JP2749424B2 - ホスフィノトリシン耐性遺伝子の使用 - Google Patents
ホスフィノトリシン耐性遺伝子の使用Info
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- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
Description
【発明の詳細な説明】
ホスフィノトリシン（PTC、２−アミノ−４−メチル
ホスフィノ酪酸）はグルタミンシンテターゼの阻害剤で
ある。PTCは抗生物質ホスフィノトリシル−アラニル−
アラニンの“構造単位”である。このトリペプチド（PT
T）は、グラム陽性及びグラム陰性細菌に対し並びに真
菌ボトリチス・シネレア（Botrytis cinerea）に対して
活性である〔バイエルら、ヘルベチカ・キミカ・アク
タ、第55巻、1972年、第224頁（Bayer et al.,Helvetic
a Chimica Acta 55（1972）224）〕。PTTはストレプト
ミセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochr
omogenes）Ｔ494株（DSM40736、DSM4112（両寄託番号
は同一の微生物に係わるものであって、後者はブタペス
ト条約上の寄託である））から産生される。 西独特許第2,717,440号明細書は、PTCが総合的除草剤
として作用することを開示している。公開PCT出願WO第8
6/02097号明細書は、PTCに対する耐性がグルタミンシン
テターゼの過剰産生に起因する植物について開示する。
このタイプの過剰産生、例えば遺伝子増幅に基づくも
の、は不安定性というリスクを伴う。かかる不安定性は
グルタミンシンテターゼ過剰産生の低下と関係するもの
であり、PTCの競合的阻害作用が再度発現することにな
るであろう。 これに対し、特許請求の範囲で規定される本発明は、
PTC耐性遺伝子のラセミPTCのＬ型の選択的Ｎ−アセチル
化のためのその使用に関する。なお、この遺伝子はPTC
耐性植物製造にも、また耐性マーカーとしても、使用す
ることができるので、以下においてはこれらの点につい
ても述べるものとする。 本発明のPTC耐性遺伝子は、PTT耐性に関して選択され
たストレプトミセス・ビリドクロモゲネスDSM4112由来
全DNAをBamH Iで切断し、大きさ4.0kbの断片をクローニ
ングし、更にPTT耐性について選別することにより得る
ことができる。制限地図（第１図）はこの4.0kb断片の
特徴を詳しく表わしている。 この4kb断片部分のクローニング実験は、コード領域
部位を更に正確に局在化させるために行なわれた。これ
によって、耐性遺伝子は1.6kbSst II−Sst I断片（第１
図において0.55〜2.15位）上に位置することが明らかに
なった。Bgl IIで消化した場合に断片が得られたが、こ
の断片は大きさが0.8kbであって、プラスミドに組込み
かつストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces liv
idans）を形質転換させた後にはPTT耐性を与える。この
耐性はPTCのＮ−アセチル化により生じる。 0.8kb断片のマキサム（Maxam）及びギルバート（Gilb
ert）配列決定により、DNA配列Ｉ（後記）が決定され
る。耐性遺伝子の位置は、この配列の開放読取り枠から
決定することができる（258位以後）。遺伝子の末端は
掲示された中で端から２番目のヌクレオチド（806位）
に位置しており、即ち最後のヌクレオチド（807位）が
停止コードンの最初のヌクレオチドとなっている。 DNA配列Ｉにおけるシャイン−ダルガルノ（Shine−Da
lgarno）配列は、開始コードンとして機能するGTGと同
様に、下線によって強調されている。したがって、最初
の下線部分が究極的な読取り枠を表わす。 DNA配列IIは、配列決定された遺伝子中の制限部位を
示す。７回以上配列を切断する酵素は示されていない。 抗生物質PTTは細菌によって取込まれ、PTCに分解され
る。後者もまた細菌中のグルタミンシンテターゼを阻害
することから、細菌はグルタミン欠乏により死滅する。
したがって、PTT産生細菌はPTTの作用から自らを保護す
るメカニズム、即ち産生されたPTTの再取込みを妨げる
か又は分解産物PTCを変化させるようなメカニズム、を
有していなければならない。しかしながら、驚くべきこ
とに、PTT産生株S.ビリドクロモゲネスDSM4112は、その
自らの抗生物質に対して感受性を有している。ところが
予想に反し、PTT耐性について選択することにより、PTT
に耐性でありかつ隣接コロニーのバックグラウンド増殖
を抑制する選択株を10-5の驚異的高率で発現させること
が可能であった。 遺伝子バンクは、DNAを単離し、それをBamH Iで切断
し、かつそれをストレプトミセテスベクターと連結する
ことにより、これらの選択株のDNAから製造された。連
結混合産物で市販S.リビダンスTK23株を形質転換して、
連結混合産物１μｇ当たり約１〜5kbの挿入物を有する
約5000〜10000個の形質転換株が得られた。形質転換株
中にPTT耐性S.リビダンス株が存在していた。プラスミ
ドの単離及びS.リビダンスの再形質転換によって、耐性
がプラスミドにコードされていることを証明することが
可能であった。耐性をになう遺伝子は4kb BamH I断片上
に位置している（第１図）。コード領域は0.8kbBgl II
断片上に位置する。BamH I断片は酵素Cla I、EcoR I、E
coR V、Hind III、Hpa I、Kpn I、Pvu I、Pvu II及びXh
o Iの切断部位を有していない。 ストレプトミセス・ヒグロスコピクス（Streptomyces
hygroscopicus）FERM BP−130/ATCC21705（欧州特許
出願公開第0,173,327号、第７図）に関する、まだ詳細
には特徴づけられていない耐性遺伝子の制限地図との比
較により、本発明の耐性遺伝子はPTT生合成遺伝子に関
する研究中に見出された公知遺伝子と異なることが示さ
れる。 一方ではS.ビリドクロモゲネスDSM4112及びS.リビタ
ンスTK23の細胞抽出物と、他方ではPTT耐性S.ビリドク
ロモゲネス選択株及びプラスミド担持S.リビダンス形質
転換株と、PTC及びアセチルCoAとのインキュベーション
により、後者の細胞がアセチル化活性を有することを明
らかにすることができた。クロマトグラフィー試験は、
アセチル化がアミノ基で生じることを示している。 PTT耐性が大腸菌（Escherichia coli）でもみられ、
よって耐性メカニズムがグラム陰性菌でも機能している
ことから、輸送現象に基づく耐性を除去することができ
る。したがって、植物プロモーターに結合させた後適当
なベクターを用いて、本発明の耐性遺伝子を植物に組込
んで形質転換させることができ、もってこの方法により
PTC耐性植物を製造することができる。 PTCのＮ−アセチル化は、Ｌ型のみの選択的アセチル
化が生じることから、合成D,L−PTCのラセミ分割のため
にも利用することができる。 このように、本発明は、ラセミPTCのＬ型の選択的Ｎ
−アセチル化のための耐性遺伝子の使用にも関する。 本発明の耐性遺伝子によりコードされたPTCアセチル
トランスフェラーゼは、Ｌ型のみを選択的に攻撃し、Ｄ
型は未変化のままであることから、例えば西独特許第2,
717,440号明細書の方法から得られるように、ラセミ体
をこの酵素のアセチル化作用に供することにより、ラセ
ミPTCを光学対掌体に分割するために使用することがで
きる。かくして得られる混合物は次いで、性質の違いに
基づき自体公知の方法で分割される。 Ｎ−アシル−D,L−アミノ酸をアシラーゼ（担体に固
定しておいてもよい）と接触させてＬ−アミノ酸を選択
的に遊離させ、次いで酸性化後にＮ−アシル−Ｄ−アミ
ノ酸含有混合物からこのＬ−アミノ酸を水不溶性溶媒で
抽出することが、開示されている（英国特許第1,369,46
2号明細書）。Ｎ−アシル−D,L−PTCの同様の分画は、
例えば西独公開第2,939,269号又は米国特許第4,226,941
号明細書に開示されている。 本発明では残存するＤ−PTCは公知の方法（欧州特許
出願公開第（EP−Ａ）0,137,371号、実施例８）でラセ
ミ化され、次いで元のプロセスに戻される。 必ずしも必要ではないが、酵素を単離することは可能
であり、ここで酵素とは本文及び以下において常に酵素
的に活性な部分をも意味しているつもりである。酵素が
単離される場合、これは遊離型として又は担体に固定さ
れて使用することができる。適当な担体の例はEP−Ａ第
0,141,223号明細書に記載されている。しかしながら、
酵素を単離するのではなく、本発明の酵素を発現するい
ずれかの望ましいPTC耐性細胞を用いることが得策であ
る。したがってS.ビリドクロモゲネスDSM4112のPTT耐性
選択株を用いることが、可能かつ得策である。更には、
本発明の遺伝子で形質転換されかつPTCアセチルトラン
スフェラーゼを発現しうるいずれかの望ましい細胞を用
いることが、可能かつ有利である。このような関係か
ら、本発明の遺伝子は、これもその活性部分を意味する
つもりであるが、プラスミドに組込まれた形で又はトラ
ンスフェクション（transfection）のような他の慣用的
遺伝子操作法により宿主細胞中に導入することができ
る。例えばEP−Ａ第0,163,249号及び第0,171,024号明細
書の公知の方法による、例えば大腸菌発現プラスミドへ
の組込み及びかかるプラスミドによる大腸菌の形質転換
が得策である。 ラセミ体中のＬ−PTCの本発明によるＮ−アセチル化
の場合、PTCアセチルトランスフェラーゼを発現する細
胞は遊離又は固定された形で使用することができるが、
固定化としては慣用的方法が適用される（例えば西独公
開第3,237,341号明細書及びそこで引用された文献）。 Ｌ−PTCの本発明による酵素的アセチル化は、酵素反
応に関して慣用的な方法により行なわれるが、その方法
の条件は使用される生物の特徴によって定められる。原
則として、これに適した方法は上記選択的脱アシル化方
法と同様である。 本発明は下記例によって詳細に説明されている。他に
言及のない限り、及び百分率は重量基準である。 例1:PTT耐性選択株 S.ビリドクロモゲネスDSM4112株を最少培地〔ホップ
ウッドら、ストレプトミセスの遺伝子操作、実験マニュ
アル、ザ・ジョン・インズ・ファンデーション、ノーリ
ッジ、イングランド、1985年、233頁（Hopwood et al.,
Genetic Manipulation of Streptomyces,A Laboratory
Manual,The John Innes Foundation,Norwich,England
（1985）,page233）〕で培養し、PTT濃度を増加させな
がら加えた。濃度100μg/mlで、約105のコロニーにつき
１つの耐性コロニーが見出された。 例2:ベクターの調製 プラスミドpSVH1（欧州特許第0,070,522号明細書、米
国特許第4,673,642号明細書）をBgl IIで切断し、大き
さ約7.1kbの断片を分離し、チオストレプトン耐性の1.1
kbBcl I断片と連結させる（欧州特許出願公開第0,158,2
01号）。大きさが約8.15kbのプラスミドpEB2が得られる
（第２図）。 例3:耐性遺伝子の分離 全DNAを例１の選択株から分離し、これをBamH Iで切
断する。プラスミドpEB2をBamH Iで同様に開環し、２つ
の混合物を合わせ、連結させる。連結混合産物でS.リビ
ダンスTK23（ジョン・インズ・ファンデーションから入
手可能）を形質転換すると、約１〜5kbの挿入物を有す
る5000〜10000個の形質転換株が連結混合産物１μｇ当
たりから得られる。PTT耐性について選別により２つの
耐性S.リビダンスコロニーが得られる。取込まれたプラ
スミドを後者から分離し、BamH Iで切断する。耐性の要
因となる遺伝子を含む4kbBamH I断片が見出される。こ
のプラスミドをpPR1（第３図）と命名した。 S.リビダンスTK23の再形質転換により形質転換株はPT
T100μg/ml含有最少培地で増殖することから、PTT耐性
がプラスミドにコードされていることが示される。 例4:N−アセチル化によるPTC不活性化の証明 クローニングした断片のアセチル化活性を証明するた
めに、下記株を試験した:S.ビリドクロモゲネスDSM411
2、S.ビリドクロモゲネス（PTT耐性変異株）、S.リビダ
ンスTK23及びS.リビダンスTK23（pPR1）。 そのためには、株を溶菌培地Ａ（欧州特許出願公開第
0,158,872号、第６頁）に接種し、かつオービタルシェ
ーカー（orbital shaker）中30℃で２日間インキュベー
ションすることが必要である。回収後、菌糸体1mgを適
当な緩衝液〔例えばRS緩衝液：シー・ジェイ・トムソン
ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、第151巻、1
982年、第678−685頁（C.J.Thompson et al.,Journal o
f Bacteriology 151（1982）,678−685）〕中超音波で
破壊する。PTC分解を測定するための典型的実験操作法
は下記のとおりである。 PTC（250μg/ml）溶液100μｌ及びアセチルCoA（4mg/
ml）50μｌを粗抽出物250μｌに加え、混合物を30℃で
２時間インキュベーションする。その時点でもなお存在
するPTC量をHPLCで測定する。この結果は以下のとおり
である。 薄層クロマトグラフィーによる参照物質（ニンヒドリ
ンで染色されない）との比較は、PTCのＮ−アセチル化
が生じたことを示すものである。
ホスフィノ酪酸）はグルタミンシンテターゼの阻害剤で
ある。PTCは抗生物質ホスフィノトリシル−アラニル−
アラニンの“構造単位”である。このトリペプチド（PT
T）は、グラム陽性及びグラム陰性細菌に対し並びに真
菌ボトリチス・シネレア（Botrytis cinerea）に対して
活性である〔バイエルら、ヘルベチカ・キミカ・アク
タ、第55巻、1972年、第224頁（Bayer et al.,Helvetic
a Chimica Acta 55（1972）224）〕。PTTはストレプト
ミセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochr
omogenes）Ｔ494株（DSM40736、DSM4112（両寄託番号
は同一の微生物に係わるものであって、後者はブタペス
ト条約上の寄託である））から産生される。 西独特許第2,717,440号明細書は、PTCが総合的除草剤
として作用することを開示している。公開PCT出願WO第8
6/02097号明細書は、PTCに対する耐性がグルタミンシン
テターゼの過剰産生に起因する植物について開示する。
このタイプの過剰産生、例えば遺伝子増幅に基づくも
の、は不安定性というリスクを伴う。かかる不安定性は
グルタミンシンテターゼ過剰産生の低下と関係するもの
であり、PTCの競合的阻害作用が再度発現することにな
るであろう。 これに対し、特許請求の範囲で規定される本発明は、
PTC耐性遺伝子のラセミPTCのＬ型の選択的Ｎ−アセチル
化のためのその使用に関する。なお、この遺伝子はPTC
耐性植物製造にも、また耐性マーカーとしても、使用す
ることができるので、以下においてはこれらの点につい
ても述べるものとする。 本発明のPTC耐性遺伝子は、PTT耐性に関して選択され
たストレプトミセス・ビリドクロモゲネスDSM4112由来
全DNAをBamH Iで切断し、大きさ4.0kbの断片をクローニ
ングし、更にPTT耐性について選別することにより得る
ことができる。制限地図（第１図）はこの4.0kb断片の
特徴を詳しく表わしている。 この4kb断片部分のクローニング実験は、コード領域
部位を更に正確に局在化させるために行なわれた。これ
によって、耐性遺伝子は1.6kbSst II−Sst I断片（第１
図において0.55〜2.15位）上に位置することが明らかに
なった。Bgl IIで消化した場合に断片が得られたが、こ
の断片は大きさが0.8kbであって、プラスミドに組込み
かつストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces liv
idans）を形質転換させた後にはPTT耐性を与える。この
耐性はPTCのＮ−アセチル化により生じる。 0.8kb断片のマキサム（Maxam）及びギルバート（Gilb
ert）配列決定により、DNA配列Ｉ（後記）が決定され
る。耐性遺伝子の位置は、この配列の開放読取り枠から
決定することができる（258位以後）。遺伝子の末端は
掲示された中で端から２番目のヌクレオチド（806位）
に位置しており、即ち最後のヌクレオチド（807位）が
停止コードンの最初のヌクレオチドとなっている。 DNA配列Ｉにおけるシャイン−ダルガルノ（Shine−Da
lgarno）配列は、開始コードンとして機能するGTGと同
様に、下線によって強調されている。したがって、最初
の下線部分が究極的な読取り枠を表わす。 DNA配列IIは、配列決定された遺伝子中の制限部位を
示す。７回以上配列を切断する酵素は示されていない。 抗生物質PTTは細菌によって取込まれ、PTCに分解され
る。後者もまた細菌中のグルタミンシンテターゼを阻害
することから、細菌はグルタミン欠乏により死滅する。
したがって、PTT産生細菌はPTTの作用から自らを保護す
るメカニズム、即ち産生されたPTTの再取込みを妨げる
か又は分解産物PTCを変化させるようなメカニズム、を
有していなければならない。しかしながら、驚くべきこ
とに、PTT産生株S.ビリドクロモゲネスDSM4112は、その
自らの抗生物質に対して感受性を有している。ところが
予想に反し、PTT耐性について選択することにより、PTT
に耐性でありかつ隣接コロニーのバックグラウンド増殖
を抑制する選択株を10-5の驚異的高率で発現させること
が可能であった。 遺伝子バンクは、DNAを単離し、それをBamH Iで切断
し、かつそれをストレプトミセテスベクターと連結する
ことにより、これらの選択株のDNAから製造された。連
結混合産物で市販S.リビダンスTK23株を形質転換して、
連結混合産物１μｇ当たり約１〜5kbの挿入物を有する
約5000〜10000個の形質転換株が得られた。形質転換株
中にPTT耐性S.リビダンス株が存在していた。プラスミ
ドの単離及びS.リビダンスの再形質転換によって、耐性
がプラスミドにコードされていることを証明することが
可能であった。耐性をになう遺伝子は4kb BamH I断片上
に位置している（第１図）。コード領域は0.8kbBgl II
断片上に位置する。BamH I断片は酵素Cla I、EcoR I、E
coR V、Hind III、Hpa I、Kpn I、Pvu I、Pvu II及びXh
o Iの切断部位を有していない。 ストレプトミセス・ヒグロスコピクス（Streptomyces
hygroscopicus）FERM BP−130/ATCC21705（欧州特許
出願公開第0,173,327号、第７図）に関する、まだ詳細
には特徴づけられていない耐性遺伝子の制限地図との比
較により、本発明の耐性遺伝子はPTT生合成遺伝子に関
する研究中に見出された公知遺伝子と異なることが示さ
れる。 一方ではS.ビリドクロモゲネスDSM4112及びS.リビタ
ンスTK23の細胞抽出物と、他方ではPTT耐性S.ビリドク
ロモゲネス選択株及びプラスミド担持S.リビダンス形質
転換株と、PTC及びアセチルCoAとのインキュベーション
により、後者の細胞がアセチル化活性を有することを明
らかにすることができた。クロマトグラフィー試験は、
アセチル化がアミノ基で生じることを示している。 PTT耐性が大腸菌（Escherichia coli）でもみられ、
よって耐性メカニズムがグラム陰性菌でも機能している
ことから、輸送現象に基づく耐性を除去することができ
る。したがって、植物プロモーターに結合させた後適当
なベクターを用いて、本発明の耐性遺伝子を植物に組込
んで形質転換させることができ、もってこの方法により
PTC耐性植物を製造することができる。 PTCのＮ−アセチル化は、Ｌ型のみの選択的アセチル
化が生じることから、合成D,L−PTCのラセミ分割のため
にも利用することができる。 このように、本発明は、ラセミPTCのＬ型の選択的Ｎ
−アセチル化のための耐性遺伝子の使用にも関する。 本発明の耐性遺伝子によりコードされたPTCアセチル
トランスフェラーゼは、Ｌ型のみを選択的に攻撃し、Ｄ
型は未変化のままであることから、例えば西独特許第2,
717,440号明細書の方法から得られるように、ラセミ体
をこの酵素のアセチル化作用に供することにより、ラセ
ミPTCを光学対掌体に分割するために使用することがで
きる。かくして得られる混合物は次いで、性質の違いに
基づき自体公知の方法で分割される。 Ｎ−アシル−D,L−アミノ酸をアシラーゼ（担体に固
定しておいてもよい）と接触させてＬ−アミノ酸を選択
的に遊離させ、次いで酸性化後にＮ−アシル−Ｄ−アミ
ノ酸含有混合物からこのＬ−アミノ酸を水不溶性溶媒で
抽出することが、開示されている（英国特許第1,369,46
2号明細書）。Ｎ−アシル−D,L−PTCの同様の分画は、
例えば西独公開第2,939,269号又は米国特許第4,226,941
号明細書に開示されている。 本発明では残存するＤ−PTCは公知の方法（欧州特許
出願公開第（EP−Ａ）0,137,371号、実施例８）でラセ
ミ化され、次いで元のプロセスに戻される。 必ずしも必要ではないが、酵素を単離することは可能
であり、ここで酵素とは本文及び以下において常に酵素
的に活性な部分をも意味しているつもりである。酵素が
単離される場合、これは遊離型として又は担体に固定さ
れて使用することができる。適当な担体の例はEP−Ａ第
0,141,223号明細書に記載されている。しかしながら、
酵素を単離するのではなく、本発明の酵素を発現するい
ずれかの望ましいPTC耐性細胞を用いることが得策であ
る。したがってS.ビリドクロモゲネスDSM4112のPTT耐性
選択株を用いることが、可能かつ得策である。更には、
本発明の遺伝子で形質転換されかつPTCアセチルトラン
スフェラーゼを発現しうるいずれかの望ましい細胞を用
いることが、可能かつ有利である。このような関係か
ら、本発明の遺伝子は、これもその活性部分を意味する
つもりであるが、プラスミドに組込まれた形で又はトラ
ンスフェクション（transfection）のような他の慣用的
遺伝子操作法により宿主細胞中に導入することができ
る。例えばEP−Ａ第0,163,249号及び第0,171,024号明細
書の公知の方法による、例えば大腸菌発現プラスミドへ
の組込み及びかかるプラスミドによる大腸菌の形質転換
が得策である。 ラセミ体中のＬ−PTCの本発明によるＮ−アセチル化
の場合、PTCアセチルトランスフェラーゼを発現する細
胞は遊離又は固定された形で使用することができるが、
固定化としては慣用的方法が適用される（例えば西独公
開第3,237,341号明細書及びそこで引用された文献）。 Ｌ−PTCの本発明による酵素的アセチル化は、酵素反
応に関して慣用的な方法により行なわれるが、その方法
の条件は使用される生物の特徴によって定められる。原
則として、これに適した方法は上記選択的脱アシル化方
法と同様である。 本発明は下記例によって詳細に説明されている。他に
言及のない限り、及び百分率は重量基準である。 例1:PTT耐性選択株 S.ビリドクロモゲネスDSM4112株を最少培地〔ホップ
ウッドら、ストレプトミセスの遺伝子操作、実験マニュ
アル、ザ・ジョン・インズ・ファンデーション、ノーリ
ッジ、イングランド、1985年、233頁（Hopwood et al.,
Genetic Manipulation of Streptomyces,A Laboratory
Manual,The John Innes Foundation,Norwich,England
（1985）,page233）〕で培養し、PTT濃度を増加させな
がら加えた。濃度100μg/mlで、約105のコロニーにつき
１つの耐性コロニーが見出された。 例2:ベクターの調製 プラスミドpSVH1（欧州特許第0,070,522号明細書、米
国特許第4,673,642号明細書）をBgl IIで切断し、大き
さ約7.1kbの断片を分離し、チオストレプトン耐性の1.1
kbBcl I断片と連結させる（欧州特許出願公開第0,158,2
01号）。大きさが約8.15kbのプラスミドpEB2が得られる
（第２図）。 例3:耐性遺伝子の分離 全DNAを例１の選択株から分離し、これをBamH Iで切
断する。プラスミドpEB2をBamH Iで同様に開環し、２つ
の混合物を合わせ、連結させる。連結混合産物でS.リビ
ダンスTK23（ジョン・インズ・ファンデーションから入
手可能）を形質転換すると、約１〜5kbの挿入物を有す
る5000〜10000個の形質転換株が連結混合産物１μｇ当
たりから得られる。PTT耐性について選別により２つの
耐性S.リビダンスコロニーが得られる。取込まれたプラ
スミドを後者から分離し、BamH Iで切断する。耐性の要
因となる遺伝子を含む4kbBamH I断片が見出される。こ
のプラスミドをpPR1（第３図）と命名した。 S.リビダンスTK23の再形質転換により形質転換株はPT
T100μg/ml含有最少培地で増殖することから、PTT耐性
がプラスミドにコードされていることが示される。 例4:N−アセチル化によるPTC不活性化の証明 クローニングした断片のアセチル化活性を証明するた
めに、下記株を試験した:S.ビリドクロモゲネスDSM411
2、S.ビリドクロモゲネス（PTT耐性変異株）、S.リビダ
ンスTK23及びS.リビダンスTK23（pPR1）。 そのためには、株を溶菌培地Ａ（欧州特許出願公開第
0,158,872号、第６頁）に接種し、かつオービタルシェ
ーカー（orbital shaker）中30℃で２日間インキュベー
ションすることが必要である。回収後、菌糸体1mgを適
当な緩衝液〔例えばRS緩衝液：シー・ジェイ・トムソン
ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、第151巻、1
982年、第678−685頁（C.J.Thompson et al.,Journal o
f Bacteriology 151（1982）,678−685）〕中超音波で
破壊する。PTC分解を測定するための典型的実験操作法
は下記のとおりである。 PTC（250μg/ml）溶液100μｌ及びアセチルCoA（4mg/
ml）50μｌを粗抽出物250μｌに加え、混合物を30℃で
２時間インキュベーションする。その時点でもなお存在
するPTC量をHPLCで測定する。この結果は以下のとおり
である。 薄層クロマトグラフィーによる参照物質（ニンヒドリ
ンで染色されない）との比較は、PTCのＮ−アセチル化
が生じたことを示すものである。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明に係るPTC耐性遺伝子の制限地図であ
る。 第２図は、プラスミドpEB2の制限地図である。 第３図は、プラスミドpPR1の制限地図である。
る。 第２図は、プラスミドpEB2の制限地図である。 第３図は、プラスミドpPR1の制限地図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(31)優先権主張番号 Ｐ３７００３１３．５
(32)優先日 1987年１月８日
(33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ）
微生物の受託番号 ＤＳＭ ４１１２
前置審査
(72)発明者 レナーテ、アリヤー
ドイツ連邦共和国ビーレフェルト、ケス
ターカムプ、14
(72)発明者 アルフレート、ピューラー
ドイツ連邦共和国ビーレフェルト、ア
ム、ワルトシュレースヒェン、２
(72)発明者 ゲルハルト、ウェナー
ドイツ連邦共和国フレールスハイム、ア
ム、マイン、フレールスハイマー、シュ
トラーセ、27
(72)発明者 リューディガー、マルクバルト
ドイツ連邦共和国フランクフルト、ア
ム、マイン、ギュンタースブルクアレ
ー、69
(72)発明者 ズザンネ、グラープライ
ドイツ連邦共和国ケーニヒシュタイン
／タウヌス、ヘルダーリンシュトラー
セ、７
(72)発明者 ディーター、ブラウアー
ドイツ連邦共和国フレールスハイム、ア
ム、マイン、ベルリナー、シュトラー
セ、14
(72)発明者 クラウス、バールチェ
ドイツ連邦共和国ケルクハイム（タウヌ
ス）メーメルシュトラーセ、２
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．ホスフィノトリシル−アラニル−アラニン（PTT）
に耐性のストレプトミセス・ビリドクロモゲネスDSM411
2を選別し、耐性株由来全DNAをBamH Iで切断し、大きさ
4.0kb断片をクローニングし、更にPTT耐性について選別
することにより得ることができるホスフィノトリシン
（PTC）耐性遺伝子、を発現する細胞又はこの遺伝子で
コードされた酵素をラセミPTCと接触させることからな
る、ラセミPTCの選択的Ｎ−アセチル化法。 ２．下記に示された制限地図を有する遺伝子を発現する
細胞又はこの遺伝子でコードされた酵素をラセミPTCと
接触させることからなる、特許請求の範囲第１項記載の
ラセミPTCの選択的Ｎ−アセチル化法。 ３．下記のアミノ酸配列をコードするDNA配列を有する
遺伝子を発現する細胞又はこの遺伝子でコードされた酵
素をラセミPTCと接触させることからなる、特許請求の
範囲第１項記載のラセミPTCの選択的Ｎ−アセチル化
法。
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