DE69621714T2

DE69621714T2 - Verfahren zur herstellung von trans-4-hydroxy-l-prolin

Info

Publication number: DE69621714T2
Application number: DE69621714T
Authority: DE
Inventors: Hideo Mori; Akio Ozaki; Takeshi Shibasaki
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1995-03-07
Filing date: 1996-03-07
Publication date: 2003-01-30
Anticipated expiration: 2016-03-08
Also published as: KR970702921A; DE69621714D1; HK1000712A1; ES2176441T3; EP0759472A1; EP0759472B1; WO1996027669A1; CN1150821A; ATE219142T1; CA2189682C; EP0759472A4; CN1132938C; JP3440100B2; KR100460579B1; CA2189682A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft industrielle Verfahren zur Herstellung von trans-4-Hydroxy-L-Prolin, das als Ausgangsverbindung für Medikamente und als Futterzusatz nützlich ist, Gene, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität zur Hydroxylierung der 4-Position von L-Prolin kodieren und die für den vorstehend genannten Prozess nützlich sind (hier als L-Prolin-4- Hydroxylase-Gene bezeichnet), Transformanten, die das Gen enthalten und Verfahren zur Produktion von L-Prolin-4-Hydroxylasen unter Verwendung der Transformanten.

Hintergrund der Erfindung

Die folgenden mikrobiologischen Verfahren sind bisher für die Produktion von trans-4- Hydroxy-L-Prolin bekannt:
1) Ein Verfahren zur Herstellung von trans-4-Hydroxy-L-Prolin aus 4-Hydroxy-2- oxoglutarsäure unter Verwendung von Mikroorganismen, die zur Gattung Escherichia gehören (JP-A-266995/91),
2) Ein Verfahren zur direkten Herstellung von trans-4-Hydroxy-L-Prolin durch Fermentation mit Pilzen oder Bakterien (EP-A2-0 547 898, und JP-A-236,980/93 und 245,782/94)
3) Ein Verfahren zur Herstellung von trans-4-Hydroxy-L-Prolin aus L-Prolin mit Hilfe von Mikroorganismen, die zur Gattung Streptomyces gehören (J. Biol. Chem. 254, 6684 1979; Biochem. Biophys. Res. Com. 120, 45, 1984; Tetrahedron Letters, 34, 7489 (1993) und Tetrahedron Letters, 35, 4649 (1994)).
Die gewöhnlichen Verfahren können jedoch aus folgenden Gründen kaum im industriellen Maßstab durchgeführt werden:
1) Ein Substrat für die Herstellung von trans-4-Hydroxy-L-Prolin, wie 4-Hydroxy-2- Oxoglutarsäure ist zu teuer und schwer erhältlich.
2) Die Produktivität an trans-4-Hydroxy-L-Prolin ist gering.
3) Die Aktivität der Enzyme, die die Produktion von trans-4-Hydroxy-L-Prolin betreffen, ist recht schwach.
Im Hinblick auf das Enzym, das die Produktion von trans-4-Hydroxy-L-Prolin katalysiert, wurde in einer Publikation berichtet, dass es aus einem Mikroorganismus der Gattung Streptomyces aufgereinigt wurde. Ein Verfahren zum Erhalt des Enzyms und die physikochemischen Eigenschaften des Enzyms werden dort nicht beschrieben. Weiterhin wurde in keiner Publikation die Klonierung eines Gens berichtet, welches für L-Prolin-4- Hydroxylase mit der Aktivität zur Konversion von freiem L-Prolin zu trans-4-Hydroxy-L-Prolin in Anwesenheit von 2-Ketoglutarsäure und einem zweiwertigen Eisenion kodiert.
Es besteht ein Bedarf an einem industriell vorteilhaften Verfahren zur Produktion von trans- 4-Hydroxy-L-Prolin unter Verwendung von L-Prolin-4-Hydroxylase mit einer hohen Aktivität.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines effizienten Verfahrens zur Herstellung von trans-4-Hydroxy-L-Prolin aus preiswertem und leicht erhältlichem L- Prolin durch Verwendung von L-Prolin-4-Hydroxylasen. Für das Verfahren werden, um trans- 4-Hydroxy-L-Prolin industriell vorteilhafter produzieren zu können, Gene für L-Prolin-4- Hydroxylase und Transformanten bereitgestellt, die die Gene enthalten.
L-Prolin-4-Hydroxylasen werden unter Verwendung dieser Gene und der Transformanten in großen Mengen hergestellt, und trans-4-Hydroxy-L-Prolin wird durch Verwendung der Transformanten und der Hydroxylasen mit niedrigen Kosten hergestellt.

Offenbarung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue, von Mikroorganismen abgeleitete L-Prolin- 4-Hydroxylase-Gene, auf rekombinante DNA, die das Gen enthält, auf Transformanten, die die rekombinante DNA enthalten, auf Verfahren zur Herstellung von L-Prolin-4-Hydroxylasen unter Verwendung der Transformanten, auf die Hydroxylasen, und auch auf Verfahren zur Herstellung von trans-4-Hydroxy-L-Prolin unter Verwendung der Transformanten oder der Hydroxylasen.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend detailliert beschrieben.
Die L-Prolin-4-Hydroxylasen der vorliegenden Erfindung sind Enzyme, durch die freies L- Prolin in Anwesenheit von 2-Ketoglutarsäure und einem zweiwertigen Ion unter Bildung von trans-4-Hydroxy-L-Prolin hydroxyliert wird.
Die vorliegende Erfindung umfasst jedes Protein mit der enzymatischen Aktivität zur Hydroxylierung der 4-Position von L-Prolin, was z. B. ein Protein mit der Aminosäuresequenz von Sequenz No. 1 einschließt, ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, die aus dem Protein resultiert oder aus einem Protein mit einer partiellen Aminosäuresequenz des Proteins, das an ein Peptid mit einer partiellen Aminosäuresequenz eines von E. coli abgeleiteten β-Galactosidase-Proteins gebunden ist, ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, die aus dem Protein mit der Aminosäuresequenz in Sequenz Nr. 1 resultiert oder ein Protein mit einer partiellen Aminosäuresequenz des Proteins, das an ein Peptid mit einer partiellen Aminosäuresequenz eines von E. coli abgeleiteten Maltosebindenden Proteins gebunden ist etc. Beispiele der fusionierten Proteine schließen ein Protein mit den in den Sequenzen Nr. 18 oder 19, etc., gezeigten Aminosäuresequenzen ein.
Das Protein mit der in den Sequenzen Nr. 1, 18 oder 19 gezeigten Aminosäuresequenz schließt Proteine mit einer Aminosäuresequenz ein, in der eine oder mehrere Aminosäuren substituiert, deletiert oder hinzugefügt sind, und die enzymatische Aktivität der Hydroxylierung der 4-Position von L-Prolin aufweisen. Die Substitution, Deletion und Addition von Aminosäuren kann gemäß dem in Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982); Proc. Nah Acad. Sci USA, 79, 6409 (1982); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5662 (1984); Science 224, 1431 (1984); PCT WO85/00817 (1985); Nature 316, 601 (1985); Gene 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research 13, 4431 (1985); Current Protocols in Molecular Biology, Kapitel 8, Mutagenesis of Klond DNA, John Wiley & Sons, Inc. (1989), etc. beschriebenen Verfahren durchgeführt werden.
Die Erfindung umfasst jedes L-Prolin-4-Hydroxylase-Gen eines DNA-Fragments, das ein Gen enthält, das für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität der Hydroxylierung der 4- Position von L-Prolin katalysiert. Dies kann z. B. Gene einschließen, die für das Protein mit der Aminosäuresequenz der Sequenz Nr. 1, 18 oder 19 kodieren, und ebenfalls Gene, die für ein Protein kodieren, das eine Aminosäuresequenz besitzt, die den Aminosäuresequenzen der Sequenz Nr. 1, 18 oder 19 entspricht und die davon durch Substitution, Deletion oder Addition wenigstens einer Aminosäure abgeleitet ist, und die die enzymatische Aktivität zur Hydroxylierung der 4-Position von L-Prolin besitzen. Konkret werden DNAs erwähnt, die durch die Sequenzen Nr. 2, 8 und 15 dargestellt werden, etc.
Die L-Prolin-4-Hydroxylase-Gene der vorliegenden Erfindung schließen die vorstehend definierten DNAs und auch DNAs ein, die davon durch Mutation abgeleitet sind, wie durch eine Substitutionsmutation, eine Deletionsmutation, eine inserierende Mutation oder Ähnliches, die bis zu einem Ausmaß durchgeführt wird, dass die mutierten DNAs die L- Prolin-4-Hydroxylase-Aktivität nicht verlieren, z. B. DNAs mit Homologie zur Sequenz Nr. 2, 8 oder 15. Solche homologen DNAs werden durch Kolonie-Hybridisierung oder Plaque- Hybridisierung mit einer DNA als Sonde mit der Nukleotidsequenz, die durch die Sequenzen Nr. 2, 8 oder 15 gezeigt wird, erhalten. Diese Behandlungen können gemäß bekannter in vitro Rekombinationstechniken durchgeführt werden (vgl. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, herausgegeben von Sambrook, Fritsch, Maniatis, veröffentlicht von Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
Das DNA-Fragment, das das L-Prolin-4-Hydroxylase-Gen enthält, kann aus Mikroorganismen mit der Fähigkeit zur Hydroxylierung von L-Prolin unter Bildung von trans- 4-Hydroxy-L-Prolin erhalten werden. Als Mikroorganismus kann jeder Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Hydroxylierung von L-Prolin unter Bildung von trans-4-Hydroxy-L-Prolin in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Zu bevorzugende Beispiele für solch einen Mikroorganismus sind Mikroorganismen, die zur Gattung Dactylosporangium, Amycolatpsis oder Streptomyces gehören, die die genannte Aktivität der L-Prolin-4-Hydroxylase aufweisen. Weitere bevorzugte Beispiele schließen Dactylosporangium sp. RH1 (FERM BP- 4400), Amycolatpsis sp. RH2 (FERM BP-4581), Streptomyces griseovirides JCM4250, Streptomyces daghestanicus JCM4365 und Mutanten oder Derivate dieser Stämme ein.
Dactylosporangium sp. RH1 und Amycolatpsis sp. RH2 wurden von den vorliegenden Erfindern als Mikroorganismen mit der Fähigkeit zur Produktion von L-Prolin-4-Hydroxylase isoliert. Streptomyces griseovirides JCM4250 und Streptomyces daghestanicus JCM4365 sind Mikroorganismen, deren Fähigkeit zur Herstellung von L-Prolin-4-Hydroxylase von den vorliegenden Erfindern zum ersten Mal gefunden wurde.
Verfahren zur Gewinnung eines L-Prolin-4-Hydroxylase-Gens aus den Mikroorganismen mit der Fähigkeit zur Produktion von L-Prolin-4-Hydroxylase werden nachstehend beschrieben.
Aus einem Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Herstellung von L-Prolin-4-Hydroxylase wird chromosomale DNA mit einem gewöhnlichen DNA-Isolierungsverfahren isoliert, z. B. mit dem Phenolverfahren (Biochem. Biophys. Acta, 72, 619). Die so erhaltene chromosomale DNA wird mit einer geeigneten Restriktionsendonuklease gespalten; dann werden die gespaltenen Fragmente in Vektor-DNAs inseriert, um chromosomale DNA-Bibliotheken für die Chromosomen der Mikroorganismen zu erzeugen. Ein Wirtsorganismus kann mit dieser chromosomalen DNA-Bibliothek transformiert werden. Aus den erhaltenen Transformanten werden die Transformanten, die das L-Prolin-4-Hydroxylase-Gen enthalten, mit einem Hybridisierungsverfahren selektiert. Aus den so selektierten Transformanten können DNAs erhalten werden, die das beabsichtigte Gen enthalten.
Das Verfahren, das eine Reihe solcher Schritte beinhaltet, kann gemäß bekannten in vitro Rekombinationsverfahren durchgeführt werden (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, herausgegeben von Sambrook, Fritsch und Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
Als Vektor-DNA zur Konstruktion der Bibliothek aus chromosomaler DNA des Mikroorganismus, der die Fähigkeit zur Produktion von L-Prolin-4-Hydroxylase besitzt können Phagen-Vektoren und Plasmid-Vektoren verwendet werden, wenn diese autonom in dem E. coli Stamm K12 repliziert werden können. Bevorzugte Beispiele der Vektor-DNA schließen λZAPII, pUC18 und pBluescript ein (kommerziell von STRATAGENE erhältlich).
Jeder der Mikroorganismen, die zur Gattung Escherichia gehören, kann als Wirts- Mikroorganismus zur Herstellung der chromosomalen DNA-Bibliothek des Mikroorganismus verwendet werden, der die Fähigkeit zur Produktion von L-Prolin-4-Hydroxylase besitzt. Bevorzugte Beispiele der Wirts-Mikroorganismen schließen E. coli XL1-Blue, E. coli XL2- Blue, E. coli DH1, E. coli MC1000, etc. ein.
Basierend auf der Information über die Aminosäuresequenz von L-Prolin-4-Hydroxylase werden DNA-Primer synthetisiert. Unter Verwendung der DNA-Primer werden DNA- Fragmente durch die Polymerasekettenreaktion (im weiteren als PCR bezeichnet) hergestellt. Unter Verwendung der so erhaltenen DNA-Fragmente können Transformanten, die ein L-Prolin-4-Hydroxylase-Gen enthalten, durch das Hybridisierungsverfahren selektiert werden.
Die Information über die Aminosäuresequenzen von L-Prolin-4-Hydroxylasen kann durch Analyse reiner L-Prolin-4-Hydroxylasen mit gewöhnlichen Aminosäure-Sequenziergeräten erhalten werden, wie mit einem Protein Sequencer Modell PPSQ-10 (hergestellt von Shimadzu Seisakusho K. K.). Als Information über die so erhaltenen Aminosäuresequenzen werden konkret partielle Aminosäuresequenzen in der in Sequenz Nr. 1 gezeigten Aminosäuresequenz erwähnt, z. B. eine teilweise Aminosäuresequenz mit der Aminosäuresequenz von der N-terminalen bis zur 24. Aminosäure, die in Sequenz Nr. 1 gezeigt ist, etc.
Der DNA-Primer kann mittels eines gewöhnlichen DNA-Synthesizers hergestellt werden, z. B. mit dem 380 A DNA Synthesizer von Applied Biosystems.
Als Sonden für die Hybridisierung können partielle Fragmente von L-Prolin-4-Hydroxylase- Genen verwendet werden, die durch PCR erhalten werden können. Es werden z. B. eine DNA, die in Sequenz ülr. 3 gezeigt ist (dies entspricht einer Sinn-Strang-DNA, die für die 1.- 6. Aminosäure in der Aminosäuresequenz von Sequenz Nr. 1 kodiert) und eine DNA, die in Sequenz Nr. 4 gezeigt ist (dies entspricht einer Antisense-Strang-DNA, die für die 19.-24. Aminosäure der Aminosäuresequenz von Sequenz Nr. 1 kodiert) chemisch synthetisiert Verwendet man diese DNA-Primer in der PCR, erhält man ein DNA-Fragment von 71 bp, das in Sequenz Nr. 5 gezeigt ist. Das so erhaltene DNA-Fragment kann als Sonde für die Hybridisierung verwendet werden.
Die DNA, die das L-Prolin-4-Hydroxylase-Gen enthält und aus der Transformante erhalten wird, die durch die Hybridisierung ausgewählt wurde, wird durch eine geeignete Restriktionsendonuklease, z. B. XhoI, gespalten, und dann in ein Plasmid wie pBluescript KS(+) kloniert (kommerziell von Stratagene Co. erhältlich). Die Nukleotidsequenz des vorstehend genannten Gens kann durch gewöhnliche Verfahren zur Bestimmung der Nukleotidsequenz bestimmt werden, z. B. durch die Didesoxy-Kettenabbruchmethode von Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463, 1977). Die Bestimmung der Nukleotidsequenz kann auf einem automatisierten DNA-Sequenziergerät durchgeführt werden, z. B. mit dem 373 A DNA Synthesizer von Applied Biosystems. Es können z. B. die in Sequenz Nr. 2 und 8 gezeigten Nukleotidsequenzen als die auf diese Weise bestimmten Nukleotidsequenzen der L-Prolin-4-Hydroxylase-Gene genannt werden.
Die DNA, die für eine L-Prolin-4-Hydroxylase der vorliegenden Erfindung kodiert, kann in herkömmlicher Weise in Vektoren eingebracht werden.
Als Plasmid, das für die DNA, die für die L-Prolin-4-Hydroxylase der vorliegenden Erfindung kodiert, kann z. B. pRH71 etc. genannt werden. Escherichia coli SOLR/pRH71, d. h. Escherichia coli, der pRH71 enthält, wurde bei dem National Institute of Bioscience und Human-Technology der Agency of Industrial Science und Technology (1-3, Higashi 1- chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japan) am 2. März 1995 als FERM BP-5025 im Rahmen des Budapester Vertrags hinterlegt.
Zur Expression des auf diese Weise erhaltenen L-Prolin-4-Hydroxylase-Gens im Wirt wird das DNA-Fragment, das das L-Prolin-4-Hydroxylase-Gen enthält, zuerst durch eine Restriktionsendonuklease oder durch eine andere Desoxyribonuklease gespalten, um ein DNA-Fragment geeigneter Länge, das das L-Prolin-4-Hydroxylase-Gen enthält, zu bilden. Das auf diese Weise gebildete DNA-Fragment wird stromabwärts von einem Promotor in einen Expressionsvektor inseriert. Danach wird der Expressionsvektor mit der so integrierten DNA in eine Wirtszelle eingebracht, die für den Expressionsvektor geeignet ist.
Jede Wirtszelle, die das beabsichtigte Gen exprimieren kann, kann verwendet werden. Als Beispiele der Wirtszelle können sowohl bakterielle Zellen eines Mikroorganismus, der zur Gattung Escherichia, Serratia, Corynebacterium, Brevibacterium, Pseudomonas, Bacillus etc. gehört, als auch Hefestämme, tierische Wirtszellen erwähnt werden.
Ein Expressionsvektor, der in der vorstehend genannten Wirtszelle autonom replizierbar ist oder in ein Chromosom eingesetzt werden kann und der an der Stelle, an der das L-Prolin-4- Hydroxylase-Gen transkribiert werden kann, einen Promotor enthält, kann verwendet werden.
Wenn Mikroorganismen wie Escherichia coli oder Ähnliche als Wirtszelle verwendet werden, ist es ratsam, dass der Expressionsvektor in den Mikroorganismen autonom repliziert wird und aus einem Promotor, einer Ribosomenbindungssequenz wie einer Shine-Dalgarno- Sequenz, einem L-Prolin-4-Hydroxylase-Gen und einer Transkriptionsterminationssequenz aufgebaut ist. Es kann auch ein regulatorisches Gen darin enthalten sein.
Als Beispiele für den Expressionsvektor werden pBRtrp2, pBTac1, pBTac2 (alle von Boehringer Mannheim käuflich zu erwerben); pKYP10 (vgl. JP-A-Nr. 110600/83); pKYP200 (vgl. Agricol. Biol. Chem., 48, 669, 1984); pLSA1 (vgl. Agricol. Biol. Chem., 53, 277, 1989); pGEL1 (vgl. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4306, 1985); pBLUESCRIPT (hergestellt von STRATAGENE Co.); pTRs30 (hergestellt aus Escherichia coli JM109/pTrS30 (FERM BP- 5407); pTrS 32 (hergestellt aus Escherichia coli JM109/pTrS32 (FERM BP-5408), etc. erwähnt.
Als Promotor kann ein Promotor verwendet werden, der in Wirten wie Escherichia coli exprimiert werden kann. Es werden z. B. Promotoren erwähnt, die von Escherichia coli, Phage etc. abgeleitet sind, wie der trp Promotor (Ptrp), lac Promotor (Plac), P~ Promotor und PR Promotor. Es können auch künstlich entworfene und modifizierte Promotoren wie Ptrpx2 verwendet werden, der durch Verbindung zweier Ptrps in Reihe hergestellt wird, als auch der tac Promotor (ptac).
Als Ribosomen-Bindungssequenz kann jede Sequenz verwendet werden, die in Wirten wie Escherichia coli exprimiert werden kann. Es ist jedoch wünschenswert, Plasmide mit einer Ribosomen-Bindungssequenz und einem Initiationskodon zu verwenden, die voneinander durch geeignete Intervalle getrennt sind (z. B. 6-18 Basen).
Das L-Prolin-4-Hydroxylase-Gen schließt jedes Gen ein, das für eine L-Prolin-4-Hydroxylase kodiert. Es ist jedoch wünschenswert, dass die Basen, aus denen die DNA-Sequenz des Gens besteht, in geeigneter Weise substituiert sind, so dass die substituierte DNA-Sequenz aus Kodons aufgebaut wird, die zur Expression in den zu verwendenden Wirts- Mikroorganismen am besten geeignet sind. Als Beispiele für L-Prolin-4-Hydroxylase-Gene, in denen die konstitutiven Basen substituiert wurden, um sie in Kodons umzuwandeln, die für ihre Expression am besten geeignet sind, werden die Nukleotidsequenzen der Sequenz Nr. 15, etc. genannt.
Transkriptionsterminationssequenzen sind nicht immer zur Expression der Gene der vorliegenden Erfindung notwendig. Es ist jedoch wünschenswert, dass eine Transkriptionsterminationssequenz unmittelbar nach dem Struktur-Gen angeordnet wird.
Beispiele für die Wirtszellen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können schließen Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL-2 Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485, Escherichle coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli No. 49, Escherichia coli W3110, Escherichia coli NY49, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefacines, Brevibacterium immariophilum ATCC14068, Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870. Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354, etc. ein.
Wenn ein Hefe-Stamm als Wirtszelle verwendet wird, können z. B. Yep13 (ATCC37115), Yep24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419) etc. als Expressionsvektor verwendet werden.
Es kann jeder Promotor verwendet werden, der in den Wirtszellen des Hefe-Stamms exprimiert werden kann, z. B. Promotoren von glykolytischen Genen wie Hexosekinase, Gal1-Promotor, gal 10-Promotor, Hitzeschockprotein-Promotor, MFa1-Promotor und CUP 1 Promotor.
Als Beispiele der Wirtszelle können Sacharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromycas lactis, Trichosporon pullulans und Schwanniomyces alluvius etc. erwähnt werden.
Werden tierische Zellen als Wirtszelle verwendet, dann können z. B. pcDNA I/Amp, pcDNA I und pcDM8 (alle käuflich von Funakosi Co erhältlich) als Expressionsvektor verwendet werden.
Als Promotor kann jeder Promotor verwendet werden, der in den verwendeten tierischen Wirtszellen exprimiert werden kann, z. 3. ein Promotor eines IE (immediate early) Gens von humanem CMV, etc. Zusammen mit dem Promotor kann ein Enhancer des IE-Gens von humanen CMV verwendet werden.
Als Beispiele dieser Wirtszellen können Namalwa, HBT5637 (JP-A 299/88), COS-Zellen, CHO-Zellen, etc. verwendet werden.
Zur Einbringung von DNA in tierische Zellen kann jedes Verfahren verwendet werden, das zur Einbringung von DNA in tierische Zellen fähig ist. Es können z. B. Elektroporationsverfahren (vgl. Miyaji et al., Cytotechnology 3, 133 (1990), Kalzium- Phosphat-Verfahren (vgl. JP-A-227075/90), Lipofektionsverfahren (vgl. Philip L. Felgner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413, 1987) etc. verwendet werden. Die entstehenden Transformanten können gemäß den in den JP-A-227075/90 und 257891/90 beschriebenen Verfahren geerntet und kultiviert werden.
Die so erhaltene Transformante wird mit einem gewöhnlichen Kultivierungsverfahren kultiviert.
Das Medium, das zur Kultivierung dieser bakteriellen Transformanten wie Escherichia coli, Hefestämmen oder Ähnlichen verwendet wird, kann jedes natürliche oder synthetische Medium sein, solange es Kohlenstoff-Quellen, Stickstoff-Quellen, anorganische Salze etc. enthält und die Transformanten effizient kultiviert werden.
Alle Kohlenstoffquellen, die durch die Mikroorganismen assimiliert werden können, können verwendet werden. Beispiele der Kohlenstoffquellen schließen Kohlenhydrate wie Glukose, Fruktose, Sucrose, Molassen, die diese Bestandteile enthalten, Stärke und Stärke- Hydrolysate; organische Säuren wie Essigsäure und Propionsäure; und Alkohole wie Ethanol und Propanol ein.
Als Stickstoffquellen können Ammonium, Ammoniumsalze von anorganischen oder organischen Säuren wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumacetat und Ammoniumphosphat, andere Stickstoff-enthaltende Verbindungen, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, "Corn steep liquor", Kasein-Hydrolysate, Sojabohnenkuchen, Sojabohnenkuchen-Hydrolysate, kultivierte fermentierte Zellen, deren Abbauprodukte etc. verwendet werden.
Als anorganische Salze können Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumphosphat, Natriumchlorid, Eisensulfat, Mangansufat, Kupfersulfat, Kalziumkarbonat etc. verwendet werden.
Die Kultivierung dieser Mikroorganismen erfolgt unter aeroben Bedingungen, z. B. durch eine Schüttelkultur oder durch Rührkultur mit submerser Belüftung. Die Kultivierungstemperatur beträgt 15 bis 40ºC und die Kultivierungsdauer beträgt im allgemeinen 16 bis 96 Stunden. Während der Kultivierung wird der pH-Wert des Mediums bei 3,0 bis 9,0 gehalten. Der pH- Wert wird mit anorganischen oder organischen Säuren, alkalischen Lösungen, Harnstoff, Kalziumkarbonat, Ammonium oder Ähnlichem eingestellt.
L-Prolin wird in geeigneter Weise dem Medium zugegeben, so dass seine Konzentration von 5 bis 1000 mM beträgt, bevorzugt von 20 bis 200 mM, wodurch die beabsichtigten L-Prolin- 4-Hydroxylasen auf wirksamere Weise hergestellt werden können.
Antibiotika wie Ampicillin, Tetrazyklin oder Ähnliches können, wenn nötig, dem Medium während der Kultivierung zugegeben werden.
Zu Kultivierung von Mikroorganismen, die mit dem Expressionsvektor unter Verwendung des induzierbaren Promotors transformiert sind, können, wenn nötig, Inducer zum Medium zugegeben werden. Bei der Kultivierung von Mikroorganismen, die mit einem Expressionsvektor mit dem Lac-Promotor transformiert sind, kann lsopropyl-β-D- Thiogalactopyranosid (IPTG) zum Medium zugegeben werden. Bei Kultivierung von Mikroorganismen, die mit dem Expressionsvektor mit dem trp-Promotor transformiert sind, kann lndolacrylsäure (IAA) zum Medium zugegeben werden.
Als Medium für die Kultivierung der Transformanten, die gewonnen werden, wenn man tierische Zellen als Wirtszellen verwendet, kann RPM11640-Medium oder Eagle's MEM- Medium verwendet werden, die im allgemeinen verwendet werden oder jene Kulturmedien, die fötales Rinderserum enthalten.
Die Zellen werden in Anwesenheit von 5% Kohlendioxid kultiviert. Die Temperatur für die Kultivierung beträgt bevorzugt 35 bis 37ºC der Zeitraum für die Kultivierung beträgt gewöhnlicherweise 3 bis 7 Tage.
L-Prolin wird in geeigneter Weise dem Medium zugegeben, so dass seine Konzentration 5 bis 1000 mM betragen kann, bevorzugt von 20 bis 200 mM, wodurch die beabsichtigten L- Prolin-4-Hydroxylasen auf wirksamere Weise hergestellt werden können.
Antibiotika wie Kanamycin, Penicillin oder Ähnliches können, falls sie benötigt werden, während der Kultivierung zum Medium zugegeben werden.
In den so kultivierten Transformanten wird im Vergleich zum Stamm des Mikroorganismus, der als Genquelle verwendet wird, wie Dactylosporangium sp. RH1 oder Ähnliche, eine beachtliche Menge an L-Prolin-4-Hydroxylase produziert und angelagert. Somit kann die Isolierung und Aufreinigung des Enzyms oder die Produktion von trans-4-Hydroxy-L-Prolin aus L-Prolin unter Verwendung des Enzyms weitaus effizienter als im Vergleich zur Herstellung von trans-4-Hydroxy-L-Prolin aus L-Prolin unter Verwendung der nicht genetisch veränderten Mikroorganismen als Genquelle, wie Dactylosporangium sp. RH1 oder Ähnlichen durchgeführt werden.
Die Bildung von L-Prolin-4-Hydroxylase in den Transformanten kann bestätigt werden durch Nachweis von hergestelltem trans-4-Hydroxy-L-Prolin durch Zugabe der Kultur, der Zellen oder der behandelten Zellen zu einem wässrigen Medium, das für die enzymatischen Reaktionen geeignet ist, zusammen mit L-Prolin, einem zweiwertigen Eisenion, und 2- Ketoglutarsäure und durch Zugabe eines Surfaktans oder eines organischen Lösungsmittels, wenn nötig, zur Bestimmung des produzierten trans-4-Hydroxy-L-Prolin. Im Hinblick auf die Aktivität der L-Prolin-4-Hydroxylase, deren Bildung in der Zelle bestätigt wird, wird die Aktivität des Enzyms zur Herstellung von 1 nmol trans-4-Hydroxy-L-Prolin in 1 Minute unter den folgenden Bedingungen als eine Einheit (U) definiert. Die Zellen des Mikroorganismus und die tierischen Zellen werden hier als Zellen bezeichnet.

Messung der Aktivität von L-Prolin-4-Hydroxylase

Zellen, behandelte Zellen oder die Enzym-Zubereitung werden zu 240 mM MES zugegeben [2-(N-morpholino) Ethansulfonsäure]-Puffer, pH 6,5, der 12 mM L-Prolin, 24 mM 2- Ketoglutarsäure, 4 mM Eisensulfat und 8 mM L-Ascorbinsäure enthält und insgesamt 250 ul ergibt. Das Gemisch wird für 10 Minuten bei 35ºC gehalten. Das Reaktionsgemisch wird für 2 Minuten auf 100ºC erhitzt, um die Reaktion zu stoppen, und die Menge an trans-4- Hydroxy-L-Prolin, die im Reaktionsgemisch hergestellt wurde, wird durch Hochleistungs- Flüssigchromatographie (hier als HPLC bezeichnet) bestimmt.
Für die Bestimmung kann jegliches Verfahren verwendet werden, das die Menge von trans- 4-Hydroxy-L-Prolin bestimmen kann. Es kann z. B. ein Verfahren zur Abtrennung und Elution von trans-4-Hydroxy-L-Prolin aus dem Reaktionsgemisch durch HPLC unter Verwendung einer Liganden-Austausch-Chromatographiesäule verwendet werden, wie SUMICHIRAL OA5000 (hergestellt von Sumika Analysis Center Co.) oder Ähnlichen, gefolgt von dessen Umsetzung mit 7-Chlor-4-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol (hier als NBD bezeichnet), um nach der Säule sein Derivat zu ergeben und Nachweis des entstehenden Derivats (nach der Säule geschaltetes Derivatisierungsverfahren); ein Verfahren zur vorherigen Umsetzung des Produkts im Reaktionsgemisch mit NBD, um sein Derivat zu erzeugen, gefolgt von der Isolierung und Nachweis des entstehenden Derivats mit NBD anhand reverse Phase Chromatographie mit HPLC (vor der Säule geschaltetes Derivatisierungsverfahren) [vgl. William J. Lindblad und Robert F. Diegelmann, Analytical Biochemistry, Band 138, Seiten 390-395, 1984], etc. Der Nachweis des Derivats mit NBD wird durch Messung seiner Lumineszenz (bei der angeregten Wellenlänge von 503 nm und der Fluoreszenzwellenlänge von 541 nm) in beiden Fällen durchgeführt.
Das Enzym kann in gewohnter Weise aus der Kultur der Transformanten isoliert und aufgereinigt werden, in denen die Bildung von L-Prolin-4-Hydroxylase in den kultivierten Zellen wie vorstehend erwähnt bestätigt wurde. Die Kulturbrühe des Transformanten wird z. B. zur Ernte der kultivierten Zellen zentrifugiert, die Zellen werden gewaschen und durch einen Ultraschall-Zellaufschliesser, eine "French Press", einen Manto-Gauline- Homogenisator, eine Dyno-Mühle oder Ähnliches zum Erhalt eines zellfreien Extraktes aufgeschlossen. Die aufgereinigte Enzymzubereitung kann durch Ammoniumsulfatpräzipitation, Anionen-Austauschchromatographie, wie Diethylaminoethyl (DEAE) Sepharose oder Ähnliches, hydrophobe Chromatographie wie Butyl-Sepharose, Phenyl-Sepharose oder Ähnliches, Gelfiltration, Elektrophorese, wie Elektrophorese am isolelektrischen Punkt usw. aus dem Überstand des zelifreien Extraktes, der durch Zentrifugation erhalten wurde, erhalten werden.
Die kultivierten Transformantenzellen, die L-Prolin-4-Hydroxylase enthalten, können unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend beschrieben kultiviert werden, unter denen die Transformantenzellen kultiviert wurden, wodurch die Zellen trans-4-Hydroxy-L-Prolin in den Zellen produzieren und anlagern. Das so hergestellte trans-4-Hydroxy-L-Prolin kann aus der Kultur gewonnen werden.
Wenn die von einer Wirtszelle abgeleitete Transformantenzelle verwendet wird, die die Fähigkeit zur Produktion von L-Prolin aus Saccharidquellen und zur Anlagerung in den Kulturen besitzt und wo solche Zellen verwendet werden, ist es möglich, trans-4-Hydroxy-L- Prolin auch dann zu produzieren, wenn während der Kultivierung der Zellen kein L-Prolin zum Medium zugegeben wird. Es ist jedoch wünschenswert, in geeigneter Weise L-Prolin zum Medium in einer Konzentration von 5 bis 1000 mM zuzugeben, bevorzugt von 20 bis 200 mM, wodurch das beabsichtigte trans-4-Hydroxy-L-Prolin wirksamer hergestellt werden kann.
Wenn die Transformantenzellen die Fähigkeit zur Produktion von 2-Ketoglutarsäure aus Saccharidquellen und zur Anlagerung in den Kulturen besitzen und wenn solche Zellen verwendet werden, ist es mgl, trans-4-Hydroxy-L-Prolin auch dann zu produzieren, wenn während der Kultivierung der Zellen keine 2-Ketoglutarsäure zum Medium zugegeben wird. Bei Verwendung solcher Transformantenzellen können Saccharidquellen wie Glukose in geeigneter Weise dem Medium zugegeben werden, damit die Zellen in den Kulturen 2- Ketoglutarsäure produzieren und anlagern, wodurch das beabsichtigte trans-4-Hydroxy-L- Prolin wirksamer hergestellt werden kann. Wenn andererseits Transformantenzellen verwendet werden, die 2-Ketoglutarsäure nicht aus den verwendeten Saccharidquellen produzieren können, dann kann, falls erwünscht, 2-Ketoglutarsäure während der Inkubation der Zellen dem Medium zugegeben werden.
Wenn gewünscht, können 2-Ketoglutarsäure und zweiwertige Eisenionen während der Kultivierung der Transformantenzellen zum Medium zugegeben werden.
Zur Herstellung von trans-4-Hydroxy-L-Prolin kann auch ein nachstehend genanntes Verfahren verwendet werden, das als Enzymquelle die Kulturen der Transformantenzellen, in denen die Bildung von L-Prolin-4-Hydroxylasen nachgewiesen wurde, die aus diesen Kulturen isolierten Zellen oder die Produkte verwendet, die durch Verarbeitung dieser Zellen erhalten wurden.
Das Verfahren zur Herstellung von trans-4-Hydroxy-L-Prolin ist wie folgt. Die Kulturen der Transformantenzellen, die aus der Kultur isolierten Zellen oder die Produkte, die durch Verarbeitung der Zellen erhalten werden, werden einem wässrigen Medium zugegeben, das für eine enzymatische Reaktion geeignet ist, zusammen mit L-Prolin, zweiwertigen Eisenionen und 2-Ketoglutarsäure und optional Surfaktantien und organischen Lösungsmitteln, wodurch L-Prolin in trans-4-Hydroxy-L-Prolin umgewandelt wird. Danach wird das entstehende trans-4-Hydroxy-L-Prolin zur Gewinnung aus diesen Reaktionsgemischen geerntet.
Beispiele für verarbeitete Zellen sind getrocknete Zellen, lyophilisierte Zellen, mit Surfaktans behandelte Zellen, enzymatisch behandelte Zellen, Ultraschall-behandelte Zellen, mechanisch zerriebene Zellen, mechanisch komprimierte Zellen, mit Lösungsmittel behandelte Zellen, fraktionierte Zellproteine, immobilisierte Zellen, immobilisierte Materialien, die durch Verarbeitung der Zellen gewonnen wurden. Die Enzympräparation, die durch Extraktion aus den Zellen mit L-Prolin-4-Hydroxylase-Aktivität erhalten wurde, aufgereinigte Produkte dieser Enzyme und immobilisierte Produkte daraus können ebenfalls verwendet werden.
Als Beispiele für das wässrige Medium werden Wasser, Puffer wie Phosphate, Carbonate, Acetate, Borate, Citrate und Tris-Puffer, Alkohole wie Methanol und Ethanol, Ester wie Ethylacetat, Ketone wie Aceton und Amide wie Acetamid erwähnt.
Als Beispiele für das Surfaktans können kationische Surfaktanzien wie Polyoxyethylen- Stearylamin (z. B. das von Nippon Oils & Fats Co. hergestellte Nymeen S215), Cetyltrimethylammoniumbrodid, Kation FB, Kation F2-40E, etc. anionische Surfaktanzien wie Natrium-oleylamidosulfat; Newrex TAB und Rapizol 80; ampholytische Surfaktanzien wie Polyoxyethylen-Sorbitol-Monostearat (z. B. Nonion ST221) oder Ähnliches; und auch tertiäre Amine PB, Hexadecyldimethylamin, etc. erwähnt werden. Jedes Surfaktans, das die Reaktion fördert, kann verwendet werden: Die Konzentration des Surfaktans reicht gewöhnlicherweise von 0,1 bis 50 mg/l,, bevorzugt von 1 bis 20 mg/l.
Als Beispiele für das organische Lösungsmittel können Toluol, Xylol, aliphatische Alkohole, Benzol und Ethylacetat genannt werden. Die Konzentration des organischen Lösungsmittels reicht gewöhnlicherweise von 0,1 bis 50 pl/ml, bevorzugt von 1 bis 20 pl/ml.
Die Reaktion kann während der Kultivierung der Transformante mit L-Prolin-4-Hydroxylase- Aktivität oder auch nach Abschluss der Kultivierung im wässrigen Medium unter Verwendung der Zellen, der behandelten Zellen, des aufgereinigten Enzyms oder des aus der Kultur präparierten Rohenzyms durchgeführt werden.
Die Menge des Enzyms, das zum Reaktionsgemisch zugegeben wird, wird in Abhängigkeit von der Menge des verwendeten Substrat bestimmt. Gewöhnlich kann die Menge von 1000 bis 10,000,000 U pro Liter, bevorzugt von 10000 bis 3000000 U pro Liter wässrigen Mediums erreichen. Wenn die Zellen oder die behandelten Zellen des Mikroorganismus verwendet werden, beträgt die Konzentration an nassen Zellen gewöhnlich von 1 bis 300 g/l,.
Die Reaktion wird gewöhnlicherweise bei einer Temperatur von 15 bis 50ºC bei einem pH- Wert von 6,0 bis 9,0 für 1 bis 96 Stunden durchgeführt.
Die in der Reaktion verwendete Konzentration an L-Prolin kann von 1 mM bis 2 M reichen. L- Prolin kann durch Zugabe von L-Prolin selbst zum Reaktionsgemisch oder durch Zugabe der Kultur der Mikroorganismen, die L-Prolin aus einer Zuckerquelle produzieren und anhäufen können, geliefert werden. Weiterhin kann, wenn ein Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Herstellung von L-Prolin aus einer Zuckerquelle als Wirtsorganismus der Transformante verwendet wird, L-Prolin, das von dem Wirtsmikroorganismus aus einer Zuckerquelle gebildet wird, in der Reaktion verwendet werden. Das heißt, L-Prolin, das von der Transformante produziert wird, die von dem Wirtsmikroorganismus mit der Fähigkeit zur Herstellung von L-Prolin abgeleitet ist, wird in der Kulturbrühe unter Verwendung der von der Transformante hergestellten L-Prolin-4-Hydroxylase zu trans-4-Hydroxy-L-Prolin umgewandelt, wodurch trans-4-Hydroxy-L-Prolin in der Kultur ohne die Zugabe von L-Prolin hergestellt werden kann.
Für die Reaktion ist das zweiwertige Eisenion erforderlich. Dieses zweiwertige Eisenion wird gewöhnlich in einer Konzentration von 1 bis 100 mM verwendet. Jedes zweiwertige Ion kann verwendet werden, solange es zweiwertiges Ion enthält und die Reaktion nicht hemmt. Als Beispiele des zweiwertigen Eisenions können Sulfate wie Eisensulfat, Chloride wie Eisenchlorid; Eisencarbid; und Salze organischer Säuren wie Citrate, Laktate und Fumarate genannt werden. Wenn das zweiwertige Eisenion in den Zellen, den behandelten Zellen oder im Reaktionsgemisch enthalten ist, dann muss das zweiwertige Eisen nicht zugegeben werden.
2-Ketoglutarsäure kann zum Reaktionsgemisch zugegeben oder aus einem Vorläufer bereitgestellt werden, der durch die metabolische Aktivität der Zellen oder der verwendeten behandelten Zellen in 2-Ketoglutarsäure umgewandelt werden kann. Als Beispiele eines solchen Vorläufers können Saccharide wie Glukose; Aminosäuren wie Glutaminsäure; und organische Säuren wie Bernsteinsäure erwähnt werden. Diese Verbindungen können alleine oder in Kombination verwendet werden.
trans-4-Hydroxy-L-Prolin wird aus der Kultur oder aus dem wässrigen Medium durch jedes herkömmliche Trennungsverfahren gewonnen, z. B. durch Säulenchromatographie mit einem Ionenaustauschharz, etc., durch Kristallisierung, etc.
Die Struktur des so gewonnenen trans-4-Hydroxy-L-Prolin kann durch gewöhnliche analytische Verfahren wie ¹³C-NMR-Spektrum, ¹H-NMR-Spektrum, Massenspektrum, spezifische Rotation oder Ähnliches identifiziert werden.
Das durch die vorliegende Erfindung hergestellte trans-4-Hydroxy-L-Prolin kann quantitativ durch das vorhergehend genannte vor der Säule geschaltete Derivatisierungsverfahren oder durch das nach der Säule geschaltete Derivatisierungsverfahren bestimmt werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt eine Restriktionsenzymkarte des Plasmids pRH71 und die Schritte der Konstruktion der Plasmide pYan10 und pYan13.
In der Figur zeigen die dicken, schattierten Linien jeweils eine klonierte Dactylosporangium sp. RH1 Chromosomen-Stelle. Ap zeigt ein von pBR322 abgeleitetes Ampicillin-resistentes Gen. In der Figur werden nur die Restriktionsenzymstellen gezeigt, die einen Bezug zur Konstruktion des Plasmids haben.
Fig. 2 zeigt die Schritte der Konstruktion des Plasmids pTr14.
In der Figur zeigen die dicken, massiven schwarzen Linien jeweils einen Teil, der ein L- Prolin-4-Hydroxylase-Gen enthält. Ap zeigt ein von pBR322 abgeleitetes Ampicillinresistentes Gen; und Ptrp zeigt einen Promotor des Tryptophan-Operons von Escherichia coli. Die Pfeile zeigen jeweils die Richtung an, in der das Gen transkribiert und translatiert wird. In der Figur werden nur die Restriktionsenzymstellen gezeigt, die einen Bezug zur Konstruktion des Plasmids haben.
Fig. 3 zeigt die Schritte der Konstruktion des Plasmids pTc4OH.
In der Figur zeigen die dicken, massiven schwarzen Linien jeweils einen Teil, der ein L- Prolin-4-Hydroxylase-Gen enthält. Ap zeigt ein von pBR322 abgeleitetes Ampicillinresistentes Gen; und Ptac zeigt einen tac-Promotor. Die Pfeile zeigen jeweils die Richtung an, in der das Gen transkribiert und translatiert wird. In der Figur werden nur die Restriktionsenzymstellen gezeigt, die einen Bezug zur Konstruktion des Plasmids haben.
Fig. 4 zeigt die Schritte der Konstruktion des Plasmids pTr2-4OH.
In der Figur zeigen die dicken, massiven schwarzen Linien jeweils einen Teil, der ein L- Prolin-4-Hydroxylase-Gen enthält. Ap zeigt ein von pBR322 abgeleitetes Ampicillinresistentes Gen; und Ptrpx2 zeigt einen Promotor, der aus zwei Promotoren des Tryptophan-Operons von Escherichia coli zusammengesetzt ist, die in Reihe verbunden sind, (tandern-Tryptophan-Promotor). Die Pfeile zeigen jeweils die Richtung an, in der das Gen transkribiert und translatiert wird. In der Figur werden nur die Restriktionsenzymstellen gezeigt, die einen Bezug zur Konstruktion des Plasmids haben.
Fig. 5 zeigt die Schritte der Konstruktion des Plasmids ptr2-4OHΔ.
In der Figur zeigen die dicken, massiven schwarzen Linien jeweils einen Teil, der ein L- Prolin-4-Hydroxylase-Gen enthält. Ap zeigt ein von pBR322 abgeleitetes Ampicillinresistentes Gen; und Ptrpx2 zeigt einen Promotor, der aus zwei Promotoren des Tryptophan-Operons von Escherichia coli zusammengesetzt ist, die in Reihe verbunden sind, (tandern-Tryptophan-Promotor). Die Pfeile zeigen jeweils die Richtung an, in der das Gen transkribiert und translatiert wird. In der Figur werden nur die Restriktionsenzymstellen gezeigt, die einen Bezug zur Konstruktion des Plasmids haben.
Fig. 6 zeigt die Schritte der Konstruktion des Plasmid pWFH1.
In der Figur zeigen die dicken, schattierten Linien jeweils eine Stelle an, in die ein PCR- amplifiziertes Fragment eingesetzt ist, das mit HindIII und SalI behandelt wurde,. Die dicken, durchgezogenen schwarzen Linien zeigen jeweils einen Teil, der ein von Dactylosporangium sp. RH1 abgeleitetes L-Prolin-4-Hydroxylase-Gen enthält. Ap zeigt ein von pBR322 abgeleitetes Ampicillin-resistentes Gen; und Ptrpx2 zeigt einen Promotor, der aus zwei Promotoren des Tryptophan-Operons von Escherichia coli zusammengesetzt ist, die in Reihe verbunden sind, (tandern-Tryptophan-Promotor). Die Pfeile zeigen jeweils die Richtung an, in der das Gen transkribiert und translatiert wird. In der Figur werden nur die Restriktionsenzymstellen gezeigt, die einen Bezug zur Konstruktion des Plasmids haben.
Fig. 7 zeigt die Schritte der Konstruktion des Plasmids pES1-23a.
In der Figur zeigen die dicken massiven schwarzen Linien jeweils einen Teil an, der ein L- Prolin-4-Hydroxylase-Gen enthält. IacZ zeigt das Escherichia coli β-Galactosidase-Gen; Ap steht für ein von pBR322 abgeleitetes Ampicillin-resistentes Gen; und Plac steht für den lac Promotor. Die Pfeile zeigen jeweils die Richtung an, in der das Gen transkribiert und translatiert wird. In der Figur werden nur die Restriktionsenzymstellen gezeigt, die einen Bezug zur Konstruktion des Plasmids haben.
Fig. 8 zeigt die Schritte der Konstruktion des Plasmids pMc4OH.
In der Figur zeigen die dicken massiven schwarzen Linien jeweils einen Teil an, der ein L- Prolin-4-Hydroxylase-Gen enthält. malE steht für ein Gen für Maltose-bindendes Protein von E.coli; lacZ zeigt das β-Galactosidase-Gen von Escherichia coli; Ap steht für ein von pBR322 abgeleitetes Ampicillin-resistentes Gen; lacIq steht für ein Repressorgen des E. coli Lactose-Operons; rmB Terminator steht für einen Terminator des rrnB-Gens; und Ptac steht für den tac Promotor. Die Pfeile zeigen jeweils die Richtung an, in der das Gen transkribiert und translatiert wird. In der Figur werden nur die Restriktionsenzymstellen gezeigt, die einen Bezug zur Konstruktion des Plasmids haben.

Die besten Arten zur Durchführung der Erfindung

Beispiel 1

Präparation eines partiellen DNA-Fragments eines Gens, das für ein von Dactylosporangium sp. RH1 abgeleitetes L-Prolin-4-Hydroxylase-Protein kodiert:

(1) Isolierung chromosomaler DNA von Dactylosporangium sp. RH1:

Chromosomale DNA von Dactylosporangium sp. RH1 würde in üblicher Weise wie folgt isoliert. SK#2-Medium (umfassend 0,25% Glukose, 1% lösliche Stärke, 0,25% Hefeextrakt, 0,25% Pepton, 0,15% Fleischextrakt, 0,01% Kaliumdihydrogenphosphat und 0,03% Magnesiumsulfat, mit 6N NaOH auf einen pH von 7,6 eingestellt), welches 5% Mannitol und 0,05% Glycin enthielt, wurde in einer Menge von jeweils 10 ml in Test-Röhrchen gegeben und bei 120ºC für 20 Minuten sterilisiert. Zellen von Dactylosporangium sp. RH1, die in HT- Agar Plattenmedium kultiviert wurden (umfassend 1% lösliche Stärke, 0,2% NZ-Amin, 0,1 % Hefeextrakt, 0,1% Fleischextrakt und 1,5% Agar, eingestellt auf einen pH von 7,2 mit 6N NaOH und sterilisiert bei 120ºC für 20 Minuten) wurden in das vorstehend genannte Medium inokuliert und bei 28ºC unter Schütteln für drei Tage kultiviert.
Die Kultur wurde zentrifugiert, die erhaltenen Zellen wurden mit 10 ml einer 10,3% Sucroselösung gewaschen und in 6 ml TS, umfassend 10,3% Sucrose, 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 25 mM EDTA suspendiert. 1 ml einer Lysozym-Lösung (50 mg/ml TS) wurde zugegeben und das Gemisch bei 37ºC für 60 Minuten inkubiert. Nachfolgend wurden 0,6 ml einer Proteinase K-Lösung (hergestellt von Sigma Co.) (2 mg/ml TS) zu der mit Lysozym behandelten Lösung hinzugegeben und sanft gerührt. Weiterhin wurden unter sanftem Mischen 3,6 ml einer 3,3% (wlv) SDS-Lösung zugegeben und das Gemisch wurde bei 37ºC für 60 Minuten inkubiert. Das Gemisch wurde für 30 Minuten bei 50ºC erhitzt und dann mit Wasser abgekühlt. Eine gleiche Menge an TE- [enthielt 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 1 mM EDTA] gesättigtem Phenol-Chloroform (1/1, v/v) wurde zugegeben und die gemischte Lösung wurde für 30 Minuten sanft geschüttelt. Nach der Zentrifugation wurde die obere Schicht abgenommen und nochmals einer Extraktion mit TE gesättigtem Phenol-Chloroform unterzogen. Der Extrakt wurde zentrifugiert, zur oberen Schicht wurde eine gleiche Menge an Chloroform zugegeben und vermischt. Das Gemisch wurde nochmals zentrifugiert. Die obere Schicht wurde abgenommen und zur oberen Schicht wurden 20 ul einer wässrigen Lösung von RNase A (10 mg/ml), die bei 100ºC für 10 Minuten hitzebehandelt wurde, zugegeben. Das Gemisch wurde bei 37ºC für 45 Minuten inkubiert. Zu der mit RNaseA behandelten Lösung wurde ein 1/10 Volumen einer wässrigen Lösung von 5 M NaCl und ein ¹/&sub4; Volumen von 50% PEG6000 zugegeben und sanft vermischt. Das Gemisch wurde über Nacht stehengelassen und auf Eis gekühlt. Nachdem die gemischte Lösung bei 12000 rpm für 10 Minuten zentrifugiert wurde, wurde der Überstand komplett verworfen und das Präzipitat in 5 ml TE aufgelöst. Nachdem 1/10 Volumen einer Lösung von 3 M Natriumacetat und 1/30 Volumen einer Lösung von 66 mM Chlorid zugegeben und vermischt wurden, wurde ein 2,2-faches Volumen von kaltem Ethanol zugegeben und sanft vermischt.
Nachdem die vermischte Lösung für 10 Minuten bei 10000 rpm zentrifugiert wurde, wurde der Überstand verworfen, das Präzipitat zweimal mit 70% kaltem Ethanol gewaschen. Das Präzipitat, das 250 ug chromosomaler DNA enthält, wurde in TE aufgelöst und im nachfolgenden Experiment als chromosomale DNA verwendet.

(2) Bestimmung der partiellen Aminosäuresequenz des von Dactylosporangium sp. RH1- abgeleiteten L-Prolin-4-Hydroxylase-Proteins:

Die von Dactylosporangium sp. RH1 hergestellte L-Prolin-4-Hydroxylase wurde gemäß dem Verfahren von Referenzbeispiel 1 isoliert und aufgereinigt. Die N-terminale Aminosäuresequenz des aufgereinigten Enzymproteins wurde mit einem Protein Sequencer Modell PPSQ-10 (hergestellt von Shimadzu Seisakusho Co.) sequenziert, um die N- terminale Aminosäuresequenz zu bestimmen, die aus den N-terminalen 24 Aminosäuren von Sequenz Nr. 1 besteht.

(3) Präparation eines partiellen DNA-Fragments des L-Prolin-4-Hydroxlase-Gens

Der in Sequenz Nr. 3 gezeigte Sinn-Strang gemischte DNA-Primer, der den Aminosäuren Nr. 1 bis 6 der in Sequenz Nr. 1 gezeigten Aminosäuresequenz entspricht, und ein in Sequenz Nr. 4 gezeigter Antisense-Strang gemischter DNA-Primer, der den Aminosäuren Nr. 19 bis 24, die in Sequenz Nr. 1 gezeigt sind, entspricht, wurden auf einem 380A DNA- Synthesizer von Applied Biosystems synthetisiert.
Unter Verwendung der vorstehend synthetisierten DNA-Primer und der chromosomalen DNA von Dactylosporangium sp. RH1 als Matrize wurde die PCR durch ein "Program Temp Control System PC-700" von K. K. Astec durchgeführt. Die Reaktion wurde mit 20 ul eines Reaktionsgemisches mit der folgenden Formulierung durchgeführt.
Formulierung des Reaktionsgemisches: 22 ng/ul chromosomale DNA von Dactylosporangium sp. RH1, 10 uM Sinn-Strang-Gemisch DNA-Primer, 10 uM Antisense- Strang-Gemisch DNA-Primer, 0,125 U/ul Pfu DNA-Polymerase (hergestellt von Stratagene Co.), 10% DMSO, 20 mM Tris-HCl (pH 8,2), 10 mM KCl, 6 mM Ammoniumsulfat, 2 mM Magnesiumchlorid, 0,1% Triton-X-100, 10 ng/ul Rinderserumalbumin.
Nach Abschluss einer Inkubation bei 96ºC für 5 Minuten wurde eine Inkubation in drei Schritten, nämlich bei 96ºC für 2 Minuten, bei 37ºC für 1 Minute und bei 42ºC für 1 Minute insgesamt fünfmal wiederholt. Weiterhin wurde eine Inkubation in drei Schritten, nämlich bei 96ºC für 2 Minuten, bei 50ºC für 1 Minute und bei 72ºC für 1 Minute insgesamt 35 mal wiederholt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Elektrophorese mit 15% Polyacrylamid (PAGEL NPU-15L hergestellt von Atto Co.) unterzogen, und eine Bande von 71 bp wurde mit "da Vinci Kun" (Pen Touch Recovery NB-7000 Modell), hergestellt von Nippon Eido K. K. gewonnen. Das gewonnene DNA-Fragment (71 bp) wurde mit einem von Pharmacia Co. hergestellten "Sure Clone Ligation Kit" in eine Smal-Stelle von pUC 18 eingesetzt. Die Nukleotidsequenz wurde mit einem Nukleotidsequenzierungs-Kit (Taq DyeDeoxyTM Terminator Cycle Sequencing Kit von Applied Biosystems) bestimmt. Die bestimmte Nukleotidsequenz des DNA-Fragments von 71 bp ist in Sequenz Nr. 5 gezeigt. Die Aminosäuresequenz, die anhand der Nukleotidsequenz des DNA-Fragments von 71 bp angenommen wurde, stimmte vollständig mit der N-terminalen Aminosäuresequenz des aufgereinigten Enzyms, das in Sequenz Nr. 1 gezeigt ist, überein.

Beispiel 2

Klonierung eines DNA-Fragments, das ein L-prolin-4-Hydroxylase-Gen enthält:

(1) Herstellung einer DIG-Sonde:

Ein mit Digoxygenin (DIG) markiertes DNA-Fragment von 71 bp Länge wurde mit einem PCR DIG-Labelling Kit von Boehringer Mannheim hergestellt.
Die PCR wurde mit 2,5 U Pfu DNA-Polymerase (hergestellt von Stratagene), 5 ul 10x-Puffer für Pfu DNA-Polymerase (hergestellt von Stratagene), 5 ul DMSO, 5 ul 10 · PCR-DIG-Mix (hergestellt von Boehringer Mannheim), 1 ul einer verdünnten Lösung, die durch zehnfache Verdünnung der DNA-Lösung erhalten wurde, die das in der PCR gebildete DNA-Fragment von 71 bp enthielt, das nach der Polyacrylamid-Elektrophorese in Schritt (3) aus Beispiel 1 gewonnen wurde, und 50 ul eines Reaktionsgemisches, das 10 mM der Sinnstrang- synthetischen DNA, die in Sequenz Nr. 3 gezeigt ist enthält, und 10 uM der Antisense- synthetischen DNA, die in Sequenz Nr. 4 gezeigt ist, durchgeführt.
Nach Abschluss einer Inkubation bei 96ºC für 5 Minuten wurde eine Inkubation in drei Schritten, nämlich bei 96ºC für zwei Minuten, bei 50ºC für 1 Minute und bei 72ºC für 1 Minute insgesamt 35 mal wiederholt. Zur Identifizierung der Bildung eines Amplifikationsfragments von 71 bp wurde das Reaktionsgemisch einer Elektrophorese auf einem 12,5% Polyacrylamid-Gel unterzogen. Das Fragment wurde auf die gleiche Weise wie in (3) aus Beispiel 1 aus dem Gel gewonnen und als Sonde verwendet.

(2) Southern-Hybridisierung:

Die Restriktionsendonuklease XhoI (von Takara Shuzo, 36 U) wurde zu 10 ug chromosomaler DNA von Dactylosporangium sp. RH1 zugegeben und das Gemisch bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert. Die DNA wurde gespalten und auf einem Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt unter Verwendung der in (1) aus Beispiel 2 erhaltenen Sonde und des DIG Luminescent Detection Kit von Boehringer Mannheim, und die Southern Hybridisierung wurde gemäß den Verfahren durchgeführt, die in dem zum Kit beigefügten Handbuch beschrieben sind.
Das Agarosegel wurde nach Abschluss der Agarosegelelektrophorese sanft in 0,25 N Hydrochlorsäure für 20 Minuten geschüttelt, dann in ein Gemisch aus 0,5 M Natriumhydroxid und 1,5 M Natriumchlorid für 50 Minuten eingetaucht und weiterhin in ein Gemisch aus 2 M Natriumchlorid und 1 M Tris-HCl (pH 5,0) für 25 Minuten. Während das Gel bei 7,5 mm Hg mit einer Genopirator Pumpe AE-6680P von Atto Co. und einem Genopirator AE-6680C, ebenfalls von Atto Co. ausgesaugt wurde, wurde ein Hybond-N&spplus;-Film (hergestellt von Amersham) mit dem Gel in SSC bei einer 20 · Konzentration (Zusammensetzung von SSC bei einer Konzentration von 1 fach -150 mM Natriumchlorid und 15 mM Natriumcitrat) geblottet. Nach Abschluss des Blottings wurde der Film bei 80ºC für 10 Minuten getrocknet und dann mit einem FUNA-UV-LINKER FS-800 (hergestellt von Funakoshi) quervernetzt. Der so erhaltene Film wurde in 10 ml Hybridisierungs-Puffer (die Lösung wurde erhalten durch Auflösen von 50% v/v Formamid, 2% Blockierungsreagenz, 0,1% w/v Nlaurylsarcosin und 0,02% w/v SDS in SSC bei einer 5-fachen Konzentration) eines DIG Luminescent Detection Kit bei 42ºC für 1 Stunde eingetaucht, und dann in eine Sondenlösung [diese wurde erhalten durch Zugabe von 3 ul der in (1) aus Beispiel 2 erhaltenen Sonde zu 200 ul eines Hybridisierungspuffers, Behandeln des Gemisches bei 95ºC für 2 Minuten und dann Zugabe des Hybridisierungspuffers, um die Gesamtmenge auf 1,5 ml einzustellen] über Nacht bei 42ºC eingetaucht. Der auf diese Weise erhaltene Film wurde weiterhin zweimal mit 25 ml SSC, das 0,1% 2 · SDS enthielt, bei Raumtemperatur für jeweils 5 Minuten und dann zweimal mit 25 ml SSC, das 0,1% SDS in einer 0,1 · Konzentration enthielt, jeweils für 15 Minuten bei 68ºC gewaschen.
Der so gewaschene Film wurde mit einem Wasch-Puffer bei Raumtemperatur für 1 bis 5 Minuten behandelt [Puffer 1 (0,1 M Maleinsäure, 0,15 M Natriumchlorid, pH 7,5), der 0,3% w/v Tween-20 enthielt], mit 50 ml Puffer 2 (Puffer 1, der 1% Blockierungs-Reagenz enthält) bei Raumtemperatur für 30 Minuten, mit 10 ml Puffer 2, der 1 ul anti-Digoxygenin-AP Fab enthält, bei Raumtemperatur für 30 Minuten, zweimal mit 50 ml Puffer 2 jeweils für 30 Minuten, mit 10 ml Puffer 3 (enthält 0,1 M Tris-HCl, 0,1 M Natriumchlorid und 50 mM Magnesiumchlorid, pH 9,5) bei Raumtemperatur für 2-5 Minuten, und mit 5 ml Puffer 3, der 50 ul Lumigen PPd enthält, bei Raumtemperatur für 5 Minuten in dieser Reihenfolge. Wasser wurde anschließend schnell über Filterpapier vom Film entfernt, dieser in Saran Warp eingewickelt, und dann bei 37ºC für 15 Minuten stehengelassen. Der resultierende Film wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten einem Hyperfilm-ECL (von Amersham) ausgesetzt.
Man fand, dass das DNA-Fragment, das stark mit der Sonde hybridisiert hatte, bei einer Position von etwa 5, 5 kb anwesend war.

(3) Fraktionierung chromosomaler DNA:

Die Restriktionsendonuklease XhoI (hergestellt von Takara Shuzo Co. Ltd., 360 U) wurde zu 100 ug chromosomaler DNA von Dactylosporangium sp. RH 1 zugegeben, und das Gemisch wurde bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert. Nach Spaltung der DNA wurde eine gleiche Menge eines Gemisches von mit TE gesättigtem Phenol-Chloroform zugegeben und vermischt. Nach Zentrifugation des Gemisches wurde die obere Schicht abgenommen und sanft mit einem 2,2-fachen Volumen von kaltem Ethanol vermischt. Das Gemisch wurde für 10 Minuten bei 10000 rpm zentrifugiert. Nachdem der Überstand verworfen wurde, wurde das Präzipitat zweimal mit 70% kaltem Ethanol gewaschen, um ein Ethanol-Präzipitat zu erhalten (im weiteren wird das Verfahren zum Erhalt des Ethanol-Präzipitats unter Verwendung des Gemisches aus TE-gesättigtem Phenol-Chlorophorm und kaltem Ethanol als "Ethanol-Präzipitation" bezeichnet). Das Präzipitat wurde in 120 ul TE aufgelöst und das Gemisch wurde einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen. Nach Abschluss der Elektrophorese wurde eine DNA-Fraktion von etwa 5, 5 kb Größe aus dem Agarosegel extrahiert und mit Prep-A-Gene (hergestellt von Biorad Co.) aufgereinigt. Etwa 7 ug der durch XhoI gespaltenen chromosomalen DNA-Fraktion wurden erhalten.

(4) Konstruktion einer Phagen-Bibliothek:

Eine Phagen-Bibliothek wurde wie folgt mit einem unverdautem λ ZAPII Cloning Kit von Stratagene hergestellt.
Die Restriktionsendonuklease XhoI (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd, 36 U) wurde zu 5 ug λZAPII DNA zugegeben und das Gemisch wurde bei 37ºC für drei Stunden inkubiert. Nach Spaltung der DNA wurde das Ethanol-Präzipitat durch Ethanol-Präzipitation erhalten. Nachdem das Ethanol-Präzipitat in 35 ul TE aufgelöst wurde, wurde die Lösung mit alkalischer Phosphatase (aus Kälber-Intestinum) von Takara Shuzo, Co., Ltd. gemäß dem im Handbuch beschriebenen Verfahren dephosphoryliert. Nach Abschluss der Dephosphorylierung wurde das Ethanol-Präzipitat durch die Ethanol-Präzipitation erhalten und das Präzipitat in 5 ul TE aufgelöst. Die auf diese Weise erhaltene XhoI-gespaltene λZAPII-DNA (0,36 ug) wurde mit 0,35 ug XhoI-gespaltener chromosomaler DNA, die in (3) aus Beispiel 2 erhalten wurde bei 26ºC für 2,5 Stunden unter Verwendung eines Ligationskits (TAKARA Ligation Kit von Takara Shuzo Co., Ltd) zur Ligation der beiden DNAs umgesetzt. Zum Reaktionsgemisch wurde Ethanol zugegeben, und das entstehende DNA-Präzipitat in 4 ul TE aufgelöst. Die DNA wurde weiter in λ-Phagenpartikel mit dem Gigapack II Gold Packaging Extract von Stratagene verpackt. Währenddessen wurde der E. coli XL-1 Blue MRF' Stamm (hergestellt von Stratagene) in 3 ml LB-Medium (Lösung erhalten durch Auflösen von 10 g Bactotrypton, 5 g Bactohefeextrakt und 5 g NaCl in 1 L destilliertem Wasser und sterilisiert bei 120ºC für 20 Minuten) inokuliert, das 0,2% (w/v) Maltose und 10 mM Magnesiumsulfat enthielt, und bei 30ºC für 16 Stunden kultiviert. Nach Abschluss der Kultivierung wurden die Zellen zentrifugiert und geerntet und in 10 mM sterilisierter Magnesiumsulfatlösung so suspendiert, dass die Absorption bei 300 nm etwa 0,5 betrug.
200 ul der vorstehend erhaltenen Zeillösung wurden mit 10 ul einer Verpackungs-Lösung vermischt und die vermischte Lösung wurde dann für 15 Minuten bei 37ºC inkubiert. Zur vermischten Lösung wurden 3 ml eines LB-Weichagar-Mediums (wurde erhalten durch Zugabe von Agar zu LB-Medium, so dass die Menge an Agar 0,6% betrug), 15 ul einer 0,5 M IPTG wässrigen Lösung und 50 ul einer X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid)- Lösung (250 mg X-Gal/ml Dimethylformamid) zugegeben. Das Gemisch wurde auf LB- Agarmedium gegeben (dies wurde erhalten durch Zugabe von Agar zu LB-Medium, so dass die Menge an Agar 1,8% betrug), und über Nacht bei 37ºC kultiviert.
Etwa 5000 farblose Plaques wurden erhalten und als Phagen-Bibliothek verwendet.

(5) Selektion eines beabsichtigten Klons:

Der Plaque, der den beabsichtigten Klon enthält, wurde aus der vorstehend genannten Phagen-Bibliothek wie folgt selektiert.
Die auf LB-Agarmedium erscheinenden Plaques wurden auf einen Nylonfilm übertragen (Nytran, hergestellt von Schleicher und Schuell) und mit 5 X SSC gewaschen. Nachfolgend wurde der Film für 5 Minuten auf Filterpapier stehengelassen, das in 0,5 M Natriumhydroxid und 1,5 M Natriumchlorid eingetaucht war. Weiterhin wurde der Film zweimal für jeweils 2 Minuten auf einem Filterpapier stehengelassen, das in 1,5 M Natriumchlorid und 0,5 M Tris- HCl eingetaucht war und auf einem Filterpapier, dass in SSC mit einer 2x Konzentration eingetaucht war, jeweils für zwei Minuten. Nachfolgend wurde der entstehende Film bei 80ºC für 30 Minuten getrocknet. Der getrocknete Film wurde mit SSC, das 0,1% SDS in einer 2-x Konzentration enthielt und dann mit 2 X SSC gewaschen, und dann an der Luft getrocknet.
Der Nachweis wurde mit der in (1) aus Beispiel 2 erhaltenen DIG-Sonde und einem DIG Luminescent Detection Kit von Boehringer Mannheim gemäß dem in (1) aus Beispiel 2 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Es wurde ein positiver Plaque mit dem beabsichtigten Klon nachgewiesen.

(6) Identifizierung eines Klons:

Ein Stück von etwa 1 cm² um den positiven Plaque herum wurde ausgeschnitten. Dazu wurden 1 ml SM (enthaltend 5,8 g/l Natriumchlorid, 2 g/l Magnesiumchlorid, 0,01% Gelatine und 50 mM Tris-HCl, pH 7,5) und 20 ul Chloroform zugegeben. Das Gemisch wurde gründlich gerührt und dann zentrifugiert. Der auf diese Weise erhaltene Überstand wurde als ein Phagen-Extrakt verwendet.
Mit einem von Applied Biosystems hergestellten 380A DNA-Synthesizer wurden ein Sinnstrang-DNA-Primer, der in Sequenz Nr. 6 gezeigt ist, und der den Nukleotiden Nr. 13 bis 32 der in Sequenz Nr. 5 gezeigten Nukleotidsequenz entspricht, und ein Antisense-Strang DNA-Primer, der in Sequenz Nr. 7 gezeigt ist, der den Nukleotiden Nr. 53 bis 71 der Nukleotidsequenz entspricht, die in Sequenz Nr. 5 gezeigt ist (unter der Voraussetzung, dass das Nukleotid, das dem Nukleotid mit der Nr. 66 in Sequenz Nr. 5 entspricht, G ist) synthetisiert.
Die PCR wurde gemäß dem in (3) aus Beispiel 1 beschriebenen Verfahren mit 5 ul des Phagenextrakts, dem in Sequenz Nr. 6 gezeigten Sinnstrang-Primer und dem in Sequenz Nr. 7 gezeigten Antisense-Strang DNA-Primer durchgeführt, um ein DNA Fragment von 59 bp zu erhalten. Das DNA-Fragment wurde durch Elektrophorese auf einem 12,5%- Polyacrylamidgel analysiert und als der beabsichtigte Klon identifiziert.
Die in (4) bis (6) in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren wurden wiederholt, mit der Ausnahme, dass anstelle der in (4) in Beispiel 2 beschriebenen Verpackungsflüssigkeit zur Aufreinigung des beabsichtigten Klons der vorstehend erhaltene Phagenextrakt verwendet wurde.

(7) Bildung eines Plasmids durch in vivo Exzision der Phagen-DNA

Die Bildung eines Plasmids durch in vivo Exzision der Phagen-DNA in dem Extrakt, der in (6) in Beispiel 2 erhalten wurde, wurde mit einem unverdauten AZAPII Cloning Kit von Stratagene gemäß einem im Handbuch beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Der E. coli XL1-Blue MRF'-Stamm wurde in 3 ml LB-Medium, das 0,2% (w/v) Maltose und 10 mM Magnesiumsulfat enthielt, gemäß einem in (4) in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren inokuliert und bei 30ºC für 16 Stunden kultiviert. Nach Abschluss der Kultivierung wurde die Kultur zentrifugiert und die erhaltenen Zellen wurden so in 10 mM Magnesiumsulfat suspendiert, dass die Absorption bei 600 nm etwa 1,0 betrug. Zu 200 ul der Zellsuspension wurden 100 ml des Phagenextrakts, der in (6) von Beispiel 2 und 1 ul eines ExAssist Helfer- Phagen (hergestellt von Stratagene) zugegeben und das Gemisch wurde bei 37ºC für 15 Stunden inkubiert. Zu diesem Reaktionsgemisch wurden 3 ml 2xYT (erhalten durch Auflösung von 10 g Natriumchlorid, 10 g Hefeextrakt und 16 g Bactotrypton in 1 L destilliertem Wasser, und sterilisiert bei 120ºC für 20 Minuten) zugegeben und das Gemisch wurde bei 37ºC für 2 Stunden geschüttelt. Die entstehende Lösung wurde für 20 Minuten bei 70ºC erhitzt und zum Erhalt eines Überstand zentrifugiert. 1 ul des Überstands wurde zu 200 ul einer Suspension des E. coli SOLR-Stammes zugegeben, der auf die gleiche Weise wie der E. coli XL1-Blue MRF'-Stamm kultiviert wurde. Das Gemisch wurde bei 37ºC für 15 Minuten inkubiert, dann auf LB-Agarmedium, das 50 ug pro ml Ampicillin enthielt, ausgestrichen, und über Nacht bei 37ºC kultiviert. Aus den Kolonien, die auf dem Agarmedium wuchsen, wurde gemäß dem in (6) in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren eine positive Kolonie selektiert, mit der Ausnahme dass anstatt des Phagen-Extrakts die Kolonien verwendet wurden.
Aus der auf diese Weise erhaltenen positiven Kolonie wurde in gewöhnlicher Weise ein Plasmid extrahiert, und dessen Struktur wurde durch Verdau mit Restriktionsendonuklease identifiziert. Das auf diese Weise erhaltene Plasmid pRH71 besaß eine Struktur, in der das XhoI-gespaltene DNA-Fragment mit einer Größe von etwa 5,5 kb in die XhoI-Stelle von pBluescript Sk(-) wie in Fig. 1 gezeigt integriert war.

(8) Bestimmung der Nukleotidsequenz:

Aus dem XhoI-Fragment mit einer Größe von etwa 5,5 kb, das in den vorstehend erhaltenen pRH71 inseriert war, wurde mit den entsprechenden Restriktionsendonukleasen ein SacI- XhoI-Fragment mit einer Größe von etwa 2,4 kb (ein Fragment, das in Fig. 1 mit XhoI-1 und SacI-1 gespalten wird) oder ein SacI-Fragment mit einer Größe von etwa 2 kb (ein Fragment, das mit SacI-1 und SacI-2 gespalten werden soll) gespalten, und in die SacI- XhoI-Spaltungsstelle oder die SacI-Spaltungsstelle von pBluescript subkloniert, um die entsprechenden Plasmide pYan10 oder pYan13 zu erhalten, die in Fig. 1 gezeigt werden.
Mit einem Deletionskit für Kilosequenzen von Takara Shuzo Co., Ltd wurden aus pYan10 gemäß einem darin enthaltenen Handbuch Deletionsmutanten-Plasmide hergestellt.
Eine Nukleotidsequenz des SacI-XhoI-Fragments mit der Größe von etwa 2,4 kb im Deletionsplasmid wurde mit einem Sequenz-Bestimmungs-Kit (Taq DyeDeoxyTM Terminator Cycle Sequencing Kit von Applied Biosystems) bestimmt.
Im Hinblick auf pYan13 wurden Deletionsmutanten-Plasmide konstruiert und die Bestimmung der. Nukleotidsequenz wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt, um die Nukleotidsequenz des SacI-SacI-Fragment (Fragment des in Fig. 1 mit SacI-1 und SacI-2 gespalten wird) in dem SacI-Fragment mit einer Größe von etwa 2 kb zu bestimmen.
Die Nukleotidsequenz des SacI-XhoI-Fragment (Fragment, das in Fig. 1 mit XhoI-1 und SacI-2 gespalten werden soll) mit 2707 bp wird in Sequenz Nr. 8 gezeigt.
In der auf diese Weise bestimmten Nukleotidsequenz war die Nukleotidsequenz (entsprechend den Nukleotiden Nr. 264 bis 1079 in Sequenz Nr. 8), repräsentiert durch die Sequenz Nr. 2, die für ein Protein bestehend aus 272 Aminosäuren kodiert, die in Sequenz Nr. 1 gezeigt sind, anwesend. Diese Aminosäuresequenz beinhaltete die in Sequenz Nr. 1 gezeigte N-terminale Aminosäuresequenz, die mit aufgereinigter L-Prolin-4-Hydroxylase bestimmt wurde. Somit wurde identifiziert, dass das beabsichtigte L-Prolin-4-Hydroxylase- Gen in dem erhaltenen XhoI-Fragment mit einer Größe von etwa 5,5 kb anwesend war.

Beispiel 3

Konstruktion eines Expressionsplasmids für L-Prolin-4-Hydroxylase:

(1) Konstruktion eines Expressionsplasmids mit dem trp Promotor (Ptrp):

Ein Sinn-Strang-DNA-Primer, der in Sequenz Nr. 9 gezeigt wird und ein Antisense-Strang- DNA-Primer, der in Sequenz Nr. 10 gezeigt wird, wurden durch einen 380A DNA Synthesizer von Applied Biosystems synthetisiert. Die PCR wurde mit den synthetischen DNAs als Primer und pRH71 als Matrize durchgeführt. Die Reaktion wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 mit 20 ul eines Reaktionsgemisches, das 0,1 ug pRH71, 2uM Sinn-Strang- DNA-Primer und 2 uM eines Antisense-Strang-DNA-Primer enthielt, durchgeführt. Dies bedeutet, nach der Inkubation bei 96ºC für 5 Minuten wurde eine Inkubation in drei Schritten, nämlich bei 96ºC für 2 Minuten, bei 58ºC für 1 Minute und bei 75ºC für 1 Minute insgesamt 30 mal wiederholt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Agarosegelelektrophorese unterzogen. Danach wurde nachgewiesen, dass ein amplifiziertes Fragment von 844 bp gebildet wurde, das für das Strukturgen für L-Prolin-4-Hydroxylase kodiert. Das amplifizierte Fragment wurde in herkömmlicher Weise aus dem Agarosegel extrahiert und mit Prep-A- Gen von Biorad Co. gewonnen. Beide Enden des erhaltenen DNA-Fragments mit 844 bp wurden mit HindIII und BamHI gespalten und durch Ethanol-Präzipitation wurde dann ein Ethanol-Präzipitat erhalten. Das Ethanol-Präzipitat wurde in 5 ul TE aufgelöst.
Das Plasmid pTrS30-DNA, das Ptrp enthielt, wurde durch HindIII und BamHI gespalten. Das Strukturgen-Fragment von L-Prolin-4-Hydroxylase, das mit HindIII und BamHI behandelt wurde, wurde mit dem Ligationskit von Takara Shuzo Co., Ltd in die Speicherungsstelle inseriert. Der E. coli XL1-Blue MRF'-Stamm wurde mit dem so erhaltenen Plasmid auf herkömmliche Weise transformiert. Die Transformante wurde auf LB-Agarmedium, das 50 ug/ml Ampicillin enthielt, ausgestrichen und dann über Nacht bei 37ºC kultiviert. Das Plasmid wurde aus der Kolonie der gewachsenen Transformante in herkömmlicher Weise extrahiert, und die Struktur des Plasmids wurde durch Verdau mit einer Restriktionsendonuklease identifiziert.
Als Ergebnis wurde das Plasmid pTr14 wie in Fig. 2 gezeigt erhalten, in dem das DNA- Fragment, das das Strukturgen der L-Prolin-4-Hydroxylase enthielt, in der gleichen Richtung wie die Transkriptionsrichtung von Ptrp inseriert war.

(2) Konstruktion eines Expressionsplasmids mit dem tac Promotor (Ptac):

Ein Expressionsplasmid mit Ptac wurde auf die gleiche Weise wie in (1) in Beispiel 3 konstruiert.
Ein Sinn-Strang-DNA-Primer, wie in Sequenz Nr. 11 gezeigt, und ein Antisense-Strang- DNA-Primer, wie in Sequenz Nr. 12 gezeigt, wurden synthetisiert. Unter Verwendung der synthetischen DNAs als Primer und pRH71 als Matrize wurde die PCR zum Erhalt eines Amplifikations-Fragment von 146 bp, das für das Strukturgen der L-Prolin-4-Hydroxylase kodiert, durchgeführt. Dieses Fragment wurde durch EcoRI und HindIII gespalten, dann in die EcoRI-HindIII Spaltstelle des Plasmid pBTac1 inseriert, das Ptac (hergestellt von Boehringer Mannheim) enthält, und dann in den E. coli XL1-Blue MRF'-Stamm transformiert.
Das Plasmid pTc4OH, in dem das DNA Fragment, dass das Struktur-Gen von L-Prolin-4- Hydroxylase enthält, in der gleichen Richtung wie die Transkriptionsrichtung von Ptac inseriert war, wurde aus der in Fig. 3 gezeigten entstehende Transformante erhalten.

(3) Konstruktion eines Expressionsplasmids mit Ptrpx2

Auf die gleiche Weise wie in (1) in Beispiel 3 wurde ein amplifiziertes Fragment gewonnen, dass das Strukturgen für L-Prolin-4-Hydroxylase enthielt, und mit Restriktionsenzymen verarbeitet. Durch Ethanolpräzipitation wurde dann ein Ethanol-Präzipitat erhalten. Das Ethanol-Präzipitat wurde in 5 ul TE aufgelöst.
Ein ATG-Vektor, pTrS32, der durch Kombination eines synthetischen Linkers und des Plasmids pKYP200 gebildet wird, der aus dem Basis-Plasmid PBR322 zusammen mit zwei Promotoren Ptrps, die in Reihe verbunden sind (Ptrpx2) zusammengesetzt ist, wurde mit HindIII und BamHI gespalten. Das HindIII-BamHI-Fragment, das das Strukturgen von L- Prolin-4-Hydroxylase enthält, wurde in die HindIII-BamHI-Spaltungsstelle des Vektors mit einem Ligationskit inseriert (hergestellt von Takara Shuzo Co.).
Der Stamm E. coli XL1-Blue MRF' wurde mit dem so erhaltenen Plasmid in üblicher Weise transformiert. Die Transformante wurde auf LB-Agarmedium, das 50 ug/ml Ampicillin enthielt, ausgestrichen und dann über Nacht darauf bei 37ºC kultiviert. Das Plasmid wurde aus den gewachsenen Kolonien der Transformantenzellen in einer herkömmlichen Weise extrahiert und die Struktur des Plasmids durch Verdau mit Restriktionsenzym identifiziert. Der Teil des Strukturgens von L-Prolin-4-Hydroxylase wurde sequenziert, um seine Nukleotidsequenz zu bestimmen, unter Verwendung eines Basensequenzierung-Kits (Taq DyeDeoxyTM Terminator Cycle Sequencing Kit, hergestellt von Applied Biosystems Co.), wodurch aufgezeigt wurde, dass die Nukleotidsequenz des Strukturgens durch Sequenz Nr. 2 gezeigt wird.
Als Ergebnis wurde das Plasmid pTr2-4OH erhalten, in dem das DNA Fragment, das für das Struktur-Gen von L-Prolin-4-Hydroxylase kodiert, in der gleichen Richtung wie die Transkriptions-Richtung von Ptrpx2 inseriert ist, wie in Fig. 4 gezeigt wird.
Eine DNA, die in Sequenz Nr. 13 gezeigt wird und eine DNA, die in Sequenz Nr. 14 gezeigt wird, wurden mit einem 380A DNA-Synthesizer (von Applied Biosystems Co.) synthetisiert. Diese DNAs waren so konstruiert, dass ihre 3'-Termini von 32 Basenpaaren zueinander komplementär waren. Diese DNAs haben jeweils eine Nukleotidsequenz, die für die N- terminale Stelle des von Dactylosporangium sp. RH-1 abgeleiteten L-Prolin-4-Hydroxylase- Proteins kodiert, in der die Nukleotidsequenz ortsspezifisch substituiert wurde, um sie zu einem Kodon zu machen, das für die Expression in E. coli am besten geeignet ist.
Unter Verwendung dieser synthetischen DNAs als Primer und Matrize wurde die PCR durchgeführt. Die Reaktion wurde mit 20 ul eines Reaktionsgemischs durchgeführt, umfassend 0,5 U Pfu DNA-Polymerase (hergestellt von Stratagene Co.), 2 ul 10 · Puffer für Pfu-DNA-Polymerase, 2 pl DMSO, 1 ul 2,5 mM dNTP, 2 uM der synthetischen DNA aus Sequenz Nr. 13 und 2 uM der synthetischen DNA aus Sequenz Nr. 14. Das Reaktionsgemisch wurde bei 96ºC für 5 Minuten inkubiert. Nachfolgend wurde eine Inkubation in 3 Schritten, nämlich bei 96ºC für 2 Minuten, bei 50ºC für 1 Minute und bei 75ºC für 1 Minute insgesamt 35 mal wiederholt. Nachdem das entstehende Reaktionsgemisch einer Gelelektrophorese auf 15% Polyacrylamid unterzogen wurde, wurde die Bildung eines amplifizierten Fragments von 107 bp identifiziert. Das amplifizierte Fragment wurde auf die gleiche Weise wie in (3) aus Beispiel 1 aus dem Gel gewonnen. Die beiden Enden des auf diese Weise gewonnenen DNA-Fragments von 107 bp wurden mit HindIII und SalI gespalten und das auf diese Weise gewonnene Fragment wurde mit dem Mermaid Kit (hergestellt von Bio, Inc.) gewonnen. Die Menge der so gewonnenen Flüssigkeit betrug 16 ul.
Das Plasmid pTr2-4OH DNA wurde mit BamHI und PvuII gespalten. Das Reaktionsgemisch wurde einer Agarosegelelektrophorese unterzogen, wodurch die Bildung zweier Fragmente identifiziert wurde. Von diesen Fragmenten wurde das längere Fragment mit dem Strukturgen für L-Prolin-4-Hydroxylase mit Prep-A-Gen (hergestellt von Biorad, Co.) isoliert. Seine Enden wurden mit einem Glättungs-Kit (hergestellt von Takara Shuzo Co.) geglättet und dann mit einem Ligationskit (hergestellt von Takara Shuzo Co.) zyklisiert. Mit dem auf diese Weise erhaltenen Plasmid wurde der Stamm E. coli JM109 in herkömmlicher Weise transformiert. Die entstehenden Transformantenzellen wurden auf LB-Agar Medium, das 50 ug/ml Ampicillin enthielt, ausgestrichen und dann darauf über Nacht bei 37ºC kultiviert. Aus den gewachsenen Kolonien der Transformantenzellen wurde in herkömmlicher Weise ein Plasmid extrahiert und seine Struktur wurde durch Verdau mit Restriktionsenzym identifiziert. Als Ergebnis wurde das Plasmid pTr2-4OHΔ, dem ein Teil der Sequenz von pTr2-4OH (siehe Fig. 5) fehlt, erhalten.
Das Plasmid pTr2-4OHΔ wurde mit HindIII und mit SalI gespalten. Das PCR-amplifizierte Fragment, das vorstehend mit HindIII und SalI prozessiert wurde, wurde in die HindIII-SalI- Spaltstelle des Plasmids unter Verwendung eines Ligationskits (hergestellt von Takara Skuzo Ltd.) inseriert. Zellen des E. coli Stammes XL1-Blue MRF' wurden mit dem auf diese Weise erhaltenen Plasmid in üblicher Weise transformiert, und die entstehenden Transformantenzellen wurden auf LB-Agar Medium, das 50 ug/ml Ampicillin enthielt, ausgestrichen und dann über Nacht bei 37ºC kultiviert. Aus den gewachsenen Kolonien der Transformante wurde ein Plasmid in herkömmlicher Weise extrahiert, und seine Struktur wurde durch Verdau mit Restriktionsenzym identifiziert. Der Teil des Plasmids, in den das PCR-amplifizierte Fragment inseriert wurde, wurde mit einem Basen-Sequenzierung-Kit (Taq DyeDeoxyTM Terminator Cycle Sequencing Kit, hergestellt von Applied Biosystems Co.) sequenziert, um seine Nukleotidsequenz zu bestimmen. Es zeigt sich, dass die Nukleotidsequenz durch die Sequenz Nr. 15 gezeigt ist.
Als Ergebnis des vorstehend genannten wurde das Plasmid pWFH1 erhalten, dass das Struktur-Gen-DNA-Fragment enthält, das für die Aminosäuresequenz kodiert, die vollständig identisch zur von Dactylosporangium sp. RH1 abgeleiteten L-Prolin-4-Hydroxylase ist, mit der Ausnahme, dass vom 5'-Ende bis zur SalI-Stelle sich das Strukturgen von der von Dactylosporangium sp. RH1-abgeleiteten Nukleotidsequenz unterscheidet, in der gleichen Richtung wie die Transkriptionsrichtung von Ptrpx2 (siehe Fig. 6).

Beispiel 4

Produktion von L-Prolin-4-Hydroxylase durch die Transformante:

E. coli ATCC 12435 wurde mit den Plasmiden pTr14, Ptc4OH und pWFH1, die in Beispiel 3 erhalten wurden, zum Erhalt der Transformanten E. coli ATCC12435/pTr14, E. coli ATTC12435/pTc4OH bzw. E. coli ATTC12435/pWFH1 transformiert. E. coli ATCC12435/pTr14 und E. coli ATTC12435/pTc4OH wurden getrennt in jeweils 3 ml LB- Medium, das 50 ug/ml Ampicillin enthielt, inokuliert und über Nacht bei 30ºC unter Schütteln inkubiert.
E. coli ATTC12435/pWFH1 wurde in 50 ml Med4-Medium [1% Polypepton (hergestellt von Nippon Pharmaceuticals Co.), 0,5% Hefeextrakt (hergestellt von Difco Co.) und 1 NaCl], das 100 ug/ml Ampicillin enthielt, inokuliert und darin 16 Stunden bei 30ºC kultiviert. Die entstehende Kultur wurde als Aussaatkultur verwendet, die in einen 5 l Glas-Fermenter inokuliert wurde, der mit 2 l Med6-Medium gefüllt war (2% Glukose, 1% Ammoniumsulfat, 0,1% K&sub2;HPO&sub4;, 0,2% NaCl, 0,05% MgSO&sub4;, 0,0278% FeSO&sub4;, 0,0015% CaCl&sub2;, 0,4% Polypepton), dem 200 mM L-Prolin zugegeben wurden. Das Gemisch wurde der Kultivierung im Glas-Fermenter unter den Bedingungen von 400 rpm und 1 vvm unterzogen, bei 30ºC für 48 bis 72 Stunden. Während der Inkubation wurden Glukose und L-Prolin in geeigneter Weise dem Medium zugegeben, dass Glukose immer im Medium anwesend war und dass L-Prolin in einer Konzentration von 50 mM anwesend sein konnte, und die niedrigste Grenze des pH des Mediums wurde bei 6,5 durch Zugabe von NH&sub4;OH zum Medium kontrolliert.
Die auf diese Weise erhaltenen Kulturen wurden zentrifugiert, um die Zellen zu trennen.
Die L-Prolin-4-Hydroxylase-Aktivität der Zellen wurde unter den nachstehend beschriebenen Bedingungen gemessen. Wenn erwünscht, können die Zellen eingefroren und bei -20ºC gelagert werden, und die gefrorenen Zellen können aufgetaut und zur Messung der enzymatischen Aktivität verwendet werden.
Die wie vorstehend aufgetrennten Zellen wurden zu 250 ul eines Reaktionsgemischs [umfassend 12 mM L-Prolin, 24 mM 2-Ketoglutarsäure, 4 mM Eisensulfat und 8 mM L- Ascorbinsäure in 240 mM MES-Puffer (pH 6,5)] in einer Menge von 4% (w/v) bezogen auf nasse Zellen zugegeben und bei 35ºC für 10 Minuten umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde für zwei Minuten auf 100ºC erhitzt, um die Reaktion zu stoppen.
Nach dem Stop der Reaktion wurde das entstehende Reaktionsgemisch zentrifugiert und zu 100 ul des entstehenden Überstands wurden 100 ul 0,3 M Boratpuffer (pH 10,7), 4 ul 10% (v/v) Mercaptoethanol und 16 ul 5% (w/v) o-Phtalaldehyd in Ethanol zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei 60ºC für 30 Sekunden gehalten. Dann wurden 50 ul 2% (w/v) NBD in Ethanol zum Reaktionsgemisch zugegeben und bei 60ºC für 40 Minuten gehalten. Zum Abstoppen der Reaktion wurden 30 ul 1 N HCl zum Reaktionsgemisch zugegeben. Das entstehende Reaktionsgemisch wurde zentrifugiert und durch einen Filter filtriert, um das Präzipitat daraus zu entfernen und das entstehende Filtrat wurde durch HPLC analysiert, durch die das hergestellte trans-4-Hydroxy-L-Prolin-Produkt quantitativ bestimmt wurde.
Die HPLC wurde unter den nachstehend beschriebenen Bedingungen durchgeführt.
Mobile Phase: 10 mM Citronensäure (pH 4,0)/Methanol = 3/1 v/v)
Flussrate: 1 ml/min
Säule: YMC Pack ODS AQ-312 (hergestellt von YMC Co., 6 · 150 mm)
Säulentemperatur: 50ºC
Wellenlänge für den Anregungs-Wellenlänge: 503 nm
Nachweis: Emissions-Wellenlänge: 541 nm
Wie nachstehend in Tabelle 1 gezeigt wird, produzierten die Transformanten 210 bis 1420- fach/Zelle so viel L-Prolin-4-Hydroxylase wie der Stamm Dactylosporangium sp. RH1, der als Gen-Quelle verwendet wurde. Tabelle 1 Von Transformanten erzeugte L-Prolin-4-Hydroxylase-Aktivität
(1) Zell-Aktivität zeigt die enzymatische Aktivität pro mg nasse Zellen (U/mg nasse Zellen). Ein U zeigt die enzymatische Aktivität der Erzeugung von 1 nmol trans-4- Hydroxy-L-Prolin pro Minute (nmol/min).
(2) Relative Aktivität basiert auf der enzymatischen Aktivität, die vom Dactylosporangium sp. RH1-Stamm erzeugt wird, die 1 (eins) ist.
(3) Der Stamm wurde auf die gleiche Weise wie vorstehend kultiviert, aber ohne L-Prolin im Glas-Fermenter.
(4) beschrieben in Referenzbeispiel 2.
(5) beschrieben in Referenzbeispiel 3.

Beispiel 5

Konstruktion eines Expressionsplasmids für ein fusioniertes Protein:

(1) Konstruktion eines Expressionsplasmids für ein fusioniertes Protein mit einem β- Galactosidase-Proteinfragment:

Nachdem 2,4 ug pBluescript II KS (+) Plasmid-DNA mit den Restriktionsendonukleasen EcoRV und XbaI gespalten wurden, wurde durch Ethanolpräzipitation ein Ethanol-Präzipitat erhalten. Das Ethanol-Präzipitat wurde in 5 ul TE aufgelöst.
Nachdem 4 ug der pRH71 Plasmid-DNA mit der Restriktionsendonuklease SacI gespalten wurden, wurde ein Ethanol-Präzipitat auf die gleiche Weise wie oben erwähnt erhalten. Nachdem das Ethanol-Präzipitat (DNA-Fragment) in 36 ul TE aufgelöst wurde, wurden beide Enden des DNA-Fragments mit einem Takara DNA Blunting Kit, das von Takara Shuzo Co., Ltd hergestellt wurde, geglättet. Die behandelte DNA wurde einer Agarosegelelektrophorese unterzogen. Ein DNA-Fragment von etwa 2,4 kb wurde aus dem Gel in einer herkömmlichen Weise extrahiert und mit Prep-A-Gene von Biorad, Co. gewonnen. Die gewonnene DNA wurde mit XbaI gespalten und ein Ethanol-Präzipitat wurde auf die gleiche Weise wie vorstehend bemerkt erhalten. Das Ethanol-Präzipitat (DNA-Fragment) wurde in 10 ul TE gelöst.
Cie vorstehend genannte, mit EcoRV-XbaI gespaltene pBluescript II KS (+)-DNA wurde mit der durch SacI gespaltenen, geglätteten und durch XbaI gespaltenen DNA, die mit dem Takara Ligation Kit von Takara Shuzo Co. Ltd. gewonnen wurde, ligiert.
Nachdem der Stamm E. coli XL2-Blue MRF' (hergestellt von Stratagene) mit der auf diese Weise ligierten DNA transformiert wurde, wurde die Transformante auf LB-Agar Medium, das 50 ug pro ml Ampicillin, 0,2 mM IPTG und 40 ug/ml X-Gal enthielt, ausgestrichen und über Nacht bei 37ºC kultiviert.
Das Plasmid wurde in einer herkömmlichen Weise aus der auf dem Medium gewachsenen Kolonie extrahiert, und die Struktur des Plasmids wurde durch Verdau mit Restriktionsendonuklease identifiziert.
Weiterhin wurde eine PCR mit dem Plasmid als Matrize, mit der in Sequenz Nr. 16 gezeigten DNA als Sinn-Strang-Primer und der in Sequenz Nr. 7 gezeigten DNA als Antisense-Strang- Primer durchgeführt. Da durch die vorstehend genannte Reaktion ein DNA-Fragment von 50 Basenpaaren gebildet wurde, das der N-terminalen Aminosäuresequenz der L-Prolin-4- Hydroxylase entspricht, wurde bestätigt, dass das Strukturgen der beabsichtigten L-Prolin-4- Hydroxylase in das Plasmid inseriert war.
Das Plasmid pES1-23a, in dem das Struktur-Gen von L-Prolin-4-Hydroxylase in der gleichen Richtung wie die Transkriptions-Richtung des lac-Promotors inseriert war, fusioniert mit 34 N-terminalen Aminosäuren von β-Gal, wurde durch das vorstehend genannte Verfahren wie in Fig. 7 gezeigt erhalten. Die Aminosäuresequenz des gebildeten fusionierten Proteins wird in Sequenz Nr. 18 gezeigt.

(2) Konstruktion eines Expressionsplasmids für ein fusioniertes Protein mit einem Maltose-bindenden Protein:

Die PCR wurde mit der in Sequenz Nr. 17 gezeigten DNA als Sinn-Strang-Primer, der in Sequenz Nr. 12 gezeigten DNA als Antisense-Strang-Primer und pRH71 als Matrize auf die gleiche Weise wie in (3) in Beispiel 1 durchgeführt. Dies bedeutet, 20 ul eines Reaktionsgemischs, dass 0,1 ug pRH71, 2uM des Sinn-Strang-Primers und 2 uM des Antisense-Strang-DNA-Primers enthielt, wurden bei 96ºC für 5 Minuten inkubiert. Anschließend wurde eine Inkubation in drei Schritten, nämlich bei 96ºC für 2 Minuten, bei 58ºC für 1 Minute und bei 75ºC für 1 Minute insgesamt 30 mal wiederholt.
Nachdem das Reaktionsgemisch einer Agarosegelelektrophorese unterzogen wurde, wurde ein amplifiziertes Fragment von 833 bp, das ein Strukturgen von L-Prolin-4-Hydroxylase enthielt, in einer herkömmlichen Weise extrahiert, und das DNA-Fragment wurde mit Prep- A-Gene von Biorad, Co. gewonnen. Das gewonnene DNA-Fragment von 833 bp wurde mit HindIII gespalten und durch Ethanolpräzipitation wurde ein Ethanol-Präzipitat erhalten. Dieses wurde in 5 ul TE gelöst und als das Struktur-Gen-Fragment von L-Prolin-4- Hydroxylase verwendet.
Das Plasmid pMAL-c2, das nur ein Struktur-Gen eines Maltose-bindenden Proteins ohne eine Signalsequenz enthält (Protein Fusion & Purification System hergestellt von New England Biolabs) wurde mit XmnI und HindIII während der Regulation von Ptac gespalten.
Das Struktur-Gen-Fragment von L-Prolin-4-Hydroxylase wurde mit einem DNA-Ligationskit von Takara Shuzo Co., Ltd in die XmnI-HindIII-Spaltstelle von pMAL-c2 inseriert und der E.coli XL2-Blue MRF'-Stamm wurde auf gewöhnliche Weise transformiert. Die Transformante wurde auf LB-Agarmedium, das 50 ug/ml Ampicillin enthielt, ausgestrichen und dann über Nacht bei 37ºC kultiviert. Das Plasmid wurde aus der so erhaltenen Kolonie in üblicher Weise extrahiert, und die Struktur des Plasmids wurde durch Verdau mit einer Restriktionsendonuklease identifiziert.
Das Plasmid pMc4OH, in dem das DNA-Fragment, das für das Struktur-Gen von L-Prolin-4- Hydroxylase kodiert, so inseriert war, dass es in der Form fusioniert an das Struktur-Gen des Maltose-bindenden Proteins durch Regulierung des Ptac fusioniert war, wurde durch das zuvor beschriebene Verfahren wie in Fig. 8 erhalten. Die Aminosäuresequenz des gebildeten fusionierten Proteins ist in Sequenz Nr. 19 gezeigt.

Beispiel 6

Produktion von L-Prolin-4-Hydroxylase durch eine Transformante, die ein fusioniertes Protein-Expressionsplasmid enthält:

E. coli wurde mit den in Beispiel 5 erhaltenen Plasmiden pES1-23a und pMc4OH transformiert. Die erhaltene Transformante wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 4 kultiviert, mit der Ausnahme, dass ein Medium verwendet wurde, das 0,1 mM IPTG enthielt, und dass die Produktivität von L-Prolin-4-Hydroxylase der Transformante auf die gleiche Weise wie in Beispiel 4 gemessen wurde.
Wie in Tabelle 2 gezeigt, produzierte die Transformante L-Prolin-4-Hydroxylase in einer Menge von 29-298-fach pro Zelle, verglichen mit dem Dactylosporangium sp. RH1-Stamm, der als Genquelle verwendet wurde. Tabelle 2 Aktivitäten der von Transformanten produzierten L-Prolin-4-Hydroxylase
(1) Die Zell-Aktivität wird als enzymatische Aktivität pro mg nasse Zellen gezeigt (U/mg nasse Zellen). Ein U zeigt die enzymatische Aktivität der Erzeugung von 1 nmol trans-4-Hydroxy-L-Prolin pro Minute (nmol/min).
(2) beschrieben in Referenzbeispiel 2.
(3) Die relative Aktivität wird durch Definition der enzymatischen Aktivität vom Stamm Dactylosporangium sp. RH1 als 1 gezeigt.

Beispiel 7

Produktion von trans-4-Hydroxy-L-Prolin von einer Transformante:

(1) Produktion von trans-4-Hydroxy-L-Prolin durch die Transformante E. coli ATCC12435/pTr14:

Transformanten-Zellen von E. coli ATCC12435/pTr14, die wie in Beispiel 4 beschrieben erhalten wurden, wurden in 3 ml eines LB-Medium inokuliert, das 100 ug/ml Ampicillin enthielt und wurden darin bei 30ºC für 16 Stunden unter Schütteln inkubiert. Die entstehende Kultur wurde zentrifugiert, und die Menge an trans-4-Hydroxy-L-Prolin im so abgetrennten Überstand wurde quantitativ bestimmt.
Im Überstand der Kultur von E. coli ATCC12435/pTr14 wurden 381 uM (50,0 mg/Liter) trans- 4-Hydroxy-L-Prolin gebildet.
Andererseits wurde trans-4-Hydroxy-L-Prolin nicht im Überstand der Kultur von E. coli ATCC12435 entdeckt, der als Wirt verwendet wurde.

(2) Produktion von trans-4-Hydroxy-L-Prolin durch die Transformante E. coli ATCC 12435/pWFH 1:

Transformantenzellen von E. coli ATTC12435/pWFH1 wurden im 50 ml eines Med4- Mediums, das 100 ug/ml Ampicillin und 2% Glukose enthielt, inokuliert und unter Schütteln 16 Stunden bei 30ºC kultiviert. Die Kultur wurde als Aussaat-Kultur verwendet, die in einen 5 l Glas-Fermenter inokuliert wurde, der mit 2 l Med6-Medium gefüllt war, das anstelle von Polypepton 0,8% Pepton enthielt. Die Zellen wurden in dem Fermenter unter den Bedingungen von 400 rpm und 1 vvm bei 33ºC kultiviert.
Während der Kultivierung wurde Glukose in geeigneter Weise dem Medium in solch einer Weise zugegeben, dass Glukose immer im Medium anwesend war, und die niedrigste Grenze des pH des Mediums wurde bei 6,5 durch Zugabe von NH&sub4;OH zum Medium kontrolliert.
Die Kultur wurde zentrifugiert und die Menge an trans-4-Hydroxy-L-Prolin im abgetrennten Überstand quantitativ bestimmt. 52 Stunden nach dem Beginn der Inkubation wurden im Überstand der Kultur von E. coli ATTC12435/pWFH1 10,7 mM (1,4 g/l) trans-4-Hydroxy-L- Prolin produziert und angelagert.
Andererseits wurde freies trans-4-Hydroxy-L-Prolin nicht im Überstand der Kultur von E. coli ATCC12435 entdeckt, der als Wirt verwendet wurde.

(3) Produktion von trans-4-Hydroxy-L-Prolin durch die Transformante E. coli ATCC 12435/pWFH 1:

Transformantenzellen von E. coli ATTC12435/pWFH1 wurde in 50 ml eines Med4-Mediums, das 100 ug/ml Ampicillin enthielt, inokuliert und darin 16 Stunden bei 30ºC unter Schütteln kultiviert. Die Kultur wurde als eine Aussaat-Kultur verwendet, die in einen 5 l Glas- Fermenter inokuliert wurde, der mit 2 l eines Med6-Medium gefüllt war. Zum Medium wurden 200 mM L-Prolin zugegeben. Die Zellen wurden im Fermenter bei der Bedingung von 400 rpm und 1 vvm bei 30ºC kultiviert.
Während der Kultivierung wurden Glukose und L-Prolin in geeigneter Weise zum Medium in solch einer Weise zugegeben, dass Glukose immer im Medium anwesend war und dass L- Prolin in einer Konzentration von 50 mM anwesend sein konnte, und die niedrigste Grenze des pH des Mediums wurde bei 6,5 durch Zugabe von NH&sub4;OH zum Medium kontrolliert.
Die Kultur wurde zentrifugiert und die Menge an trans-4-Hydroxy-L-Prolin im abgetrennten Überstand wurde quantitativ bestimmt. 72 Stunden nach dem Beginn der Inkubation wurden im Überstand der Kultur von E. coli ATTC12435/pWFH1 185 mM (24 g/Liter) trans-4- Hydroxy-L-Prolin produziert und angelagert.
Andererseits wurde freies trans-4-Hydroxy-L-Prolin nicht im Überstand der Kultur von E. coli ATCC12435 entdeckt, der als Wirt verwendet wurde.

(4) Produktion von trans-4-Hydroxy-L-Prolin durch die Transformante E. coli ATCC 12435/pMc4OH:

Transformantenzellen von E. coli ATTC12435/pMC4OH wurden in 50 ml eines Med4- Mediums, das 100 ug/ml Ampicillin enthielt, inokuliert und unter Schütteln 16 Stunden bei 30ºC kultiviert. Die entstehende Kultur wurde als eine Aussaat-Kultur verwendet, die in einen 5 l Glas-Fermenter inokuliert wurde, der mit 2 Liter Med6-Medium gefüllt war, dem 200 mM L-Prolin zugegeben wurden. Die Zellen wurden im Fermenter unter den Bedingungen von 400 rpm und 1 vvm bei 30ºC kultiviert
Während der Inkubation wurden Glukose und L-Prolin in geeigneter Weise dem Medium in solch einer Weise zugegeben, dass Glukose immer im Medium anwesend war und dass L- Prolin in einer Konzentration von 50 mM anwesend sein konnte, und die niedrigste Grenze des pH des Mediums wurde bei 6,5 durch Zugabe von NH&sub4;OH zum Medium kontrolliert.
Die Kultur wurde zentrifugiert und die Menge an trans-4-Hydroxy-L-Prolin im abgetrennten Überstand quantitativ bestimmt. 72 Stunden nach dem Beginn der Inkubation wurden im Überstand der Kultur von E. coli ATTC12435/pMC4OH 85,4 mM (11,2 g/Liter) trans-4- Hydroxy-L-Prolin produziert und angelagert.
Andererseits wurde freies trans-4-Hydroxy-L-Prolin nicht im Überstand der Kultur von E. coli ATCC12435 entdeckt, der als Wirt verwendet wurde.

Beispiel 8

Konversion von L-Prolin zu trans-4-Hydroxy-L-Prolin mit Transformantenzellen:

Transformantenzellen von E. coli ATCC12435/pTr14 wurden in 10 ml LB-Medium inokuliert, das 50 ug/ml Ampicillin enthielt und darin über Nacht bei 30ºC unter Schütteln inkubiert. Die Kultur wurde zur Ernte der Zellen zentrifugiert. Wenn gewünscht, wurden die Zellen bei - 20ºC eingefroren und gelagert und vor der Verwendung aufgetaut.
Die Zellen wurden zu 250 ul eines Reaktionsgemisches zugegeben (umfassend 20 mM L- Prolin, 24 mM 2-Ketoglutarsäure, 4 mM Eisensulfat und 8 mM Ascorbinsäure in 240 mM MES Puffer, pH 6,5) bei 10% (w/v) bezogen auf nasse Zellen, und bei 35ºC für 60 Minuten umgesetzt. Die im Reaktionsgemisch gebildete Menge an trans-4-Hydroxy-L-Prolin wurde quantitativ bestimmt. Im Gemisch wurden 11,5 mM (1,5 g/Liter) trans-4-Hydroxy-L-Prolin produziert.

Referenzbeispiel 1

Isolierung und Reinigung von L-Prolin-4-Hydroxylase:

(1) Präparation gefrorener Zellen von Dactylosporangium sp. RH1:

SR3 Medium (umfassend 1,0% Glucose, 1,0% lösliche Stärke, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% Trypton, 0,3% Fleischextrakt und 0,05% Magnesiumphosphat und mit 6N NaOH auf einen pH von 7,2 eingestellt) wurde in einer Menge von 200 ml in einen 2 l Erlenmeyerkolben gegeben und bei 120ºC für 20 Minuten sterilisiert. Zellen von Dactylosporangium sp. RH1, die in einem HT-Agar-Plattenmedium gewachsen waren (umfassend 1% lösliche Stärke, 0,2 % NZ-Amin, 01,% Hefeextrakt, 0, 1% Fleischextrakt und 1,5% Agar, mit 6 NaOH auf einen pH von 7,2 eingestellt und bei 120ºC für 20 Minuten sterilisiert) wurden in das SR3-Medium inokuliert und 2 Tage unter Schütteln bei 28ºC kultiviert. Die entstehende Kultur wurde in den folgenden Schritten als Aussaat-Kultur verwendet.
Zwei Liter Df1-Medium (umfassend 5% lösliche Stärke, 1,5% Sojabohnenmehl, 0,05% Monokaliumphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat-7-hydrat und 0,5% Kalziumcarbonat, mit 6 N NaOH auf pH 7,0 eingestellt) wurde in einem 5-Liter Glas-Fermenter gegeben und bei 120ºC für 20 Minuten sterilisiert. Die vorstehend präparierte Aussaatkultur wurde unter keimfreien Bedingungen in das Medium inokuliert und darin bei 700 rpm, 1 vvm und 28ºC für 2 Tage kultiviert. Der pH-Wert des Mediums wurde während der Kultivierung nicht kontrolliert. Die entstehende Kultur wurde bei 7000 · g für 10 Minuten bei 4ºC zentrifugiert. Somit wurden 75 g nasse Zellen pro Liter Kultur erhalten. Die nassen Zellen wurden mit physiologischer Kochsalzlösung bei 4ºC gewaschen, zentrifugiert, dann eingefroren und bei -80ºC bis zur weiteren Verwendung gelagert.

(2) Herstellung von zellfreiem Extrakt:

600 g der nassen Zellen, die in (1) in Referenzbeispiel 1 erhalten wurden, wurden aufgetaut und in 3 I Puffer A [50 mM TAPS-Puffer (pH 9,0) mit 2 mM DTT, 0,2 mM EDTA und 20% (v/v) Glycerin] suspendiert, während mit Eis gekühlt wurde. Die Suspension wurde mit einer Dyno-Mühle (hergestellt von Willy A. Bachofen, Maschinenfabrik, Basel, Schweiz) zermahlen, um die Zellen aufzuschließen. Die auf diese Weise aufgeschlossene Zellsuspension wurde bei 6500 · g 30 Minuten bei 4ºC zentrifugiert, um den Überstand abzutrennen. Die darauffolgenden Schritte wurden unter Kühlung mit Eis bei einer Temperatur von 4ºC oder niedriger durchgeführt.

(3) Isolierung und Reinigung durch Säulenchromatographie:

(3)-1 STREAMLINE:

Der im vorhergehenden Schritt erhaltene Überstand wurde durch eine STREAMLINETM (hergestellt von Pharmacia Co.) passagiert, die mit 300 ml DEAE-Adsorbens befüllt und mit Puffer A equilibriert war. Die L-Prolin-4-Hydroxylase-enthaltende Fraktion wurde mit Puffer A mit 0,3 M NaCl eluiert.

(3)-2: DEAE-Sepharose-Säulenchromatographie:

Die im vorhergehenden Schritt erhaltene aktive Fraktion wurde dreifach mit Puffer A verdünnt und durch eine DEAE-Sepharose-Säule (5 · 15 cm) passagiert, die mit Puffer A equilibriert war. Die Säule wurde mit Puffer A gewaschen und die das Enzym enthaltende Fraktion wurde mit Puffer A mit Hilfe eines linearen Konzentrationsgradienten von 0 bis 0,3 M NaCl eluiert.

(3)-3 Butyl-Sepharose-Säulenchromatographie:

NaCl wurde zur im vorhergehenden Schritt erhaltenen aktiven Fraktion hinzugegeben, bis die NaCl-Konzentration 3 M betrug. Die Mischung wurde durch eine Butyl-Sepharose-Säule (Butyl-Sepharose 4 Fast Flow, 2,6 · 13 cm) passagiert, die mit Puffer A mit 3 M NaCl equilibriert war. Das Enzym wurde schrittweise mit vier verschiedenen Puffern eluiert, wobei jeder eine andere NaCl-Konzentration hatte; Puffer A mit 3 M NaCl, Puffer A mit 1,98 M NaCl, Puffer A mit 0,99 M NaCl und Puffer A ohne NaCl. Die Puffer wurden in dieser Reihenfolge von einem Elutionspuffer mit einer höheren zu einem Puffer mit einer niedrigeren NaCl-Konzentration verwendet.

(3)-4 Phenyl-Sepharose-Säulenchromatographie:

NaCl wurde zur im vorhergehenden Schritt erhaltenen aktiven Fraktion hinzugegeben, bis die NaCl-Konzentration 3 M betrug. Die Mischung wurde durch eine Phenyl-Sepharose- Säule (Phenyl-Sepharose HP Hiload 16/10, 1,6 · 10 cm) passagiert, die mit Puffer A mit 3 M NaCl equilibriert war. Die Säule wurde mit Puffer A mit 3 M NaCl gewaschen und die das Enzym enthaltende Fraktion mit Puffer A eluiert.

(3)-5 Farbstoff-Affinitäts-Säulenchromatographie:

Die im vorhergehenden Schritt erhaltene aktive Fraktion wurde mit Hilfe einer PD-10-Säule (hergestellt von Pharmacia Co.) entsalzt und die resultierende Fraktion durch eine Reactive Red 120-Säule (1 · 12,7 cm, hergestellt von Sigma Co.) passagiert, die mit Puffer A equilibriert war. Die Säule wurde mit Puffer A gewaschen und die das Enzym enthaltende Fraktion mit Puffer A unter Verwendung eines linearen Konzentrationsgradienten von 0 bis 1,5 M NaCl eluiert.

(3)-6 Resource-Q-Säulenchromatographie:

Die im vorhergehenden Schritt erhaltene aktive Fraktion wurde mit einer PD-10-Säule (hergestellt von Pharmacia Co.) entsalzt, die mit Puffer B [50 mM TAPS-Puffer (pH 8,0) mit 2 mM DTT, 0,1% (v/v) Tween 20 und 20% (v/v) Glycerin] equilibriert war. Die resultierende Fraktion wurde durch eine RESOURCETM-Q-Säule (1 ml, hergestellt von Pharmacia Co.) passagiert, die mit Puffer B equilibriert war. Die das Enzym enthaltende Fraktion wurde mit Puffer B in einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 bis 0,2 M NaCl eluiert.
Die Zusammenfassungen der Isolierung und Reinigung der L-Prolin-4-Hydroxylase sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Zusammenfassungen der Isolierung und Reinigung von L-Prolin-4-Hydroxylase

Referenzbeispiel 2

Herstellung von L-Prolin-4-Hydroxylase durch Dactylosporangium sp. RH1:

SR3-Medium wurde in einer Menge von 10 ml in Teströhrchen gegeben und bei 120ºC 20 Minuten sterilisiert. Dactylosporangium sp. RH1-Zellen, die auf HT-Agarplatten-Medium kultiviert wurden, wurden in das vorstehend erwähnte Medium in jedem Teströhrchen angeimpft, 2 Tage bei 28ºC unter Schütteln kultiviert und als Aussaat-Kultur in den nachstehenden Schritten verwendet.
Df1-Medium wurde zu je 10 ml in Teströhrchen gegeben und bei 120ºC 20 Minuten sterilisiert. 1 ml der vorstehend genannten Aussaatkultur wurde in das Medium in jedem Teströhrchen unter sterilen Bedingungen angeimpft und bei 28ºC für 2 Tage unter Schütteln kultiviert. Die so erhaltene Kultur wurde bei 8000 rpm 10 Minuten bei 4ºC zentrifugiert. Die abgetrennten Zellen wurden mit 80 mM TES [N-tris(hydroxymethyl)methyl-2- aminoethansulfonsäure]-Puffer (pH 7,5) gewaschen und sodann erneut zentrifugiert. 150 mg der so erhaltenen nassen Zellen wurden in 1,5 ml einer Reaktionsmischung suspendiert, hergestellt durch Zugabe von 1,4% (v/v) Nymeen-Lösung [hergestellt durch Zugabe von 4 g Nymeen S-215 (hergestellt von Nippon Oils and Fats Co.) zu 10 ml Xylol] zu 80 mM TES- Puffer (pH 7,5) mit 4 mM L-Prolin, 8 mM α-Ketoglutarsäure, 4 mM L-Ascorbinsäure und 2 mM Eisensulfat, und die Mischung wurde 30 Minuten bei 30ºC für die Durchführung der enzymatischen Reaktion stehengelassen.
Nach der Reaktion wurden die Zellen aus der Reaktionsmischung durch Zentrifugation entfernt und die Menge an im Überstand produzierten Hydroxyprolin bestimmt, aus dem die L- Prolin-4-Hydroxylase- Aktivität der Dactylosporangium sp. Zellen bestimmt wurde.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.

Referenzbeispiel 3

Herstellung von L-Prolin-4-Hydroxylase durch Streptomyces griseoviridis

Die L-Prolin-4-Hydroxylase-Aktivität von Streptomyces griseoviridis JCM4250 und Streptomyces daghestanicus JCM4365 wurde auf die gleiche Weise wie in Referenzbeispiel 2 bestimmt. In diesem Beispiel wurde jedoch Df4-Medium [umfassend 2,5% Glycerin, 2,5 % Glukose, 1.5% Sojabohnenmehl, 0,005% Monokaliumphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat-7-Hydrat und 0,5% Kalziumkarbonat, wobei der pH mit 6 N NaOH auf 7,0 eingestellt wurde) anstelle von Df1-Medium verwendet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.

Industrielle Anwendbarkeit der Erfindung

Erfindungsgemäß werden industrielle Verfahren zur Herstellung von trans-4-Hydroxy-L- Prolin bereitgestellt, das als eine Ausgangsverbindung für Arzneimittel und als Additiv für Lebensmittel nützlich ist, Gene, die für ein Protein mit der Aktivität zur Hydroxylierung der 4- Position von L-Prolin kodieren und die für das vorstehend genannte Verfahren nützlich sind, Transformanten, die diese Gene enthalten, und Verfahren zur Herstellung von L-Prolin-4- Hydroxylasen unter Verwendung dieser Transformanten.

SEQUENZPROTOKOLL

ALLGEMEINE INFORMATION:
ANMELDER:
NAME: Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
STRASSE: 6-1, Ohtemachi 1-chome, Chiyoda-ku
STADT: Tokio
LAND: Japan
POSTLEITZAHL: 100
TITEL DER ERFINDUNG: Verfahren zur Herstellung von trans-4-Hydroxy-L-Prolin
ANZAHL DER SEQUENZEN: 19
COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
DATENTRÄGER: 3,5 Diskette, 1,44 MB
COMPUTER: IBM PS/2-Modell 502 oder 55SX
BETRIEBSSYSTEM: MS-DOS (Version 5.0)
SOFTWARE: Microsoft Word
DATEN ZUR VORLIEGENDEN ANMELDUNG:
ANMELDENUMMER: EP 96 905 024.4
ANMELDETAG:
DATEN ZU FRÜHEREN ANMELDUNGEN:
ANMELDENUMMER: PCT/JP9600559
ANMELDETAG: 7. März 1996
INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 1:
SEQUENZKENNZEICHEN:
LÄNGE: 272 Aminosäuren
TYP: Aminosäure
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLART: Protein
URSPRUNG:
ORGANISMUS: Dactylosporangium sp.
STAMM: RH1 SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 2:
LÄNGE: 816 Basenpaare
TYP: Nukleinsäure
STRANG: Doppelstrang
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLART: genomische DNA
URSPRUNG:
ORGANISMUS: Dactylosporangium sp.
STAMM: RH1
EIGENSCHAFT:
IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN: durch Versuch SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2
INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 3:
SEQUENZKENNZEICHEN
LÄNGE: 17 Basenpaare
TYP: Nukleinsäure
STRANG: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLART: andere Nukleinsäure, synthetische DNA SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 4:
SEQUENZKENNZEICHEN:
LÄNGE: 17 Basenpaare
TYP: Nukleinsäure
STRANG: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLART: andere Nukleinsäure, synthetische DNA SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4
INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 5:
SEQUENZKENNZEICHEN:
LÄNGE: 71 Basenpaare
TYP: Nukleinsäure
STRANG: Doppelstrang
MOLEKÜLART: andere Nukleinsäure, synthetische DNA SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5
INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 6:
SEQUENZKENNZEICHEN:
LÄNGE: 20 Basenpaare
TYP: Nukleinsäure
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TOPOLOGIE: linear
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INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 7:
SEQUENZKENNZEICHEN:
LÄNGE: 19 Basenpaare
STRANG: Einzelstrang
TYP: Nukleinsäure
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLART: andere Nukleinsäure, synthetische DNA SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7
INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 8:
SEQUENZKENNZEICHEN:
LÄNGE: 2707 Basenpaare
TYP: Nukleinsäure
STRANG: Doppelstrang
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLART: genomische DNA
URSPRUNG:
ORGANISMUS: Dactylosporangium sp.
STAMM: RH1 SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8
INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 9:
SEQUENZKENNZEICHEN:
LÄNGE: 37 Basenpaare
TYP: Nukleinsäure
STRANG: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLART: andere Nukleinsäure, synthetische DNA SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9
INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 10:
SEQUENZKENNZEICHEN:
LÄNGE: 36 Basenpaare
TYP: Nukleinsäure
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TOPOLOGIE: linear
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INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 11:
SEQUENZKENNZEICHEN:
LÄNGE: 37 Basenpaare
TYP: Nukleinsäure
STRANG: Einzelstrang
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INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 12:
SEQUENZKENNZEICHEN:
LÄNGE: 38 Basenpaare
TYP: Nukleinsäure
STRANG: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLART: andere Nukleinsäure, synthetische DNA SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12
INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 13:
SEQUENZKENNZEICHEN:
LNGE: 64 Basenpaare
TYP: Nukleinsäure
STRANG: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLART: andere Nukleinsäure, synthetische DNA SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13
INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 14:
SEQUENZKENNZEICHEN:
LÄNGE: 66 Basenpaare
TYP: Nukleinsäure
STRANG: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLART: andere Nukleinsäure, synthetische DNA SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14
INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 15:
SEQUENZKENNZEICHEN:
LÄNGE: 816 Basenpaare
TYP: Nukleinsäure
STRANG: Doppelstrang
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLART: andere Nukleinsäure SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15
INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 16:
SEQUENZKENNZEICHEN:
LÄNGE: 20 Basenpaare
TYP; Nukleinsäure
STRANG: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLART: andere Nukleinsäure, synthetische DNA SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16
INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 17:
SEQUENZKENNZEICHEN:
LÄNGE: 21 Basenpaare
TYP: Nukleinsäure
STRANG: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLART: andere Nukleinsäure, synthetische DNA SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17
INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 18:
SEQUENZKENNZEICHEN:
LÄNGE: 299 Aminosäuren
TYP: Aminosäure
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLART: Protein
URSPRUNG:
ORGANISMUS: Dactylosporangium sp.
STAMM: RH1
EIGENSCHAFT:
NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
POSITION: 35 bis 299
IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN: durch Ähnlichkeit zu bekannter Sequenz oder zu einem bekannten Konsensus
URSPRUNG:
ORGANISMUS: Escherichia coli
UNMITTELBARE QUELLE: pBluescriptIIKS+
EIGENSCHAFT:
NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
Position: 1 bis 34
IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN: durch Ähnlichkeit zu bekannter Sequenz oder zu einem bekannten Konsensus SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18
INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 19:
SEQUENZKENNZEICHEN:
LÄNGE: 659 Aminosäuren
TYP: Aminosäure
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLART. Protein
URSPRUNG:
ORGANISMUS: Dactylosporangium sp.
STAMM: RH1
EIGENSCHAFT:
NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
POSITION: 389 bis 659
IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN: durch Versuch
URSPRUNG:
ORGANISMUS: Escherichia coli
UNMITTELBARE QUELLE: pMAL-c2
EIGENSCHAFT:
NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
POSITION: 1 bis 387
IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN: durch Ähnlichkeit zu bekannter Sequenz oder zu einem bekannten Konsensus SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19

Claims

1. Ein isoliertes Nukleinsäurefragment, das für ein Protein mit der Aminosäuresequenz ausgewählt aus den Sequenzen Nr. 1, 18 und 19 kodiert:

2. Isoliertes Nukleinsäurefragment, ausgewählt aus den Nukleotidsequenzen der Sequenzen Nr. 2, 8 und 15.

3. Isoliertes Nukleinsäurefragment, das mit dem Nukleinsäurefragment gemäß den Ansprüchen 1 oder 2 hybridisiert und für ein Protein kodiert, das die enzymatische Aktivität zur Hydroxylierung der 4-Position von L-Prolin besitzt, und das in Anwesenheit von 2-Ketoglutarsäure und zweiwertigen Eisenionen L-Prolin zu trans-4-Hydroxy-L-Prolin umsetzt.

4. Nukleinsäurefragment gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, wobei das Gen gewonnen wird aus Mikroorganismen, die zu den Gattungen ausgewählt aus Dactylosporangium, Amycolatopsis und Streptomyces gehören.

5. Isoliertes Nukleinsäurefragment gemäß Anspruch 4, wobei die Mikroorganismen ausgewählt sind aus Dactylosporangium sp. RH1 (FERM BP-4400), Amycolatopsis sp. RH2 (FERM BP-4581), Streptomyces griseoviridis JCM4250 und Streptomyces daghestanicus JCM4365.

6. Expressionsvektor, hergestellt durch Insertion eines Nukleinsäurefragments gemäß den Ansprüchen 1 bis 5 in einen Vektor.

7. Transformierte Zelle, enthaltend einen Expressionsvektor gemäß Anspruch 6.

8. Transformierte Zelle gemäß Anspruch 7, die Escherichia coli SOLR/pRH71 ist.

9. Protein mit einer der Aminosäuresequenzen der Sequenzen Nr. 18 und 19.

10. Verfahren zur Herstellung einer L-Prolin-4-Hydroxylase, umfassend das Kultivieren transformierter Zellen gemäß den Ansprüchen 7 oder 8 in einem Medium, wodurch eine L- Prolin-4-Hydroxylase hergestellt und angereichert wird, gefolgt von Gewinnen der L-Prolin-4- Hydroxylase aus der resultierenden Kultur.

11. Verfahren zur Herstellung von L-Prolin-4-Hydroxylase gemäß Anspruch 10, wobei L- Prolin dem Medium zugesetzt wird.

12. Verfahren zur Herstellung von trans-4-Hydroxy-L-Prolin, umfassend das Kultivieren transformierter Zellen gemäß den Ansprüchen 7 oder Bin einem Medium, wodurch trans-4- Hydroxy-L-Prolin hergestellt und angereichert wird, gefolgt von Gewinnen des trans-4- Hydroxy-L-Prolins aus der resultierenden Kultur.

13. Verfahren zur Herstellung von trans-4-Hydroxy-L-Prolin gemäß Anspruch 12, wobei die transformierte Zelle die Aktivität zur Herstellung von L-Prolin aus Zuckerquellen in dem Medium besitzt, und Anreichern von L-Prolin in der Kultur.

14. Verfahren zur Herstellung von trans-4-Hydroxy-L-Prolin gemäß Anspruch 12, wobei die transformierte Zelle die Fähigkeit zur Herstellung von 2-Ketoglutarsäure aus Zuckerquellen in dem Medium besitzt, und Anreichern von 2-Ketoglutarsäure in der Kultur.

15. Verfahren zur Herstellung von trans-4-Hydroxy-L-Prolin gemäß Anspruch 12, wobei L-Prolin dem Medium zugesetzt wird.

16. Verfahren zur Herstellung von trans-4-Hydroxy-L-Prolin gemäß Anspruch 12, wobei L-Prolin, 2-Ketoglutarsäure und zweiwertige Eisenionen dem Medium zugesetzt werden.

17. Verfahren zur Herstellung von trans-4-Hydroxy-L-Prolin, umfassend Kultivieren transformierter Zellen gemäß Anspruch 7 oder 8 in einem Medium, dann Umsetzen von L-Prolin zu trans-4-Hydroxy-L-Prolin in Anwesenheit von 2-Ketoglutarsäure und zweiwertigen Eisenionen in der Kultur oder in einem wässrigen Medium, während die Kultur, die kultivierten Zellen oder ein Produkt, das durch Verarbeiten der Zellen hergestellt werden soll, als enzymatische Quelle verwendet wird, gefolgt von Gewinnen des resultierenden trans-4-Hydroxy- L-Prolins aus der Kultur oder dem wässrigen Medium.

18. Verfahren zur Herstellung von trans-4-Hydroxy-L-Prolin gemäß Anspruch 17, wobei die transformierte Zelle die Fähigkeit zur Herstellung von L-Prolin aus Zuckerquellen in dem Medium besitzt, und Anreichern von L-Prolin in der Kultur.

19. Verfahren zur Herstellung von trans-4-Hydroxy-L-Prolin gemäß Anspruch 17, wobei die transformierte Zelle die Fähigkeit zur Herstellung von 2-Ketoglutarsäure aus Zuckerquellen in dem Medium besitzt, und Anreichern von 2-Ketoglutarsäure in der Kultur.

20. Verfahren zur Herstellung von trans-4-Hydroxy-L-Prolin gemäß Anspruch 17, wobei das durch Umsetzen der kultivierten Zellen herzustellende Produkt ausgewählt ist aus getrockneten Zellen, lyophilisierten Zellen, Surfaktanzien-behandelten Zellen, enzymatisch behandelten Zeilen, ultraschallbehandelten Zellen, mechanisch zermahlenen Zellen, Lösungsmittel-behandelten Zellen, fraktionierten Zellproteinen, immobilisierten Zellen, immobilisierten Zellprodukten, Rohenzymen mit der enzymatischen Aktivität der Hydroxylierung der 4-Position von L-Prolin, das aus den Zellen extrahiert werden soll, gereinigten Produkten aus den Rohenzymen und immobilisierten Enzymen.