DK175254B1

DK175254B1 - Resistensgensekvens mod phosphinothricin og anvendelse deraf

Info

Publication number: DK175254B1
Application number: DK198704378A
Authority: DK
Inventors: Gerhard Woehner; Ruediger Marquardt; Dieter Brauer; Susanne Grabley; Wolfgang Wohlleben; Alfred Puehler; Klaus Bartsch; Eckhard Strauch; Walter Arnold; Renate Alijah
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1986-08-23
Filing date: 1987-08-21
Publication date: 2004-07-26
Also published as: JPH03103193A; CN1124347C; JP2815847B2; EP0257542B1; FI873610A0; IL83604A; CN87105764A; JP2749424B2; JPS6371183A; DK437887A; HUT44621A; EP0257542A3; HU217208B; CA1337597C; JPH09107981A; CN1040772C; IL83604A0; GR3005200T3; FI100251B; ES2038631T3

Description

DK 175254 B1 i

Phosphinothricin (PTC, 2-amino-4-methylphosphinosmør-syre) er en glutaminsyntetase-inhibitor. PTC er en "byggesten" i antibiotikummet phosphinothricyl-alanyl-alanin.

Dette tripeptid (PTT) er aktivt overfor gram-positive og 5 gram-negative bakterier og ligeledes overfor svampen Botrytis , cinerea (Bayer et al., Helv. Chim. Acta 55 (1972) 224). PTT

produceres af stammen Streptomyces viridochromogenes Tu 494 (DSM 40736, DSM 4112).

Fra tysk patentskrift nr. 2.717.440 er det kendt, at 10 PTC virker som totalherbicid. I den offentliggjorte PCT-ansøgning WO nr. 86/02.097 er beskrevet planter, hvis resistens mod PTC skyldes, at de overproducerer glutaminsyntetase. Sådanne overproduktioner, eksempelvis som følge af en genamplifikation, gemmer dog risikoen for ustabilitet i 15 sig. Såfremt der er tale om en sådan ustabilitet, ville overproduktionen af glutaminsyntetase således gå tilbage, og den kompetitive inhibitorvirkning af PTC ville atter blive virksom.

Opfindelsen, som er defineret i patentkravene, angår 20 i modsætning hertil en resistensgensekvens mod PTC og anvendelsen deraf til fremstilling af PTC-resistente planter. Yderligere kan denne gensekvens ligeledes finde anvendelse som resistensmarkør. Endvidere egner genet sig til selektiv N-acetylering af L-formen af racemisk PTC.

25 Resistensgensekvensen ifølge opfindelsen mod PTC kan fås ud fra hele DNA'et af Streptomyces viridochromogenes < DSM 4112, der er selekteret med hensyn til PTT-resistens, ved klipning med BamHI, kloning af et 4,0 kb stort fragment og selektion med hensyn til PTT-resistens. Restriktionskortet 30 (figur 1) karakteriserer dette 4,0 kb-fragment nærmere.

Ved kloning af delområder af dette 4 kb-fragment lokaliseres beliggenheden af kodeområdet nærmere. Herved viser det sig, at resistensgenet ligger på det 1,6 kb lange Sstll-SstI-fragment (positionerne 0,55 - 2,15 i fig. 1).

35 Ved nedbrydning med Bglll fås det 0,8 kb store fragment, som efter indbygning i et plasmid og transformation af S.

I DK 175254 B1 I

I 2 I

I lividans giver PTT-resistens. Denne resistens er betinget I

I af N-acetyleringen af PCT. I

I Sekvenseringen ifølge Maxam og Gilbert af det 0,8 kb I

I lange fragment giver DNA-sekvensen I (bilag). Fra de åbne I

I 5 læserammer i denne sekvens kan man finde beliggenheden af '' I

I resistensgenet (fra stilling 258) . Slutningen af gensekvensen I

I ligger ved den næstsidste af de gengivne nucleotider (stil- I

I ling 806), dvs., at det sidste nucleotid (stilling 807) er I

I begyndelsen af stop-kodonet. I

I 10 I DNA-sekvensen I er "Shine-Dalgarno-Sekvensen" frem- I

I hævet ved understregning, ligesom det som start-kodon vir- I

I kende GTG. Den bestemmende læseramme er ligeledes udtrykt I

I i den øverste linie. I

I DNA-sekvensen II viser restriktionsskæringsstederne I

I 15 i det sekvenserede gen. Enzymer, som skærer sekvensen mere I

I end seks gange, er ikke angivet. I

I Antibiotikummet PTT optages af bakterier og nedbrydes I

I til dannelse af PTC. Dette inhiberer i bakterier ligeledes I

I glutaminsyntetasen, således at bakterierene dør af glutamin- I

I 20 mangel. PTT-producerende bakterier skal følgelig besidde en I

I mekanisme, som beskytter dem mod virkningen af PTT, altså I

I enten hindrer genoptagelsen af det producerede PTT eller I

I muliggør en ændring af nedbrydningsproduktet PTC. Overras- I

I kende er PTT-producenten S. viridochromogenes DSM 4112 imid- I

I 25 lertid følsomt overfor dets eget antibiotikum. Uventet er I

I det imidlertid lykkedes, ved selektion med hensyn til PTT- I

I -resistens med den overraskende høje rate på ca. 10“^ at ^ I

I finde selektanter, som er resistente overfor PTT og lige- I

I ledes undertrykker baggrundsvæksten af de nærliggende kolo- „ I

I 30 nier. I

I Ud fra DNA fra disse selektanter anlægges en genbank I

I ved, at DNA'et isoleres, spaltes med BamHI og ligeres til I

I en streptomycetvektor. Ligeringsblandingen transformeres i I

I den i handelen gængse stamme S. lividans TK 23, idet der I

I 35 for hver 1 mg ligeringsblanding fås fra ca. 5000 til 10.000 I

I transformanter med en indbygning fra ca. 1 til ca. 5 kb. I

3 DK 175254 B1

Blandt transformanterne befinder sig PTT-resistente S. livi-dans-stammer. Ved isolering af plasmidet og retransformation i S. lividans kan det vises, at resistensen er plasmidkodet.

Det for resistensen ansvarlige gen ligger på et 4 kb-BamHI-5 -fragment (fig. l) . Kodeområdet er lokaliseret på det 0,8 kb lange Bglll-fragment. BamHI-fragmentet indeholder ikke nogle skæringssteder for enzymerne Clal, EcoRI, EcoRV, Hind-III, Hpal, Kpnl, Pvul, PvuII og Xhol.

Sammenligningen med restriktionskortet for et ikke 10 nærmere karakteriseret resistensgen fra S. hygroscopicus FERM BP-130/ATCC 21705 (europæisk patentansøgning med offentliggørelsesnummeret 173.327, fig. 7) viser, at resistensgensekvensen ifølge opfindelsen er forskelligt fra det kendte gen, hvilket man har fundet ved søgningen efter PTT-15 biosyntesegenerne.

Ved inkubation af celleekstrakter af S. viridochromo-genes DSM 4112 og S. lividans TK 23 på den ene side og de PTT-resistente S. viridochromogenes-selektanter og en plas-midbærende S. lividans-transformant på den anden side med 2 0 PTC og acetyl-koenzym A kan det vises, at de sidstnævnte celler viser en acetylerende aktivitet. Chromatografiske undersøgelsesresultater viser, at acetyleringen sker på aminogruppen.

Da man ligeledes, i E. coli kan konstatere en PTT-25 resistens, og resistensmekanismen således ligeledes fungerer i gram-negative bakterier, kan en resistens på grund af transportfænomener udelukkes. Resistensgesekvensen ifølge opfindelsen kan følgelig efter kobling til vegetabilske promotorer med egnede vektorer transformeres til planter, 30 og der kan således fremstilles PTT-resistente planter.

N-acetyleringen af PTC kan ligeledes anvendes til racematadskillelse af syntetisk D,L-PTC, da der selektivt kun sker en acetylering af L-formen.

Opfindelsen angår følgelig også anvendelsen af resi-35 stensgensekvensen til selektiv N-acetylering af L-formen af racemisk PTC.

I DK 175254 B1 I

i 4 I

I Den af resistensgensekvensen ifølge opfindelsen kodede I

I PCT--acetyltransferase kan altså benyttes til at adskille I

I racemisk PCT, såsom den eksempelvis kan fremstilles ifølge I

I tysk patentskrift nr.2.717.440, i de optiske antipoder ved, I

I 5 at racematet udsættes for den acetylerende virkning af dette I

I enzym, idet L-formen selektivt angribes, medens D-formen ^ I

I forbliver uændret. Den således tilvejebragte blanding kan I

I derefter på baggrund af dens forskellige egenskaber adskilles I

I på i og for sig kendt måde. I

I 10 Det er kendt at bringe N-acyl-D, L-aminosyrer i kontakt I

I med eventuelt bærerfikserede acylaser, idet L-aminosyren I

I selektivt frigives, hvilken syre kan ekstraheres fra blandin- I

I gen med N-acyl-D-aminosyre efter syrning med ikke-vandbiand- I

I bare opløsningsmidler (britisk patentskrift nr. 1.369.462). I

I 15 En tilsvarende adskillelse af N-acyl-D,L-PTC er eksempelvis I

I kendt fra tysk offentliggørelsesskrift nr. 2.939.269 eller I

I US-patentskrift nr. 4.226.941. I

I Det ifølge opfindelsen tilbageblevne D-PCT kan på I

I kendt måde racemiseres (europæisk patentansøgning med of- I

I 20 fentliggørelsesnummeret (EP-A) 137.371, eksempel 8) , og I

I derpå føres tilbage til processen. I

I Isoleringen af enzymet, hvorved man her og i det I

I følgende ligeledes altid skal forstå den enzymatisk virksomme I

I del, er mulig, men ikke nødvendig. Såfremt enzymet isoleres, I

I 25 kan det anvendes i fri eller bærerfikseret form. Egnede I

I bærere er eksempelvis beskrevet i EP-A nr. 141.223. Hen- I

I sigtsmæssigt isoleres enzymet dog ikke, men man anvender ^ I

I vilkårlige PTC-resisténte celler, som eksprimerer enzymet I

I ifølge opfindelsen. Således kan man hensigtsmæssigt anvende . I

I 30 de PTT-resistente selektanter af S. viridochromogenes DSM I

I 4112. Fordelagtigt kan imidlertid også komme en vilkårlig, I

I med gensekvensen ifølge opfindelsen transformeret celle til I

I anvendelse, som er i stand til at eksprimere PTC-acetyl- I

I transferasen. Genet ifølge opfindelsen, hvorved man her I

I 35 ligeledes skal forstå aktive dele af dette, kan i den for- I

I bindelse i plasmidintegreret form eller med andre gængse I

5 DK 175254 B1 gentekniske metoder, eksempelvis ved transfektion. Hensigtsmæssig er eksempelvis indbygningen i et E. coli-ekspres-sionsplasmid og transformation af E. coli med et sådant plasmid, eksempelvis ifølge de fra EP-A nr. 163.249 og 5 171.024 kendte fremgangsmåder.

Til N-acetylering ifølge opfindelsen af L-PTC i race-matet kan man anvende de celler, som eksprimerer PTC-acetyl-transferasen, i fri eller fikseret form, idet de gængse fikseringsmetoder finder anvendelse (eksempelvis tysk of-10 fentliggørelsesskrift nr. 3.237.341 og deri citeret litteratur) .

Den enzymetiske acetylering ifølge opfindelsen af L-- PTC sker på den for enzymatiske omsætninger gængse måde, idet fremgangsmådebetingelserne retter sig efter den anvendte 15 organismes givne forhold. Principielt kommer hertil de samme metoder som for den ovennævnte selektive afacyleringsfrem-gangsmåde i betragtning.

I de følgende eksempler belyses opfindelsen nærmere.

Dele og procentangivelser er på vægtbasis, medmindre intet 20 andet er angivet.

Eksempel 1: PTT-resistente selektanter

Stammen S. viridochromogenes DSM 4112 dyrkes på minimal medium (Hopwood et al., Genetic Manipulation of Strep-25 tomyces, A Laboratory Manual, The John Innes Foundation,

Norwich, England (1985), s. 233), og der tilsættes PTT i stigende koncentrationer. Ved en koncentration på 100 ^g/ml findes der en resistent koloni pr. ca. 105 kolonier. 1 2 3 4 5 6

Eksempel 2: Fremstilling af vektoren 2

Plasmidet pSVHl (europæisk patentskrift nr. 070.522) 3 skæres med Bglll, det ca. 7,1 kb store fragment isoleres og 4 ligeres med 1,1 kb Bell-fragmentet med thiostrepton-resi- 5 stensen (europæisk patentansøgning med offentliggørelsesnum- 6 meret 158.201). Man får det 8,15 store plasmid pEB2 (fig.

2) .

I DK 175254 B1 I

I 6 I

I Eksempel 3: Isolering af resistensgenet I

I Fra selektanteme ifølge eksempel l isolerer man I

I hele DNA'et og spalter det med BamHI. Plasmidet pEB2 åbnes I

I ligeledes med BamHI, de to blandinger forenes og ligeres. I

I 5 Ligeringsblandingen transformeres ved S. lividans TK 23 ' I

I (som kan fås ved John Innes Foundation) , idet der pr. 1 //g I

I ligeringsblanding fås fra 5000 til 10.000 transformanter I

I med en indbygning fra ca. 1 til ca. 5 kb. Ved selektion med I

I hensyn til PTT-resistens fås to resistente S. lividans-kolo- I

I 10 nier. Ud fra disse isoleres det optagne plasmid og skæres I

I med BamHI. Man får et 4 kb BamHI-fragment, som bærer det I

I for resistensen ansvarlige gen. Dette plasmid får betegnelsen I

I pPRl (fig. 3). I

I Ved retransformation til S. lividans TK 23 kan det I

I 15 vises, at PTT-resistensen er plasmidkodet, da transformanter- I

I ne vokser på minimalmedium, som indeholder 100 μg PTT pr. ml. I

I Eksempel 4: Påvisning af inaktiveringen af PTC ved N-acetyl- I

I ering I

I 20 Til påvisning af den acetylerede aktivitet af det I

I klonede fragment undersøges følgende stammer: I

I S. viridochromogenes DSM 40736, S. viridochromogenes (PTT- I

I -resistente mutanter), S. lividans TK23 og S. lividans TK I

I 23 (pPRl). I

I 25 Dertil podes stammerne i lysemedium A (europæisk I

I patentansøgning med offentliggørelsesnummeret 158.872, s. I

I 6) og inkuberes i 2 dage ved 30°C i et rundry s t eapparat. I

I Efter høsten oplukkes 1 g mycelium i en egnet puffer (eksem- I

I pelvis RS-buffer: C. J. Thompson et al., J. Bacteriol. 151 I

I 30 (1982), 678-685) med ultralyd. Et typisk eksperiment til I

I måling af PTT-nedbrydningen forløber som følger*. I

I Til 250 ^liter råekstrakt sættes der 100 filter PTC- I

I -opløsning (250 j/g/ml) og 50 μϋίθΓ (4 mg/ml) acetyl-CoA, I

I og der inkuberes i 2 timer ved 30°C. De derefter endnu til- I

I 35 stedeværende PTC-mængder måles ved hjælp af HPLC. Derved I

I får man følgende resultat: I

7 DK 175254 B1

Stamme ikke-omsat PTC

anvendt PTC

5 S. lividans TK23 100% S. viridochromogenes 72% (DSM 40736) S. viridochromogenes 7% selektanter 10 S. lividans TK 23 (pPRl) 31%

At det drejer sig om en N-acetylering af PTC, kan påvises ved sammenligning med referencestoffer ved tyndtlags-chromatografi (ingen farvning med ninhydrin).

I DK 175254 B1 I

I I

I DNA-Sekvens I I

I IleTrpSerAspValLeuGlyAIaGlyProValLeuProGlyAspAspPhePheSerLeuGlyGlyThrSerlle I

I A5pLeu61uArgArgPro61y61yArgSerGlyAleAlaArgGlyArgLeuLeuLeuProArgArgHi5LeuHi5 I

I ArgSerSlyAIaThpSerTrpGlyProValArgCysCysProGlyThrThrSerSerProSerAlaAlaProPro I

I AGATCTG6AGCGACGTCCTG&GGGCCGGTCCGSTGCTGCCCGG6SAC6ACTTCTTCTCCCTCGSCGGCACCTCCA 75 I

I TCTA6ACCTC6CTGCAGGACCCCC6GCCAGGCCACGAC5G6CCCCTSCTGAAGAAGA6G&A5CC6CC5TGGAGGT _ I

I SerArgSerArgArgGlyProProArgAspProAlaAlaArgProArgSerArgArgGlyArgArgCysArgTrp I

I AspProAlaUalAspGlnPpoGlyThrArgHisGlnGlyPpoValUalGluGluGlyGluAlaAla61yGlyA5P I

I IleGlnLeuSepThrArgProAlaProGlyThrSerGlyProSerSerLysLysGluArgProPpoyalGluttei I

I SerAlaLeuArgUaiyalSerApglleArgLysGluLeuGly^JalPpoLeuArgLeuAlayalllePheGluThr I

I LeuGly'JalAlaGlyGlyLeuAlaHisProGlnGlyThpArgApgAlaThpPpoAlaArgApgAapLeuApgAsp I

I SerArgArgCys&lyTrpSerArgAlaSerAlaArgAsnSerAlaCysHisSerGlySerProOP Ser5erApg . I

I TCTC&GCGTTGCGGGTG5TCTCGC6CATCCGCAA6GAACTC6GC6TGCCACTCCG&CTCGCC6T5ATCTTCGAGA 150 I

I A6AGCCGCAACGCCCACCAGAGCGCSTA6SCGTTCCTTGAGCCGCACGGTGA6SCCGASCGGCACTAGAAGCTCT I

I ArgProThpAlaProProArgAlaCysGlyCysProUalArgArgAlaUalGlyAlaArgArgSerArgArgSer I

I ArgApgGlnProHi 5AspArgAlaAspAlaLeuPhe61uAlaHisTrp61uProGluSlyHisAspGluLeuArg I

I 51uAlaAsnArgThrThr61uArgf1etArgLeu5erSerProThrGly5erArgSerAlaThrIleLys5erVal I

I ProSerleuGluAlaValAlaGluSer-ValLeuArgGluLeuLysGlyThrAM OC Arg&lyAlaArgHisPro I

I AlaValProGlySerGlyGlyArglleArgThrProArgThrSluGlyAspVelValLysApgCysProProPro I

I ArgArgProTrpLysArgTppProAsnPpoTyrSerAlaAsnOP ArgGlyArgSerLysGluValProAlaThr I

I CGCCGTCCCTGGAASCGGTGGCCGAATCCGTACTCCGCGAACTGAAG5G6ACSTA6TAAAGAG6TGCCCGCCACC 225 I

I gcggcagggaccttcgccaccsgcttaggcatgaggcgcttgacttcccctgcatcatttctccacgggcggtgg I

I AlaThrGlyProLeuProProArgIleArgyalGlyArgValSerPrD5erThrThrPheLeuHi5Gly61yGly I

I ApgGlyGlnPheArgHisGlyPheGlyTyrGluAlaPheGlnLeuProArgLeuLeuSerThrSlyAlaUalArg I

I GlyAspArgSepAlaThrAlaSerAapThrSerArgSerSerPheProyalTyrTyrLeuProAiaArgTppGJy I

I LeuSerGlnAsnThrG1uGIyArgProHi sUa]5erPro61uArgArgProya1 GIul1eArgProA] aThpAla I

I AiaPheAlaGluHisArgArgLysThrThrArgGluProArgThrThrProGlyArgAspPpoSerArgHisArg I

I ArgPheArgApgThrProLysGluAspHisThrOP AlaGlnAsnAspAlaArgSerArgSepyalProProPro I

I C6CTTTCSCAGAACACCGAA6SAAGACCACAC5IÉA6CCCA6AAC&ACSCCCG6TC6A6ATCC6TCCCGCCACC& 300 I

I BCGAAAGCSTCTT&TS&CTTCCTTCT65TGTGCACTCG65TCTT5CT&C&GGCCÅ&CTCTAGGCA&&&CG6TGGC I

I AlaLysAlaSerCysArgLeuPheyelValArQ5erGlyLeuValVal61yProArgSer61yAspArgTrpArg I

I LysArgLeu^alGlyPheSerSerTrpyalHisAIaTrpPheSerAlaArgAspLauAspThrGiyGlyGlyGly I

I Ser61uCy5PheyalSerProLeuGlyCysThrLeuGlySerArgArg6lyThrSerIleArgGlyAlaWalAla I

I AlaAspMetAlaAlaValCysAspIleyalAsnHisTyrlleGluThrSerThrValAsnPheArgThrGluPro I

I ArgArgHxsGlySlyGlyLeuArgHisArgGlnSerLeuHisArgAspGluHisGlyGlnLeuProTyrGlyAla I

I ProProThrTrpArgArgSerAlaThrSerSerlleThrThrSerArgArgAlaArgSerThrSerValArgSer I

I CCSCCGACATS5CG5CGGTCT6CGACATCSTCAATCACTACATCGASACSASCACGGTCAACTTCCSTACGGAGC 375 I

I SGC5GCTGTACCSCC&CCAGAC6CT6TA6CAGTTA5T6AT6TAGCTCT6CTC6TGCCA6TTGAA&SCAT6CCTCG I

I ArgArgCysProProProArgArgCysArgOP AspSerCysArgSerSerCysProOP SerGlyTyrProAla I

I SlyUalHisArgArgAspAlayalAspAspIleUaiyalAspLeuArgAlaArgAspyelGluThrArgLeuArg I

I AiaSerMetAlaAlaThrSlnSerMetThrLeuOP AM MetSerValLeuValThrLeuLysArgVaiSerGly I

I GlnThrProSlnGIuTppIleAspAspLeuGIuArgLeuSlnAspArgTyrProTrpLeuValAlaGIuVaiGlu I

I AlaAspSerAla61yUalAspArgArgPro61yAlaProProGlyProLeuProLeuAlaArgArgArgGly61y I

I ArgArgLeuArgArg5er61ySerThrThrTrpSerAlaSerArgThrAlaThrProGlySerSerProArgTrp I

I C6CAGACTCCGCA9GAGTGGATCGAC5ACCTG6AGC6CCTCCAGGACCGCTACCCCT6GCTC6TC6CCGAG6TGG 450 I

I 6CGTCTGA6&C5TCCTCACCTASCTGCT6GACCTC6CGGAG6TCCT66C6AT6GG6ACCGA6CAGC66CTCCACC I

I Ala5er61uAlaProThrSerArgArg61yProAla61y61yProGlySerGlyArgAlaArgArgArgProPrD I

I LeuSerArgLeuLeuProA5pValUal61nLeuAla51uLeuValAlaValSlyPrD61uA5p61yLeuHisLeu I

I CysUalGlyCysSerHisIleSerSerArgSerArgArgTrpSerArgAM SlyGlnSerThrAlaSerThrSer I

9 DK 175254 B1 DNA-Sekvens I (fortsat)

GlyUalUalAlaGlylleAlaTyrAlaGlyProTrpLysAlaArgAsnAlaTypAspTrpThpUalGluSerThr GlyArQArgApgArgHiaArgLeuArgArgProLeuGluGlyProGlnArgLeuApgLeuAspArgArgValAsp * ArgAla5erSerProAla5erProThrProA]aProSlyArgProAlaThrProThrThr61yPro5er5erArg AGG&C6TC6TCGCC66CATC6CCTACGCC6GCCCCT66AA6GCCCGCAACGCCTAC6ACT6GACCSTCGA6TCGA B25

TCCC&CAGCAGCGGCCGTAGCGGATGCGGCCGGGGACCTTCCGGSCGTTGCGGATGCTGACCTGGCAGCTCAGCT

ProArgArgArgArgCysArgArgArgArgSlyArgSerProSlyCysArgArgArgSerSerApgArgThrSer AIaAspA5pGlyAIaAsp5IyVei61yAla61yProLeuSIyAiaVal61yVeU/aiPro61yA3pLeuArgArg ProThrThrAiaProMetAlaAM AlaProGlyGlnPheAiaArgLeuAlaAM SerSlnyalThrSerAspUal

ValTyrValSerHisArgHisSlnArgLeuGlyLeuGlySerThrLeuTyrThrHisLeLiLeuLysSerfletGlu GlyValArgLeuPrDProAlaProAlaAlaArgThrGlyLeuHisProLeuHisPrePpoAlaGluUalHisGly ArgCysThrSepProThr61yThrSer61ySerA5pTppAlaProPro5erThrPpoThrCysOP SerProTrp cggtgtacgtctcccaccggcaccagcgsctcggactgggctccaccctctacacccacctgctgaagtccatgg see

6CCACATGCAGAGGGTGGCCGTG6TCGCCGAGCCT6ACCCGAGSTSSGAGATGTGGGTGSACGACTTCASGTACC

ProThrApgArgSlySlyAlaGlyAlaAlaApgUalPpoSepTppGlyApgCysGlyGlyAlaSerThpTrpPpo

Hi.5ValA5pGlyValProValLeuPro61uSerSlnAla61y61y61uVal61yVal61nGlnLeuGlyHi5Leu ThpTyrThr61uTppArgCy5TppApgSerProSerPpo61uValArgAM ValTrpArgSerPheAspMetSer

AlaGlnGlyPheLysSerVelValAlaVaIIleGlyLeuPpoAsnAspProSerValArgLeuHisGluAlaLeu 61yPraGlyLeu61n61uArg61yArgArgHi sArgThpAlaGlnArgProGluArgAlaPpoAlaApgGlyAla ApgProArgAleSerArgAlaTppSerPpoSepSerAspCysProThrThrArgAlaCysAlaCysThpArgApg ASGCCCAGGGCTTCAA6A&CGTGGTCGCCGTCATCGGACT6CCCAAC6ACCCGAGC6T6CGCCT6CACSAGGC6C G7S TCCSSGTCCCSAAGTTCTC5CACCAGCGGCAGTAGCCTGACGGGTTGCTGG&CTCGCACGCGGAC6T6CTCCGCG Pro61yProSerOP SepArgPpoApgArgOP ApgValAlaTppApgSlySerApgAlaGlyAlaArgProAla

GlyLeuAlaGluLeuAlaHiaAspGlyAspAspSerGlnGlyValValArgAlaHisAlaGlnValLeuApg&lu

AlaTrpProLy3LeuLeuThrThrAlaThrMetPro5er61yLeu5ep61yLeuThrArgArgCysSepAlaSer

SlyTypThpAlaArgGlyThrLeuArgAleAlaGlyTypLysHisGlyGlyTrpHisAspValSlyPheTppGln ArglleHisApgAlaArgAspAlaAle61ySerArgLeuGlnAlaApg61yLeuAlaApgApg61yValLeuAla 5epAspThpPpoArgAleGlyArgCysGlyGlnProAlaThrSerThr61yAlaGlyThrThrTppGly5ep61y TCG6ATACACC6C6C6CG66ACSCT6CG6SCAGCCG&CTACAA6CAC6666GCT6GCAC6ACGT6GGSTTCT6SC 750 AGCCTATGTGGCGCGCGCCCT6CGACGCCCGTCGGCCGAT6TTCGTSCCCCC5ACC5TGCT6CACCCCAA5ACCG ApglleCysApgAlaArgSepAlaAlaPpoLeuApgSerCysAlaArgProSerAlaApgApgPpoThrArgAla , SerVal61yArgAlaProArgGlnProCysGlyAlaValLeuValProAlaProValValHisPpoGluProLeu

ProTyrVaiAlaArgPpoValSerArgAlaAlaProAtt LeuCysPrDPpo61nCy5SerThpPpoAsnGlnCys

ArgAspPheGluLeuProAlaProProApgPpoValArgProValThpGinlle AiaArøLeuArgAlaAlaSlyProAlaProPpoArgProAleArgHisThpAsp SerAlaThr5erSepCysArgProApgProAlaPro5ep61yPro5erHisArg5er ASC6CSACTTCGASCT6CCGSCCCCGCCCCGCCCCSTCCSGCCCGTCACACAGATCT 807 TCGC6CT5AAGCTCGACGSCCG6GGCGGGGCG6GGCAG5CCG6GCAGT6T6TCTAGA AlaArgSerArgAlaAlaPro51yAlaGly61yArg61yAlaArgOP ValSerArg

AlaValGluLeuGlnApgSlyApgSlyAlaGlyAspProGlyAspCysLeuAsp

ApgSerLysSerSer&lyAla61y61yArgGlyThrArgGlyThrValCy5lle

I DK 175254 B1 I

I 10 I

I DNA-Sekvens II I

I 1 A&A7CT5GA6CGAC6TCCTG666SCCG&7CC5&7GCT6CCCG6G6AC6ACTTCT7C7CCC I

I 7CTA&ACC7C5CTGCA66ACCCCC6GCCAGGCCACGAC&G6CCCC7GCTGAA6AA6A&&6 I

A A A A * A A A A A I

I 1 BGLII XHOII, 2 DPNI SAU3A . 5 G5U1 , 12 AATII ACYI, 13 MAE11 I

I , 17 APYI ECORII, 2B R5RII, 27 AOAII, 35 BBVl , 39 AOAI NCII I

I SMAI, 40 NCII, 52 MBOII, 59 MNLI, I

I El 7CGGCG6CACCTCCATCTC66C6TT6CGGGT6GTCTC5C6CATCC6CAAG6AACTCG6C6 I

I A5CC6CCST55AG67AGAGCCGCAAC6CCCACCASA5CGC67A6GCST7CCTT6ASCCSC , I

H a · I

I GB HGICl , 70 mi, 97 FNUD3I, 100 SFANI, 101 FOKI, I

I 121 T6CCACTCDG5CTC6CCG7GATCTTC6A5AC6CCGTCCCT6GAAGCGGT66CCGAA7CDG I

I ACG5TGA6GCCGAGCG&CACTA6AA6CTCT6C6GCAGGGACCTTCGCCADC6GCTTAGGC I

A * A A AAA

I 122 BGLl, 140 DPNI 5AU3A, 142 MBOII, 149 ACYI H&AI TTH1111, I

I 158 APYI ECORII, 1B9 CFRI 6DIII . 174 HlNFI, 180 R5AI , I

I 181 TACTCCGCGAACTGAA6GG6ACG7AGTAAAGA&GT6CCCGCCACCCGCTTTCGCA6AACA I

I AT6A66C6CTT6ACTTCCCCT6CATCATTTCTCCACGG6CGST666C6AAAGC6TCTT6T I

Η I

I 18B FNUDII, 201 MAE II. 2Π MNL I , 213 HGICl, 214 5DUI. I

I 241 CCGAA6GAAGACCACACGT6AGCCCAGAACGACGCCC6G7CGAGATCCGTCCCGCCACCG I

I 6&CTTCCTTCT6GTGTGCACTCGGG7CTTGCTGC5GGCCAGCTCTAGGCABG6CGST6GC I

A a * A A

I 247 MBOII, 254 AFUII , 255 PMACI, 255 MAEII , 260 HSIJII SDUI I

I , 271 ACYI H&AI, 275 NCII, 283 XHOII. 284 B1NI DPNI SAU3A, I

I 301 CCSCC6ACATB5CG6C6GTCT5C5ACATC6TCAA7CACTACATCSA&ACGAGCACG5TCA I

I 6GCS5CT6TACCSCC6CCA0ACGCTG7A6CA&TTAGTGAT5TAGCTC7GCTCGT5CCAST I

I 303 B6LI. 308 NLAIII, 3Z4 TTH111I, 350 HGIAI 5DUI, 357 HINCI I

I I

I 3G1 ACTTCC&T AC&GA6CC6CAGAC7CC6CAG&AST&GATCSAC6ACCT S6A&C6CCTCCAGS I

I 76AAGGCATGCCTC66CS7CTGASGC6TCCTCACCTA6CT6CT6GACCTCGC6GAS6TCC I

I A I

I 3B7 RSAI, 360 HINFI, 394 BINI, 395 DPNI SAU3A, 404 APYI ECOR I

I II, 405 GSUI, 409 HAEII, 413 MNLI , 414 6SU1. 415 APYI ECORII I

I , 419 AOAII, . I

I 421 ACC5CTACCCCT66CTCGTCGCC5AGGT66AG6SCGTCGTCGCCG5CATCGCCTAC6CCG I

I TGGC6ATGG6GACCGAGCA5C5BCTCCACCTCCCGCA5CAGCSGCC5TA6C6GATGC66C I

H A « I

I 430 APYI ECORII, 444 MNLI, 450 MNLI, 453 ACYI, 454 HGAI, 462 I

NAEI , 466 SFANI, 477 NAEI , I

I 4B1 GCCCC7G6AAG6CCC6CAACSCCTAC6ACT56ACCGTCSA57C6AC66T67ACGTCTCCC I

I CGGS5ACC7TCC565C6776C&6A7GC76ACCTSGCAGC7CAGC76CCACAT6CASA6SG I

I 484 APYI ECORII, 511 AUAII. 519 HINFI, 521 ACCI HINCII SALI , I

I 530 R5AI , 532 MAEII, I

11 DK 175254 B1 DNA-Sekvens II (fortsat) 541 ACC6&CACCAGCGGCTCG6ACTG6GCTCCACCCTCTACACCCACCTGCTGAAGTCCf TGGCC5TGGTCGCCGA6CCT6ACCC6A6GTGG6A6A7GT56ST5GACGACTTCAS5Tf

A A Μ ΑΜΑ AA

544 H5ICI, 549 NSPBII. 563 H6IJII SOUI , 572 MNLI, 578 TAQII, 583 BSPMI, 595 NCOI STY1, 59G NLAIII , G00 MNLI.

B01 AGGCCCAGGSCTTCAAGAGC6T6GTCGCC5TCATCG6ACT6CCCAACGACCCGA6CGTGC TCCG6GTCCCGAAGTTCTCGCACCAGCGGDAGTAGCCTGADG5GTTGCTG6GCT0GCAC6 A Λ 605 APYI EC0R1I, 550 AVAI, 661 6CCT6CACGA6GCGCTCG5ATACACCGCGCGC66GAC6CTGCGGGCAGCCGGCTACAA6C CSGACGTGCTCCSCGAGCCTATGTGGCGCGCGCCCT6CGAC6CCC5TC6GCCGATGTTC6 A A a a a a aa aa a GB9 MNLI, 671 HAEII, B86 FNUDII, E87 BSSHII, BB8 FNUDII, B90 FNUDII, B95 HGAI , 658 BBUI . 705 BB<JI, 708 ΝΑΕ I , 716 ΤΤΗ1ΠΙ I .

721 ACG666GCTGGCACGACGTSGG6TTCTGGCAGC6CGACTTCGAGCTGCCGGCCCCGCCCC TGCCCCC6ACCGTGCT6CACCCCAA6ACC6TCGCGCTGAAGCTCGACGGCCGG6GCG65G

A A A a A A A

732 DRAIII, 736 MAE11 , 749 BBUI , 753 FNUDII, 763 ALU] , 7B4 B BUI . 767 NAEI ,

781 6CCCC6TCCGSCCCGTCACACAGATCT CGGGGCA66CCGG6CA6TGTGTCTAGA

A A A

795 MAEIII , 802 BGLII XHOII , 803 DPNI SAU3A ,

Claims

1. Resistensgensekvens mod phosphinothricin (PTC), I I der fås fra hele DNA'et af med hensyn til phosphinothricyl- I I -alanyl-alanin (PTT)-resistens selekteret Streptomyces viri- I I 5 dochromogenes DSM 4112 ved skæring med BamHI, kloning af et . I I 4,0 kb stort fragment og selektion med hensyn til PTT-resi- I I stens. I

2. Gensekvens ifølge krav 1,kendetegnet I I ved restriktionskortet ifølge fig. 1. I I 10

3. Gensekvens ifølge krav 1 og 2,kendetegn I I et ved DNA-sekvensen I (bilag), fra position nr. 258 til I I nr. 806. I

4. Anvendelse af gensekvensen ifølge krav 1 til 3 I I til fremstilling af PTT-resistente planter. I I 15

5. Anvendelse af gensekvensen ifølge krav 1-3 som I I PTT-resistens-markør i bakterier. I

6. Anvendelse af gensekvensen ifølge krav 1-3 som I I PTC-resi-stens-markør i planteceller. I

7. Anvendelse af gensekvensen ifølge krav 1-3 til I I 20 selektiv N-acetylering af L-formen af racemisk PTC. I