JP2002209577A - 酸化還元酵素ＹｖｇＮ、同酵素をコードする遺伝子、同酵素遺伝子含有形質転換体および同酵素の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 芳香族ジケトン化合物に対して還元能を有す
るバチラス属由来の酸化還元酵素、同酵素をコードする
遺伝子、同遺伝子を含有するベクター、同ベクターで形
質転換した形質転換体ならびに同酵素の製法を提供する
ことを目的とする。 【解決手段】 芳香族ジケトン化合物に対して還元能を
有し、たとえばベンジルを不斉に還元することができ
る、バチラス属由来の酸化還元酵素、同酵素をコードす
る遺伝子、同遺伝子を含有するベクター、同ベクターで
形質転換した形質転換体ならびに同酵素の製法を提供し
た。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、バチラス属（Baci
llus）由来の酸化還元酵素ＹｖｇＮ、同酵素をコードす
る遺伝子、同遺伝子を含有するベクター、同酵素遺伝子
含有形質転換体および同酵素の製法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ｙｖｇＮ遺伝子は、国際バチラス ズブ
チルスゲノム配列決定プロジェクト（the Bacillus sub
tilis genome sequencing project）（Ｉ．モスザー
（I. Moszer）ら、FEBS Letters、第４３０巻、２８〜
３６頁、１９９８年）によりバチラス ズブチルス１６
８株において同定され、命名されたオープンリーディン
グフレーム（以下、ＯＲＦと略称する）の１つである。
該遺伝子の塩基配列および推定アミノ酸配列は、前記プ
ロジェクトに基づいたウェブサイトＳｕｂｔｉＬｉｓｔ
（Ｉ．モスザーら、Microbiology、第１４１巻、２６１
〜２６８頁、１９９５年）において、得ることができ
る。

【０００３】また、バチラス セリウス（Bacillus cer
eus）由来のｙｖｇＮ遺伝子が、バチラス ズブチルス
のｙｖｇＮ遺伝子と相同性を有する部分的な遺伝子断片
として単離されており（オクスタッドＯ．Ａ．（Oksta
d, O. A.）ら、Microbiology、第１４５巻、６２１〜６
３１頁、１９９９年）、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢ
ａｎｋ国際塩基配列データベースに登録されている（登
録番号ＡＪ０１０１３３）。

【０００４】前記のようにｙｖｇＮ遺伝子は、種によっ
てその一部または全部の塩基配列が公知であった。しか
しながら、該遺伝子がコードしていると推定されるＹｖ
ｇＮタンパク質の機能に関しては、なんら明らかになっ
ていなかった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、芳香族ジケ
トン化合物、たとえばベンジル、を不斉に還元すること
ができるバチラス属由来の酸化還元酵素ＹｖｇＮ、同酵
素をコードする遺伝子、同遺伝子を含有するベクター、
同ベクターで形質転換した形質転換体ならびに同酵素の
製法を提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、バチラス
ズブチルスＰＣ−１株（パスツール研究所のＳｕｂｔ
ｉＬｉｓｔにおける登録番号ＢＧ１３９５９）由来のｙ
ｖｇＮ遺伝子およびバチラス セリウスＴｉｍ−ｒ０１
株（ＦＥＲＭ Ｐ−１４２１０）由来の完全長のｙｖｇ
Ｎ遺伝子をそれぞれ単離し、それらの塩基配列を決定し
た。ついで、該ｙｖｇＮ遺伝子がコードするＹｖｇＮタ
ンパク質が、芳香族ジケトン化合物に対して還元能を有
すること、さらに、たとえばベンジルを不斉に還元する
ことを見出した。

【０００７】したがって、本発明者らは、以下に示す発
明を提供することで、前記課題を解決するものである。
すなわち本発明は、（１）バチラス属由来の酸化還元酵
素ＹｖｇＮ、（２）バチラス ズブチルス由来である前
記（１）記載の酸化還元酵素ＹｖｇＮ、（３）バチラス
セリウス由来である前記（１）記載の酸化還元酵素Ｙ
ｖｇＮ、（４）配列番号４または８に示したアミノ酸配
列を有する前記（１）記載の酸化還元酵素ＹｖｇＮ、
（５）配列番号４または８に示したアミノ酸配列におい
て１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および
／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ酸化還
元能を有する前記（１）記載の酸化還元酵素ＹｖｇＮ、
（６）配列番号３または７に示した塩基配列に相補的な
塩基配列を有するＤＮＡにストリンジェントな条件にて
ハイブリダイズするＤＮＡでコードされ、かつ酸化還元
能を有する前記（１）記載の酸化還元酵素ＹｖｇＮ、
（７）配列番号３または７に示した塩基配列を有し、前
記（１）記載の酸化還元酵素ＹｖｇＮをコードするｙｖ
ｇＮ遺伝子、（８）前記（４）または（５）記載の酸化
還元酵素ＹｖｇＮのアミノ酸配列をコードするｙｖｇＮ
遺伝子、（９）前記（７）または（８）記載の遺伝子を
含有する組換えベクター、（１０）前記（９）記載の組
換えベクターで形質転換された形質転換体、（１１）宿
主細胞が微生物である前記（１０）記載の形質転換体、
（１２）前記微生物が大腸菌である前記（１１）記載の
形質転換体、および（１３）前記（１０）、（１１）ま
たは（１２）記載の形質転換体を培養し、培養物から酸
化還元酵素を採取することを特徴とする酸化還元酵素の
製法に関する。

【０００８】本発明にかかる酸化還元酵素ＹｖｇＮ、同
酵素をコードする遺伝子および同遺伝子を含有するベク
ターは、以下に説明する実施の態様に基づいて得ること
ができ、また形質転換体の製法および酸化還元酵素の製
法も、以下に示す実施の態様に基づいて実施することが
できる。以下、本発明について詳細に説明する。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明にかかるタンパク質Ｙｖｇ
Ｎは、公知のｙｖｇＮ遺伝子または該遺伝子に相同性を
有する遺伝子にコードされ、芳香族ジケトン化合物、た
とえばベンジル、を不斉に還元することができる酸化還
元酵素である。

【００１０】本発明の酸化還元酵素は、たとえば、配列
番号４に示したバチラス ズブチルス由来の酸化還元酵
素ＹｖｇＮまたは配列番号８に示したバチラス セリウ
ス由来の酸化還元酵素ＹｖｇＮのアミノ酸配列からなる
タンパク質を包含する。本発明はまた、配列番号４また
は８に示したＹｇｖＮのアミノ酸配列と７０％以上の同
一性を有し、かつ酸化還元能を有するタンパク質も包含
する。また、ＹｖｇＮの検出または精製を容易にするた
めに、当該ＹｖｇＮタンパク質のアミノ末端側やカルボ
キシル末端側に別の蛋白質、たとえば大腸菌のβ−ガラ
クトシダーゼまたはヒスチジンタグ、を遺伝子工学的手
法などを用いて付加したタンパク質をも含む。また、Ｙ
ｖｇＮの機能をより深く解析するために、部位特異的突
然変異誘発などの周知の方法によって置換、欠失、挿入
および／または付加できる程度の数のアミノ酸を置換、
欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列をも
包含する。つまり本発明は、このような周知の遺伝子工
学的手法により作製した当該酵素の変異体も包含するも
のである。

【００１１】さらに本発明は、ＹｖｇＮをコードする遺
伝子ｙｖｇＮ、たとえば配列番号３または７に示した塩
基配列、と７０％以上の相同性を有するＤＮＡでコード
され、かつ酸化還元能を有するタンパク質またはポリペ
プチドを包含する。また、本発明は、配列番号３または
７に示した塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡ
にストリンジェントな条件にてハイブリダイズするＤＮ
Ａでコードされ、かつ酸化還元能を有するタンパク質ま
たはポリペプチドをも包含する。該ハイブリダイゼーシ
ョンは、当業者らに周知の操作（たとえば、メインコス
Ｊ（Meinkoth, J）およびＧ．ワール（G. Wahl）、An
al. Biochem.、第１３８巻、２６７〜２８４頁、１９８
４年）により実施することができる。ハイブリダイゼー
ションのストリンジェントな条件としては、フィルター
の洗浄工程における０．１×ＳＳＣＰ（１×ＳＳＣＰ：
１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１２ｍＭクエン酸三ナトリ
ウム、１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、１ｍＭ エチ
レンジアミン四酢酸（以下、ＥＤＴＡと略称する）、ｐ
Ｈ７．２）、５０℃の条件であり、さらにストリンジェ
ントな条件としては、同工程における０．１×ＳＳＣ
Ｐ、６５℃の条件を挙げることができる。

【００１２】本発明におけるｙｖｇＮ遺伝子は、前記酸
化還元酵素ＹｖｇＮをコードする遺伝子を意味し、たと
えば配列番号３に示したバチラス ズブチルス由来の酸
化還元酵素遺伝子または配列番号７に示したバチラス
セリウス由来の酸化還元酵素遺伝子を包含する。ここ
で、配列番号３または７において、１もしくは数個の塩
基が欠失、置換、挿入または付加された配列を作製する
ことは当業者にとって容易である。また、当該遺伝子の
５’末端側にプロモーターやエンハンサーといった塩基
配列を付加すること、および／または当該遺伝子の３’
末端側にポリＡ付加シグナル塩基配列を付加することな
ども当業者にとって極めて容易である。したがって、配
列番号３または７に示した塩基配列の５’末端側や３’
末端側および／またはそれらの間に１つ以上の塩基の欠
失、置換、挿入または付加を有する塩基配列からなるｙ
ｖｇＮ遺伝子は、本発明に包含される。

【００１３】また本発明は、配列表３または７の塩基配
列に基づいて合成したプライマーを用いたポリメラーゼ
連鎖反応（以下ＰＣＲと略称する）を実施することによ
り得られ、かつ酸化還元能を有するタンパク質をコード
するＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドをも含む。

【００１４】ＰＣＲ法により本発明のｙｖｇＮ遺伝子を
得る場合には、当該遺伝子を含有する試料を、プライマ
ー、耐熱性ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ（デオキシＡＴＰ、
デオキシＴＴＰ、デオキシＧＴＰおよびデオキシＣＴ
Ｐ）ならびに緩衝液を含む溶液に加えた反応液を調製す
る。当該ＰＣＲに用いるプライマーは、配列番号３また
は７に基づいて適宜設定することができる。なお、ＰＣ
Ｒにより増幅した遺伝子をベクターに挿入するために
は、プライマーの５’末端側に制限酵素の認識配列を含
むのが好ましい。当該制限酵素の認識配列としては、該
配列の出現する位置でＤＮＡ鎖を正確に消化することが
できるという点で、ＩＩ型制限酵素、たとえば制限酵素
ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、
ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、
ＳａｐＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｈＩまたはＸｂａＩなどの認
識配列を選択するのが好ましい。当該制限酵素の認識配
列に加え、制限酵素による消化を助けるクランプ（clam
p）とよばれる数個の塩基を付加してもよい。ＰＣＲに
用いる試料としては、所望の遺伝子を含む試料であれば
いずれのものを用いても良く、たとえばバチラス ズブ
チルスまたはバチラスセリウスの染色体ＤＮＡ、同染色
体のＤＮＡライブラリー、ｃＤＮＡライブラリーまたは
本発明の遺伝子を含むプラスミドを用いることができ
る。また、ＰＣＲに用いる耐熱性ポリメラーゼとは、至
適温度が７０℃以上で、９０℃でも不活しにくいＤＮＡ
依存性５’→３’ＤＮＡ合成酵素である。当該耐熱性ポ
リメラーゼとしては、たとえばＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔ
ａｑ（商標、宝酒造株式会社製）を用いることができ
る。

【００１５】当該遺伝子のＰＣＲ条件は、当業者により
適宜設定することができるが、たとえば９４℃で１分間
インキュベーションした後、９４℃で１分間および７２
℃で３分間を１サイクルとしてこれを１０サイクル、さ
らに９４℃で１分間、６５℃で２分間および７２℃で１
分間を１サイクルとしてこれを１０サイクル、その上さ
らに９４℃で１分間、６０℃で２分間および７２℃で１
分間を１サイクルとしてこれを１５サイクル行うことで
実施することができる（Genes to Cells、第５巻、１１
１〜１２５頁、２０００年）。ｙｖｇＮ遺伝子の増幅反
応後、たとえば１．５％のアガロースゲルを用いる電気
泳動にてＰＣＲ産物を展開し、約８５０ｂｐのＤＮＡバ
ンドを含む画分を切り出す。ついで、たとえばＰｒｅｐ
−Ａ−Ｇｅｎｅ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｋｉｔ（商品名、バイオラッド社（BIO-RAD）製）を用
いることにより、所望の遺伝子ＤＮＡを精製することが
できる。ついで、制限酵素の認識配列を含むプライマー
を用いた場合には、ＰＣＲにて増幅された遺伝子に対し
て、当該プライマーに含まれた制限部位を認識する制限
酵素を作用させる。

【００１６】前記ｙｖｇＮ遺伝子を含有する組換えベク
ターは、制限酵素処理した前記遺伝子とべクターを２〜
５：１のモル比で混合してライゲーションすることによ
り調製することができる。すなわち、ベクターに制限酵
素を作用させて消化し、当該遺伝子を挿入するためのベ
クターを得る。制限酵素による消化反応の反応温度、反
応時間などの反応条件は、選択した酵素に応じて適宜条
件設定することができる。組換えベクターに用いるベク
ターに制約はなく、たとえばプラスミドベクター、バク
テリオファージベクター、レトロウイルスベクター、バ
キュロウイルスベクターまたはパピローマウイルスベク
ターなどをいずれも用いることができる。具体的には、
たとえばｐＵＣ１９ＤＮＡ（宝酒造株式会社製）、ｐＭ
ＮＴベクター（西澤ら、FEBS Lett.、第２９９巻、３６
〜３８頁、１９９２年）を用いることができる。これら
のベクターは、必要とあればフェノール抽出などの精製
手段により精製し、さらにたとえばエタノール沈殿法な
どの濃縮手段により濃縮することができる。ベクター断
片のセルフライゲーションを防ぐために、たとえば仔牛
小腸由来のアルカリホスファターゼなどによるホスファ
ターゼ処理を行ってもよい。ついで、前記遺伝子とベク
ターを混合し、これにリガーゼ、たとえばＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ、を作用させて組換えベクターを得ることができ
る。具体的には、市販のライゲーションキット、たとえ
ばＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ＫｉｔＶｅｒ．１（商品
名、宝酒造株式会社製）またはＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉ
ｇｈ（商品名、東洋紡績株式会社製）、を用いて規定の
条件にてライゲーションを行うことにより、組換えベク
ターを得ることができる。

【００１７】本発明のｙｖｇＮ遺伝子含有形質転換体
は、前記組換えベクターを既知の形質転換法により宿主
に導入することによって得ることができる。この形質転
換は、常法（たとえばMethods Enzymol.、第２０４巻、
６３〜１１３頁、１９９１年）により、好適に実施する
ことができる。本発明における宿主細胞としては、前記
組換えベクターが複製可能なものであれば制限なく使用
することができる。宿主細胞の具体例としては、たとえ
ば大腸菌および酵母のような微生物、ｓｆ９株のような
昆虫細胞、またはＣＯＳ細胞のような動物細胞などを挙
げることができる。具体的には、たとえば大腸菌ＤＨ５
αまたはＥｐｉｃｕｒｉａｎ Ｃｏｌｉ（商標） ＢＬ
２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）（ストラタジーン
社（Stratagene）製）を用いることができる。

【００１８】本発明のさらなる実施態様によれば、本発
明に係る酸化還元酵素は、前記ｙｖｇＮ遺伝子を含有す
る組換えベクターで形質転換された形質転換体を培養す
ることによって、工業的に有利に製造することができ
る。

【００１９】当該酵素生産に使用する形質転換体として
は、前記組換えベクターによる形質変換体をそのまま用
いることができる。また、前記組換えベクターの挿入断
片を新たな別の発現ベクターにサブクローニングしても
よいし、あるいは前記組換えベクターを新たな宿主細胞
に導入した形質転換体を用いることもできる。これらの
場合は、適当な宿主細胞とベクターの選択および使用法
などは当業者に既知であり、それらの中から本発明に係
る酸化還元酵素遺伝子の発現に適した系を任意に選択す
ることができる。たとえばベクターと宿主細胞として
は、前記遺伝子クローニング工程で例示したものから選
択することができる。

【００２０】当該形質転換体の培養条件は、宿主細胞に
より適宜選択でき、特定の条件に限定されるわけではな
い。培養は、通常この技術分野で用いられる培地および
培養条件下で行うことができる。たとえば炭素源として
は、グルコース、グリセロール、でんぷんなどを、窒素
源としては硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸
アンモニウムなどのアンモニウム塩、硝酸塩、トリプト
ン、ペプトンなどを用いることができる。その他微量の
無機金属類、ビタミン類、成長促進因子、たとえばチア
ミン、ビオチンを含む酵母エキスなどを添加してもよ
い。これらの培地成分は本発明の形質転換体の生育を阻
害しない濃度であればよい。培地は通常ｐＨ７．０〜
７．５に調整し、滅菌して使用する。培養温度の範囲は
該形質転換体が生育し得る温度であればよく、通常は３
０〜３７℃で培養するのが好ましい。形質転換体を液体
培養する場合は、振とう培養または通気撹拌培養が好ま
しい。培養時間は他の培養条件によって異なるが、振と
う培養または通気撹拌培養の場合は１２〜３６時間培養
するのが適当である。または、５５０〜６００ｎｍの吸
光度が１〜６になるまで１５〜３７℃で培養した後、イ
ソプロピルチオガラクトシド（以下、ＩＰＴＧと略称す
る）を加えてさらに培養することにより、酵素の発現を
誘導してもよい。

【００２１】培養終了後、遠心分離、濾過または共沈な
どの通常の方法によって、培養液から菌体細胞壁などの
不溶物を除去した粗酵素液を得ることができる。あるい
は当業者に公知の手段により、該粗酵素液の濃縮液を得
ることもできる。このようにして得られた粗酵素液は、
さらに硫安分画法、有機溶媒分画法、透析、等電点沈殿
法またはカラムクロマトグラフィーなどの通常の酵素精
製法を単独または組み合わせて用いることにより、精製
することもできる。

【００２２】当該酵素を用いる酸化還元反応は、周知の
方法にて実施することができる。また、該反応により得
られた産物も、周知の方法にて得ることができる。たと
えば、本発明の形質転換体を培養することにより酸化還
元酵素ＹｖｇＮを発現させ、該培養液中に基質を添加し
てさらに培養を続けることにより、酸化還元反応を実施
することができる。該反応の生成物は、たとえばカラム
クロマトグラフィーにて得ることができる。さらに該生
成物は、逆層クロマトグラフィーにて、高度に精製する
ことができる。当該生成物の収率および光学純度は、当
業者に周知の方法にて得ることができる。

【００２３】

【実施例】本発明を以下に実施例をあげて説明するが、
本発明は本実施例に限定されるものではない。

【００２４】実施例１ （１）プライマーの合成 前述のＳｕｂｔｉＬｉｓｔにて公開されているｙｖｇＮ
遺伝子の塩基配列に基づいてプライマー配列を設定し、
２種のオリゴヌクレオチドを亜リン酸−トリエステル法
により合成した。合成したオリゴヌクレオチドの配列
は、５’−ＧＧＣＧＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＡＣＡＡＧＴ
ＴＴＡＡＡＡＧＡＴ−３’（配列番号１）および５’−
ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＡＡＣＡＧＡＡＧＣＴＣＡＴ
ＣＡＧＧ−３’（配列番号２）である。なお、該遺伝子
の５’末端をＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングするた
めに、開始コドンＶａｌ（ＧＴＧ）をＬｅｕ（ＴＴＧ）
とした。配列番号１におけるＡＡＧＣＴＴ、および配列
番号６におけるＧＧＡＴＣＣは、各々制限酵素の識別配
列である。

【００２５】（２）バチラス ズブチルスの染色体ＤＮ
Ａの調製 バチラス ズブチルスＰＣ−１（パスツール研究所のＳ
ｕｂｔｉＬｉｓｔにおける登録番号ＢＧ１３９５９）株
の菌体を液体培地（ハートインフュージョンブロス（He
art infusion broth）（ディフコ社（Difco）製）２０
ｇ／ｌ）１０ｍｌにて一晩培養した。培養終了後に遠心
分離し、上清を除いて菌体を得、当該菌体に酵母・グラ
ム陽性菌用Ｇｅｎとるくん（商標、宝酒造株式会社製）
のＧｅｎＴＬＥ溶液Ｉ１８０μｌを添加後、直ちに２０
秒間ボルテックスにて強く撹拌した。ついで、ＧｅｎＴ
ＬＥ溶液ＩＩ２０μｌを添加して５秒間ボルテックスに
て撹拌し、７０℃で１０〜１５分間インキュベーション
して溶菌させた後、ＧｅｎＴＬＥ溶液ＩＩＩ１００μｌ
を添加してよく混和した。氷中で５分間放置した後遠心
し、上清を別のチューブに移して等量のイソプロパノー
ルを加え、よく混和した。その後、さらに遠心して上清
を除き、沈殿を７０％エタノールで洗浄し、数秒間軽く
遠心して上清を除いた。沈殿をＴＥ緩衝液（１０ｍＭト
リス−塩酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）３００μ
ｌに溶解し、７．５Ｍ酢酸アンモニウム１５０μｌとエ
タノール４５０μｌを加えて混和し、糸状のＤＮＡ沈殿
をピペットチップの先で絡め取り、ＴＥ緩衝液３００μ
ｌに溶解した。

【００２６】（３）ＰＣＲによる遺伝子の増幅および挿
入断片の調製 前記（１）にて合成した２種のプライマーを用いて、酸
化還元酵素遺伝子を増幅した。すなわち、前記（２）に
て調製したＤＮＡ１μｇ、２．５ｍＭのｄＮＴＰ４μ
ｌ、２５μＭのプライマー各２μｌ、ＴａＫａＲａ Ｅ
ｘ Ｔａｑ（商品名、宝酒造株式会社製）を２ユニッ
ト、ａｎｔｉ−Ｔａｑ ｈｉｇｈ（商品名、東洋紡績株
式会社製）０．４μｌおよび１０倍濃縮ＥｘＴａｑ緩衝
液１０μｌに純水を加えて全量１００μｌとし、ＰＣＲ
を行った。当該ＰＣＲは、９４℃で１分間インキュベー
ションした後、９４℃で１分間および７２℃で３分間を
１サイクルとしてこれを１０サイクル、さらに９４℃で
１分間、６５℃で２分間および７２℃で１分間を１サイ
クルとしてこれを１０サイクル、その上さらに９４℃で
１分間、６０℃で２分間および７２℃で１分間を１サイ
クルとしてこれを１５サイクル行うことで実施した。

【００２７】ついで、該ＰＣＲ産物０．５μｇ、制限酵
素ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩを各２０ユニット、およ
び緩衝液（２００ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．５）、
１００ｍＭ 塩化マグネシウム、５ｍＭ ジチオトレイ
トール（以下、ＤＴＴと略称する）、６６０ｍＭ 酢酸
カリウム）５μｌに純水を加えて全量５０μｌとする。
この反応溶液を３７℃で２時間インキュベーションする
ことにより、該ＰＣＲ産物を消化した。ついで、該ＰＣ
Ｒ産物をさらに１．５％のアガロースゲルを用いた電気
泳動により展開し、目的のＤＮＡ断片を含む画分をゲル
から切りだし、Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ ＤＮＡ Ｐｕ
ｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（商品名、バイオラッド
社製）を用いてＰＣＲ産物を回収した。すなわち、ＤＮ
Ａ断片を含むアガロースゲルをＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ
結合緩衝液１ｍｌに溶解し、Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅの
マトリックス２０μｌにＤＮＡを吸着させた。ついで、
Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ洗浄液６００μｌで２回洗浄し
た後、ＴＥ緩衝液３０μｌ中で５０℃にて５分間インキ
ュベーションし、ＤＮＡ断片を溶出して回収した。

【００２８】（４）ベクターの調製 ２μｇのｐＵＣ１９ＤＮＡ（宝酒造株式会社製）、制限
酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを各２０ユニッ
ト、緩衝液（２００ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．
５）、１００ｍＭ 塩化マグネシウム、５ｍＭ ＤＴ
Ｔ、６６０ｍＭ 酢酸カリウム）５μｌおよび大腸菌由
来のアルカリホスファターゼ（宝酒造株式会社製）０．
４ユニットに純水を加えて全量５０μｌとし、３７℃で
２時間反応させることにより該ベクターを消化した。つ
いで、該ベクターをフェノール抽出により精製し、さら
にエタノール沈殿法により濃縮した。

【００２９】（５）ＰＣＲ産物とｐＵＣ１９ベクターと
のライゲーション 前記（３）で調製したＰＣＲ産物と前記（４）で調製し
たｐＵＣ１９を２：１のモル比で混合し、ＤＮＡ Ｌｉ
ｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１（商品名、宝酒造株
式会社製）の緩衝液ＡをＤＮＡ溶液に対して４倍量添加
し、さらに酵素液ＢをＤＮＡ溶液と等量添加する。１６
℃で１時間ライゲーションを行い、組換えベクターを得
た。

【００３０】（６）酸化還元酵素遺伝子含有形質体の製
法 前記（５）にて作製した組換えベクターで大腸菌ＤＨ５
α株（ギブコＢＲＬライフテクノロジーズ社（GibcoBRL
Life Technologies）製）のコンピテント細胞を形質転
換させた。すなわち、組換えベクターを含むライゲーシ
ョン液１０μｌとＤＨ５α株のコンピテント細胞２００
μｌとを穏かに混和した後、氷中で３０分間放置した。
ついで、４２℃で１分間インキュベーションしたのち、
氷中で１分間冷却して形質転換体を得た。

【００３１】（７）ＤＮＡ断片の塩基配列決定 前記（６）にて得られた形質転換体にＳＯＣ培地（トリ
プトン２０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、１０ｍＭ塩化
ナトリウム、２．５ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭ塩化マ
グネシウム、１０ｍＭ硫酸マグネシウム、２０ｍＭグル
コース）を１ｍｌ加え、３７℃で１時間インキュベーシ
ョンした。インキュベーション後、該形質転換体の菌体
溶液をアンピシリン含有ＬＢ寒天培地（トリプトン１０
ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／
ｌ、寒天１５ｇ／ｌ、ｐＨ７．４）に塗布し、３７℃で
一晩培養し、酸化還元酵素遺伝子含有形質転換体のコロ
ニーを得た。ついで、当該コロニーをアンピシリン含有
ＬＢ液体培地（トリプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ
／ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／ｌ、ｐＨ７．４）３．５
ｍｌにて３７℃で一晩振とう培養した。培養後、遠心操
作により菌体を回収した。ついで、市販のＦｌｅｘｉＰ
ｒｅｐ（商品名）Ｋｉｔ（アマシャムファルマシアバイ
オテク社（Amersham Pharmacia Biotech）製）を用い、
該菌体からプラスミドＤＮＡを調製した。すなわち、培
養後に菌体を回収し、該菌体に溶液Ｉ（１００ｍＭトリ
ス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、４００
μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅＩ）２００μｌを添加し、ボル
テックスにて懸濁する。ついで、溶液ＩＩ（１Ｍ 水酸
化ナトリウム、５．３％（重量／容量）ＳＤＳ）２００
μｌを添加し穏かに混和した後、溶液ＩＩＩ（３Ｍカリ
ウム、５Ｍ酢酸）２００μｌを添加し混和した。遠心し
て得た上清に対しイソプロパノール沈殿を行った後、遠
心によりＤＮＡの沈殿を得た。Ｓｅｐｈａｇｌａｓ（商
品名）ＦＰ（７Ｍグアニジン−塩酸、５０ｍＭトリス−
塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）１５０μｌ
を添加して懸濁し、該ＤＮＡを溶解させた。ついで遠心
して上清を除き、洗浄緩衝液（２０ｍＭトリス−塩酸
（ｐＨ７．５）、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２００ｍＭ塩化ナ
トリウム、６０％エタノール）２００μｌを添加して懸
濁し、再び遠心により沈殿を得た。該沈殿に７０％エタ
ノール３００μｌを添加し、ボルテックスにて軽く撹拌
した。再び遠心して沈殿を得、ボルテックスにて軽く撹
拌し、沈殿を室内で１０分間乾燥させた。ついで、ＴＥ
緩衝液で溶出することによりＤＮＡを回収し、さらにイ
ソプロパノール沈殿法によりＤＮＡを濃縮した。

【００３２】当該ＤＮＡ断片の塩基配列は、ＡＢＩ Ｐ
ＲＩＺＭ（商品名） ＢｉｇＤｙｅ（商品名） Ｔｅｒ
ｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（商品名、ＰＥ
アプライドバイオシステムズ社（PE Applied Biosystem
s）製）を用い、プライマーとしてＭ４プライマーまた
はＲＶプライマー（ともに宝酒造株式会社製）を用いた
ジデオキシ法により、当該ＤＮＡ断片の５’側および
３’側から決定した。ジデオキシ法におけるＰＣＲ条件
は、９６℃で３０秒間、５０℃で１５秒間および６０℃
で４分間を１サイクルとしてこれを２８サイクル行うこ
とで実施した。

【００３３】その結果、８３１ｂｐの塩基配列が決定さ
れた。該塩基配列を配列番号３に、また当該遺伝子の推
定アミノ酸配列を配列番号４に示す。ただし（１）に記
載したように、該配列は、開始コドンＶａｌ（ＧＴＧ）
がＬｅｕ（ＴＴＧ）となっている。

【００３４】実施例２ 実施例１（６）にて得たｙｖｇＮ遺伝子含有形質転換体
にＳＯＣ培地を１ｍｌ加え、３７℃で１時間インキュベ
ーションした。インキュベーション後、該形質転換体の
菌体溶液をアンピシリン含有ＬＢ寒天培地に塗布し、３
７℃で一晩培養して、該形質転換体のコロニーを得た。
当該コロニーをアンピシリン含有ＬＢ液体培地２００ｍ
ｌに接種し、３７℃で１２時間培養した。ついで、基質
のベンジルを最終濃度が１ｍＭとなるように該培養液に
添加した後、さらに３７℃で１２時間培養した。培養終
了後、培養液に酢酸エチル４０ｍｌを加えて撹拌し、遠
心により酢酸エチルの層を分離した。当該操作をさらに
２回繰り返し、得られた酢酸エチル層１２０ｍｌを濃縮
した。得られた生成物を、ヘキサン：エーテル：酢酸
（容量比４５：５：１）を展開溶媒とした薄層クロマト
グラフィーにかけて、ベンゾインの画分を分取した。収
率は７１％、光学純度は８７％ｅｅであった。

【００３５】実施例３ （１）菌体からの染色体ＤＮＡ回収方法 バチラス セリウスＴｉｍ−ｒ０１菌株のシングルコロ
ニーをＰＮＥ培地（ポリペプトン１０ｇ／ｌ、カツオ魚
肉エキス１０ｇ／ｌ、塩化ナトリウム２ｇ／ｌ、ｐＨ
７．４）１０ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振とう培
養した。培養終了後に遠心分離し、上清を除いて菌体を
回収した。当該菌体を菌体として用いたほかは実施例１
（２）と同様にして、酵母・グラム陽性菌用Ｇｅｎとる
くん（商標、宝酒造株式会社製）ＤＮＡを調製した。

【００３６】このようにして得られたＤＮＡ量は、数回
分を合わせて２２０μｇであった。

【００３７】（２）染色体ＤＮＡ挿入断片の調製 前記（１）で調整した染色体ＤＮＡ５０μｇ、制限酵素
Ｓａｕ３ＡＩ（宝酒造株式会社製）２．５ユニットおよ
びＳａｕ３ＡＩ緩衝液（５００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ
７．５）、１００ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ Ｄ
ＴＴ、１０００ｍＭ塩化ナトリウム）５０μｌに純水を
加えて全量５００μｌとし、３７℃で２０分間反応させ
ることにより該染色体ＤＮＡを部分消化した。

【００３８】ついで、部分消化した反応液をフェノール
抽出後、７．５Ｍ酢酸アンモニウム２５０μｌとイソプ
ロパノール７５０μｌを加えて混和し、ＤＮＡを沈殿さ
せた。再度イソプロパノール沈殿を行ない、遠心して上
清を除き、沈殿を７０％エタノールで洗浄した。

【００３９】つぎに、前記の方法で得たＤＮＡ断片、５
ｍＭのｄＡＴＰ（デオキシＡＴＰ）およびｄＧＴＰ（デ
オキシＧＴＰ）を各５μｌ、緩衝液（１００ｍＭトリス
−塩酸（ｐＨ７．５）、７０ｍＭ塩化マグネシウム、１
ｍＭ ＤＴＴ）５μｌ、クレノウフラグメント（宝酒造
株式会社製）８ユニットに純水を加えて全量５０μｌと
し、２２℃で１０分間反応させて、Ｓａｕ３ＡＩによる
消化で生じた５’突出末端の半分を埋めた。したがって
該染色体ＤＮＡ断片においては、ＧＡが５’突出末端と
なる。

【００４０】ついで、該ＤＮＡ断片を０．８％のアガロ
ースゲルを用いた電気泳動により展開し、２〜４ｋｂの
ＤＮＡ断片を含む画分をゲルから切り出した。当該画分
をＤＮＡ断片を含む画分として用いたほかは実施例１
（３）と同様にして、Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ ＤＮＡ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（商品名、バイオ
ラッド社製）を用いてＰＣＲ産物を回収した。

【００４１】（３）ベクターの調製 つぎに、ｐＵＣ１９ＤＮＡ（宝酒造株式会社製）２μ
ｇ、制限酵素ＳａｌＩ（宝酒造株式会社製）１５ユニッ
ト、ＳａｌＩ緩衝液（５００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ
７．５）、１００ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ Ｄ
ＴＴ、１０００ｍＭ塩化ナトリウム）３μｌに純水を加
えて全量３０μｌとし、３７℃で２時間反応させること
により該ベクターを完全に消化した。ついで、前記反応
液、５ｍＭのｄＴＴＰ（デオキシＴＴＰ）およびｄＣＴ
Ｐ（デオキシＣＴＰ）各４μｌ、ＳａｌＩ緩衝液１μｌ
ならびに２ユニットのクレノウフラグメントに純水を加
えて全量４０μｌとし、２２℃で５分間反応させて、Ｓ
ａｌＩによる消化で生じた５’突出末端の半分を埋め
た。したがって該ｐＵＣ１９における５’突出末端は、
ＴＣである。

【００４２】（４）挿入断片とベクターとのライゲーシ
ョン ＧＡが５’突出末端である該染色体ＤＮＡおよびＴＣが
５’突出末端である該ｐＵＣ１９ＤＮＡを２：１のモル
比で混合し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅ
ｒ．１（商品名、宝酒造株式会社製）の緩衝液ＡをＤＮ
Ａ溶液に対して４倍量添加し、さらに酵素液ＢをＤＮＡ
溶液と等量添加する。１６℃で１時間ライゲーション反
応を行なった。これにより、バチラス セリウスの染色
体ＤＮＡライブラリーを完成させた。

【００４３】（５）染色体ＤＮＡライブラリー含有形質
転換体の作製 （４）にて作製した染色体ライブラリー２５ｎｇを用い
て、大腸菌ＤＨ５α株（ギブコＢＲＬライフテクノロジ
ー社製）のコンピテント細胞を形質転換させた。すなわ
ち、該染色体ＤＮＡライブラリー５ｎｇをＤＨ５α株コ
ンピテント細胞２００μｌに加え、穏かに混和した後、
氷中で３０分間放置した。ついで、４２℃で１分間イン
キュベーションし、氷中で１分間冷却した後、ＳＯＣ培
地を１ｍｌ加え、３７℃で１時間インキュベーションし
た。

【００４４】実施例４ （１）プライマーの合成 前述したバチラス セリウスのｙｖｇＮ遺伝子の部分配
列に基づいてプライマー配列を設定し、２種のオリゴヌ
クレオチドを亜リン酸−トリエステル法により合成し
た。合成したオリゴヌクレオチドの配列は、５’−ＡＴ
ＧＡＧＴＴＴＡＡＣＡＡＧＴＴＴＡＡＡＡＧＡ−３’
（配列番号５）および５’−ＴＡＡＣＧＣＴＴＴＣＣＡ
ＴＧＡＴＴＣＡＧＴ−３’（配列番号６）である。配列
番号５におけるＡＡＧＣＴＴ、および配列番号６におけ
るＧＧＡＴＣＣは、各々制限酵素の識別配列である。

【００４５】（２）ＰＣＲによる遺伝子の増幅および挿
入断片の調製 実施例３（１）にて調製したＤＮＡ１μｇをＤＮＡとし
て用い、前記（１）にて合成した２種のプライマーを用
いたほかは実施例１（３）と同様にして、ＰＣＲを実施
した。ついで、該ＰＣＲ産物を１．５％のアガロースゲ
ルを用いた電気泳動により展開し、目的のＤＮＡ断片を
含む画分をゲルから切りだした。当該画分をＤＮＡ断片
を含む画分として用いたほかは実施例１（３）と同様に
して、Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（商品名、バイオラッド社製）を
用いてＰＣＲ産物を回収した。

【００４６】（３）組換えベクターの作製 前記（２）にて回収したＤＮＡ断片を、ｐＧＥＭ（商
標）−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ ＳｙｓｔｅｍＩ
（プロメガ社製）を用いて、ライゲーションした。すな
わち、回収したＤＮＡ断片５０ｎｇ、ｐＧＥＭ（商標）
−Ｔ Ｅａｓｙ（プロメガ社製）５０ｎｇ、２×Ｒａｐ
ｉｄ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（６０ｍＭ ト
リス−塩酸（ｐＨ７．８）、２０ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、２０ｍＭＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ、１０％ ポリエ
チレングリコール）（プロメガ社製）５μｌおよびＴ４
ＤＮＡリガーゼ（プロメガ社製）１μｌに純水を加えて
全量１０μｌとし、２２℃で１時間ライゲーションを実
施して、組換えベクターを得た。

【００４７】（４）酸化還元酵素遺伝子含有形質体の製
法 （３）にて作製した組換えベクターを組換えベクターと
して用いたほかは実施例１（６）と同様にして、大腸菌
ＤＨ５α株（ギブコビーアールエルライフテクノロジー
ズ社製）のコンピテント細胞を形質転換させ、形質転換
体を得た。

【００４８】（５）ＤＮＡ断片の塩基配列決定 （４）にて得られた形質転換体を形質転換体として用い
たほかは実施例１（７）と同様にして、形質転換体のコ
ロニーを得た。ついで、当該コロニーを形質転換体のコ
ロニーとして用いたほかは、実施例１（７）と同様にし
て、振とう培養した。培養後、遠心操作により菌体を回
収した。ついで、当該菌体を菌体として用いたほかは実
施例１（７）と同様にして、市販のＦｌｅｘｉＰｒｅｐ
（商品名）Ｋｉｔ（アマシャムファルマシアバイオテク
社（Amersham Pharmacia Biotech）製）を用い、該菌体
からプラスミドＤＮＡを調製した。該プラスミドＤＮＡ
を鋳型として用い、ＳＰ６プライマーまたはＴ７プライ
マー（ともに宝酒造株式会社製）を用いたほかは実施例
１（７）と同様にして、ＤＮＡ断片の塩基配列を決定し
た。その結果、約３７０ｂｐの塩基配列を決定した。

【００４９】実施例５ （１）コロニーハイブリダイゼーション 当業者に周知の方法（メインコス ＪおよびＧ．ワー
ル、Anal. Biochem.、第１３８巻、２６７〜２８４頁、
１９８４年）にしたがって、コロニーハイブリダイゼー
ションを実施した。

【００５０】実施例３（５）にて作製したＴｉｍ−ｒ０
１菌株の染色体ライブラリー含有形質転換体のプールを
つくり、各プールから菌液を少量とってナイロン膜（商
品名：ナイトラン（商品名）Ｎ、スクレイチャー＆シュ
ーエル社（Schleicher & Schuell）製）に塗布した。つ
いで、アンピシリンを含有したＬＢ寒天プレート上に該
ナイロン膜を載せ、３７℃で一晩インキュベーションし
た。

【００５１】つぎに、ナイロン膜をプレートから剥が
し、０．４Ｎ水酸化ナトリウムおよび１Ｍ塩化ナトリウ
ムからなる溶液に浸したろ紙上に載せて室温にて１０分
間おくことにより、アルカリ処理を実施した。アルカリ
処理後、０．５Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７．５）および
１．５Ｍ塩化ナトリウムからなる溶液に３０秒間、つい
で２×ＳＳＣＰに３０秒間、該ナイロン膜を浸して中和
した。該ナイロン膜を乾燥したのち、８０℃にて３０分
間インキュベーションしてプラスミドＤＮＡをナイロン
膜に固定した。

【００５２】該ナイロン膜を３×ＳＳＣＰおよび０．１
％ＳＤＳからなる溶液に浸し、６５℃にて３時間インキ
ュベーションした。ついで、プレハイブリダイゼーショ
ン溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣＰ、５×デン
ハート溶液、２５０ｇ／ｍｌサケ精巣ＤＮＡ（以下、キ
ャリアーＤＮＡとする））にナイロン膜を浸し、４２℃
にて２時間インキュベーションした。プレハイブリダイ
ゼーション終了後、^{３ ２}Ｐで標識したプローブを含むハ
イブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×
ＳＳＣＰ、０．５％ＳＤＳ、３×デンハート溶液、１０
０ｇ／ｍｌキャリアーＤＮＡ、１０％硫酸デキストラ
ン）にナイロン膜を浸し、４２℃にて１２時間インキュ
ベーションした。なお、プローブの配列としては、実施
例４（５）にて決定したｙｖｇＮ遺伝子の部分配列を用
いた。ついで、２×ＳＳＣＰおよび０．２％ＳＤＳから
なる洗浄溶液２５０ｍｌに当該ナイロン膜を浸し、室温
にて１０分間振とうした。洗浄溶液を交換し、同じ条件
の洗浄を再度実施した。さらに続いて、０．１×ＳＳＣ
Ｐおよび０．５％ＳＤＳからなる洗浄溶液３００ｍｌに
該ナイロン膜を浸し、５０℃にて２０分間振とうした。
洗浄溶液を交換し、同じ条件の洗浄をさらに２回実施し
た。ついで、当該ナイロン膜を用いてオートラジオグラ
フィーを実施し、陽性クローンを含む菌体のプールを特
定した。

【００５３】特定したプールを構成する菌体それぞれを
形質転換体として用いたほかは実施例４（２）と同様に
して、ＰＣＲを実施した。ついで、それぞれのＰＣＲ産
物を１．５％のアガロースゲルにおける電気泳動にて展
開し、陽性クローンを同定した。該陽性クローンを、以
下、ｐＵＣ−Ｓ２Ｅ１−１８とよぶ。

【００５４】（２）全長ｙｖｇＮ遺伝子の塩基配列決定 前記（１）にて同定したｐＵＣ−Ｓ２Ｅ１−１８を形質
転換体として用いたほかは実施例１（７）と同様にし
て、プラスミドＤＮＡを調製した。ついで、調製したプ
ラスミドＤＮＡ１μｇを試料として用い、Ｍ４プライマ
ーまたはＲＶプライマー（ともに宝酒造株式会社製）を
プライマーとして用いたほかは実施例１（７）と同様に
して、該プラスミドＤＮＡ中に挿入されているバチラス
セリウスＴｉｍ−ｒ０１菌株由来のＤＮＡ配列を同定
した。また、実施例４にて同定したバチラス セリウス
Ｔｉｍ−ｒ０１菌株由来のｙｖｇＮ断片の塩基配列も考
慮して、全長ｙｖｇＮ遺伝子の塩基配列を決定した。当
該ｙｖｇＮ遺伝子のＯＲＦを配列番号７に、該遺伝子の
推定アミノ酸配列を配列番号８に示す。

【００５５】実施例６ （１）挿入断片の調製 ｐＵＣ−Ｓ２Ｅ１−１を鋳型として用い、配列番号９お
よび１０に示した塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
をプライマーとして用いたほかは実施例１（３）と同様
にして、ＰＣＲを実施した。ついで、該ＤＮＡ断片、Ｎ
ｄｅＩ２０ユニットおよび緩衝液（５００ｍＭ トリス
−塩酸（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、１０ｍＭ ＤＴＴ、１Ｍ 塩化ナトリウム）４μｌ
に純水を加えて全量を４０μｌとし、３７℃で２時間反
応させ、ＤＮＡ断片を消化した。ついで、ＰＣＲ反応液
のかわりに該ＤＮＡ断片の溶液を用いたほかは実施例１
（３）と同様の方法にて、ＤＮＡ断片を展開して目的の
ＤＮＡを含む画分を切り出した。つづいて、該画分をＤ
ＮＡを含む画分として用いたほかは実施例１（３）と同
様にして、ＤＮＡを精製した。

【００５６】（２）ベクターの調製 ２μｇのｐＭＮＴベクター（西澤ら、FEBS Lett.、第２
９９巻、３６〜３８頁、１９９２年）を用い、制限酵素
ＮｄｅＩ２０ユニット、緩衝液（５００ｍＭトリス−塩
酸（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ 塩化マグネシウム、１
０ｍＭ ＤＴＴ、１Ｍ 塩化ナトリウム）２μｌおよび
大腸菌由来のアルカリホスファターゼ（宝酒造株式会社
製）０．６ユニットに純水を加えて全量２０μｌとし、
３７℃で２時間反応させることにより該ベクターを消化
した。ついでフェノール処理およびエタノール沈殿を行
い、該ベクターを調製した。

【００５７】（３）組換えベクターの作製 前記（１）にてｐＵＣ−Ｓ２Ｅ１−１から調製したＤＮ
Ａ断片と前記（２）にて調製したベクターを１：１のモ
ル比で混合し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖ
ｅｒ．１（商品名、宝酒造株式会社製）を用いることに
より、１６℃で１時間ライゲーションを行い、組換えベ
クターを得た。

【００５８】（４）形質転換体の製法 前記（３）にて得られた組換えベクターを組換えベクタ
ーとして用い、Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ Ｃｏｌｉ（登録商
標） ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩ
Ｌ株（ストラタジーン社製）を宿主として用いたほかは
実施例１（６）と同様にして、形質転換体を得た。

【００５９】（５）酸化還元酵素の精製 前記（４）にて得られた形質転換体にＳＯＣ培地を１ｍ
ｌ加え、３７℃で１時間インキュベーションした。イン
キュベーション後、該形質転換体の懸濁液をアンピシリ
ン含有ＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養し、酸
化還元酵素遺伝子含有形質転換体のコロニーを得た。当
該コロニーを２５０ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ液体培
地に接種し、３７℃で１２時間振とう培養した。つい
で、基質のベンジルおよびＩＰＴＧを最終濃度がそれぞ
れ１Ｍおよび０．４ｍＭとなるように添加した後、該培
養液をさらに３７℃で１２時間培養した。ついで、培養
液に酢酸エチル４０ｍｌを加えて撹拌し、遠心により酢
酸エチルの層を分離した。当該操作をさらに２回繰り返
し、得られた酢酸エチル層１２０ｍｌを濃縮した。得ら
れた生成物を、ヘキサン：エーテル：酢酸（容量比４
５：５：１）を展開溶媒とした薄層クロマトグラフィー
にかけて、ベンゾインの画分を分取した。収率は７４
％、光学純度は８８％ｅｅであった。

【００６０】

【発明の効果】本発明は、芳香族ジケトン化合物、たと
えばベンジル、を不斉に還元することができるバチラス
属由来の酸化還元酵素ＹｖｇＮ、同酵素をコードするｙ
ｖｇＮ遺伝子、同遺伝子を含有するベクター、同ベクタ
ーで形質転換した形質転換体ならびに酸化還元酵素Ｙｖ
ｇＮの製法を提供した。

【００６１】

【配列表フリーテキスト】

配列番号１：バチラス ズブチルス由来のｙｖｇＮ遺伝
子をクローニングするための５’プライマー 配列番号２：バチラス ズブチルス由来のｙｖｇＮ遺伝
子をクローニングするための３’プライマー 配列番号５：バチラス セリウス由来のｙｖｇＮ遺伝子
の部分ＤＮＡ増幅するための５’プライマー 配列番号６：バチラス セリウス由来のｙｖｇＮ遺伝子
の部分ＤＮＡ増幅するための３’プライマー 配列番号９：バチラス セリウス由来のｙｖｇＮ遺伝子
をクローニングするための５’プライマー 配列番号１０：バチラス セリウス由来のｙｖｇＮ遺伝
子をクローニングするための３’プライマー

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Arakawa Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha <120> Oxido-reductases YvgN, genes encoding the enzymes, Transformants having the genes and A method for preparing the enzymes <130> JP-12505 <140> <141> <160> 10 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 5' primer for cloning yvgN gene derived from Bacillus subtilis <400> 1 ggcgaagctt gccaacaagt ttaaaagat 29 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 3' primer for cloning yvgN gene derived from Bacillus subtilis <400> 2 cgcggatcct aaaacagaag ctcatcagg 29 <210> 3 <211> 831 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 3 ttgccaacac gtttaaaaga tactgtaaag ttacataacg gagttgaaat gccttggttc 60 ggtctgggtg tttttaaagt agaaaatggt aatgaagcga ctgaatcagt gaaagcggca 120 attaaaaatg gttatcgcag tattgataca gcagcgatct acaaaaatga agaaggcgtt 180 ggcatcggga ttaaagaatc cggtgtggca agagaagagc tcttcatcac atcaaaagtg 240 tggaatgaag atcaaggcta cgaaacaacg cttgctgcct ttgaaaaaag cctggaaaga 300 ttacagcttg attacttaga tttatatttg atccattggc ctggcaaaga taaatataaa 360 gatacatggc gcgcgcttga aaagctgtac aaagatggca aaattcgcgc gatcggcgtc 420 agcaacttcc aagttcatca tttagaagag ctgttgaaag atgctgaaat caaaccgatg 480 gtgaaccaag ttgaatttca ccctcgtttg acgcaaaaag aattaagaga ttactgcaaa 540 gcgcaaggca ttcagctgga agcgtggtct ccgctcatgc agggacagct tttggataac 600 gaagtgctga cacagattgc tgaaaaacac aataaatctg tggctcaagt gattttgcgc 660 tgggatctgc agcatgaagt tgtaaccatt ccaaaatcca ttaaagaaca ccgtatcatc 720 gaaaacgctg atatttttga tttcgaattg tctcaagaag acatggacaa aattgacgca 780 ttaaataaag atgagcgtgt cggcccaaat cctgatgagc ttctgtttta g 831 <210> 4 <211> 276 <212> PRT <213> Bacillus sbtilis <400> 4 Leu Pro Thr Arg Leu Lys Asp Thr Val Lys Leu His Asn Gly Val Glu 1 5 10 15 Met Pro Trp Phe Gly Leu Gly Val Phe Lys Val Glu Asn Gly Asn Glu 20 25 30 Ala Thr Glu Ser Val Lys Ala Ala Ile Lys Asn Gly Tyr Arg Ser Ile 35 40 45 Asp Thr Ala Ala Ile Tyr Lys Asn Glu Glu Gly Val Gly Ile Gly Ile 50 55 60 Lys Glu Ser Gly Val Ala Arg Glu Glu Leu Phe Ile Thr Ser Lys Val 65 70 75 80 Trp Asn Glu Asp Gln Gly Tyr Glu Thr Thr Leu Ala Ala Phe Glu Lys 85 90 95 Ser Leu Glu Arg Leu Gln Leu Asp Tyr Leu Asp Leu Tyr Leu Ile His 100 105 110 Trp Pro Gly Lys Asp Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Arg Ala Leu Glu Lys 115 120 125 Leu Tyr Lys Asp Gly Lys Ile Arg Ala Ile Gly Val Ser Asn Phe Gln 130 135 140 Val His His Leu Glu Glu Leu Leu Lys Asp Ala Glu Ile Lys Pro Met 145 150 155 160 Val Asn Gln Val Glu Phe His Pro Arg Leu Thr Gln Lys Glu Leu Arg 165 170 175 Asp Tyr Cys Lys Ala Gln Gly Ile Gln Leu Glu Ala Trp Ser Pro Leu 180 185 190 Met Gln Gly Gln Leu Leu Asp Asn Glu Val Leu Thr Gln Ile Ala Glu 195 200 205 Lys His Asn Lys Ser Val Ala Gln Val Ile Leu Arg Trp Asp Leu Gln 210 215 220 His Glu Val Val Thr Ile Pro Lys Ser Ile Lys Glu His Arg Ile Ile 225 230 235 240 Glu Asn Ala Asp Ile Phe Asp Phe Glu Leu Ser Gln Glu Asp Met Asp 245 250 255 Lys Ile Asp Ala Leu Asn 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ggaaagcatt agaaaaactt tataaagatg gccgtgttcg cgctatcggt 420 gtgagtaatt tccacattca ccacttacaa gacgtatttg aaattgctga aattaagcca 480 atggtcaacc aagtggaata ccacccacgt ttagcacaag aagagttaca tgcattctgt 540 aaagaacata atattcagct tgaagcttgg tcaccattaa tgcaaggaca actactagat 600 aatccaacgt tacaagaaat tgcgacaaaa tataataaat caactgcgca aattatttta 660 cgctgggatt tacaaaacga agttgtaaca attcccaaat caattaaaga acatcgcatt 720 attgaaaatg caaacatctt cgactttgaa ttaagtgctg atgatatgaa agcaattcaa 780 gctttaaatg aagatcgtcg cgttggtcca gatccagata actttaactt ctag 834 <210> 8 <211> 277 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 8 Met Ile Leu Thr Ser Leu Lys Asp Tyr Thr Thr Leu His Asn Gly Val 1 5 10 15 Lys Met Pro Trp Phe Gly Leu Gly Val Phe Lys Val Glu Asp Gly Ser 20 25 30 Glu Val Ile Asp Ser Val Lys Ala Ala Ile Lys Asn Gly Tyr Arg Ser 35 40 45 Ile Asp Thr Ala Ala Ile Tyr Gln Asn Glu Glu Gly Val Gly Gln Ala 50 55 60 Ile Arg Glu Ser Gly Val Ser Arg Glu Glu Leu Phe Ile Thr Ser Lys 65 70 75 80 Val Trp Asn Ser Asp Gln Gly 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Artificial Sequence: 5' primer for cloning yvgN gene derived from Bacillus cereus <400> 9 ggaattccat atgattttaa caagtttaaa 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 3' primer for cloning yvgN gene derived from Bacillus cereus <400> 10 aatacggccg ctagaagtta aagttatctg 30

フロントページの続き (72)発明者 丸山 励治 富山市寺町けや木台52 つかさハイツ寺町 203号 (72)発明者 糸井 泰 大阪府大東市南新田一丁目21−502 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA08 CA02 DA06 EA04 GA11 4B050 CC03 DD02 LL05 4B065 AA15Y AA16Y AA19Y AA26X AB01 BA02 CA28

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 バチラス属由来の酸化還元酵素Ｙｖｇ
   Ｎ。
2. 【請求項２】 バチラス ズブチルス由来である請求項
   １記載の酸化還元酵素ＹｖｇＮ。
3. 【請求項３】 バチラス セリウス由来である請求項１
   記載の酸化還元酵素ＹｖｇＮ。
4. 【請求項４】 配列表の配列番号４または８に示したア
   ミノ酸配列を有する請求項１記載の酸化還元酵素Ｙｖｇ
   Ｎ。
5. 【請求項５】 配列表の配列番号４または８に示したア
   ミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、
   置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列から
   なり、かつ酸化還元能を有する請求項１記載の酸化還元
   酵素ＹｖｇＮ。
6. 【請求項６】 配列表の配列番号３または７に示した塩
   基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡにストリンジ
   ェントな条件にてハイブリダイズするＤＮＡでコードさ
   れ、かつ酸化還元能を有する請求項１記載の酸化還元酵
   素ＹｖｇＮ。
7. 【請求項７】 配列表の配列番号３または７に示した塩
   基配列を有し、請求項１記載の酸化還元酵素ＹｖｇＮを
   コードするｙｖｇＮ遺伝子。
8. 【請求項８】 請求項４または５記載の酸化還元酵素Ｙ
   ｖｇＮをコードするｙｖｇＮ遺伝子。
9. 【請求項９】 請求項７または８記載の遺伝子を含有す
   る組換えベクター。
10. 【請求項１０】 請求項９記載の組換えベクターで形質
    転換された形質転換体。
11. 【請求項１１】 宿主細胞が微生物である請求項１０記
    載の形質転換体。
12. 【請求項１２】 前記微生物が大腸菌である請求項１１
    記載の形質転換体。
13. 【請求項１３】 請求項１０、１１または１２記載の形
    質転換体を培養し、培養物から酸化還元酵素を採取する
    ことを特徴とする酸化還元酵素の製法。