JP3440100B2 - トランス−４−ヒドロキシ−ｌ−プロリン - Google Patents
トランス−４−ヒドロキシ−ｌ−プロリンInfo
- Publication number
- JP3440100B2 JP3440100B2 JP52677096A JP52677096A JP3440100B2 JP 3440100 B2 JP3440100 B2 JP 3440100B2 JP 52677096 A JP52677096 A JP 52677096A JP 52677096 A JP52677096 A JP 52677096A JP 3440100 B2 JP3440100 B2 JP 3440100B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- proline
- dna
- seq
- hydroxy
- trans
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
- C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/24—Proline; Hydroxyproline; Histidine
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Botany (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pyrrole Compounds (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、医薬品の合成原料または食品添加物として
有用なトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを工業
的に製造する方法、該方法に有用なＬ−プロリン４位水
酸化酵素活性を有する蛋白質をコードする遺伝子（以
下、Ｌ−プロリン４位水酸化遺伝子と略記する）、該遺
伝子を含有する形質転換体、および該形質転換体を用い
たＬ−プロリン４位水酸化酵素の製造法に関する。
有用なトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを工業
的に製造する方法、該方法に有用なＬ−プロリン４位水
酸化酵素活性を有する蛋白質をコードする遺伝子（以
下、Ｌ−プロリン４位水酸化遺伝子と略記する）、該遺
伝子を含有する形質転換体、および該形質転換体を用い
たＬ−プロリン４位水酸化酵素の製造法に関する。
背景技術
微生物を用いトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリ
ンを製造する方法としては、 １）エッシェリヒア属に属する微生物を用い、４−ヒド
ロキシ−２−オキソグルタル酸からトランス−４−ヒド
ロキシ−Ｌ−プロリンを製造する方法（特開平３−2669
95） ２）細菌やかび類を用い直接発酵生産する方法（Europe
an Patent Application EP 0 547 898 A2、特開平５−2
36980、特開平６−245782） ３）ストレプトミセス属に属する微生物を用い、Ｌ−プ
ロリンから製造する方法〔ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、254巻、6684
〜6690ページ（1979年）、バイオケミカル・アンド・バ
イオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション（Bioc
hem.Biophys.Res.Comm.）、120巻,45〜51ページ（1984
年）、テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Letter
s）,34巻,7489〜7492ページ（1993年）、テトラヘドロ
ン・レターズ（Tetrahedron Letters）、35巻,4649〜46
52ページ（1994年）〕が知られている。
ンを製造する方法としては、 １）エッシェリヒア属に属する微生物を用い、４−ヒド
ロキシ−２−オキソグルタル酸からトランス−４−ヒド
ロキシ−Ｌ−プロリンを製造する方法（特開平３−2669
95） ２）細菌やかび類を用い直接発酵生産する方法（Europe
an Patent Application EP 0 547 898 A2、特開平５−2
36980、特開平６−245782） ３）ストレプトミセス属に属する微生物を用い、Ｌ−プ
ロリンから製造する方法〔ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、254巻、6684
〜6690ページ（1979年）、バイオケミカル・アンド・バ
イオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション（Bioc
hem.Biophys.Res.Comm.）、120巻,45〜51ページ（1984
年）、テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Letter
s）,34巻,7489〜7492ページ（1993年）、テトラヘドロ
ン・レターズ（Tetrahedron Letters）、35巻,4649〜46
52ページ（1994年）〕が知られている。
従来のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製
造方法は、１）４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸
等のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを製造す
るための基質が高価で入手困難である、２）トランス−
４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生産性が低い、３）ト
ランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造に関与す
る酵素の活性が極めて微弱である、等の理由から、工業
化は困難である。
造方法は、１）４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸
等のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを製造す
るための基質が高価で入手困難である、２）トランス−
４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生産性が低い、３）ト
ランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造に関与す
る酵素の活性が極めて微弱である、等の理由から、工業
化は困難である。
トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造に関
与する酵素については、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素を
前述のストレプトマイセス属に属する微生物より精製し
たとの報告があるが、該酵素の取得方法および該酵素の
理化学的性質は開示されていない。さらに、２−ケトグ
ルタル酸および２価鉄イオンの存在下において、遊離の
Ｌ−プロリンをトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリ
ンに変換させる活性を有する、Ｌ−プロリン４位水酸化
酵素をコードする遺伝子をクローニングしたという報告
はない。
与する酵素については、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素を
前述のストレプトマイセス属に属する微生物より精製し
たとの報告があるが、該酵素の取得方法および該酵素の
理化学的性質は開示されていない。さらに、２−ケトグ
ルタル酸および２価鉄イオンの存在下において、遊離の
Ｌ−プロリンをトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリ
ンに変換させる活性を有する、Ｌ−プロリン４位水酸化
酵素をコードする遺伝子をクローニングしたという報告
はない。
活性の高いＬ−プロリン４位水酸化酵素を用い、工業
的に有利にトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを
製造する方法が求められている。
的に有利にトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを
製造する方法が求められている。
本発明の目的は、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素を用い
て、安価で入手が容易なＬ−プロリンから効率的にトラ
ンス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを製造する方法に
おいて、より工業的に有利にトランス−４−ヒドロキシ
−Ｌ−プロリンを製造するために、Ｌ−プロリン４位水
酸化酵素遺伝子および該遺伝子を含有する形質転換体を
提供し、該遺伝子および該形質転換体を用いてＬ−プロ
リン４位水酸化酵素を大量に生産させ、該形質転換体ま
たは該酵素を用いてトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プ
ロリンを工業的に安価に製造する方法を提供することに
ある。
て、安価で入手が容易なＬ−プロリンから効率的にトラ
ンス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを製造する方法に
おいて、より工業的に有利にトランス−４−ヒドロキシ
−Ｌ−プロリンを製造するために、Ｌ−プロリン４位水
酸化酵素遺伝子および該遺伝子を含有する形質転換体を
提供し、該遺伝子および該形質転換体を用いてＬ−プロ
リン４位水酸化酵素を大量に生産させ、該形質転換体ま
たは該酵素を用いてトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プ
ロリンを工業的に安価に製造する方法を提供することに
ある。
発明の開示
本発明は、微生物由来の新規なＬ−プロリン４位水酸
化酵素遺伝子、該遺伝子を含有する組換え体DNA、該組
換え体DNAを含有する形質転換体、該形質転換体を用い
たＬ−プロリン４位水酸化酵素の製造法、該酵素および
該形質転換体または該酵素を用いたトランス−４−ヒド
ロキシ−Ｌ−プロリンの製造法に関する。
化酵素遺伝子、該遺伝子を含有する組換え体DNA、該組
換え体DNAを含有する形質転換体、該形質転換体を用い
たＬ−プロリン４位水酸化酵素の製造法、該酵素および
該形質転換体または該酵素を用いたトランス−４−ヒド
ロキシ−Ｌ−プロリンの製造法に関する。
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明にかかわるＬ−プロリン４位水酸化酵素は、２
−ケトグルタル酸および２価鉄イオンの存在下におい
て、遊離のＬ−プロリンを水酸化してトランス−４−ヒ
ドロキシ−Ｌ−プロリンを生成する酵素である。
−ケトグルタル酸および２価鉄イオンの存在下におい
て、遊離のＬ−プロリンを水酸化してトランス−４−ヒ
ドロキシ−Ｌ−プロリンを生成する酵素である。
Ｌ−プロリン４位水酸化酵素活性を有する蛋白質とし
ては、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素活性を有する蛋白質
であればいずれでもよく、例えば配列番号１に示したア
ミノ酸配列を有する蛋白質、該蛋白質あるいは該蛋白質
の部分アミノ酸配列を有する蛋白質と大腸菌由来のβガ
ラクトシダーゼ蛋白質の部分アミノ酸配列を有するペプ
チドとが結合したアミノ酸配列を有する融合蛋白質、お
よび配列番号１に示したアミノ酸配列を有する蛋白質あ
るいは該蛋白質の部分アミノ酸配列を有する蛋白質と大
腸菌由来のマルトース結合蛋白質の部分アミノ酸配列を
有するペプチドとが結合したアミノ酸配列を有する融合
蛋白質等をあげることができる。融合蛋白質の具体的な
例としては、配列番号18または19に示したアミノ酸配列
を有する蛋白質等をあげることができる。
ては、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素活性を有する蛋白質
であればいずれでもよく、例えば配列番号１に示したア
ミノ酸配列を有する蛋白質、該蛋白質あるいは該蛋白質
の部分アミノ酸配列を有する蛋白質と大腸菌由来のβガ
ラクトシダーゼ蛋白質の部分アミノ酸配列を有するペプ
チドとが結合したアミノ酸配列を有する融合蛋白質、お
よび配列番号１に示したアミノ酸配列を有する蛋白質あ
るいは該蛋白質の部分アミノ酸配列を有する蛋白質と大
腸菌由来のマルトース結合蛋白質の部分アミノ酸配列を
有するペプチドとが結合したアミノ酸配列を有する融合
蛋白質等をあげることができる。融合蛋白質の具体的な
例としては、配列番号18または19に示したアミノ酸配列
を有する蛋白質等をあげることができる。
さらに、配列番号１、18または19で表されるアミノ酸
配列とは一個以上のアミノ酸が置換、欠失または付加し
たアミノ酸配列を有し、かつプロリン４位水酸化酵素活
性を有する蛋白質をあげることができる。ここで、アミ
ノ酸の置換、欠失または付加は、ヌクレイック・アシッ
ド・リサーチ（Nucleic Acid Research）,10巻,6487〜6
500ページ（1982年）、プロシーディングス・オブ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.
Acad.Sci.,USA）,79巻,6409〜6413ページ（1982年）、
プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.,USA）,81巻,5
662〜5666ページ（1984年）、サイエンス（Science）,2
24巻,1431〜1433ページ（1984年）、PCT WO 85/00817
（1985年）、ネイチャー（Nature）,316巻,601〜605ペ
ージ（1985年）、ジーン（Gene）,34巻,315〜323ページ
（1985年）、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucl
eic Acids Research）,13巻,4431〜4442ページ（1985
年）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー
・バイオロジー（Current Protocols in Molecular Bio
logy）,8章Mutagenesis of Cloned DNA,John Wiley ＆
Sons,Inc.（1989年）等に記載の方法に準じて実施する
ことができる。
配列とは一個以上のアミノ酸が置換、欠失または付加し
たアミノ酸配列を有し、かつプロリン４位水酸化酵素活
性を有する蛋白質をあげることができる。ここで、アミ
ノ酸の置換、欠失または付加は、ヌクレイック・アシッ
ド・リサーチ（Nucleic Acid Research）,10巻,6487〜6
500ページ（1982年）、プロシーディングス・オブ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.
Acad.Sci.,USA）,79巻,6409〜6413ページ（1982年）、
プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.,USA）,81巻,5
662〜5666ページ（1984年）、サイエンス（Science）,2
24巻,1431〜1433ページ（1984年）、PCT WO 85/00817
（1985年）、ネイチャー（Nature）,316巻,601〜605ペ
ージ（1985年）、ジーン（Gene）,34巻,315〜323ページ
（1985年）、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucl
eic Acids Research）,13巻,4431〜4442ページ（1985
年）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー
・バイオロジー（Current Protocols in Molecular Bio
logy）,8章Mutagenesis of Cloned DNA,John Wiley ＆
Sons,Inc.（1989年）等に記載の方法に準じて実施する
ことができる。
本発明にかかわるＬ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子
としては、Ｌ−プロリン４位水酸化活性を有する蛋白質
をコードする遺伝子を含むDNA断片であればいずれでも
よく、例えば、配列番号１、18または19で表されるアミ
ノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子、あるい
は、配列番号１、18または19で表されるアミノ酸配列と
は一個以上のアミノ酸が置換、欠失または付加したアミ
ノ酸配列を有し、かつプロリン４位水酸化酵素活性を有
する蛋白質をコードする遺伝子をあげることができる。
具体的には配列番号２、８および15で示されるDNA等を
あげることができる。
としては、Ｌ−プロリン４位水酸化活性を有する蛋白質
をコードする遺伝子を含むDNA断片であればいずれでも
よく、例えば、配列番号１、18または19で表されるアミ
ノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子、あるい
は、配列番号１、18または19で表されるアミノ酸配列と
は一個以上のアミノ酸が置換、欠失または付加したアミ
ノ酸配列を有し、かつプロリン４位水酸化酵素活性を有
する蛋白質をコードする遺伝子をあげることができる。
具体的には配列番号２、８および15で示されるDNA等を
あげることができる。
更に、本発明にかかわるＬ−プロリン４位水酸化酵素
遺伝子として、上記で定義されるDNAに対して、Ｌ−プ
ロリン４位水酸化酵素活性を失わない範囲内で置換変
異、欠失変異、挿入変異などの変異が導入されたDNA、
例えば、配列番号２、８または15と相同性を有するDNA
などをあげることができる。この相同性を有するDNAと
は、配列番号２、８または15に示した塩基配列を含むDN
Aをプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション
法またはプラークハイブリダイゼーション法を用いるこ
とにより得られるDNAを意味する。これらの操作は、公
知のin vitro組換え技法〔モレキュラー・クローニン
グ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Clonin
g,A laboratory manual）、第２版〔サンブルック（Sam
brook）、フリッチ（Fritsch）、マニアチス（Maniati
s）編集、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラト
リー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s）、1989年刊〕に準じて行うことができる。
遺伝子として、上記で定義されるDNAに対して、Ｌ−プ
ロリン４位水酸化酵素活性を失わない範囲内で置換変
異、欠失変異、挿入変異などの変異が導入されたDNA、
例えば、配列番号２、８または15と相同性を有するDNA
などをあげることができる。この相同性を有するDNAと
は、配列番号２、８または15に示した塩基配列を含むDN
Aをプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション
法またはプラークハイブリダイゼーション法を用いるこ
とにより得られるDNAを意味する。これらの操作は、公
知のin vitro組換え技法〔モレキュラー・クローニン
グ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Clonin
g,A laboratory manual）、第２版〔サンブルック（Sam
brook）、フリッチ（Fritsch）、マニアチス（Maniati
s）編集、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラト
リー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s）、1989年刊〕に準じて行うことができる。
該Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含むDNA断片
は、Ｌ−プロリンを水酸化してトランス−４−ヒドロキ
シ−Ｌ−プロリンを生成する能力を有する微生物より取
得することができる。このような微生物としては、Ｌ−
プロリンを水酸化してトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−
プロリンを生成する能力を有する微生物であればいずれ
でもよいが、好ましくは、ダクチロスポランジウム属、
アミコラトプシス属またはストレプトミセス属に属し、
かつ、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素活性を有する微生物
をあげることができる。さらに好ましくは、ダクチロス
ポランジウム・エスピー（Dactylosporangium sp.）、R
H1（FERM BP−4400）、アミコラトプシス・エスピー
（Amycolatopsis sp.）RH2（FERM BP−4581）、ストレ
プトミセス・グリゼオビリディス（Streptomyces grise
oviridis）JCM4250、ストレプトミセス・ダジェスタニ
クス（Streptomyces daghestanicus）JCM4365あるい
は、これらの菌株の突然変異株もしくは誘導体をあげる
ことができる。
は、Ｌ−プロリンを水酸化してトランス−４−ヒドロキ
シ−Ｌ−プロリンを生成する能力を有する微生物より取
得することができる。このような微生物としては、Ｌ−
プロリンを水酸化してトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−
プロリンを生成する能力を有する微生物であればいずれ
でもよいが、好ましくは、ダクチロスポランジウム属、
アミコラトプシス属またはストレプトミセス属に属し、
かつ、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素活性を有する微生物
をあげることができる。さらに好ましくは、ダクチロス
ポランジウム・エスピー（Dactylosporangium sp.）、R
H1（FERM BP−4400）、アミコラトプシス・エスピー
（Amycolatopsis sp.）RH2（FERM BP−4581）、ストレ
プトミセス・グリゼオビリディス（Streptomyces grise
oviridis）JCM4250、ストレプトミセス・ダジェスタニ
クス（Streptomyces daghestanicus）JCM4365あるい
は、これらの菌株の突然変異株もしくは誘導体をあげる
ことができる。
ダクチロスポランジウム・エスピーRH1およびアミコ
ラトプシス・エスピーRH2は、本発明者らがＬ−プロリ
ン４位水酸化酵素を生成する能力を有する微生物として
分離した微生物であり、ダクチロスポランジウム・エス
ピーRH1はFERM BP−4400として平成５年９月１日付け
で、アミコラトプシス・エスピーRH2はFERM BP−4581
として平成６年２月24日付けで、ブダペスト条約に基づ
いて、工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城
県つくば市東１丁目１番３号）にそれぞれ寄託されてい
る。また、ストレプトミセス・グリセオビリディス JC
M 4250およびストレプトミセス・ダジェスタニクス JC
M 4365は、本発明者らがプロリン４位水酸化酵素を生成
する能力を有することを新たに見いだした微生物であ
る。
ラトプシス・エスピーRH2は、本発明者らがＬ−プロリ
ン４位水酸化酵素を生成する能力を有する微生物として
分離した微生物であり、ダクチロスポランジウム・エス
ピーRH1はFERM BP−4400として平成５年９月１日付け
で、アミコラトプシス・エスピーRH2はFERM BP−4581
として平成６年２月24日付けで、ブダペスト条約に基づ
いて、工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城
県つくば市東１丁目１番３号）にそれぞれ寄託されてい
る。また、ストレプトミセス・グリセオビリディス JC
M 4250およびストレプトミセス・ダジェスタニクス JC
M 4365は、本発明者らがプロリン４位水酸化酵素を生成
する能力を有することを新たに見いだした微生物であ
る。
以下にＬ−プロリン４位水酸化酵素を生成する能力を
有する微生物由来のプロリン４位水酸化酵素遺伝子の取
得方法について示す。
有する微生物由来のプロリン４位水酸化酵素遺伝子の取
得方法について示す。
Ｌ−プロリン４位水酸化酵素を生成する能力を有する
微生物から、通常のDNA単離法、例えばフェノール法
〔バイオキミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（Biochi
m.Biophys.Acta）72巻、619〜629ページ〕により、該微
生物の染色体DNAを調製する。得られた染色体DNAを適当
な制限酵素により切断し該制限酵素切断断片をベクター
DNAに組込むことにより、該微生物染色体の染色体DNAラ
イブラリーを構築する。この染色体DNAライブラリーを
用いて宿主微生物を形質転換する。得られた形質転換体
からハイブリダイゼーション法により、Ｌ−プロリン４
位水酸化酵素遺伝子を含む形質転換体の選択を行う。選
択された該形質転換体より目的とする遺伝子を含むDNA
を得ることができる。
微生物から、通常のDNA単離法、例えばフェノール法
〔バイオキミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（Biochi
m.Biophys.Acta）72巻、619〜629ページ〕により、該微
生物の染色体DNAを調製する。得られた染色体DNAを適当
な制限酵素により切断し該制限酵素切断断片をベクター
DNAに組込むことにより、該微生物染色体の染色体DNAラ
イブラリーを構築する。この染色体DNAライブラリーを
用いて宿主微生物を形質転換する。得られた形質転換体
からハイブリダイゼーション法により、Ｌ−プロリン４
位水酸化酵素遺伝子を含む形質転換体の選択を行う。選
択された該形質転換体より目的とする遺伝子を含むDNA
を得ることができる。
この一連の操作は、公知のin vitro組換え技法〔モレ
キュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュア
ル（Molecular Cloning,A laboratory manual）、第２
版、サンブルック（Sambrook）、フリッチ（Fritsc
h）、マニアティス（Maniatis）編集、コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press）、1989年刊〕に準じて行
うことができる。
キュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュア
ル（Molecular Cloning,A laboratory manual）、第２
版、サンブルック（Sambrook）、フリッチ（Fritsc
h）、マニアティス（Maniatis）編集、コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press）、1989年刊〕に準じて行
うことができる。
Ｌ−プロリン４位水酸化酵素を生成する能力を有する
微生物の染色体DNAライブラリーを構築するベクターDNA
としては、大腸菌K12株中で自律複製できるものであれ
ば、ファージベクター、プラスミッドベクターなどいず
れでも使用できる。好適な例としては、λZAP II、pUC1
8、pBluescript（STRATAGENE社より市販）などをあげる
ことができる。
微生物の染色体DNAライブラリーを構築するベクターDNA
としては、大腸菌K12株中で自律複製できるものであれ
ば、ファージベクター、プラスミッドベクターなどいず
れでも使用できる。好適な例としては、λZAP II、pUC1
8、pBluescript（STRATAGENE社より市販）などをあげる
ことができる。
宿主微生物としては、エッシェリヒア属に属する微生
物であればいずれでも使用することができる。好適に
は、エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）XL1−B
lue、Escherichia coli XL2−Blue、Escherichia coli
DH1、Escherichia coli MC1000等があげられる。
物であればいずれでも使用することができる。好適に
は、エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）XL1−B
lue、Escherichia coli XL2−Blue、Escherichia coli
DH1、Escherichia coli MC1000等があげられる。
Ｌ−プロリン４位水酸化酵素中のアミノ酸配列の情報
を基に、DNAプライマーを作製し、このDNAプライマーを
用い、ポリメラーゼチェイン反応（以下、PCRと略記す
る）を行い、得られたDNA断片を用い、ハイブリダイゼ
ーション法により、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子
を含む形質転換体を選択できる。
を基に、DNAプライマーを作製し、このDNAプライマーを
用い、ポリメラーゼチェイン反応（以下、PCRと略記す
る）を行い、得られたDNA断片を用い、ハイブリダイゼ
ーション法により、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子
を含む形質転換体を選択できる。
Ｌ−プロリン４位水酸化酵素のアミノ酸配列の情報
は、通常用いられるアミノ酸配列分析装置、例えば島津
製作所社製Protein sequencer model PPSQ−10等、を用
い、精製されたＬ−プロリン４位水酸化酵素を分析する
ことにより、得ることができる。このようにして得られ
たアミノ酸配列情報としては、例えば、配列番号１に示
したアミノ酸配列中の部分アミノ酸配列をあげることが
でき、例えば、配列番号１に示したアミノ酸配列のＮ末
端から24番目までのアミノ酸配列を有する部分アミノ酸
配列等をあげることができる。
は、通常用いられるアミノ酸配列分析装置、例えば島津
製作所社製Protein sequencer model PPSQ−10等、を用
い、精製されたＬ−プロリン４位水酸化酵素を分析する
ことにより、得ることができる。このようにして得られ
たアミノ酸配列情報としては、例えば、配列番号１に示
したアミノ酸配列中の部分アミノ酸配列をあげることが
でき、例えば、配列番号１に示したアミノ酸配列のＮ末
端から24番目までのアミノ酸配列を有する部分アミノ酸
配列等をあげることができる。
DNAプライマーの合成は、通常用いられるDNA合成機、
例えばアプライド・バイオシステムズ（Applied Biosys
tems）社製380A・DNA合成機等、を用い行うことができ
る。
例えばアプライド・バイオシステムズ（Applied Biosys
tems）社製380A・DNA合成機等、を用い行うことができ
る。
ハイブリダイゼーション法に使用するプローブとして
は、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子の部分断片を用
いることができる。Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子
の部分断片は、PCR法を利用して得ることができる。具
体的には、配列番号３（配列番号１に記載のアミノ酸配
列の１〜６番目のアミノ酸をコードするセンス鎖DNAに
対応する）に示したDNAと、配列番号４（配列番号１に
記載のアミノ酸配列の19〜24番目のアミノ酸をコードす
るアンチセンス鎖DNAに対応する）に示したDNAを化学合
成し、これらをDNAプライマーとして用いてPCRを行い、
得られた配列番号５に示した71bpのDNA断片等をプロー
ブとしてあげることができる。
は、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子の部分断片を用
いることができる。Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子
の部分断片は、PCR法を利用して得ることができる。具
体的には、配列番号３（配列番号１に記載のアミノ酸配
列の１〜６番目のアミノ酸をコードするセンス鎖DNAに
対応する）に示したDNAと、配列番号４（配列番号１に
記載のアミノ酸配列の19〜24番目のアミノ酸をコードす
るアンチセンス鎖DNAに対応する）に示したDNAを化学合
成し、これらをDNAプライマーとして用いてPCRを行い、
得られた配列番号５に示した71bpのDNA断片等をプロー
ブとしてあげることができる。
ハイブリダイゼーション法により選択された形質転換
体より得られた、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を
含むDNAを、適当な制限酵素、例えばXho Iなどで切断
後、pBluescript KS（＋）（STRATAGEN社より市販）等
のプラスミッドにクローニングし、通常用いられる塩基
配列分析方法、例えばサンガー（Sanger）らのジデオキ
シ法〔プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.,USA）,
74巻,5463ページ,1977年〕等によって、該遺伝子の塩基
配列を決定することができる。塩基配列の分析は、塩基
配列自動分析装置、例えばアプライド・バイオシステム
ズ（Applied Biosystems）社製373A・DNAシークエンサ
ー（Sequencer）等を用いて行うことができる。このよ
うにして決定されたＬ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子
の塩基配列として、例えば、配列番号２および８で示さ
れた塩基配列をあげることができる。
体より得られた、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を
含むDNAを、適当な制限酵素、例えばXho Iなどで切断
後、pBluescript KS（＋）（STRATAGEN社より市販）等
のプラスミッドにクローニングし、通常用いられる塩基
配列分析方法、例えばサンガー（Sanger）らのジデオキ
シ法〔プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.,USA）,
74巻,5463ページ,1977年〕等によって、該遺伝子の塩基
配列を決定することができる。塩基配列の分析は、塩基
配列自動分析装置、例えばアプライド・バイオシステム
ズ（Applied Biosystems）社製373A・DNAシークエンサ
ー（Sequencer）等を用いて行うことができる。このよ
うにして決定されたＬ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子
の塩基配列として、例えば、配列番号２および８で示さ
れた塩基配列をあげることができる。
本発明のＬ−プロリン４位水酸化酵素をコードするDN
Aを含むプラスミッドとしては、例えばpRH71があげられ
る。pRH71を含む大腸菌であるEscherichia coli SOLR/p
RH71は、平成７年３月２日付けで工業技術院生命工学工
業技術研究所、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号
（郵便番号305）にFERM BP−5025として寄託されてい
る。
Aを含むプラスミッドとしては、例えばpRH71があげられ
る。pRH71を含む大腸菌であるEscherichia coli SOLR/p
RH71は、平成７年３月２日付けで工業技術院生命工学工
業技術研究所、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号
（郵便番号305）にFERM BP−5025として寄託されてい
る。
上記のようにして得られるＬ−プロリン４位水酸化酵
素遺伝子を宿主中で発現させるためには、まず、Ｌ−プ
ロリン４位水酸化酵素遺伝子を含むDNA断片を、制限酵
素類あるいはDNA分解酵素類で、Ｌ−プロリン４位水酸
化酵素遺伝子を含む適当な長さのDNA断片とした後に、
発現ベクター中プロモーターの下流に挿入し、次いで上
記DNAを挿入した発現ベクターを、発現ベクターに適合
した宿主中に導入する。宿主としては、目的とする遺伝
子を発現できるものは全て用いることができる。例え
ば、エッシェリヒア属、セラチア属、コリネバクテリウ
ム属、ブレビバクテリウム属、シュードモナス属、バチ
ルス属、等に属する微生物菌株の他、酵母菌株や動物細
胞宿主等をあげることができる。
素遺伝子を宿主中で発現させるためには、まず、Ｌ−プ
ロリン４位水酸化酵素遺伝子を含むDNA断片を、制限酵
素類あるいはDNA分解酵素類で、Ｌ−プロリン４位水酸
化酵素遺伝子を含む適当な長さのDNA断片とした後に、
発現ベクター中プロモーターの下流に挿入し、次いで上
記DNAを挿入した発現ベクターを、発現ベクターに適合
した宿主中に導入する。宿主としては、目的とする遺伝
子を発現できるものは全て用いることができる。例え
ば、エッシェリヒア属、セラチア属、コリネバクテリウ
ム属、ブレビバクテリウム属、シュードモナス属、バチ
ルス属、等に属する微生物菌株の他、酵母菌株や動物細
胞宿主等をあげることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主において自律複製可
能ないしは染色体中への組込みが可能で、Ｌ−プロリン
４位水酸化酵素遺伝子を転写できる位置にプロモーター
を含有しているものが用いられる。
能ないしは染色体中への組込みが可能で、Ｌ−プロリン
４位水酸化酵素遺伝子を転写できる位置にプロモーター
を含有しているものが用いられる。
大腸菌等の微生物を宿主として用いる場合は、Ｌ−プ
ロリン４位水酸化酵素発現ベクターは微生物中で自律複
製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合
配列、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子、転写終結配
列、より構成されていることが好ましい。プロモーター
を制御する遺伝子が含まれていてもよい。
ロリン４位水酸化酵素発現ベクターは微生物中で自律複
製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合
配列、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子、転写終結配
列、より構成されていることが好ましい。プロモーター
を制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、pBTrp2、pBTac1、pB
Tac2（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、
pKYP10（特開昭58−110600）、pKYP200〔アグリカルチ
ャラル・バイオロジカル・ケミストリー（Agric.Biol.C
hem.）,48巻,669〜675ページ（1984年）〕、pLSA1〔ア
グリカルチャラル・バイオロジカル・ケミストリー（Ag
ric.Biol.Chem.）,53巻,277ページ（1989年）〕、pGEL1
〔プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.,USA）,82
巻,4306ページ（1985年）〕、pBluescript（STRATAGENE
社）、pTrs30〔エシェリヒア・コリJM109/pTrS30（FERM
BP−5407）より調製〕およびpTrs32〔エシェリヒア・
コリJM109/pTrS32（FERM BP−5408）より調製〕等を例
示することができる。
Tac2（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、
pKYP10（特開昭58−110600）、pKYP200〔アグリカルチ
ャラル・バイオロジカル・ケミストリー（Agric.Biol.C
hem.）,48巻,669〜675ページ（1984年）〕、pLSA1〔ア
グリカルチャラル・バイオロジカル・ケミストリー（Ag
ric.Biol.Chem.）,53巻,277ページ（1989年）〕、pGEL1
〔プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.,USA）,82
巻,4306ページ（1985年）〕、pBluescript（STRATAGENE
社）、pTrs30〔エシェリヒア・コリJM109/pTrS30（FERM
BP−5407）より調製〕およびpTrs32〔エシェリヒア・
コリJM109/pTrS32（FERM BP−5408）より調製〕等を例
示することができる。
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現でき
るものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプ
ロモーター（Ptrp）、lacプロモーター（Plac）、PLプ
ロモーター、PRプロモーターなどの、大腸菌やファージ
等に由来するプロモーターをあげることができる。また
Ptrpを２つ直列させたプロモーター（Ptrp x 2）、tac
プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモー
ター等も用いることができる。
るものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプ
ロモーター（Ptrp）、lacプロモーター（Plac）、PLプ
ロモーター、PRプロモーターなどの、大腸菌やファージ
等に由来するプロモーターをあげることができる。また
Ptrpを２つ直列させたプロモーター（Ptrp x 2）、tac
プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモー
ター等も用いることができる。
リボソーム結合配列としては、大腸菌等の宿主中で発
現できるものであればいかなるものでもよいが、リボソ
ーム結合配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば
６〜18塩基）に調節したプラスミッドを用いることが好
ましい。
現できるものであればいかなるものでもよいが、リボソ
ーム結合配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば
６〜18塩基）に調節したプラスミッドを用いることが好
ましい。
Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子はＬ−プロリン４
位水酸化酵素をコードする遺伝子であればいずれも用い
ることができるが、該遺伝子のDNA配列を宿主微生物で
の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換して用
いることが好ましい。大腸菌を宿主として、発現に最適
なコドンとなるように塩基を置換したＬ−プロリン４位
水酸化酵素遺伝子の具体例として、配列番号15で示され
る塩基配列等をあげることができる。
位水酸化酵素をコードする遺伝子であればいずれも用い
ることができるが、該遺伝子のDNA配列を宿主微生物で
の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換して用
いることが好ましい。大腸菌を宿主として、発現に最適
なコドンとなるように塩基を置換したＬ−プロリン４位
水酸化酵素遺伝子の具体例として、配列番号15で示され
る塩基配列等をあげることができる。
本遺伝子の発現には転写終結配列は必ずしも必要では
ないが、好適には構造遺伝子直下に転写終結配列を配置
することが望ましい。
ないが、好適には構造遺伝子直下に転写終結配列を配置
することが望ましい。
宿主としては、Escherichia coli XL1−Blue、Escher
ichia coli XL2−Blue、Escherichia coli DH1、Escher
ichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escher
ichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escheric
hia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichi
a coli W3110、Escherichia coli NY49、Bacillus subt
ilis、Bacillus amyloliquefacines、Brevibacterium i
mmariophilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyt
icum ATCC14066、Brevibacterium flavum ATCC14067、B
revibacterium lactofermentum ATCC13869、Corynebact
erium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium acetoa
cidophilum ATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum
ATCC15354等をあげることができる。
ichia coli XL2−Blue、Escherichia coli DH1、Escher
ichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escher
ichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escheric
hia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichi
a coli W3110、Escherichia coli NY49、Bacillus subt
ilis、Bacillus amyloliquefacines、Brevibacterium i
mmariophilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyt
icum ATCC14066、Brevibacterium flavum ATCC14067、B
revibacterium lactofermentum ATCC13869、Corynebact
erium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium acetoa
cidophilum ATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum
ATCC15354等をあげることができる。
酵母菌株を宿主として用いる場合には、発現ベクター
として、例えば、YEp13（ATCC37115）、YEp24（ATCC370
51）、YCp50（ATCC37419）等を例示することができる。
として、例えば、YEp13（ATCC37115）、YEp24（ATCC370
51）、YCp50（ATCC37419）等を例示することができる。
プロモーターとしては、酵母菌株の宿主中で発現でき
るものであればいかなるものでもよい。例えば、ヘキソ
ースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、gal
1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショック
蛋白質プロモーター、MFα１プロモーター、CUP 1プロ
モーター等のプロモーターをあげることができる。
るものであればいかなるものでもよい。例えば、ヘキソ
ースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、gal
1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショック
蛋白質プロモーター、MFα１プロモーター、CUP 1プロ
モーター等のプロモーターをあげることができる。
宿主としては、Saccharomyces cerevisae、Schizosac
charomyces pombe、Kluyveromyces lactis、Trichospor
on pullulans、Schwanniomyces alluvius等をあげるこ
とができる。
charomyces pombe、Kluyveromyces lactis、Trichospor
on pullulans、Schwanniomyces alluvius等をあげるこ
とができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクター
として、例えば、pcDNA I/Amp、pcDNA I、pcDM8（いず
れもフナコシ社より市販）等を例示することができる。
プロモーターとしては、動物細胞の宿主中で発現できる
ものであればいかなるものでもよい。例えば、ヒトCMV
のIE（immediate early）遺伝子のプロモーター等のプ
ロモーターをあげることができる。また、ヒトCMVのIE
遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよ
い。宿主としては、ナマルバ細胞、HBT5637（特開昭63
−299）、COS細胞、CHO細胞等をあげることができる。
として、例えば、pcDNA I/Amp、pcDNA I、pcDM8（いず
れもフナコシ社より市販）等を例示することができる。
プロモーターとしては、動物細胞の宿主中で発現できる
ものであればいかなるものでもよい。例えば、ヒトCMV
のIE（immediate early）遺伝子のプロモーター等のプ
ロモーターをあげることができる。また、ヒトCMVのIE
遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよ
い。宿主としては、ナマルバ細胞、HBT5637（特開昭63
−299）、COS細胞、CHO細胞等をあげることができる。
動物細胞へのDNAの導入法としては、動物細胞にDNAを
導入することができればいかなる方法も用いることがで
きる。例えば、エレクトロポーレーション法〔Miyaji
ら：サイトテクノロジー（Cytotechnology），３,133
（1990）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−22707
5）、リポフェクション法〔フィリップ・エル・フェル
グナー（Philip L.Felgner）ら：プロシーディング・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（Proc.Natl.Acad.Sci.,USA），84,7413（1987）〕等を
用いることができる。形質転換株の取得および培養は、
特開平２−227075あるいは特開平２−257891に記載され
ている方法に準じて行なうことができる。
導入することができればいかなる方法も用いることがで
きる。例えば、エレクトロポーレーション法〔Miyaji
ら：サイトテクノロジー（Cytotechnology），３,133
（1990）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−22707
5）、リポフェクション法〔フィリップ・エル・フェル
グナー（Philip L.Felgner）ら：プロシーディング・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（Proc.Natl.Acad.Sci.,USA），84,7413（1987）〕等を
用いることができる。形質転換株の取得および培養は、
特開平２−227075あるいは特開平２−257891に記載され
ている方法に準じて行なうことができる。
上記のようにして得られた形質転換体の培養は、通常
の培養方法に従って行われる。
の培養方法に従って行われる。
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として用いた形質転
換体を培養する培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒
素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的
に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでも
よい。
換体を培養する培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒
素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的
に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでも
よい。
炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るもの
であればよく、グルコース、フラクトース、スクロー
ス、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン
加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機
酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類が用
いられる。
であればよく、グルコース、フラクトース、スクロー
ス、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン
加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機
酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類が用
いられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫
酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、りん酸アンモニウ
ム、等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他
含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆
粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消
化物等が用いられる。
酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、りん酸アンモニウ
ム、等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他
含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆
粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消
化物等が用いられる。
無機物としては、りん酸第一カリウム、りん酸第二カ
リウム、りん酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化
ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸
カルシウム等が用いられる。
リウム、りん酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化
ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸
カルシウム等が用いられる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気
的条件下で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間
は、通常16〜96時間である。培養中pHは、3.0〜9.0に保
持する。pHの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ
溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて
行う。
的条件下で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間
は、通常16〜96時間である。培養中pHは、3.0〜9.0に保
持する。pHの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ
溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて
行う。
Ｌ−プロリンを５〜1000、好ましくは20〜200mMの濃
度となるように、適時培地に添加することにより、より
効率的にＬ−プロリン４位水酸化酵素の製造を行うこと
ができる。
度となるように、適時培地に添加することにより、より
効率的にＬ−プロリン４位水酸化酵素の製造を行うこと
ができる。
また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイ
クリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
クリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発
現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、
必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。
例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質
転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−
Ｄ−チオガラクトピラノシド（IPTG）等を、trpプロモ
ーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培
養するときにはインドールアクリル酸（IAA）等を培地
に添加してもよい。
現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、
必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。
例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質
転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−
Ｄ−チオガラクトピラノシド（IPTG）等を、trpプロモ
ーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培
養するときにはインドールアクリル酸（IAA）等を培地
に添加してもよい。
動物細胞を宿主として用いた形質転換体を培養する培
地は、一般に使用されているRPMI1640培地、EagleのMEM
培地またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等
が用いられる。
地は、一般に使用されているRPMI1640培地、EagleのMEM
培地またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等
が用いられる。
培養は、５％CO2存在下等の条件下で行う。培養温度
は35〜37℃がよく、培養時間は、通常３〜７日間であ
る。
は35〜37℃がよく、培養時間は、通常３〜７日間であ
る。
Ｌ−プロリンを５〜1000、好ましくは20〜200mMの濃
度となるように、適時培地に添加することにより、より
効率的にＬ−プロリン４位水酸化酵素の製造を行うこと
ができる。
度となるように、適時培地に添加することにより、より
効率的にＬ−プロリン４位水酸化酵素の製造を行うこと
ができる。
また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン
等の抗生物質を培地に添加してもよい。
等の抗生物質を培地に添加してもよい。
このように培養して得た形質転換体中には、遺伝子源
として用いた微生物菌株、例えばダクチロスポランジウ
ム・エスピーRH1等、と比較してＬ−プロリン４位水酸
化酵素が著量生成蓄積しており、酵素の単離精製あるい
は該酵素を用いたＬ−プロリンからのトランス−４−ヒ
ドロキシ−Ｌ−プロリン製造を、遺伝子源として用いた
微生物菌株、例えばダクチロスポランジウム・エスピー
RH1等、を用いた場合と比較して、はるかに効率的に行
うことができる。
として用いた微生物菌株、例えばダクチロスポランジウ
ム・エスピーRH1等、と比較してＬ−プロリン４位水酸
化酵素が著量生成蓄積しており、酵素の単離精製あるい
は該酵素を用いたＬ−プロリンからのトランス−４−ヒ
ドロキシ−Ｌ−プロリン製造を、遺伝子源として用いた
微生物菌株、例えばダクチロスポランジウム・エスピー
RH1等、を用いた場合と比較して、はるかに効率的に行
うことができる。
該形質転換体中にＬ−プロリン４位水酸化酵素が生成
していることは、培養物、菌体または菌体処理物を、酵
素反応に適した水性媒体中に、Ｌ−プロリン、二価鉄イ
オン、２−ケトグルタル酸とともに加え、また必要に応
じて界面活性剤や有機溶剤を添加することにより、生成
するトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを検出す
ることにより知ることができる。生成されたＬ−プロリ
ン４位水酸化酵素の活性は、下記測定条件下、１分間に
1nmolのトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを生
成する活性を１単位（Ｕ）として表示する。なお、ここ
では、微生物菌体に加え、動物細胞を含めて菌体と呼
ぶ。
していることは、培養物、菌体または菌体処理物を、酵
素反応に適した水性媒体中に、Ｌ−プロリン、二価鉄イ
オン、２−ケトグルタル酸とともに加え、また必要に応
じて界面活性剤や有機溶剤を添加することにより、生成
するトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを検出す
ることにより知ることができる。生成されたＬ−プロリ
ン４位水酸化酵素の活性は、下記測定条件下、１分間に
1nmolのトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを生
成する活性を１単位（Ｕ）として表示する。なお、ここ
では、微生物菌体に加え、動物細胞を含めて菌体と呼
ぶ。
Ｌ−プロリン４位水酸化酵素活性の測定：
12mM Ｌ−プロリン、24mM ２−ケトグルタル酸、4m
M 硫酸第一鉄および8mM Ｌ−アスコルビン酸を含有す
る240mMのMES〔２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン
酸〕緩衝液（pH6.5）に菌体、菌体処理物または酵素標
品等を添加して合計250μｌとし、35℃、10分間反応す
る。反応液を100℃、２分間加熱して反応を停止した後
に、反応液中に生成したトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ
−プロリンを高速液体クロマトグラフィー（以下、HPLC
と略記する）を用いて定量する。
M 硫酸第一鉄および8mM Ｌ−アスコルビン酸を含有す
る240mMのMES〔２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン
酸〕緩衝液（pH6.5）に菌体、菌体処理物または酵素標
品等を添加して合計250μｌとし、35℃、10分間反応す
る。反応液を100℃、２分間加熱して反応を停止した後
に、反応液中に生成したトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ
−プロリンを高速液体クロマトグラフィー（以下、HPLC
と略記する）を用いて定量する。
定量にはトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを
定量できる方法であればどのような方法を用いてもよい
が、例えば、反応液中のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ
−プロリンを配位子交換クロマトグラフィーカラム、例
えば、株式会社住化分析センター製SUMICHIRAL OA5000
等を用いてHPLCで分離溶出後、７−クロロ−４−ニトロ
ベンゾ−２−オキサ−１、３−ジアゾール（以下、NBT
と略記する）によってポストカラム誘導体化し検出する
方法（ポストカラム誘導体化法）、あるいは反応液中の
目的化合物をあらかじめNBD誘導化しておき、これをHPL
Cを用いた逆相クロマトグラフィーにかけてNBD誘導体化
物を分離後検出する方法〔William J.Lindblad and Rob
ert F.Diegelmann,アナリティカル・バイオケミストリ
ー（Analytical Biochemistry）、138巻、390〜395ペー
ジ、1984年〕（プレカラム誘導体化法）等があげられ
る。NBD誘導体化物の検出は、いずれもその蛍光（励起
波長503nm、蛍光波長541nm）測定によって行われる。
定量できる方法であればどのような方法を用いてもよい
が、例えば、反応液中のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ
−プロリンを配位子交換クロマトグラフィーカラム、例
えば、株式会社住化分析センター製SUMICHIRAL OA5000
等を用いてHPLCで分離溶出後、７−クロロ−４−ニトロ
ベンゾ−２−オキサ−１、３−ジアゾール（以下、NBT
と略記する）によってポストカラム誘導体化し検出する
方法（ポストカラム誘導体化法）、あるいは反応液中の
目的化合物をあらかじめNBD誘導化しておき、これをHPL
Cを用いた逆相クロマトグラフィーにかけてNBD誘導体化
物を分離後検出する方法〔William J.Lindblad and Rob
ert F.Diegelmann,アナリティカル・バイオケミストリ
ー（Analytical Biochemistry）、138巻、390〜395ペー
ジ、1984年〕（プレカラム誘導体化法）等があげられ
る。NBD誘導体化物の検出は、いずれもその蛍光（励起
波長503nm、蛍光波長541nm）測定によって行われる。
上記のようにして培養菌体中にＬ−プロリン４位水酸
化酵素の生成が確認された形質転換体の培養物から、酵
素を単離精製するには、通常の酵素の単離、精製法を用
いればよい。例えば、該形質転換体の培養液を遠心分離
することにより、培養液中の菌体を集め、該菌体を洗浄
した後に、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガ
ウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により菌体を破砕
し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠沈分離す
ることにより得られた上清から、硫安等による塩析、ジ
エチルアミノエチル（DEAE）−セファロースなどの陰イ
オン交換クロマトグラフィー、ブチルセファロース、フ
ェニルセファロースなどの疎水性クロマトグラフィー、
分子篩を用いたゲル濾過法、等電点電気泳動等の電気泳
動法等の手法を用い、精製酵素標品を得ることができ
る。
化酵素の生成が確認された形質転換体の培養物から、酵
素を単離精製するには、通常の酵素の単離、精製法を用
いればよい。例えば、該形質転換体の培養液を遠心分離
することにより、培養液中の菌体を集め、該菌体を洗浄
した後に、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガ
ウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により菌体を破砕
し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠沈分離す
ることにより得られた上清から、硫安等による塩析、ジ
エチルアミノエチル（DEAE）−セファロースなどの陰イ
オン交換クロマトグラフィー、ブチルセファロース、フ
ェニルセファロースなどの疎水性クロマトグラフィー、
分子篩を用いたゲル濾過法、等電点電気泳動等の電気泳
動法等の手法を用い、精製酵素標品を得ることができ
る。
培養菌体中にＬ−プロリン４位水酸化酵素の生成が確
認された形質転換体を、上記の形質転換体の培養条件と
同様の条件で培養し、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−
プロリンを生成蓄積させ、該培養物よりトランス−４−
ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを採取することにより、トラ
ンス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを製造することが
できる。
認された形質転換体を、上記の形質転換体の培養条件と
同様の条件で培養し、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−
プロリンを生成蓄積させ、該培養物よりトランス−４−
ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを採取することにより、トラ
ンス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを製造することが
できる。
Ｌ−プロリンを糖源から生成し培養液中に蓄積する能
力のある形質転換体を用いることにより、培養中にＬ−
プロリンを添加しなくともトランス−４−ヒドロキシ−
Ｌ−プロリンを製造することができるが、Ｌ−プロリン
を５〜1000、好ましくは20〜200mMの濃度となるよう
に、適時培地に添加することにより、より効率的にＬ−
プロリン４位水酸化酵素の製造を行うことができる。
力のある形質転換体を用いることにより、培養中にＬ−
プロリンを添加しなくともトランス−４−ヒドロキシ−
Ｌ−プロリンを製造することができるが、Ｌ−プロリン
を５〜1000、好ましくは20〜200mMの濃度となるよう
に、適時培地に添加することにより、より効率的にＬ−
プロリン４位水酸化酵素の製造を行うことができる。
２−ケトグルタル酸を糖源から生成し培養液中に蓄積
する能力のある形質転換体を用いることにより、培養中
に２−ケトグルタル酸を添加しなくともトランス−４−
ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを製造することができる。該
形質転換体を用いる場合には、グルコース等の糖源を適
時培地に添加し、２−ケトグルタル酸を培養液中に生
成、蓄積させることにより、より効率的にＬ−プロリン
４位水酸化酵素の製造を行うことができる。２−ケトグ
ルタル酸を糖源から生成し培養液中に蓄積する能力のな
い形質転換体を用いる場合には、必要に応じて２−ケト
グルタル酸を培養時に添加する。
する能力のある形質転換体を用いることにより、培養中
に２−ケトグルタル酸を添加しなくともトランス−４−
ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを製造することができる。該
形質転換体を用いる場合には、グルコース等の糖源を適
時培地に添加し、２−ケトグルタル酸を培養液中に生
成、蓄積させることにより、より効率的にＬ−プロリン
４位水酸化酵素の製造を行うことができる。２−ケトグ
ルタル酸を糖源から生成し培養液中に蓄積する能力のな
い形質転換体を用いる場合には、必要に応じて２−ケト
グルタル酸を培養時に添加する。
また、必要に応じて２−ケトグルタル酸および２価鉄
イオンを培養時に添加してもよい。
イオンを培養時に添加してもよい。
トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造は、
Ｌ−プロリン４位水酸化酵素の生成が確認された形質転
換体の培養物、該培養物から分離した菌体または菌体処
理物を酵素源として用いて行うこともできる。
Ｌ−プロリン４位水酸化酵素の生成が確認された形質転
換体の培養物、該培養物から分離した菌体または菌体処
理物を酵素源として用いて行うこともできる。
即ち、該形質転換体の培養物、該培養物から分離した
菌体または菌体処理物を、酵素反応に適した水性媒体中
に、Ｌ−プロリン、二価鉄イオン、２−ケトグルタル酸
とともに加え、また必要に応じて界面活性剤や有機溶剤
を添加することにより、Ｌ−プロリンをトランス−４−
ヒドロキシ−Ｌ−プロリンに変換させ、次いで反応液よ
りトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを採取する
ことにより、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン
を製造することができる。
菌体または菌体処理物を、酵素反応に適した水性媒体中
に、Ｌ−プロリン、二価鉄イオン、２−ケトグルタル酸
とともに加え、また必要に応じて界面活性剤や有機溶剤
を添加することにより、Ｌ−プロリンをトランス−４−
ヒドロキシ−Ｌ−プロリンに変換させ、次いで反応液よ
りトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを採取する
ことにより、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン
を製造することができる。
菌体処理物としては、菌体の乾燥物、菌体の凍結乾燥
物、菌体の界面活性剤処理物、菌体の酵素処理物、菌体
の超音波処理物、菌体の機械的摩砕処理物、菌体の溶媒
処理物、菌体の蛋白質分画物、菌体および菌体処理物の
固定化物などがあげられる。また、該菌体より抽出して
得られるＬ−プロリン４位水酸化酵素活性を有する酵
素、該酵素の精製標品、固定化物なども用いられる。
物、菌体の界面活性剤処理物、菌体の酵素処理物、菌体
の超音波処理物、菌体の機械的摩砕処理物、菌体の溶媒
処理物、菌体の蛋白質分画物、菌体および菌体処理物の
固定化物などがあげられる。また、該菌体より抽出して
得られるＬ−プロリン４位水酸化酵素活性を有する酵
素、該酵素の精製標品、固定化物なども用いられる。
水性媒体としては、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、
ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、メタノー
ル、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどの
エステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドな
どのアミド類などがあげられる。
ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、メタノー
ル、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどの
エステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドな
どのアミド類などがあげられる。
界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・ステアリ
ルアミン（例えばナイミーンＳ−215、日本油脂社製
等）、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイド、カ
チオンFB、カイトンF2−40Eなどのカチオン性界面活性
剤、ナトリウムオレイルアミド硫酸、ニューレックスTA
B、ラビゾール80などのアニオン性界面活性剤、ポリオ
キシエチレンソルビタン・モノステアレート（例えばノ
ニオンST221）などの両性界面活性剤、その他三級アミ
ンPB、ヘキサデシルジメチルアミンなどがあげられ、反
応を促進するものであればいずれでも使用できる。これ
らは通常0.1〜50mg/l、好ましくは、１〜20mg/lの濃度
で用いられる。
ルアミン（例えばナイミーンＳ−215、日本油脂社製
等）、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイド、カ
チオンFB、カイトンF2−40Eなどのカチオン性界面活性
剤、ナトリウムオレイルアミド硫酸、ニューレックスTA
B、ラビゾール80などのアニオン性界面活性剤、ポリオ
キシエチレンソルビタン・モノステアレート（例えばノ
ニオンST221）などの両性界面活性剤、その他三級アミ
ンPB、ヘキサデシルジメチルアミンなどがあげられ、反
応を促進するものであればいずれでも使用できる。これ
らは通常0.1〜50mg/l、好ましくは、１〜20mg/lの濃度
で用いられる。
有機溶剤としては、トルエン、キシレン、脂肪族アル
コール、ベンゼン、酢酸エチルなどが用いられる。通常
0.1〜50μl/ml、好ましくは１〜20μl/mlの濃度で用い
られる。
コール、ベンゼン、酢酸エチルなどが用いられる。通常
0.1〜50μl/ml、好ましくは１〜20μl/mlの濃度で用い
られる。
反応は、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素活性を有する形
質転換体を培養後、該形質転換体の培養物、該培養物か
ら分離した菌体、菌体処理物を酵素源として用いて水性
媒体中で行う。
質転換体を培養後、該形質転換体の培養物、該培養物か
ら分離した菌体、菌体処理物を酵素源として用いて水性
媒体中で行う。
これら酵素源の反応液中における酵素活性は、用いる
基質量などにより決定されるが、通常１、000〜10、00
0、000U/l、好ましくは10、000〜３、000、000U/lであ
る。微生物の菌体および菌体処理物を用いる場合、その
濃度は通常湿菌体で１〜300g/lである。
基質量などにより決定されるが、通常１、000〜10、00
0、000U/l、好ましくは10、000〜３、000、000U/lであ
る。微生物の菌体および菌体処理物を用いる場合、その
濃度は通常湿菌体で１〜300g/lである。
反応は通常、温度15〜50℃、pH6.0〜9.0、で１〜96時
間行う。反応に用いられるＬ−プロリンの濃度は、1mM
〜2Mである。Ｌ−プロリンは、単品を反応液に直接添加
して用いてもよいし、Ｌ−プロリンを糖源から生成し培
養液中に蓄積する能力のある微生物の培養液等を用いて
供給してもよい。さらには、Ｌ−プロリンを糖源から生
成する能力のある微生物を形質転換体の宿主微生物とし
て用いることにより、該宿主微生物が生成するＬ−プロ
リンを反応に利用することもできる。
間行う。反応に用いられるＬ−プロリンの濃度は、1mM
〜2Mである。Ｌ−プロリンは、単品を反応液に直接添加
して用いてもよいし、Ｌ−プロリンを糖源から生成し培
養液中に蓄積する能力のある微生物の培養液等を用いて
供給してもよい。さらには、Ｌ−プロリンを糖源から生
成する能力のある微生物を形質転換体の宿主微生物とし
て用いることにより、該宿主微生物が生成するＬ−プロ
リンを反応に利用することもできる。
反応には二価鉄イオンが必要とされ、通常１〜100mM
の濃度で用いられる。二価鉄イオンとしては、二価鉄を
含み反応を阻害しない物であれば、どのようなものでも
用いることができる。例えば、硫酸第一鉄などの硫化
物、塩化第一鉄等の塩化物、炭酸第一鉄などの他、クエ
ン酸塩、乳酸塩、フマル酸塩等のような有機酸塩等をあ
げることができる。使用する該形質転換体の培養物、該
培養物から分離した菌体、菌体処理物あるいは反応液成
分中に二価鉄イオンが含まれていれば、特に二価鉄イオ
ンを添加しなくてもよい。
の濃度で用いられる。二価鉄イオンとしては、二価鉄を
含み反応を阻害しない物であれば、どのようなものでも
用いることができる。例えば、硫酸第一鉄などの硫化
物、塩化第一鉄等の塩化物、炭酸第一鉄などの他、クエ
ン酸塩、乳酸塩、フマル酸塩等のような有機酸塩等をあ
げることができる。使用する該形質転換体の培養物、該
培養物から分離した菌体、菌体処理物あるいは反応液成
分中に二価鉄イオンが含まれていれば、特に二価鉄イオ
ンを添加しなくてもよい。
２−ケトグルタル酸は、反応液に単品を添加してもよ
いし、用いる菌体および菌体処理物の有する代謝活性に
よって２−ケトグルタル酸に転換し得る化合物を用いて
供給してもよい。このような化合物としては、グルコー
スのような糖質、グルタミン酸などのアミノ酸、コハク
酸などの有機酸等があげられる。これらの化合物は単独
で用いてもよいし、複数を併用してもよい。
いし、用いる菌体および菌体処理物の有する代謝活性に
よって２−ケトグルタル酸に転換し得る化合物を用いて
供給してもよい。このような化合物としては、グルコー
スのような糖質、グルタミン酸などのアミノ酸、コハク
酸などの有機酸等があげられる。これらの化合物は単独
で用いてもよいし、複数を併用してもよい。
培養物または水性媒体からトランス−４−ヒドロキシ
−Ｌ−プロリンを回収する方法としては、イオン交換樹
脂等を用いるカラムクロマトグラフィー、あるいは晶出
法等、通常の分離方法が用いられる。回収されたトラン
ス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンは13C−NMRスペクト
ル、1H−NMRスペクトル、マススペクトル、比旋光度等
の通常の分析手段によって、その構造を確認することが
できる。
−Ｌ−プロリンを回収する方法としては、イオン交換樹
脂等を用いるカラムクロマトグラフィー、あるいは晶出
法等、通常の分離方法が用いられる。回収されたトラン
ス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンは13C−NMRスペクト
ル、1H−NMRスペクトル、マススペクトル、比旋光度等
の通常の分析手段によって、その構造を確認することが
できる。
本発明により製造されたトランス−４−ヒドロキシ−
Ｌ−プロリンは、前述のポストカラム誘導体化法やプレ
カラム誘導体化法によって、定量分析することができ
る。
Ｌ−プロリンは、前述のポストカラム誘導体化法やプレ
カラム誘導体化法によって、定量分析することができ
る。
図面の簡単な説明
第１図は、プラスミッドpRH71の制限酵素地図、およ
び、プラスミッドpYan10およびpYan13の造成工程を示す
図である。
び、プラスミッドpYan10およびpYan13の造成工程を示す
図である。
図中、黒塗の太線で示した部分が、クローン化された
Dactylosporangium sp.RH1の染色体部分を示す。ApはpB
R322由来のアンピシリン耐性遺伝子を示す。なお図中に
はプラスミッドの造成に関係する制限酵素部位のみを表
示してある。
Dactylosporangium sp.RH1の染色体部分を示す。ApはpB
R322由来のアンピシリン耐性遺伝子を示す。なお図中に
はプラスミッドの造成に関係する制限酵素部位のみを表
示してある。
第２図は、プラスミッドpTr14の造成工程を示す図で
ある。
ある。
図中、黒塗の太線で示した部分が、Ｌ−プロリン４位
水酸化酵素遺伝子を含む部分を示す。ApはpBR322由来の
アンピシリン耐性遺伝子を、Ptrpは大腸菌トリプトファ
ンオペロンのプロモーターを示す。矢印は遺伝子の転写
並びに翻訳の方向を示す。なお図中にはプラスミッドの
造成に関係する制限酵素部位のみを表示してある。
水酸化酵素遺伝子を含む部分を示す。ApはpBR322由来の
アンピシリン耐性遺伝子を、Ptrpは大腸菌トリプトファ
ンオペロンのプロモーターを示す。矢印は遺伝子の転写
並びに翻訳の方向を示す。なお図中にはプラスミッドの
造成に関係する制限酵素部位のみを表示してある。
第３図は、プラスミッドpTc4OHの造成工程を示す図で
ある。
ある。
図中、黒塗の太線で示した部分が、Ｌ−プロリン４位
水酸化酵素遺伝子を含む部分を示す。ApはpBR322由来の
アンピシリン耐性遺伝子を、Ptacはtacプロモーターを
示す。矢印は遺伝子の転写並びに翻訳の方向を示す。な
お図中にはプラスミッドの造成に関係する制限酵素部位
のみを表示してある。
水酸化酵素遺伝子を含む部分を示す。ApはpBR322由来の
アンピシリン耐性遺伝子を、Ptacはtacプロモーターを
示す。矢印は遺伝子の転写並びに翻訳の方向を示す。な
お図中にはプラスミッドの造成に関係する制限酵素部位
のみを表示してある。
第４図は、プラスミドpTr2−4OHの造成工程を示す図
である。
である。
図中、黒塗の太線で示した部分が、Ｌ−プロリン４位
水酸化酵素遺伝子を含む部分を示す。ApはpBR322由来の
アンピシリン耐性遺伝子を、Ptrp×２は大腸菌由来のト
リプトファンオペロンのプロモーターを２つ直列させた
プロモーター（タンデムトリプトファンプロモーター）
を示す。矢印は遺伝子の転写並びに翻訳の方向を示す。
なお図中にはプラスミドの造成に関係する制限酵素部位
のみを示してある。
水酸化酵素遺伝子を含む部分を示す。ApはpBR322由来の
アンピシリン耐性遺伝子を、Ptrp×２は大腸菌由来のト
リプトファンオペロンのプロモーターを２つ直列させた
プロモーター（タンデムトリプトファンプロモーター）
を示す。矢印は遺伝子の転写並びに翻訳の方向を示す。
なお図中にはプラスミドの造成に関係する制限酵素部位
のみを示してある。
第５図は、プラスミドpTr2−4OHΔの造成工程を示す
図である。
図である。
図中、黒塗の太線で示した部分が、Ｌ−プロリン４位
水酸化酵素遺伝子を含む部分を示す。ApはpBR322由来の
アンピシリン耐性遺伝子を、Ptrp×２は大腸菌由来のト
リプトファンオペロンのプロモーターを２つ直列させた
プロモーター（タンデムトリプトファンプロモーター）
を示す。矢印は遺伝子の転写並びに翻訳の方向を示す。
なお図中にはプラスミドの造成に関係する制限酵素部位
のみを示してある。
水酸化酵素遺伝子を含む部分を示す。ApはpBR322由来の
アンピシリン耐性遺伝子を、Ptrp×２は大腸菌由来のト
リプトファンオペロンのプロモーターを２つ直列させた
プロモーター（タンデムトリプトファンプロモーター）
を示す。矢印は遺伝子の転写並びに翻訳の方向を示す。
なお図中にはプラスミドの造成に関係する制限酵素部位
のみを示してある。
第６図は、プラスミドpWFH1の造成工程を示す図であ
る。
る。
図中、網掛けの太線で示した部分が、Hind IIIおよび
Sal I処理したPCR増幅断片の挿入部分を示す。黒塗の太
線で示した部分が、Dactylosporangium sp.RH1由来のＬ
−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含む部分を示す。Ap
はpBR322由来のアンピシリン耐性遺伝子を、Ptrp×２は
大腸菌由来のトリプトファンオペロンのプロモーターを
２つ直列させたプロモーター（タンデムトリプトファン
プロモーター）を示す。矢印は遺伝子の転写並びに翻訳
の方向を示す。なお図中にはプラスミドの造成に関係す
る制限酵素部位のみを示してある。
Sal I処理したPCR増幅断片の挿入部分を示す。黒塗の太
線で示した部分が、Dactylosporangium sp.RH1由来のＬ
−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含む部分を示す。Ap
はpBR322由来のアンピシリン耐性遺伝子を、Ptrp×２は
大腸菌由来のトリプトファンオペロンのプロモーターを
２つ直列させたプロモーター（タンデムトリプトファン
プロモーター）を示す。矢印は遺伝子の転写並びに翻訳
の方向を示す。なお図中にはプラスミドの造成に関係す
る制限酵素部位のみを示してある。
第７図は、プラスミッドpES1−23aの造成工程を示す
図である。
図である。
図中、黒塗の太線で示した部分が、Ｌ−プロリン４位
水酸化酵素遺伝子を含む部分を示す。lacZは大腸菌β−
ガラクトシダーゼ遺伝子を、ApはpBR322由来のアンピシ
リン耐性遺伝子を、Placはlacプロモーターを示す。矢
印は遺伝子の転写並びに翻訳の方向を示す。なお図中に
はプラスミッドの造成に関係する制限酵素部位のみを表
示してある。
水酸化酵素遺伝子を含む部分を示す。lacZは大腸菌β−
ガラクトシダーゼ遺伝子を、ApはpBR322由来のアンピシ
リン耐性遺伝子を、Placはlacプロモーターを示す。矢
印は遺伝子の転写並びに翻訳の方向を示す。なお図中に
はプラスミッドの造成に関係する制限酵素部位のみを表
示してある。
第８図は、プラスミッドpMc4OHの造成工程を示す図で
ある。
ある。
図中、黒塗の太線で示した部分が、Ｌ−プロリン４位
水酸化酵素遺伝子を含む部分を示す。malEは大腸菌マル
トース結合蛋白遺伝子を、lacZは大腸菌β−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子を、ApはpBR322由来のアンピシリン耐性遺
伝子を、lac Iqは大腸菌ラクトースオペロンのリプレッ
サー遺伝子を、rrnB terminatorはrrnB遺伝子のターミ
ネーターを、Ptacはtacプロモーターを示す。矢印は遺
伝子の転写並びに翻訳の方向を示す。なお図中にはプラ
スミッドの造成に関係する制限酵素部位のみを表示して
ある。
水酸化酵素遺伝子を含む部分を示す。malEは大腸菌マル
トース結合蛋白遺伝子を、lacZは大腸菌β−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子を、ApはpBR322由来のアンピシリン耐性遺
伝子を、lac Iqは大腸菌ラクトースオペロンのリプレッ
サー遺伝子を、rrnB terminatorはrrnB遺伝子のターミ
ネーターを、Ptacはtacプロモーターを示す。矢印は遺
伝子の転写並びに翻訳の方向を示す。なお図中にはプラ
スミッドの造成に関係する制限酵素部位のみを表示して
ある。
発明を実施するための最良の形態
実施例１ ダクチロスポランジウム・エスピーRH1のＬ
−プロリン４位水酸化酵素蛋白質をコードする遺伝子の
部分DNAの調製 （１）ダクチロスポランジウム・エスピーRH1染色体DNA
の単離 ダクチロスポランジウム・エスピーRH1の染色体DNAは
常法に従って以下の様に単離した。マンニトール５％、
グリシン0.05％を添加したSK＃２培地（グルコース0.25
％、可溶性澱粉1.0％、酵母エキス0.25％、ペプトン0.2
5％、肉エキス0.15％、りん酸１カリウム0.01％、硫酸
マグネシウム0.03％を含み、6N NaOHでpH7.6に調整した
培地）を試験管に10ml分注し、120℃、20分間殺菌し
た。これに、HT寒天平板培地（可溶性澱粉１％、NZアミ
ン0.2％、酵母エキス0.1％、肉エキス0.1％、寒天1.5％
を含み、6N NaOHでpH7.2に調整後、120℃、20分間殺菌
した培地）に生育したダクチロスポランジウム・エスピ
ーRH1を一白金耳植菌し、28℃、３日間振とう培養し
た。
−プロリン４位水酸化酵素蛋白質をコードする遺伝子の
部分DNAの調製 （１）ダクチロスポランジウム・エスピーRH1染色体DNA
の単離 ダクチロスポランジウム・エスピーRH1の染色体DNAは
常法に従って以下の様に単離した。マンニトール５％、
グリシン0.05％を添加したSK＃２培地（グルコース0.25
％、可溶性澱粉1.0％、酵母エキス0.25％、ペプトン0.2
5％、肉エキス0.15％、りん酸１カリウム0.01％、硫酸
マグネシウム0.03％を含み、6N NaOHでpH7.6に調整した
培地）を試験管に10ml分注し、120℃、20分間殺菌し
た。これに、HT寒天平板培地（可溶性澱粉１％、NZアミ
ン0.2％、酵母エキス0.1％、肉エキス0.1％、寒天1.5％
を含み、6N NaOHでpH7.2に調整後、120℃、20分間殺菌
した培地）に生育したダクチロスポランジウム・エスピ
ーRH1を一白金耳植菌し、28℃、３日間振とう培養し
た。
該培養液を遠心分離し、得られた菌体を10mlの10.3％
スクロース溶液で洗浄後、6mlのTS〔10.3％スクロー
ス、50mM Tris・HCl（pH8.0）、25mM EDTA〕に懸濁し、
リゾチーム溶液（50mg/ml TS）1mlを加え、37℃、60分
間インキュベートした。次いで、該リゾチーム処理液に
プロテイナーゼＫ（シグマ社製）溶液（2mg/ml TS）0.6
mlを加え穏やかに混合し、さらに3.6mlの3.3％（W/V）S
DS溶液を穏やかに混合しつつ加え、37℃、60分間インキ
ュベートした。該混合液を50℃、30分間加熱後水冷し、
TE〔10mM Tris・HCl（pH8.0）1mM EDTA〕飽和フェノー
ル／クロロホルム（1/1、v/v）を等量加え、30分間穏や
かに振とうした。遠心分離後、上層をとり、再度TE飽和
フェノール／クロロホルムによる抽出操作を行い、遠心
分離後、得られた上層に等量のクロロホルムを加え、混
合後、再度遠心分離した。上層をとり、該上層に100
℃、10分間の加熱処理をしたRNase A水溶液（10mg/ml）
を20μｌ加え、37℃、45分間インキュベートした。該RN
ase A処理液に、1/10容量の5M食塩水および1/4容量の50
％PEG6000を加え、穏やかに混合後、氷冷下一晩放置し
た。該混合液を12、000rpm、10分間遠心分離後、上清を
完全に捨て、残った沈殿を5mlのTEに溶解した。1/10容
量の3M酢酸ナトリウム溶液および1/30容量の66mM塩化マ
グネシウム溶液を加え混合後、2.2倍容量の冷エタノー
ルを加え、穏やかに混合した。該混合液を10,000rpm、1
0分間遠心分離後、上清を捨て、得られた沈殿を70％冷
エタノールで２回洗浄した。該沈殿（250μｇの染色体D
NAを含有）をTEに溶解し、染色体DNAとして以後の実験
に用いた。
スクロース溶液で洗浄後、6mlのTS〔10.3％スクロー
ス、50mM Tris・HCl（pH8.0）、25mM EDTA〕に懸濁し、
リゾチーム溶液（50mg/ml TS）1mlを加え、37℃、60分
間インキュベートした。次いで、該リゾチーム処理液に
プロテイナーゼＫ（シグマ社製）溶液（2mg/ml TS）0.6
mlを加え穏やかに混合し、さらに3.6mlの3.3％（W/V）S
DS溶液を穏やかに混合しつつ加え、37℃、60分間インキ
ュベートした。該混合液を50℃、30分間加熱後水冷し、
TE〔10mM Tris・HCl（pH8.0）1mM EDTA〕飽和フェノー
ル／クロロホルム（1/1、v/v）を等量加え、30分間穏や
かに振とうした。遠心分離後、上層をとり、再度TE飽和
フェノール／クロロホルムによる抽出操作を行い、遠心
分離後、得られた上層に等量のクロロホルムを加え、混
合後、再度遠心分離した。上層をとり、該上層に100
℃、10分間の加熱処理をしたRNase A水溶液（10mg/ml）
を20μｌ加え、37℃、45分間インキュベートした。該RN
ase A処理液に、1/10容量の5M食塩水および1/4容量の50
％PEG6000を加え、穏やかに混合後、氷冷下一晩放置し
た。該混合液を12、000rpm、10分間遠心分離後、上清を
完全に捨て、残った沈殿を5mlのTEに溶解した。1/10容
量の3M酢酸ナトリウム溶液および1/30容量の66mM塩化マ
グネシウム溶液を加え混合後、2.2倍容量の冷エタノー
ルを加え、穏やかに混合した。該混合液を10,000rpm、1
0分間遠心分離後、上清を捨て、得られた沈殿を70％冷
エタノールで２回洗浄した。該沈殿（250μｇの染色体D
NAを含有）をTEに溶解し、染色体DNAとして以後の実験
に用いた。
（２）ダクチロスポランジウム・エスピーRH1由来のＬ
−プロリン４位水酸化酵素蛋白の部分アミノ酸配列の決
定 ダクチロスポランジウム・エスピーRH1の生産するＬ
−プロリン４位水酸化酵素を参考例１の方法に準じて単
離精製し、該精製酵素蛋白質のＮ末端アミノ酸配列を島
津製作所社製Protein sequencer model PPSQ−10を用い
て分析し、配列番号１に示された配列のＮ末端24アミノ
酸残基の配列を決定した。
−プロリン４位水酸化酵素蛋白の部分アミノ酸配列の決
定 ダクチロスポランジウム・エスピーRH1の生産するＬ
−プロリン４位水酸化酵素を参考例１の方法に準じて単
離精製し、該精製酵素蛋白質のＮ末端アミノ酸配列を島
津製作所社製Protein sequencer model PPSQ−10を用い
て分析し、配列番号１に示された配列のＮ末端24アミノ
酸残基の配列を決定した。
（３）Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子の部分DNAの
調製 配列番号１記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜６
に対応する配列番号３記載のセンス鎖ミックスDNAプラ
イマーと、配列番号１記載のアミノ酸配列のアミノ酸番
号19〜24に対応する配列番号４記載のアンチセンス鎖ミ
ックスDNAプライマーをアプライド・バイオシステムズ
（Applied Biosystems）社製380A・DNA合成機を用いて
合成した。
調製 配列番号１記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜６
に対応する配列番号３記載のセンス鎖ミックスDNAプラ
イマーと、配列番号１記載のアミノ酸配列のアミノ酸番
号19〜24に対応する配列番号４記載のアンチセンス鎖ミ
ックスDNAプライマーをアプライド・バイオシステムズ
（Applied Biosystems）社製380A・DNA合成機を用いて
合成した。
該合成DNAをプライマーとし、ダクチロスポランジウ
ム・エスピーRH1染色体DNAを鋳型としてPCRを行った。P
CRは、株式会社アステック製プログラム・テンプ・コン
トロール・システム PC−700を用いて行った。反応
は、以下の組成の反応液20μｌを用いて行った。
ム・エスピーRH1染色体DNAを鋳型としてPCRを行った。P
CRは、株式会社アステック製プログラム・テンプ・コン
トロール・システム PC−700を用いて行った。反応
は、以下の組成の反応液20μｌを用いて行った。
反応液組成：ダクチロスポランジウム・エスピーRH1
染色体DNA 22ng/μｌ、センス鎖ミックスDNAプライマー
およびアンチセンス鎖ミックスDNAプライマー各10μ
Ｍ、Pfu DNAポリメラーゼ（STRATAGENE社製）0.125U/μ
ｌ、DMSO 10％、Tris・HCl（pH8.2）20mM、KCl 10mM、
硫酸アンモニウム6mM、塩化マグネシウム2mM、Triton X
−100 0.1％、Bovine Serum Albumine 10ng/μｌ。
染色体DNA 22ng/μｌ、センス鎖ミックスDNAプライマー
およびアンチセンス鎖ミックスDNAプライマー各10μ
Ｍ、Pfu DNAポリメラーゼ（STRATAGENE社製）0.125U/μ
ｌ、DMSO 10％、Tris・HCl（pH8.2）20mM、KCl 10mM、
硫酸アンモニウム6mM、塩化マグネシウム2mM、Triton X
−100 0.1％、Bovine Serum Albumine 10ng/μｌ。
反応は、96℃、５分間のインキュベーション後、96℃
−２分間、37℃−１分間、72℃−１分間のインキュベー
ションの工程を５回繰り返し、さらに、96℃−２分間、
50℃−１分間、72℃−１分間のインキュベーション工程
を35回繰り返した。反応液を15％ポリアクリルアミド
（アトー株式会社製、パジェルNPU−15L）電気泳動にか
けた後、71bpのバンドを日本エイドー株式会社製のダヴ
ィンチくん（ペンタッチリカバリーNB−7000型）を用い
て回収した。回収した71bpのDNA断片を、ファルマシア
社製Sure Clone Ligation Kitを用いてpUC18のSma I部
位に挿入し、アプライドバイオシステムズ社製の塩基配
列決定キット（Taq DyeDeoxyTM Terminator Cycle Sequ
encing Kit）を用いてその塩基配列を決定した。決定し
た71bpのDNA断片の塩基配列を配列番号５に示す。この7
1bpのDNA断片の塩基配列から推定されるアミノ酸配列
は、配列番号１記載の精製酵素のＮ末端アミノ酸配列と
完全に一致した。
−２分間、37℃−１分間、72℃−１分間のインキュベー
ションの工程を５回繰り返し、さらに、96℃−２分間、
50℃−１分間、72℃−１分間のインキュベーション工程
を35回繰り返した。反応液を15％ポリアクリルアミド
（アトー株式会社製、パジェルNPU−15L）電気泳動にか
けた後、71bpのバンドを日本エイドー株式会社製のダヴ
ィンチくん（ペンタッチリカバリーNB−7000型）を用い
て回収した。回収した71bpのDNA断片を、ファルマシア
社製Sure Clone Ligation Kitを用いてpUC18のSma I部
位に挿入し、アプライドバイオシステムズ社製の塩基配
列決定キット（Taq DyeDeoxyTM Terminator Cycle Sequ
encing Kit）を用いてその塩基配列を決定した。決定し
た71bpのDNA断片の塩基配列を配列番号５に示す。この7
1bpのDNA断片の塩基配列から推定されるアミノ酸配列
は、配列番号１記載の精製酵素のＮ末端アミノ酸配列と
完全に一致した。
実施例２ Ｌ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子を含むDN
A断片の取得 （１）DIG化プローブの作成 71bpのDNA断片のジゴキシゲニン（Digoxigenin、DI
G）化は、ベーリンガー マンハイム社製PCR DIG Label
ling Kitを用いて行った。
A断片の取得 （１）DIG化プローブの作成 71bpのDNA断片のジゴキシゲニン（Digoxigenin、DI
G）化は、ベーリンガー マンハイム社製PCR DIG Label
ling Kitを用いて行った。
Pfu DNAポリメラーゼ（STRATAGENE社製）2.5U、Pfu D
NAポリメラーゼ用×10緩衝液（STRATAGENE社製）５μ
ｌ、DMSO 5μｌ、×10 PCR DIG mix（ベーリンガー マ
ンハイム社製）５μｌ、実施例１（３）に於いてPCRに
より作成しポリアクリルアミドゲル電気泳動後回収した
71bpのフラグメントを含むDNA溶液を10倍希釈して得ら
れた該希釈液１μｌ、配列番号３記載のセンス鎖合成DN
Aと配列番号４記載のアンチセンス鎖合成DNAを各10μＭ
を含む反応液50μｌを用いてPCRを行った。反応は、96
℃、５分間のインキュベーション後、96℃−２分間、50
℃−１分間、72℃−１分間のインキュベーション工程を
35回繰り返した。該反応液を、12.5％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動にかけ、71bpの増幅断片の生成を確認
し、ゲルより実施例１（３）と同様の操作により診断片
を回収し、これをプローブとして用いた。
NAポリメラーゼ用×10緩衝液（STRATAGENE社製）５μ
ｌ、DMSO 5μｌ、×10 PCR DIG mix（ベーリンガー マ
ンハイム社製）５μｌ、実施例１（３）に於いてPCRに
より作成しポリアクリルアミドゲル電気泳動後回収した
71bpのフラグメントを含むDNA溶液を10倍希釈して得ら
れた該希釈液１μｌ、配列番号３記載のセンス鎖合成DN
Aと配列番号４記載のアンチセンス鎖合成DNAを各10μＭ
を含む反応液50μｌを用いてPCRを行った。反応は、96
℃、５分間のインキュベーション後、96℃−２分間、50
℃−１分間、72℃−１分間のインキュベーション工程を
35回繰り返した。該反応液を、12.5％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動にかけ、71bpの増幅断片の生成を確認
し、ゲルより実施例１（３）と同様の操作により診断片
を回収し、これをプローブとして用いた。
（２）サザーンハイブリダイゼーション
ダクチロスポランジウム・エスピーRH1の染色体DNA 1
0μｇに、制限酵素Xho I（宝酒造社製）36Uを添加し、3
7℃、２時間反応させ、該DNAを切断後、該DNAをアガロ
ースゲル電気泳動にかけた。実施例２（１）で得たプロ
ーブを用い、ベーリンガー マンハイム社製のDIG Lumi
nescent Detection Kitを用いて、添付の説明書記載の
方法に従ってサザーンハイブリダイゼーションを行っ
た。
0μｇに、制限酵素Xho I（宝酒造社製）36Uを添加し、3
7℃、２時間反応させ、該DNAを切断後、該DNAをアガロ
ースゲル電気泳動にかけた。実施例２（１）で得たプロ
ーブを用い、ベーリンガー マンハイム社製のDIG Lumi
nescent Detection Kitを用いて、添付の説明書記載の
方法に従ってサザーンハイブリダイゼーションを行っ
た。
即ち、アガロースゲル電気泳動後、アガロースゲルを
0.25N塩酸中で20分間ゆるやかに振とうし、次いで、0.5
M水酸化ナトリウム−1.5M塩化ナトリウム中で50分間浸
した。さらに、2M塩化ナトリウム−1M Tris・HCl（pH5.
0）に25分間浸した。アトー社製ジェノピレーターポン
プAE−6680Pおよびアトー社製ジェノピレーターAE−668
0Cを用いて、7.5mmHgで吸引しつつ、Hybond−N+膜（ア
マーシャム社製）に、20倍濃度のSSC（１倍濃度のSSCの
組成は、150mM塩化ナトリウム、15mMクエン酸ナトリウ
ムである）中で、ブロッティングした。ブロッティング
後、80℃、10分間乾燥し、さらにFUNA−UV−LINKER FS
−800（フナコシ社製）を用いてクロスリンクを行っ
た。このようにして得た膜を、DIG Luminescent Detect
ion Kitのハイブリダイゼーション・バッファー（フォ
ルムアミド50％v/v、ブロッキング試薬２％、Ｎ−ラウ
リルザルコシン0.1％w/v、SDS 0.02％w/v、を５倍濃度
のSSC中に含んだ溶液）10ml中に42℃、１時間浸した
後、プローブ溶液〔実施例２（１）で得たプローブ３μ
ｌを200μｌのハイブリダイゼーション・バッファーに
添加し、95℃、２分間処理後、ハイブリダイゼーション
・バッファーを添加し1.5mlに調製したもの〕中に、42
℃、一晩浸した。該膜をさらに、0.1％SDSを含む２倍濃
度の25ml SSCを用いて室温で５分間づつ２回洗浄後、0.
1％SDSを含む0.1倍濃度の25ml SSCを用いて68℃で15分
間づつ２回洗浄した。
0.25N塩酸中で20分間ゆるやかに振とうし、次いで、0.5
M水酸化ナトリウム−1.5M塩化ナトリウム中で50分間浸
した。さらに、2M塩化ナトリウム−1M Tris・HCl（pH5.
0）に25分間浸した。アトー社製ジェノピレーターポン
プAE−6680Pおよびアトー社製ジェノピレーターAE−668
0Cを用いて、7.5mmHgで吸引しつつ、Hybond−N+膜（ア
マーシャム社製）に、20倍濃度のSSC（１倍濃度のSSCの
組成は、150mM塩化ナトリウム、15mMクエン酸ナトリウ
ムである）中で、ブロッティングした。ブロッティング
後、80℃、10分間乾燥し、さらにFUNA−UV−LINKER FS
−800（フナコシ社製）を用いてクロスリンクを行っ
た。このようにして得た膜を、DIG Luminescent Detect
ion Kitのハイブリダイゼーション・バッファー（フォ
ルムアミド50％v/v、ブロッキング試薬２％、Ｎ−ラウ
リルザルコシン0.1％w/v、SDS 0.02％w/v、を５倍濃度
のSSC中に含んだ溶液）10ml中に42℃、１時間浸した
後、プローブ溶液〔実施例２（１）で得たプローブ３μ
ｌを200μｌのハイブリダイゼーション・バッファーに
添加し、95℃、２分間処理後、ハイブリダイゼーション
・バッファーを添加し1.5mlに調製したもの〕中に、42
℃、一晩浸した。該膜をさらに、0.1％SDSを含む２倍濃
度の25ml SSCを用いて室温で５分間づつ２回洗浄後、0.
1％SDSを含む0.1倍濃度の25ml SSCを用いて68℃で15分
間づつ２回洗浄した。
該洗浄膜を洗浄バッファー〔0.3％w/v Tween−20を含
むバッファー１（0.1Mマレイン酸、0.15M塩化ナトリウ
ム、pH7.5）〕を用いて室温で１〜５分、50mlのバッフ
ァー２（１％ブロッキング試薬を含むバッファー１）を
用いて室温で30分間、１μｌのanti−digoxigenin−AP
Fabを含む10mlのバッファー２を用いて室温で30分間、5
0mlのバッファー２を用いて室温で30分間づつ２回、10m
lのバッファー３（0.1M Tris・HCl、0.1M塩化ナトリウ
ム、50mM塩化マグネシウム、pH9.5）を用いて室温で２
〜５分、Lumigen PPD 50μｌを含む5mlバッファー３を
用いて室温で５分間、順次処理した後、濾紙上で素早く
水を切り、サランラップに包んだ後、37℃で15分間静置
した。これをHyperfilm−ECL（アマーシャム社製）を用
いて室温で30分間露光した。
むバッファー１（0.1Mマレイン酸、0.15M塩化ナトリウ
ム、pH7.5）〕を用いて室温で１〜５分、50mlのバッフ
ァー２（１％ブロッキング試薬を含むバッファー１）を
用いて室温で30分間、１μｌのanti−digoxigenin−AP
Fabを含む10mlのバッファー２を用いて室温で30分間、5
0mlのバッファー２を用いて室温で30分間づつ２回、10m
lのバッファー３（0.1M Tris・HCl、0.1M塩化ナトリウ
ム、50mM塩化マグネシウム、pH9.5）を用いて室温で２
〜５分、Lumigen PPD 50μｌを含む5mlバッファー３を
用いて室温で５分間、順次処理した後、濾紙上で素早く
水を切り、サランラップに包んだ後、37℃で15分間静置
した。これをHyperfilm−ECL（アマーシャム社製）を用
いて室温で30分間露光した。
約5.5kbの位置にプローブと強くハイブリダイズするD
NA断片が存在することが判明した。
NA断片が存在することが判明した。
（３）染色体DNAの分画
ダクチロスポランジウム・エスピーRH1の染色体DNA10
0μｇに、制限酵素Xho I（宝酒造社製）360Uを添加し、
37℃、２時間反応させ、該DNAを切断後、等量のTE飽和
フェノール／クロロホルムを加え混合した。遠心分離
後、上層をとり、2.2倍容量の冷エタノールを加え、穏
やかに混合した。10、000rpm、10分間遠心分離し、上清
を捨てたのち、沈殿を70％冷エタノールで２回洗浄し、
エタノール沈殿を得た。以後、TE飽和フェノール／クロ
ロホルム、冷エタノールを用いエタノール沈殿を得る操
作をエタノール沈殿法と呼ぶ。該沈殿を120μl TEに溶
解し、アガロースゲル電気泳動にかけた。泳動後、5.5k
b付近のDNA画分をPrep−Ａ−gene（バイオラッド社製）
を用いてアガロースゲルより抽出精製し、約７μｇのXh
o I切断染色体DNA画分を得た。
0μｇに、制限酵素Xho I（宝酒造社製）360Uを添加し、
37℃、２時間反応させ、該DNAを切断後、等量のTE飽和
フェノール／クロロホルムを加え混合した。遠心分離
後、上層をとり、2.2倍容量の冷エタノールを加え、穏
やかに混合した。10、000rpm、10分間遠心分離し、上清
を捨てたのち、沈殿を70％冷エタノールで２回洗浄し、
エタノール沈殿を得た。以後、TE飽和フェノール／クロ
ロホルム、冷エタノールを用いエタノール沈殿を得る操
作をエタノール沈殿法と呼ぶ。該沈殿を120μl TEに溶
解し、アガロースゲル電気泳動にかけた。泳動後、5.5k
b付近のDNA画分をPrep−Ａ−gene（バイオラッド社製）
を用いてアガロースゲルより抽出精製し、約７μｇのXh
o I切断染色体DNA画分を得た。
（４）ファージライブラリーの作成
STRATAGENE社製のUndigested λZAPII Cloning Kitを
用いて以下の様にファージライブラリーを作成した。
用いて以下の様にファージライブラリーを作成した。
λZAPII DNA5μｇに、制限酵素Xho I（宝酒造社製）3
6Uを添加し、37℃、３時間反応させ、該DNAを切断後、
エタノール沈殿法により、エタノール沈殿を得た。該エ
タノール沈殿を35μｌのTEに溶解後、宝酒造社製のアル
カリフォスファターゼ〔Alkaline Phosphatase（Calf I
ntesteine）〕を用い、添付の説明書記載の方法に従っ
て脱リン酸化反応を行った。反応後、エタノール沈殿法
により、エタノール沈殿を得た。該沈殿を５μｌのTEに
溶解した。このようにして得たXho I切断λZAPII DNA
0.36μｇと実施例２（３）で得たXho I切断染色体DNA
0.35μｇを、ライゲーションキット（TAKARA ligation
Kit、宝酒造社製）を用いて26℃、2.5時間反応させ、連
結した。該反応液にエタノールを添加し、生じたDNAの
沈殿を４μｌのTEに溶解した。該DNAをさらに、Gigapac
k II Gold Packaging Extract（STRATAGENE社製）を用
いて、λファージ粒子中にパッケージングした。
6Uを添加し、37℃、３時間反応させ、該DNAを切断後、
エタノール沈殿法により、エタノール沈殿を得た。該エ
タノール沈殿を35μｌのTEに溶解後、宝酒造社製のアル
カリフォスファターゼ〔Alkaline Phosphatase（Calf I
ntesteine）〕を用い、添付の説明書記載の方法に従っ
て脱リン酸化反応を行った。反応後、エタノール沈殿法
により、エタノール沈殿を得た。該沈殿を５μｌのTEに
溶解した。このようにして得たXho I切断λZAPII DNA
0.36μｇと実施例２（３）で得たXho I切断染色体DNA
0.35μｇを、ライゲーションキット（TAKARA ligation
Kit、宝酒造社製）を用いて26℃、2.5時間反応させ、連
結した。該反応液にエタノールを添加し、生じたDNAの
沈殿を４μｌのTEに溶解した。該DNAをさらに、Gigapac
k II Gold Packaging Extract（STRATAGENE社製）を用
いて、λファージ粒子中にパッケージングした。
一方、E.coli XL1−Blue MRF'株（STRATAGENE社製）
を0.2％（w/v）マルトースおよび10mM硫酸マグネシウム
を含むLB培地（バクトトリプトン10g、バクトイースト
エキストラクト5g、食塩5gを蒸留水１リッターに含み、
120℃、20分間滅菌）3mlに植菌し、30℃、16時間培養し
た。培養後、遠心分離により集菌し、得られた菌体を、
600nmにおける吸光度が約0.5となるように、10mM滅菌硫
酸マグネシウム溶液に懸濁した。
を0.2％（w/v）マルトースおよび10mM硫酸マグネシウム
を含むLB培地（バクトトリプトン10g、バクトイースト
エキストラクト5g、食塩5gを蒸留水１リッターに含み、
120℃、20分間滅菌）3mlに植菌し、30℃、16時間培養し
た。培養後、遠心分離により集菌し、得られた菌体を、
600nmにおける吸光度が約0.5となるように、10mM滅菌硫
酸マグネシウム溶液に懸濁した。
上記の菌液200μｌとパッケージング液10μｌを混合
後、37℃、15分間インキュベートした。該混合液にLB軟
寒天培地（LB培地に寒天を0.6％になるように加えたも
の）3ml、0.5M IPTG水溶液15μｌ、Ｘ−Gal（５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシ
ド）溶液（250mg X−Gal/mlジメチルフォルムアミド）5
0μｌを添加混合し、LB寒天培地（LB培地に寒天を1.8％
になるように加えたもの）上に重層後、37℃で一晩培養
した。
後、37℃、15分間インキュベートした。該混合液にLB軟
寒天培地（LB培地に寒天を0.6％になるように加えたも
の）3ml、0.5M IPTG水溶液15μｌ、Ｘ−Gal（５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシ
ド）溶液（250mg X−Gal/mlジメチルフォルムアミド）5
0μｌを添加混合し、LB寒天培地（LB培地に寒天を1.8％
になるように加えたもの）上に重層後、37℃で一晩培養
した。
約5000個の無色のプラークが得られ、これをファージ
ライブラリーとして用いた。
ライブラリーとして用いた。
（５）目的クローンの選択
上記ファージライブラリーの中から、目的となるクロ
ーンを有するプラークを以下の方法で選択した。
ーンを有するプラークを以下の方法で選択した。
LB寒天培地上に出現したプラークを、５倍濃度のSSC
で洗浄したナイロン膜（シュライヒャー・アンド・シュ
ール、Schleicher ＆ Schuell、社製Nytran）に移しと
った後、該膜を0.5M水酸化ナトリウム−1.5M塩化ナトリ
ウムを染み込ませた濾紙上に５分間静置した。さらに、
該膜を1.5M塩化ナトリウム−0.5M Tris・HCl（pH8.0）
を染み込ませた濾紙上に２分間づつ２回、２倍濃度のSS
Cを染み込ませた濾紙上に２分間づつ２回静置後、80℃
で30分間乾燥させた。乾燥させた該膜を、0.1％SDSを含
む２倍濃度のSSCで洗浄した後、２倍濃度のSSCで洗浄
し、風乾した。
で洗浄したナイロン膜（シュライヒャー・アンド・シュ
ール、Schleicher ＆ Schuell、社製Nytran）に移しと
った後、該膜を0.5M水酸化ナトリウム−1.5M塩化ナトリ
ウムを染み込ませた濾紙上に５分間静置した。さらに、
該膜を1.5M塩化ナトリウム−0.5M Tris・HCl（pH8.0）
を染み込ませた濾紙上に２分間づつ２回、２倍濃度のSS
Cを染み込ませた濾紙上に２分間づつ２回静置後、80℃
で30分間乾燥させた。乾燥させた該膜を、0.1％SDSを含
む２倍濃度のSSCで洗浄した後、２倍濃度のSSCで洗浄
し、風乾した。
実施例２（１）で得られたDIG化プローブおよび、ベ
ーリンガー マンハイム社製のDIG Luminescent Detect
ion Kitを用いて、実施例２（２）記載の方法に従って
検出を行った結果、目的とするクローンを有するポジテ
ィブプラークを１つ検出した。
ーリンガー マンハイム社製のDIG Luminescent Detect
ion Kitを用いて、実施例２（２）記載の方法に従って
検出を行った結果、目的とするクローンを有するポジテ
ィブプラークを１つ検出した。
（６）クローンの確認
該ポジティブプラークの周辺約１平方センチを切りだ
し、1mlのSM（5.8g/l塩化ナトリウム、2g/l塩化マグネ
シウム、0.01％ゼラチン、50mM Tris・HCl、pH7.5）お
よび20μｌのクロロホルムを添加し充分に撹拌後、遠心
分離し、得られた上清をファージ抽出液とした。
し、1mlのSM（5.8g/l塩化ナトリウム、2g/l塩化マグネ
シウム、0.01％ゼラチン、50mM Tris・HCl、pH7.5）お
よび20μｌのクロロホルムを添加し充分に撹拌後、遠心
分離し、得られた上清をファージ抽出液とした。
配列番号５に記載の塩基配列の13〜32に対応する配列
番号６記載のセンス鎖DNAプライマーと、配列番号５に
記載の塩基配列の53〜71に対応する配列番号７記載のア
ンチセンス鎖DNAプライマー（但し配列番号５記載の66
番目の塩基に対応する塩基をＧとした）をアプライド・
バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製380A・DN
A合成機を用いて合成した。
番号６記載のセンス鎖DNAプライマーと、配列番号５に
記載の塩基配列の53〜71に対応する配列番号７記載のア
ンチセンス鎖DNAプライマー（但し配列番号５記載の66
番目の塩基に対応する塩基をＧとした）をアプライド・
バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製380A・DN
A合成機を用いて合成した。
上記のファージ抽出液５μｌおよび配列番号６記載の
センス鎖DNAプライマーと配列番号７記載のアンチセン
ス鎖DNAプライマーを用い、実施例１（３）記載の方法
に準じPCRを行い、59bp DNA断片を得た。このDNA断片
を、12.5％ポリアクリルアミド電気泳動で解析し、目的
とするクローンであることを確認した。
センス鎖DNAプライマーと配列番号７記載のアンチセン
ス鎖DNAプライマーを用い、実施例１（３）記載の方法
に準じPCRを行い、59bp DNA断片を得た。このDNA断片
を、12.5％ポリアクリルアミド電気泳動で解析し、目的
とするクローンであることを確認した。
実施例２（４）に示したパッケージング液の代わり
に、上記ファージ抽出液を用い、再度実施例２（４）〜
（６）を繰り返し、目的とするクローンを純化した。
に、上記ファージ抽出液を用い、再度実施例２（４）〜
（６）を繰り返し、目的とするクローンを純化した。
（７）ファージDNAのin vivo切除（excision）によるプ
ラスミッド化 実施例２（６）で得た抽出液中のファージDNAのin vi
vo切除によるプラスミッド化を、STRATAGENE社製のUndi
gested λZAPII Cloning Kitを用い、添付の説明書記載
の方法に従い、以下の様に行った。
ラスミッド化 実施例２（６）で得た抽出液中のファージDNAのin vi
vo切除によるプラスミッド化を、STRATAGENE社製のUndi
gested λZAPII Cloning Kitを用い、添付の説明書記載
の方法に従い、以下の様に行った。
実施例２（４）の方法に準じ、E.coli XL1−Blue MR
F'株を0.2％（w/v）マルトースおよび10mM硫酸マグネシ
ウムを含むLB培地3mlに植菌し、30℃、16時間培養し
た。培養後、遠心分離し、得られた菌体を、600nmにお
ける吸光度が約1.0なるように、10mM硫酸マグネシウム
溶液に懸濁した。この菌液200μｌに、実施例２（６）
で得たファージ抽出液100μｌおよびExAssist helper p
hage（STRATAGENE社製）１μｌを加え37℃で15分間イン
キュベートした。これに3mlの2xYT（10g塩化ナトリウ
ム、10gイーストエキストラクト、16gバクトトリプトン
を１リッターの蒸留水に溶解し、120℃、20分間滅菌し
たもの）を加え、37℃で２時間振とうした。これを70
℃、20分間加熱後、遠心分離し上清を得た。該上清１μ
ｌをE.coli XL1−Blue MRF'株と同様の方法で培養して
得たE.coli.SOLR株の懸濁液200μｌに加え、37℃、15分
間インキュベートした後、50μg/mlのアンピシリンを含
むLB寒天培地に塗布し、37℃、一晩インキュベートし
た。寒天培地上に生育してきたコロニーの中から、ファ
ージ抽出液の代わりに、該コロニーを用いる以外は、実
施例２（６）記載の方法に準じ、ポジティブコロニーを
選択した。
F'株を0.2％（w/v）マルトースおよび10mM硫酸マグネシ
ウムを含むLB培地3mlに植菌し、30℃、16時間培養し
た。培養後、遠心分離し、得られた菌体を、600nmにお
ける吸光度が約1.0なるように、10mM硫酸マグネシウム
溶液に懸濁した。この菌液200μｌに、実施例２（６）
で得たファージ抽出液100μｌおよびExAssist helper p
hage（STRATAGENE社製）１μｌを加え37℃で15分間イン
キュベートした。これに3mlの2xYT（10g塩化ナトリウ
ム、10gイーストエキストラクト、16gバクトトリプトン
を１リッターの蒸留水に溶解し、120℃、20分間滅菌し
たもの）を加え、37℃で２時間振とうした。これを70
℃、20分間加熱後、遠心分離し上清を得た。該上清１μ
ｌをE.coli XL1−Blue MRF'株と同様の方法で培養して
得たE.coli.SOLR株の懸濁液200μｌに加え、37℃、15分
間インキュベートした後、50μg/mlのアンピシリンを含
むLB寒天培地に塗布し、37℃、一晩インキュベートし
た。寒天培地上に生育してきたコロニーの中から、ファ
ージ抽出液の代わりに、該コロニーを用いる以外は、実
施例２（６）記載の方法に準じ、ポジティブコロニーを
選択した。
このようにして得たポジティブコロニーより、常法に
従ってプラスミッドを抽出し、その構造を制限酵素消化
により確認した。得られたプラスミッドpRH71は、pBlue
script SK（−）のXho I部位に約5.5kbのXho I切断DNA
断片が挿入された構造を有していた（第１図）。
従ってプラスミッドを抽出し、その構造を制限酵素消化
により確認した。得られたプラスミッドpRH71は、pBlue
script SK（−）のXho I部位に約5.5kbのXho I切断DNA
断片が挿入された構造を有していた（第１図）。
（８）塩基配列の決定
上記で得られたpRH71に挿入されている約5.5kbのXho
I断片より、約2.4kbのSac I−Xho I断片（第１図中Xho
I−１およびSac I−１で切断される断片）と、約2kbのS
al I断片（第１図中Sal I−１およびSal I−２で切断さ
れる断片）をそれぞれ制限酵素で切断後取得し、pBlues
cript II KS（＋）のSac I−Xho I切断部位およびSal I
切断部位にそれぞれサブクローン化、プラスミッドpYan
10およびpYan13を得た（第１図）。
I断片より、約2.4kbのSac I−Xho I断片（第１図中Xho
I−１およびSac I−１で切断される断片）と、約2kbのS
al I断片（第１図中Sal I−１およびSal I−２で切断さ
れる断片）をそれぞれ制限酵素で切断後取得し、pBlues
cript II KS（＋）のSac I−Xho I切断部位およびSal I
切断部位にそれぞれサブクローン化、プラスミッドpYan
10およびpYan13を得た（第１図）。
宝酒造社製キロシークエンス用デレーションキットを
用いて、pYan10より欠失変異プラスミッドを作成した。
具体的な試薬および方法は、キットに添付の説明書に従
った。
用いて、pYan10より欠失変異プラスミッドを作成した。
具体的な試薬および方法は、キットに添付の説明書に従
った。
次に、アプライドバイオシステムズ社製の塩基配列決
定キット（Taq DyeDeoxyTM Terminator Cycle Sequenci
ng Kit）を用いて、該欠失プラスミッド中の約2.4kbのS
ac I−Xho I断片の塩基配列を決定した。
定キット（Taq DyeDeoxyTM Terminator Cycle Sequenci
ng Kit）を用いて、該欠失プラスミッド中の約2.4kbのS
ac I−Xho I断片の塩基配列を決定した。
pYan13についても同様に、欠失変異プラスミッドを作
成後、塩基配列の分析を行い、約2kbのSal I断片中のSa
l I−Sac I断片（第１図中Sal I−１およびSac I−２で
切断される断片）の塩基配列を決定した。
成後、塩基配列の分析を行い、約2kbのSal I断片中のSa
l I−Sac I断片（第１図中Sal I−１およびSac I−２で
切断される断片）の塩基配列を決定した。
Sac I−Xho I断片（第１図中Xho I−１およびSac I−
２で切断される断片）2707bの塩基配列を配列番号８に
示した。
２で切断される断片）2707bの塩基配列を配列番号８に
示した。
このようにして決定された塩基配列には、配列番号１
に示された272アミノ酸から構成されるタンパク質をコ
ードする配列番号２に示した塩基配列（配列番号８の塩
基番号264から1079に対応）が存在していた。このアミ
ノ酸配列中には、精製Ｌ−プロリン４位水酸化酵素を用
いて決定された配列番号１に示されるＮ末端アミノ酸配
列が含まれており、取得した約5.5kbのXho I断片中に目
的とするＬ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子が存在する
ことが確認された。
に示された272アミノ酸から構成されるタンパク質をコ
ードする配列番号２に示した塩基配列（配列番号８の塩
基番号264から1079に対応）が存在していた。このアミ
ノ酸配列中には、精製Ｌ−プロリン４位水酸化酵素を用
いて決定された配列番号１に示されるＮ末端アミノ酸配
列が含まれており、取得した約5.5kbのXho I断片中に目
的とするＬ−プロリン４位水酸化酵素遺伝子が存在する
ことが確認された。
実施例３ Ｌ−プロリン４位水酸化酵素発現プラスミッ
ドの構築 （１）trpプロモーター（Ptrp）を用いた発現プラスミ
ッドの構築 配列番号９記載のセンス鎖DNAプライマーと、配列番
号10に記載のアンチセンス鎖DNAプライマーをアプライ
ド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製380A
・DNA合成機を用いて合成した。該合成DNAをプライマー
として、pRH71を鋳型としてPCRを行った。反応は、pRH7
1を0.1μｇ、センス鎖およびアンチセンス鎖DNAプライ
マー各２μＭを含む反応液20μｌを用い、実施例１と同
様に行った。反応は、96℃、５分間のインキュベーショ
ン後、96℃−２分間、58℃−１分間、75℃−１分間のイ
ンキュベーション工程を30回繰り返した。反応液をアガ
ロースゲル電気泳動にかけ、Ｌ−プロリン４位水酸化酵
素の構造遺伝子をコードする844bpの増幅断片が生成さ
れていることを確認後、アガロースゲルより該増幅断片
を常法により抽出し、バイオラッド社製のPrep−Ａ−ge
neを用いて断片を回収した。回収した844bpのDNA断片の
両末端をHind IIIおよびBamH Iで切断後、エタノール沈
殿法により、エタノール沈殿を得た。該エタノール沈殿
を５μｌのTEに溶解した。
ドの構築 （１）trpプロモーター（Ptrp）を用いた発現プラスミ
ッドの構築 配列番号９記載のセンス鎖DNAプライマーと、配列番
号10に記載のアンチセンス鎖DNAプライマーをアプライ
ド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製380A
・DNA合成機を用いて合成した。該合成DNAをプライマー
として、pRH71を鋳型としてPCRを行った。反応は、pRH7
1を0.1μｇ、センス鎖およびアンチセンス鎖DNAプライ
マー各２μＭを含む反応液20μｌを用い、実施例１と同
様に行った。反応は、96℃、５分間のインキュベーショ
ン後、96℃−２分間、58℃−１分間、75℃−１分間のイ
ンキュベーション工程を30回繰り返した。反応液をアガ
ロースゲル電気泳動にかけ、Ｌ−プロリン４位水酸化酵
素の構造遺伝子をコードする844bpの増幅断片が生成さ
れていることを確認後、アガロースゲルより該増幅断片
を常法により抽出し、バイオラッド社製のPrep−Ａ−ge
neを用いて断片を回収した。回収した844bpのDNA断片の
両末端をHind IIIおよびBamH Iで切断後、エタノール沈
殿法により、エタノール沈殿を得た。該エタノール沈殿
を５μｌのTEに溶解した。
Ptrpを含むプラスミッドpTrS30 DNAをHind IIIおよび
BamH Iで切断した。該切断部位に、Hind IIIおよびBamH
I処理した上記のＬ−プロリン４位水酸化酵素構造遺伝
子断片を、宝酒造社製のライゲーションキットを用い
て、挿入した。得られたプラスミドを用い、E.coli XL1
−Blue MRF'株を常法にしたがって形質転換し、該形質
転換体を50μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗
布後、37℃で一晩培養した。生育してきた形質転換体の
コロニーより常法に従ってプラスミッドを抽出し、その
構造を制限酵素消化により確認した。
BamH Iで切断した。該切断部位に、Hind IIIおよびBamH
I処理した上記のＬ−プロリン４位水酸化酵素構造遺伝
子断片を、宝酒造社製のライゲーションキットを用い
て、挿入した。得られたプラスミドを用い、E.coli XL1
−Blue MRF'株を常法にしたがって形質転換し、該形質
転換体を50μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗
布後、37℃で一晩培養した。生育してきた形質転換体の
コロニーより常法に従ってプラスミッドを抽出し、その
構造を制限酵素消化により確認した。
上記の結果、Ptrpの転写方向と同方向にＬ−プロリン
４位水酸化酵素の構造遺伝子をコードするDNA断片が挿
入されたプラスミッドpTr14（第２図）を得た。
４位水酸化酵素の構造遺伝子をコードするDNA断片が挿
入されたプラスミッドpTr14（第２図）を得た。
（２）tacプロモーター（Ptac）を用いた発現プラスミ
ッドの構築 実施例３（１）と同様の方法で、Ptacを用いた発現プ
ラスミッドを構築した。
ッドの構築 実施例３（１）と同様の方法で、Ptacを用いた発現プ
ラスミッドを構築した。
配列番号11記載のセンス鎖DNAプライマーと配列番号1
2に記載のアンチセンス鎖DNAプライマーを合成し、該合
成DNAをプライマーとして、pRH71を鋳型としてPCRを行
い、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素の構造遺伝子をコード
する846bpの増幅断片を得た。この断片をEcoR I及びHin
d III切断後、Ptacを含むプラスミッドpBTacl（ベーリ
ンガーマンハイム社製）のEcoR I−Hind III切断部位に
挿入し、E.coli XL1−Blue MRF'株に形質転換した。
2に記載のアンチセンス鎖DNAプライマーを合成し、該合
成DNAをプライマーとして、pRH71を鋳型としてPCRを行
い、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素の構造遺伝子をコード
する846bpの増幅断片を得た。この断片をEcoR I及びHin
d III切断後、Ptacを含むプラスミッドpBTacl（ベーリ
ンガーマンハイム社製）のEcoR I−Hind III切断部位に
挿入し、E.coli XL1−Blue MRF'株に形質転換した。
得られた形質転換体から、Ptacの転写方向と同方向に
Ｌ−プロリン４位水酸化酵素の構造遺伝子をコードする
DNA断片が挿入されたプラスミッドpTc4OHを得た（第３
図）。
Ｌ−プロリン４位水酸化酵素の構造遺伝子をコードする
DNA断片が挿入されたプラスミッドpTc4OHを得た（第３
図）。
（３）Ptrp×２を用いた発現プラスミドの構築
実施例３（１）と同様の方法により、Ｌ−プロリン４
位水酸化酵素の構造遺伝子をコードする増幅断片を回収
し、制限酵素処理後、エタノール沈殿法によりエタノー
ル沈殿を得た。該エタノール沈殿を５μｌのTEの溶解し
た。
位水酸化酵素の構造遺伝子をコードする増幅断片を回収
し、制限酵素処理後、エタノール沈殿法によりエタノー
ル沈殿を得た。該エタノール沈殿を５μｌのTEの溶解し
た。
pBR322を基本とし、Ptrpを２つ直列させたロモーター
Ptrp×２を持つプラスミドpKYP200と合成リンカーを組
み合わせて作製されたATGベクターpTrS32 DNAをHind II
IおよびBamH Iで切断した。該切断部位に、Hind IIIお
よびBamH Iで切断処理した上記のＬ−プロリン４位水酸
化酵素構造遺伝子断片を、宝酒造社製のライゲーション
キットを用いて、挿入した。
Ptrp×２を持つプラスミドpKYP200と合成リンカーを組
み合わせて作製されたATGベクターpTrS32 DNAをHind II
IおよびBamH Iで切断した。該切断部位に、Hind IIIお
よびBamH Iで切断処理した上記のＬ−プロリン４位水酸
化酵素構造遺伝子断片を、宝酒造社製のライゲーション
キットを用いて、挿入した。
得られたプラスミドを用い、E.coli XL1−Blue MRF'
株を常法に従って形質転換し、該形質転換体を50μg/ml
のアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布後、37℃で１晩
培養した。生育してきた形質転換体のコロニーより常法
に従ってプラスミドを抽出し、その構造を制限酵素消化
により確認した。構造遺伝子部分についてはアプライド
バイオシステムズ社製の塩基配列決定キット（Taq DyeD
eoxyTM Terminator Cycle Sequencing Kit）を用いて、
塩基配列を決定し、配列番号２で示した塩基配列である
ことを確認した。
株を常法に従って形質転換し、該形質転換体を50μg/ml
のアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布後、37℃で１晩
培養した。生育してきた形質転換体のコロニーより常法
に従ってプラスミドを抽出し、その構造を制限酵素消化
により確認した。構造遺伝子部分についてはアプライド
バイオシステムズ社製の塩基配列決定キット（Taq DyeD
eoxyTM Terminator Cycle Sequencing Kit）を用いて、
塩基配列を決定し、配列番号２で示した塩基配列である
ことを確認した。
該方法により、Ptrp×２の転写方向と同方向にＬ−プ
ロリン４位水酸化酵素の構造遺伝子をコードするDNA断
片が挿入されたプラスミドpTr2−4OH（第４図）を得
た。
ロリン４位水酸化酵素の構造遺伝子をコードするDNA断
片が挿入されたプラスミドpTr2−4OH（第４図）を得
た。
配列番号13記載のDNAと配列番号14記載のDNAをアプラ
イド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製38
0A・DNA合成機を用いて合成した。該合成DNAの3'末端25
bpは互いに相補的な配列となるように設計されている。
さらに、該合成DNAには、Dactylosporangium sp.RH1由
来のＬ−プロリン４位水酸化酵素蛋白のＮ末端部分をコ
ードする塩基配列が含有されているが、該塩基配列に
は、Dactylosporangium Ps.RH1由来の塩基配列を、大腸
菌での発現に最適なコドンとなるように部位特異的な塩
基置換がほどこされている。
イド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製38
0A・DNA合成機を用いて合成した。該合成DNAの3'末端25
bpは互いに相補的な配列となるように設計されている。
さらに、該合成DNAには、Dactylosporangium sp.RH1由
来のＬ−プロリン４位水酸化酵素蛋白のＮ末端部分をコ
ードする塩基配列が含有されているが、該塩基配列に
は、Dactylosporangium Ps.RH1由来の塩基配列を、大腸
菌での発現に最適なコドンとなるように部位特異的な塩
基置換がほどこされている。
該合成DNAをプライマーかつ鋳型としてPCRを行った。
反応はPfu DNAポリメラーゼ（STRATAGENE社製）0.5U、P
fu DNAポリメラーゼ用×10緩衝液（STRATAGENE社製）２
μｌ、DMSO 2μｌ、各2.5mM dNTP液１μｌ、配列番号13
記載の合成DNAと配列番号14記載の合成DNA各２μＭを含
む反応液20μｌを用いて行った。反応は96℃、５分間の
インキュベーションの後、96℃−２分間、50℃−１分
間、75℃−１分間のインキュベーション工程を35回繰り
返した。該反応液を、15％ポリアクリルアミドゲル電気
泳動にかけ、107bpの増幅断片の生成を確認し、ゲルよ
り実施例１（３）と同様の操作により該断片を回収し
た。回収した107bpのDNA断片の両末端をHind IIIおよび
Sal Iで切断後、Bio,Inc.製MERmaid Kitを用いて回収し
た。回収液量は16μｌとなった。
反応はPfu DNAポリメラーゼ（STRATAGENE社製）0.5U、P
fu DNAポリメラーゼ用×10緩衝液（STRATAGENE社製）２
μｌ、DMSO 2μｌ、各2.5mM dNTP液１μｌ、配列番号13
記載の合成DNAと配列番号14記載の合成DNA各２μＭを含
む反応液20μｌを用いて行った。反応は96℃、５分間の
インキュベーションの後、96℃−２分間、50℃−１分
間、75℃−１分間のインキュベーション工程を35回繰り
返した。該反応液を、15％ポリアクリルアミドゲル電気
泳動にかけ、107bpの増幅断片の生成を確認し、ゲルよ
り実施例１（３）と同様の操作により該断片を回収し
た。回収した107bpのDNA断片の両末端をHind IIIおよび
Sal Iで切断後、Bio,Inc.製MERmaid Kitを用いて回収し
た。回収液量は16μｌとなった。
プラスミドpTr2−4OHDNAをBamH IおよびPvu IIで切断
した。反応液をアガロースゲル電気泳動にかけ、２つの
断片が生成していることを確認した。そして、Ｌ−プロ
リン水酸化酵素の構造遺伝子を含む断片の方をバイオラ
ッド社製のPrep−Ａ−geneを用いて回収し、宝酒造社製
のブランティングキットを用いて末端を平滑化した後、
宝酒造社製のライゲーションキットを用いて連結環状化
した。得られたプラスミドを用い、E.coli.JM109株を常
法に従って形質転換し、該形質転換体を50μg/mlのアン
ピシリンを含むLB寒天培地に塗布後、37℃で１晩培養し
た。生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従っ
てプラスミドを抽出し、その構造を制限酵素消化により
確認した。以上の結果、pTr2−4OHの一部の配列を削除
したプラスミドpTr2−4OHΔ（第５図）を得た。
した。反応液をアガロースゲル電気泳動にかけ、２つの
断片が生成していることを確認した。そして、Ｌ−プロ
リン水酸化酵素の構造遺伝子を含む断片の方をバイオラ
ッド社製のPrep−Ａ−geneを用いて回収し、宝酒造社製
のブランティングキットを用いて末端を平滑化した後、
宝酒造社製のライゲーションキットを用いて連結環状化
した。得られたプラスミドを用い、E.coli.JM109株を常
法に従って形質転換し、該形質転換体を50μg/mlのアン
ピシリンを含むLB寒天培地に塗布後、37℃で１晩培養し
た。生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従っ
てプラスミドを抽出し、その構造を制限酵素消化により
確認した。以上の結果、pTr2−4OHの一部の配列を削除
したプラスミドpTr2−4OHΔ（第５図）を得た。
プラスミドpTr2−4OHDNAをHind IIIおよびSal Iで切
断した。該切断部位に、Hind IIIおよびSal I処理した
上記PCR増幅断片を、宝酒造社製のライゲーションキッ
トを用いて、挿入した。得られたプラスミドを用い、E.
coli XL1−Blue MRF'株を常法に従って形質転換し、該
形質転換体を50μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地
に塗布後、37℃で１晩培養した。生育してきた形質転換
体のコロニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、そ
の構造を制限酵素消化により確認した。PCR増幅断片挿
入部分についてはアプライドバイオシステムズ社製の塩
基配列決定キット（Taq DyeDeoxyTM Terminator Cycle
Sequencing Kit）を用いて、塩基配列を決定した。配列
番号15で示した塩基配列が確認された。
断した。該切断部位に、Hind IIIおよびSal I処理した
上記PCR増幅断片を、宝酒造社製のライゲーションキッ
トを用いて、挿入した。得られたプラスミドを用い、E.
coli XL1−Blue MRF'株を常法に従って形質転換し、該
形質転換体を50μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地
に塗布後、37℃で１晩培養した。生育してきた形質転換
体のコロニーより常法に従ってプラスミドを抽出し、そ
の構造を制限酵素消化により確認した。PCR増幅断片挿
入部分についてはアプライドバイオシステムズ社製の塩
基配列決定キット（Taq DyeDeoxyTM Terminator Cycle
Sequencing Kit）を用いて、塩基配列を決定した。配列
番号15で示した塩基配列が確認された。
上記の結果、Ptrp×２の転写方向と同方向に、構造遺
伝子のＮ末端のSal I部位までがDactylosporangium sp.
RH1由来の塩基配列とは一部異なるが、Dactylosporangi
um sp.RH1由来のＬ−プロリン４位水酸化酵素とまった
く同じアミノ酸配列をコードする構造遺伝子DNA断片が
挿入されたプラスミドpWFH1（第６図）を得た。
伝子のＮ末端のSal I部位までがDactylosporangium sp.
RH1由来の塩基配列とは一部異なるが、Dactylosporangi
um sp.RH1由来のＬ−プロリン４位水酸化酵素とまった
く同じアミノ酸配列をコードする構造遺伝子DNA断片が
挿入されたプラスミドpWFH1（第６図）を得た。
実施例４ 形質転換体によるＬ−プロリン４位水酸化酵
素の生産 実施例３で得たプラスミッドpTr14、pTc4OHおよびpWF
H1を用いて、E.coli ATCC12435を形質転換し、形質転換
体、E.coli ATCC12435/pTr14、E.coli ATCC12435/pTc4O
H、E.coli ATCC12435/pWFH1を取得した。E.coli ATCC12
435/pTr14およびE.coli ATCC12435/pTc4OH株を各々50μ
g/mlのアンピシリンを含む3ml LB培地に植菌し30℃、
一晩振とう培養した。
素の生産 実施例３で得たプラスミッドpTr14、pTc4OHおよびpWF
H1を用いて、E.coli ATCC12435を形質転換し、形質転換
体、E.coli ATCC12435/pTr14、E.coli ATCC12435/pTc4O
H、E.coli ATCC12435/pWFH1を取得した。E.coli ATCC12
435/pTr14およびE.coli ATCC12435/pTc4OH株を各々50μ
g/mlのアンピシリンを含む3ml LB培地に植菌し30℃、
一晩振とう培養した。
形質転換体E.coli ATCC12435/pWFH1はアンピシリン10
0μg/mlを含む50mL Med4培地〔ポリペプトン（日本製
薬）１％、イーストエキストラクト（Difco）0.5％、Na
Cl1％〕に植菌し、30℃で16時間振とう培養し、さら
に、該培養液を種培養液とし、２リッターのMed6培地
（グルコース２％、硫酸アンモニウム１％、K2HPO40.1
％、NaCl0.2％、MgSO40.05％、FeSO40.0278％、CaCl20.
0015％、ポリペプトン0.4％）を入れた５リッタージャ
ーファーメンターに植菌後、Ｌ−Proを200mM添加し、培
養温度30℃、撹拌数400回転／分、通気量１リッター／
培養液１リッター／分という条件で48〜72時間培養し
た。
0μg/mlを含む50mL Med4培地〔ポリペプトン（日本製
薬）１％、イーストエキストラクト（Difco）0.5％、Na
Cl1％〕に植菌し、30℃で16時間振とう培養し、さら
に、該培養液を種培養液とし、２リッターのMed6培地
（グルコース２％、硫酸アンモニウム１％、K2HPO40.1
％、NaCl0.2％、MgSO40.05％、FeSO40.0278％、CaCl20.
0015％、ポリペプトン0.4％）を入れた５リッタージャ
ーファーメンターに植菌後、Ｌ−Proを200mM添加し、培
養温度30℃、撹拌数400回転／分、通気量１リッター／
培養液１リッター／分という条件で48〜72時間培養し
た。
培養中、グルコースは無くならぬように、Ｌ−プロリ
ンは約50mMとなるように適時添加し、NH4OHを用いて、p
H6.5に下限コントロールした。
ンは約50mMとなるように適時添加し、NH4OHを用いて、p
H6.5に下限コントロールした。
上記形質転換体の培養により得られた培養液を遠心分
離し、菌体を取得した。
離し、菌体を取得した。
該菌体のＬ−プロリン４位水酸化酵素活性を下記条件
下で測定した。該菌体は必要に応じて−20℃で凍結保存
することが可能で、使用時に解凍し酵素活性の測定に用
いることができる。
下で測定した。該菌体は必要に応じて−20℃で凍結保存
することが可能で、使用時に解凍し酵素活性の測定に用
いることができる。
反応液〔240mMのMES緩衝液（pH6.5）中に、12mM L−
プロリン、24mM 2−ケトグルタル酸、4mM硫酸第一鉄お
よび8mM L−アスコルビン酸を含有する〕250μｌに湿菌
体量として４％（w/v）となるように加え、35℃で10分
間反応した。反応液を100℃、２分間加熱することによ
り反応を停止した。
プロリン、24mM 2−ケトグルタル酸、4mM硫酸第一鉄お
よび8mM L−アスコルビン酸を含有する〕250μｌに湿菌
体量として４％（w/v）となるように加え、35℃で10分
間反応した。反応液を100℃、２分間加熱することによ
り反応を停止した。
該反応停止液を遠心分離し、得られた上清100μｌ
に、0.3Mホウ酸緩衝液（pH10.7）100μｌ、10％（v/v）
メルカプトエタノール水溶液４μｌおよび５％（w/v）
ｏ−フタルアルデヒドのエタノール溶液16μｌを添加し
60℃で30秒間放置後、２％（w/v）NBDのエタノール溶液
50μｌを加え、60℃で40分間反応した。該反応液に1N塩
酸30μｌを加えて反応を停止した。該反応停止液を遠心
分離後、フィルター濾過し、沈殿を除去した後、高速液
体クロマトグラフィーにより分析を行い、生成したトラ
ンス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを定量した。
に、0.3Mホウ酸緩衝液（pH10.7）100μｌ、10％（v/v）
メルカプトエタノール水溶液４μｌおよび５％（w/v）
ｏ−フタルアルデヒドのエタノール溶液16μｌを添加し
60℃で30秒間放置後、２％（w/v）NBDのエタノール溶液
50μｌを加え、60℃で40分間反応した。該反応液に1N塩
酸30μｌを加えて反応を停止した。該反応停止液を遠心
分離後、フィルター濾過し、沈殿を除去した後、高速液
体クロマトグラフィーにより分析を行い、生成したトラ
ンス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを定量した。
高速液体クロマトグラフィーは以下の条件で行った。
移動相:10mM クエン酸（pH4.0）／メタノール＝3/1
（v/v） 流速:1ml/分 カラム:YMC Pack ODS AQ−312（YMC社製、6x150mm） カラム温度:50℃ 検出：蛍光検出、励起波長503nm、蛍光波長541nm 第１表に示したように、形質転換体は、遺伝子源とし
て用いたダクチロスポランジウムエスピーRH1株と比較
して、菌体あたり210〜1420倍のＬ−プロリン４位水酸
化酵素を生産していた。
（v/v） 流速:1ml/分 カラム:YMC Pack ODS AQ−312（YMC社製、6x150mm） カラム温度:50℃ 検出：蛍光検出、励起波長503nm、蛍光波長541nm 第１表に示したように、形質転換体は、遺伝子源とし
て用いたダクチロスポランジウムエスピーRH1株と比較
して、菌体あたり210〜1420倍のＬ−プロリン４位水酸
化酵素を生産していた。
実施例５ 融合蛋白発現プラスミッドの構築
（１）β−ガラクトシダーゼ蛋白断片との融合蛋白発現
プラスミッドの構築 プラスミッドpBluescript II KS（＋）DNA 2.4μｇ
に、制限酵素EcoR Vを添加し、該DNAを切断後、エタノ
ール沈殿法により、エタノール沈殿を得た。該エタノー
ル沈殿を５μｌのTEに溶解した。
プラスミッドの構築 プラスミッドpBluescript II KS（＋）DNA 2.4μｇ
に、制限酵素EcoR Vを添加し、該DNAを切断後、エタノ
ール沈殿法により、エタノール沈殿を得た。該エタノー
ル沈殿を５μｌのTEに溶解した。
プラスミッドpRH71 DNA 4μｇに、制限酵素Sac Iを添
加し、該DNAを切断後、上記と同様の方法でエタノール
沈殿を得た。該エタノール沈殿（DNA断片）を36μｌのT
Eに溶解後、宝酒造社製Takara DNA Blunting Kitを用い
て、該DNA断片の両末端をブラント化した。該処理DNAを
アガロースゲル電気泳動にかけ、ゲルより約2.4kbのDNA
断片を常法により抽出し、バイオラッド社製のPrep−Ａ
−geneを用いて回収した。回収した該DNAをXba Iで切断
し、上記と同様の方法でエタノール沈殿を得た。該エタ
ノール沈殿を10μｌのTEに溶解した。
加し、該DNAを切断後、上記と同様の方法でエタノール
沈殿を得た。該エタノール沈殿（DNA断片）を36μｌのT
Eに溶解後、宝酒造社製Takara DNA Blunting Kitを用い
て、該DNA断片の両末端をブラント化した。該処理DNAを
アガロースゲル電気泳動にかけ、ゲルより約2.4kbのDNA
断片を常法により抽出し、バイオラッド社製のPrep−Ａ
−geneを用いて回収した。回収した該DNAをXba Iで切断
し、上記と同様の方法でエタノール沈殿を得た。該エタ
ノール沈殿を10μｌのTEに溶解した。
上記のEcoR V−Xba I切断したpBluescript II KS
（＋）DNAと、Sac I切断後ブラント化しXba I切断し回
収したDNAとを、宝酒造社製Takara Ligation Kitを用い
て連結した。
（＋）DNAと、Sac I切断後ブラント化しXba I切断し回
収したDNAとを、宝酒造社製Takara Ligation Kitを用い
て連結した。
該連結DNAを用い、E.coli XL2−Blue MRF'株（STRATA
GENE社製）を形質転換後、該形質転換株を50μg/mlのア
ンピシリン、0.2mM IPTG、40μg/ml X−Galを含むLB寒
天培地に塗布し、37℃で一晩培養した。
GENE社製）を形質転換後、該形質転換株を50μg/mlのア
ンピシリン、0.2mM IPTG、40μg/ml X−Galを含むLB寒
天培地に塗布し、37℃で一晩培養した。
生育してきたコロニーより常法に従ってプラスミッド
を抽出し、その構造を制限酵素消化により確認した。
を抽出し、その構造を制限酵素消化により確認した。
更に、該プラスミッドを鋳型、配列番号16記載のDNA
をセンス鎖プライマー、配列番号７記載のDNAをアンチ
センス鎖プライマーとして、PCRを行った。該反応によ
り、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素のＮ末アミノ酸配列に
対応する50bpのDNA断片が生成されたことより、プラス
ミドに目的とするＬ−プロリン４位水酸化酵素の構造遺
伝子が挿入されていることを確認した。
をセンス鎖プライマー、配列番号７記載のDNAをアンチ
センス鎖プライマーとして、PCRを行った。該反応によ
り、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素のＮ末アミノ酸配列に
対応する50bpのDNA断片が生成されたことより、プラス
ミドに目的とするＬ−プロリン４位水酸化酵素の構造遺
伝子が挿入されていることを確認した。
上記の方法により、lacプロモーターの転写方向と同
方向にＬ−プロリン４位水酸化酵素の構造遺伝子がβ−
GalのＮ末34アミノ酸と融合した形で挿入されたプラス
ミッドpES1−23aを得た（第７図）。構築した融合蛋白
アミノ酸配列を配列番号18に示す。
方向にＬ−プロリン４位水酸化酵素の構造遺伝子がβ−
GalのＮ末34アミノ酸と融合した形で挿入されたプラス
ミッドpES1−23aを得た（第７図）。構築した融合蛋白
アミノ酸配列を配列番号18に示す。
（２）マルトース結合蛋白との融合蛋白発現プラスミッ
ドの構築 配列番号17記載のDNAをセンス鎖プライマー、配列番
号12に記載のDNAをアンチセンス鎖プライマー、pRH71を
鋳型として、実施例１（３）の方法に準じ、PCRを行っ
た。即ち、pRH71を0.1μｇ、センス鎖およびアンチセン
ス鎖DNAプライマー各２μＭを含む反応液20μｌを用
い、96℃で５分間インキュベーションした後、96℃−２
分間、58℃−１分間、75℃−１分間のインキュベーショ
ン工程を30回繰り返した。
ドの構築 配列番号17記載のDNAをセンス鎖プライマー、配列番
号12に記載のDNAをアンチセンス鎖プライマー、pRH71を
鋳型として、実施例１（３）の方法に準じ、PCRを行っ
た。即ち、pRH71を0.1μｇ、センス鎖およびアンチセン
ス鎖DNAプライマー各２μＭを含む反応液20μｌを用
い、96℃で５分間インキュベーションした後、96℃−２
分間、58℃−１分間、75℃−１分間のインキュベーショ
ン工程を30回繰り返した。
該反応液をアガロースゲル電気泳動にかけた後、Ｌ−
プロリン４位水酸化酵素の構造遺伝子をコードする833b
pの増幅断片を常法により抽出し、バイオラッド社のPre
p−Ａ−geneを用いて該DNA断片を回収した。回収した83
3bpのDNA断片をHind IIIで切断後、エタノール沈殿法に
より、エタノール沈殿を得た。該エタノール沈殿を５μ
ｌのTEに溶解し、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素構造遺伝
子断片として用いた。
プロリン４位水酸化酵素の構造遺伝子をコードする833b
pの増幅断片を常法により抽出し、バイオラッド社のPre
p−Ａ−geneを用いて該DNA断片を回収した。回収した83
3bpのDNA断片をHind IIIで切断後、エタノール沈殿法に
より、エタノール沈殿を得た。該エタノール沈殿を５μ
ｌのTEに溶解し、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素構造遺伝
子断片として用いた。
tacプロモーター（Ptac）制御下にマルトース結合蛋
白の構造遺伝子のみを有する（シグナル配列を持たな
い）プラスミッドpMAL−c2（NEW ENGLAND Biolabs社製P
ROTEIN FUSION ＆ PURIFICATION SYSTEM）をXmn Iおよ
びHind IIIで切断した。
白の構造遺伝子のみを有する（シグナル配列を持たな
い）プラスミッドpMAL−c2（NEW ENGLAND Biolabs社製P
ROTEIN FUSION ＆ PURIFICATION SYSTEM）をXmn Iおよ
びHind IIIで切断した。
上記Ｌ−プロリン４位水酸化酵素構造遺伝子断片をpM
AL−c2のXmn I−Hind III切断部位に宝酒造社製のDNAラ
イゲーションキットを用いて挿入し、E.coli XL2−Blue
MRF'株に常法にしたがって形質転換した。該形質転換
体を、50μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布
後、37℃で一晩培養した。このようにして得たコロニー
より常法に従ってプラスミッドを抽出し、その構造を制
限酵素消化により確認した。
AL−c2のXmn I−Hind III切断部位に宝酒造社製のDNAラ
イゲーションキットを用いて挿入し、E.coli XL2−Blue
MRF'株に常法にしたがって形質転換した。該形質転換
体を、50μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布
後、37℃で一晩培養した。このようにして得たコロニー
より常法に従ってプラスミッドを抽出し、その構造を制
限酵素消化により確認した。
上記の方法により、Ptac支配下、マルトース結合蛋白
の構造遺伝子と融合した形でＬ−プロリン４位水酸化酵
素の構造遺伝子をコードするDNA断片が挿入されたプラ
スミッドpMc4OHを得た（第８図）。構築した融合蛋白の
アミノ酸配列を配列番号19に示す。
の構造遺伝子と融合した形でＬ−プロリン４位水酸化酵
素の構造遺伝子をコードするDNA断片が挿入されたプラ
スミッドpMc4OHを得た（第８図）。構築した融合蛋白の
アミノ酸配列を配列番号19に示す。
実施例６ 融合蛋白発現プラスミッドを含む形質転換体
によるＬ−プロリン４位水酸化酵素の生産 実施例５で得たプラスミッドpES1−23aおよびpMc4OH
を用いて、E.coli DH1を形質転換した。実施例４に準じ
た方法で、得られた形質転換体の培養および該形質転換
体のＬ−プロリン４位水酸化酵素の生産性を調べた。た
だし、培養においては、IPTGを0.1mM添加した培地を用
いた。
によるＬ−プロリン４位水酸化酵素の生産 実施例５で得たプラスミッドpES1−23aおよびpMc4OH
を用いて、E.coli DH1を形質転換した。実施例４に準じ
た方法で、得られた形質転換体の培養および該形質転換
体のＬ−プロリン４位水酸化酵素の生産性を調べた。た
だし、培養においては、IPTGを0.1mM添加した培地を用
いた。
第２表に示したように、該形質転換体は、遺伝子源と
して用いたダクチロスポランジウムエスピーRH1株と比
較して、菌体あたり29〜298倍のＬ−プロリン４位水酸
化酵素を生産した。
して用いたダクチロスポランジウムエスピーRH1株と比
較して、菌体あたり29〜298倍のＬ−プロリン４位水酸
化酵素を生産した。
実施例７ 形質転換体によるトランス−４−ヒドロキシ
−Ｌ−プロリンの生産 （１） 形質転換体E.coli ATCC12435/pTr14を用いたト
ランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生産 実施例４で得た形質転換体E.coli ATCC12435/pTr14を
アンピシリン100μg/mlを含む3ml LB培地に植菌し、30
℃で16時間振とう培養した。該培養液を遠心分離し、得
られた上清中のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリ
ン量を定量した。
−Ｌ−プロリンの生産 （１） 形質転換体E.coli ATCC12435/pTr14を用いたト
ランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生産 実施例４で得た形質転換体E.coli ATCC12435/pTr14を
アンピシリン100μg/mlを含む3ml LB培地に植菌し、30
℃で16時間振とう培養した。該培養液を遠心分離し、得
られた上清中のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリ
ン量を定量した。
その結果、E.coli ATCC12435/pTr14の培養液上清中
に、381μＭ（50.0mg/l）のトランス−４−ヒドロキシ
−Ｌ−プロリンが生成していた。
に、381μＭ（50.0mg/l）のトランス−４−ヒドロキシ
−Ｌ−プロリンが生成していた。
一方、宿主として用いたE.coli ATCC12435の培養上清
中には遊離のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン
は検出されなかった。
中には遊離のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン
は検出されなかった。
（２）形質転換体E.coli ATCC12435/pWFH1を用いたトラ
ンス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生産 該形質転換体E.coli ATCC12435/pWFH1をアンピシリン
100μg/mlおよびグルコース２％を添加した50ml Med4培
地に植菌し、30℃で16時間振とう培養した。該培養液を
種培養液とし、ポリペプトンの代わりにペプトン0.8％
を添加した２リッターのMed6培地を入れた５リッタージ
ャーファーメンターに植菌した。培養温度33℃、撹拌数
400回転／分、通気量１リッター／培養液１リッター／
分という条件で運転した。
ンス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生産 該形質転換体E.coli ATCC12435/pWFH1をアンピシリン
100μg/mlおよびグルコース２％を添加した50ml Med4培
地に植菌し、30℃で16時間振とう培養した。該培養液を
種培養液とし、ポリペプトンの代わりにペプトン0.8％
を添加した２リッターのMed6培地を入れた５リッタージ
ャーファーメンターに植菌した。培養温度33℃、撹拌数
400回転／分、通気量１リッター／培養液１リッター／
分という条件で運転した。
培養中、グルコースを無くならぬように適時添加し、
NH4OHを用いて、pH6.5に下限コントロールした。
NH4OHを用いて、pH6.5に下限コントロールした。
該培養液を遠心分離し、得られた上清中のトランス−
４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを定量したところ、培養
52時間で10.7mM（1.4g/L）のトランス−４−ヒドロキシ
−Ｌ−プロリンがE.coli ATCC12435/pWFH1の培養液上清
中に生成蓄積していた。
４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを定量したところ、培養
52時間で10.7mM（1.4g/L）のトランス−４−ヒドロキシ
−Ｌ−プロリンがE.coli ATCC12435/pWFH1の培養液上清
中に生成蓄積していた。
一方、宿主として用いたE.coli ATCC12435の培養上清
中には遊離のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン
は検出されなかった。
中には遊離のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン
は検出されなかった。
（３）形質転換体E.coli ATCC12435/pWFH1を用いたトラ
ンス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生産 該形質転換体E.coli ATCC12435/pWFH1をアンピシリン
100μg/mlを含む50ml Med4培地に植菌し、30℃で16時
間振とう培養した。該培養液を種培養液とし、２リッタ
ーのMed6培地を入れた５リッタージャーファーメンター
に植菌した。さらにＬ−Proを200mM添加し、培養温度30
℃、撹拌数400回転／分、通気量１リッター／培養液１
リッター／分という条件で運転した。
ンス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生産 該形質転換体E.coli ATCC12435/pWFH1をアンピシリン
100μg/mlを含む50ml Med4培地に植菌し、30℃で16時
間振とう培養した。該培養液を種培養液とし、２リッタ
ーのMed6培地を入れた５リッタージャーファーメンター
に植菌した。さらにＬ−Proを200mM添加し、培養温度30
℃、撹拌数400回転／分、通気量１リッター／培養液１
リッター／分という条件で運転した。
培養中、グルコースは無くならぬように、Ｌ−プロリ
ンは約50mMとなるように適時添加し、NH4OHを用いて、p
H6.5に下限コントロールした。
ンは約50mMとなるように適時添加し、NH4OHを用いて、p
H6.5に下限コントロールした。
該培養液を遠心分離し、得られた上清中のトランス−
４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを定量したところ、培養
72時間で185mM（24g/L）のトランス−４−ヒドロキシ−
Ｌ−プロリンがE.coli ATCC12435/pWFH1の培養液上清中
に生成蓄積していた。
４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを定量したところ、培養
72時間で185mM（24g/L）のトランス−４−ヒドロキシ−
Ｌ−プロリンがE.coli ATCC12435/pWFH1の培養液上清中
に生成蓄積していた。
一方、宿主として用いたE.coli ATCC12435の培養上清
中には遊離のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン
は検出されなかった。
中には遊離のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン
は検出されなかった。
（４）形質転換体E.coli ATCC12435/pMc40Hを用いたト
ランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生産 該形質転換体E.coli ATCC12435/pMc40Hをアンピシリ
ン100μg/mlを含む50ml Med4培地に植菌し、30℃で16時
間振とう培養した。該培養液を種培養液とし、２リッタ
ーのMed6培地を入れた５リッタージャーファーメンター
に植菌した。さらにＬ−Proを200mM添加し、培養温度30
℃、撹拌数400回転／分、通気量１リッター／培養液１
リッター／分という条件で運転した。
ランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生産 該形質転換体E.coli ATCC12435/pMc40Hをアンピシリ
ン100μg/mlを含む50ml Med4培地に植菌し、30℃で16時
間振とう培養した。該培養液を種培養液とし、２リッタ
ーのMed6培地を入れた５リッタージャーファーメンター
に植菌した。さらにＬ−Proを200mM添加し、培養温度30
℃、撹拌数400回転／分、通気量１リッター／培養液１
リッター／分という条件で運転した。
培養中、グルコースは無くならぬように、Ｌ−プロリ
ンは約50mMとなるように適時添加し、NH4OHを用いて、p
H6.5に下限コントロールした。
ンは約50mMとなるように適時添加し、NH4OHを用いて、p
H6.5に下限コントロールした。
該培養液を遠心分離し、得られた上清中のトランス−
４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを定量したところ、培養
72時間で85.4mM（11.2g/L）のトランス−４−ヒドロキ
シ−Ｌ−プロリンがE.coli ATCC12435/pWFH1の培養液上
清中に生成蓄積していた。
４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを定量したところ、培養
72時間で85.4mM（11.2g/L）のトランス−４−ヒドロキ
シ−Ｌ−プロリンがE.coli ATCC12435/pWFH1の培養液上
清中に生成蓄積していた。
一方、宿主として用いたE.coli ATCC12435の培養上清
中には遊離のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン
は検出されなかった。
中には遊離のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン
は検出されなかった。
実施例８ 形質転換菌体を用いたＬ−プロリンからのト
ランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンへの転換 該形質転換体E.coli ATCC12435/pTr14を50μg/mlのア
ンピシリンを含む10ml LB培地に植菌し30℃で一晩振と
う培養した。該培養液を遠心分離し、菌体を取得した。
該菌体は必要に応じて−20℃で凍結保存し、使用時に解
凍して用いた。
ランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンへの転換 該形質転換体E.coli ATCC12435/pTr14を50μg/mlのア
ンピシリンを含む10ml LB培地に植菌し30℃で一晩振と
う培養した。該培養液を遠心分離し、菌体を取得した。
該菌体は必要に応じて−20℃で凍結保存し、使用時に解
凍して用いた。
反応液（240mMのMES緩衝液、pH6.5、中に、20mM L−
プロリン、24mM 2−ケトグルタル酸、4mM硫酸第一鉄お
よび8mM L−アスコルビン酸を含有する）250μｌに湿菌
体量として10％（w/v）となるように加え、35℃で60分
間反応した。反応液中に生成したトランス−４−ヒドロ
キシ−Ｌ−プロリン量を定量した結果、11.5mM（1.5g/
l）のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンが生成
していた。
プロリン、24mM 2−ケトグルタル酸、4mM硫酸第一鉄お
よび8mM L−アスコルビン酸を含有する）250μｌに湿菌
体量として10％（w/v）となるように加え、35℃で60分
間反応した。反応液中に生成したトランス−４−ヒドロ
キシ−Ｌ−プロリン量を定量した結果、11.5mM（1.5g/
l）のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンが生成
していた。
参考例１ Ｌ−プロリン４位水酸化酵素の単離および精
製 （１）ダクチロスポランジウム・エスピー（Dactylospo
rangium sp.）RH1の凍結菌体の調製 SR3培地（グルコース1.0％、可溶性澱粉1.0％、酵母
エキス0.5％、トリプトン0.5％、肉エキス0.3％および
リン酸マグネシウム0.05％を含み、6N NaOHでpH7.2に調
整した培地）を２リッター三角フラスコに200mlずつ分
注し、120℃、20分間殺菌した。この培地に、HT寒天平
板培地（可溶性澱粉１％、NZアミン0.2％、酵母エキス
0.1％、肉エキス0.1％および寒天1.5％を含み、6N NaOH
でpH7.2に調整後、120℃、20分間殺菌処理した培地）に
生育したダクチロスポランジウム・エスピー（Dactylos
porangium sp.）RH1を植菌し、28℃、２日間振盪培養
し、種培養液として用いた。
製 （１）ダクチロスポランジウム・エスピー（Dactylospo
rangium sp.）RH1の凍結菌体の調製 SR3培地（グルコース1.0％、可溶性澱粉1.0％、酵母
エキス0.5％、トリプトン0.5％、肉エキス0.3％および
リン酸マグネシウム0.05％を含み、6N NaOHでpH7.2に調
整した培地）を２リッター三角フラスコに200mlずつ分
注し、120℃、20分間殺菌した。この培地に、HT寒天平
板培地（可溶性澱粉１％、NZアミン0.2％、酵母エキス
0.1％、肉エキス0.1％および寒天1.5％を含み、6N NaOH
でpH7.2に調整後、120℃、20分間殺菌処理した培地）に
生育したダクチロスポランジウム・エスピー（Dactylos
porangium sp.）RH1を植菌し、28℃、２日間振盪培養
し、種培養液として用いた。
Df1培地（可溶性澱粉５％、ソイビーンミール1.5％、
リン酸１カリウム0.05％、硫酸マグネシウム７水塩0.05
％および炭酸カルシウム0.5％を含み、6N NaOHでpH7.0
に調整した培地）を５リッタージャーファーメンターに
２リッター分注後、120℃、20分間殺菌した。この培地
に、上記種培養液を無菌的に接種し、700rpm、1vvmの条
件で28℃、２日間培養した。培養中のpHは調整しなかっ
た。得られた培養液を7,000xg、10分間、４℃で遠心分
離し、湿菌体を培養液１リッター当たり75g得た。湿菌
体は４℃で生理食塩水で洗浄し、遠心後使用時まで−80
℃で凍結保存した。
リン酸１カリウム0.05％、硫酸マグネシウム７水塩0.05
％および炭酸カルシウム0.5％を含み、6N NaOHでpH7.0
に調整した培地）を５リッタージャーファーメンターに
２リッター分注後、120℃、20分間殺菌した。この培地
に、上記種培養液を無菌的に接種し、700rpm、1vvmの条
件で28℃、２日間培養した。培養中のpHは調整しなかっ
た。得られた培養液を7,000xg、10分間、４℃で遠心分
離し、湿菌体を培養液１リッター当たり75g得た。湿菌
体は４℃で生理食塩水で洗浄し、遠心後使用時まで−80
℃で凍結保存した。
（２）無細胞抽出液の調製
参考例１（１）で得た凍結菌体600gを融解後、３リッ
ターの緩衝液Ａ〔2mM DTT、0.2mM EDTAおよび20％（v/
v）グリセロールを含む50mM TAPS［Ｎ−トリス（ヒドロ
キシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸］
緩衝液（pH9.0）］に氷冷下で懸濁した。懸濁液をダイ
ノミル（DYNO−MILL,WILLY A BACHOFEN MASCHINENFABRI
K,BASEL,スイス）で処理し、菌体を破砕した。この処理
液を、４℃、6,500xgで30分間遠心分離し、上清を得
た。
ターの緩衝液Ａ〔2mM DTT、0.2mM EDTAおよび20％（v/
v）グリセロールを含む50mM TAPS［Ｎ−トリス（ヒドロ
キシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸］
緩衝液（pH9.0）］に氷冷下で懸濁した。懸濁液をダイ
ノミル（DYNO−MILL,WILLY A BACHOFEN MASCHINENFABRI
K,BASEL,スイス）で処理し、菌体を破砕した。この処理
液を、４℃、6,500xgで30分間遠心分離し、上清を得
た。
これ以降の操作は全て氷冷下ないしは４℃で行った。
（３）カラムクロマトグラフィーによる単離および精製
（３）−１ ストリームライン
前記工程で得た上清を、緩衝液Ａで平衡化しておいた
DEAE吸着体300mlを充填したファルマシア社製ストリー
ムライン（STREAMLINETM）に通塔し、Ｌ−プロリン４位
水酸化酵素を含む画分を0.3Mの食塩を含む緩衝液Ａで溶
出した。
DEAE吸着体300mlを充填したファルマシア社製ストリー
ムライン（STREAMLINETM）に通塔し、Ｌ−プロリン４位
水酸化酵素を含む画分を0.3Mの食塩を含む緩衝液Ａで溶
出した。
（３）−２ DEAEセファロースカラムクロマトグラフ
ィー 前記工程で得た活性画分を緩衝液Ａで３倍に希釈後、
予め緩衝液Ａで平衡化しておいたDEAEセファロースカラ
ム（5cm ｘ 15cm）に通塔した。カラムを緩衝液Ａで
洗浄後、該酵素を含む画分を緩衝液Ａ中に作成した０か
ら0.3Mまでの食塩の直線濃度勾配を用いて溶出した。
ィー 前記工程で得た活性画分を緩衝液Ａで３倍に希釈後、
予め緩衝液Ａで平衡化しておいたDEAEセファロースカラ
ム（5cm ｘ 15cm）に通塔した。カラムを緩衝液Ａで
洗浄後、該酵素を含む画分を緩衝液Ａ中に作成した０か
ら0.3Mまでの食塩の直線濃度勾配を用いて溶出した。
（３）−３ ブチルセファロースカラムクロマトグラ
フィー 前記工程で得た活性画分に3M濃度になるように食塩を
添加溶解し、予め3M食塩を含む緩衝液Ａで平衡化してお
いたブチルセファロースカラム（Butyl Sepharose 4 Fa
st Flow、2.6cm ｘ 13cm）にかけた。酵素を3M 食塩
を含む緩衝液Ａ、1.98M 食塩を含む緩衝液Ａ、0.99M
食塩を含む緩衝液Ａおよび緩衝液Ａのみ、の食塩濃度が
異なる４種類の緩衝液で、食塩濃度の高い方から低い方
へ段階的に溶出した。
フィー 前記工程で得た活性画分に3M濃度になるように食塩を
添加溶解し、予め3M食塩を含む緩衝液Ａで平衡化してお
いたブチルセファロースカラム（Butyl Sepharose 4 Fa
st Flow、2.6cm ｘ 13cm）にかけた。酵素を3M 食塩
を含む緩衝液Ａ、1.98M 食塩を含む緩衝液Ａ、0.99M
食塩を含む緩衝液Ａおよび緩衝液Ａのみ、の食塩濃度が
異なる４種類の緩衝液で、食塩濃度の高い方から低い方
へ段階的に溶出した。
（３）−４ フェニルセファロースカラムクロマトグ
ラフィー 前記工程で得た活性画分に3M濃度になるように食塩を
添加溶解し、予め3M食塩を含む緩衝液Ａで平衡化してお
いたフェニルセファロースカラム（Phenyl Sepharose H
P HiLoad 16/10,1.6cm x 10cm）に通塔した。3M 食塩
を含む緩衝液Ａで洗浄後、該酵素を含む画分を緩衝液Ａ
で溶出した。
ラフィー 前記工程で得た活性画分に3M濃度になるように食塩を
添加溶解し、予め3M食塩を含む緩衝液Ａで平衡化してお
いたフェニルセファロースカラム（Phenyl Sepharose H
P HiLoad 16/10,1.6cm x 10cm）に通塔した。3M 食塩
を含む緩衝液Ａで洗浄後、該酵素を含む画分を緩衝液Ａ
で溶出した。
（３）−５ 色素アフィニティーカラムクロマトグラ
フィー 前記工程で得た活性画分をファルマシア社製PD−10カ
ラムを用いて脱塩後、予め緩衝液Ａで平衡化しておいた
リアクティブレッド120カラム（シグマ社製Reactive re
d 120,1cm x 12.7cm）に通塔した。緩衝液Ａで洗浄後、
該酵素を含む画分を緩衝液Ａ中に作成した０から1.5Mま
での食塩の直線濃度勾配を用いて溶出した。
フィー 前記工程で得た活性画分をファルマシア社製PD−10カ
ラムを用いて脱塩後、予め緩衝液Ａで平衡化しておいた
リアクティブレッド120カラム（シグマ社製Reactive re
d 120,1cm x 12.7cm）に通塔した。緩衝液Ａで洗浄後、
該酵素を含む画分を緩衝液Ａ中に作成した０から1.5Mま
での食塩の直線濃度勾配を用いて溶出した。
（３）−６ リソースＱカラムクロマトグラフィー
前記工程で得た活性画分を緩衝液Ｂ〔2mM DTT、0.1
％（v/v）Tween 20および20％（v/v）グリセロールを含
む50mM TAPS緩衝液（pH8.0）〕で平衡化したファルマ
シア社製PD−10カラムを用いて脱塩後、予め緩衝液Ｂで
平衡化しておいたリソースＱカラム（ファルマシア社製
RESOURCETMQ,1ml）に通塔した。緩衝液Ｂ中に作成し
た０から0.2Mまでの食塩の直線濃度勾配を用いて溶出し
た。
％（v/v）Tween 20および20％（v/v）グリセロールを含
む50mM TAPS緩衝液（pH8.0）〕で平衡化したファルマ
シア社製PD−10カラムを用いて脱塩後、予め緩衝液Ｂで
平衡化しておいたリソースＱカラム（ファルマシア社製
RESOURCETMQ,1ml）に通塔した。緩衝液Ｂ中に作成し
た０から0.2Mまでの食塩の直線濃度勾配を用いて溶出し
た。
Ｌ−プロリン４位水酸化酵素の単離および精製の概要
を第３表にまとめた。
を第３表にまとめた。
参考例２ ダクチロスポランジウム・エスピーによるＬ
−プロリン４位水酸化酵素の生産 SR3培地を試験管に10mlずつ分注し、120℃、20分間殺
菌した。この培地に、HT寒天平板培地に生育したダクチ
ロスポランジウム・エスピー（Dactylosporangium s
p.）RH1を一白金耳植菌し、28℃、２日間振盪培養し、
種培養液として用いた。
−プロリン４位水酸化酵素の生産 SR3培地を試験管に10mlずつ分注し、120℃、20分間殺
菌した。この培地に、HT寒天平板培地に生育したダクチ
ロスポランジウム・エスピー（Dactylosporangium s
p.）RH1を一白金耳植菌し、28℃、２日間振盪培養し、
種培養液として用いた。
Df1培地を試験管に10mlずつ分注し、120℃、20分間殺
菌した。この培地に、上記種培養液1mlを無菌的に接種
し、28℃、２日間振盪培養した。得られた培養液を8000
rpm、10分間、４℃で遠心分離した。得られた菌体を80m
M TES［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−
アミノエタンスルホン酸］緩衝液（pH7.5）で洗浄後、
遠心分離した。得られた湿菌体150mgを、1.5mlの反応液
［4mM Ｌ−プロリン、8mM α−ケト−グルタル酸、4m
M Ｌ−アスコルビン酸、2mM 硫酸第一鉄、を含有する
80mM TES緩衝液（pH7.5）にナイミーン溶液（ナイミー
ンＳ−215（日本油脂株式会社製）4gをキシレン10mlに
溶解）を1.4％（v/v）添加］に懸濁し、30℃、30分間反
応を行った。反応後、菌体反応液より菌体を遠心分離除
去した上清中に生成したヒドロキシプロリンについて分
析を行い、ダクチロスポランジウム・エスピー菌体のＬ
−プロリン４位水酸化酵素活性を測定した。
菌した。この培地に、上記種培養液1mlを無菌的に接種
し、28℃、２日間振盪培養した。得られた培養液を8000
rpm、10分間、４℃で遠心分離した。得られた菌体を80m
M TES［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−
アミノエタンスルホン酸］緩衝液（pH7.5）で洗浄後、
遠心分離した。得られた湿菌体150mgを、1.5mlの反応液
［4mM Ｌ−プロリン、8mM α−ケト−グルタル酸、4m
M Ｌ−アスコルビン酸、2mM 硫酸第一鉄、を含有する
80mM TES緩衝液（pH7.5）にナイミーン溶液（ナイミー
ンＳ−215（日本油脂株式会社製）4gをキシレン10mlに
溶解）を1.4％（v/v）添加］に懸濁し、30℃、30分間反
応を行った。反応後、菌体反応液より菌体を遠心分離除
去した上清中に生成したヒドロキシプロリンについて分
析を行い、ダクチロスポランジウム・エスピー菌体のＬ
−プロリン４位水酸化酵素活性を測定した。
結果を第１表に示した。
参考例３ ストレプトマイセス・グリゼオビリディスに
よるＬ−プロリン４位水酸化酵素の生産 ストレプトマイセス・グリゼオビリディス（Streptom
yces griseoviridis）JCM4250およびストレプトミセス
・ダジェスタニクスJCM4365を用いて参考例２と同様に
Ｌ−プロリン４位水酸化酵素活性を測定した。但しDf1
のかわりにDf4培地［グリセロール2.5％、グルコース2.
5％、ソイビーンミール1.5％、りん酸１カリウム0.05
％、硫酸マグネシウム７水塩0.05％、炭酸カルシウム0.
5％をあ含み、6N NaOHでpH7.0に調整した培地］を用い
た。
よるＬ−プロリン４位水酸化酵素の生産 ストレプトマイセス・グリゼオビリディス（Streptom
yces griseoviridis）JCM4250およびストレプトミセス
・ダジェスタニクスJCM4365を用いて参考例２と同様に
Ｌ−プロリン４位水酸化酵素活性を測定した。但しDf1
のかわりにDf4培地［グリセロール2.5％、グルコース2.
5％、ソイビーンミール1.5％、りん酸１カリウム0.05
％、硫酸マグネシウム７水塩0.05％、炭酸カルシウム0.
5％をあ含み、6N NaOHでpH7.0に調整した培地］を用い
た。
結果を第１表に示した。
産業上の利用可能性
本発明によれば、医薬品の合成原料または食品添加物
として有用なトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン
を工業的に製造する方法、該方法に有用なＬ−プロリン
４位水酸化酵素活性を有する蛋白質をコードする遺伝
子、該遺伝子を含有する組換え体DNA、該組換え体DNAを
含有する形質転換体、該形質転換体を用いたＬ−プロリ
ン４位水酸化酵素の製造法、該酵素を提供することがで
きる。
として有用なトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン
を工業的に製造する方法、該方法に有用なＬ−プロリン
４位水酸化酵素活性を有する蛋白質をコードする遺伝
子、該遺伝子を含有する組換え体DNA、該組換え体DNAを
含有する形質転換体、該形質転換体を用いたＬ−プロリ
ン４位水酸化酵素の製造法、該酵素を提供することがで
きる。
配列表
配列番号:1
配列の長さ:272
配列の型：アミノ酸
鎖の数：直鎖状
配列の種類：タンパク質（protein）
起源
生物名:Dactylosporangium sp.
株名:RH1
配列
配列番号:2
配列の長さ:816
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
配列の種類:Genomic DNA
起源
生物名:Dactylosporangium sp.
株名:RH1
特徴を決定した方法:E
配列：
配列番号:3
配列の長さ:17
配列の型：核酸
トポロジー：一本鎖
配列の種類：他の核酸、合成DNA
配列：
ATGCTSACSC CNACNGA
配列番号:4
配列の長さ:17
配列の型：核酸
トポロジー：一本鎖
配列の種類：他の核酸、合成DNA
配列：
配列番号:5
配列の長さ:71
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
配列の種類：他の核酸、合成DNA
配列：
配列番号:6
配列の長さ:20
配列の型：核酸
トポロジー：一本鎖
配列の種類：他の核酸、合成DNA
配列：
配列番号:7
配列の長さ:19
配列の型：核酸
トポロジー：一本鎖
配列の種類：他の核酸、合成DNA
配列：
配列番号:8
配列の長さ:2707
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
配列の種類:Genomic DNA
起源
生物名:Dactylosporangium sp.
株名:RH1
配列
配列番号:9
配列の長さ:37
配列の型：核酸
トポロジー：一本鎖
配列の種類：他の核酸、合成DNA
配列：
配列番号:10
配列の長さ:36
配列の型：核酸
トポロジー：一本鎖
配列の種類：他の核酸、合成DNA
配列：
配列番号:11
配列の長さ:37
配列の型：核酸
トポロジー：一本鎖
配列の種類：他の核酸、合成DNA
配列：
配列番号:12
配列の長さ:38
配列の型：核酸
トポロジー：一本鎖
配列の種類：他の核酸、合成DNA
配列：
配列番号:13
配列の長さ:64
配列の型：核酸
トポロジー：一本鎖
配列の種類：他の核酸、合成DNA
配列：
配列番号:14
配列の長さ:66
配列の型：核酸
トポロジー：一本鎖
配列の種類：他の核酸、合成DNA
配列：
配列番号:15
配列の長さ:816
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
配列番号:16
配列の長さ:20
配列の型：核酸
トポロジー：一本鎖
配列の種類：他の核酸、合成DNA
配列：
配列番号:17
配列の長さ:21
配列の型：核酸
トポロジー：一本鎖
配列の種類：他の核酸、合成DNA
配列：
配列番号:18
配列の長さ:299
配列の型：アミノ酸
鎖の数：直鎖状
配列の種類：蛋白質
起源
生物名:Dactylosporangium sp.
株名:RH1
配列の特徴
特徴を表す記号:peptide
存在位置:35..299
特徴を決定した方法:S
起源
生物名:Escherichia coli
直接の起源
pBluescriptIIKS＋
配列の特徴
特徴を表す記号:peptide
存在位置:1..34
特徴を決定した方法:S
配列：
配列番号:19
配列の長さ:659
配列の型：アミノ酸
鎖の数：直鎖状
配列の種類：蛋白質
起源
生物名:Dactylosporangium sp.
株名:RH1
配列の特徴
特徴を表す記号:peptide
存在位置:389..659
特徴を決定した方法:E
起源
生物名:Escherichia coli
直接の起源
pMAL−c2
配列の特徴
特徴を表す記号:peptide
存在位置:1..387
特徴を決定した方法:S
配列：
フロントページの続き
(56)参考文献 ＢＡＬＤＷＩＮ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａ
ｌ．，ｒｏｌｉｎｅ ４−Ｈｙｄｒｏｘ
ｙｌａｓｅ：Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌ Ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｒ
ｅａｃｔｉｏｎ，ＴＥＴＲＡＨＥＤＲＯ
Ｎ ＬＥＴＴ．，Ｖｏｌ．34，Ｎｏ.
46，ｐ．7489−7492
ＢＡＬＤＷＩＮ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｐｅｃｉ
ｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｐｒｏｌｉｎｅ
４−Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ：Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ２Ｓ，３
Ｒ，４Ｓ−Ｅｐｏｘｙｐｒｏ，ＴＥＴＲ
ＡＨＥＤＲＯＮ ＬＥＴＴ．，Ｖｏｌ.
35，Ｎｏ．26，ｐ．4649−4652
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
C12N 1/00 - 1/38
C12N 9/00 - 9/99
C12P 13/00 - 13/24
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ
ｅｑ
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／Ｅ
ＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ)
Claims (20)
- 【請求項１】配列番号１で表されるアミノ酸配列からな
る蛋白質、配列番号18で表されるアミノ酸配列からなる
蛋白質、および配列番号19で表されるアミノ酸配列から
なる蛋白質からなる群より選ばれる蛋白質をコードする
DNA。 - 【請求項２】配列番号２で表される塩基配列からなるDN
A、配列番号８で表される塩基配列からなるDNA、および
配列番号15で表される塩基配列からなるDNAからなる群
より選ばれるDNA。 - 【請求項３】配列番号２で表される塩基配列からなるDN
A、配列番号５で表される塩基配列からなるDNA、配列番
号８で表される塩基配列からなるDNA、および配列番号1
5で表される塩基配列からなるDNAからなる群より選ばれ
るDNAと下記の条件下でハイブリダイズし、かつ２−ケ
トグルタル酸および２価鉄イオンの存在下、遊離のＬ−
プロリンに作用して、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−
プロリンを生成するＬ−プロリン４位水酸化酵素活性を
有する蛋白質をコードするDNA。 （ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるDNA、配
列番号５で表される塩基配列からなるDNA、配列番号８
で表される塩基配列からなるDNA、および配列番号15で
表される塩基配列からなるDNAからなる群より選ばれるD
NAからなる群より選ばれるDNAを固定したHybond−N+膜
を、ハイブリダイゼーション・バッファー（フォルムア
ミド50％v/v、ブロッキング試薬２％、Ｎ−ラウリルザ
ルコシン0.1％w/v、SDS0.02％w/vを750mM塩化ナトリウ
ムおよび75mMクエン酸ナトリウムからなる溶液中に含ん
だ溶液）中、42℃で一晩放置し、 （ｂ）0.1％SDSを含む300mM塩化ナトリウムおよび30mM
のクエン酸ナトリウムからなる溶液25mlを用いて室温で
５分間づつ２回洗浄後、0.1％SDSを含む15mM塩化ナトリ
ウムおよび1.5mMのクエン酸ナトリウムからなる溶液25m
lを用いて68℃で15分間づつ２回該膜を洗浄する - 【請求項４】DNAが、ダクチロスポランジウム属、アミ
コラトプシス属およびストレプトミセス属に属する微生
物から選ばれる微生物由来のDNAである、請求項３記載
のDNA。 - 【請求項５】微生物が、ダクチロスポランジウム・エス
ピーRH1（FERM BP−4400）、アミコラトプシス・エス
ピーRH2（FERM BP−4581）ストレプトミセス・グリセ
オビリディス JCM4250およびストレプトミセス・ダジ
ェスタニクスJCM4365から選ばれる微生物である、請求
項４記載のDNA。 - 【請求項６】請求項１〜５いずれか１項に記載のDNAを
含むDNA断片をベクターに組み込んで得られる組換え体D
NA。 - 【請求項７】請求項６記載の組換え体DNAを保有する形
質転換体。 - 【請求項８】形質転換体が、エシェリヒア・コリSOLR/p
RH71である、請求項７記載の形質転換体。 - 【請求項９】配列番号１で表されるアミノ酸配列からな
る蛋白質、配列番号18で表されるアミノ酸配列からなる
蛋白質、および配列番号19で表されるアミノ酸配列から
なる蛋白質からなる群より選ばれる蛋白質。 - 【請求項１０】請求項７または８記載の形質転換体を培
地中で培養し、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素を生成蓄積
させ、該培養物からＬ−プロリン４位水酸化酵素を採取
することを特徴とする、Ｌ−プロリン４位水酸化酵素の
製造法。 - 【請求項１１】培地中にＬ−プロリンを添加することを
特徴とする、請求項10記載のＬ−プロリン４位水酸化酵
素の製造法。 - 【請求項１２】請求項７または８記載の形質転換体を培
地中で培養し、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリ
ンを生成蓄積させ、該培養物よりトランス−４−ヒドロ
キシ−Ｌ−プロリンを採取することを特徴とするトラン
ス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造法。 - 【請求項１３】形質転換体が、培地中の糖源よりＬ−プ
ロリンを生産し培養液中に蓄積する能力のある形質転換
体であること特徴とする、請求項12記載のトランス−４
−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造法。 - 【請求項１４】形質転換体が、培地中の糖源より２−ケ
トグルタル酸を生産し培養液中に蓄積する能力のある形
質転換体であること特徴とする、請求項12記載のトラン
ス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造法。 - 【請求項１５】培地中にＬ−プロリンを添加することを
特徴とする、請求項12記載のトランス−４−ヒドロキシ
−Ｌ−プロリンの製造法。 - 【請求項１６】培地中にＬ−プロリン、２−ケトグルタ
ル酸および２価鉄イオンを添加することを特徴とする、
請求項12記載のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリ
ンの製造法。 - 【請求項１７】請求項７または８記載の形質転換体を培
養し、該培養物、菌体または菌体処理物を酵素源とし
て、２−ケトグルタル酸および二価鉄イオンの存在下、
培養液中または水性媒体中で、Ｌ−プロリンをトランス
−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンに変換させ、生成した
トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを該培養物ま
たは該水性媒体より採取することを特徴とするトランス
−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造法。 - 【請求項１８】形質転換体が、培地中の糖源よりＬ−プ
ロリンを生産し培養液中に蓄積する能力のある形質転換
体であること特徴とする、請求項17記載のトランス−４
−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造法。 - 【請求項１９】形質転換体が、培地中の糖源より２−ケ
トグルタル酸を生産し培養液中に蓄積する能力のある形
質転換体であること特徴とする、請求項17記載のトラン
ス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造法。 - 【請求項２０】菌体処理物が、菌体の乾燥物、菌体の凍
結乾燥物、菌体の界面活性剤処理物、菌体の酵素処理
物、菌体の超音波処理物、菌体の機械的摩砕処理物、菌
体の溶媒処理物、菌体の蛋白質分画物、菌体および菌体
処理物の固定化物、菌体より抽出して得られるＬ−プロ
リン４位水酸化酵素活性を有する酵素、該酵素の精製標
品および該酵素の固定化物から選ばれる菌体処理物であ
ること特徴とする、請求項17記載のトランス−４−ヒド
ロキシ−Ｌ−プロリンの製造法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4698895 | 1995-03-07 | ||
| JP7-46988 | 1995-03-07 | ||
| PCT/JP1996/000559 WO1996027669A1 (fr) | 1995-03-07 | 1996-03-07 | Procede de production de trans-4-hydroxy-l-proline |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP3440100B2 true JP3440100B2 (ja) | 2003-08-25 |
Family
ID=12762595
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP52677096A Expired - Lifetime JP3440100B2 (ja) | 1995-03-07 | 1996-03-07 | トランス−４−ヒドロキシ−ｌ−プロリン |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0759472B1 (ja) |
| JP (1) | JP3440100B2 (ja) |
| KR (1) | KR100460579B1 (ja) |
| CN (1) | CN1132938C (ja) |
| AT (1) | ATE219142T1 (ja) |
| CA (1) | CA2189682C (ja) |
| DE (1) | DE69621714T2 (ja) |
| ES (1) | ES2176441T3 (ja) |
| HK (1) | HK1000712A1 (ja) |
| WO (1) | WO1996027669A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101715484B (zh) | 2007-04-06 | 2014-02-19 | 协和发酵生化株式会社 | 二肽的制造方法 |
| JP5662167B2 (ja) | 2009-02-09 | 2015-01-28 | 協和発酵バイオ株式会社 | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| CN101864436B (zh) * | 2010-05-26 | 2012-05-23 | 东北农业大学 | 同位素13c标记的4-羟基脯氨酸的生物合成方法 |
| CN103275998B (zh) * | 2013-06-14 | 2015-03-04 | 河北博伦特药业有限公司 | 一种编码高活性反式-4-羟基-l-脯氨酸羟化酶的基因片段及其应用 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69126141T2 (de) * | 1991-08-26 | 1997-08-28 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Verfahren zur herstellung von 4-hydroxy-l-prolin |
| JPH05236980A (ja) * | 1991-12-17 | 1993-09-17 | Sankyo Co Ltd | トランス−４−ヒドロキシ−ｌ−プロリンの製造法 |
| KR100356926B1 (ko) * | 1993-09-07 | 2003-01-10 | 교와 핫꼬 고교 가부시끼가이샤 | 트랜스-4-히드록시-l-프롤린의제조법 |
| JPH07126297A (ja) * | 1993-11-05 | 1995-05-16 | Sagami Chem Res Center | カルモジュリン融合蛋白質 |
-
1996
- 1996-03-07 DE DE69621714T patent/DE69621714T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-07 EP EP96905024A patent/EP0759472B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-07 KR KR1019960706294A patent/KR100460579B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-03-07 CA CA002189682A patent/CA2189682C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-07 CN CN96190335A patent/CN1132938C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-07 AT AT96905024T patent/ATE219142T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-03-07 JP JP52677096A patent/JP3440100B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-07 WO PCT/JP1996/000559 patent/WO1996027669A1/ja active IP Right Grant
- 1996-03-07 ES ES96905024T patent/ES2176441T3/es not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-11-28 HK HK97102278A patent/HK1000712A1/xx not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ＢＡＬＤＷＩＮ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，ｒｏｌｉｎｅ ４−Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ：Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＴＥＴＲＡＨＥＤＲＯＮ ＬＥＴＴ．，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．４６，ｐ．７４８９−７４９２ |
| ＢＡＬＤＷＩＮ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｐｒｏｌｉｎｅ ４−Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ−Ｅｐｏｘｙｐｒｏ，ＴＥＴＲＡＨＥＤＲＯＮ ＬＥＴＴ．，Ｖｏｌ．３５，Ｎｏ．２６，ｐ．４６４９−４６５２ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR970702921A (ko) | 1997-06-10 |
| DE69621714D1 (de) | 2002-07-18 |
| HK1000712A1 (en) | 2002-09-27 |
| ES2176441T3 (es) | 2002-12-01 |
| EP0759472A1 (en) | 1997-02-26 |
| EP0759472B1 (en) | 2002-06-12 |
| WO1996027669A1 (fr) | 1996-09-12 |
| CN1150821A (zh) | 1997-05-28 |
| ATE219142T1 (de) | 2002-06-15 |
| CA2189682C (en) | 2001-12-04 |
| EP0759472A4 (en) | 1999-05-19 |
| CN1132938C (zh) | 2003-12-31 |
| KR100460579B1 (ko) | 2005-01-15 |
| CA2189682A1 (en) | 1996-09-12 |
| DE69621714T2 (de) | 2003-01-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2749424B2 (ja) | ホスフィノトリシン耐性遺伝子の使用 | |
| KR100591500B1 (ko) | 트랜스―4―히드록시―ｌ―프롤린의 제조법 | |
| US20090263885A1 (en) | Process for producing trans-4-hydroxy-L-proline | |
| JP3440100B2 (ja) | トランス−４−ヒドロキシ−ｌ−プロリン | |
| KR101461408B1 (ko) | 신규 선택 시스템 | |
| US6767726B2 (en) | Process for producing cis-3-hydroxy-L-proline | |
| JP3781776B2 (ja) | シス−３−ヒドロキシ−ｌ−プロリンの製 | |
| JP3492776B2 (ja) | シス−３−ヒドロキシ−ｌ−プロリンの製造法 | |
| JPH11137254A (ja) | バチルス属細菌由来のトランスグルタミナーゼの製造法 | |
| WO2008013262A1 (fr) | L-leucine hydroxylase et adn codant pour l'enzyme | |
| JP3764164B2 (ja) | トランス−４−ヒドロキシ−ｌ−プロリンの製造法 | |
| JP4555920B2 (ja) | ｍＲＮＡの安定制御によるタンパク質大量発現系 | |
| US20040229337A1 (en) | Process for producing Cis-3-hydroxy-L-proline | |
| JPH10136987A (ja) | ピコリン酸類の製造方法 | |
| WO2001081563A1 (fr) | Nouvelle (r)-2-hydroxy-3-phenylpropionate (d-phenyl-lactate) deshydrogenase et gene codant pour celle-ci | |
| JP2001099823A (ja) | トランス−４−ヒドロキシ−ｌ−プロリンの製造法 | |
| JPH11155572A (ja) | ４（ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸アルドラーゼおよび該酵素をコードするｄｎａ | |
| JPH11221078A (ja) | Ｌ−グルタミン酸・ｌ−ピログルタミン酸相互変換酵素をコードする遺伝子 | |
| JPS63102681A (ja) | クレアチナ−ゼ遺伝子 | |
| JP2002209577A (ja) | 酸化還元酵素ＹｖｇＮ、同酵素をコードする遺伝子、同酵素遺伝子含有形質転換体および同酵素の製法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080613 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090613 Year of fee payment: 6 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090613 Year of fee payment: 6 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090613 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100613 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110613 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110613 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120613 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120613 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130613 Year of fee payment: 10 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |