CN1132938C

CN1132938C - 生产反－4－羟基－l－脯氨酸的方法

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Publication number: CN1132938C
Application number: CN96190335A
Authority: CN
Inventors: 尾崎明夫; 森英郎; 柴崎刚
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1995-03-07
Filing date: 1996-03-07
Publication date: 2003-12-31
Anticipated expiration: 2016-03-07
Also published as: KR970702921A; DE69621714D1; HK1000712A1; ES2176441T3; EP0759472A1; EP0759472B1; WO1996027669A1; CN1150821A; ATE219142T1; CA2189682C; EP0759472A4; JP3440100B2; KR100460579B1; CA2189682A1; DE69621714T2

Abstract

本发明涉及生产作为药物和食品添加剂有用的反-4-羟基-L-脯氨酸的工业方法，编码具有L-脯氨酸4-位羟化酶活性之蛋白并可用于上述生产方法的基因，含有该基因的重组DNA，含有该重组DNA的转化子，和使用该转化子生产L-脯氨酸-4-羟化酶的方法和该L-脯氨酸-4-羟化酶。

Description

生产反-4-羟基-L-脯氨酸的方法

本发明涉及生产作为药物和食品添加剂有用的反-4-羟基-L-脯氨酸的工业方法，编码具有L-脯氨酸4-位羟化酶活性之蛋白并可用于上述生产方法的基因(以下称为L-脯氨酸4-羟化酶基因)，含有该基因的转化子，和使用该转化子生产L-脯氨酸4-羟化酶的方法。

下列方法是使用微生物生产反-4-羟基-L-脯氨酸的已知方法。

1)用埃希氏菌属微生物从4-羟基-2-氧代戊二酸生产反-4-羟基-L-脯氨酸的方法(日本公开而未审查的专利申请266,995/91)。

2)用细菌或真菌直接通过发酵生产反-4-羟基-L-脯氨酸的方法(EP 0547898A2，和日本公开而未审查的专利申请236,980和245,782/94)。

3)用链霉菌属的细菌从L-脯氨酸生产反-4-羟基-L-脯氨酸的方法[J.Biol.Chem.，254 vol.，6684(1979)，Biochem.Res.Comm.，120 Vol.，45-51，(1984)，Tetrhedron Letters，34，7489-7492(1993)，和TetrhadronLetters，35，4649-4652(1994)]。

但由于下列原因传统方法难于在工业规模上实施：

1)生产反-4-羟基-L-脯氨酸的底物如4-羟基-2-氧代戊二酸过于昂贵，难以得到。

2)反-4-羟基-L-脯氨酸的产率低。

3)生产反-4-羟基-L-脯氨酸所涉及酶的活性很弱。

关于生产反-4-羟基-L-脯氨酸的催化酶，有文章报道说从一种链霉菌属的微生物中纯化了L-脯氨酸-4-羟化酶。但其中没有描述获得该酶的方法和该酶的理化性质。而且没有文章报道具有在2-氧代戊二酸和二价离子存在下将游离L-脯氨酸转化成反-4-羟基-L-脯氨酸的L-脯氨酸-4-羟化酶的编码基因的克隆。

需要一种有利地利用具有高水平活性的L-脯氨酸-4-羟化酶生产反-4-羟基-L-脯氨酸的工业方法。

本发明的目的是提供用L-脯氨酸-4-羟化酶从廉价易得的L-脯氨酸有效地生产反-4-羟基-L-脯氨酸的方法，为了更适于工业生产反-4-羟基-L-脯氨酸，本发明还提供L-脯氨酸-4-羟化酶基因和含有该基因的转化子。利用该基因和转化子可以大量生产L-脯氨酸-4-羟化酶，利用该转化子或羟化酶可以低成本地工业生产反-4-羟基-L-脯氨酸。

本发明涉及由微生物衍生的新的L-脯氨酸-4-羟化酶基因，含有该基因的重组DNA，含有该重组DNA的转化子，利用该转化子产生L-脯氨酸-4-羟化酶的方法，和利用转化子或羟化酶生产反-4-羟基-L-脯氨酸的方法。

以下详细地描述本发明。

本发明的L-脯氨酸-4-羟化酶是在2-氧代戊二酸和二价铁离子存在下能将游离L-脯氨酸羟化成反-4-羟基-L-脯氨酸的酶。

本发明包括任何具有L-脯氨酸4-位羟化酶活性的蛋白，还包括例如具有序列号1所示氨基酸序列的蛋白，具有该蛋白产生的氨基酸序列的融合蛋白或具有该蛋白的部分序列并与具有大肠杆菌衍生β-半乳糖苷酶蛋白部分氨基酸序列的肽结合的蛋白，具有序列号1氨基酸序列蛋白产生的氨基酸序列的融合蛋白或具有该蛋白的部分序列并与具有大肠杆菌衍生麦芽糖结合蛋白部分氨基酸序列的肽结合的蛋白等。融合蛋白的实例包括具有如序列号18或19所示氨基酸序列的蛋白。

具有序列号1、18或19所示氨基酸序列的蛋白包括其中一个或多个氨基酸被取代、缺失或插入并具有羟化L-脯氨酸4-位的酶活性的蛋白。可以按照下列文献中描述的方法进行氨基酸的取代、缺失和插入：

Nucleic Acids Research， 10，6487(1982)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA.， 79，6409(1982)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，81，5662(1984)；Science， 224，1431(1984)；PCT WO85/00817(1985)；Nature， 316，601(1985)；Gene， 34，315(1985)；Nucleic AcidsResearch， 13，4431(1985)；Current Protocols in Molecular Biology，Chap.8，Mutagenesis of Cloned DNA，John Wiley & Sons，Inc.(1989)，etc.

本发明包括含有编码有羟化L-脯氨酸4-位酶活性之蛋白基因的任何L-脯氨酸-4-羟化酶基因DNA片段，这可以包括例如基因如序列号1、18或19所示氨基酸序列之蛋白的编码基因，以及以下蛋白的编码基因：该蛋白具有相应于序列号1、18或19所示氨基酸序列的氨基酸序列，是通过取代、缺失或插入至少一个氨基酸从中生产的，并具有羟化L-脯氨酸4-位的酶活性。具体可提及序列号2、8和15所示的DNA。

作为本发明的L-脯氨酸-4-羟化酶基因，相对于以上定义的DNA，还可以有通过突变如取代突变、缺失突变、插入突变等而从中衍生的DNA，这种突变进行的限度是突变的DNA不丧失L-脯氨酸-4-羟化酶活性，例如与序列号2、8或15序列同源的DNA。这种同源DNA是用具有序列号2、8或15所示核苷酸序列的DNA作为探针通过菌落杂交或斑点杂交所获得的DNA。可以按已知的体外重组技术进行这些操作[见Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，由Sambrook，Fritch，Maniatis编写，Cold Spring Harbor Laboratory Press出版，1989]。

含有L-脯氨酸-4-羟化酶基因的DNA片段可以从能够羟化L-脯氨酸产生反-4-羟基-L-脯氨酸的微生物中获得。任何具有羟化L-脯氨酸产生反-4-羟基-L-脯氨酸能力的微生物都可以用于本发明。这种微生物的优选实例可提及具有L-脯氨酸-4-羟化酶活性的属于指孢囊菌属、Amycolatpsis、链霉菌属的微生物。更优选的实例包括指孢囊菌RH1(FERM BP-4400)、Amycolatpsis sp.RH2(FERM BP-4581)、灰绿链霉菌JCM4250、达格斯坦链霉菌JCM4365和这些菌株的突变株或衍生物。

指孢囊菌RH1和Amycolatpsis sp.RH2是由本发明者作为有产生L-脯氨酸-4-羟化酶活性的菌株分离得到的微生物，灰绿链霉菌JCM4250和达格斯坦链霉菌JCM4365的产L-脯氨酸-4-羟化酶能力是本发明者首先发现的。

以下描述从具有生产L-脯氨酸-4-羟化酶能力的微生物获得L-脯氨酸-4-羟化酶基因的方法。

通过常规DNA分离方法如苯酚方法(Biochem.Biophys.Acta，72，619-629)，从具有生产L-脯氨酸-4-羟化酶能力的微生物制备染色体DNA。用适当的限制性内切酶切割如此获得的染色体DNA，然后将限制性内切酶切割的片段插入载体DNA中，以构建该微生物染色体的染色体DNA文库。利用该染色体DNA文库可以转化宿主微生物。通过杂交方法从所获得的转化子中筛选含有L-脯氨酸-4-羟化酶基因的转化子。从如此筛选的转化子中可以获得含有目的基因的DNA。

可以按已知的体外重组技术进行包括一系列这种步骤的方法[见Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，由Sambrook，Fritch，Maniatis编写，Cold Spring Harbor Laboratory Press出版，1989]。

作为用于构建能产生L-脯氨酸-4-羟化酶微生物的染色体文库的载体DNA，可以使用噬细胞和质粒载体，只要它们能够在大肠杆菌K12菌株中自主复制。载体DNA的优选实例包括λZAPII、pUC18和pBluescript(STRATAGENE Co.出售)。

作为用于构建能产L-脯氨酸-4-羟化酶微生物的染色体文库的宿主微生物，可以使用属于埃希氏菌属的任何微生物。宿主微生物的优选实例包括大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue、大肠杆菌DH1、大肠杆菌MC1000等。

基于L-脯氨酸-4-羟化酶氨基酸序列的信息合成DNA引物。利用这些DNA引物通过聚合酶链反应(以下称为PCR)合成DNA片段。利用如此获得的DNA片段通过杂交方法可以筛选到含有L-脯氨酸-4-羟化酶基因的转化子。

用普通氨基酸序列仪如Protein Sequencer Model PPSQ-10(ShimadzuSeisakusho K.K.制造)分析纯的L-脯氨酸-4-羟化酶可以获得关于L-脯氨酸-4-羟化酶氨基酸序列的信息。这样获得的氨基酸序列具体可提及序列号1中氨基酸序列的部分氨基酸序列，例如，序列号1所示氨基酸序列中从N-末端到第24氨基酸的部分氨基酸序列等。

可以利用普通的DNA合成仪例如Applied Biosystems制造的38OA·DNA合成仪来合成DNA引物。

作为杂交探针，可以使用L-脯氨酸-4-羟化酶基因的部分片段，这可以通过PCR来获得。例如，化学合成了序列号3所示DNA(这相当于编码序列号1氨基酸序列中1-6氨基酸的正链DNA)和如序列号4中所示的DNA(这相当于编码序列号1氨基酸序列中19-24氨基酸的反义链DNA)。用这些DNA引物通过PCR获得了序列号5所示的71bp的DNA片段。这样获得的DNA片段可用作杂交探针。

从杂交筛选的转化子获得的含有L-脯氨酸-4-羟化酶基因的DNA，用适当的限制性内切酶如 Xho I切断，然后克隆到诸如pBluescriptKS(+)(STRATAGENE Co.出售)的质粒中。上述基因的核苷酸序列可通过常规核苷酸序列测定方法来确定，例如Sanger等的双脱氧链终止法[Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.， 74，5463，(1977)]。这种核苷酸序列测定可以在DNA自动序列仪上进行，例如Applied Biosystems的373A·DNA测序仪。作为如此测定的L-脯氨酸-4-羟化酶基因的核苷酸序列，例如可提及序列号2和8所示核苷酸序列。

可用常规方法将编码本发明的L-脯氨酸-4-羟化酶的DNA导入载体中。

作为含有编码本发明L-脯氨酸-4-羟化酶的DNA的质粒，例如可提及pRH71等。含有pRH71的大肠杆菌SOLR/pRH71已于1995年3月2日按布达佩斯条约保藏在National Institute of Bioscience and Human-Technology of the Agency of Industrial Science and Technology(它位于日本1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305)，保藏号是FERMBP-5025.

为了在宿主中表达这样获得的L-脯氨酸-4-羟化酶基因，先用限制性内切酶或其它脱氧核酸酶酶切含有L-脯氨酸-4-羟化酶基因的DNA片段，以形成含有L-脯氨酸-4-羟化酶基因的适当长度的DNA片段。将所获得的DNA片段插入表达载体中启动子的下游位置，然后将含有插入DNA的表达载体引入适于该表达载体的宿主细胞中。

可以使用任何能够表达目的基因的宿主细胞。宿主细胞的实例可提及埃希氏菌属、沙雷氏菌属、棒杆菌属、短杆菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属等的微生物细胞，以及酵母菌株、动物细胞宿主等。

可以使用能够在上述宿主细胞中自主复制或能够被插入染色体中并且在可转录L-脯氨酸-4-羟化酶基因的位置含有启动子的表达载体。

当使用大肠杆菌等微生物作为宿主细胞时，该表达载体最好能够在该微生物中自主复制并且由启动子、核糖体结合序列如Shine-Dargarno序列、L-脯氨酸-4-羟化酶基因和转录终止序列组成。其中可含有控制启动子的基因。

可提及的表达载体实例有pBTrp2，pBTac1，pBTac2(BehringerManheim Co.出售)；pKYP10(见日本公开而未审查的专利申请110600/83)；pKYP200[见Agric.Biol.Chem.，48，669(1984)]；pLSA1[见Agric.Biol.Chem.，53，277(1989)]；pGEL1[见Agric.Biol.Chem.，82，4306(1985)]；pBluescript(STRATAGENE Co.生产)；pTrs30[从大肠杆菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制得]；pTrs32[从大肠杆菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)制得]等。

作为启动子可以使用能够在诸如大肠杆菌的宿主中表达的任何启动子。例如可提及来自大肠杆菌、嗜细胞等的启动子，如 trp启动子(P trp)、lac启动子(P lac)、P_L启动子和P_R启动子。还可以使用人工设计和改造的启动子例如两个P trp顺序连接而制得的P trp×2以及 tac启动子(P tac)。

可以使用能够在诸如大肠杆菌的宿主中表达的任何核糖体结合序列。但最好使用含有核糖体结合序列并且该序列与起始密码子有适当间隔(例如6-18个碱基)的质粒。

L-脯氨酸-4-羟化酶基因包括任何编码L-脯氨酸-4-羟化酶的基因。但是，组成该基因DNA序列的碱基最好被适当地取代，以使取代后的DNA序列由最适合在所用宿主微生物中表达的密码子组成。其中的碱基为成为最适于表达的密码子而进行了碱基取代的L-脯氨酸-4-羟化酶基因，其实例是序列号15的核苷酸序列等。

本发明基因的表达不一定需要转录终止序列。但最好将转录终止序列安排在结构基因的紧下方。

适合于本发明的宿主细胞实例包括大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue、大肠杆菌DH1、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌KY3276、大肠杆菌W1485、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌No.49、大肠杆菌W3110、大肠杆菌NY49、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短杆菌B.immariophilum ATCC14068、短杆菌B.saccharolyticumATCC14066、短杆菌B.flavum ATCC14067、短杆菌B.lactofermentumATCC13869、谷氨酸棒杆菌ATCC13032、嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870、微杆菌M.ammoniaphilum ATCC15354等。

当使用酵母菌株作为宿主细胞时，例如可以使用YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)等作为表达载体。

可以使用任何能够在酵母宿主细胞中表达的启动子。启动子的实例有糖酵解基因如己糖激酶的启动子、gal1启动子、gal10启动子、热激蛋白启动子、MFα1启动子和CUP1启动子等。

宿主细胞的实例有酿酒酵母、裂殖酵母S.pombe、乳酸克鲁维酵母、出芽丝孢酵母和Schwanniomyces alluvius等。

当使用动物细胞作为宿主细胞时，例如pcDNA I/Amp、pcDNA I和pcDM8(均由Funakosi Co.出售)可用作表达载体。

可以使用任何在动物细胞宿主中表达的启动子，例如人CMV的IE基因(即早基因)启动子。人CMV IE基因的增强子可与该启动子一起使用。

可使用的宿主细胞例如为Namalwa、HBT5637(日本公开而未审查的专利申请299/88)，COS细胞、CHO细胞等。

为将DNA引入动物细胞，可使用任何能够将DNA引入动物细胞的方法。例如可使用电穿孔法[见Miyaji et al.，Cytotechnoligy，3，133(1990)]、磷酸钙法[见日本公开而未审查的专利申请227075/90]、脂质体转染法[见Philip L.Felgner，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，84,7413(1987)]等。形成的转化子可以按日本公开而未审查的专利申请227075/90和257891/90中描述的方法进行收集和培养。

这样获得的转化子用普通培养方法培养。

培养这些微生物转化子如大肠杆菌、酵母等的培养基可以是含有可以被该微生物吸收的碳源、氮源和无机盐等的任何天然培养基和合成培养基。

可以使用能被微生物吸收的任何碳源。碳源的实例包括碳水化合物如葡萄糖、果糖、蔗糖和含有这些成分的molasses、淀粉和淀粉水解物；有机酸如乙酸和丙酸；及醇如乙醇和丙醇。

作为氮源可使用氨、无机和有机酸的铵盐如氯化铵、硫酸铵、醋酸铵和磷酸铵，其它含氮化合物：蛋白胨、肉浸膏、酵母膏、玉米浸液、酪蛋白水解物、豆饼、豆饼水解物、培养的发酵细胞、它们的消化产物等。

作为无机盐可使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。

在通气条件下进行培养，例如摇床培养或液下通气搅拌培养。培养温度为15-40℃。培养时间一般为16-96小时。培养过程中保持培养基的pH为3.0-9.0。用无机和有机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙、氨等来调节pH。

向培养基中加入适量的L-脯氨酸，使其浓度为5-1000mM，优选20-200mM，以更有效地产生L-脯氨酸一4-羟化酶。

如果需要在培养过程中可以向培养基中加入抗生素如氨苄青霉素、四环素等。

用可诱导启动子进行了表达载体转化的微生物在培养时可向培养基中加入诱导物。例如用lac启动子进行了表达载体转化的微生物，在培养时可向培养基中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)。用trp启动子进行了表达载体转化的微生物，在培养时可向培养基中加入吲哚丙烯酸(IAA)。

作为培养用动物细胞作为宿主细胞所获得的转化子的培养基，一般使用RPMI1640培养基和Eagle’s MEM培养基，或者可以使用含有胎牛血清的那些培养基。

在5％CO₂存在下进行细胞培养。培养温度优选为35-37℃，培养时间通常为3-7天。

向培养基中加入适量的L-脯氨酸，使其浓度为5-1000mM，优选20-200mM，以更有效地产生L-脯氨酸-4-羟化酶。

如果需要在培养过程中可以向培养基中加入抗生素如卡那霉素、青霉素等。

与用作基因源的微生物菌株如指孢囊菌RH1等相比，这样培养的转化子产生了大量的L-脯氨酸-4-羟化酶并在其中积累。因此，与用非基因工程菌作为基因源如指孢囊菌RH1等从L-脯氨酸生产反-4-羟基-L-脯氨酸相比，可以更有效地进行酶的分离和纯化或用该酶从L-脯氨酸生产反-4-羟基-L-脯氨酸。

转化子中L-脯氨酸-4-羟化酶的产生可以这样进行：向适于酶反应的含水培养基中加入培养物细胞或处理后的细胞，同时加入L-脯氨酸、二价铁离子和2-氧代戊二酸，并且必要时加入表面活性剂或有机溶剂以保证产生反-4-羟基-L-脯氨酸。对于已证实在细胞中形成的L-脯氨酸-4-羟化酶的活性，在下列条件下每分钟催化产生1nmol的反-4-羟基-L-脯氨酸的酶活性被定义为1单位(U)。微生物细胞和动物细胞这里都称为细胞。

L-脯氨酸-4-羟化酶活性的测定

将细胞、处理后的细胞或酶制剂加入到含有12mM L-脯氨酸、24mM2-氧代戊二酸、4mM硫酸亚铁和8mM L-抗坏血酸的240mM MES[2-(N-吗啉基)乙磺酸]缓冲液中，总体积为250μl。混合物在35℃保温10分钟。将反应混合物在100℃下加热2分钟以终止反应，用高效液相色谱(以下称为HPLC)测定反应混合物中的反-4-羟基-L-脯氨酸的量。

为测定形成的反-4-羟基-L-脯氨酸的量，可以使用能够测定它的方法。例如，可以使用以配体交换色谱柱如SUMICHIRAL OA5000(由Sumika Analysis Center Co.生产)进行HPLC分离并洗脱反-4-羟基-L-脯氨酸，过柱后使其与7-氯-4-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑(以下称为NBD)反应生产其衍生物，再检测生成的衍生物的方法(柱后衍生物法)；反应混合物中的产物先与NBD反应生成其衍生物，然后用反相HPLC分离并检测所生成的与NBD的衍生物(柱前衍生物法)[见William J.Lindblad and Robert F.Diegelmann，Analytical Biochemitry，Vol.138，pp.390-395，1984]等。这两种方法中都是通过测定其荧光来检测NBD衍生物的(激发波长503nm，荧光波长541nm)。

如上所述证实了培养细胞中形成了L-羟基-4-羟化酶后，按常规方法从转化子培养物中分离和纯化该酶。例如，将转化子培养液离心以从中收集培养细胞，洗涤细胞并用超声波破碎仪、法式压力、Manton-Gauline均化器、Dyno磨等打碎细胞，以得到无细胞提取物。可以通过磷酸铵沉淀、阴离子交换色谱如二乙氨基乙基琼脂糖(DEAE)、疏水色谱如丁基琼脂糖、苯基琼脂糖等、凝胶过滤、电泳如等电点电泳从离心获得的无细胞上清液获得纯化的酶制剂标准品。

可以在上述相同条件下培养已证明含有L-脯氨酸-4-羟化酶的转化子细胞，以使这些细胞产生并在细胞中积累反-4-羟基-L-脯氨酸，从中收集并获得这样产生的反-4-羟基-L-脯氨酸。

如果转化子细胞是从能够以糖源产生L-脯氨酸并在培养液中积累L-脯氨酸的宿主细胞产生的，甚至在细胞培养过程中不向培养基中加入L-脯氨酸也可能产生反-4-羟基-L-脯氨酸。但最好向培养基中加入浓度为5-1000mM，优选20-200mM的L-脯氨酸，以更有效地产生目的产物反-4-羟基-L-脯氨酸。

如果转化子细胞具有从糖源产生并在培养液中积累2-氧代戊二酸的能力并使用这种细胞，甚至在细胞培养过程中不向培养基中加入2-氧代戊二酸也可能产生反-4-羟基-L-脯氨酸。当使用这种转化子细胞时，可以向培养基中适当加入糖源如葡萄糖，以使细胞不在培养液中产生积累2-氧代戊二酸，从而更有效地生成反-4-羟基-L-脯氨酸。相反，如果使用没有从糖源生成2-氧代戊二酸能力的转化子细胞，则在细胞培养过程中必要时可加入2-氧代戊二酸。

必要时，在转化子细胞培养过程中可以向培养基中加入2-氧代戊二酸和二价铁离子。

为产生反-4-羟基-L-脯氨酸，还可以使用下面提及的另-种方法，其中作为酶源使用已证明形成L-脯氨酸-4-羟化酶的转化子细胞的培养物，使用从培养物中分离的细胞或从该细胞加工而成的产品。

生产反-4-羟基-L-脯氨酸的方法如下。向适于酶反应的含水培养基中加入转化子细胞培养物、从培养物中分离的细胞或加工该细胞获得的产品，以及L-脯氨酸、二价铁离子和2-氧代戊二酸，任选地加入表面活性剂和有机溶剂，从而将L-脯氨酸转化为反-4-羟基-L-脯氨酸，然后从反应混合物中收集得到生成的反-4-羟基-L-脯氨酸。

可以使用的加工细胞的实例有干燥细胞、冷冻干燥细胞、表面活性剂处理的细胞、酶处理的细胞、超声处理的细胞、机械研磨的细胞、机械压碎的细胞、溶剂处理的细胞、分级分离的细胞蛋白、固定化细胞、固定化的细胞加工所得材料等。还可使用从L-脯氨酸-4-羟化酶的活性的细胞提取获得的酶制剂、这些酶的纯化产品和其固定化产物。

作为含水培养基的实例可提及水，缓冲液如磷酸盐、碳酸盐、醋酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐和tris缓冲液，醇如乙醇和甲醇，酯如乙酸乙酯，酮如丙酮，和酰胺如乙酰胺。

作为表面活性剂的实例可提及阳离子表面活性剂如聚氧乙烯-硬脂基胺(例如，Nippon Oils & Fats Co.生产的Nymeen S215)，鲸蜡基三甲基溴化铵，Cation FB，Cation F2-40E等；阴离子表面活性剂如油酰氨基硫酸钠，Newrex TAB和Rapizole 80；两性表面活性剂如聚氧乙烯-脱水山犁醇单硬脂酸酯(例如Nonion ST221)等；和其它叔胺PB，十六烷基二甲基胺等。可以使用能促进反应的任何表面活性剂。表面活性剂的浓度一般为0.1-50mg/升，优选1-20mg/升。

作为有机溶剂的实例可提及甲苯、二甲苯、脂肪醇、苯和乙酸乙酯。有机溶剂的浓度通常为0.1-50μl/ml，优选1-20μl/ml。

该反应可以在具有L-脯氨酸一4一羟化酶活性的转化子培养过程中进行，或在培养结束后用从培养液中制得的细胞、处理后的细胞、纯化酶或粗酶在含水培养基中进行。

根据所用底物的量来确定向反应混合物中加入的酶量。通常为1,000-10,000,000U/升，优选10,000-3,000,000U/升含水培养基。当使用细胞或处理后的微生物细胞时，湿细胞的浓度通常为1-300g/升。

该反应一般在15-50℃的温度和6.0-9.0的pH下进行1-96小时。

用于本反应的L-脯氨酸浓度可为1mM到2M。可以向反应混合物中加入L-脯氨酸本身，或加入从糖源产生并积累L-脯氨酸的微生物培养物来提供L-脯氨酸。另外，如果使用具有从糖源产生L-脯氨酸能力的微生物作为转化子的宿主细胞，由宿主微生物从糖源产生的L-脯氨酸可用于该反应。即，由具有产生L-脯氨酸能力之微生物衍生的转化子所产生的L-脯氨酸，在培养液中用转化子产生的L-脯氨酸-4-羟化酶转化为反-4-羟基-L-脯氨酸，从而在不向培养液中加入L-脯氨酸的情况下能够产生反-4-羟基-L-脯氨酸。

该反应需要二价铁离子。这种二价铁离子的使用浓度一般为1-100mM。可以使用任何二价铁离子，只要它不抑制本反应。二价铁离子的实例可提及硫酸亚铁；氯化物如氯化亚铁；碳化亚铁；有机酸盐如柠檬酸盐、乳酸盐、富马酸盐。当细胞、处理后的细胞或反应混合物中含有二价铁离子时，则不必加入二价铁离子。

可以向反应混合物中加入2-氧代戊二酸本身或从可以被所用细胞或处理后的细胞的代谢活性转化为2-氧代戊二酸的前体获得。这种前体的实例可提及糖如葡萄糖；氨基酸如谷氨酸；和有机酸如琥珀酸。这些化合物可以单独使用或联合使用。

通过任何普通分离方法，例如用离子交换树脂进行柱层析、结晶等方法从培养物或含水培养基中回收反-4-羟基-L-脯氨酸。

这样得到的反-4-羟基-L-脯氨酸的结构可通过常规分析方法如¹³C-NMR谱、¹H-NMR谱、质谱、比旋光度等来鉴定。可以用上述柱后衍生法或柱前衍生法定量测定本发明产生的反-4-羟基-L-脯氨酸。

附图简单说明

图1表示质粒pRH71的限制性酶谱和构建质粒pYan10和pYan13的步骤。

图中每个粗的阴影线表示指孢囊菌RH1的克隆位点。Ap表示来自pBR322的氨苄青霉素抗性基因。图中只显示了与质粒的构建有关的限制性酶切位点。

图2表示构建质粒pTr14的步骤。

图中每个粗的阴影线表示含有L-脯氨酸-4-羟化酶基因的部分。Ap表示来自pBR322的氨苄青霉素抗性基因；P trp表示大肠杆菌色氨酸操纵子的启动子。每个箭头表示基因转录和翻译的方向。图中只显示了与质粒的构建有关的限制性酶切位点。

图3表示构建质粒pTc4OH的步骤。

图中每个粗的阴影线表示含有L-脯氨酸-4-羟化酶基因的部分。Ap表示来自pBR322的氨苄青霉素抗性基因；P tac表示 tac启动子。每个箭头表示基因转录和翻译的方向。图中只显示了与质粒的构建有关的限制性酶切位点。

图4表示构建质粒pTr2-4OH的步骤。

图中每个粗的阴影线表示含有L-脯氨酸-4-羟化酶基因的部分。Ap表示来自pBR322的氨苄青霉素抗性基因；P trp×2表示由两个大肠杆菌色氨酸操纵子的启动子顺序连接而组成的启动子(串联启动子)。每个箭头表示基因转录和翻译的方向。图中只显示了与质粒的构建有关的限制性酶切位点。

图5表示构建质粒pTr2-4OHΔ的步骤。

图6表示构建质粒pWFH1的步骤。

图中每个粗的阴影线表示插入用 HindIII和 SalI处理后的PCR扩增片段的位点。每个粗影线表示含有来自指孢囊菌RH1的L-脯氨酸-4-羟化酶基因的部分。Ap表示来自pBR322的氨苄青霉素抗性基因；P trp×2表示由两个大肠杆菌色氨酸操纵子的启动子顺序连接而组成的启动子(串联启动子)。每个箭头表示基因转录和翻译的方向。图中只显示了与质粒的构建有关的限制性酶切位点。

图7表示构建质粒pES-23a的步骤。

图中每个粗的阴影线表示含有L-脯氨酸-4-羟化酶基因的部分。LacZ表示大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因；Ap表示来自pBR322的氨苄青霉素抗性基因；P lac表示 lac启动子。每个箭头表示基因转录和翻译的方向。图中只显示了与质粒的构建有关的限制性酶切位点。

图8表示构建质粒pMc4OH的步骤。

图中每个粗的阴影线表示含有L-脯氨酸-4-羟化酶基因的部分。malE表示大肠杆菌麦芽糖结合基因； LacZ表示大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因；Ap表示来自pBR322的氨苄青霉素抗性基因； lacIq表示大肠杆菌乳糖操纵子的抑制基因； rrnB终止子表示 rrnB基因的终止子；及P tac表示tac启动子。每个箭头表示基因转录和翻译的方向。图中只显示了与质粒的构建有关的限制性酶切位点。

实施例1指孢囊菌RH1的L-脯氨酸-4-羟化酶蛋白编码基因部分DNA片段的制备(1)指孢囊菌RH1染色体DNA的分离

利用常法按如下所示分离指孢囊菌RH1的染色体DNA。将10ml添加有5％甘露糖醇、0.05％甘氨酸的SK#2培养基(含有0.25％葡萄糖、1.0％可溶性淀粉、0.25％酵母提取物、0.25％蛋白胨、0.15％肉膏、0.01％磷酸二氢钾、0.03％硫酸镁，用6N NaOH调节pH为7.6的培养基)分别注入试管内，120℃灭菌20分钟。然后，在HT琼脂平板培养基(含有1％可溶性淀粉、0.2％N Z胺、0.1％酵母提取物、0.1％肉膏、1.5％琼脂，用6N NaOH调节pH为7.2后，120℃灭菌20分钟后的培养基)上生长的指孢囊菌RH1细胞用一接种环接种在上述培养基中，28℃振荡培养3天。

将该培养液离心分离，将得到的细胞用10ml的10.3％蔗糖溶液洗涤后，悬浮在6ml的TS〔10.3％蔗糖、50mM Tris·HCl(pH8.0)25mMEDTA〕中，加入1ml溶菌酶溶液(50mg/ml TS)，37℃培养60分钟。然后在该溶菌酶处理液中加入0.6ml蛋白酶K(Sigma社制)溶液(2mg/ml TS)，慢慢混合，再一边慢慢混合一边加入3.6ml的3.3％(W/V)SDS溶液，37℃培养60分钟。将该混合液在50℃下加热30后用水冷却，加入等量的TE〔10mM Tris·HCl(pH8.0)，1mM EDTA〕饱和的苯酚/氯仿(1/1、v/v)，平稳振荡30分钟。离心分离后取上层，再次利用TE饱和的苯酚/氯仿进行萃取操作，离心分离后在得到的上层中加入等量的氯仿，混合后再次进行离心分离。取上层，在该上层中加入100℃下加热处理10分钟后得到的Rnase A水溶液(10mg/ml)20μl，37℃培养45分钟。在该RNase A处理液中加入1/10容量的5M食盐水及1/4容量的50％PEG6000，缓慢混合后，冰冷下放置一夜。将该混合液以12000rpm离心分离10分钟后，完全弃去上清，将剩下的沉淀溶于5ml的TE中。加入1/10容量的3M醋酸钠溶液及1/30容量的66mM氯化镁溶液，混合后加入2.2倍容量的冷乙醇，缓慢混合。将该混合液以10000rpm离心分离10分钟后，弃去上清，将得到的沉淀用70％冷乙醇洗涤2次。将该沉淀(含有250μg的染色体DNA)溶于TE，作为染色体DNA用于以后的实验。(2)来自指孢囊菌RH1的L一脯氨酸-4-羟化酶蛋白部分氨基酸序列的确定

按照参考例1的方法将产自指孢囊菌RH1的L-脯氨酸-4-羟化酶分离精制，使用岛津制作所制Protein Sequencer model PPSQ-10分析该精制酶蛋白的N末端氨基酸序列，确定序列号1中所示序列的N末端24个氨基酸残基的序列。(3)L-脯氨酸-4-羟化酶基因的部分DNA片段的制备

使用Applied Biosystems社制的380A DNA合成仪，合成对应于序列号1记载的氨基酸序列的第1-6氨基酸的如序列号3记载的有义链混合DNA引物及、对应于序列号1记载的氨基酸序列的第19-24氨基酸的如序列号4记载的反义链混合DNA引物。

将该合成DNA作为引物，将指孢囊菌RH1染色体DNA作为模板，进行PCR。使用株式会社Astec制的Program·tenp·Control·System PC-700进行PCR。使用以下组成的反应液20μl进行反应。

反应液组成：指孢囊菌RH1染色体DNA 22ng/μl、有义链混合DNA引物及反义链混合DNA引物各10μM、 Pfu DNA聚合酶(STR ATAGENE社制)0.125U/μl、DMSO10％、Tris·HCl(pH8.2)20mM、KCl 10mM、硫酸铵6mM、氯化镁2mM、Triton X-1000.1％、胎牛血清白蛋白10ng/μl。

反应是在96℃培养5分钟后，将90℃-2分钟、37℃-1分钟、72℃-1分钟的三步培养重复进行5次，再将96℃-2分钟、50℃-1分钟、72℃-1分钟的三步培养重复进行35次。将反应液用15％聚丙烯酰胺(Atto株式会社制、PAGEL NPU-15L)进行电泳后，使用日本Eido株式会社制的da Vin ci Kun(pen Touch Recovery NB-7000型)回收71bp的泳带。将回收的71bp的DNA片段用Pharmacia社制的Sure CloneLigation Kit插入pUC18的 SmaI位点，使用Applied Biosystem社制的核苷酸测序试剂盒(Taq Dye Deoxy^TM Termi nator Cycle SequencingKit(确定其核苷酸序列。确定的71bp的DNA片段的核苷酸序列如序列号5所示。由该71bp的DNA片段的核苷酸序列推定的氨基酸序列与序列号1记载的纯化酶的N末端氨基酸序列完全一致。实施例2含有L-脯氨酸-4-羟化酶基因的DNA片段的克隆(1)DIG探针的制备

使用Boehringer Mannheim社制的PCR DIG标记试剂盒进行71bp的DNA片段的洋地黄毒苷(DIG)标记。

使用 Pfu DNA聚合酶(STRATAGENE社制)2.5U、 Pfu DNA聚合酶的X10缓冲液(STRATAGENE社制)5μl、DMSO 5μl、X10PCR DIG mix(Boehringer Mannheim社制)5μl、将含有在实施例1(3)中利用PCR制成并用聚丙烯酰胺凝胶电泳回收的71bp的片段的DNA溶液稀释10倍后得到的该稀释液1μl、含有序列号3记载的有义链合成DNA与序列号4记载的反义链合成DNA各10μM的反应液50μl，进行PCR。反应是在96℃5培养分钟后，将96℃-2分钟、50℃-1分钟、72℃-1分钟的三步培养重复进行35次。将该反应液进行12.5％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，确认71bp的扩增片段的生成，利用凝胶进行与实施例1(3)同样的操作，回收该片段，将其作为探针使用。(2)Southern杂交

在10μg指孢囊菌RH1的染色体DNA中加入限制性内切酶 XhoI(宝酒造社制)36U，37℃保温2小时。将该DNA酶切后，将该DNA进行琼脂糖凝胶电泳。使用由实施例2(1)得到的探针，使用BoehringerMannheim社制的DIG荧光检测试剂盒，按附带的说明书中记载的方法进行Southern杂交。

即，在琼脂糖胶电泳后，将琼脂糖凝胶在0.25N盐酸中缓慢振荡20分钟，然后在0.5M氢氧化钠-1.5M氯化钠中浸泡50分钟。再在2M氯化钠-1M Tris·HCl(pH5.0)中浸泡25分钟。在Atto社制的Genopiratorpump AE 6680 P及Atto社制的Genopirator AE-6680 C以7.5mmHg进行吸附的同时，在Hybond-N⁺膜(Amersham社制)上，在20倍浓度的SSC(1倍浓度的SSC的组成为150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠)中进行印迹。印迹后将膜于80℃干燥10分钟，再用FUNA-UV-LINKER FS-800(Funakoshi社制)进行交联。将这样得到的膜在DIG荧光检测试剂盒的杂交缓冲液(在5倍浓度的SSC中含有甲酰胺50％v/v、封阻试剂20％、N-月桂基肌氨酸0.1％w/v、SDS 0.02％w/v的溶液)10ml中于42℃浸泡1小时后，在探针溶液〔将由实施例2(1)得到的探针3μl添加到200μl的杂交缓冲液中，95℃处理2分钟后添加杂交缓冲液至1.5ml得到的溶液〕中于42℃浸泡过夜。将该膜再用含有0.1％SDS的2倍浓度的25ml SSC在室温下洗涤2次(每次5分钟中)后，用含有0.1倍浓度SSC的25ml 0.1％SDS在68℃每次15分钟洗涤2次。

将该洗过的膜按下列顺序处理，用洗涤缓冲液〔含有0.3％w/vTween-20的缓冲液1(0.1M马来酸、0.15M氯化钠、pH7.5)〕室温下1-5分钟、使用50ml的缓冲液2(含有1％封阻试剂的缓冲液1)室温下30分钟、使用含有1μm抗洋地黄毒苷-AP Fab的10ml的缓冲液2室温下30分钟、使用50ml的缓冲液2室温下每次30分钟2次、使用10ml的缓冲液3(0.1M Tris·HCl、0.1M氯化钠、50mM氯化镁、pH9.5)室温2～5分钟、使用含有Lumigen PPD 50μl的5ml缓冲液3室温5分钟，然后在滤纸上快速除去水分，用Saran包装膜包裹后，37℃静置15分钟。使用Hyperfilm-ECL(Amersham社制)将其在室温下曝光30分钟。

发现与探针烈杂交的DNA片段存在于约5.5kb的位置。

(3)染色体DNA的分级分离

在指孢囊菌RH1的染色体DNA 100μg中加入限制性内切酶 Xho I(宝酒造社)360U，37℃下保温2小时，该DNA酶切后，加入等量的TE饱和的苯酚/氯仿并混合。离心分离后取上层，加入2.2倍容量的冷乙醇，缓慢混合。以10000rpm离心分离10分钟，弃去上清后，用70％冷乙醇洗涤沉淀2次，得到乙醇沉淀(以下将使用TE饱和苯酚/氯仿、冷乙醇得到乙醇沉淀的操作称为乙醇沉淀法)。将该沉淀溶于120μl TE中，进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结束，从琼脂糖凝胶上取下5.5kb附近的DNA级分并用Prep-A-gene(Biorad社制)纯化，得到约7μg的 Xho I酶切染色体DNA。

(4)噬细胞文库的构建

使用STRATAGENE社制的UndigestedλZAPII克隆试剂盒按如下方式制成噬细胞文库。

在λZAPII DNA 5μg中加入限制性内切酶 Xho I(宝酒造社制)36U，37℃反应3小时，将该DNA酶切后，利用乙醇浓淀法得到乙醇沉淀。将该乙醇沉淀溶于35μl的TE，使用宝酒造社制的碱性磷酸酶(CalfIntesteine)，按所附说明书中记载的方法进行脱磷酸化反应。反应后利用乙醇沉淀法得到乙醇沉淀。将该沉淀溶于5μl的TE。使用连接试剂盒(TAKARAligation Kit、宝酒造社制)使由上述得到的 Xho I酶切λZAPIIDNA 0.36μg与由实施例2(3)得到的 Xho I酶切染色体DNA 0.35μg在26℃下反应2.5小时，进行连接。在该反应液中加入乙醇，将生成的DNA的沉淀溶于4μl的TE。再将该DNA利用Gigapack II Gold PackagingExtract(STRATAGENE社制)包人λ噬细胞粒子中。

另一方面，将大肠杆菌XLI-Blue MRF’株(STRATAGENE社制)接种到含有0.2％(w/v)麦芽糖及10mM硫酸镁的LB培养基(在1升蒸馏水中含有细菌培养用胰化蛋白胨10g、细菌培养用酵养母提取物5g、食盐5g、120℃灭菌20分钟)3ml中，30℃培养6小时。培养后利用离心分离收集细胞，将得到的细胞悬浮在10mM灭菌硫酸镁溶液中，使在600nm处的吸光度为约0.5。

将上述的菌液200μl与包裹液10μl混合后，37℃培养15分钟。在该混合液中加入含LB软琼脂培养基(在LB培养基中加入琼脂使浓度为0.6％)3ml、0.5M IPTG水溶液15μl、X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)溶液的溶液(250mg X-Gal/ml二甲基甲酰胺)50μl。将此混合物铺在LB琼脂培养基(在LB培养基中加入琼脂使浓度为1.8％)上，之后在37℃培养一夜。

(5)目标克隆的筛选

从上述噬细胞文库中按以下方法筛选含有目标克隆的菌斑。

将在LB琼脂培养基上出现的菌斑转移到用5倍浓度的SSC洗涤过的尼龙膜(Schleicher & Schuell社制Nytran)上；之后将该膜在用0.5MNaOH-1.5M NaCl浸过的滤纸上静置5分钟。再将该膜在用1.5MNaCl-0.5M Tris·HCl(pH8.0)浸过的滤纸上每次2分钟2次、在用2倍浓度的SSC浸过的滤纸上每次2分钟2次静置后，80℃干燥30分钟。将干燥的该膜用含有0.1％SDS的2倍浓度的SSC洗涤后，用2倍浓度的SSC洗涤后风干。

使用由实施例2(1)得到的DIG探针及Boehringer Mannheim社制的DIG荧光检测试剂盒，按照实施例2(2)记载的方法进行检测，结果检测出一个含有目标克隆的阳性菌斑。

(6)克隆的确认

将该阴性菌斑周边约1平方厘米的部分切下，加入1ml的SM(5.8g/lNaCl、2g/l MgCl₂、0.01％明胶、50mM Tris·HCl、pH7.5)及20μl的氯仿，充分搅拌后离心分离，将得到的上清作为噬细胞提取液。

使用Applied Biosystems社制的380A·DNA合成仪合成对应于序列号5中记载的核苷酸序列的第13～32核苷酸的序列号6记载的有义链·DNA引物与对应于序列号5中记载的核苷酸序列的第53～71核苷酸如序列号7记载的反义链DNA引物(但对应于序列号5记载的第66号核苷酸的核苷酸是G)。

使用上述的噬细胞提取液5μl及序列号6记载的有义链DNA引物及序列号7记载的反义链DNA引物，按照实施例1(3)记载的方法进行PCR，得到59bp DNA片段。将该DNA片段用12.5％聚丙烯酰胺电泳进行分析，确认为目标克隆。

使用上述噬细胞提取液代替实施例2(4)中的包裹液，重复进行实施例2(4)～(6)，纯化目标克隆。

(7)利用噬细胞DNA的体内切除(excision)形成质粒

使用STRATAGENE社制的UndigestedλZAPII克隆试剂盒，按所附说明书记载的方法，利用由实施例2(6)得到的提取液中的噬细胞DNA的体内切除形成质粒。

按照实施例2(4)的方法，将大肠杆菌XL1-Blue MRF’株接种到含有0.2％(w/v)麦芽糖及10mM MgSO₄的LB培养基3ml中，30℃培养16小时。培养后进行离心分离，将得到的细胞悬浮在10mM MgSO₄溶液中，使在600nm处的吸光度达到约1.0。在该菌液200μl中加入由实施例2(6)得到的噬细胞提取液100μl及ExAsist辅助噬细胞(STRATAGENE社制)1μl，37℃培养15分钟。向其中加入3ml的ZXYT(将10g NaCl、10g酵母提取物、16g细菌培养用胰化蛋白胨溶于1升蒸馏水中，120℃灭菌20分钟后得到的产物)，37℃振荡2小时。将其在70℃加热20分钟后离心分离得到上清。将该上清1μl加入到用与大肠杆菌XLK1-Bule MRF’株同样的方法培养得到的大肠杆菌SOLR株的悬浮液200μl中，37℃培养15分钟后涂布在含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，37℃培养一夜除使用该菌落代替噬细胞提取液之外，按照实施例2(6)记载的方法从在琼脂培养基上生长的菌落中筛选阳性菌落。

利用上述得到的阳性菌落，按照常法提取质粒，通过限制性内切酶消化确认其结构。得到的质粒pRH 71具有在pBluescript SK(-)的 Xho I位点上插入有约5.5kb的 Xho I酶切DNA片段的结构(图1)

(8)碱基序列的确定

利用插入在上述得到的pRH7中的约5.5kb的 Xho I片段，用限制性内切酶酶切后分别得到约2.4kb的 Sac I- Xho I片段(图1中由 Xho I-1及 Sac I-1酶切的片段)及约2kb的Sal I片段(图1中由 Sal I-1及Sal I-2酶切的片段)，在pBluescript II KS(+)的 Sac I- Xho I酶切位点及Sal I酶切位点分别进行亚克隆化，得到质粒p Yan 10及p Yan 13(图1)。

使用宝酒造社制kilosequence用缺失试剂盒，由PYan 10制成缺失突变质粒。具体的试剂及方法按试剂盒中所附的说明书进行。

然后使用Applied Biosystem社制的碱基序列确定试剂盒(TaqDyeDeoxy^TM Terminator Cycle Seqaencing Kit)确定该缺失质粒中的约2.2kb的 Sac I- Xho片段的核苷酸序列。

对于pYan 13也同样，制成缺失突变质粒后，进行核苷酸序列的分析，确定约2kb的 Sal I片段中的 Sal I- Sac I片段(图1中被 Sal I-1及 Sac I-2切断的片段)的核苷酸序列。

Sac I- Xho片段(图1中被 Xho I-1及 Sac I-2酶切的片段)2707b的核苷酸序列如序列号8所示。

在这样测定的核苷酸序列中，存在编码序列号1所示的272个氨基酸构成的蛋白质的序列号2所示的核苷酸序列(对应于从序列号8的核苷酸序号264到1079)。在该氨基酸序列中，含有采用精制L-脯氨酸-4-羟化酶确定的如序列号1所示的N末端氨基酸序列，可以确认在得到的约5.5kb的 Xho I片段中存在作为目标的L-脯氨酸-4-羟化酶基因。实施例3L-脯氨酸4-羟化酶表达质粒的构建

(1)使用 trp启动子(P trp)构建表达质粒

使用Applied Biosystems社制的380 A·DNA合成仪合成序列号9记载的有义链DNA引物及、序列号10记载的反义链DNA引物。将该合成DNA作为引物，将pRH71作为模板进行PCR。反应是使用含有pRH710.1μg、有义链及反义链DNA引物各2μM的反应液20μl，与实施例1同样进行。反应是在96℃培养5分钟后，重复进行96℃-2分钟、58℃-1分钟、75℃-1分钟的三步培养30次。将反应液进行琼脂糖凝胶电泳，确认编码L-脯氨酸-4-羟化酶的结构基因的844bp的扩增片段的生成后，利用琼脂糖凝胶按常法提取该扩增片段，使用Biorad社制的Prep-A-gene回收片段。将回收的844bp的DNA片段的两末端用 Hind III及 Bam HI酶切后利用乙醇沉淀法得到乙醇沉淀。将该乙醇沉淀溶于5μl的TE。

将含有P trp的质粒p TrS 30DNA用Hind III及Bam HI酶切。在该酶切位点使用宝酒造社制的连接试剂盒插入用 Hind III及 Bam HI处理过的上述的L-脯氨酸4-羟化酶结构基因片段。使用得到的质粒，按常法将大肠杆菌XL1-Blue MRF’株进行转化，将该转化子涂布在含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，之后在37℃培养一夜。从生成的转化子菌落中利用常法提取质粒，利用限制性内切酶消化确认其结构。

上述的结果是得到了在与P trp的转录方向同方向上插入了编码L-脯氨酸-4-羟化酶结构基因的DNA片段的质粒pTr 14(图2)。

(2)使用 tac启动子(P tac)构建表达质粒

按照与实施例3(1)同样的方法，构建使用P tac的表达质粒。

合成序列号11记载的有义链DNA引物及序列号12记载的反义链DNA引物，将该合成DNA作为引物，将pRH71作为模板进行PCR，得到编码L-脯氨酸-4-羟化酶的结构基因的846bp的扩增片段。将该片段用Eco RI及 Hind III酶切后，插入含有P tac的质粒pBTacl(BoehringerMannheim社制)的 Eco RI- Hind III酶切位点，转化成大肠杆菌XL1-Blue MRF’株。

从得到的转化子，得到了在与P tac的转录方向同方向上插入了编码L-脯氨酸4-羟化酶结构基因的DNA片段的质粒pTC 4 OH(图3)。

(3)使用P trp×2构建表达质粒

按照与实施例3(1)同样的方法，回收编码L-脯氨酸-4-羟化酶结构基因的扩增片段，用限制性内切酶处理后，利用乙醇沉淀法得到乙醇沉淀，将该沉淀溶于5μl TE。

由质粒pKYP 200(由基本质粒pBR322与两个顺序连接的启动子P trp(Ptrpx2)组成)与合成接头制成的ATG载体pTrS 32用 Hind III及 BamHI酶切。在该酶切位点，使用宝酒造社制的连接试剂盒，将用 Hind III及Bam HI酶切处理的上述L-脯氨酸-4-羟化酶结构基因片段插入。

使用得到的质粒，将大肠杆菌XL1-Blue MRF’株利用常法进行转化，将转化子涂布在含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，然后在37℃培养一夜。从生成的转化子的菌落利用常法提取出质粒，利用限制性内切酶确认其结构。对于结构基因部分，使用Applied Biosystems社制的碱基序列确定试剂盒(Taq DyeDeoxy^TM Terminator CycleSequencing Kit)确定核苷酸序列，确认为序列号2所示的核苷酸序列。

利用该方法，得到在与P trp×2的转录方向同方向上插入了编码L-脯氨酸-4-羟化酶的结构基因的DNA片段的质粒pTr2-4OH(图4)。

使用Applied Biosystenis社制的380A·DNA合成仪合成序列号13记载的DNA及序列号14记载的DNA。该合成DNA的3’末端25bp被设计成互补的序列。另外，在该合成DNA中含有由指孢囊菌RH1得到的编码L-脯氨酸-4-羟化酶蛋白的N末端部分的碱基序列，在该碱基序列上将由指孢囊菌RH1得来的碱基序列进行部位特异的碱基置换，使其成为最适合在大肠菌中表达的密码子。

将该合成DNA作为引物及模板进行PCR。反应是使用含 Pfu DNA聚合酶(STRATAGENE社制)0.5U、 Pfu DNA聚合酶的X10缓冲液(STRATA GENE社制)2μl、DMSO 2μl、各25mM dNTP液1μl、含有序列号13记载的合成DNA及序列号14记载的合成DNA各2μM的反应液20μl的反应混合物进行的。反应是在96℃培养5分钟后，重复进行96℃-2分钟、50℃-1分钟、75℃-1分钟的三步培养工序35次。将该反应液进行15％聚丙烯酰胺凝胶电泳，确认生成107bp的扩增片段，利用凝胶进行与实施例1(3)同样的操作。回收该片段。将回收的107bp的DNA片段的两末端用 Hind III及 SalI酶切后，使用Bio，Inc制MERmaid Kit回收。回收液量为16μl。

将质粒pTr 2-4 OH DNA用 Bam HI及 Pvu II酶切。将反应液进行琼脂糖凝胶电泳，确认生成了2个片段。然后将含有L-脯氨酸-4-羟化酶的结构基因的长片段用Biorad社制的Prep-A-gene回收，使用宝酒造社制的钝化(blunting)试剂盒将末端钝化后，使用宝酒造社制的连接试剂盒连接成环状。使用得到的质粒，对大肠杆菌JM 109株按常法进行转化，将转化子涂布在含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基上后，37℃下培养一晚。从生成的转化子菌落利用常法提取质粒，利用限制性内切酶消化确认其结构。结果得到削除了pTr 2-4OH的一部分序列的质粒pTr2-4OHΔ(图5)。

将质粒pTr2-4OH DNA用 Hind III及 Sal I酶切。在该酶切位点，使用宝酒造社制的连接试剂盒，将用 Hind III及 Sal I处理的上述PCR扩增片段插入。使用得到的质粒，对大肠杆菌XL1-Blue MRF’株利用常法进行转化，将转化子涂布在含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，然后在37℃培养一夜。从生成的转化子菌落利用常法提取质粒，利用限制性内切酶消化确认其结构。对于PCR扩增片段插入部分，使用Applied Biosystems社制的碱基序列确定试剂盒(Taq DyeDeoxyr^TMTerminator Cycle Sequencing Kit)确定核苷酸序列。确认为由序列号15所示的核苷酸序列。

上述的结果得到了，在与P trp×2的转录方向的相同方向上，插入了编码除结构基因的5’末端到 Sal I位点部分不同但所编码氨基酸序列与指孢囊菌RH1由来的L-脯氨酸-4-羟化酶完全相同的结构基因DNA片段的质粒pWFH1(图6)。实施例4由转化子生产L-脯氨酸-4-羟化酶

使用由实施列3得到的质粒pTr14、pTc4 OH及pWFH1，将大肠杆菌ATCC 12435转化，得到转化子大肠杆菌ATCC 12435/pTr14、大肠杆菌ATCC 12435/pTc 4OH、大肠杆菌ATCC 12435/pWFH1。将大肠杆菌ATCC 12435 pTr 14及大肠杆菌ATCC 12435/Ptc 4OH株分别接种在含有50μg/ml的氨苄青霉素的3mlLB培养基上，30℃振荡一夜。

将转化子大肠杆菌ATCC 12435/p WFH1接种在含有氨苄青霉素100μg/ml的50ml Med 4培养基〔polypeptone(日本制药)1％、酵母提取物(Difco)0.5％、NaCl 1％〕中，30℃振荡培养16小时，再将该培养液作为种子培养液，接种到加入了2升的Med 6培养基(葡萄糖2％、(NH₄)₂SO₄ 1％、K₂HPO₄ 0.1％、NaCl 0.2％、MgSO₄0.05％、FeSO₄O·0278％、CaCl₂ 0.0015％、Poly Peptone 0.4％)的5升发酵缸中，加入L-pro 200mM，在培养温度30℃、搅拌数400转/分、通气量1升/培养液1升/分的条件下培养48～72小时。培养中为保持葡萄糖的存在加入葡萄糖，并适时地添加L-脯氨酸，使浓度为约50mM，使用NH₄OH控制pH的下限为6.5。

将由上述转化子的培养得到的培养液离心分离，得到细胞。按下述条件测定该细胞的L-脯氨酸-4-羟化酶活性。该细胞根据需要可以在-20℃冷冻保存，可以在使用时解冻用于测定酶活性。

将上述分离得到的细胞加入反应液〔240mM的MES缓冲液(pH6.5)中含有12mM L-脯氨酸、24mM 2-氧代戊二酸、4mM硫酸亚铁及8mM L-抗坏血酸〕250μl中，使湿细胞量为4％(w/v)，35℃反应10分钟。通过将反应液在100℃加热2分钟而停止反应。

将该反应混合物离心分离，在得到的上清100μl中加入0.3M硼酸缓冲液(pH10.7)100μl、10％(v/v)巯基乙醇水溶液4μl及5％(w/v)邻苯二甲醛的乙醇溶液16μl，60℃下放置30秒钟后，加入2％(w/v)NBD的乙醇溶液50μl，60℃下反应40小时。在该反应液中加入1N HCl 30μl使反应停止。将该反应混合物离心分离后，滤膜过滤，除去沉淀后用高速液相色谱法分析，定量测定生成的反-4-羟基-L-脯氨酸。

高速液相色谱法按以下条件进行。流动相：10mM柠檬酸(pH4.0)/甲醇＝3/1(v/v)流速：1ml/分柱：YMC Pack ODS AQ-312(YMC社制，6×150mm)柱温：50℃检测波长：萤光检测、激发波长503nm、萤光波长541nm

如表1所示，转化子与作为基因源使用的指孢囊菌RH1株相比，每个细胞可以生产210～1420倍的L-脯氨酸-4-羟化酶。

表1

转化子生产的L-脯氨酸-4-羟化酶活性菌株细胞活性¹⁾ 相对活性²⁾大肠杆菌ATCC 12435/pHRH1 40.00 1428大肠杆菌ATCC 12435/pWFH1³⁾ 4.96 177大肠杆菌ATCC 12435/pTr 14 10.68 381大肠杆菌ATCC 12435/pTc 4OH 5.98 213大肠杆菌ATCC 12435/pTrS30 未检出 -大肠杆菌ATCC 12435/pBTacl 未检出 -指孢囊菌RH1⁴⁾ 0.028 1灰绿链霉菌JCM 4250⁵⁾ 0.020 0.7达格斯坦链霉菌JCM 4365⁵⁾ 0.009 0.3

1)：细胞活性以每1mg湿细胞的酶活性(U/mg wet cells)表示。1U为每1分钟生成1nmol的反-4-羟基-L-脯氨酸的酶活性。

2)：相对活性是将指孢囊菌RH1株生产的酶活性作为1得到的。

3)：使用5升的发酵缸进行与实施例4同样的实验，而在培养时不添加L-脯氨酸得到的结果。

4)：记载于参考例2中。

5)：记载于参考例3中。实施例5融合蛋白表达质粒的构建(1)与β-半乳糖苷酶蛋白片段的融合蛋白表达质粒的构建

在2.4μg质粒pBluescript II KS(+)DNA中加入限制性内切酶EcoRV，酶切该DNA后，利用乙醇沉淀法得到乙醇沉淀。将该乙醇沉淀溶于5μl的TE中。

在质粒pRH71 DNA 4μg中加入限制性内切酶SacI，酶切该DNA后，用与上述相同的方法得到沉淀。将该乙醇沉淀(DNA片段)溶于36μl TE后，使用宝酒造社Takara DNA Blunting Kit将该DNA片段的两末端钝化。将该处理DNA进行琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶按常法提取约2.4kb的DNA片段，使用Biorad社制的Prep-A-gene回收。将回收的该DNA用Xba I酶切，按上述相同方法得到乙醇沉淀。将该乙醇沉淀溶于10μl TE。

使用宝酒造社制的Takara连接试剂盒将上述用 Eco RV- Xba酶切的pBluescript IIKS(+)DNA及 Sac I酶切后平端化再用 Xba I酶切后回收的DNA连接。

使用该连接DNA，将大肠杆菌XL2-Blue MRF’株(STRATAGENE社制)转化，将该转化子涂布在含有50μg/ml的氨苄青霉素、0.2mMIPTG、40μg/ml X-Gal的LB琼脂培养基上，37℃下培养一夜。

从生长的菌落利用常法提取质粒，利用限制性内切酶消化确认其结构。

将该质粒作为模板、序列号16记载的DNA作为有义链引物、序列号7记载的DNA作为反义链引物，进行PCR。通过该反应生成了对应于L-脯氨酸4-羟化酶的N末端氨基酸序列的50bp的DNA片段，由此可以确认在质粒上插入了作为目标的L-脯氨酸-4-羟化酶的结构基因。

按照上述方法，得到了在与 lac启动子的转录方向相同方向上插入了与β-Gal的N末端34氨基酸融合的L-脯氨酸-4-羟化酶的结构基因的质粒pES1-23a(图7)。构建的融合蛋白氨基酸序列如序列号18所示。

(2)与麦芽糖结合蛋白的融合表达质粒的构建

将序列号17记载的DNA作为有义链引物，序列号12记载的DNA作为反义链引物，pRH 71作为模板，按实施例1(3)的方法进行PCR。即，使用含有pRH 71 0.1μg、有义链及反义链DNA引物各2μM的反应液20μl，96℃培养5分钟后，重复进行96℃-2分钟、58℃-1分钟、75℃-1分钟的三步培养工序30次。

将该反应液进行琼脂糖凝胶电泳后，将编码L-脯氨酸-4-羟化酶的结构基因的833bp的扩增片段利用常法提取，使用Biorad社的Prep-A-gene将该DNA片段回收。将回收的833bp的DNA片段用 Hind III酶切后，利用乙醇沉淀法得到乙醇沉淀。将该乙醇沉淀溶于5μl的TE，作为L-脯氨酸-4-羟化酶结构基因片段使用。

在 tac启动子(P tac)控制下，将只具有麦芽糖结合蛋白的结构基因的(不具有信号序列)质粒pMAL-c2(NEW ENGAND Biolabs社制PROTEIN FUSION & PURIFICATION SYSTEM)用 Xmn I及 HindIII酶切。

将上述L-脯氨酸-4-羟化酶结构基因片段用宝酒造社制的DNA连接试剂盒插入在pMAL-c2的 Xmn I- Hind III酶切位点，利用常法转化大肠杆菌XL2-Blue MRF’株。在37℃培养-夜。从这样得到的菌落利用常法提取质粒，利用限制性内切酶消化确认其结构。

利用上述方法，在P tac的支配下，得到插入了编码L-脯氨酸-4-羟化酶的结构基因的DNA片段的质粒pMC 4OH，该DNA片段的插入是以与麦芽糖结合蛋白的结构基因相融合的形式进行的(图8)。构建的融合蛋白的氨基酸序列如序列号19所示。实施例6利用含有融合蛋白表达质粒的转化子生产L-脯氨酸-4-羟化酶

使用由实施例5得到的质粒pES 1-23a及pMC 4OH转化大肠杆菌DH1。按照实施例4的方法培养所得转化子，但该培养使用添加了0.1mMIPTG的培养基，并按实施例4测定该转化子的L-脯氨酸-4-羟化酶的生产量。

如表2所示，该转化子与作为基因源使用的指孢囊菌RH1株相比，每个细胞生产29～298倍的L-脯氨酸-4-羟化酶。

表2

转化子生产的L-脯氨酸-4-羟化酶活性菌株细胞活性¹⁾ 相对活性³⁾大肠杆菌DH1/PES1-23a 0.80 29大肠杆菌DH1/pMc 40H 8.35 298大肠杆菌DH1/pBluescript II KS(+) 未检出 -大肠杆菌DH1/pMAL-c2 未检出 -指孢囊菌RH1²⁾ 0.028 1

1)：细胞活性以每1mg湿细胞的酶活性(U/mg wet cells)表示。1U为每分钟生成1nmol的反-4-羟基-L-脯氨酸的酶活性。

2)：记载于参考例2中。

3)：相对活性是将指孢囊菌RH1株产生的酶活性作为1得到的。实施例7转化子生产反-4-羟基-L-脯氨酸(1)使用转化子大肠杆菌ATCC 12435/pTr 14生产反-4-羟基-L-脯氨酸

将由实施例4得到的转化子大肠杆菌ATCC 12435/pTr接种到含有氨苄青霉素100μg/ml的3ml LB培养基中，30℃振荡培养16小时。将该培养液离心分离，定量测定得到的上清中的反-4-羟基-L-脯氨酸。

其结果，在大肠杆菌ATCC 2435/pTr 14的培养液上清中生成了381μM(50.0mg/l)的反-4-羟基-L-脯氨酸。

另一方面，在作为宿主使用的大肠杆菌ATCC 12435的培养上清中末检测出游离的反-4-羟基-L-脯氨酸。(2)使用转化子大肠杆菌ATCC 12435/pWFH1生产反-4-羟基-L-脯氨酸

将该转化子大肠杆菌ATCC 12435/pWFH1接种到添加有100μg/ml氨苄青霉素及2％葡萄糖的50ml Med 4培养基中，30℃振荡培养16小时。将该培养液作为种子培养液，接种到加入了2升Med 6培养基的5升发酵缸中，在Med 6培养基中代替Poly Peptone添加了0.8％的蛋白胨。在培养温度33℃、搅拌数400转/分钟、通气量1升/培养液1升/分的条件下运转。

培养中为保持葡萄糖的存在要适时添加，使用NH₄OH控制pH的下限为6.5。

将该培养液离心分离，定量测定得到的上清中的反-4-羟基-L-脯氨酸，培养52小时，在大肠杆菌ATCC 12435/pWFH1的培养液上清中生成并积累了10.7mM(1.4g/L)的反-4-羟基-L-脯氨酸。

另一方面，在作为宿主使用的大肠杆菌ATCC 12435的培养上清中未检测出游离的反-4-羟基-L-脯氨酸。(3)使用转化子大肠杆菌ATCC12435/pWFH1生产反-4-羟基-L-脯氨酸

将该转化子大肠杆菌ATCC 12435/pWFH1接种到含有氨苄青霉素100μg/ml的50ml的Med 4培养基中，30℃振荡培养16小时。将该培养液作为种子培养液，接种到加入了2升Med 6培养基的5升发酵缸中。再添加L-Pro 200mM，在培养温度30℃、搅拌数400转/分、通气量1升/培养液1升/分的条件下运转。

培养中，要适时添加葡萄糖和L-脯氨酸，以保持葡萄糖的存在，并且使L-脯氨酸为约50mM，使用NH₄OH控制pH的下限为6.5。

将该培养液离心分离，定量测定得到的上清中的反-4-羟基-L-脯氨酸，培养72小时，在大肠杆菌ATCC 12435/pWFH1的培养液上清中生成蓄积了185mM(24g/L)的反-4-羟基-L-脯氨酸。

另一方面，在作为宿主使用的大肠杆菌ATCC12435的培养上清中未检测到反-4-羟基-L-脯氨酸。(4)使用转化子大肠杆菌ATCC 12435/pMc4OH生产反-4-羟基-L-脯氨酸

将该转化子大肠杆菌ATCC 12435/pMc 4OH接种到含有氨苄青霉素100μg/ml的50ml的Med 4培养基中，30℃振荡培养16小时。将该培养液作为种子培养液，接种到加入了2升Med 6培养基的5升发酵缸中。再添加L-Pro 200mM，在培养温度30℃、搅拌数400转/分、通气量1升/培养液1升/分的条件下运转。

培养中，为保持葡萄糖的存在，而且要保持L-脯氨酸为约50mM，要随时添加葡萄糖及L-脯氨酸，使用NH₄OH控制pH的下限为6.5。

将该培养液离心分离，定量测定得到的上清中的反-4-羟基-L-脯氨酸，培养72小时，在大肠杆菌ATCC 12435/pWFH1的培养液上清中生成并蓄积了85.4mM(11.2g/L)的反-4-羟基-L-脯氨酸。

另一方面，在作为宿主使用的大肠杆菌ATCC 12435的培养上清中未检出游离的反-4-羟基-L-脯氨酸。实施例8使用转化子细胞从L-脯氨酸转换成反-4-羟基-L-脯氨酸

将转化子细胞大肠杆菌ATCC 12435/pTr 14接种到含有50μg/ml的氨苄青霉素的10ml的LB培养基中，30℃振荡培养一夜。将该培养液离心分离，得到细胞。根据需要可将该细胞在-20℃冻结保存，使用时解冻。

在250μl反应液(在pH6.5的240mM的MES缓冲液中含有20mML-脯氨酸、24mM2-氧代戊二酸、4mM硫酸亚铁及8mM L-抗坏血酸)中加入湿细胞，使其含量为10％(w/v)，35℃反应60分钟。定量测定反应液中生成的反-4-羟基-L-脯氨酸，结果生成了11.5mM(1.5g/l)的反-4-羟基-L-脯氨酸。参考例1L-脯氨酸-4-羟化酶的分离及精制(1)指孢囊菌RH1的冻结细胞的制备

在2升的三角烧瓶中分别注入200ml的SR3培养基(含有葡萄糖1.0％、可溶性淀粉1.0％、酵母提取物0.5％、胰化蛋白胨0.5％、肉膏0.3％及磷酸镁0.05％，用6N NaOH调节pH为7.2的培养基)，120℃灭菌20分钟。在该培养基中接种在TH琼脂平板培养基(含有可溶性淀粉1％、NZ胺0.2％、酵母提取物0.1％、肉膏0.1％及琼脂1.5％，用6N NaOH调节pH7.2后，120℃灭菌处理20分钟得到的培养基)中生长的指孢囊菌RH1，28℃振荡培养2天，作为下步的种子培养液。

在5升的发酵缸中分别注入2升的Df1培养基(含有可溶性淀粉5％、豆粉1.5％、磷酸二氢钾0.05％、MgSO₄·7H₂O 0.05％及碳酸钙0.5％，用6N NaOH调节pH为7.0的培养基)后，在700rpm、1vvmr条件下，28℃培养2天。在培养过程中不调节pH。将得到的培养液在7000xg、4℃离心分离10分钟，每1升培养液得到湿细胞75g。用生理盐水在4℃下洗涤湿细胞，从离心后一直到使用时在-80℃下冻结保存。(2)无细胞提取液的制备

将由参考例1(1)得到的冻结细胞600g熔化后，在冰冷下悬浮在3升的缓冲液A〔含有2mM DTT、0.2mM EDTA及20％(v/v)甘油的50mM TAPS〔N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸〕缓冲液(pH9.0)〕中。将悬浮液用DYNO-MILL(WILLY ABACHOFENMASCHINENFABRIK，BASEL，SWISS)处理，将细胞破碎。将该处理液在4℃、6500xg的条件下离心分离30分钟，得到上清。

之后的操作全部在冰冷下或4℃下进行。(3)利用柱色谱法进行分离及精制(3)-1STREAMLINE：

将由上述工序得到的上清通过充填有300ml的用缓冲液A平衡化的DEAE吸附剂的pharmacia社制的STREAM LINE^TM，将含有L-脯氨酸4-羟化酶的级分用含有0.3M NaCl的缓冲液A洗脱。(3)-2 DEAE琼脂糖凝胶柱色谱

将由上述工序得到的活性级分用缓冲液A稀释3倍后，通过预先用缓冲液A平衡化的DEAE琼脂糖凝胶柱(5cm×15cm)。用缓冲液A将柱洗涤后，将含有该酶的级分用在缓冲液A中制成的0～0.3M的氯化钠的直线浓度梯度进行洗脱。(3)-3丁基琼脂糖凝胶柱色谱

在由上述工序得到的活性级分中添加NaCl，使浓度为3M，通过预先用含有3M NaCl的缓冲液A平衡化的丁基琼脂糖凝胶柱(ButylSepharose 4 Fast Flow、2.6cm×13cm)。将该酶分别用含有3M NaCl的缓冲液A、含有1.98M NaCl的缓冲液A、含有0.99M NaCl的缓冲液A及单独的缓冲液A4种不同NaCl浓度的缓冲液从高NaCl浓度到低浓度阶段洗脱。(3)-4苯基琼脂糖凝胶柱色谱

在由上述工序得到的活性级分中添加NaCl，使浓度为3M，通过预先用含有3M NaCl的缓冲液A平衡化的苯基琼脂糖凝胶柱(PhenylSepharose HP Hiload 16/10 1.6cm×10cm)。用含有3M NaCl的缓冲液A洗涤后，将含有该酶的级分用缓冲液A洗脱。(3)-5色素亲和柱色谱

将由上述工序得到的活性级分用Pharmacia社制的PD-10柱脱盐后，通过预先用缓冲液A平衡化的Reactive Red 120柱(Sigma社制Reactive red 120，1cm×12.7cm)。用缓冲液A洗涤后，将含有该酶的级分用在缓冲液AK制成的从0～1.5M的NaCl直线浓度梯度进行洗脱。(3)-6 Resource Q柱色谱

将由上述工序得到的活性级分用预先用缓冲液B〔含有2mM DTT、0.1％(v/v)Tween 20及20％(v/v)甘油的50mM TAPS缓冲液(pH8.0)〕平衡化的Pharmacia社制的PD-10柱脱盐后，通过预先用缓冲液B平衡化的Resource Q柱(Pharmacia社制RESOURCE^TM Q，1ml)。用在缓冲液B中制成的0～0.2M的NaCl直线浓度梯度洗脱。

表3

L-脯氨酸-4-羟化酶的分离及精制的概要级分总蛋白总活性比活性收率

(mg) (U) (U/mg蛋白) (％)无细胞提取液 13330 11000 0.83 100STREAMLINE 4875 4880 1.00 44.4DEAE琼脂糖凝胶 353 3820 10.8 34.7丁基琼脂糖凝胶 35.1 1310 37.3 11.9苯基琼脂糖凝胶 1.44 814 565.3 7.4色素亲和柱 0.212 366 1726 3.3Resource Q 0.100 384 3840 3.5

参考例2利用指孢囊菌生产L-脯氨酸-4-羟化酶

在试管中分别注入10ml的SR3培养基，120℃灭菌20分钟。在该培养基中接种一接种环的在HT琼脂平板培养基中生长的指孢囊菌RH1，28℃振荡培养2天，作为种子培养液使用。

在试管中分别注入10ml的Df1培养基，120℃灭菌20分钟，在该培养基中无菌接种上述种子培养液1ml，28℃振荡培养2天。将得到的培养液在8000rpm、4℃的条件下离心分离10分钟。将得到的细胞用80mM的TES〔N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸〕缓冲液(pH7.5)洗涤后，离心分离。将得到的湿细胞150mg悬浮在1.5ml的反应液〔在含有4mM L-脯氨酸、8mM α-氧代戊二酸、4mM L-抗坏血酸、2mM硫酸亚铁的80mM TES缓冲液(pH7.5)中加入1.4％(v/v)Nymeen溶液(将4g Nymeen S-215(日本油脂株式社制)4g溶于10ml二甲苯中)〕中，30℃反应30分钟。反应后，从细胞反应液中离心分离除去细胞后，对于上清中生成的羟基脯氨酸进行分析，测定指孢囊菌细胞的L-脯氨酸-4-羟化酶活性。结果如表1所示。参考例3由灰绿链霉菌生产L-脯氨酸-4-羟化酶

使用灰绿链霉菌JCM 4250及达格斯坦链霉菌JCM 4365与参考例2同样测定L-脯氨酸-4-羟化酶活性。使用Df4培养基〔含有甘油2.5％、葡萄糖2.5％、豆粉1.5％、磷酸二氢钾0.05％、Mg₂SO₄·7H₂O 0.05％、碳酸钙0.5％，用6N NaOH调节pH为7.0的培养基〕代替Df1培养基。结果如表1所示。

根据本发明，可以提供工业制备作为医药品合成原料或食品添加剂有用的反-4-羟基-L-脯氨酸的方法，还可以提供用于该方法的编码具有L-脯氨酸-4-羟化酶活性的蛋白质的基因、含有该基因的重组DNA、含有该重组DNA的转化子、使用该转化子制造L-脯氨酸-4-羟化酶的方法及该L-脯氨酸-4-羟化酶。

序列表序列号：1序列长度：272序列类型：氨基酸

链数：直链状序列种类：蛋白质(protein)起源生物名：指孢囊菌属株名：RH1序列Met Leu Thr Pro Thr Glu Leu Lys Gln Tyr Arg Glu Ala Gly Tyr Leu1 5 10 15Leu Ile Glu Asp Gly Leu Gly Pro Arg Glu Val Asp Cys Leu Arg Arg

20 25 30Ala Ala Ala Ala Leu Tyr Ala Gln Asp Ser Pr0 Asp Arg Thr Leu Glu

35 40 45Lys Asp Gly Arg Thr Val Arg Ala Val His Gly Cys His Arg Arg Asp

50 55 60Pro Val Cys Arg Asp Leu Val Arg His Pro Arg Leu Leu Gly Pro Ala65 70 75 80Met Gln Ile Leu Ser Gly Asp Val Tyr Val His Gln Phe Lys Ile Asn

85 90 95Ala Lys Ala Pro Met Thr Gly Asp Val Trp Pro Trp His Gln Asp Tyr

100 105 110Ile Phe Trp Ala Arg Glu Asp Gly Met Asp Arg Pro His Val Val Asn

115 120 125Val Ala Val Leu Leu Asp Glu Ala Thr His Leu Asn Gly Pro Leu Leu

130 135 140Phe Val Pro Gly Thr His Glu Leu Gly Leu Ile Asp Val Glu Arg Arg145 150 155 160Ala Pro Ala Gly Asp Gly Asp Ala Gln Trp Leu Pro Gln Leu Ser Ala

165 170 175Asp Leu Asp Tyr Ala Ile Asp Ala Asp Leu Leu Ala Arg Leu Thr Ala

180 185 190Gly Arg Gly Ile Glu Ser Ala Thr Gly Pro Ala Gly Ser Ile Leu Leu

195 200 205Phe Asp Ser Arg Ile Val His Gly Ser Gly Thr Asn Met Ser Pro His

210 215 220Pro Arg Gly Val Val Leu Val Thr Tyr Asn Arg Thr Asp Asn Ala Leu225 230 235 240Pro Ala Gln Ala Ala Pro Arg Pro Glu Phe Leu Ala Ala Arg Asp Ala

245 250 255Thr Pro Leu Val Pro Leu Pro Ala Gly Phe Ala Leu Ala Gln Pro Val

260 265 270序列号：2序列长度：816序列类型：核酸链数：二条链序列种类：Genomic DNA起源生物名：指孢囊菌属株名：RH1

决定特征的方法：E序列：ATGCTGACCC CGACGGAGCT CAAGCAGTAC CGCGAGGCGG GCTATCTGCT CATCGAGGAC 60GGCCTCGGCC CGCGGGAGGT CGACTGCCTG CGCCGGGCGG CGGCGGCCCT CTACGCGCAG 120GACTCGCCGG ACCGCACGCT GGAGAAGGAC GGCCGCACCG TGCGCGCGGT CCACGGCTGC 180CACCGGCGCG ACCCGGTCTG CCGCGACCTG GTCCGCCACC CGCGCCTGCT GGGCCCGGCG 240ATGCAGATCC TGTCCGGCGA CGTGTACGTC CACCAGTTCA AGATCAACGC GAAGGCCCCG 300ATGACCGGCG ATGTCTGGCC GTGGCACCAG GACTACATCT TCTGGGCCCG AGAGGACGGC 360ATGGACCGTC CGCACGTGGT CAACGTCGCG GTCCTGCTCG ACGAGGCCAC CCACCTCAAC 420GGGCCGCTGT TGTTCGTGCC GGGCACCCAC GAGCTGGGCC TCATCGACGT GGAGCGCCGC 480GCGCCGGCCG GCGACGGCGA CGCGCAGTGG CTGCCGCAGC TCAGCGCCGA CCTCGACTAC 540GCCATCGACG CCGACCTGCT GGCCCGGCTG ACGGCCGGGC GGGGCATCGA GTCGGCCACC 600GGCCCGGCGG GCTCGATCCT GCTGTTCGAC TCCCGGATCG TGCACGGCTC GGGCACGAAC 660ATGTCGCCGC ACCCGCGCGG CGTCGTCCTG GTCACCTACA ACCGCACCGA CAACGCCCTG 720CCGGCGCAGG CCGCTCCGCG CCCGGAGTTC CTGGCCGCCC GCGACGCCAC CCCGCTGGTG 780CCGCTGCCCG CGGGCTTCGC GCTGGCCCAG CCCGTC 816序列号：3序列长度：17序列类型：核酸拓扑结构：一条链序列种类：其他的核酸、合成DNA序列：ATGCTSACSC CNACNGA 17 序列号：4序列长度：17序列类型：核酸拓扑结构：一条链序列种类：其他的核酸、合成DNA序列：GGSCCSAGNC CRTCYTC 17序列号：5序列长度：71序列类型：核酸链数：二条链序列种类：其他的核酸、合成DNA序列：ATG CTG ACG CCG ACG GAG CTC AAG CAG TAC CGC GAG GCG GGC TAT CTG 48Met Leu Thr Pr0 Thr Glu Leu Lys Gln Tyr Arg Glu Ala Gly Tyr Leu1 5 10 15CTC ATC GAG GAC GGT CTG GGC CC 71Leu Ile Glu Asp Gly Leu Gly

20序列号：6序列长度：20序列类型：核酸拓扑结构：一条链

序列种类：其他的核酸、合成DNA序列：ACGGAGCTCA AGCAGTACCG 20序列号：7序列长度：19序列类型：核酸拓扑结构：一条链序列种类：其他的核酸、合成DNA序列：GGGCCGAGAC CGTCCTCGA 19序列号：8序列长度：2707序列类型：核酸链数：二条链序列种类：Genomic DNA起源生物名：指孢囊菌属株名：RH1序列GAGCTCTACC GGCGAACGCG CNCNCGGTGG CCGAATACGA NCCGGCGCCC CACGATGTNC 60GGGCCACCCT CGTGCAGNCG GCCGAGCAGG ACGCCGGGCT ACGGGCGGCG NCGGTCGAGN 120CGTGGACCCG CGCCTGCGGG GCGCCCCCGN CGGTGCATGT GCTGCCGGGC GGGCACTTCT 180CGCTCTGCGC CGGCCGCACG TCGAGCGGCT GGCCCGGCTC CTGCCCGGCC TGTAGGCGAC 240CTAACCCACC GTGAGGAGCG CTCATGCTGA CCCCGACGGA GCTCAAGCAG TACCGCGAGG 300CGGGCTATCT GCTCATCGAG GACGGCCTCG GCCCGCGGGA GGTCGACTGC CTGCGCCGGG 360CGGCGGCGGC CCTCTACGCG CAGGACTCGC CGGACCGCAC GCTGGAGAAG GACGGCCGCA 420CCGTGCGCGC GGTCCACGGC TGCCACCGGC GCGACCCGGT CTGCCGCGAC CTGGTCCGCC 480ACCCGCGCCT GCTGGGCCCG GCGATGCAGA TCCTGTCCGG CGACGTGTAC GTCCACCAGT 540TCAAGATCAA CGCGAAGGCC CCGATGACCG GCGATGTCTG GCCGTGGCAC CAGGACTACA 600TCTTCTGGGC CCGAGAGGAC GGCATGGACC GTCCGCACGT GGTCAACGTC GCGGTCCTGC 660TCGACGAGGC CACCCACCTC AACGGGCCGC TGTTGTTCGT GCCGGGCACC CACGAGCTGG 720GCCTCATCGA CGTGGAGCGC CGCGCGCCGG CCGGCGACGG CGACGCGCAG TGGCTGCCGC 780AGCTCAGCGC CGACCTCGAC TACGCCATCG ACGCCGACCT GCTGGCCCGG CTGACGGCCG 840GGCGGGGCAT CGAGTCGGCC ACCGGCCCGG CGGGCTCGAT CCTGCTGTTC GACTCCCGGA 900TCGTGCACGG CTCGGGCACG AACATGTCGC CGCACCCGCG CGGCGTCGTC CTGGTCACCT 960ACAACCGCAC CGACAACGCC CTGCCGGCGC AGGCCGCTCC GCGCCCGGAG TTCCTGGCCG 102CCCGCGACGC CACCCCGCTG GTGCCGCTGC CCGCGGGCTT CGCGCTGGCC CAGCCCGTCT 1080AGGCTGCCGC AGGCGGCGCA CGGCCCACCT CAGCGCAGGC CGAGCAGCCG CCCCACGCCG 1140GCGGCGAAGC GGATCAGGCC GCGCAGGCCG AGCGGCGGGC GAGGCGAGCA TTGTCGGGCT 1200GCCCAGTCGT CGTGTCGTGG GTGACAGCCC GTGGCGGCTC TTCTGACGGC CCGCGACGGA 1260TCACGGTCAT GTTTGCCGAT GGGACGTCAC GGTCGTGTGC CCGGACGGTC GAAAATCACC 1320AGAATGGTGC TGATGGCCTG TCGCGGGGTG TCGGTGGTGC GGTCGCCAGC ATCCCTCGGC 1380CGCGCCGGGG CCGGTGCGTC TCACCAGGCC GTGCGGGCGT TGACGGCCGA GACGGCGGAC 1440CGGAAGGCGG CCACCGGTTC GCCGAGATAG CACCACGGGA ACTCGGTGAC CAACTCGCCG 1500ATGGCCAGAA ACTGCATCGC CGCCGCCTCG TCGTCGCCGG CCGCCAGAAA CGCGACCGCG 1560AACGCGTTGG CGTCCAGGGC CCAGTCCCGG CGCCGCACAT AGCGGCGGTG CCGGACCGAC 1620TCGCGGGCCG CGTCGTTGAG CGACTCCCGC ACCGCCGCCG AGCGGATGTA GTCACGGCTA 1680GGCGCGCCAC CGAGGTCCAG CCAGTGTTCA AGGTGCGCCA GGGCGACGAG CGTGCCAAGA 1740CGGCTGCCCT CGCCTGCGTC CCGCGCGGCC CCCTCGGCGA ACGCGCGCAT CCGCTCCGGC 1800GAGCCGCCCC ACTTCCGGCA GAGGTTCTGC AGCATCGCGG TGTGGGCGCG GTAGTTGTCC 1860GGGTCATGCG CGACCGCCGC ATCGAACCGG CGCCGCTGCT CGTCCGCACT CAGACCCAGG 1920CCACGGGCGA CGGTGATCAG GCCAGTCCAG GCCGTGACAT TGGCCGGCTC CCGGCGTACC 1980ACCTCCTGCA GGCAGTACTC GGCGAGTTCC AGCCGCTGCC GGAACAGCAC CCACGCTCAG 2040GCGGGACGTA CGCGGCAGGA AGCCCGGTGC GAGCCTCCCA GGCCCACGCG ATCGCCCGGT 2100GACCGCGCAC GAGCAGCGCC AGGGGATCGT CCGGCCCGTG CTCGATTACA TGCGCACAGC 2160ACAGTGCTCG GTGCCGGGGA CCTGGGCCGC GACCGAGACC AGGAAGTCGA GATCCTCTCT 2220TGTGCCGCTC GGCGGCCAGN ATGGGCCGCG CGGNAAGCCA GTCTCCGGCG GCCAACGCTG 2280CCCACAGCCA CCGGGCGTCG GCATCACCGA GCGTCGGGTC GAAGGCGCGC GCCACGCGCC 2340CTGCGGACCG CCGGAACAGG GGCATGCGCG CATCCTCCAG CCGATGCGCC GATCAGCCGG 2400CGCGGCAAGA TCGTACGCCC GGACCGCGAG GTCGGGAGGT CCACGGGCGG TCCCCACTGG 2460GCGACGACTG TCAGNTGCTA CGCTGGCCCG GTGGCCGAGA TCACCGGGGC GTTCGAGATC 2520CATGTAACCG TCGAGGCGCA CCACGGCACG GACCTCGCCC GGTTCGCCGA GAAGCACGAC 2580GTCAAGTTCC TGCACATCGT CCTGGACCGC GGCCGGTTTC CGTCCCAGCC GATCTCACGC 2640TGCCGATGCA CGGCACCCTC GCTCAGGCAC GGAAGACGGC GCCACGTGGC GGGAGCGGCT 2700ACTCGAG 2707序列号：9序列长度：37序列类型：核酸拓扑结构：一条链序列种类：其他的核酸、合成DNA序列：GTGAGGAAAG CTTATGCTGA CCCCGACGGA GCTCAAG 37序列号：10序列长度：36序列类型：核酸拓扑结构：一条链序列种类：其他的核酸、合成DNA序列：GCCTGCGGGA TCCTAGACGG GCTGGGCCAG CGCGAA 36序列号：11序列长度：37序列类型：核酸拓扑结构：一条链序列种类：其他的核酸、合成DNA序列：GTGAGGAGAA TTCATGCTGA CCCCGACGGA GCTCAAG 37序列号：12序列长度：38序列类型：核酸拓扑结构：一条链序列种类：其他的核酸、合成DNA序列：CCGCCTGAAG CTTCCTAGAC GGGCTGGGCC AGCGCGAA 38序列号：13序列长度：64序列类型：核酸拓扑结构：一条链序列种类：其他的核酸、合成DNA 序列：TGAGGAAAGC TTATGCTGAC CCCGACCGAA CTGAAACAGT ATCGTGAAGC 50GGGCTATCTG CTGA 64序列号：14序列长度：66序列类型：核酸拓扑结构：一条链序列种类：其它的核酸、合成DNA序列：CCGGAATTCG TCGACTTCAC GCGGGCCCAG GC CATCTTCA ATCAGCAGAT 50AGCCCGCTTC ACGATA 66序列号：15序列长度：816序列类型：核酸链数：二条链拓扑结构：直链状序列种类：其他的核酸序列ATG CTG ACC CCG ACC GAA CTG AAA CAG TAT CGT GAA GCG GGC TAT CTG 48Met Leu Thr Pro Thr Glu Leu Lys Gln Tyr Arg Glu Ala Gly Tyr Leu1 5 10 15CTG ATT GAA GAT GGC CTG GGC CCG CGT GAA GTC GAC TGC CTG CGC CGG 96Leu Ile Glu Asp Gly Leu Gly Pro Arg Glu Val Asp Cys Leu Arg Arg

20 25 30GCG GCG GCG GCC CTC TAC GCG CAG GAC TCG CCG GAC CGC ACG CTG GAG 144Ala Ala Ala Ala Leu Tyr Ala Gln Asp Ser Pro Asp Arg Thr Leu Glu

35 40 45AAG GAC GGC CGC ACC GTG CGC GCG GTC CAC GGC TGC CAC CGG CGC GAC 192Lys Asp Gly Arg Thr Val Arg Ala Val His Gly Cys His Arg Arg Asp

50 55 60CCG GTC TGC CGC GAC CTG GTC CGC CAC CCG CGC CTG CTG GGC CCG GCG 240Pro Val Cys Arg Asp Leu Val Arg His Pro Arg Leu Leu Gly Pro Ala65 70 75 80ATG CAG ATC CTG TCC GGC GAC GTG TAC GTC CAC CAG TTC AAG ATC AAC 288Met Gln Ile Leu Ser Gly Asp Val Tyr Val His Gln Phe Lys Ile Asn

85 90 95GCG AAG GCC CCG ATG ACC GGC GAT GTC TGG CCG TGG CAC CAG GAC TAC 336Ala Lys Ala Pro Met Thr Gly Asp Val Trp Pro Trp His Gln Asp Tyr

100 105 110ATC TTC TGG GCC CGA GAG GAC GGC ATG GAC CGT CCG CAC GTG GTC AAC 384Ile Phe Trp Ala Arg Glu Asp Gly Met Asp Arg Pro His Val Val Asn

115 120 125GTC GCG GTC CTG CTC GAC GAG GCC ACC CAC CTC AAC GGG CCG CTG TTG 432Val Ala Val Leu Leu Asp Glu Ala Thr His Leu Asn Gly Pro Leu Leu

130 l35 140TTC GTG CCG GGC ACC CAC GAG CTG GGC CTC ATC GAC GTG GAG CGC CGC 480Phe Val Pro Gly Thr His Glu Leu Gly Leu Ile Asp Val Glu Arg Arg145 150 155 160GCG CCG GCC GGC GAC GGC GAC GCG CAG TGG CTG CCG CAG CTC AGC GCC 528Ala Pro Ala Gly Asp Gly Asp Ala Gln Trp Leu Pro Gln Leu Ser Ala

165 170 175GAC CTC GAC TAC GCC ATC GAC GCC GAC CTG CTG GCC CGG CTG ACG GCC 576Asp Leu Asp Tyr Ala Ile Asp Ala Asp Leu Leu Ala Arg Leu Thr Ala

180 185 190GGG CGG GGC ATC GAG TCG GCC ACC GGC CCG GCG GGC TCG ATC CTG CTG 624Gly Arg Gly Ile Glu Ser Ala Thr Gly Pro Ala Gly Ser Ile Leu Leu

195 200 205TTC GAC TCC CGG ATC GTG CAC GGC TCG GGC ACG AAC ATG TCG CCG CAC 672Phe Asp Ser Arg Ile Val His Gly Ser Gly Thr Asn Met Ser Pro His

210 215 220CCG CGC GGC GTC GTC CTG GTC ACC TAC AAC CGC ACC GAC AAC GCC CTG 720Pro Arg Gly Val Val Leu Val Thr Tyr Asn Arg Thr Asp Asn Ala Leu225 230 235 240CCG GCG CAG GCC GCT CCG CGC CCG GAG TTC CTG GCC GCC CGC GAC GCC 768Pro Ala Gln Ala Ala Pro Arg Pro Glu Phe Leu Ala Ala Arg Asp Ala

245 250 255ACC CCG CTG GTG CCG CTG CCC GCG GGC TTC GCG CTG GCC CAG CCC GTC 816Thr Pro Leu Val Pro Leu Pro Ala Gly Phe Ala Leu Ala Gln Pro Val

260 265 270序列号：16序列长度：20序列类型：核酸拓扑结构：一条链序列种类：其它的核酸、合成DNA序列：AAGCAGTACC GCGAGGCGGG 20序列号：17序列长度：21序列类型：核酸拓扑结构：一条链序列种类：其它的核酸、合成DNA序列：ATGCTGACCC CGACGGAGCT C 21序列号：18序列长度：299序列类型：氨基酸链数：直链状序列种类：蛋白质起源生物名：指孢囊菌属株名：RH1序列的特征表示特征的记号：peptide存在位置：35..299

决定特征的方法：S起源生物名：大肠杆菌直接的起源

pBluescriptIIKS+序列的特征表示特征的记号：peptide存在位置：1..34

决定特征的方法：S序列：Met Thr Met Ile Thr Pro Ser Ala Gln Leu Thr Leu Thr Lys Gly Asn1 5 10 15Lys Ser Trp Val Pro Gly Pro Pro Ser Arg Ser Thr Val Ser Ile Ser

20 25 30Leu Ile Lys Gln Tyr Arg Glu Ala Gly Tyr Leu Leu Ile Glu Asp Gly

35 40 45Leu Gly Pro Arg Glu Val Asp Cys Leu Arg Arg Ala Ala Ala Ala Leu

50 55 60Tyr Ala Gln Asp Ser Pro Asp Arg Thr Leu Glu Lys Asp Gly Arg Thr65 70 75 80Val Arg Ala Val His Gly Cys His Arg Arg Asp Pro Val Cys Arg Asp

85 90 95Leu Val Arg His Pro Arg Leu Leu Gly Pro Ala Met Gln Ile Leu Ser

100 105 110Gly Asp Val Tyr Val His Gln Phe Lys Ile Asn Ala Lys Ala Pro Met

115 120 125Thr Gly Asp Val Trp Pro Trp His Gln Asp Tyr Ile Phe Trp Ala Arg

130 135 140Glu Asp Gly Met Asp Arg Pro Hi sVal Val Asn Val Ala Val Leu Leu145 150 155 160Asp Glu Ala Thr His Leu Asn Gly Pro Leu Leu Phe Val Pro Gly Thr

165 170 175His Glu Leu Gly Leu Ile Asp Val Glu Arg Arg Ala Pro Ala Gly Asp

180 185 190Gly Asp Ala Gln Trp Leu Pro Gln Leu Ser Ala Asp Leu Asp Tyr Ala

195 200 205Ile Asp Ala Asp Leu Leu Ala Arg Leu Thr Ala Gly Arg Gly Ile Glu

210 215 220Ser Ala Thr Gly Pro Ala Gly Ser Ile Leu Leu Phe Asp Ser Arg Ile225 230 235 240Val His Gly Ser Gly Thr Asn Met Ser Pro His Pro Arg Gly Val Val

245 250 255Leu Val Thr Tyr Asn Arg Thr Asp Asn Ala Leu Pro Ala Gln Ala Ala

260 265 270Pro Arg Pro Glu Phe Leu Ala Ala Arg Asp Ala Thr Pro Leu Val Pro

275 280 285Leu Pro Ala Gly Phe Ala Leu Ala Gln Pro Val

290 295序列号：19序列长度：659序列类型：氨基酸链数：直链状序列种类：蛋白质起源生物名：指孢囊菌属株名：RH1序列的特征表示特征的记号：peptide存在位置：389..659决定特征的方法：E起源生物名：大肠杆菌直接的起源pMAL-c2序列的特征表示特征的记号：peptide存在位置：1..387

决定特征的方法：S序列：Met Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys1 5 10 15Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr

20 25 30Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe

35 40 45Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala

50 55 60His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile65 70 75 80Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp

85 90 95Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu

100 105 110Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys

115 120 125Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly

130 135 140Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro145 150 155 160Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys

165 170 175Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly

180 185 190Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp

195 200 205Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala

210 215 220Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys225 230 235 240Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser

245 250 255Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro

260 265 270Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp

275 280 285Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala

290 295 300Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala305 3l0 315 320Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln

325 330 335Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala

340 345 350Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn

355 360 365Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Ile

370 375 380Glu Gly Arg Met Leu Thr Pro Thr Glu Leu Lys Gln Tyr Arg Glu Ala385 390 395 400Gly Tyr Leu Leu Ile Glu Asp Gly Leu Gly Pro Arg Glu Val Asp Cys

405 410 415Leu Arg Arg Ala Ala Ala Ala Leu Tyr Ala Gln Asp Ser Pro Asp Arg

420 425 430Thr Leu Glu Lys Asp Gly Arg Thr Val Arg Ala Val His Gly Cys His

435 440 445Arg Arg Asp Pro Val Cys Arg Asp Leu Val Arg His Pro Arg Leu Leu

450 455 460Gly Pro Ala Met Gln Ile Leu Ser Gly Asp Val Tyr Val His Gln Phe465 470 475 480Lys Ile Asn Ala Lys Ala Pro Met Thr Gly Asp Val Trp Pro Trp His

485 490 495Gln Asp Tyr Ile Phe Trp Ala Arg Glu Asp Gly Met Asp Arg Pro His

500 505 510Val Val Asn Val Ala Val Leu Leu Asp Glu Ala Thr His Leu Asn Gly

515 520 525Pro Leu Leu Phe Val Pro Gly Thr His Glu Leu Gly Leu Ile Asp Val

530 535 540Glu Arg Arg Ala Pro Ala Gly Asp Gly Asp Ala Gln Trp Leu Pro Gln545 550 555 560Leu Ser Ala Asp Leu Asp Tyr Ala Ile Asp Ala Asp Leu Leu Ala Arg

565 570 575Leu Thr Ala Gly Arg Gly Ile Glu Ser Ala Thr Gly Pro Ala Gly Ser

580 585 590Ile Leu Leu Phe Asp Ser Arg Ile Val His Gly Ser Gly Thr Asn Met

595 600 605Ser Pro His Pro Arg Gly Val Val Leu Val Thr Tyr Asn Arg Thr Asp

610 6l5 620Asn Ala Leu Pro Ala Gln Ala Ala Pro Arg Pro Glu Phe Leu Ala Ala625 630 635 640Arg Asp Ala Thr Pro Leu Val Pro Leu Pro Ala Gly Phe Ala Leu Ala

645 650 655Gln Pro Val

Claims

1.编码具有选自序列号1、序列号18和序列号19的氨基酸序列的蛋白质的DNA。

2.具有选自序列号2、序列号8和序列号15的碱基序列的DNA。

3.与权利要求2的DNA在以下条件下进行杂交，而且编码具有L-脯氨酸4-位羟化酶活性的蛋白质的DNA，

(a)与固定有权利要求2记载的DNA的Hybond-N⁺膜，在含有甲酰胺50％v/v、封阻试剂20％、N-月桂基肌氨酸0.1％w/v、SDS 0.02％w/v的750mM的氯化钠、15mM的柠檬酸钠构成的杂交缓冲液中于42℃放置过夜进行杂交；

(b)用含有0.1％SDS的300mM的氯化钠、30mM的柠檬酸钠构成的溶液在室温下洗涤2次，每次5分钟，用含有0.1％SDS的15mM的氯化钠、1.5mM的柠檬酸钠构成的溶液在68℃洗涤2次，每次15分钟。

4.权利要求1～3中任一项的DNA，其中该DNA来自属于指孢囊菌属、拟无核酸菌属或链霉菌属的微生物。

5.权利要求4记载的DNA，其中微生物选自保藏编号为FERM BP-4400的指孢囊菌属RH1、保藏编号为FERM BP-4581的拟无核酸菌属RH2、保藏编号为JCM4250的灰绿链霉菌和保藏编号为JCM4365的达格斯坦链霉菌。

6.一种重组DNA，它通过将含有权利要求1～5中任一项记载的DNA的DNA片段插入载体构建而成。

7.一种含有权利要求6的重组DNA的转化子。

8.根据权利要求7的转化子，它是保藏编号为FERM BP-5025的大肠杆菌SOLR/pRH71。

9.一种产生L-脯氨酸-4-羟化酶的方法，其包括在培养基中培养权利要求7或8的转化子，产生并积累L-脯氨酸-4-羟化酶，从形成的培养物中收集L-脯氨酸-4-羟化酶。

10.根据权利要求9的产生L-脯氨酸-4-羟化酶的方法，其中向培养基中加入L-脯氨酸。

11.一种生产反-4-羟基-L-脯氨酸的方法，其包括在培养基中培养权利要求7或8的转化子，产生并积累反-4-羟基-L-脯氨酸，从形成的培养物中收集反-4-羟基-L-脯氨酸。

12.根据权利要求11的生产反-4-羟基-L-脯氨酸的方法，其中所述转化子具有从培养基中的糖源产生L-脯氨酸并在培养物中积累L-脯氨酸的活性。

13.根据权利要求11的生产反-4-羟基-L-脯氨酸的方法，其中所述转化子具有从培养基中的糖源产生2-氧代戊二酸并在培养物中积累2-氧代戊二酸的活性。

14.根据权利要求11的生产反-4-羟基-L-脯氨酸的方法，其中向培养基中加入L-脯氨酸。

15.根据权利要求11的生产反-4-羟基-L-脯氨酸的方法，其中向培养基中加入L-脯氨酸、2-氧代戊二酸和二价铁离子。

16.一种生产反-4-羟基-L-脯氨酸的方法，其包括在培养液中或在含水培养基中，以权利要求7或8的转化子的培养物、培养的细胞和加工该细胞而制得的产品作为酶源，在2-氧代戊二酸和二价铁离子存在下，将L-脯氨酸转变为反-4-羟基-L-脯氨酸，从培养物或含水培养物中收集生成的反-4-羟基-L-脯氨酸。

17.根据权利要求16的生产反-4-羟基-L-脯氨酸的方法，其中所述转化子具有从培养基中的糖源产生L-脯氨酸并在培养物中积累L-脯氨酸的活性。

18.根据权利要求16的生产反-4-羟基-L-脯氨酸的方法，其中所述转化子具有从培养基中的糖源产生2-氧代戊二酸并在培养物中积累2-氧代戊二酸的活性。

19.根据权利要求16的生产反-4-羟基-L-脯氨酸的方法，其中加工该细胞而制得的产品选自干燥细胞、冷冻干燥细胞、表面活性剂处理的细胞、酶处理的细胞、超声处理的细胞、机械研磨的细胞、溶剂处理的细胞、分级分离处理的细胞、固定化细胞、固定化细胞产物、从细胞提取的具有L-脯氨酸-4-羟化酶的活性的酶、该酶的纯化产物和固定化酶。