ切断部位とｐＧＡ２２のカナマイシン耐性遺伝
子を含む方のＢａｍＨ１断片とを両制限酵素の同一接着
末端を利用して連結したものである。
プラスミドｐＡＲＯｃ；ＩＤＮＡ３μｇを含む制限酵素
Ｈｐａ Ｉ反応液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ。
Ｈｐａ Ｉ反応液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ。
５ｍＭ ＭｇＣβ２ 、 １０ｍ）Ｊ Ｎａ（１！
、ｐＨ７，５）１００μｇに５単位のＨｐａｌ（宝酒造
社製）を加え、３７℃で６０分間反応させた。この反応
液に２ＭＮａＣｆ ５威および５単位のＮｒｕ １（宝
酒造社製）を加え、３７℃でさらに６０分間反応させた
。
、ｐＨ７，５）１００μｇに５単位のＨｐａｌ（宝酒造
社製）を加え、３７℃で６０分間反応させた。この反応
液に２ＭＮａＣｆ ５威および５単位のＮｒｕ １（宝
酒造社製）を加え、３７℃でさらに６０分間反応させた
。
一方、ｐｃＥ５１を保有するエシェリシア・コＩＪ Ｊ
Δ１９４株より前記と同様にして調製したプラスミドｐ
ｃＥ５１ ＤＮΔ３μｇを含む制限酵素ＥｃｏＲＶ反
応液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＮ。
Δ１９４株より前記と同様にして調製したプラスミドｐ
ｃＥ５１ ＤＮΔ３μｇを含む制限酵素ＥｃｏＲＶ反
応液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＮ。
６ｍＭ ＭｇＣｆ、 、 １５０ｍＭ ＮａＣｆ
ｆ、ｐｉｔ７．５）１００ＪｉＱに５単位のＥＣ０ＲＶ
（宝酒造社製）を加え、３７℃で６０分間反応させた
。
ｆ、ｐｉｔ７．５）１００ＪｉＱに５単位のＥＣ０ＲＶ
（宝酒造社製）を加え、３７℃で６０分間反応させた
。
反応後、いずれも６５℃で１０分間加熱して反応を停止
させた。両反応液を混合後、この混合物にＴ４リガーゼ
用緩衝液４０ＡＩ！、 ＡＴＰ （５ｍＭ）４０ρ、Ｔ
４リガーゼ（宝酒造社製 １単位／ρ）０．４ｍおよび
Ｈ２Ｏ１１５μＱを加え、４℃で２４時間反応させた。
させた。両反応液を混合後、この混合物にＴ４リガーゼ
用緩衝液４０ＡＩ！、 ＡＴＰ （５ｍＭ）４０ρ、Ｔ
４リガーゼ（宝酒造社製 １単位／ρ）０．４ｍおよび
Ｈ２Ｏ１１５μＱを加え、４℃で２４時間反応させた。
このリガーゼ反応混合物を用い、前記と同様に、エシェ
リシア・コリＡ８３２４８株を形質転換し、菌体を各々
５０μｇ／ｍｌのヒスチジン。
リシア・コリＡ８３２４８株を形質転換し、菌体を各々
５０μｇ／ｍｌのヒスチジン。
プロリン、アルギニン、イソロイシン、バリンを含むＭ
９平板培地に塗布した。
９平板培地に塗布した。
Ｍ９平板培地に生育したコロニーを各々アンピシリン１
００■／ｍ１．テトラサイクリン２０μｇ／ｍｌ 、カ
ナマイシン２０μｇ／ｍｌを含むＬＢ平板培地に塗布し
、カナマイシン含有培地で生育し、アンピンリン、テト
ラサイクリン含有培地で生育てきないコロニーを選択し
た。
００■／ｍ１．テトラサイクリン２０μｇ／ｍｌ 、カ
ナマイシン２０μｇ／ｍｌを含むＬＢ平板培地に塗布し
、カナマイシン含有培地で生育し、アンピンリン、テト
ラサイクリン含有培地で生育てきないコロニーを選択し
た。
このように選択した形質転換株より、前記と同様にして
プラスミドＤＮＡを単離した。形質転換株の一株から得
たプラスミドｐＰ、ａｒｏＧ ｌを各種制限酵素で消化
後、アガロースゲル電気泳動で解析した結果、ｐｃＥ５
１のＥｃｏＲＶ切断部位に約２，７ｋｂのａｒｏＧ遺伝
子を含むＨｐａ Ｉ −Ｎｒｕ ｌ切断ＤＮＡ断片が挿
入されたプラスミドであることが判明した（第１図参照
）。
プラスミドＤＮＡを単離した。形質転換株の一株から得
たプラスミドｐＰ、ａｒｏＧ ｌを各種制限酵素で消化
後、アガロースゲル電気泳動で解析した結果、ｐｃＥ５
１のＥｃｏＲＶ切断部位に約２，７ｋｂのａｒｏＧ遺伝
子を含むＨｐａ Ｉ −Ｎｒｕ ｌ切断ＤＮＡ断片が挿
入されたプラスミドであることが判明した（第１図参照
）。
（４） ａｒｏＧ遺伝子がフェニルアラニンによる阻
害から解除された変異プラスミドｐＥａｒｏＧ ２の取
得：ｐ ＥａｒｏＧ ｌを保有するエシェリシア・コリ
へＢ５２４８株を、カナマイシン２０μｇ／ｍ＋を含む
ＬＢ培地で対数増殖の後期まで増殖させた。
害から解除された変異プラスミドｐＥａｒｏＧ ２の取
得：ｐ ＥａｒｏＧ ｌを保有するエシェリシア・コリ
へＢ５２４８株を、カナマイシン２０μｇ／ｍ＋を含む
ＬＢ培地で対数増殖の後期まで増殖させた。
菌体を５０ｍＭ）ＩＪス・マレイン酸緩衝液（ｐＨ６，
０）で２回遠心洗浄後、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ
−ニトロソグアニジン４００μｇ／ｍ＋を含む５０ｍＭ
）！Ｊス・マレイン酸緩衝液（ｐＨ６，０）中で、室温
で３０分間処理した。処理菌体を５０ｍＭ）リス・マレ
イン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で２回遠心洗浄後、洗浄菌
体をカナマイシン２０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地中、３
０℃で１６時間培養し、前記と同様の方法でプラスミド
ＤＮＡを単離した。
０）で２回遠心洗浄後、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ
−ニトロソグアニジン４００μｇ／ｍ＋を含む５０ｍＭ
）！Ｊス・マレイン酸緩衝液（ｐＨ６，０）中で、室温
で３０分間処理した。処理菌体を５０ｍＭ）リス・マレ
イン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で２回遠心洗浄後、洗浄菌
体をカナマイシン２０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地中、３
０℃で１６時間培養し、前記と同様の方法でプラスミド
ＤＮＡを単離した。
単離したプラスミドを用い、エシェリシア・コＩＪ Ａ
Ｂ ３２４８株を前記と同様の方法で形質転換した。
Ｂ ３２４８株を前記と同様の方法で形質転換した。
形質転換株の選択は、フェニルアラニン６ｍｇ／ｍｌ、
ヒスチジン、プロリン、アルギニン、イソロイシン、バ
リンを各々５０μｇ ／ｍｌ含むＭ９平板培地上で行っ
た。出現したコロニーかう、フェニルアラニン６ｍｇ／
ｍｌ、ヒスチジン、プロリン、アルギニン、イソロイシ
ン、バリン各々５０μｇ／ｍｌを含むＭ９平板培地およ
びカナマイシン２０μｇ／ｍｌを含むＬＢ平板培地上で
生育できるコロニーを選択した。
ヒスチジン、プロリン、アルギニン、イソロイシン、バ
リンを各々５０μｇ ／ｍｌ含むＭ９平板培地上で行っ
た。出現したコロニーかう、フェニルアラニン６ｍｇ／
ｍｌ、ヒスチジン、プロリン、アルギニン、イソロイシ
ン、バリン各々５０μｇ／ｍｌを含むＭ９平板培地およ
びカナマイシン２０μｇ／ｍｌを含むＬＢ平板培地上で
生育できるコロニーを選択した。
このようにして得たコロニーは、また同時にフェニルア
ラニンのアナログであるｐ−フルオロフェニルアラニン
３．２ ｍｇ ／ｍｌまたはｍ−フルオロフェニルアラ
ニン３．２ｍｇ／ｍｌおよびヒスチジン、プロリン、ア
ルギニン、インロイシン。
ラニンのアナログであるｐ−フルオロフェニルアラニン
３．２ ｍｇ ／ｍｌまたはｍ−フルオロフェニルアラ
ニン３．２ｍｇ／ｍｌおよびヒスチジン、プロリン、ア
ルギニン、インロイシン。
バリン各々５０μｇ／ｍｌを含むＭ９平板培地上で生育
でき、ｐ−フルオロフェニルアラニンおよびｍ−フルオ
ロフェニルアラニンに耐性であることが判明した。
でき、ｐ−フルオロフェニルアラニンおよびｍ−フルオ
ロフェニルアラニンに耐性であることが判明した。
このようにして得た形質転換株から得たプラスミドは細
菌にフェニルアラニンまたはフェニルアラニンアナログ
耐性を与えることができる。
菌にフェニルアラニンまたはフェニルアラニンアナログ
耐性を与えることができる。
その−株から分離したプラスミドをｐ ＥａｒｏＧ ２
と命名した。
と命名した。
（５） ａ ｒ ｏ Ｆ遺伝子のシャトルベクターｐ
ＣＥ５３へのザブクローン化； ｐｋｍｌａｒｏＦ ｌ −ｍ −１８より、ａｒｏＦ遺
伝子部分のＤＮＡ断片を取得し、エシェリシア・コリと
コリネバクテリウム・グルタミクムのシャトルベクター
ｐＣＥ５３に連結する。
ＣＥ５３へのザブクローン化； ｐｋｍｌａｒｏＦ ｌ −ｍ −１８より、ａｒｏＦ遺
伝子部分のＤＮＡ断片を取得し、エシェリシア・コリと
コリネバクテリウム・グルタミクムのシャトルベクター
ｐＣＥ５３に連結する。
ｐｋｍｌａｒｏＦ ｌ−ｍ −１８は特開昭６０−３４
１９７に開示したエシェリシア・コリのａｒｏＦおよび
ｔｙｒＡ遺伝子を含む）（ｉｎｃｎ切断ＤＮＡ断片をエ
シェリシア・コリとコリネバクテリウム・グルタミクム
のシャトルベクターｐｃＥ５１のＨｉｎｃＩＩ切断部位
に挿入させたプラスミドｐｋｍｌａｒｏＦ １より誘導
したチロシン耐性を宿主に付与する変異プラスミドであ
る。
１９７に開示したエシェリシア・コリのａｒｏＦおよび
ｔｙｒＡ遺伝子を含む）（ｉｎｃｎ切断ＤＮＡ断片をエ
シェリシア・コリとコリネバクテリウム・グルタミクム
のシャトルベクターｐｃＥ５１のＨｉｎｃＩＩ切断部位
に挿入させたプラスミドｐｋｍｌａｒｏＦ １より誘導
したチロシン耐性を宿主に付与する変異プラスミドであ
る。
ｐＣＥ５３は特開昭５７−１３４５００に開示したコリ
ネバクテリウム・グルタミクムのプラスミドｐ ＣＧ
１とエシェリシア・コリのプラスミドｐＧＡ２２ （ア
ン シイ（八ｎ、 Ｇ、）ｅｔ ａｔ ：ジャーナル・
オブ・バタテリオロジイ（Ｊ、 Ｂａｃｔｅ−ｒｉｏｌ
、Ｎ４し、 ４００（１９７９）参照〕とを和合連結さ
せたプラスミドである。詳しくはｐＣＧｌ−Ｆ、に１カ
所しかないＢｇＲＨ切断部位とｐＧＡ２２上に２カ所あ
るＢａｍＨＩ切断部位のうちテトラサイタリン耐性遺伝
子内でないＢａｍＨＩ切断部位とで、両制限酵素の同一
接着末端を利用して連結したものである。ｐＣＥ５３は
ｐＧＡ２２由来のカナマイシン耐性遺伝子などの選択マ
ーカーを有し、制限酵素５ａｌｌに対する切断部位は１
カ所である。
ネバクテリウム・グルタミクムのプラスミドｐ ＣＧ
１とエシェリシア・コリのプラスミドｐＧＡ２２ （ア
ン シイ（八ｎ、 Ｇ、）ｅｔ ａｔ ：ジャーナル・
オブ・バタテリオロジイ（Ｊ、 Ｂａｃｔｅ−ｒｉｏｌ
、Ｎ４し、 ４００（１９７９）参照〕とを和合連結さ
せたプラスミドである。詳しくはｐＣＧｌ−Ｆ、に１カ
所しかないＢｇＲＨ切断部位とｐＧＡ２２上に２カ所あ
るＢａｍＨＩ切断部位のうちテトラサイタリン耐性遺伝
子内でないＢａｍＨＩ切断部位とで、両制限酵素の同一
接着末端を利用して連結したものである。ｐＣＥ５３は
ｐＧＡ２２由来のカナマイシン耐性遺伝子などの選択マ
ーカーを有し、制限酵素５ａｌｌに対する切断部位は１
カ所である。
ｐｋｍｌａｒＯＦｌ−ｍ−１８を保有するエシェリシア
・コリＡ３３２４８株より、前記と同様にして調製した
プラスミドｐｋｍｌａｒｏＦ １− ｍ −１８ＤＮＡ
３■を含む制限酵素Ｂ ａ ｍ ＨＴ反応液（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ −ト１ｃ ｆｌ 、 ６ｍＭ
ＭｇＣｊｉ’ ２ 。
・コリＡ３３２４８株より、前記と同様にして調製した
プラスミドｐｋｍｌａｒｏＦ １− ｍ −１８ＤＮＡ
３■を含む制限酵素Ｂ ａ ｍ ＨＴ反応液（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ −ト１ｃ ｆｌ 、 ６ｍＭ
ＭｇＣｊｉ’ ２ 。
１００ｍＭ Ｎａ（１，ｐＨ７，５）１００μＦに５
単位のＢａｍＨＩ（宝酒造社製）を加え、３７℃で６０
分間反応させた。また、ｐＣＥ５３を保有するエシェリ
シア・コリＪＡ１９４株より前記と同様にして調製した
プラスミドｐＣＥ５３ＤＮＡ３μｇを含む制限酵素１３
ａｍＨＩ反応液１００μ＆に５単位のＢａｍＨＩを加え
、３７℃で６０分間反応させた。反応後、いずれも６５
℃で１０分間加熱して反応を停止させた。両反応液を混
合後、この混合物にＴ４１Ｊガーゼ用緩衝液４０ｎ、Ａ
ＴＰ （５ｍＭ）４０μＬ Ｔ４リガーセ（宝酒造社製
、１単位／ρ）０．４ρおよびＨ２Ｏ１２０ρを加え、
４℃で２４時間反応させた。
単位のＢａｍＨＩ（宝酒造社製）を加え、３７℃で６０
分間反応させた。また、ｐＣＥ５３を保有するエシェリ
シア・コリＪＡ１９４株より前記と同様にして調製した
プラスミドｐＣＥ５３ＤＮＡ３μｇを含む制限酵素１３
ａｍＨＩ反応液１００μ＆に５単位のＢａｍＨＩを加え
、３７℃で６０分間反応させた。反応後、いずれも６５
℃で１０分間加熱して反応を停止させた。両反応液を混
合後、この混合物にＴ４１Ｊガーゼ用緩衝液４０ｎ、Ａ
ＴＰ （５ｍＭ）４０μＬ Ｔ４リガーセ（宝酒造社製
、１単位／ρ）０．４ρおよびＨ２Ｏ１２０ρを加え、
４℃で２４時間反応させた。
このリガーゼ反応混合物を用い、前記と同様にエシェリ
シア・コリＡ３３２４８株を形質転換シ、菌体をヒスチ
ジン、プロリン、アルギニン。
シア・コリＡ３３２４８株を形質転換シ、菌体をヒスチ
ジン、プロリン、アルギニン。
イソロイシン、バリンを各々５０Ｊ１ｇ／＋ｎ＋含むＭ
９平板培地に塗布した。Ｍ９平板培地に生育しタコロニ
ーヲ各々アンピシリン１００μｇ／ｍｌ、テトラサイク
リン２０μｇ／ｍｌ、カナマイシン２０μｇ／ｍｌを含
むＬＢ平板培地に塗布し、カナマイシン含有培地で生育
し、アンピシリン、テトラサイクリン含有培地で生育で
きないコロニーを選択した。
９平板培地に塗布した。Ｍ９平板培地に生育しタコロニ
ーヲ各々アンピシリン１００μｇ／ｍｌ、テトラサイク
リン２０μｇ／ｍｌ、カナマイシン２０μｇ／ｍｌを含
むＬＢ平板培地に塗布し、カナマイシン含有培地で生育
し、アンピシリン、テトラサイクリン含有培地で生育で
きないコロニーを選択した。
このように選択した形質転換株より、前記と同様にして
プラスミドＤＮＡを単離した。形質転換株の一株から得
たプラスミドｐ ＥａｒｏＦ １８を各種制限酵素で消
化後、アガロースゲル電気泳動で解析した結果、ｐＣＥ
５３のＢａｍＨｒ切断部位に約２．７ｋｂのａｒｏＦ遺
伝子を含むＢａｍＨＩ切断ＤＮＡ断片が挿入されたプラ
スミドであることが判明した（第２図参照）。
プラスミドＤＮＡを単離した。形質転換株の一株から得
たプラスミドｐ ＥａｒｏＦ １８を各種制限酵素で消
化後、アガロースゲル電気泳動で解析した結果、ｐＣＥ
５３のＢａｍＨｒ切断部位に約２．７ｋｂのａｒｏＦ遺
伝子を含むＢａｍＨＩ切断ＤＮＡ断片が挿入されたプラ
スミドであることが判明した（第２図参照）。
（６） フェニルアラニン生産性コリネバクテリウム
・グルタミクムの形質転換株によるフェニルアラニンの
生産： フェニルアラニン生産性菌株コリネバクテリウｌ、・ク
ルクミンＡＫ−３８（特開昭６０−２４１ ！１２
ＦＥＲＭ ）ＩＰ−４５４）をＮＢ培地（＋１５）未
ブイヨン２０ｇ、酵母エキス５ｇを水１ｐに含みｐ １
１７．２に調整した培地）にて３０℃で１６時間振盪培
養し、その種培養を３３Ｍ培地〔グルコース２０ｇ、（
ＮＨ４）２ＳＯ４１０ｇ、尿素３ ｇ 、酵母エキス］
ｇ 、 ＫＩＩ２ＰＯ４Ｉｇ、ＭｇＣＬ・ｆｉｌ１２
０ ０．４ｇ、Ｆｅ５０゜・７Ｈｚ０ １０ｍｇ、Ｍｎ
ＳＯ４・４〜６ｔ（ｚｏｏ、２ｍｇ、 Ｚｎ５Ｏ＜
ｌ ７ｔ１２０ ０．９ｍｇ、 Ｃ１１ＳＯ４・５ ＋
−ｈ０ ０．４ ｍｇ、 Ｎ ａ２ＢｎＯｔ弓旧Ｉ２０
０、０９ ｍｇ、 （ＮＩ＋４） ６Ｍ ０７０２４
’ ４１１２０ ０．０４ｍｇ、ビオチン３０■、サイ
アミン塩酸塩１ｍｇを水１ｐに含みｐ ＋−１７，２に
調整した培地〕に接種して３０℃で振盪培養した。ＯＤ
Ｏ，２になった時点で０，５単位／ｍｌになるように
ペニシリンＧを添加した。さらに培養を続け、ＯＩ〕約
０．６になったところで細胞を集菌し、ＲＣＧＰ培地〔
グルコース５ｇ、カザミノ酸５ｇ、酵母エキス２．５ｇ
、に２１１ＰＯ，３，５ｇ、Ｋ１−１□ＰＯ４１，５ｇ
、ＭｇＣβ２ ・６Ｈ２００，４１ｇ。
・グルタミクムの形質転換株によるフェニルアラニンの
生産： フェニルアラニン生産性菌株コリネバクテリウｌ、・ク
ルクミンＡＫ−３８（特開昭６０−２４１ ！１２
ＦＥＲＭ ）ＩＰ−４５４）をＮＢ培地（＋１５）未
ブイヨン２０ｇ、酵母エキス５ｇを水１ｐに含みｐ １
１７．２に調整した培地）にて３０℃で１６時間振盪培
養し、その種培養を３３Ｍ培地〔グルコース２０ｇ、（
ＮＨ４）２ＳＯ４１０ｇ、尿素３ ｇ 、酵母エキス］
ｇ 、 ＫＩＩ２ＰＯ４Ｉｇ、ＭｇＣＬ・ｆｉｌ１２
０ ０．４ｇ、Ｆｅ５０゜・７Ｈｚ０ １０ｍｇ、Ｍｎ
ＳＯ４・４〜６ｔ（ｚｏｏ、２ｍｇ、 Ｚｎ５Ｏ＜
ｌ ７ｔ１２０ ０．９ｍｇ、 Ｃ１１ＳＯ４・５ ＋
−ｈ０ ０．４ ｍｇ、 Ｎ ａ２ＢｎＯｔ弓旧Ｉ２０
０、０９ ｍｇ、 （ＮＩ＋４） ６Ｍ ０７０２４
’ ４１１２０ ０．０４ｍｇ、ビオチン３０■、サイ
アミン塩酸塩１ｍｇを水１ｐに含みｐ ＋−１７，２に
調整した培地〕に接種して３０℃で振盪培養した。ＯＤ
Ｏ，２になった時点で０，５単位／ｍｌになるように
ペニシリンＧを添加した。さらに培養を続け、ＯＩ〕約
０．６になったところで細胞を集菌し、ＲＣＧＰ培地〔
グルコース５ｇ、カザミノ酸５ｇ、酵母エキス２．５ｇ
、に２１１ＰＯ，３，５ｇ、Ｋ１−１□ＰＯ４１，５ｇ
、ＭｇＣβ２ ・６Ｈ２００，４１ｇ。
Ｆｅ５Ｏｎ ・７ｔ（ｚｏ １０ｍｇ、ＭＴＩＳＯ
４・４−６ Ｈ２Ｏ２ｍｇ、 Ｚ ｎ ＳＯ４・７ Ｈ
ａＯｏ、 ９ ｍｇ、 （Ｎ １１４＞５ Ｍ ０７
０２４ ・４ Ｈ２Ｏ２ｍｇ、コハク酸二ナトリウム１
３５ｇ、ポリビニルピロリドン（分子量１０．０００）
３０ｇを水１！に含む培地〕に１ｍｇ／ｍｌのりゾチー
ムを含む液（ｐ Ｈ７，６）に約１０９細ｔｅａ／ｍｌ
となるように懸濁し、１、型試験管に移して３０℃で５
時間緩やかに振盪反応してプロトプラスト化した。
４・４−６ Ｈ２Ｏ２ｍｇ、 Ｚ ｎ ＳＯ４・７ Ｈ
ａＯｏ、 ９ ｍｇ、 （Ｎ １１４＞５ Ｍ ０７
０２４ ・４ Ｈ２Ｏ２ｍｇ、コハク酸二ナトリウム１
３５ｇ、ポリビニルピロリドン（分子量１０．０００）
３０ｇを水１！に含む培地〕に１ｍｇ／ｍｌのりゾチー
ムを含む液（ｐ Ｈ７，６）に約１０９細ｔｅａ／ｍｌ
となるように懸濁し、１、型試験管に移して３０℃で５
時間緩やかに振盪反応してプロトプラスト化した。
このプロトプラスト訃濁液０．５ｍｌを小試験管にとり
２．５００Ｘｇで５分間遠心分離し、ｉ’ ＳＭＣ緩衝
液（１０ｍＭ塩化マグネシウム、３０ｍＭ塩化カルシウ
ム、５０ｍＭ）リス、４００ｍＭシヨ糖、 ｐＨ７，５
） １ｍｌに再懸濁して遠心洗浄後、ＴＳＭＣ５ＭＣ緩
衝液中ｌに再懸濁した。この懸濁液に２倍濃度のＴＳＭ
Ｃ緩衝液と上記ｐＥａｒｏＧ ２またはｐＥａｒｏＰ１
８ Ｄ ＮΔ混合物の１対１混合液１００ｍを加えて混
和し、次いでＴＳＭＣ緩衝液中に２０％ポリエチレング
リコール６、０００（Ｐ Ｅ ０６．０００＞を含む液
３．３ｍｌを添加して混合した。３分後、ＲＣＧＰ培地
（ｐＨ７，２） ２ｍｌを添加し、２，５００ｘｇで５
分間遠心分離にかけてに澄み液を除去し、沈澱したプロ
トプラストを１ｍｌのＲＣＧＰ培地に懸濁してから３０
℃で２時間緩やかに振盪した。このプロトプラスト懸濁
液のＱ、２ｍｌをカナマイシン２００μｇ／ｍｌを含む
ＲＣＧＰ寒天培地（ＲＣＧＰ培地に１．４％寒天を含む
培地、ｐｌ＋ ７．２ ）に塗布し、３０℃で７日間培
養した。出現したコ「】ニーの中からカナマイシン１０
μｇ／ｍｌを含むＮＢ寒天培地上で生育できる株が得ら
れた。
２．５００Ｘｇで５分間遠心分離し、ｉ’ ＳＭＣ緩衝
液（１０ｍＭ塩化マグネシウム、３０ｍＭ塩化カルシウ
ム、５０ｍＭ）リス、４００ｍＭシヨ糖、 ｐＨ７，５
） １ｍｌに再懸濁して遠心洗浄後、ＴＳＭＣ５ＭＣ緩
衝液中ｌに再懸濁した。この懸濁液に２倍濃度のＴＳＭ
Ｃ緩衝液と上記ｐＥａｒｏＧ ２またはｐＥａｒｏＰ１
８ Ｄ ＮΔ混合物の１対１混合液１００ｍを加えて混
和し、次いでＴＳＭＣ緩衝液中に２０％ポリエチレング
リコール６、０００（Ｐ Ｅ ０６．０００＞を含む液
３．３ｍｌを添加して混合した。３分後、ＲＣＧＰ培地
（ｐＨ７，２） ２ｍｌを添加し、２，５００ｘｇで５
分間遠心分離にかけてに澄み液を除去し、沈澱したプロ
トプラストを１ｍｌのＲＣＧＰ培地に懸濁してから３０
℃で２時間緩やかに振盪した。このプロトプラスト懸濁
液のＱ、２ｍｌをカナマイシン２００μｇ／ｍｌを含む
ＲＣＧＰ寒天培地（ＲＣＧＰ培地に１．４％寒天を含む
培地、ｐｌ＋ ７．２ ）に塗布し、３０℃で７日間培
養した。出現したコ「】ニーの中からカナマイシン１０
μｇ／ｍｌを含むＮＢ寒天培地上で生育できる株が得ら
れた。
カナマイシンに耐性になった形質転換株を４００ｍｌＳ
ＳＭ培地で振盪培養し、ＯＤ ０．２になったところで
０．５単位／ｎ＋１となるようにペニシリンＧを添加し
、さらにＯＤ約０．６まで培養し、集菌した菌体から実
施例１（１）と同様な方法でプラスミドを単離した。こ
れらのプラスミドを制限酵素消化後アガロースゲル電気
泳動で解析した結果、ｐ ＥａｒｏＧ ２、またはｐ
ＥａｒｏＦ１８と同一のプラスミドであることがわかっ
た。
ＳＭ培地で振盪培養し、ＯＤ ０．２になったところで
０．５単位／ｎ＋１となるようにペニシリンＧを添加し
、さらにＯＤ約０．６まで培養し、集菌した菌体から実
施例１（１）と同様な方法でプラスミドを単離した。こ
れらのプラスミドを制限酵素消化後アガロースゲル電気
泳動で解析した結果、ｐ ＥａｒｏＧ ２、またはｐ
ＥａｒｏＦ１８と同一のプラスミドであることがわかっ
た。
コリネバクテリウム・グルタミクムに−３８およびｐ
ＥａｒｏＧ ２またはｐ ＥａｒｏＦ １８を保有する
形質転換株について、ＤＳ活性を比較した。
ＥａｒｏＧ ２またはｐ ＥａｒｏＦ １８を保有する
形質転換株について、ＤＳ活性を比較した。
Ｋ−３８株のＤＳ活性を１としたときのｐ ＥａｒｏＧ
２またはｐ ＥａｒｏＦ １８を保有する形質転換株の
ＤＳ活性は１０〜１５倍に増加しており、ｐ Ｅａｒｏ
Ｇ ２およびｐ ＥａｒｏＦ］３かに一３８株内で発現
していることが判明した。
２またはｐ ＥａｒｏＦ １８を保有する形質転換株の
ＤＳ活性は１０〜１５倍に増加しており、ｐ Ｅａｒｏ
Ｇ ２およびｐ ＥａｒｏＦ］３かに一３８株内で発現
していることが判明した。
コリネバクテリウム・グルタミクムに−３８およびｐ
ＥａｒｏＧ ２またはｐ ＥａｒｏＦ １８を保有する
形質転換株の１．−フェニルアニン生産試験を行った。
ＥａｒｏＧ ２またはｐ ＥａｒｏＦ １８を保有する
形質転換株の１．−フェニルアニン生産試験を行った。
ＮＢ培地中で３０℃、１６時間振盪培養した種培養Ｑ、
５ｍｌを５ｍｌの生産培地Ｐ４［廃糖蜜２００ｇ、（Ｎ
Ｈ，）２ＳＯ４２０ｇ。
５ｍｌを５ｍｌの生産培地Ｐ４［廃糖蜜２００ｇ、（Ｎ
Ｈ，）２ＳＯ４２０ｇ。
ＫＨｚＰＯ＊０．５ｇ、に２ＨＰＯ＜ ０．５ｇ。
ＭｇＳＯ２・７Ｈ２００，２５ｇ、ＮＺアミン２．５ｇ
、ＣａＣＯ３２０ｇを水１１に含み、ｐｉ−１７，２に
調整した培地〕の入った試験管に接種し、３０℃で７２
時間振盪培養した。培養後、培養ｐ液をペーパークロマ
トグラフィーにかけ、ニンヒドリン発色後、比色定量し
てＬ−フェニルアラニンの生成量を測定した。
、ＣａＣＯ３２０ｇを水１１に含み、ｐｉ−１７，２に
調整した培地〕の入った試験管に接種し、３０℃で７２
時間振盪培養した。培養後、培養ｐ液をペーパークロマ
トグラフィーにかけ、ニンヒドリン発色後、比色定量し
てＬ−フェニルアラニンの生成量を測定した。
対照株コリネバクテリウム・グルタミクムに−３８とと
もにＬ−フェニルアラニンの生成１を第１表に示す。
もにＬ−フェニルアラニンの生成１を第１表に示す。
第 １ 表
実施例２゜
トリプトファン生産性コリネバクテリウム・グルタミク
ムの形質転換株によるトリプトファンの生産ニ トリプトファン生産性コリネバクテリウム・・グルタミ
クムに−５５（ＦＦ：ＲＭ ＢＰ−８６４）をＮＢ培
地中で３０℃、１６時間振盪培養し、その種培養を３３
Ｍ培地に接種して３０℃で浸透培養した。ＯＤ約０．６
になったところで細胞を集菌し、実施例１（６）と同様
にリゾチームで処理してプロトプラスト化した。このプ
ロトプラストを実施例１（６）と同様な方法により、Ｐ
Ｅ Ｇ６．０００を介して、ｐ ＥａｒｏＧ ２また
はｐ ＥａｒｏＦ１８で形質転換し、カナマイシン耐性
の形質転換株を得た。
ムの形質転換株によるトリプトファンの生産ニ トリプトファン生産性コリネバクテリウム・・グルタミ
クムに−５５（ＦＦ：ＲＭ ＢＰ−８６４）をＮＢ培
地中で３０℃、１６時間振盪培養し、その種培養を３３
Ｍ培地に接種して３０℃で浸透培養した。ＯＤ約０．６
になったところで細胞を集菌し、実施例１（６）と同様
にリゾチームで処理してプロトプラスト化した。このプ
ロトプラストを実施例１（６）と同様な方法により、Ｐ
Ｅ Ｇ６．０００を介して、ｐ ＥａｒｏＧ ２また
はｐ ＥａｒｏＦ１８で形質転換し、カナマイシン耐性
の形質転換株を得た。
各株の形質転換株を３３Ｍ培地で振盪培養後、ＯＤ約０
．６になったところで細胞を集菌し、実施例１（１）と
同様な方法でプラスミドを単離した。
．６になったところで細胞を集菌し、実施例１（１）と
同様な方法でプラスミドを単離した。
これらのプラスミドを制限酵素消化後、アガロースゲル
電気泳動で解析した結果、形質転換株はｐ ＥａｒｏＧ
２またはｐ ＥａｒｏＦ１８と同一のプラスミドを有
していることがわかった。
電気泳動で解析した結果、形質転換株はｐ ＥａｒｏＧ
２またはｐ ＥａｒｏＦ１８と同一のプラスミドを有
していることがわかった。
コリネバクテリウム・グルタミクムに−５５おおよびｐ
ＥａｒｏＧ ２またはｐ ＥａｒｏＰ１８を保有する
形質転換株のＬ−） ＩＪブトファン生産試験を実施例
第１図 １（６）と同一条件で行った。その結果を第２表に示す
。
ＥａｒｏＧ ２またはｐ ＥａｒｏＰ１８を保有する
形質転換株のＬ−） ＩＪブトファン生産試験を実施例
第１図 １（６）と同一条件で行った。その結果を第２表に示す
。
第 ２ 表
発明の効果
本発明によれば、微生物のＤＳをコードする遺伝子とベ
クタープラスミドとの組換え体を保有させて、コリネバ
クテリウム属およびブレビバクテリウム属におけるＬ−
フェニルアラニンまたはＩ、−トリプトファンの生産性
を向−トすることができる。
クタープラスミドとの組換え体を保有させて、コリネバ
クテリウム属およびブレビバクテリウム属におけるＬ−
フェニルアラニンまたはＩ、−トリプトファンの生産性
を向−トすることができる。
第１図はｐ ＥａｒｏＧ ｌの制限酵素切断地図とその
作製工程を示す。第２図はｐ ＥａｒｏＦ１８の制限酵
素地図とその作製工程を示す。矢印は遺伝子の転写され
る方向を示しである。プラスミドの分子中はキロベース
（ｋｂ）で表示されている。 第２図 岑づ ａｍＨＩ 「
作製工程を示す。第２図はｐ ＥａｒｏＦ１８の制限酵
素地図とその作製工程を示す。矢印は遺伝子の転写され
る方向を示しである。プラスミドの分子中はキロベース
（ｋｂ）で表示されている。 第２図 岑づ ａｍＨＩ 「
Claims (6)
- （１）微生物の芳香族アミノ酸の生合成に関与する３−
デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−ホス
フェートシンセターゼの合成に係る遺伝子を含むＤＮＡ
断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを保有するコ
リネバクテリウム属、またはブレビバクテリウム属に属
する微生物を培地中に培養し、培養物中に芳香族アミノ
酸を生成蓄積させ、該培養物から芳香族アミノ酸を採取
することを特徴とする芳香族アミノ酸の製造法。 - （２）該芳香族アミノ酸がＬ−フェニルアラニンまたは
Ｌ−トリプトファンであることを特徴とする特許請求の
範囲第１項記載の方法。 - （３）該遺伝子がエシェリシア属、コリネバクテリウム
属、ブレビバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、バ
チルス属、スタフィロコッカス属、ストレフトコッカス
属またはセラチア属に属する微生物に由来することを特
徴とする特許請求の範囲第１項の記載の方法。 - （４）ベクターがコリネバクテリウム属に属する微生物
由来のｐＣＧ１、ｐＣＧ２、ｐＣＧ４、ｐＣＧ１１、ｐ
ＣＥ５１、ｐＣＥ５２、ｐＣＥ５３、ｐＣＢ１０１およ
びそれらから誘導されるプラスミドから選ばれる特許請
求の範囲第１項記載の方法。 - （５）３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート
−７−ホスフェートシンセターゼの合成に関与する遺伝
子を含み、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム属に属する微生物に芳香族アミノ酸のアナログに対
する耐性を付与することができるＤＮＡ断片とベクター
ＤＮＡとが結合した組換え体ＤＮＡ。 - （６）３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート
−７−ホスフェートシンセターゼの合成に関与する遺伝
子を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮ
Ａを保有するコリネバクテリウム属またはブレビバクテ
リウム属に属する微生物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60205104A JPS6265691A (ja) | 1985-09-17 | 1985-09-17 | 芳香族アミノ酸の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60205104A JPS6265691A (ja) | 1985-09-17 | 1985-09-17 | 芳香族アミノ酸の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6265691A true JPS6265691A (ja) | 1987-03-24 |
Family
ID=16501481
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60205104A Pending JPS6265691A (ja) | 1985-09-17 | 1985-09-17 | 芳香族アミノ酸の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6265691A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01265892A (ja) * | 1988-04-18 | 1989-10-23 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Ｌ−トリプトファンの製造法 |
-
1985
- 1985-09-17 JP JP60205104A patent/JPS6265691A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01265892A (ja) * | 1988-04-18 | 1989-10-23 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Ｌ−トリプトファンの製造法 |
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