JPH07147985A - ホスフィノトリシン耐性遺伝子の使用 - Google Patents

ホスフィノトリシン耐性遺伝子の使用

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JPH07147985A
JPH07147985A JP6249627A JP24962794A JPH07147985A JP H07147985 A JPH07147985 A JP H07147985A JP 6249627 A JP6249627 A JP 6249627A JP 24962794 A JP24962794 A JP 24962794A JP H07147985 A JPH07147985 A JP H07147985A
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エックハルト、シュトラウホ
Wolfgang Wohlleben
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Walter Arnold
ワルター、アルノルト
Renate Alijah
レナーテ、アリヤー
Alfred Puehler
アルフレート、ピューラー
Gerhard Woehner
ゲルハルト、ウェーナー
Ruediger Marquardt
リューディガー、マルクバルト
Susanne Grabley
ズザンネ、グラープライ
Dieter Brauer
ディーター、ブラウアー
Klaus Dr Bartsch
クラウス、バールチュ
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 ホスフィノトリシン耐性遺伝子の使用方法の
提供。 【構成】 ホスフィノトリシル‐アラニル‐アラニン
（ＰＴＴ）に耐性のストレプトミセス・ビリドクロモゲ
ネスＤＳＭ４１１２を選別し、耐性株由来全ＤＮＡをＢ
ａｍＨＩで切断し、大きさ４．０ｋｂ断片をクローニン
グし、更にＰＴＴ耐性について選別することにより得る
ことができるホスフィノトリシン（ＰＴＣ）耐性遺伝子
を植物ゲノム中に組込むことからなる、植物にＰＴＣ耐
性を付与する方法、ならびに当該遺伝子を含んでなる、
細菌に於けるＰＴＴ耐性マーカーおよびＰＴＣ耐性マー
カー。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】ホスフィノトリシン（ＰＴＣ、２‐アミノ
‐４‐メチルホスフィノ酪酸）はグルタミンシンテター
ゼの阻害剤である。ＰＴＣは抗生物質ホスフィノトリシ
ル‐アラニル‐アラニンの“構造単位”である。このト
リペプチド（ＰＴＴ）は、グラム陽性及びグラム陰性細
菌に対し並びに真菌ボトリチス・シネレア（Botrytisci
nerea）に対して活性である〔バイエルら、ヘルベチカ
・キミカ・アクタ、第５５巻、１９７２年、第２２４頁
（Bayer et al.,Helvetica Chimica Acta 55(1972)22
4)〕。ＰＴＴはストレプトミセス・ビリドクロモゲネス
（Streptomycesviridochromogenes)
【化１０】 から産生される。
【０００２】西独特許第２，７１７，４４０号明細書
は、ＰＴＣが総合的除草剤として作用することを開示し
ている。公開ＰＣＴ出願ＷＯ第８６／０２０９７号明細
書は、ＰＴＣに対する耐性がグルタミンシンテターゼの
過剰産生に起因する植物について開示する。このタイプ
の過剰産生、例えば遺伝子増幅に基づくもの、は不安定
性というリスクを伴う。かかる不安定性はグルタミンシ
ンテターゼ過剰産生の低下と関係するものであり、ＰＴ
Ｃの競合的阻害作用が再度発現することになるであろ
う。
【０００３】これに対し、特許請求の範囲で規定される
本発明は、ＰＴＣ耐性遺伝子の発見に基き、ＰＴＣ耐性
植物製造のためのその使用に関する。なお、この遺伝子
は耐性マーカーとしても使用することができる。更に
は、この遺伝子はラセミＰＴＣのＬ型の選択的Ｎ‐アセ
チル化にも適している。
【０００４】本発明を用いるＰＴＣ耐性遺伝子は、ＰＴ
Ｔ耐性に関して選択されたストレプトミセス・ビリドク
ロモゲネスＤＳＭ４１１２由来全ＤＮＡをＢａｍＨＩで
切断し、大きさ４．０ｋｂの断片をクローニングし、更
にＰＴＴ耐性について選別することにより得ることがで
きる。制限地図（図１）はこの４．０ｋｂ断片の特徴を
詳しく表わしている。
【０００５】この４ｋｂ断片部分のクローニング実験
は、コード領域部位を更に正確に局在化させるために行
なわれた。これによって、耐性遺伝子は１．６ｋｂＳｓ
ｔII−ＳｓｔＩ断片（図１において０．５５〜２．１５
位）上に位置することが明らかになった。ＢｇｌIIで消
化した場合に断片が得られたが、この断片は大きさが
０．８ｋｂであって、プラスミドに組込みかつストレプ
トミセス・リビダンス（Streptomyces lividans)を形質
転換させた後にはＰＴＴ耐性を与える。この耐性はＰＴ
ＣのＮ‐アセチル化により生じる。
【０００６】０．８ｋｂ断片のマキサム（Maxam)及びギ
ルバート（Gilbert)配列決定により、ＤＮＡ配列Ｉ（後
記）が決定される。耐性遺伝子の位置は、この配列の開
放読取り枠から決定することができる（２５８位以
後）。遺伝子の末端は掲示された中で端から２番目のヌ
クレオチド（８０６位）に位置しており、即ち最後のヌ
クレオチド（８０７位）が停止コードンの最初のヌクレ
オチドとなっている。
【０００７】ＤＮＡ配列Ｉにおけるシャイン‐ダルガル
ノ（Shine-Dalgarno）配列は、開始コードンとして機能
するＧＴＧと同様に、下線によって強調されている。し
たがって、最初の下線部分が究極的な読取り枠を表わ
す。
【０００８】ＤＮＡ配列IIは、配列決定された遺伝子中
の制限部位を示す。７回以上配列を切断する酵素は示さ
れていない。
【０００９】抗生物質ＰＴＴは細菌によって取込まれ、
ＰＴＣに分解される。後者もまた細菌中のグルタミンシ
ンテターゼを阻害することから、細菌はグルタミン欠乏
により死滅する。したがって、ＰＴＴ産生細菌はＰＴＴ
の作用から自らを保護するメカニズム、即ち産生された
ＰＴＴの再取込みを妨げるか又は分解産物ＰＴＣを変化
させるようなメカニズム、を有していなければならな
い。しかしながら、驚くべきことに、ＰＴＴ産生株Ｓ．
ビリドクロモゲネスＤＳＭ４１１２は、その自らの抗生
物質に対して感受性を有している。ところが予想に反
し、ＰＴＴ耐性について選択することにより、ＰＴＴに
耐性でありかつ隣接コロニーのバックグラウンド増殖を
抑制する選択株を１０-5の驚異的高率で発現させること
が可能であった。
【００１０】遺伝子バンクは、ＤＮＡを単離し、それを
ＢａｍＨＩで切断し、かつそれをストレプトミセテスベ
クターと連結することにより、これらの選択株のＤＮＡ
から製造された。連結混合産物で市販Ｓ．リビダンスＴ
Ｋ２３株を形質転換して、連結混合産物１μｇ当たり約
１〜５ｋｂの挿入物を有する約５０００〜１００００個
の形質転換株が得られた。形質転換株中にＰＴＴ耐性
Ｓ．リビダンス株が存在していた。プラスミドの単離及
びＳ．リビダンスの再形質転換によって、耐性がプラス
ミドにコードされていることを証明することが可能であ
った。耐性をになう遺伝子は４ｋｂＢａｍＨＩ断片上に
位置している（図１）。コード領域は０．８ｋｂＢｇｌ
II断片上に位置する。ＢａｍＨＩ断片は酵素ＣｌａＩ、
ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄIII 、ＨｐａＩ、Ｋ
ｐｎＩ、ＰｖｕＩ、ＰｖｕII及びＸｈｏＩの切断部位を
有していない。
【００１１】ストレプトミセス・ヒグロスコピクス（St
reptomyces hygroscopicus) ＦＥＲＭ ＢＰ−１３０／
ＡＴＣＣ２１７０５（欧州特許出願公開第０，１７３，
３２７号、第７図）に関する、まだ詳細には特徴づけら
れていない耐性遺伝子の制限地図との比較により、本発
明の耐性遺伝子はＰＴＴ生合成遺伝子に関する研究中に
見出された公知遺伝子と異なることが示される。
【００１２】一方ではＳ．ビリドクロモゲネスＤＳＭ４
１１２及びＳ．リビダンスＴＫ２３の細胞抽出物と、他
方ではＰＴＴ耐性Ｓ．ビリドクロモゲネス選択株及びプ
ラスミド担持Ｓ．リビダンス形質転換株と、ＰＴＣ及び
アセチルＣｏＡとのインキュベーションにより、後者の
細胞がアセチル化活性を有することを明らかにすること
ができた。クロマトグラフィー試験は、アセチル化がア
ミノ基で生じることを示している。
【００１３】ＰＴＴ耐性が大腸菌（Escherichia coli）
でもみられ、よって耐性メカニズムがグラム陰性菌でも
機能していることから、輸送現象に基づく耐性を除去す
ることができる。したがって、植物プロモーターに結合
させた後適当なベクターを用いて、本発明の耐性遺伝子
を植物に組込んで形質転換させることができ、もってこ
の方法によりＰＴＣ耐性植物を製造することができる。
【００１４】ＰＴＣのＮ‐アセチル化は、Ｌ型のみの選
択的アセチル化が生じることから、合成Ｄ，Ｌ‐ＰＴＣ
のラセミ分割のためにも利用することができる。
【００１５】このように、本発明は、ラセミＰＴＣのＬ
型の選択的Ｎ‐アセチル化のための耐性遺伝子の使用に
関する。
【００１６】本発明に用いる耐性遺伝子によりコードさ
れたＰＴＣアセチルトランスフェラーゼは、Ｌ型のみを
選択的に攻撃し、Ｄ型は未変化のままであることから、
例えば西独特許第２，７１７，４４０号の方法から得ら
れるように、ラセミ体をこの酵素のアセチル化作用に供
することにより、ラセミＰＴＣを光学対掌体に分割する
ために使用することができる。かくして得られる混合物
は次いで、性質の違いに基づき自体公知の方法で分割さ
れる。
【００１７】Ｎ‐アシル‐Ｄ，Ｌ‐アミノ酸をアシラー
ゼ（担体に固定しておいてもよい）と接触させてＬ‐ア
ミノ酸を選択的に遊離させ、次いで酸性化後にＮ‐アシ
ル‐Ｄ‐アミノ酸含有混合物からこのＬ‐アミノ酸を水
不溶性溶媒で抽出することが、開示されている（英国特
許第１，３６９，４６２号明細書）。Ｎ‐アシル‐Ｄ，
Ｌ‐ＰＴＣの同様の分画は、例えば西独公開第２，９３
９，２６９号又は米国特許第４，２２６，９４１号明細
書に開示されている。
【００１８】本発明では残存するＤ‐ＰＴＣは公知の方
法（欧州特許出願公開第（ＥＰ−Ａ）０，１３７，３７
１号、実施例８）でラセミ化され、次いで元のプロセス
に戻される。
【００１９】必ずしも必要ではないが、酵素を単離する
ことは可能であり、ここで酵素とは本文及び以下におい
て常に酵素的に活性な部分をも意味しているつもりであ
る。酵素が単離される場合、これは遊離型として又は担
体に固定されて使用することができる。適当な担体の例
はＥＰ−Ａ第０，１４１，２２３号明細書に記載されて
いる。しかしながら、酵素を単離するのではなく、本発
明の酵素を発現するいずれかの望ましいＰＴＣ耐性細胞
を用いることが得策である。したがってＳ．ビリドクロ
モゲネスＤＳＭ４１１２のＰＴＴ耐性選択株を用いるこ
とが、可能かつ得策である。更には、本発明の遺伝子で
形質転換されかつＰＴＣアセチルトランスフェラーゼを
発現しうるいずれかの望ましい細胞を用いることが、可
能かつ有利である。このような関係から、本発明の遺伝
子は、これもその活性部分を意味するつもりであるが、
プラスミドに組込まれた形で又はトランスフェクション
（transfection）のような他の慣用的遺伝子操作法によ
り宿主細胞中に導入することができる。例えばＥＰ−Ａ
第０，１６３，２４９号及び第０，１７１，０２４号各
明細書に記載されている公知の方法による、例えば大腸
菌発現プラスミドへの組込み及びかかるプラスミドによ
る大腸菌の形質転換が得策である。
【００２０】ラセミ体中のＬ‐ＰＴＣの本発明によるＮ
‐アセチル化の場合、ＰＴＣアセチルトランスフェラー
ゼを発現する細胞は遊離又は固定された形で使用するこ
とができるが、固定化としては慣用的方法が適用される
（例えば西独公開第３，２３７，３４１号明細書及びそ
こで引用された文献）。
【００２１】Ｌ‐ＰＴＣの本発明による酵素的アセチル
化は、酵素反応に関して慣用的な方法により行なわれる
が、その方法の条件は使用される生物の特徴によって定
められる。原則として、これに適した方法は上記選択的
脱アシル化方法と同様である。
【００２２】本発明は下記例によって詳細に説明されて
いる。他に言及のない限り、及び百分率は重量基準であ
る。
【００２３】例１：ＰＴＴ耐性選択株 Ｓ．ビリドクロモゲネスＤＳＭ４１１２株を最少培地
〔ホップウッドら、ストレプトミセスの遺伝子操作、実
験マニュアル、ザ・ジョン・インズ・ファウンデーショ
ン、ノーリッジ、イングランド、１９８５年、２３３頁
（Hopwood et al.,GeneticManipulation of Streptomyc
es,A LaboratoryManual,The John Innes Foundation,No
rwich,England(1985),page233)〕で培養し、ＰＴＴ濃度
を増加させながら加えた。濃度１００μｇ／mlで、約１
０5 のコロニーにつき１つの耐性コロニーが見出され
た。
【００２４】例２：ベクターの調製 プラスミドｐＳＶＨ１（欧州特許第０，０７０，５２２
号明細書、米国特許第４，６７３，６４２号明細書）を
ＢｇｌIIで切断し、大きさ約７．１ｋｂの断片を分離
し、チオストレプトン耐性の１．１ｋｂＢｃｌＩ断片と
連結させる（欧州特許出願公開第０，１５８，２０１
号）。大きさが約８．１５ｋｂのプラスミドｐＥＢ２が
得られる（図２）。
【００２５】例３：耐性遺伝子の分離 全ＤＮＡを例１の選択株から分離し、これをＢａｍＨＩ
で切断する。プラスミドｐＥＢ２をＢａｍＨＩで同様に
開環し、２つの混合物を合わせ、連結させる。連結混合
産物でＳ．リビダンスＴＫ２３（ジョン・インズ・ファ
ンデーションから入手可能）を形質転換すると、約１〜
５ｋｂの挿入物を有する５０００〜１００００個の形質
転換株が連結混合産物１μｇ当たりから得られる。ＰＴ
Ｔ耐性について選別により２つの耐性Ｓ．リビダンスコ
ロニーが得られる。取込まれたプラスミドを後者から分
離し、ＢａｍＨＩで切断する。耐性の要因となる遺伝子
を含む４ｋｂＢａｍＨＩ断片が見出される。このプラス
ミドをｐＰＲ１（図３）と命名した。
【００２６】Ｓ．リビダンスＴＫ２３の再形質転換によ
り形質転換株はＰＴＴ１００μｇ／ml含有最少培地で増
殖することから、ＰＴＴ耐性がプラスミドにコードされ
ていることが示される。
【００２７】例４：Ｎ‐アセチル化によるＰＴＣ不活性
化の証明 クローニングした断片のアセチル化活性を証明するため
に、下記株を試験した：Ｓ．ビリドクロモゲネスＤＳＭ
４１１２、Ｓ．ビリドクロモゲネス（ＰＴＴ耐性変異
株）、Ｓ．リビダンスＴＫ２３及びＳ．リビダンスＴＫ
２３（ｐＰＲ１）。
【００２８】そのためには、株を溶菌培地Ａ（欧州特許
出願公開第０，１５８，８７２号、第６頁）に接種し、
かつオービタルシェーカー（orbital shaker）中３０℃
で２日間インキュベーションすることが必要である。回
収後、菌糸体１mgを適当な緩衝液〔例えばＲＳ緩衝液：
シー・ジェイ・トムソンら、ジャーナル・オブ・バクテ
リオロジー、第１５１巻、１９８２年、第６７８−６８
５頁（C.J.Thompson et al.,Journal of Bacteriology
151 (1982),678-685）〕中超音波で破壊する。ＰＴＣ分
解を測定するための典型的実験操作法は下記のとおりで
ある。
【００２９】ＰＴＣ（２５０μｇ／ml）溶液１００μｌ
及びアセチルＣｏＡ（４mg／ml）５０μｌを粗抽出物２
５０μｌに加え、混合物を３０℃で２時間インキュベー
ションする。その時点でもなお存在するＰＴＣ量をＨＰ
ＬＣで測定する。この結果は以下のとおりである。
【００３０】 未 反 応ＰＴＣ 株 導入されたＰＴＣ Ｓ．リビダンスＴＫ２３ １００％ Ｓ．ビリドクロモゲネス（ＤＳＭ４１１２） ７２％ Ｓ．ビリドクロモゲネス選択株（例１による） ７％ Ｓ．リビダンスＴＫ２３（ｐＰＲ１） ３１％ 薄層クロマトグラフィーによる参照物質（ニンヒドリン
で染色されない）との比較は、ＰＴＣのＮ‐アセチル化
が生じたことを示すものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明によるＰＴＣ耐性遺伝子の制限地図。
【図２】プラスミドｐＥＢ２の制限地図。
【図３】プラスミドｐＰＲ１の制限地図。
フロントページの続き (31)優先権主張番号 Ｐ３７００３１３．５ (32)優先日 1987年１月８日 (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (72)発明者 ワルター、アルノルト ドイツ連邦共和国ビーレフェルト、アム、 ゴッテスベルク、25 (72)発明者 レナーテ、アリヤー ドイツ連邦共和国ビーレフェルト、ケスタ ーカムプ、14 (72)発明者 アルフレート、ピューラー ドイツ連邦共和国ビーレフェルト、アム、 ワルトシュレースヒェン、２ (72)発明者 ゲルハルト、ウェーナー ドイツ連邦共和国フレールスハイム、ア ム、マイン、フレールスハイマー、シュト ラーセ、27 (72)発明者 リューディガー、マルクバルト ドイツ連邦共和国フランクフルト、アム、 マイン、ギュンタースブルクアレー、69 (72)発明者 ズザンネ、グラープライ ドイツ連邦共和国ケーニヒシュタイン／タ ウヌス、ヘルダーリンシュトラーセ、７ (72)発明者 ディーター、ブラウアー ドイツ連邦共和国フレールスハイム、ア ム、マイン、ベルリナー、シュトラーセ、 14 (72)発明者 クラウス、バールチュ ドイツ連邦共和国ケルクハイム（タウヌ ス）メーメルシュトラーセ、２

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ホスフィノトリシル‐アラニル‐アラニン
    （ＰＴＴ）に耐性のストレプトミセス・ビリドクロモゲ
    ネスＤＳＭ４１１２を選別し、耐性株由来全ＤＮＡをＢ
    ａｍＨＩで切断し、大きさ４．０ｋｂ断片をクローニン
    グし、更にＰＴＴ耐性について選別することにより得る
    ことができるホスフィノトリシン（ＰＴＣ）耐性遺伝子
    を植物ゲノム中に組込むことからなる、植物にＰＴＣ耐
    性を付与する方法。
  2. 【請求項２】ホスフィノトリシン耐性遺伝子が、下記の
    アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する、請求項
    １に記載の、植物にＰＴＣ耐性を付与する方法。 【化１】
  3. 【請求項３】下記の制限地図を有する遺伝子を植物ゲノ
    ム中に組込むことからなる、請求項１および２のいずれ
    か１項に記載の、植物にＰＴＣ耐性を付与する方法。 【化２】
  4. 【請求項４】下記のＤＮＡ配列を有する遺伝子を植物ゲ
    ノム中に組込むことからなる、請求項１〜３のいずれか
    １項に記載の、植物にＰＴＣ耐性を付与する方法。 【化３】
  5. 【請求項５】ホスフィノトリシル‐アラニル‐アラニン
    （ＰＴＴ）に耐性のストレプトミセス・ビリドクロモゲ
    ネスＤＳＭ４１１２を選別し、耐性株由来全ＤＮＡをＢ
    ａｍＨＩで切断し、大きさ４．０ｋｂ断片をクローニン
    グし、更にＰＴＴ耐性について選別することにより得る
    ことができる、ホスフィノトリシン（ＰＴＣ）耐性遺伝
    子を含んでなる、細菌に於けるＰＴＴ耐性マーカー。
  6. 【請求項６】ホスフィノトリシン耐性遺伝子が、下記の
    アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する、請求項
    ５に記載の、細菌に於けるＰＴＴ耐性マーカー。 【化４】
  7. 【請求項７】下記の制限地図を有する遺伝子を含んでな
    る、請求項５および６のいずれか１項に記載の、細菌に
    於けるＰＴＴ耐性マーカー。 【化５】
  8. 【請求項８】下記のＤＮＡ配列を有する遺伝子を含んで
    なる、請求項５〜７のいずれか１項に記載の、細菌に於
    けるＰＴＴ耐性マーカー。 【化６】
  9. 【請求項９】ホスフィノトリシル‐アラニル‐アラニン
    （ＰＴＴ）に耐性のストレプトミセス・ビリドクロモゲ
    ネスＤＳＭ４１１２を選別し、耐性株由来全ＤＮＡをＢ
    ａｍＨＩで切断し、大きさ４．０ｋｂ断片をクローニン
    グし、更にＰＴＴ耐性について選別することにより得る
    ことができるホスフィノトリシン（ＰＴＣ）耐性遺伝子
    を含んでなる、植物細胞に於けるＰＴＣ耐性マーカー。
  10. 【請求項１０】ホスフィノトリシン耐性遺伝子が、下記
    のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する、請求
    項９に記載の、植物細胞に於けるＰＴＣ耐性マーカー。 【化７】
  11. 【請求項１１】下記の制限地図を有する遺伝子を含んで
    なる、請求項９および１０のいずれか１項に記載の、植
    物細胞に於けるＰＴＣ耐性マーカー。 【化８】
  12. 【請求項１２】下記のＤＮＡ配列を有する遺伝子を含ん
    でなる、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の、植物
    細胞に於けるＰＴＣ耐性マーカー。 【化９】
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